固定在疏水改性多糖中的酶
阅读：582发布：2021-12-17
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1、一种生物阳极，其包含：
(a)电子导体；
(b)至少一种阳极酶，所述阳极酶能够与电子介体的氧化形式和燃料流体 反应产生燃料流体的氧化形式和电子介体的还原形式，电子介体的还原形 式能够向电子导体释放电子；和
(c)对燃料流体和电子介体可渗透的酶固定化材料；
其中所述酶固定化材料包含疏水改性多糖。
2、权利要求1的生物阳极，其中酶固定化材料包括电子介体。
3、一种生物阳极，其包含：
(a)电子导体；
(b)至少一种阳极酶，所述阳极酶能够与电子介体的氧化形式和燃料流体 反应产生燃料流体的氧化形式和电子介体的还原形式；
(c)对燃料流体和电子介体可渗透的酶固定化材料；和
(d)邻近电子导体的电催化剂，电催化剂的氧化形式能够与电子介体的还 原形式反应产生电子介体的氧化形式和电催化剂的还原形式，电催化剂的 还原形式能够向电子导体释放电子；
其中所述酶固定化材料包含疏水改性多糖。
4、权利要求3的生物阳极，其中酶固定化材料包含电子介体、电 催化剂、或电子介体和电催化剂。
5、一种生物阴极，其包含：
(a)电子导体；
(b)至少一种阴极酶，所述阴极酶能够与电子介体的还原形式和氧化剂反 应产生电子介体的氧化形式和水；和
(c)包含电催化剂、电子介体、或电催化剂和电子介体的酶固定化材料， 所述酶固定化材料是氧化剂可渗透的，电催化剂的氧化形式能够从电子导 体获得电子产生电催化剂的还原形式，电催化剂的还原形式能够与电子介 体的氧化形式反应产生电子介体的还原形式和电催化剂的氧化形式；和 其中所述酶固定化材料包含疏水改性多糖。
6、一种生物阴极，其包含：
(a)电子导体；
(b)至少一种阴极酶，所述阴极酶能够与电子介体的还原形式和氧化剂反 应产生电子介体的氧化形式和水；和
(c)包含电子介体的酶固定化材料，酶固定化材料是氧化剂可渗透的，电 子介体的氧化形式能够从电子导体获得电子产生电子介体的还原形式；和 其中所述酶固定化材料包含疏水改性多糖。
7、一种用于产生电的生物燃料电池，其包含：
燃料流体；
电子介体；
权利要求1-4中任一项的生物阳极；和
权利要求5或6的生物阴极。
8、一种用于产生电的生物燃料电池，其包含：
燃料流体；
电子介体；
权利要求1-4中任一项的生物阳极；和
阴极。
9、一种用于产生电的生物燃料电池，其包含：
燃料流体；
电子介体；
阳极；和
权利要求5或6的生物阴极。
10、权利要求1至9中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电 池，其中多糖包括脱乙酰壳多糖、纤维素、甲壳质、淀粉、直链淀粉、藻 酸盐、及其组合。
11、权利要求1至10中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电 池，其中疏水改性多糖能够使酶固定化和稳定化。
12、权利要求1至11中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电 池，其中疏水改性多糖具有胶束结构。
13、权利要求1至12中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电 池，其中酶固定化材料包含疏水改性藻酸盐。
14、权利要求13的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中疏水 改性藻酸盐采用比NH4+大的疏水阳离子改性。
15、权利要求14的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中疏水 阳离子包括基于铵的阳离子、季铵阳离子、烷基三甲基铵阳离子、有机阳 离子、鏻阳离子、三苯基鏻、吡啶鎓阳离子、咪唑鎓阳离子、十六烷基吡 啶鎓、乙锭、紫精、甲基紫精、苄基紫精、二(三苯基膦)亚胺、金属络合 物、联吡啶金属络合物、基于菲咯啉的金属络合物、[Ru(联吡啶)3]2+或[Fe(菲 咯啉)3]3+。
16、权利要求14的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中疏水 阳离子包括由式4表示的季铵阳离子：
其中R1、R2、R3和R4独立地为氢、烃基、取代烃基、或杂环，其中R1、 R2、R3和R4的至少之一不是氢。
17、权利要求16的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R1、 R2、R3和R4独立地为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、 辛基、壬基或癸基，其中R1、R2、R3和R4的至少之一不是氢。
18、权利要求16的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R1、 R2、R3和R4相同且为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。
19、权利要求16的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R1、 R2、R3和R4为丁基。
20、权利要求16的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R1、 R2、R3和R4之一为己基、辛基、癸基、十二烷基或十四烷基并且其它基 团独立地为甲基、乙基或丙基。
21、权利要求12的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中所述 胶束疏水改性多糖符合式1的结构式
其中n为整数；
R10独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体；且
R11独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体。
22、权利要求21的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中疏水 改性多糖具有的分子量为约90,000至约500,000。
23、权利要求21的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中疏水 改性多糖具有的分子量为约225,000至约275,000。
24、权利要求21的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R10 独立地为氢或烷基且R11独立地为氢或烷基。
25、权利要求21的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R10 独立地为氢或己基且R11独立地为氢或己基。
26、权利要求21的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R10 独立地为氢或辛基且R11独立地为氢或辛基。
