淀粉样变性是细胞外不溶性蛋白原纤维沉积，其导致组织损害和 疾病(Pepys，1996；Tan等人，1995；Kelly，1996)。当正常的可溶性 蛋白和肽以不正常的方式进行自结合时，就形成了原纤维 (Kelly，1997)。
淀粉状蛋白与严重疾病有关，包括系统性淀粉样变性、阿尔茨海 默氏病、成熟期突发型糖尿病、帕金森氏病、亨廷顿病、额颞痴呆和 朊病毒相关的传染型海绵状脑病(在人中是库鲁病(kuru)和克—雅 病(Creutzfeldt-Jacob)，在羊和牛中分别是瘙痒症和牛绵状脑病 (BSE))，并且淀粉状蛋白斑形成看起来与人类疾病的发展密切相关， 例如在阿尔茨海默氏病中。在动物模型中，在沉积物中发现的蛋白的 过度表达或修饰形式的表达，例如β-淀粉状蛋白，已经显示引起多 种疾病症状，例如阿尔茨海默氏样症状。对于淀粉状蛋白沉积没有特 效的治疗方法，这些疾病通常是致命的。
淀粉状蛋白原纤维的亚单位可以是野生型、变异体或截短的蛋白， 相似的原纤维可以在体外由寡肽和变性的蛋白形成(Bradbury等人， 1960；Filshie等人，1964；Burke和Rougvie，1972)。原纤维的多肽 成分的性质决定着淀粉样变性病的特点。尽管淀粉状蛋白在大小、天 然结构和功能上存在很大的不同，但所有的淀粉状蛋白原纤维长度不 确定，无分支，直径70～120，并显示特征性刚果红染色(Pepys，1996)。 它们呈特征性的交叉β结构(Pauling和Corey，1951)，其中多肽链 组成β-片层形式。尽管淀粉状蛋白具有非常不同的前体结构，但它 们都可能沿相似的路径经过结构转换以形成错折叠的形式，它是β- 片层螺旋状原丝的建筑模块。
此独特的纤维形式使得这种淀粉样变性病被称作β-原纤维病 (Glenner，1980a，b)，且阿尔茨海默氏病的原纤维蛋白在其二级结构 被发现之前被称作β-蛋白(Glenner和Wong，1984)。特征性的交叉 -β衍射图案以及原纤维状外观和染色特性是目前公认的淀粉状蛋白 的诊断标志，并且提示尽管原纤维由相当不同的蛋白前体形成，但是 不管其前体蛋白的性质如何，原纤维具有一定程度的结构相似性并组 成一个结构上的超家族(Sunde M，Serpell LC，Bartlam M，Fraser PE，Pepys MB，Blake CCFJ Mol Biol 1997 Oct 31；273(3)：729-739)。
其中在中枢神经系统中的淀粉状蛋白沉积物在疾病进展中有重要 的作用的最普遍和最熟知的疾病之一是阿尔茨海默氏病。 阿尔茨海默氏病
阿尔茨海默氏病(AD)是一个不可逆的、进行性脑疾病，其逐渐 发生并引起记忆丧失、行为和个性改变及智力下降。这些功能丧失与 脑细胞死亡和细胞间连接的损坏有关。此疾病的病程因人而异，下降 速度也如此。尽管此病可以持续至20年，但AD患者在其诊断后平均 生存8到10年。
AD分阶段地发展，从早期轻度的遗忘到智力功能的严重丧失。此 丧失称为痴呆。在大多数AD人群中，症状首先在60岁之后出现，但 较早发作也并不罕见。最早的症状经常包括近期记忆丧失、错误判断 和个性改变。通常，初始阶段的AD患者思维欠清晰并忘记熟人和常见 物体的名字。在疾病的后期，他们可忘记如何做甚至很简单的工作。 最后，AD患者丧失所有推理能力并变得依赖其他人照顾每日生活。最 终，疾病使患者变得如此虚弱，以致患者卧床不起并易于形成其它疾 病和感染。最常见的是，AD患者死于肺炎。
尽管发生AD的危险性随年龄增加而增加，但AD和痴呆症状并不 是正常衰老的一部分。AD和其它致人发狂的疾病是由影响大脑的疾病 引起的。在正常衰老过程中，脑内的神经细胞并不大量丢失。相反， AD破坏了三个关键的过程：神经细胞通讯、代谢和修复。此破坏最终 导致许多神经细胞停止发挥功能、丧失与其它神经细胞的联系并死亡。
首先，AD破坏脑内特别是位于海马区内的控制记忆部分中的神经 元，以及相关的结构。当海马区的神经细胞完全停止发挥功能时，短 期记忆衰退，通常，病人进行简单而熟悉的工作的能力开始下降。AD 也侵犯大脑皮层，特别是负责语言和推理的区域。最终，涉及大脑许 多其它的区域，所有这些大脑区域萎缩(缩小)，AD患者变得卧床不起、 大小便失禁、完全失能并对外界无反应(出处：国立研究所对阿尔茨 海默氏病衰老过程的报告，1999)。
AD的影响
AD是65岁及其以上的人群发生痴呆的最常见原因。因其对个人、 家庭、卫生保健系统和社会总体上的巨大影响而成为一个重要的健康 问题。科学家估计高到400万人目前患有此病，且对于超过65岁的人， 患病率每5年增加一倍。还估计每年将发生大约360,000新病例(发 病率)，尽管此数字会随着人口老化而增加(Brookmeyer等人，1998)。
AD给社会带来了沉重的经济负担。一个最近在美国进行的研究估 计到，照顾一个轻度AD患者的年护理费用为$18,408，中度AD患者为 $30,096，重度AD患者为$36,132。美国照顾AD患者的年全国费用估 计略超过$500亿(Leon等人，1998)。
大约400万美国人为85岁或85岁以上，且在大多数工业化国家， 此年龄组是人口中增长最快的人群之一。据估计，美国到2030年此组 数目接近850万；一些研究人口趋势的专家认为此数目可能更大。由 于越来越多的人生命延长，患老年疾病包括AD的人数将持续增长。例 如，一些研究显示85岁及其以上的人群中接近半数有某种形式的痴呆。 (国立研究所对阿尔茨海默氏病衰老过程的报告，1999)
AD的主要特征
大脑中两个异常结构是AD的标志：淀粉状蛋白斑和神经原纤维缠 结(NFT)。斑是致密的、很大程度上具有不溶性的蛋白和细胞物质的 沉积物，位于大脑神经元外及其周围。缠结是不溶性的合股纤维，它 们在神经元内逐步形成。
存在两种类型的AD：家族性AD(FAD)，其遵循某种遗传方式；和 散发性AD，未见其表现出明显的遗传方式。因为发作年龄不同，AD进 一步描述为早发型(发生在65岁以下的人群中)或晚发型(发生于65 岁及其以上的人群中)。早发型AD是罕见的(大约占病例的10％)，通 常侵犯在30～60岁间的人群。一些类型的早发型AD是遗传的并在家 族中蔓延。通常，早发型AD也较更常见的晚发型发展更快。
目前已知的所有FAD具有早期发作的特点，现在知道50％的病例 是由位于三个不同的染色体上的三个基因发生缺陷引起的。它们是21 号染色体上的淀粉状蛋白前体(APP)基因的突变；14号染色体上的基 因突变，称为早老素-1(presenilin 1)；和1号染色体上的基因突变， 称为早老素-2(presenilin 2)。然而，至今没有证据表明任何这些突 变在晚发型AD中的更常见的、散发性的或非家族性疾病中起主要作用。 (国立研究所对阿尔茨海默氏病衰老过程的报告，1999)
淀粉状蛋白斑
在AD中，淀粉状蛋白斑首先在用于记忆和其它认知功能的大脑区 域中形成。它们主要包括β淀粉状蛋白(此后命名为Aβ)的不溶性 沉积物，并混合有部分神经元和非神经细胞如小胶质细胞和星形胶质 细胞，其中β淀粉状蛋白是被称作淀粉状蛋白前体(APP，其氨基酸序 列表示在SEQ ID NO：2中)的较大蛋白的一个蛋白片段。尚不知道是 否淀粉状蛋白斑本身构成AD的主要原因，或者是否它们是AD过程中 的一个副产物。当然，正如在由APP基因突变引起的遗传型AD中所显 示的那样，APP蛋白的改变可以引起AD，且看起来Aβ斑的形成与人 类这种疾病的发展密切相关(Lippa C.F.等人，1998)。
APP
APP是与细胞膜联系在一起的许多蛋白之一。在它形成后，APP嵌 入神经细胞膜内，一部分在细胞内，一部分在细胞外。近期应用转基 因小鼠的研究表明，APP看起来在神经元生长和生存中起重要作用。例 如，某些类型和数量的APP可防止神经元受短期和长期的损害，并可 使受损的神经元具有较好的自身修复能力，帮助脑损伤后的部分神经 元的生长。
在APP嵌入细胞膜中时，蛋白酶作用在APP上的特定位点，将其 分裂成蛋白片段。一种蛋白酶辅助APP分裂形成Aβ，另一种蛋白酶在 淀粉状蛋白片段的中部分裂APP而不能形成Aβ。形成的Aβ具有两种 不同的长度，一种是较短的具有40(或41)个氨基酸的Aβ，其是相 对可溶的且聚合较慢；一种是略长的具有42个氨基酸的“粘性”Aβ， 其迅速地形成不溶性团块。虽然Aβ形成了，但还不确切地知道它如 何经过神经细胞或在神经细胞周围移动。在此过程的最后阶段，“粘 性”Aβ与已死亡和正在死亡的神经元以及小胶质细胞和星形胶质细 胞的碎片一起在细胞外聚合成长细丝，在脑组织中形成AD特征性的斑。
存在一些证据表明APP中的突变使Aβ更可能从APP前体中剪切 出来，因此导致形成更多的总Aβ或相对更多的“粘性”形式。并且 看起来好象早老素基因突变可至少以两种方式对神经元的退化起作 用：通过调节Aβ的产生或更直接地通过引发细胞的死亡。其他研究 者提出，突变的早老素-1和早老素-2可能涉及加快细胞凋亡的速度。
预期，随着疾病的发展，将形成越来越多的斑，占据越来越多的 大脑空间。研究提示，可能的情况是Aβ可能按一种动力学平衡的方 式同时聚合和解聚。这样产生了可能破坏斑的希望，甚至在它们形成 之后。(国立研究所对阿尔茨海默氏病衰老过程的报告，1999)
据信，Aβ对神经元是有毒性的。在组织培养研究中，研究者观察 到，同过度表达正常人APP的神经元相比，经基因工程处理的过度表 达突变形式人APP的海马神经元细胞的死亡增加(Luo等人，1999)。
此外，在动物模型中显示，过度表达或表达修饰形式的Aβ蛋白 引起阿尔茨海默氏样症状。(Hsiao K等人，1998)
假设Aβ产生增加、其聚合成斑和所引起的神经毒性可导致AD， 探索可以减速或甚至阻止Aβ聚合成斑的条件是有治疗意义的。
早老素
早老素-1(S-180)突变几乎占所有早发型家族性AD(FAD)病例的 50％。已鉴定了大约30个突变可造成AD。AD的发作依突变而不同。 早老素-2突变占FAD病例中的非常小的一部分，但仍然是一个显著的 因素。尚不知道是否早老素涉及散发性的非家族性AD。不知道早老素 的功能，但它们看起来涉及加工APP产生Aβ-42(该肽的较长的较粘 形式，SEQ ID NO：2，残基673-714)的过程，因为具有早老素突变的 AD患者此肽水平增加。不清楚早老素在引起神经原纤维缠结形成中是 否也有作用。有人提出，早老素也可能在神经元退化和神经元死亡中 有更直接的作用。早老素-1位于染色体14上而早老素-2与染色体1 连锁。如果一个人具有这些基因之一的仅仅一个突变形式，他或她几 乎肯定要形成早发型AD。
还不能确定早老素-1是否等同于涉及APP加工的假想的γ-分泌 酶(Naruse等人，1998)。
载脂蛋白E
载脂蛋白E通常与胆固醇结合在一起，但在AD患者大脑的斑和缠 结中也有发现。虽然等位基因1-3看起来不涉及AD，但APOE-e4等位 基因的出现和晚发型AD的形成之间有显著的相关(Strittmatter等 人，1993)。然而，这对于早老素和APP突变情形而言，只是一个危险 因素而非直接原因，且这不限于家族性AD。
对于APOE-e4蛋白增加AD形成可能性的方式尚未确切知道，但一 个可能的理论是，它加速了Aβ的聚集，这有助于降低AD的发作年龄， 或者特定的APOE等位基因的存在或不存在可影响神经元对损伤的反应 方式(Buttini等人，1999)。
此外Apo A1已经被显示出具有形成淀粉状蛋白的性质。完整的apo A1本身可以在体外形成刚果红阳性的淀粉样原纤维(Am J Pathol 147 (2)：238-244(1995年8月)，Wisniewski T，Golabek AA，Kida E，Wisniewski KE，Frangione B)。
看起来有一些矛盾的结果，表明同其它等位基因相比，APOE-e4 等位基因在减少智力丧失中有正效应(Stern，Brandt，1997，Annals of Neurology 41)。
神经元纤维缠结
AD的第二个标志由神经细胞内发现的异常聚集的缠绕细丝构成。 缠结的主要成分是称为tau(t)蛋白的一种形式。在中枢神经系统中， tau蛋白因其结合并帮助微管稳定的能力而最著名，微管是细胞内支持 结构或骨架的一个组成部分。然而，在AD患者中，tau发生了化学变 化，此改变的tau不再能够稳定微管，而使它们崩解。这种运送系统 的崩溃可首先引起神经细胞间通讯障碍，随后可导致神经元死亡。
在AD患者中，化学改变的tau缠绕成配对的螺旋状纤维一两条互 相缠绕在一起的tau细丝。这些纤维是在神经元纤维缠结中发现的主 要物质。在一个最近的研究中，研究者发现，健康人大脑海马区的特 定部位中发生神经元纤维改变的神经元不到6％，在死于轻度AD的人 群中这些神经元超过43％，在死于严重AD的人群中为71％。在研究 神经元丧失时发现了相似的发展过程。这种类型的证据支持一种观点， 即缠结的形成和神经元的丧失一起贯穿于AD的发展过程中。(国立研 究所对阿尔茨海默氏病衰老过程的报告，1999)
Tau蛋白病(Tauopathies)和缠结
除了AD以外，几种神经变性疾病以tau在神经元和神经胶质中聚 集成不溶的细丝为特征，导致功能障碍和死亡。最近，对除AD外的具 有各种遗传性痴呆的家族进行研究的几组研究者发现了位于17号染色 体上的tau基因的第一个突变(Clark等人，1998；Hutton等人，1998； Poorkaj等人，1998；Spillantini等人，1998)。在这些家族中，tau 基因的突变引起神经元细胞死亡和痴呆。这些疾病与AD共有某些特征， 但是在几个重要方面又与其不同，它们被集合起来称作“与17号染色 体连锁的额颞痴呆及帕金森氏病”(FTDP-17)。它们包括，例如帕金 森氏病，一些类型的肌萎缩性侧索硬化(ALS)，皮质基底变性、进行性 核上型瘫痪和皮克病，所有这些疾病均以tau蛋白异常聚集为特征。
其它AD样神经系统疾病
AD和其它神经系统疾病间具有重要的相似性，包括朊病毒病(例 如库鲁病、克-雅病和牛海绵状脑炎)、帕金森氏病、亨廷顿病和额— 颞痴呆。所有这些疾病均涉及异常蛋白在脑内的沉积物。AD和朊病毒 病导致痴呆和死亡，都与不溶性淀粉状蛋白原纤维的形成有关，但是 来自互不相同的膜蛋白。
研究帕金森氏病，即仅次于AD的第二个最常见的神经变性疾病， 科学家发现了与该疾病相关的第一个基因。此基因编码一个称作 synuclein的蛋白，令人感兴趣的是，它也在AD患者脑内的淀粉状蛋 白斑中发现(Lavedan C，1998，Genome Res.8(9)：871-80)。研究人员 也已发现另一种引起痴呆的进行性神经变性疾病，即亨廷顿病的基因 缺陷导致亨廷顿蛋白形成不溶性原纤维，该原纤维与AD病的Aβ原纤 维和朊病毒病的蛋白原纤维很相似(Scherzinger E等人，1999，PNAS U.S.A.96(8)：4604-9)。
科学家还发现了一个新的基因，当它发生突变时，是家族性不列 颠痴呆(FBD)的原因，FBD是一种罕见的遗传性疾病，导致严重的运 动障碍和进行性痴呆，与AD所见相似。对FBD斑中发现的淀粉状蛋白 原纤维进行的生化分析，发现了一种称为ABri的独特的肽(Vidal等 人，1999)。在此基因上特定位点的突变导致产生一种比正常Bri蛋白 较长的蛋白。从Bri蛋白的变异末端剪切而成的ABri肽沉积为淀粉状 蛋白原纤维。认为这些斑引起FBD特征性的神经元功能障碍和痴呆。
用Aβ的免疫
免疫系统通常会参加机体内外源蛋白和蛋白样颗粒的清除，但是 与上述疾病相关的沉积物通常主要地由自体蛋白组成，因而使免疫系 统在控制这些疾病中的作用不明显。此外，沉积物位于通常与免疫系 统隔离的区域中(中枢神经系统)，这两个事实提示任何疫苗或免疫治 疗方法将不会成功。
然而，最近科学家们试图用一种由异源人Aβ和一种已知刺激免 疫系统的物质组成的疫苗免疫小鼠(Schenk等人，1999和WO 99/27944)。在用人突变的APP基因插入小鼠DNA而形成的部分转基因 小鼠AD模型中试验了此疫苗。随着小鼠变老，小鼠产生了修饰的APP 蛋白并形成了淀粉状蛋白斑。这个小鼠模型被用来检测用抗修饰的转 基因人APP的疫苗接种对斑的形成是否有效。在第一个实验中，一组 转基因小鼠在6周龄时开始每月给予疫苗注射，至11个月时终止。第 二组转基因小鼠不接受注射并作为对照组。在13月龄时，对照组小鼠 有斑形成，占大脑的2～6％。相反，被免疫的小鼠实际上没有斑形成。
在第二个实验中，在已经有一些斑形成的第11个月，研究者开始 注射。经过7个月的时间，对照组转基因小鼠的大脑内斑的量增加了 17倍，而接受疫苗者同18个月大的对照组转基因小鼠相比下降了99 ％。在一些小鼠中，一些已经存在的斑沉积物看起来通过治疗被去除 了。还发现作为免疫作用的结果，其它与斑相关的损害如炎症和异常 的神经细胞活动减少了。
上面所述因而是在小鼠中进行的一个初步研究，例如，科学家们 需要弄清楚接种疫苗的小鼠是否在其它方面仍然健康，以及接种疫苗 的小鼠的记忆是否保持正常。此外，由于小鼠模型不是AD的完全代表 模型(该动物不形成神经元纤维缠结，也没有许多神经元的死亡)，有 必要进行另外的研究以确定人与小鼠是否有相似的或不同的反应。另 一个要考虑的问题是，此方法可能“治疗”淀粉状蛋白的沉积，但不 能阻止痴呆的形成。
技术问题也存在着较大的挑战。例如，即使有可能也不大可能用 此技术产生一种能够使人形成抗其自身蛋白的抗体的疫苗。因此，在 能够考虑任何人体试验之前，需要解决大量的安全性和有效性问题。
因此，Schenk等人的工作显示，如果有可能对中枢神经系统中的 蛋白样沉积物中的自体蛋白产生强免疫反应，就有可能防止沉积物的 形成并且有可能清除已经形成的斑。 发明目的
本发明的目的是对以淀粉状蛋白沉积为特征的状态，如AD，提供 新的治疗方法。另外的目的是形成一个抗淀粉状蛋白的自体疫苗，以 获得一种对AD和其它涉及淀粉状蛋白沉积的病理学异常的新治疗方 法。
发明概述
这里所描述的是应用一种自体疫苗接种技术以便对在其它情况下 无免疫原性的自体蛋白产生强免疫反应，该自体蛋白包括在与病理学 相关的淀粉状蛋白沉积物中。因此，产生的强免疫反应或者针对淀粉 状蛋白，或者针对包括在沉积物中的一种或多种成分，或者针对一种 或多种造成淀粉状蛋白形成的蛋白。还描述了这种疫苗的制备，该疫 苗预防、可能治疗或缓解与淀粉状蛋白沉积相关疾病的症状。
因此，在其最广泛和最普遍的范围内，本发明涉及一种对动物， 包括人类，进行体内下调淀粉状蛋白的方法，该方法包括实现将下述 免疫学有效剂量的物质呈递给动物免疫系统：
——至少一种致淀粉状蛋白产生多肽或其子序列，其已经被配制 而成，因此，用该致淀粉状蛋白产生多肽或其部分对动物的进行免疫 诱导产生抗该致淀粉状蛋白产生多肽的抗体，和/或
——至少一种淀粉状蛋白类似物，其中在该致淀粉状蛋白产生多 肽中引入修饰，其结果是用此类似物免疫动物导致产生抗致淀粉状蛋 白产生多肽的抗体。
因此，本发明包括下述用途：1)天然存在抗原及其片段，予以配 制以便触发免疫反应，以及2)这种天然存在抗原的类似物，该类似物 能够引起可交叉反应的免疫反应。
本发明还涉及致淀粉状蛋白产生多肽的类似物以及编码它们的子 集的核酸片段。包括类似物或核酸片段的免疫原性组合物也是本发明 的一部分。
本发明也涉及确定能产生免疫原性效果的致淀粉状蛋白产生多肽 的类似物的方法，以及制备含该类似物的组合物的方法。
附图说明
图1：为来自淀粉状蛋白前体蛋白的自体疫苗变异体的示意图，自 体疫苗变异体的目的是产生针对Aβ蛋白，Aβ-43(或C-100)的抗体 响应。本图的上端为APP示意图，其余图示结构显示模式抗原决定簇 P2和P30被取代或插入到各种截短的APP中的情况。在本图中，黑色 图案表示APP信号序列，双向交叉阴影是APP的细胞外部分，深色垂 直阴影是APP的跨膜结构域，浅色垂直影是APP的胞内结构域，粗的 交叉阴影表示P30抗原决定簇，细的交叉阴影表示P2抗原决定簇。实 线框表示Aβ-42/43，实线框和虚线框一起表示C-100。“Abeta”代 表Aβ。
发明详述
定义
下面将用于本说明书和权利要求书的若干术语进行详细地定义和 解释，以阐明本发明公认的界限和范围。
在这里，可以互换使用的术语“淀粉状蛋白”和“淀粉样的蛋 白”是表示一类长度不确定的蛋白样无分支原纤维。淀粉样原纤维显 示特征性的刚果红染色并具有一个交叉β结构，其中多肽链组成β- 片层形式。淀粉状蛋白通常来自致淀粉状蛋白产生蛋白，后者具有许 多不同的前体结构但都可能经过结构转换形成错折叠的形式，它是β -片层螺旋状原丝的构建模块。一般地，淀粉样原纤维的直径在大约 70～120间变化。
术语“致淀粉状蛋白产生蛋白”规定为表示一种涉及淀粉状蛋白 沉积物形成的多肽，或者是这种沉积物的一部分，或者是导致沉积物 形成的生物合成途径的一部分。因此，致淀粉状蛋白产生蛋白的实例 是APP和Aβ，但牵扯在这些蛋白代谢中的蛋白也可能是致淀粉状蛋白 产生蛋白。在这里将详细讨论几种致淀粉状蛋白产生多肽。
在这里，“淀粉状蛋白多肽”规定为表示含有上面讨论的致淀粉 状蛋白产生蛋白的氨基酸序列的多肽，其中致淀粉状蛋白产生蛋白来 自人或其它哺乳动物(或其截短形式，其与完整的致淀粉状蛋白产生 蛋白共同具有大量的B细胞抗原决定簇)——因此一个致淀粉状蛋白 产生多肽可以包括，例如形成该致淀粉状蛋白产生多肽的前体的实质 性部分(就Aβ而言，一种可能的淀粉状蛋白多肽可能是衍生的APP)。 在原核系统中制备的非糖基化形式的致淀粉状蛋白产生多肽，同由于 应用例如酵母或其它非哺乳动物真核表达系统的各种糖基化形式者一 样，也包括在本术语的范围内。然而，应当注意到，当应用术语“致 淀粉状蛋白产生多肽”时，它是指要讨论的多肽在呈递给要治疗的动 物时通常是无免疫原性的。换句话说，致淀粉状蛋白产生多肽是自体 蛋白或这种自体蛋白的类似物，它们通常不会产生抗所述动物的致淀 粉状蛋白产生物质的免疫反应。
一种“致淀粉状蛋白产生多肽的类似物”是一种已经在其一级结 构上接受改变的致淀粉状蛋白产生多肽。这种改变可以是，例如，将 一种致淀粉状蛋白产生多肽融合到一个适合的融合成分上(即，只涉 及在C-或N-末端添加氨基酸残基的一级结构改变)的形式，和/或在 致淀粉状蛋白产生多肽的氨基酸序列中插入和/或删除和/或取代的形 式。此术语还包括衍生化的致淀粉状蛋白产生分子，参看下面对致淀 粉状蛋白产生多肽修饰的讨论。如果致淀粉状蛋白产生多肽是淀粉状 蛋白或前体，于是必须构建类似物，如此以致不大能或甚至不能产生 抗淀粉状蛋白的正常前体蛋白的抗体，因而避免作为淀粉状蛋白前体 的多肽的(生理学正常的)非聚集形式的不受欢迎的干扰，。
应当注意到，可以设想在人体中应用人致淀粉状蛋白产生多肽的 异源类似物(如狗或猪的类似物)作为疫苗，以产生需要的抗致淀粉 状蛋白产生多肽的免疫性。这种应用异源类似物进行免疫接种的方法 也被认为是本发明的一部分。
本文中的术语“多肽”意指包括2～10个氨基酸残基的短肽、11～ 100个氨基酸残基的寡肽和超过100个氨基酸残基的多肽。进一步而 言，此术语还要包括蛋白群，即至少包括一种多肽的功能性生物分子； 当至少包括两种多肽时，它们可形成共价连接或非共价连接的复合物。 蛋白中的多肽可以是糖基化的和/或脂化的和/或含有辅基。
术语“T-淋巴细胞”和“T-细胞”将互换地用于胸腺来源的淋巴 细胞，它们负责各种细胞介导的免疫反应以及在体液免疫反应中起辅 助活性。相似地，术语“B-淋巴细胞”和“B-细胞”将互换地用于产 生抗体的淋巴细胞。
术语“子序列”指分别直接衍生自天然存在的淀粉状蛋白的氨基 酸序列或核酸序列的任何一段连续含有至少3个氨基酸或相应地至少 3个核苷酸的结构。
本文中的术语“动物”通常规定表示一个动物种类(优选哺乳动 物)，例如人类、家犬等，并不止一个动物。然而，此术语也表示这种 动物种类的一个群体，因为考虑到用同样的免疫原免疫动物，重要的 是按照本发明方法免疫的所有个体均具有实质上一样的致淀粉状蛋白 产生多肽。例如，如果在不同的人群中存在致淀粉状蛋白产生多肽的 基因变异体，就可能有必要在这些不同的群体中应用不同的免疫原以 便能够以最佳的方式在每一个群体中打破对致淀粉状蛋白产生多肽的 自体耐受性。专业技术人员会清楚，本文中的动物是有免疫系统的生 物。优选的动物是脊椎动物，如哺乳动物。
至于术语“淀粉状蛋白的体内下调”在这里是指生物机体内沉积 的相关类型淀粉状蛋白的总量下降。下调可以用几种机制获得：其中， 通过抗体结合简单的干扰淀粉状蛋白以防止错误聚集是最简单的方 法。然而，抗体结合引起清除细胞(如巨噬细胞和其它吞噬细胞)移 除淀粉状蛋白，以及抗体干扰其它导致淀粉状蛋白形成的致淀粉状蛋 白产生多肽，也包括在本发明的范围内。
表述“有效呈递…到免疫系统”规定是指动物免疫系统以一种可 控的方式接受一个免疫源性的刺激。如在下面公开内容中将要公开的 那样，这种免疫系统的刺激能以几种方式起效，其中最重要的是用含 “药物疫苗(pharmaccine)”的多肽进行接种(即，一种用于治疗或 改善正在发生的疾病的疫苗)，或核酸“药物疫苗(pharmaccine)” 接种。欲获得的重要结果是使动物体内的免疫感受态细胞以免疫学有 效的方式碰到抗原，而获得此结果的精确模式对于成为本发明基础的 发明思想而言是不太重要。
术语“免疫学有效量”具有其本领域内通常的含义，即，免疫原 的量能够引起明显与致病因子有关的免疫反应，该免疫反应能与具有 免疫原免疫学特征的致病因子对抗。
当应用致淀粉状蛋白产生多肽已经被“修饰”的表述时，这里是 指构成致淀粉状蛋白产生多肽主要成分的多肽的化学修饰。这种修饰 可以是，例如，致淀粉状蛋白产生多肽序列中某些氨基酸残基的衍生 作用(如烷基化)，但是正如将从下面公开内容中所能理解到的那样， 优选的修饰包括改变氨基酸序列的一级结构。
在讨论“对致淀粉状蛋白产生多肽的自体耐受性”时，由于致淀 粉状蛋白产生多肽在要接种的群体中是自体蛋白，可以理解到群体中 的正常者不发动针对抗致淀粉状蛋白产生多肽的免疫反应；可是不能 排除动物群体中的偶发个体可能产生抗天然致淀粉状蛋白产生多肽的 抗体，例如作为自身免疫病的一部分。无论如何，动物通常仅对其自 身的致淀粉状蛋白产生多肽具有自体耐受性，但不能排除所述动物也 会对从其它动物种类或具有不同表现型的群体衍生的类似物具有耐受 性。
“外源T-细胞抗原决定簇”(或“外源T-淋巴细胞抗原决定簇”) 是一个能够与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合并在一个动物种 类中刺激T-细胞的肽。本发明优选的外源T-细胞抗原决定簇是“混杂 的”抗原决定簇，即与一个动物种类或群体中的特定类MHC分子的实 质部分结合的抗原决定簇。已知仅有数量非常有限的这种混杂T-细胞 抗原决定簇，将在下面对它们进行详细讨论。混杂的T-细胞抗原决定 簇也表示“通用”的T-细胞抗原决定簇。应当注意到，为使根据本发 明使用的免疫原在动物群体的尽可能大的部分中有效，可能有必要：1) 在同一个类似物中插入数个外源T-细胞抗原决定簇，或2)制备几个 类似物，其中每个类似物插入不同的混杂抗原决定簇。还应当注意到， 外源T-细胞抗原决定簇的概念也包括应用隐蔽的T-细胞抗原决定簇， 即从自身蛋白衍生的抗原决定簇，当其以不是所述自身蛋白的一部分 的分离形式存在时，才表现免疫学行为。
“外源T辅助淋巴细胞抗原决定簇”(外源TH抗原决定簇)是一 种与II型MHC分子结合的外源T-细胞抗原决定簇，并能够被呈递到与 II型MHC分子结合的抗原呈递细胞(APC)的表面。
本发明中(生物)分子的“功能部分”规定是指该分子中，负责至 少一种该分子所发挥的生物化学或生理学作用的部分。本领域熟知的 是，许多酶和其它效应分子具有一个负责所述分子发挥作用的活性位 点。分子的其它部分可作为稳定或增加溶解性的目的而发挥作用，因 此假如这些目的在本发明的某些实施例所述情况下是不相干的，它们 就可以被省去。例如，可以应用某些细胞因子作为致淀粉状蛋白产生 多肽的修饰部分(参看下面的详细讨论)，在这种情况下，稳定性的问 题是离题的问题，因为对致淀粉状蛋白产生多肽的偶合可提供所需要 的稳定性。
术语“佐剂”具有其在疫苗技术领域中通常的含义，即一种物质 或物质组合物：1)其本身不能发动抗疫苗免疫原的特异免疫反应，但 2)尽管如此，它能增强抗免疫原的免疫反应。或换句话说，用佐剂单 独接种不提供抗免疫原的免疫反应，用免疫原接种可能产生或不产生 抗免疫原的免疫反应，但免疫原和佐剂联合接种引起强于免疫原单独 引起的抗免疫原免疫反应。
本文中，分子的“导向作用”规定是表示当一种分子一旦导入动 物体时，将优先出现在某些组织中或将优先与某些细胞或细胞类型相 联系的情况。此效果可用几种方法实现，包括将分子配入促进导向的 成分中，或通过在分子中导入促进导向的基团。这些问题将在下面详 细讨论。
“免疫系统的刺激作用”是指一种物质或物质组合物可表现出一 般的、非特异的免疫刺激作用。许多佐剂和推定的佐剂(如某些细胞 因子)具有刺激免疫系统的能力。应用免疫刺激剂的结果是增强了免 疫系统的“警觉状态”，意味着用免疫原同时或随后免疫时引起与单 独使用免疫原相比更显著有效的免疫反应。
淀粉状蛋白下调的优选实施方案
优选的是，用作本发明方法中的免疫原的致淀粉状蛋白产生多肽 为修饰的分子，其中在致淀粉状蛋白产生多肽的氨基酸序列中至少存 在一个改变，因为那样大大增加了获得对致淀粉状蛋白产生多肽的自 体耐受性进行全面阻断的机会，例如，这可以以此处实施例2中所示 结果予以证明，其中用野生型Aβ的免疫与用Aβ变异体分子的免疫 进行了比较。应当注意到，应用修饰的分子不排除在配方中应用这种 修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的可能性，该配方进一步促进了对致淀 粉状蛋白产生多肽的自体耐受性的阻断，如含佐剂的配方。
已经表明(在Dalum I等人，1996，J.Immunol.157：4796-4808中) 在正常个体中生理性地存在潜在的自身免疫反应B-淋巴细胞识别自体 蛋白。然而，为了引起这些B-淋巴细胞真正产生与相关自体蛋白发生 反应的抗体，需要来自产生细胞因子的T-辅助淋巴细胞(TH-细胞或TH- 淋巴细胞)的协助。正常情况下不提供这种辅助，因为当被抗原呈递 细胞(APC)呈递时，T-淋巴细胞通常不识别来自自体蛋白的T-细胞抗 原决定簇。然而，通过在自体蛋白上提供一个“外源性”成分(即通 过导入一个免疫学显著的修饰)，识别外源成分的T-细胞一旦识别APC (如，开始时是单核细胞)上外源抗原决定簇时被激活。能够识别修 饰的自体蛋白上的自身抗原决定簇的多克隆B-淋巴细胞(它们也是 APC)也使抗原内化，并随后呈递其外源T-细胞抗原决定簇，激活的 T-淋巴细胞随后提供辅助这些自反应多克隆B-淋巴细胞的细胞因子。 由于这些多克隆B-淋巴细胞产生的抗体与修饰的多肽上的不同抗原决 定簇反应，包括那些也存在于天然多肽中的抗原决定簇，因此诱导了 一个与未修饰的自体蛋白交叉反应的抗体。总之，T-淋巴细胞就好象 多克隆B-淋巴细胞群识别了一个完整的外源抗原一样而被诱导发挥作 用，而事实上只有插入的抗原决定簇对宿主而言是异质的。按此方式， 诱导了能够与未修饰的自身抗原交叉反应的抗体。
本领域已知几种修饰自身抗原肽以实现阻断自体耐受性的方法。 因此，根据本发明，修饰可以包括：
——至少导入一个外源T-细胞抗原决定簇，和/或
——至少导入一个第一部分，它作用于将修饰的分子导向到抗原 呈递细胞(APC)，和/或
——至少导入一个第二部分，它刺激免疫系统，和/或
——至少导入一个第三部分，它使修饰的致淀粉状蛋白产生多肽 呈递给免疫系统的过程最适化。
然而，所有这些修饰的进行应当同时保持致淀粉状蛋白产生多肽 中原始B-淋巴细胞抗原决定簇的实质部分，因为如此增强了B-淋巴细 胞对天然分子的识别。
在一个优选的实施例中，侧基(以外源T-细胞抗原决定簇形式或 上面提到的第一、第二和第三部分)被共价地或非共价地导入。这意 味着衍生来自致淀粉状蛋白产生多肽的一段氨基酸残基序列时，不改 变一级结构的氨基酸序列，或至少不在链内单个氨基酸间的肽键中导 入改变。
一个优选的可选择的实施例应用到氨基酸取代和/或缺失和/或插 入和/或添加(其可通过重组的方法或肽合成的方法实现；涉及一段长 的氨基酸序列的修饰能产生融合多肽)。本实施例一个特别优选的版本 是WO 95/05849中描述的技术，它公开了一个通过用自体蛋白的类似 物免疫而下调自体蛋白的方法，其中数个氨基酸序列被相应数量的氨 基酸序列取代，每个氨基酸序列含有一个外源免疫优势的T-细胞抗原 决定簇，而同时保持了类似物中自体蛋白的总体四级结构。然而，对 于本发明的目的，如果修饰(插入、添加、缺失或取代)产生了外源 T-细胞抗原决定簇同时保存了致淀粉状蛋白产生多肽中B-细胞抗原决 定簇的基本数量就足够了。但是，为了获得诱导的免疫反应的最大效 果，优选在修饰的分子中保持致淀粉状蛋白产生多肽的总体四级结构。 下面的分子式描述了本发明一般涵盖的分子构建物：(MOD1)s1(amyloi de1)n1(MOD2)s2(amyloide2)n2……(MODx)sx(amyloidex)nx(I)
其中amyloidel-amyloidex是x个含致淀粉状蛋白产生多肽的子序 列的B-细胞抗原决定簇，它们独立地相同或不相同，可含有或不含有 外源侧基，x是一个≥3的整数，n1-nx是x整数≥0(至少一个≥1)， MOD1-MODx是保守的B-细胞抗原决定簇间导入的x个修饰，s1-sx是x 整数≥0(如果在amyloidex序列中没有导入侧基，则至少一个≥1)。 因此，假定存在对本结构的免疫原性上的一般性功能约束，本发明允 许所有对致淀粉状蛋白产生多肽原始序列的置换类型及其所有的修 饰。于是，通过删除诸如在体内有副作用的致淀粉状蛋白产生多肽的 部分序列淀粉状蛋白或删除通常在细胞内并因此产生不需要的免疫反 应的部分所获得的修饰的致淀粉状蛋白产生多肽包括在本发明中。
上面概括的构建物的一个首选版本，当可应用时，是其中含淀粉 状蛋白的子序列的B-细胞抗原决定簇不以前体多肽的形式暴露于细胞 外的构建物，其中淀粉状蛋白由该前体多肽产生。通过对这样的淀粉 状蛋白抗原决定簇的选择，保证了不产生与制造淀粉状蛋白前体的细 胞反应的抗体，因而产生的免疫反应被限制为抗不需要的淀粉状蛋白 沉积物的免疫反应。当可应用时，可以选择其它致淀粉状蛋白产生多 肽而非淀粉状蛋白。在这些情况下，例如，诱导针对致淀粉状蛋白产 生多肽抗原决定簇的免疫性是可行的，其中当这些致淀粉状蛋白产生 多肽从产生其的细胞中解除任何形式偶联时，仅暴露于胞外相。
如这里所描述的，保持B-细胞抗原决定簇的实质部分或甚至保持 受修饰的蛋白的总体四级结构，可以用几种方法获得。一种是简单地 制备一种直接抗致淀粉状蛋白产生多肽的多克隆抗血清(如在兔中制 备的抗血清)，然后用此抗血清作为一种用于产生的修饰蛋白的检测试 剂(如在竞争ELASA中)。具有与致淀粉状蛋白产生多肽和抗血清同样 反应程度的修饰型(类似物)一定被认为同致淀粉状蛋白产生多肽具 有同样的总体四级结构，而表现出与这种抗血清具有有限反应性(但 仍然是显著的和特异的)的类似物被认为保持了原始B-细胞抗原决定 簇的实质部分。
可选择地，可以制备一个与致淀粉状蛋白产生多肽上独特抗原决 定簇反应的单克隆抗体筛选库，并用作一个检测组。此方法具有以下 优势，实现了1)致淀粉状蛋白产生多肽的抗原决定簇作图，和2)保 持在制备的类似物中的抗原决定簇作图。
当然，第三种方法将解析致淀粉状蛋白产生多肽或其生物活性截 短形式(参看上面叙述)的三维结构，并将此与已制备的类似物的已解 析三维结构比较。三维结构可以通过X-线衍射研究和核磁共振(NMR) -光谱学的帮助来解决。有关四级结构的进一步信息在一定程度上可以 从圆二色性研究中获得，其优势是仅需要纯化形式的多肽(而X-线衍 射需要准备晶体化的多肽，NMR需要准备多肽的同位素变体)以提供给 定分子四级结构的有用信息。然而，最终需要X-线衍射和/或NMR以获 得结论性数据，因为圆二色性只能通过二级结构成分的信息提供正确 三维结构的非直接证据。
本发明一个优选的实施例应用了致淀粉状蛋白产生多肽的B-淋巴 细胞抗原决定簇的多显示形式(即分子式I，其中至少有一个B-细胞 抗原决定簇出现在两个位置中)。此效果可以用各种方法获得，如通过 简单地制备含(致淀粉状蛋白产生多肽)m结构的融合多肽，其中m是一 个≥2的整数，然后在至少一个淀粉状蛋白序列中导入这里讨论的修 饰。导入的修饰包括至少一个重复的B-淋巴细胞抗原决定簇和/或导入 一个半抗原是优选的。这些包括所选抗原决定簇多显示形式的实施例 在仅有小部分致淀粉状蛋白产生多肽被用作疫苗制剂成分时是特别优 选的。
如上面提到的，外源T-细胞抗原决定簇的导入可以通过导入至少 一个氨基酸的插入、添加、缺失或取代而完成。当然，一般情况下会 导入在氨基酸序列中超过一个的改变(如由一个完整的T-细胞抗原决 定簇引起的插入或取代)，但要达到的重要目的是，当类似物被抗原呈 递细胞(APC)处理时将产生这种外源免疫优势的T-细胞抗原决定簇， 它出现在APC表面上的II型MHC分子中。因此，如果在致淀粉状蛋白 产生多肽的氨基酸序列的适当位置含有几个也可在外源TH抗原决定簇 中发现的氨基酸残基，那么外源TH抗原决定簇的导入可以通过氨基酸 插入、添加、缺失和取代方法通过提供外源抗原决定簇的剩余氨基酸 而实现。换句话说，不必通过插入或取代导入一个完整的TH抗原决定 簇来完成本发明的目的。
氨基酸插入、缺失、取代或添加的数目，优选的是至少2个，如3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 和25个氨基酸的插入、取代、添加或缺失。进一步优选的是，氨基酸 插入、取代、添加或缺失的数目不超过150个，如最多100、最多90、 最多80和最多70。特别优选的是取代、插入、缺失或添加的数目不超 过60，特别是此数目不应超过50甚至40。最优选的是数目不多于30。 关于氨基酸添加，应当注意到，当得到的构建物是融合多肽形式时， 这些经常大大高于150。
本发明的优选实施例包括通过导入至少一个外源免疫优势的T-细 胞抗原决定簇的修饰。可以理解，T-细胞抗原决定簇的免疫优势依赖 于所讨论的动物种类。如这里所用的，术语“免疫优势”简单地指在 免疫接种的个体/群体中产生一个显著的免疫反应，但众所周知的事实 是，在一个个体/群体中是免疫优势的T-细胞抗原决定簇不一定在同一 种类的另一个个体中具有免疫优势，尽管它能够在后者中与MHC-II分 子结合。因此，对于本发明的目的，一个免疫优势的T-细胞抗原决定 簇是当出现抗原时将有效地提供T-细胞帮助的T-细胞抗原决定簇。典 型地，免疫优势T-细胞抗原决定簇具有一个固有的特征，即不论其存 在部位，它们将总是基本上表现出与一个MHC II型分子结合在一起。
另一个重要论点是T-细胞抗原决定簇的MHC限制问题。一般地， 天然存在的T-细胞抗原决定簇是MHC限制的，即构成T-细胞抗原决定 簇的某个肽将仅与一个II型MHC分子亚型有效地结合。这反过来具有 这样的作用，在大多数情况下，应用一个特异的T-细胞抗原决定簇将 得到仅在部分群体中有效的疫苗成分，根据该部分的大小，可能有必 要在同一个分子中包括更多的T-细胞抗原决定簇，或可选择地，制备 一个多元件疫苗，其中的元件是致淀粉状蛋白产生多肽的变异体，它 们因导入的T-细胞抗原决定簇的性质不同而相互区别。
如果所用T-细胞的MHC限制是完全未知的(例如在免疫接种的动 物具有很不明确的MHC成分的情况下)，那么特定疫苗成分覆盖的群体 分数可以通过下面的公式确定： $f_{\mathrm{population}}=1-\underset{i=1}{\overset{n}{\Pi }}(1-p_i)----\left(\mathrm{II}\right)$
其中pi是群体中对疫苗成分中存在的第i个外源T-细胞抗原决定 簇发生反应者的频率，n是疫苗成分中外源T-细胞抗原决定簇的总数 目。于是，含3个外源T-细胞抗原决定簇的疫苗成分在群体中分别有 0.8、0.7和0.6的反应频率，将产生
1-0.2×0.3×0.4＝0.976
即，群体中的97.6％将在统计学上发动MHC-II介导的对疫苗的反 应。
上面的公式不能用于已知所用肽的MHC限制方式不太精确的情况。 如果，例如某个肽仅与HLA-DR等位基因DR1、DR3、DR5和DR7编码的 人MHC-II分子结合，那么这个肽与另一种能与由人体白细胞D抗原相 关抗原(HLA-DR)等位基因编码的其余MHC-II分子结合的肽将在所述 群体完成100％的覆盖。同样地，如果第二个肽仅结合DR3和DR5，添 加此肽将根本不能增加覆盖率。如果纯粹根据疫苗中T-细胞抗原决定 簇的MHC限制计算群体反应，一个特定疫苗成分覆盖的群体分数可以 通过下面的公式确定： $f_{\mathrm{population}}=1-\underset{j=1}{\overset{3}{\Pi }}{(1-{\phi }_j)}^2----\left(\mathrm{III}\right)$
——其中φj是编码MHC分子的等位基因单倍体群体中发生频次的 总和，MHC分子与疫苗中的任何一个T-细胞抗原决定簇结合并属于3 个已知的人体白细胞抗原(HLA)位点(DP、DR和DQ)中的第j个； 实际上，首先确定哪个MHC分子将识别疫苗中的每个T-细胞抗原决定 簇，其后按类型(DP、DR和DQ)列表—然后，对每个类型总计列入表 内的不同等位基因单倍体的单独频率，由此产生φ1、φ2和φ3。
可能发生公式II中的pi值超过相应的理论pi值： ${\pi }_i=1-\underset{j=1}{\overset{3}{\Pi }}{(1-v_j)}^2----\left(\mathrm{IV}\right)$
——其中vj是编码MHC分子的等位基因单倍体群体中发生频次 的总和，MHC分子与疫苗中的第i个T-细胞抗原决定簇结合并属于3 个已知的HLA位点(DP、DR和DQ)中的第j个。这意味着群体的1— pi是fresidual-1＝(pi-pi)/(1-pi)的反应频率。因此，公式III可以调整以 产生公式V： $f_{\mathrm{population}}=1-\underset{j=1}{\overset{3}{\Pi }}{(1-{\phi }_j)}^2+(1-\underset{i=1}{\overset{n}{\Pi }}\left(f_{\mathrm{residual}\_1}\right))----\left(V\right)$
——如果是阴性，其中术语1-φresidual-i被设为0。应当注意到， 公式V需要所有的抗原决定簇已经对照同批单倍体绘制了单倍体图谱。
因此，在选择要导入类似物中的T-细胞抗原决定簇时，重要的是 包括可获得的有关该抗原决定簇的所有知识：1)群体中对每个抗原决 定簇的反应频率，2)MHC限制数据，和3)相关单倍体群体中的频率。
有许多天然存在的“混杂”T-细胞抗原决定簇，它们在一个动物 种类或动物群体的大部分个体中有活性，这些被优选导入疫苗中，从 而减少了在同一疫苗中需要有很多不同类似物。
根据本发明，混杂的抗原决定簇可以是天然存在的人T-细胞抗原 决定簇，如来自破伤风毒素(如P2和P30抗原决定簇)、白喉毒素、 流感病毒血凝素(HA)和P.falciparum CS抗原的抗原决定簇。
在这些年，已经确定了许多其它混杂的T-细胞抗原决定簇。特别 是已经确定了能够与大部分由不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分 子结合的肽，这些都是有可能导入按本发明应用的类似物中的T-细胞 抗原决定簇。也参看下面文献中讨论的抗原决定簇，它们在此均汇编 为参考文献：WO 98/23635(Frazer IH等人，转让给昆士兰大学)； Southwood S等人，1998，J.Immunol.160：3363-3373；Sinigaglia F 等人，1998，Nature 336：778-780；Chicz RM等人，1993，J.Exp.Med 178：27-47；Hammer J等人，1993，Cell 74：197-203；和Falk K等人， 1994，Immunogenetics 39：230-242。最后面的文献也涉及HLA-DQ和 -DP配体。所有列在这5篇文献中的抗原决定簇作为要用在本发明中的 天然抗原决定簇的候选者是相关的，与这些抗原决定簇具有共同模体 (基序)的抗原决定簇也是如此。
可选择地，抗原决定簇可以是能够结合大部分II型MHC分子的任 何人工T-细胞抗原决定簇。在本文中，WO 95/07707和相应论文 Alexander J等人，1994，Immunity 1：751-761(将两个公开文献均以 参考文献汇编于此)中描述的泛DR抗原决定簇肽(“PADRE”)是引人 关注的能按本发明应用的抗原决定簇候选者。应当注意到，在这些文 章中公开的大多数有效PADRE肽在C-和N-末端携带D-氨基酸，以改善 施用施用时的稳定性。然而，本发明的主要目的是掺入相关的抗原决 定簇，作为修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的一部分，它们应当随后在 APC的溶酶体腔中被酶性分解，接着使之呈递在MHC-II分子范围内， 因此，在本发明中使用的抗原决定簇内掺入D-氨基酸是不利的。
一个特别优选的PADRE肽是具有AKFVAAWTLKAAA氨基酸序列者或 其免疫学有效的子序列。它和其它具有同样MHC限制缺陷的抗原决定 簇是优选的T-细胞抗原决定簇，应当存在于本发明方法使用的类似物 中。这种超混杂的抗原决定簇将用于进行本发明最简单的实施例，该 实施例中仅有一个单一修饰的致淀粉状蛋白产生多肽被呈递给免疫接 种动物的免疫系统。
如上所述，对致淀粉状蛋白产生多肽的修饰也可以包括导入将修 饰的致淀粉状蛋白产生多肽导向到APC或B-淋巴细胞的第一部分。例 如，该第一部分可以是B-淋巴细胞特异的表面抗原或APC特异表面抗 原的特异性结合成分。许多这种特异的表面抗原是本领域已知的。例 如，该部分可以是在B-淋巴细胞或APC上具有受体的碳水化合物(如 甘露聚糖或甘露糖)。可选择地，第二部分可以是一个半抗原。特异地 识别APC或淋巴细胞上的表面分子的抗体片段也可以被用作第一部分 (表面分子可以是例如巨噬细胞和单核细胞的FCγ受体，如FcγRI， 或可选择的任何其它特异性表面标记如CD40或CTLA-4)。应当注意到， 所有这些举例说明的导向分子也可以被用作佐剂的一部分，参看下面。
作为将修饰的致淀粉状蛋白产生多肽导向到某个细胞类型以获得 免疫反应增强的备选或补充物，有可能通过将上面提到的刺激免疫系 统的第二部分包括在内来提高免疫系统的应答水平。这种第二部分的 典型实例是细胞因子和热休克蛋白或分子成分，及其有效部分。
本发明所使用的适合的细胞因子是那些也通常在疫苗组合物中作 为佐剂者，即，例如干扰素γ(IFN-γ)、白介素1(IL-1)、白介素2 (IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、 白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和粒细胞—巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)；可选择地，细胞因子分子的功能部分可能足以作为 第二部分。关于应用这种细胞因子作为佐剂物质参看下面的讨论。
按照本发明，用作第二部分的适合的热休克蛋白或分子成分可以 是HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(也通称gp96，参看Wearsch PA等 人，1998，Biochemistry 37：5709-19)和CRT(钙网蛋白)。
可选择地，第二部分可以是一个毒素，如李斯特氏菌溶胞素(LLO)、 脂质A和热不稳定肠毒素。许多分枝杆菌衍生物如MDP(胞壁酰二肽)、 CFA(完全弗氏佐剂)和海藻糖二酯TDM和TDE也有令人关注的可能性。
本发明的又一个重要实施例是导入一个增强修饰的致淀粉状蛋白 产生多肽呈递到免疫系统的第三部分的可能性。本领域已有几个此原 理的实例。例如，已知布氏疏螺旋体蛋白OspA中的棕榈酰脂化锚可以 被用来提供自辅多肽(参看，如WO 96/40718)——看起来脂化蛋白成 为胶粒样结构，它具有由多肽脂化锚部分组成的核心和从该核心中突 出的该分子的其它部分，产生了多抗原决定簇外观。因此，本发明优 选的实施例是应用此方法和使用不同脂化锚(如肉豆寇基、肉豆寇基、 法呢基、香叶基—香叶基、糖基磷脂酰肌醇固着物和N-酰基甘油二酯 基)的相关方法，特别是因为在重组产生的蛋白中这种脂化锚的供应 相当直接，且仅需要应用如天然存在的信号序列作为修饰的致淀粉状 蛋白产生多肽的融合伙伴。另一个可能性是应用补体因子C3的C3d片 段或C3本身(参看Dempsey等人，1996，Science 271，348-350和Lou & Kohler，1998，Nature Biotechnology 16，458-462)。
导致将致淀粉状蛋白产生多肽的重要抗原决定簇区的多个(如至 少2个)拷贝呈递到免疫系统的本发明的一个可选择的实施例是致淀 粉状蛋白产生多肽淀粉状蛋白、子序列或其变异体共价偶联到某分子 上。例如，可以使用多聚物，如像葡聚糖的碳水化合物，参看例如Lees A等人，1994，Vaccine 12：1160-1166；Lees A等人，1990，J Immunol.145：3594-3600，但甘露糖和甘露聚糖也是有用的替代者。来 自例如大肠杆菌和其它杆菌的完整膜蛋白也是有用的偶联成分。传统 的载体分子如钥孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素、白喉类毒素和牛 血清白蛋白(BSA)也是优选和有用的偶联成分。
将淀粉状蛋白产生多肽共价偶联到如碳水化合物的多羟基聚合物 上的优选实施例，涉及应用至少一种致淀粉状蛋白产生多肽，和至少 一种单独偶联到多羟基聚合物上的外源T-辅助细胞抗原决定簇(即外 源T-辅助细胞抗原决定簇不与致淀粉状蛋白产生多肽相互融合，而结 合到后来作为载体主干的多羟基聚合物上)。此外，当携带致淀粉状蛋 白产生多肽区的适合B-细胞抗原决定簇通过短肽段构建时，这种实施 例是最优选的——因为此方法是一种在得到的免疫原制剂中获得所选 抗原决定簇多个外观的非常方便的方法。
特别优选的是，外源T-辅助细胞抗原决定簇与致淀粉状蛋白产生 (多)肽的偶合是依靠酰胺键的，该键可以被肽酶裂解。此方法有这 样的效果，即APC将能够摄取偶合物同时处理偶合物，随后将外源T -细胞抗原决定簇呈递在II型MHC范围内。
实现肽的偶合(既有致淀粉状蛋白产生多肽又有外源抗原决定簇) 的一个方法是用tresyl基团激活一个适合的多羟基聚合物；例如有可 能如WO 00/05316和US 5,874,469(均在此汇编为参考文献)所描述 的制备tresyl化的多糖，并将其与致淀粉状蛋白产生多肽和采用传统 固相或液相肽合成技术制备的T-细胞抗原决定簇偶合。得到的产物含 有多羟基聚合物主干(如葡聚糖主干)，致淀粉状蛋白产生多肽和外源 T-细胞抗原决定簇以其N-末端或其它可利用的氮部分附着在其上。如 果需要，也可能合成致淀粉状蛋白产生多肽以保护除N-末端一个氨基 以外所有可利用的氨基，然后将得到的被保护肽与tresyl化葡聚糖部 分偶合，并最终去除偶合物的保护。此方法的一个特殊实例描述于下 面的实施例中。
代替应用如WO 00/05316和US 5,874,469中讲授的水溶性多糖分 子，应用交联的多糖分子是同样可能的，由此在多糖和多肽间获得一 个特别的偶合物——据信引起多糖呈递到免疫系统的改善，因为达到 了两个目的，即当注射偶合物时获得局部沉积效果，并得以成为APC 有吸引力的靶标颗粒。应用这种颗粒系统的方法也在实施例中详细描 述。
在致淀粉状蛋白产生多肽中选择导入修饰的区域时要考虑的是： a)保存已知的和预计的B-细胞抗原决定簇，b)保存四级结构，c)避免 B-细胞抗原决定簇出现在“发生细胞”上等。无论如何，如上所述， 筛选一组已全部在不同部位插入了T-细胞抗原决定簇的修饰致淀粉状 蛋白产生分子是相当容易的。
由于本发明最优选的实施例涉及人Aβ的下调，因此优选地上面 讨论的致淀粉状蛋白产生多肽是人Aβ多肽。在此实施例中，特别优 选的是人致淀粉状蛋白产生多肽已经被至少一个相等或不同长度并含 有外源TH抗原决定簇的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中取代至少一个氨 基酸序列而修饰。修饰的致淀粉状蛋白产生的APP和Aβ的优选实例 图解地显示于图1中，以P2和P30抗原决定簇为例。这种结构所依据 的基本原理将在实例中详细讨论。
更特别地，被导入SEQ ID NO：2中的含TH(或完整的)氨基酸序 列可在SEQ ID NO：2中的任何氨基酸处导入。即，导入可能在1-770 氨基酸的任何一个之后，但优选地在SEQ ID NO：2中的下面任何氨基 酸之后：671，672，673，674，675，676，677，678，679，680，681， 682，683，684，685，686，687，688，689，690，691，692，693， 694，695，696，697，698，699，700，701，702，703，704，705， 706，707，708，709，710，711，712，713和714。这可与删除1-671 氨基酸的任一或全部或删除715-770氨基酸的任一或全部相结合。进 一步，当应用取代技术时，SEQ ID NO：2中的下列氨基酸的任何一个结 合导入可被删除：671，672，673，674，675，676，677，678，679， 680，681，682，683，684，685，686，687，688，689，690，691， 692，693，694，695，696，697，698，699，700，701，702，703， 704，705，706，707，708，709，710，711，712，713和714。
致淀粉状蛋白产生多肽和修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的配方
当致淀粉状蛋白产生多肽或修饰的致淀粉状蛋白产生多肽通过给 动物注射有效地呈递到动物免疫系统时，多肽的配方遵循本领域一般 公认的原理。
含有肽序列作为活性成分的疫苗的制备通常为本领域所熟知，如 美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792； 和4,578,770所举例说明的，在此全部汇编为参考文献。典型地，这 种疫苗被制备成可注射的液体溶液或悬液；也可以制备成适合在注射 前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。活性免疫 原成分通常与药物学可接受的且可与活性成分配伍的赋形剂混和。适 合的赋形剂是，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或其类似物， 以及它们的组合物。此外，如果需要，疫苗可含有较少量辅助物质如 湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增加疫苗有效性的佐剂；参看下面佐剂 的详细讨论。
疫苗常规地是胃肠外施用的，例如通过皮下、皮内、真皮下、真 皮内或肌肉内注射。适合其它施用方式的另外配方包括栓剂，在某些 情况下为口服、口腔、舌下、腹膜内、阴道内、肛门、硬膜外、脊髓 和颅内配方。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如，聚亚烷基 二醇或甘油三酯；这种栓剂可由含0.5％～10％，优选1-2％活性成 分的混合物制成。口服配方包括这种通用的赋形剂如药用级甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物表 现为溶液、悬液、片、小丸、胶囊、持续释放制剂或粉剂形式，并含 有10-95％，优选25-70％的活性成分。对于口服配方，霍乱毒素是 令人关注的配方成分(也是一个可能的偶合成分)。
多肽可被制成中性或含盐疫苗。药物学可接受的盐包括酸加成盐 (与肽的游离氨基形成)，它是与无机酸如盐酸或磷酸形成的，或与有 机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。与游离羧基形成的盐 也可以衍生自无机碱如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及这样的 有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
疫苗以符合剂量处方的方式施用，以将会有治疗效果并产生免疫 性的剂量施用。要给予的量有赖于要治疗的对象，包括，例如个体免 疫系统进行免疫反应的能力以及所需要的防护程度。适合的剂量范围 达到每次接种数百微克活性成分的水平，优选的范围大约为0.1μg～ 2,000μg(即使考虑在1-10mg范围的较高剂量)，如大约0.5μg～ 1,000μg的范围，优选的范围从1μg到500μg，特别是大约10μg 到100μg的范围。适合的初始施用和加强注射方案也是可以变化的， 但以开始施用接着后续接种或其它施用为代表。
应用的方式是可广泛变化的。任何常规的给予疫苗的方法均可应 用。这些包括以生理学可接受的固体成分或生理学上可接受的分散体 的形式口服施用，或通过注射或类似方式进行非肠道施用。疫苗的剂 量将有赖于施用的途径，并根据受接种者的年龄和抗原的处方而变化。
疫苗的某些多肽是足以在一个疫苗中产生免疫性的，而对某些其 它多肽，如果疫苗进一步包含一个佐剂物质将会增强免疫反应。
已知有多种获得疫苗佐剂作用的方法。一般的原理和方法细述于 “The Theory and Practical Application of Adjuvants”(佐剂的 理论和实际应用)，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(编辑)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6，也见于“Vaccines：New Generation Immunological Adjuvants”(疫苗：新一代免疫学佐剂)，1995， Gregoriadis G等人(编辑)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9，两者均在此合并为参考文献。
特别优选地应用一个显示能够加速中止对自体抗原的自动耐受性 的佐剂；事实上，在未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽被用作自体疫苗 中活性成分的情况下，这是必需的。适合佐剂的非限制性实例选自： 免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂如毒素、细胞因子、和分枝杆菌衍生物； 油配方；聚合物；胶粒形成佐剂；皂甙；免疫激发复合基质(ISCOM 基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊糖；及佐剂。通常应当 注意到，上面公布的涉及在类似物中用于第一、第二和第三部分的化 合物和试剂，也涉及它们在用于本发明疫苗的佐剂时加以必要的变更。
佐剂的应用包括，使用如氢氧化铝或磷酸(铝)试剂，通常以0.05～ 0.1％缓冲盐溶液使用，以0.25％溶液使用的与糖的合成聚合物形成的 掺和物(如Carbopol)，通过温度范围为70°到101℃、分别经过30 秒到2分钟的热处理凝集疫苗中的蛋白，，通过交联剂凝集也是可能的。 用作区段替代物，也可以使用通过与胃蛋白酶处理的抗体(Fab片段) 的反应凝集到白蛋白上，与细菌细胞如小棒杆菌或革兰氏阴性杆菌的 内毒素或脂多糖成分混和，在生理学上可接受的油载体如二缩甘露醇 单油酸酯(Aracel A)中乳化，或者用20％的全氟化碳(Fluosol-DA) 溶液乳化。也优选与油如角鲨烯和IFA混合。
按照本发明，DDA(溴化二甲基双十八基铵)同DNA和γ-菊糖一 样是令人关注的佐剂候选者，而且，弗氏完全和不完全佐剂以及 quillaja皂甙如QuilA和QS21同RIBI一样是令人关注的。进一步有 可能性的是单磷酰脂质A(MPL)、上面提到的C3和C3d、和胞壁酰二 肽(MDP)。
已知脂质体制剂也具有佐剂作用，因此按照本发明脂质体佐剂是 优选的。
免疫激发复合基质型(ISCOM基质)佐剂也是按照本发明的优选 选择，特别是已经发现此型佐剂能够上调抗原呈递细胞的II型MHC表 达。ISCOM基质由来自Quillaja肥皂草的(可选择性分馏的)皂甙(三 萜系化合物)、胆固醇、和磷脂组成。在与免疫原蛋白混和时，得到的 颗粒状制剂即是已知的ISOCM颗粒，其中皂甙构成以重量比计占60-70 ％，胆固醇和磷脂以重量比计占10-15％，蛋白以重量比计占10-15 ％。有关免疫激发复合物的组成和应用的细节可以在例如上面提到的 研究佐剂的教科书中发现，而且，Morein B等人，1995， Clin.Immunother.3：461-475以及Barr IG和Mitchell GF，1996， Immuno.and Cell Biol.74：8-25(均在此合并为参考文献)提供了制 备完全免疫激发复合物的有用指导。
另一个高度关注的(因此，也是优选的)获得佐剂效果的可能性 是应用Gosselin等人1992年描述的技术(在此合并为参考文献)。简 单地说，如本发明抗原的相应抗原可以通过将该抗原与抗单核细胞/巨 噬细胞上的Fcγ受体的抗体(或抗原结合抗体的片段)结合而增强呈 递。抗原和抗FcγRI间的特殊偶合物已经显示出增强了以免疫接种为 目的的免疫原性。
其它可能性涉及使用上面提到的靶向和免疫调节物质(即细胞因 子)作为致淀粉状蛋白产生多肽的修饰形式的第一和第二部分的候选 者。在这一点上，细胞因子的合成诱导剂如多聚I：C也是可能的。
适合的分枝杆菌衍生物选自：胞壁酰二肽、完全弗氏佐剂、RIBI、 和海藻糖二酯如TDM和TDE。
适合的免疫靶向佐剂选自：CD40配体和CD40抗体或其特异性的结 合片段(参看上面讨论的)、甘露糖、Fab片段、和CTLA-4。
适合的聚合物佐剂选自：碳水化合物如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露 聚糖和甘露糖；塑料聚合物；和胶乳如胶乳珠。
还有另一个令人注目的调节免疫反应的方式是在一个“虚拟淋巴 结”(VLN)(一种专利医用装置，由ImmunoTherapy公司开发，360 Lexington Avenue，New York，NY 10017-6501)中包含免疫原(可选 择地与佐剂和药理学可接受的载体和运载工具结合在一起)。VLN(一 个细管状装置)模拟淋巴结的结构和功能。在皮下插入VLN产生了一 个伴有细胞因子和趋化因子急剧上升的无菌性炎症部位。T-和B-细胞 以及抗原呈递细胞迅速对危险信号反应，募集到炎症部位并聚集到VLN 的多孔基质内。已经显示，当应用VLN时，诱发对抗原的免疫反应所 需要的必需抗原的剂量减少了，且用VLN免疫接种具有的免疫防护作 用超过传统的用Ribi作佐剂的免疫作用。此技术即简要地描述于 Gelber C等人，1998年，“Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node”(用 一个命名为虚拟淋巴结的新医用装置激发对小量免疫原的强大细胞和 体液免疫反应)中，见：“From the Laboratory to the Clinic，Book of Abstracts”(从实验室到临床，摘要卷)，1998年10月12-15日， Seascape Resort，Aptos，California”。
疫苗的微粒制剂已经在很多情况下显示可增加蛋白抗原的免疫原 性，因而成为本发明的另一个优选的实施例。微粒被制成抗原与聚合 物、脂质、碳水化合物或其它适合制备颗粒的共同制剂，或者微粒可 以是仅由抗原本身组成的均质颗粒。
以聚合物为基础的微粒实例是以PLGA和PVP为基础的颗粒(Gupta， R.K.等人，1998)，其中聚合物和抗原浓缩在一个固体颗粒中。脂质为 基础的颗粒可被制成其中俘获了抗原的脂质胶粒(所谓的脂质体) (Pietrobon，P.J.1995)。碳水化合物为基础的颗粒典型地由适合的可 降解碳水化合物组成，例如淀粉或脱乙酰壳多糖。碳水化合物和抗原 以与用于聚合物颗粒相似的步骤混和并浓缩在颗粒中(Kas，H.S.等人 1997)。
仅由抗原组成的颗粒可用各种喷雾和冻干技术制造。特别适合本 发明用途的是超临界流体技术，它被用来产生非常一致的可控大小的 颗粒(York，P.1999 & Shekunov，B.等人，1999)。
预计疫苗应当每年给予1-6次，例如给需要这种疫苗的个体一年 给予1、2、3、4、5、或6次。已经明显地显示，通过应用按本发明优 选的自体疫苗而诱导的记忆免疫性是不持久的，因此免疫系统需要定 期地用致淀粉状蛋白产生多肽或修饰的致淀粉状蛋白产生多肽激发。
由于遗传性变异，不同的个体可能对同一种多肽以不同强度发生 免疫反应。因此，本发明所述的疫苗可包括几种不同的多肽以增加免 疫反应，也参看上面有关外源T-细胞抗原决定簇导入的选择的讨论。 疫苗可包括两种或多种多肽，其中所有的多肽如上面所规定的。
因此疫苗可包括3-20种不同的、修饰的或未修饰的多肽，如3 -10种不同的多肽。
核酸接种
作为经典的以肽为基础的疫苗施用的可替代方法，核酸接种技术 (通常也被称为“核酸免疫作用”、“遗传免疫作用”和“基因免疫作 用”)提供了许多有吸引力的特征。
首先，同传统的疫苗方法相比，核酸接种不需要大规模生产免疫 原药剂所消耗的资源(如以工业规模发酵微生物的形式生产修饰的致 淀粉状蛋白产生多肽)。进一步，不需要免疫原纯化和重折叠过程的装 置。最后，由于核酸接种依靠被接种个体的生化器官以产生导入核酸 的表达产物，预期要发生表达产物最佳的翻译后过程；这在自体接种 的情况下是特别重要的，因为，如上所述，原始B-细胞抗原决定簇的 一个重要部分应当被保存在修饰的分子中，并且由于B-细胞抗原决定 簇原则上可由任何(生物)分子(如碳水化合物、脂质、蛋白等)部 分组成。因此，免疫原的天然糖基化和脂质化方式对整体免疫原性可 以是非常重要的，这一点通过使宿主产生免疫原可最好地予以保证。
因此，本发明的一个优选实施例包括，通过将编码修饰的致淀粉 状蛋白产生多肽的核酸导入动物细胞，并由此获得导入核酸的细胞的 体内表达，而有效地将修饰的致淀粉状蛋白产生多肽呈递给免疫系统。
在此实施例中，导入的核酸优选的是DNA，其形式可以是：裸露 DNA，与带电荷或无电荷脂质配伍的DNA，在脂质体中配伍的DNA，包 括在病毒载体中的DNA，与转染促进蛋白或多肽配伍的DNA，与一个靶 向蛋白或多肽配伍的DNA，与钙沉淀试剂配伍的DNA，与一个惰性载体 分子耦合的DNA，包封在聚合物中的DNA，如在PLGA(参看在WO 98/31398 中描述的微囊包封技术)中或在甲壳质或脱乙酰壳多糖中，和与佐剂配 伍的DNA。在本文中注意到，几乎所有与在传统疫苗配方中应用佐剂有 关的考虑均适用于DNA疫苗的配方。因此，这里公布的所有涉及以多 肽为基础的疫苗中佐剂的应用，加以必要的变更，适用于其在核酸接 种技术中的应用。
关于上面已经细述的施用途径和以多肽为基础的疫苗施用方案， 也可应用于本发明的核酸疫苗，且上面所有关于多肽施用途径和施用 方案的讨论加以必要的变更也适用于核酸。对此应当加上，核酸疫苗 可以适合静脉内和动脉内施用。进一步，本领域熟知，核酸疫苗可以 用所谓的基因枪施用，因此它和相当的施用模式也被认为是本发明的 一部分。最后，在给予核酸时使用VLN也被报道产生了好的结果，因 此这个特别的施用模式是特别优选的。
此外，用作免疫作用药剂的核酸可以含有编码第一、第二和/或第 三部分的区域，例如以上面描述的免疫调节物质的形式，诸如讨论用 作佐剂的细胞因子。本实施例的一个优选模式包括含有类似物的编码 区和在不同的读取框内或至少在不同的启动子控制下，含有免疫调制 剂的编码区。因此避免了类似物或抗原决定簇作为免疫调制剂的融合 成分而产生。可选择地，可以使用两个不同的核苷酸片段，但这不太 优选，因为当两个编码区包括在同一个分子中时有保证共同表达的优 势。
据此，本发明也涉及诱导抗致淀粉状蛋白产生多肽的抗体产生的 组合物，该组合物包括：
——本发明的核酸片段或载体(参看下面载体的讨论)，和
——如上讨论的药理学和免疫学上可接受的运载工具和/或载体 和/或佐剂。
在一般情况下，编码变异体的核酸以载体的形式被导入，其中的 表达是在病毒启动子的控制之下。对于本发明所述载体的更详细的讨 论参看下面的讨论。关于核酸疫苗的配方和应用的详细公开资料也可 获得，参看Donnelly JJ等人，1997，Annu.Rev.Immunol.15：617-648 和Donnelly JJ等人，1997，Life Sciences 60：163-172。这两个文 献均在此合并为参考文献。
活疫苗
第三个可选择的将修饰的致淀粉状蛋白产生多肽有效呈递到免疫 系统的方法是应用活疫苗技术。在活体疫苗接种中，通过给予动物一 个非致病微生物而有效地呈递到免疫系统，其中该微生物已经被用编 码修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的核酸片段或掺入了这种核酸片段的 载体转化。非致病微生物可以是任何适合的减毒细菌株(通过传代或 通过采用重组DNA技术移除致病表达产物而减毒)，如牛分枝杆菌结核 菌苗、非致病链球菌亚种、大肠杆菌、沙门氏菌亚种、霍乱弧菌、志 贺氏菌属等。关于最新的活疫苗制备的综述可见于，例如Saliou P，1995，Rev.Prat.45：1492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10：977-990，两者在此合并为参考文献。关于这种活疫苗中所用的核 酸片段和载体的细节参看下面的讨论。
作为细菌活疫苗的替代，下面讨论的本发明的核酸片段可以整合 进一个无毒的病毒疫苗载体中，如牛痘株或任何其它适合的痘病毒。
通常，非致病微生物或病毒仅给予动物一次，但在某些情况下， 可能有必要在一生中超过一次地给予微生物以维持保护性免疫性。甚 至可以考虑，在应用活的或病毒疫苗时，如上面细述的多肽接种的免 疫作用方案将是有用的。
可选择地，活的或病毒接种与其前或其后的多肽和/或核酸接种相 结合。例如，有可能用活的或病毒疫苗引起初级免疫作用，随后用多 肽或核酸方法继发增强的免疫作用。
微生物或病毒可以用核酸转化，该核酸含有编码第一、第二和/或 第三部分的区域，如以上面描述的免疫调节物质的形式，如讨论的作 为有用佐剂的细胞因子。本实施例的一个优选模式包括含有类似物的 编码区和在不同的读取框内或至少在不同的启动子控制下，含有免疫 调制剂的编码区。因此避免了类似物或抗原决定簇作为免疫调制剂的 融合成分而产生。可选择地，可以使用两个不同的核苷酸片段作为转 化剂。当然，在同一个读取框内具有第一和/或第二和/或第三部分可 以提供作为一个表达产物、一个本发明的类似物，且按照本发明，这 种实施例是特别优选的。
在疾病治疗中使用本发明的方法
如从上面讨论中会理解到的，本发明的方法的提供可控制以淀粉 状蛋白沉积物为特征的疾病。在这种情况下，AD是本发明方法的关键 靶位，而且其它以淀粉状蛋白沉积物为特征的疾病也是可能的靶位。 因此，本发明方法下调淀粉状蛋白活性的一个重要实施例包括治疗和/ 或预防和/或缓解AD或其它以淀粉状蛋白沉积为特征的疾病，该方法 包括根据本发明方法下调淀粉状蛋白以至使淀粉状蛋白明显地降低。
特别优选的是淀粉状蛋白的减少可引起淀粉状蛋白形成和淀粉状 蛋白降解/清除之间平衡的逆转，即淀粉状蛋白降解/清除的速率超过 淀粉状蛋白形成的速率。通过谨慎控制具有这种需求的个体的免疫作 用的次数和免疫学影响，将可能随着时间的推移获得一种平衡，使淀 粉状蛋白沉积物发生净减少而没有过多的副作用。
可以选择的是，如果在一个个体中本发明方法不能清除或减少已 存在的淀粉状蛋白沉积物，本发明的方法可被用来在临床上明显地减 少新淀粉状蛋白的形成，因此显著延长了疾病不发生恶化的时间。通 过测定血清中淀粉状蛋白的浓度(据信与沉积物质是相平衡的)，或通 过采用正电子发射体层摄影技术(PET)扫描，参看Small GW等，1996， Ann N Y Acad Sci 802：70-78，应该能监测淀粉状蛋白沉积的速率。
本手段和方法和途径可以以相似的方式治疗或缓解的其它疾病和 状态已经在前面所述的“发明背景”中提及(系统性淀粉样变性、成熟 期突发型糖尿病、帕金森病、亨廷顿病、额—颞痴呆和朊病毒相关传 播性海绵状脑病)，或在下面以“其它淀粉样疾病及其相关蛋白”为 标题的章节中列举。
肽类、多肽以及本发明的组合物
如从上面讨论中明显表明的，本发明是基于用致淀粉状蛋白产生 抗原免疫机体的构想，以便减少病理学上相关的淀粉状蛋白沉积物的 量。获得这种免疫作用的优选途径是采用致淀粉状蛋白产生多肽的修 饰体，从而产生了本领域以前没有公开过的分子。
据信，在此所讨论的修饰分子就其本身而言是独创的，因此本发 明的一个重要部分是关于一种来自一种动物致淀粉状蛋白产生多肽的 类似物，其中被引入一种修饰作用，这种修饰作用的结果是用该类似 物免疫该动物可产生特异地与未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽反应的 抗体。优选的是，当讨论本发明方法的多种实施例并采用修饰的致淀 粉状蛋白产生多肽时，修饰作用的特性符合上面所述的修饰作用的类 型。因此，任何关于修饰的致淀粉状蛋白产生分子的在此公开内容与 描述的本发明所述致淀粉样产生蛋白类似物的目的是有关联的，任何 这样的公开内容加以必要的更改适用于描述这些类似物。
应该注意的是，优选的修饰的致淀粉状蛋白产生分子包括一些修 饰作用，可产生一种与致淀粉蛋白产生蛋白或其至少10个氨基酸长度 的子序列有至少70％序列同一性的多肽。优选更高的序列同一性，如 至少75％或甚至至少80％、85％、90％或95％。蛋白和核酸的序列同 一性可以用(Nref-Ndif)·100/Nref来计算，其中Ndif是当对齐时两个序列中 非相同残基的总数目，其中Nref是序列之一的残基数目。因此，DNA序 列AGTCAGTC与序列AATCAATC(Ndif＝2和Nref＝8)具有75％的序列同一性。
本发明也关于实施本发明方法中所用的组合物。因此，本发明也 涉及一种包括免疫学有效量的一种对致淀粉状蛋白产生多肽的免疫原 性组合物淀粉状蛋白，所述的致淀粉状蛋白产生多肽是一种动物的自 体蛋白，与免疫学可接受的佐剂配伍在一起，以便打破动物针对致淀 粉状蛋白产生多肽的自体耐受性，该组合物进一步包括一种药学和免 疫学上可接受的稀释剂和/或运载工具和/或载体和/或赋形剂。换句话 说，本发明的这一部分是关于天然存在的致淀粉状蛋白产生多肽的配 制，它与本发明方法的实施例一起进行了描述。
本发明也涉及一种免疫原的组合物，它包括免疫学上有效量的上 面定义的类似物，所述的组合物进一步包括药学和免疫学上可接受的 稀释剂和/或媒介和/或载体和/或赋形剂，以及可选的一种佐剂。换句 话说，本发明的这一部分是关于修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的配制， 基本上如上所述。因此当提到在本发明方法中用来下调淀粉状蛋白的 修饰和未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的配制时，佐剂、载体和媒介 的选择相应的是与上面所讨论的保持一致。
多肽是根据本领域已知的方法来制备的。较长的多肽通常是通过 重组基因技术来制备的，该技术包括将一个编码类似物的核酸序列引 入一个合适的载体中，用载体转化一种合适的宿主细胞，通过宿主细 胞来表达核酸序列，从宿主细胞或其培养物上清液中回收表达产物， 然后进行纯化及进一步进行可选择的修饰作用，如重折叠或衍生化作 用。
较短的肽类优选通过已知的固相或液相肽合成技术来制备。但是， 最近这种技术的进展已经可能通过这种技术产生全长的多肽和蛋白， 因此通过合成方法来制备长的构建物也是在本发明的范围之内的。
本发明的核酸片段和载体
从上面的公开内容中可以理解到的是：修饰的致淀粉状蛋白产生 多肽可以通过多种重组基因技术来制备，也可以通过化学合成或半合 成的方法来制备；当修饰作用包括将蛋白载体(如KLH，白喉类毒素， 破伤风类毒素，以及牛血清白蛋白)和非蛋白分子如糖类聚合物偶联到 致淀粉状蛋白产生多肽衍生的肽链上时，后面的两种选择是特别相关 的，当然当修饰作用包括将一个侧链或侧链基团添加到致淀粉状蛋白 产生多肽衍生的肽链上时也是一样。
对于重组基因技术而言，当然也对于核酸免疫作用而言，编码修 饰的致淀粉状蛋白产生多肽的核酸片段是重要的化学产物。因此，本 发明的一个重要部分是关于一种核酸片段，它编码一种致淀粉状蛋白 产生多肽的类似物，即一种致淀粉状蛋白产生多肽衍生的多肽，它包 括已经加入或插入一个融合成分的天然序列，或优选包括一种致淀粉 状蛋白产生多肽衍生的多肽，其中已经通过插入和/或加入，优选通过 替代和/或缺失引入了一个外源T细胞抗原决定簇。本发明的核酸片 段是DNA或RNA片段。
本发明的核酸片段正常情况下被插入到一个合适的载体中形成携 带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体；这样的新载体也是本发明 的一部分。关于本发明的这些载体构建物的详细细节将在下面的转化 细胞和微生物的章节中讨论。根据应用的目的和类型，载体可以是质 粒、噬菌体、粘粒、微型染色体或病毒的形式，仅仅暂时在特定细胞 中表达的裸露DNA也是一种重要的载体。本发明优选的克隆载体和表 达载体能够自主复制，因而为进行高水平的表达或为随后的克隆进行 高水平复制获得很高的拷贝数目。
本发明的载体的基本构造以5’-3’方向和可操作连锁方式包括 下列特征：驱动本发明的核酸片段表达的一个启动子，可选择的一个 编码一段引导肽的核酸序列，该引导肽促进多肽片段的分泌(进入细胞 外相，或当适用时进入周质)或将该多肽片断整合入膜上，本发明的核 酸片段，以及可以选择的一个编码终止子的核酸序列。当在生产菌株 或细胞系中用表达载体进行操作时，为了保持转化细胞的遗传稳定性， 优选载体在进入一个宿主细胞时被整合进宿主细胞基因组中。相反， 当使用用来影响动物体内表达的载体进行操作时(即，当在DNA接种时 使用载体)，出于安全性原因优选载体不能被整合进入宿主细胞基因组 中；典型地，可使用裸露的DNA或非整合性的病毒载体，其选择是本 领域技术人员所熟知的。
本发明的载体可用来转化宿主细胞以产生本发明的修饰的致淀粉 状蛋白产生多肽。这样的转化细胞，也是本发明的一部分，可以是培 养细胞或细胞系，用来增殖本发明的核酸片段和载体，或用来重组产 生本发明的修饰的致淀粉状蛋白产生多肽。可以选择的是，转化细胞 可以是合适的活疫苗菌株，其中已经插入了核酸片段(一个单一的或多 个拷贝)以影响修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的分泌或对细菌膜或细 胞壁的整合作用。
本发明优选的转化细胞是微生物，例如细菌(如埃希杆菌属[如大 肠杆菌]，芽孢杆菌属[如枯草芽孢杆菌]，沙门菌属，或分支杆菌属[优 选非病原性，如牛分支杆菌结核菌苗])，酵母(如酿酒酵母)，以及原 生动物。可以选择的是，转化细胞可以来源于一种多细胞的生物体， 如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。最优选的是来自于人 类的细胞，参看下面对细胞系和载体的讨论。最近的结果显示使用市 售果蝇细胞系(可从Invitrogen购到的Schneider 2(S2)细胞系和载体 系统)在申请者的实验室中具有很大的重组生产多肽的前景，因此特别 优选这种表达系统。
为了克隆和/或优化表达，优选转化细胞能够复制本发明的核酸片 段。表达核酸片段的细胞是本发明优选的有用的实施例；它们可于小 量或大量制备修饰的致淀粉状蛋白产生多肽，或者在使用非病原性细 菌的情况下，可在活疫苗中作为疫苗的组分。
当采用转化细胞的方法产生本发明的修饰分子时，尽管不是必要 的，但还是很便利的，表达产物可以被运输至培养基中或携带到转化 细胞表面。
当已经鉴定了一种有效的生产细胞时，优选在其基础上建立一种 稳定的细胞系，该细胞系携带本发明的载体并表达编码修饰的致淀粉 状蛋白产生多肽的核酸片段。优选地，这种稳定的细胞系分泌或携带 本发明的类似物，因此便于其纯化。
一般来说，含有来源于宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的 质粒载体可用于该宿主。载体一般携带一个复制位点，以及能够在转 化细胞中提供筛选显型的标记序列。例如，大肠杆菌一般采用pBR322 来转化，后者是一个来自一种大肠杆菌种属的质粒(参见，如，Bolivar 等人，1977)。PBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此可 以为鉴定转化细胞提供很容易的手段。pBR质粒，或其它微生物质粒或 噬菌体也必须含有，或被修饰后含有，可被原核微生物表达使用的启 动子。
这些启动子大多数普遍用在重组DNA构建物中，包括β-内酰胺酶 (青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人，1978；Itakura等人，1977； Goeddel等人，1979)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，1979； EP-A-0 036 776)。除了这些被最普遍使用的以外，其它微生物启动子 也已经被发现和使用，关于其核苷酸序列的详细情况也已经被发表， 从而使专业技术人员能够用质粒载体将它们功能性的连接在一起 (Siebwenlist等人，1980)。来自原核生物的某些基因可能在大肠杆菌 中通过其自体的启动子序列而被有效的表达，这就排除了通过人工的 方法加入其它启动子的需求。
除了原核生物，可以使用真核微生物，如酵母培养物也可以使用， 在此该启动子应该能够驱动表达。酿酒酵母，或普通的面包酵母是真 核微生物中最普遍使用的，尽管许多其它的菌株也普遍可以获得。例 如，为了在酵母属中进行表达，经常使用质粒YRp7(Stinchcomb等人， 1979；Kingsman等人，1979；Tschemper等人，1980)。这种质粒已经 含有trpl基因，该基因可为不能在色氨酸中生长的酵母突变株提供一 个选择性标记物，例如ATCC 44076或PEP4-1(Jones，1977)。作为酵 母宿主细胞基因组的特征，trpl区受到破坏的存在使细胞在缺乏色氨 酸的环境下的生长为检测转化提供了一个有效的环境。
在酵母载体中合适的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等 人，1980)或其它糖分解酶(Hess等人，1968；Holland等人，1978)， 如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸 果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶， 磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，以及糖激酶的启动子。在构建 合适的表达载体过程中，与这些基因有关的终止序列也连接入表达载 体中，在上述期望表达的序列的3’端提供mRNA多腺苷化和终止作用。
具有生长条件控制转录的又一优点的其它启动子，是乙醇脱氢酶 2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，和前面提到 的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及利用麦芽糖和半乳糖的酶的启动区。任 何含有酵母相容性启动子，复制起点和终止序列的质粒载体都是合适 的。
除微生物以外，来自多细胞生物体的细胞培养物也可作为宿主。 原则上，任何这样的细胞培养物均是可使用的，无论是来自脊椎动物 或无脊椎动物培养物。但最大的兴趣在脊椎动物细胞，培养的脊椎动 物(组织培养)的增殖近年来已经成为一个常规的方法(Tissue Culture(组织培养)，1973)。这种有用的宿主细胞系的实例是VERO和 HeLa细胞，中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)，和W138，BHK，COS-7 293， Spodoptera frugiperda(SF)细胞(可作为完全表达系统从i.a. Protein Sciences，1000 Research Parkway，Meriden，CT 06450，美 国以及Invitrogen的商业渠道获得)，以及MDCK细胞系。在本发明中， 一种特别优选的细胞系是可从Invitrogen，PO Box 2312，9704 CH Groningen，荷兰，获得的S2。
这些细胞的表达载体通常包括(如果需要)一个复制起点，一个位 于要表达的基因前面的启动子，连同任何必需的核糖体结合位点，RNA 剪接位点，多聚腺苷化位点，和转录终止子序列。
为了在哺乳动物中使用，表达载体上的控制功能经常是由病毒材 料来提供的。例如，通常使用的启动子来源于多瘤病毒，腺病毒2，以 及最常用的猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子是特别有 用的，因为两者都很容易从病毒中作为一个片段获得，该片段也含有 SV40病毒复制起点(Fiers等人，1978)。也可使用更小或更大的SV40 片段，只要它包括位于病毒复制起点中的从HindIII位点延伸至BglI 位点的大约250bp序列。进一步，也可能，经常希望，使用一般与所 需基因序列相关的启动子或控制序列，只要这样的控制序列与宿主细 胞系统相容。
一个复制起点可以通过构建包含一个外源起点的载体提供，例如 可能来自SV40或其它病毒(如，多瘤病毒，腺病毒，VSV，BPV)，或通 过宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体被整合进入宿主细胞染色 体中，后一机制经常是足够的。
有用类似物的鉴定
对于专业技术人员来说，很明显不是所有可能的突变体或天然发 生的对致淀粉状蛋白产生多肽的修饰作用将有能力在动物中诱发产生 可与天然形式交叉反应的抗体。但是，对修饰的致淀粉状蛋白产生多 肽建立一个有效的标准筛选试验并不困难，该试验可满足对在此所述 免疫学反应性的最小需求。因此，本发明的另一部分是关于一种鉴定 一个修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的方法，该多肽能够在一个该种动 物中诱导产生针对未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的抗体，其中未修 饰的致淀粉状蛋白产生多肽是一个(无免疫原性的)自体蛋白，该方法 包括：
一通过肽合成或基因工程技术的方法来制备一组相互不同的修饰 的致淀粉状蛋白产生多肽，其中已经将氨基酸添加、插入、删除或替 代该种动物的致淀粉状蛋白产生多肽的氨基酸序列，因此引起该组中 的氨基酸序列发生变化，其中包含对该种动物是外源的T细胞抗原决 定簇，或制备一组编码该组相互不同的修饰的致淀粉状蛋白产生多肽 的核酸片段，
—检测该组修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的成员或核酸片段的成 员是否具有在该种动物体内诱导出针对未修饰的致淀粉状蛋白产生多 肽的抗体产生的能力，和
—鉴定和选择性的分离该组修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的成 员，该多肽可明显地诱导该种动物未修饰抗致淀粉状蛋白产生多肽的 抗体的产生或鉴定和选择性的分离多肽表达产物，该表达产物是由能 够明显诱导该种动物抗未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的抗体产生的 该组核酸片段的成员所编码的。
在本文中，“一组相互不同的修饰的致淀粉状蛋白产生多肽”是不 相同的修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的集合，它们可以以上述讨论的 标准为基础来筛选(如，结合圆二色法，核磁共振波谱，和/或X线衍 射图形的研究)。该组可仅由几个成员组成，但也可以考虑该组包含几 百个成员。
该组成员的检测最终可在体内进行，但也可应用许多体外检测来 缩小将用于本发明目的的修饰分子数目。
因为引入外源T细胞抗原决定簇的目的是通过T细胞的辅助来支 持B细胞反应，所以一个首要条件是通过修饰的致淀粉状蛋白产生多 肽来诱导T细胞的增殖。T细胞的增殖可通过标准的体外增殖试验来检 测。简言之，一个富含T细胞的样品可从一个受试者中获得，然后以 培养物保存。培养的T细胞与受试者的抗原呈递细胞接触，其中抗原 呈递细胞此前已经摄取了修饰的分子，并处理该分子而且呈递其T细 胞抗原决定簇。T细胞的增殖被监测，并与合适的对照(如，与曾处理 过完整的、天然的致淀粉状蛋白产生多肽的抗原呈递细胞接触过的培 养的T细胞)相比较。可以选择的是，增殖可以通过确定T细胞在识别 外源T细胞发生反应中释放的相关细胞因子的浓度来测量。
如果认为每个类型组中至少一种修饰的致淀粉状蛋白产生多肽具 有诱导抗致淀粉状蛋白产生多肽的抗体产生的能力是高度可能的，那 么就可能制备一种免疫原性组合物，其中包括至少一种能够在一种动 物中诱导抗未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽的抗体产生的修饰的致淀 粉状蛋白产生多肽，其中未修饰的致淀粉状蛋白产生多肽是一种自体 蛋白，该方法包括将该组的成员混合，这些成员可明显地在该种动物 中诱导抗体的产生，这些抗体与淀粉状蛋白带有一个药学和免疫学上 可以接受的运载工具和/或载体和/或稀释剂和/或赋形剂，也可任选与 至少一个药学和免疫学可接受的佐剂联合使用的致淀粉状蛋白产生多 肽能够反应。
本发明上述关于多肽组检测的方面可以很便利地进行，其过程是 先制备许多相互不同的本发明的核酸序列或载体，将它们插入至合适 的表达载体中，用载体转化合适的宿主细胞(或宿主动物)，并实现本 发明核酸序列的表达。这些步骤之后是分离表达产物。优选核酸序列 和/或载体通过下面的方法制备，即包括使用一种分子扩增技术，如PCR 或通过核酸合成的方法。
特异的致淀粉状蛋白产生的靶位
除了与阿尔兹海姆病，β-淀粉状蛋白前体蛋白(APP)，载脂蛋白 E4(ApoE4)和Tau蛋白最常有关的蛋白以外，还有许多其它蛋白以某 种方式与AD相联系，或是通过直接存在于AD脑中的斑或缠结中，或 与AD发生的危险性增加有明显的遗传相关性。如果不是全部，这些抗 原的大多数均与在本发明中假定的靶蛋白在一起，即上述讨论的Aβ， APP，衰老蛋白和ApoE4。
αl-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)是丝氨酸蛋白酶超家族的一个主要部 分，被认为在AD病变和脑血管淀粉状蛋白变性(CA)(Acta neuropathol， 1998，96：628-36)所引起伤害的发病机制中具有重要作用。它与Aβ在体 外相互作用，并激发Aβ-42原纤维的形成和崩解(JBC，1998， 273：28360-4)。
α2-巨球蛋白是通过免疫染色在AD脑的斑核心中发现的。在斑核 心中发现β亚单位的跨膜片段，而可溶性的α片段则在斑中细胞外发现。 Acta neuropathol，1998，96：628-36和Brain Res.，1997，777： 223-227。
ABAD(Aβ-肽结合乙醇脱氢酶)与Aβ在细胞内结合。它是一个存在于 正常细胞中的神经元酶，但在AD累及的神经元中过度表达。Aβ对过度 表达ABAD的细胞具有更大的毒性。ABAD与X染色体连锁。Yan，1997， Nature 389。
APLP1和-2(淀粉状蛋白前体蛋白样蛋白1和-2)：两种蛋白都属于 淀粉状蛋白前体蛋白同源性超家族蛋白，但缺少Aβ肽区。虽然如此， 在神经炎性斑中仍具有明显的APLP染色。Acta Neuropathol，1997， 94：519-524。
AMY117是一个在AD人群的脑中斑样病变中新近发现的蛋白，看上 去似乎很丰富，很广泛，并对这种疾病是“高度特异的”。猜测该蛋白 AMY117可能在AD的发生和发展过程中通过形成这些斑而具有重要的 作用。有趣的是，含有AMY117的斑与那些含有Aβ的斑不具有相同的定 位，因此表明除了已知的含有Aβ的斑和含有Tau的缠结之外，还有一 个AD的新的特征性表现。AMY117阳性斑被发现在AD散发性病例的脑 中以及唐氏综合征病人的脑中很丰富，但在对照组以及其它神经变性 疾病的脑中却“很少或缺如”(Am J Pathol 1997；151：69，80)。
Bax：单克隆抗体已经检测到Bax是AD脑中老年斑(SP)的成分 之一。在营养障碍性轴突中也过度表达。Acta Neuropathol. 1998，95：407-412。
Bcl-2的作用不清楚。在斑周围的神经胶质细胞中过度表达。Acta Neuropathol.1998，95：407-412。
博莱霉素水解酶可能是一个β-分泌酶。在AD的SP中已经发现有 抗博莱霉素水解酶的免疫反应性(Brain Res.1999，830：200-202)。在 某些病例中一种特定的博莱霉素水解酶基因型与AD发生的危险性增加 有关，而在其它疾病中却已经发现没有关联(Ann Neurol，1998，44： 808-811和Ann Neurol，1999，46：136-137)。
BRI/ABRI：ABRI是一个被公认的跨膜蛋白的4kD片段，由在第 13号染色体上的BRI基因编码，发现于家族性性不列颠痴呆(FBD)患者 的淀粉状蛋白斑中。这些患者在BRI基因的终止密码子上有一个突变， 产生一个更长的开放阅读框。改变蛋白的34个羰基末端氨基酸的释放 可产生ABRI淀粉状蛋白亚单位。ABRI抗体可识别FBD患者脑中的实质 和血管病变。ABri沉积为淀粉状蛋白原纤维，产生的斑被认为可引起 神经元功能障碍和痴呆，而这些均是FBD的特征(Vidal，R等人，1999， Nature 399)。
嗜铬粒蛋白A已经在一些弥漫性淀粉状蛋白沉积物中和围绕沉积 物的营养障碍性轴突中发现(Brain Res.，1991，539：143-50)。
簇连蛋白(Clusterin)/apoJ：它是一个经常可在不同的分子生物 学领域的实验室中通过差示筛选分离的基因，因为它在多种变性疾病 如AD和瘙痒症的病例中是过度表达的(Biochem J 1997 11月15日； 328(1)：45-50 Michel D，Chatelain G，North S，Brun G)。
CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)结合蛋白可结合41 aa CRF肽， 后者是脑中应激反应中的一个重要调节因子。因为大多数CRF是由CRF 结合蛋白结合的，去除CRF结合蛋白(通过免疫治疗方法)可导致游离 CRF水平升高，相信这样对AD具有积极的效应。Behan，1997， J.Neurochemistry，68：2053-2060。
EDTF(内皮细胞毒性因子)：一个由AD患者微血管产生的蛋白。它 对神经元细胞具有特殊的毒性。WO 99/24468。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖已经显示在SP中与Aβ具有共同的定位。大 鼠的研究表明硫酸乙酰肝素粘聚糖对于淀粉状蛋白原纤维的形成是必 须的(Neuron，1994，12：219-234和Acta neuropathol，1998， 96：628-36)。
人老衰蛋白反应介导蛋白-2(Human collapsin response mediator protein-2)是一个在神经原纤维缠结中被一个单克隆抗体 识别的65kDa蛋白。整合进缠结中可能去除了可溶性的蛋白，并引起 异常的轴突生长，因此加速了神经元的变性。JBC，1998，273：9761-8。
Huntingtin(亨廷顿病蛋白)：在HD中，Huntingtin蛋白的N末端 是以聚谷氨酰胺延伸的。Huntingtin的这种形式也在AD脑的NFT和皮 克病中发现(Exp.Neurol，1998，150：213-222)。
细胞间黏附分子1在SP中堆积。Acta neuropathol，1998，96： 628-36和Am.J Pathol.1994，144：104-16。
白介素6与神经原纤维的改变有关，发现位于斑的中央。它被认 为是AD中的一个触发事件。在星形胶质细胞中可被Aβ活性肽25-35 强烈扩增。Brain Res.，1997，777：223-227和Behav Brain Res， 1996，78：37-41。
溶酶体相关抗原CD 68可被NFT和SP中的KP-1抗体识别。因此， 溶酶体在缠结和斑的形成中可能具有一定的作用。Dement Geriatr Cogn Disord，1998，9：13-19。
P21 ras作为一个基本的步骤参与在AD发展早期可见到的生长因 子和有丝分裂原水平的升高。Neuroscience，1999，91：1-5。
PLC-δ1(磷脂酶C同工酶δ1)在NFT和斑核心周围的轴突中是异常积 累的。它是位于细胞内的。Alzheimer Dis Assoc Disord，1995，9： 15-22。
血清淀粉状蛋白P组分(SAP)是一个存在于所有淀粉淀粉状蛋白沉 积物，包括AD的淀粉状蛋白中的正常血浆组分(JBC，1995， 270：26041-4)。它在SP和NFT中都可观察到。在一些研究中显示它可 以促进Aβ的聚集，并阻止原纤维的蛋白水解(Biochem Biophys Res Commun，1995，211：349v-53和PNAS，1995，92：4299-4303)，而其它的 研究表明SAP可抑制Aβ原纤维的形成(JBC，1995，270：26041-4)。
突触小泡蛋白已经在一些弥漫性淀粉状蛋白淀粉状蛋白沉积物和 其周围的营养障碍性轴突中被检测到。(Brain Res，1991，539：143-50)。
共核蛋白(Synuclein)(α-synuclein或非Aβ蛋白的成分的前体 蛋白(NACP))：AD淀粉状蛋白的非Aβ组分(NAC)作为从AD患者的脑 组织中纯化的淀粉状蛋白的第二个主要成分被生化鉴定。NAC，来自其 140个氨基酸长的前体NACP，至少有35个氨基酸的长度(NAC35)，尽 管其氨基末端并未明确确定。一个NAC单克隆抗体可免疫染色AD脑中 的SP，但不与NACP反应(Biochemistry 34(32)：10139-10145(1995 年8月15日)Iwai A，Yoshimoto M，Masliah E，Saitoh T)。NAC在 Aβ存在时是一个自体寡聚体。新的证据指出这个分子在淀粉状蛋白样 原纤维形成和线粒体功能障碍引起的突触损害和神经毒性中具有潜在 的作用。Brain Pathol 1999 10月；9(4)：707-20。FEBS Lett，1998，421： 73-76。一部分NACP与APP的C末端淀粉状蛋白片段和瘙痒症朊病毒 蛋白(PrPSc)的一个区域具有高度的同源性。共核蛋白是帕金森病中的 一个主要致病因素(Chem Biol，1995，2：163-9)。
TGF-b1(转化生长因子b1)：在TG小鼠中TGF-b1与突变APP的过 度表达可加速Aβ的沉积。因此，人们相信TGF-b1涉及启动和促进淀粉 状蛋白斑的形成(Wyss-Coray，1997，Nature 389)。
其它淀粉状蛋白疾病和与其相关的蛋白
除了上述提及的潜在性参与AD和AD样疾病的蛋白(亨廷顿病，帕 金森病，FBD和其它形式的痴呆)，还存在除了AD以外的相对大量的疾 病，其中淀粉状蛋白淀粉状蛋白的形成涉及触发疾病或引起疾病的症 状。虽然涉及这些疾病的蛋白在性质上不同，但它们具有定义淀粉状 蛋白的同样的特征淀粉状蛋白，参看上文。下表列出了许多这样的淀 粉状蛋白疾患和引起这些疾病的蛋白。
         淀粉状蛋白的原纤维蛋白的多样性   临床症状                                   原纤维亚单位                             前体结构 脑淀粉状蛋白血管病 (CAA) Aβ 所有均是β 单克隆蛋白系统性 (AL)淀粉状蛋白变性 Ig轻链V结构域的全 长或片段 所有均是β 反应性系统性(AA)淀 粉状蛋白变性 淀粉状蛋白A的N末 端76残基片段 α/β 家族性淀粉状蛋白性 多神经病 甲状腺运载蛋白变异 体的全长或片段 所有均是β 遗传性ApoA1淀粉状 蛋白变性 ApoA1变异体的N末端 片段(～90个残基) (α/β) 遗传性溶菌酶淀粉状 蛋白变性淀粉状蛋白 全长溶酶体变异体 α+β II型糖尿病 胰岛-淀粉状蛋白多 肽的37残基片段 未知 胰岛素相关的淀粉状 蛋白 全长的野生型胰岛素 α+β 传播性海绵状脑病 朊病毒蛋白的全长或 片段 α+β 甲状腺髓样癌 降钙素的片段 未知 老年性系统性淀粉状 蛋白变性淀粉状蛋白 甲状腺运载蛋白的全 长或片段 所有均是β 血液透析相关的淀粉 状蛋白变性淀粉状蛋 白 全长，野生型β-2微球 蛋白 所有均是β 孤立性心房淀粉状蛋 白变性淀粉状蛋白 心房利钠因子 未知 遗传性脑淀粉状蛋白 血管病 胱蛋白酶变异体的 110残基片段 α+β 芬兰遗传性淀粉状蛋 白变性淀粉状蛋白 胶溶素变异体的71残 基片段 α/β 遗传性血纤蛋白原a- 链淀粉状蛋白变性淀 粉状蛋白 血纤蛋白原a-链变异 体片段  未知
这些蛋白，类似在AD中涉及的蛋白，所有均是在此所建议的免疫 方法的潜在靶位。
可以考虑的是对致淀粉状蛋白产生多肽进行免疫的大多数方法应 该限制在产生与天然致淀粉状蛋白产生多肽具有交叉反应的抗体的免 疫反应中。然而，在某些病例中，重要的是针对从致淀粉状蛋白产生 多肽呈递了MHC I型抗原决定簇的细胞以CTL反应的形式诱导细胞免 疫—这在那些病例中是有利的，其中产生致淀粉状蛋白产生多肽的细 胞数目减少不会引起严重的反作用。在需要CTL反应的这些病例中， 优选应用申请者的PCT/DK99/00525(对应于USSN 09/413,186)中的教 导内容。这两个文件的公开内容在此引入作为参考。
在下列非限制性的实施例中，重点是开发一种针对AD的以Aβ为基 础的自体疫苗。但是，在此所提出的原理可同样地应用于任何淀粉状 蛋白。
实施例1
针对AD免疫的白体疫苗接种方法
敲除Aβ蛋白的小鼠不显示任何异常或不利的副作用的事实表明， 删除Aβ或降低Aβ的量是安全的，Zheng H.(1996)。
已发表的转基因动物被转基因人Aβ蛋白免疫的试验表明，如果可 能打破自体耐受，Aβ的下调可通过自体反应抗体来实现。这些试验进 一步表明这样的Aβ下调将有潜力预防斑的形成，并清除脑中已经形成 的Aβ斑，参看，Schenk等人，(1999)。但是，传统上，不可能出现抗 自体蛋白的抗体。
已发表的数据没有提供打破针对真正的自体蛋白的真正的自体耐 受的方法。数据也没有提供任何关于怎样保证免疫反应仅仅针对或主 要针对Aβ沉积物的信息，而不是针对结合Aβ前体蛋白(APP)的细胞膜 的信息，如果这被认为是必要的话。采用已有的技术产生的免疫反应 大概会以一种不可调节的方式产生针对自体蛋白的免疫反应，所以可 能会产生针对Aβ蛋白部分的不需要的、过度的自体反应。因此，采用 已有的免疫方法最大的可能性是不能产生针对自体蛋白的强烈的免疫 反应，并且进一步来说，由于对结合在细胞膜上的APP的潜在强烈交 叉反应，因此是不安全的，其中APP存在于中枢神经系统中的大量细 胞上。
本发明提供了可有效产生强烈的可调节的针对真正的自体蛋白的 免疫反应的方法，该自体蛋白在中枢神经系统或机体的其它部分中可 形成斑并引起严重的疾病。将采用这种技术来开发一种用于治疗AD的 安全有效的人Aβ蛋白治疗性疫苗。
就此而言，可能预计到AD，即一种预计在下个世纪削弱卫生保健 系统的疾病，可能被治愈，或者所描述的这种疫苗至少可建立一种治 疗这种疾病的症状和发展的有效治疗方法。
这种技术代表了一种阻断淀粉状蛋白在AD以及其它神经性疾病中 沉积的全新的免疫学方法。  
在下表中，简要说明了35个考虑过的构建物。在表中给定的所有 位置都是相对于APP的起始蛋氨酸，即甲硫氨酸(SEQ ID NO：2中的第 一个氨基酸)，包括起始和终止氨基酸，例如672-714片段包括氨基酸 672和714。P2和P30的起始和终止位置表明，在指明的位置上抗原决 定簇替代了一部分APP片段(两个位置也包括在替代物中)—在大多数 构建物中，引入的抗原决定簇替代了抗原决定簇长度的片段。表中的 星号具有以下含义：
*)P2和P30仅有一个位置指示抗原决定簇已经在指示位置中 (抗原决定簇在给定的位置附近的氨基酸C末端开始)被插入至APP衍 生物。
**)构建物34含有3个相同的、分别被P30和P2分隔的APP片 段。
***)构建物35含有9个相同的、交替被P30和P2抗原决定簇分 隔的APP片段。
                          APP AutoVac构建物  变异体编  号   相对APP   aal的APP   片段起始   点   相对APP   aal的APP   片段终止   点   相对APP aal   的P2抗原决定   簇位置   相对APP aal的   P30抗原决定簇   位置     分子长度     1     630     770      656-670     635-655     141     2     630     714      656-670     635-655     85     3     672     770      735-749     714-728     99     4     672     770     714-728     99     5     672     770      714-728     99     6     672     770      723*     723*     135     7     672     770     723*     120     8     672     770      723*     114     9     672     714     672*     64     10     672     714     714*     64     11     672     714      672*     58     12     672     714      714*     58     13     672     714      714*     672*     79     14     672     714      680-694     43     15     672     714      685-799     43     16     672     714      690-704     43     17     672     714      695-709     43     18     672     714     675-695     43     19     672     714     680-700     43     20     672     714     685-705     43     21     672     714     690-710     43     22     672     714      680*     680*     79     23     672     714      690*     690*     79     24     672     714      700*     700*     79     25     672     714      710*     710*     79     26     672     714     680*     64    27   672    714   690*    64    28   672    714   700*    64    29   672    714   710*    64    30   672    714    680*    58    31   672    714    690*    58    32   672    714    700*    58    33   672    714    710*    58    34   672    714    在rep.1**后   在rep.2**后    165    35   672    714    34×3*   34×3***    165
紧靠最可能产生反应的片段的APP部分是43个氨基酸的Aβ核心肽 (Aβ-43，与SEQ ID NO：2对应，相当于残基672-714)，它是AD脑中淀 粉状蛋白斑的主要成分。这个APP片段是上面所列的所有构建物的一 部分。
变异体1和2包括一部分APP，在Aβ-43上游，其中已经放置了模 式抗原决定簇P2和P30。变异体1和3-8均包括C-100片段，该片段 显示是有神经毒性的-C-100片段对应于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基 714-770。在变异体3-5中，抗原决定簇替代了C-100的一部分，而在 变异体6-8它则已经插入至C-100中。
变异体9-35仅含有核心Aβ-43蛋白。在变异体9-13中，P2和P30 被融合至Aβ-43的任意一个末端中；在14-21中，P2和P30替代了 Aβ-43部分；在22-23中，P2和P30被插入至Aβ-43中；34含有三个 相同的、分别被P30和P2相隔的Aβ-43片段；35含有9个交替被P2 和P30抗原决定簇分隔的Aβ-43重复片段。
详细情况见上面的图1和表。
特别优选构建物的另外类型。因为本发明的一个目标是需要删除 Aβ而避免破坏产生APP的细胞，所以制备仅包括部分Aβ的自体疫苗构 建物似乎是可行的，该构建物当存在于APP中时不暴露在细胞外相中。 因此，这样的构建物需要含有至少一个B细胞抗原决定簇，该表位来 自由在SEQ ID NO：2中的700-714氨基酸确定的氨基酸片段。
因为这样的一个短多肽片段预计仅有微弱的抗原性，因此优选这 样的一个自体疫苗构建物，其中该构建物含有B细胞抗原决定簇的几 个拷贝，如以具有在本发明详细公开内容中的式I中所显示结构的构 建物的形式存在，参看前文。在式I的这个版本中，术语amyloide1- amyloidex淀粉状蛋白淀粉状蛋白是x个含有来自SEQ ID NO：2中的 700-714氨基酸的氨基酸序列的B细胞抗原决定簇。一个优选的选择是 上述所详细描述的将淀粉状蛋白产生(多)肽和选择出的外源T辅助细 胞抗原决定簇经酰胺键偶联至一个多糖载体分子上的可能性—用这种 方法，使由SEQ ID NO：2中的700-714氨基酸构成的“微弱的”抗原 决定簇的多种呈递作用成为可能，并且在B细胞和T细胞抗原决定簇 之间选择一个最佳的比例也成为可能。 实例2
根据本发明用Aβ和修饰蛋白对转基因小鼠进行免疫
构建编码hAB43+-34的DNA。用几个步骤来构建hAB43+-34基因。 首先用引物ME#800(SEQ ID NO：9)作为模板，用引物ME#801(SEQ ID NO：10)和引物ME#802(SEQ ID NO：11)产生一个PCR片段。ME#800编 码具有大肠杆菌优化密码子的人abeta-43片段。ME#801和802在片段 中加入了适当的限制性位点。
纯化PCR片段，用NcoI和HindIII消化，再次纯化并克隆进 NcoI-HindIII消化和纯化的pET28b+大肠杆菌表达载体中。得到的编 码野生型人Aβ-43的质粒称为pAB1。
在下面的步骤中，T辅助细胞抗原决定簇，P2，加入至该分子的C 末端。引物ME#806(SEQ ID NO：12)含有编码P2抗原决定簇的序列， 因此通过PCR反应产生了一个P2和Abeta-43的融合体。
采用pAB1作为模板，通过引物ME#178(SEQ ID NO：8)和ME#806 制备一个PCR片段进行克隆。纯化片断，用NcoI和HindIII消化，再 次纯化并克隆进NcoI-HindIII消化和纯化的pET28b+载体中。得到的 质粒称为pAB2。
以类似的方式，制备了另一个质粒，该质粒包含了Aβ-43编码序 列以及加入至N末端的另一个T辅助细胞抗原决定簇，P30。这个过程 可以通过采用pAB1为模板，以引物ME#105(SEQ ID NO：7)和ME#807(SEQ ID NO：13)制备一个PCR片段来完成。
纯化片段，用NcoI和HindII消化，再次纯化，并克隆进 NcoI-HindIII消化和纯化的pET28b+载体中。得到的质粒称为pAB3。
在第三步中，第二个Aβ-43重复序列通过引物ME#809(SEQ ID NO：14)从C末端加入至质粒pAB2的P2抗原决定簇上。同时ME#809 在Aβ-43重复序列后立即产生一个BamHI位点。采用pAB2作为模板， 用引物ME#178和ME#809制备一个PCR片段。用NcoI和HindIII消化 该片段，纯化并克隆进经NcoI-HindIII消化和纯化的pET28b+载体中。 该质粒称为pAB4。
最后，来自pAB3的P30抗原决定簇-Aβ-43重复序列被克隆进 pAB4质粒中。这个过程可以采用pAB3为模板，用引物ME#811(SEQ ID NO：16)和ME#105制备一个PCR片段来完成。纯化该片段，在随后的采 用pAB3作为模板的PCR中与ME#810(SEQ ID NO：15)一起用作引物。 纯化得到的片段，用BamHI和HindIII消化，并克隆进BamHI-HindIII 消化和纯化的pAB4质粒中。得到的质粒，pAB5，编码hAB43+-34分子。
所有的PCR和克隆步骤均主要参看Sambrook，J.，Fritsch，E.F. & Maniatis，T.1989“Molecular cloning：a laboratory manual(分 子克隆：实验室指南)”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory， 纽约。
对于所有的克隆步骤，使用的是大肠杆菌K-12细胞和Top-10 F’ 菌株(Stratagene，美国)。pET28b+载体购自Novagen，美国。所有引 物由丹麦的DNA Technology合成。
hAB43+-34的表达和纯化。如pET28b+系统提供商(Novagen)所描述 的，由pAB5编码的hAB43+-34蛋白在BL21-Gold(Novagen)大肠杆菌 细胞中表达。
洗涤包涵体，并在在6M尿素存在的条件下，使用BioCad纯化工 作台(PerSeptive Biosystem，美国)进行阳离子交换色谱纯化表达的 hAB43+-34蛋白，使纯度高于85％。然后通过在一个尿素含量逐渐降低 的溶液中进行逐步透析去除尿素。最终的缓冲液为10mM Tris，pH8.5。
免疫作用研究。在研究中使用人APP(阿尔兹海姆前体蛋白)转基因 小鼠。这些小鼠，称为TgRND8+，表达APP的一种突变形式，可导致在 鼠脑中高浓度的Aβ-40和Aβ-42(Janus，C.等人)。
小鼠(每组8-10只小鼠)用Abeta-42(SEQ ID NO：2，残基673-714， 用一种标准的Fmoc方法合成)或hAB43+-34变异体(实施例1所含的表 中的构建物34，重组产生)免疫4次，时间间隔为两周。剂量为Aβ100mg 或hAB43+-34 50mg。小鼠在第43天(3次注射后)和第52天后(4次注 射后)被放血，采用一种针对Aβ-42的ELISA法来确定血清中抗Aβ-42 的特异性效价。
下表显示了抗Abeta-42的平均相对滴度。    免疫原 第43天(3次免疫后) 第52天(4次免疫后)    Aβ-42         4000       3000    hAB43+-34        16000       23000
很清楚的是，当用hAB43+-34Aβ变异体免疫时，获得的抗体效价 在3和4次免疫后，较采用未改变的野生型Aβ-42作为免疫原获得的 效价分别高大约4倍和7.5倍。当考虑用于免疫的变异体的量仅为用 于免疫的野生型序列量的50％这一实际情况时，这一事实可进一步认为 是正确的。
实施例3
采用激活的多聚-羟基聚合物作为交联剂合成一个Aβ肽共聚物疫 苗
引言。一个传统的结合疫苗由共价偶联于一个载体蛋白上的肽(多 肽)组成。该肽包含B细胞抗原决定簇(多个)和提供T辅助细胞抗原决 定簇的载体蛋白。但是，大多数载体蛋白作为T细胞抗原决定簇的来 源正常情况下是不相关的，因为总序列中仅一小部分含有相关的T辅 助细胞抗原决定簇。这些抗原决定簇可被确定和合成为肽，例如12-15 个氨基酸的肽。如果这些肽与含有B细胞抗原决定簇的肽共价结合， 例如通过一个多价的激活的多聚-羟基聚合物，就可以获得一个仅含有 相关部分的疫苗分子。进一步而言，就可能提供含有优化比例的B细 胞和T细胞抗原决定簇的一个疫苗结合物。
激活的多聚-羟基聚合物的合成。多聚-羟基聚合物，例如葡聚糖、 淀粉、琼脂糖等，可用2，2，2-三氟乙磺酰氯(tresyl氯化物)来激活， 或通过同质合成(葡聚糖)方法，溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中；或通 过异质合成(淀粉，琼脂糖，交联葡聚糖)方法，例如溶解在丙酮中。
将225毫升干燥的N-甲基吡咯烷酮(NMP)在干燥条件下加入至冻 干的、水溶性的葡聚糖(4.5克，83毫摩尔，临床级，重均分子量(平 均)78000)中，置于一个500毫升的圆底烧瓶中并加入一个搅拌磁体。 烧瓶置于60℃油浴中并进行磁力搅拌。温度升高至92℃，处理超过20 分钟。当葡聚糖溶解时，将烧瓶立即从油浴中移出，油浴中的温度降 至40℃。将烧瓶再次置于油浴中，仍然进行磁力搅拌，逐滴加入tresyl 氯化物(2.764毫升，25毫摩尔)。15分钟后，逐滴加入干燥的吡啶(无 水的，2.020毫升，25毫摩尔)。将烧瓶从油浴中移出，在室温中搅拌 1小时。将产物(Tresyl激活的葡聚糖，TAD)在1200毫升冷乙醇(99.9％) 中沉淀。倒出上清液，将沉淀收集在50毫升聚丙烯离心管中，2000rpm 离心。沉淀溶解在50毫升0.5％乙酸中，在5000毫升0.5％乙酸中透析 两次，并冻干。TAD作为冻干粉末可储存在-20℃。
不溶的多聚-羟基聚合物，如琼脂糖或交联葡聚糖可以是tresyl 激活的，通过制备一种例如在丙酮中的多聚-羟基聚合物悬浮液，并作 为一种固相合成法进行合成。激活的多聚-羟基聚合物可通过过滤来收 集。合适的方法有报道，例如Nilsson K和Mosbach K(1987)，Methods in Enzymology(酶学方法)135，67页和Hermansson GT等人(1992)， “Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press， Inc.，87页。
A Beta肽共聚物疫苗的合成。TAD(10毫克)溶解在100微升水和 1000微升碳酸盐缓冲液中，后者pH9.6并含有5毫克Aβ-42(SEQ ID NO：2，残基673-714)，然后加入2.5毫克P2(SEQ ID NO：4)和2.5毫 克P30(SEQ ID NO：6)。Aβ-42和P2和P30肽均含有保护的赖氨酸基团： 它们的形式是1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己烷基-1-基亚基)乙基 (Dde)保护的赖氨酸基团。肽通过标准的Fmoc方法制备，其中常规的 Fmoc-Lys(Boc)-OH被Fmoc-Lys(Dde)-OH(从Novabiochem获得，目录 号04-12-1121)替代，即赖氨酸中的ε-氨基基团被Dde而不是Boc保 护。
测定pH值并用1M HCL调整至9.6。室温2.5小时后，加入80％的 肼溶液至肼终浓度为8％，溶液继续在室温下孵育30分钟，此后立即冻 干。冻干的产物溶解在水中，并在最后冻干前用水进行大量透析。
在终产物中，B细胞抗原决定簇(Aβ)和T辅助细胞抗原决定簇(P2 和P30)的比例可以通过在合成步骤中所使用的这些肽的不同浓度来 改变。而且，终产物可以被标记，例如，方法是通过在合成步骤中的 碳酸盐缓冲液中加入氨化甘露糖从而用甘露糖标记(为了将结合物靶 向抗原呈递细胞)。
如果一种不溶的激活的多聚-羟基聚合物用来结合含有B细胞抗原 决定簇和T辅助细胞抗原决定簇的肽，与该聚合物的偶联可以以固相 合成来进行，收集终产物，通过洗涤和过滤来纯化。
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                              序列表
                             序列列表 <110>法麦克萨有限公司 <120>下调淀粉状蛋白的新方法 <130>P1009PC1 <140> <141> <160>16 <170>PatentIn Ver.  3.0 <210>1 <211>2313 <212>DNA <213>人类 <220> <221>CDS <222>(1)..(2313) <220> <221>misc_feature <222>(2098)..(2169) <223>编码跨膜区的核苷酸 <220> <221>misc feature <222>(2014)..(2313) <223>编码C-100的核苷酸 <220> <221>misc_feature <222>(2016)..(2144) <223>Abeta 42/43 <220> <221>misc_feature <222>(2014)..(2142) <223>Abeta 42/43 <400>1 atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg gct cgg   48 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg   1               5                  10                  15 gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc   96 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
         20                  25                  30 cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag   144 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln
     35                  40                  45 aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat   192 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
 50                  55                  60 acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg   240 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65                   70                  75              80 cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac   288 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn
             85                  90                  95 tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg   336 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
        100                 105                 110 att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc   384 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
    115                 120                 125 gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc   432 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
130                 135                 140 gaa act cat ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag    480 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145                 150                 155                 160 aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg ttg ctg ccc tgc gga att    528 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
            165                 170                 175 gac aag ttc cga ggg gta gag ttt gtg tgt tgc cea ctg gct gaa gaa    576 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
        180                 185                 190 agt gac aat gtg gat tct gct gat gcg gag gag gat gac tcg gat gtc    624 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
    195                 200                 205 tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa    672 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210                 215                 220 gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag gtg gaa gaa gaa    720 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225                 230                 235                 240 gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa    768 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
            245                 250                 255 gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc agc att     816 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
        260                 265                 270 gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tct gtg gaa gag gtg gtt cga     864 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
    275                 280                 285 gag gtg tgc tct gaa caa gcc gag acg ggg ccg tgc cga gca atg atc     912 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
290                 295                 300 tcc cgc tgg tac ttt gat gtg act gaa ggg aag tgt gcc cea ttc ttt    960 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305                 310                 315                 320 tac ggc gga tgt ggc ggc aac agg aac aac ttt gac aca gaa gag tac    1008 Tyr Gly Gly cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
            325                 330                 335 tgc atg gcc gtg tgt ggc agc gcc atg tcc caa agt tta ctc aag act    1056 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr
        340                 345                 350 acc cag gaa cct ctt gcc cga gat cct gtt aaa ctt cct aca aca gca    1104 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
    355                 360                 365 gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag aca cct ggg gat    1152 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370                 375                 380 gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc    1200 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385                 390                 395                 400 aag cac cga gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gaa gag gca    1248 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
            405                 4l0                 415 gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa gct gat aag aag gca gtt atc    1296 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
        420                 425                 430 cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ttg gaa cag gaa gca gcc aac    1344 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn
    435                 440                 445 gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg    1392 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450                 455                 460 ctc aat gac cgc cgc cgc ctg gcc ctg gag aac tac atc acc gct ctg    1440 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465                 470                 475                 480 cag gct gtt cct cct cgg cct ogt cac gtg ttc aat atg cta aag aag    1488 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
            485                 490                 495 tat gtc cgc gca gaa cag aag gac aga cag cac acc cta aag cat ttc    1536 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe
        500                 505                 510 gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc gct cag atc cgg tcc    1584 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser
    515                 520                 525 cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag cgc atg aat cag tct    1632 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser
530                 535                 540 ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc gag gag att cag gat    1680 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545                 550                 555                 560 gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tca gat gac gtc    1728 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val
            565                 570                 575 ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat gct    1776 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
        580                 585                 590 ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg gag ctc ctt ccc    1824 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
    595                 600                 605 gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag ccg tgg cat tct ttt    1872 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe
610                 615                 620 ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag cct gtt    1920 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625                 630                 635                 640 gat gcc cgc cct gct gcc gac cga gga ctg acc act cga cca ggt tct    1968 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
            645                 650                 655 ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tct gaa 9tg aag atg gat    2016 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
        660                 665                 670 gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa ttg    2064 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
    675                 680                 685 gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gca atc att gga    2112 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690                 695                 700 ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg    2160 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705                 710                 715                 720 gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg    2208 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
            725                 730                 735 gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc cac ctg tcc aag atg    2256 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
        740                 745                 750 cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg    2304 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met
    755                 760                 765 cag aac tag                                                        2313 Gln Asn
770 <210>2 <211>770 <212>PRT <213>人类 <400>2 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg   l               5                  10                  15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
         20                  25                  30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln
     35                  40                  45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
 50                  55                  60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu  65                  70                  75                  80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn
             85                  90                  95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
        100                 105                 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
    115                 120                 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
130                 135                 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145                 150                 155                 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
            165                 170                 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
        180                 185                 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
    195                 200                 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210                 215                 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225                 230                 235                 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
            245                 250                 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
        260                 265                 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
    275                 280                 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
290                 295                 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305                 310                 315                 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
            325                 330                 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr
        340                 345                 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
    355                 360                 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370                 375                 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385                 390                 395                 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
            405                 410                 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
        420                 425                 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn
    435                 440                 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450                 455                 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465                 470                 475                 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
            485                 490                 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe
        500                 505                 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser
    515                 520                 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser
530                 535                 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545                 550                 555                 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val
            565                 570                 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
        580                 585                 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
    595                 600                 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe
610                 615                 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625                 630                 635                 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
            645                 650                 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
        660                 665                 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
    675                 680                 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690                 695                 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705                 710                 715                 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
            725                 730                 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
        740                 745                 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met
    755                 760                 765 Gln Asn
770 <210>3 <211>45 <212>DNA <213>破伤风杆菌 <220> <221>CDS <222>(1)..(45) <223>编码P2抗原决定簇的DNA <400>3 cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg    45 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu   1               5                  10                  15 <210>4 <2l1>15 <212>PRT <213>破伤风杆菌 <400>4 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu   l               5                  l0                  15 <210>5 <211>63 <212>DNA <213>破伤风杆菌 <220> <221>CDS <222>(1)..(63) <223>编码P30抗原决定簇的DNA <400>5 ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc    48 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser   1               5                  10                  15 gct agc cac ctg gaa                                                 63 Ala Ser His Leu Glu
         20 <210>6 <211>21 <212>PRT <213>破伤风杆菌 <400>6 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser   1               5                  10                  15 Ala Ser His Leu Glu
         20 <210>7 <211>21 <212>DNA <213>合成的 <400>7 caactcagct  tcctttcggg c                                            21 <210>8 <211>21 <212>DNA <213>合成的 <400>8 agatctcgat cccgcgaaat t                                             21 <210>9 <211>135 <212>DNA <213>合成的 <400>9 atggatgcag aattccgtca cgactccggt tacgaagttc accaccagaa actggttttc   60 ttcgcagaag atgttggttc caacaaaggt gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt    120 gttatcgcga cctag                                                     135 <210>10 <211>31 <212>DNA <213>合成的 <400>10 gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c                                   31 <210>11 <211>39 <212>DNA <213>合成的 <400>11 gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc                           39 <210>12 <211>84 <212>DNA <213>合成的 <400>12 ccggcaagct tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg    60 gtcgcgataa caacaccgcc aacc                                           84 <210>13 <211>101 <212>DNA <213>合成的 <400>13 gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgaaagttag    60 cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g                        101 <210>14 <211>172 <212>DNA <213>合成的 <400>14 gggccaagct tggatccggt cgcgataaca acaccgccaa ccatcagacc gatgattgca    60 cctttgttgg aaccaacatc ttctgcgaag aaaaccagtt tctggtggtg aacttcgtaa    120 ccggagtcgt gacggaactc tgcatccagc tcggtgatac cgatgaattt gg            172 <210>15 <211>30 <212>DNA <213>合成的 <400>15 ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc                                     30 <210>16 <211>35 <212>DNA <213>合成的 <400>16 gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta  gcttc                              35