27、权利要求21的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中R10 独立地为氢或疏水氧化还原介体且R11独立地为氢或疏水氧化还原介体。
28、权利要求21或27的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其 中疏水氧化还原介体为锇、钌、铁、镍、铑、铼或钴与1，10-菲咯啉(phen)、 2，2’-联吡啶(bpy)或2，2’，2”-三联吡啶(terpy)、亚甲绿、亚甲蓝、聚(亚甲绿)、 聚(亚甲蓝)、鲁米诺、硝基-芴酮衍生物、吖嗪、锇菲咯啉二酮、儿茶酚- 侧基三联吡啶、甲苯蓝、甲酚蓝、尼罗蓝、中性红、吩嗪衍生物、tionin、 天青A、天青B、甲苯胺蓝O、苯乙酮、金属酞菁、尼罗蓝A、改性过渡 金属配位体、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen-二 酮)(CO)3Cl]、[Re(phen-二酮)3](PF6)2、聚(金属酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亚 胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩噁嗪、甲苯胺蓝、亮甲酚蓝、3，4- 二羟基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天青I)、聚(尼罗蓝A)、聚苯胺、聚吡啶、 聚吡咯、聚噻吩、聚(噻吩并[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-亚乙基 二氧吡咯)、聚(异硫茚)、聚(3，4-亚乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二 氰基亚甲基-4H-环戊[2，1-b；3，4-b’]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性 红)或其组合的过渡金属络合物。
29、权利要求21或27的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其 中疏水氧化还原介体为Ru(phen)3+2、Fe(phen)3+2、Os(phen)3+2、 Co(phen)3+2、Cr(phen)3+2、Ru(bpy)3+2、Os(bpy)3+2、Fe(bpy)3+2、Co(bpy)3+2、 Cr(bpy)3+2、Os(terpy)3+2、Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、 Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4- 甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2或其组合。
30、权利要求21或27的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其 中疏水氧化还原介体为Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、 Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4- 甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2或其组合。
31、权利要求21或27的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其 中疏水氧化还原介体为Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2。
32、权利要求1-31中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池， 其中电子导体包括基于碳的材料、金属导体、半导体、金属氧化物或经改 性的导体。
33、权利要求1-32中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池， 其中电子导体包括基于碳的材料。
34、权利要求33的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池，其中电子 导体包括碳布、碳纸、碳丝网印刷的电极、碳黑、碳粉、碳纤维、单壁碳 纳米管、双壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纳米管阵列、金刚石-涂布的导 体、玻璃碳和中孔碳、石墨、未压缩的石墨蠕虫、分层的经纯化片状石墨、 高性能石墨、高度有序的热解石墨、热解石墨和多晶石墨。
35、权利要求1-34中任一项的生物阳极、生物阴极或生物燃料电池， 其中酶包括氧化还原酶。
36、权利要求1-4、7、8和10-35中任一项的生物阳极或生物燃料电 池，其中阳极酶包括葡萄糖氧化酶、基于醇的氧化酶或基于胆固醇的氧化 酶。
37、权利要求5、6、7和9-36中任一项的生物阴极或生物燃料电池， 其中阴极酶包括漆酶、细胞色素C氧化酶、胆红素氧化酶或过氧化物酶。
38、权利要求5、6、7和9-36中任一项的生物阴极或生物燃料电池， 其中阴极酶包括在pH为约6.5与约7.5之间时具有最佳活性的氧氧化还原 酶。
39、权利要求5、6、7和9-36中任一项的生物阴极或生物燃料电池， 其中阴极酶包括胆红素氧化酶。
40、权利要求1-4、7、8和10-39中任一项的生物阳极或生物燃料电 池，其中阳极酶包括PQQ依赖脱氢酶。
41、权利要求7-40中任一项的生物燃料电池，其中氧化剂包括阳极 或过氧化物。
42、权利要求41的生物燃料电池，其中氧化剂包括氧。
43、权利要求7-42中任一项的生物燃料电池，其中燃料流体包括氨、 甲醇、乙醇、丙醇、异丁醇、丁醇和异丙醇、烯丙醇、芳基醇、甘油、丙 二醇、甘露醇、葡萄糖醛酸、醛、糖类、葡萄糖、葡萄糖-1、D-葡萄糖、 L-葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酯、乳酸酯、乳酸酯-6-磷酸酯、D-乳酸酯、L- 乳酸酯、果糖、半乳糖-1、半乳糖、醛糖、山梨糖、甘露糖、甘油酸酯、 辅酶A、乙酰辅酶A、苹果酸酯、异柠檬酸酯、甲醛、乙醛、乙酸酯、柠 檬酸酯、L-葡糖酸酯、β-羟基类固醇、α-羟基类固醇、乳醛、睾酮、葡糖 酸酯、脂肪酸、脂类、磷酸甘油酸酯、视黄醛、雌二醇、环戊醇、十六醇、 长链醇、松柏醇、肉桂醇、甲酸酯、长链醛、丙酮酸酯、丁醛、酰基辅酶 A、类固醇、氨基酸、黄素、NADH、NADH2、NADPH、NADPH2或氢。
44、权利要求43的生物燃料电池，其中燃料流体包括甲醇、乙醇或 丙醇。
45、权利要求44的生物燃料电池，其中燃料流体包括乙醇。
46、权利要求7、8和10-45的生物燃料电池，其中生物阳极包括具 有静电结合到其上的PQQ分子的PQQ依赖醇脱氢酶。
47、权利要求7和10-46的生物燃料电池，其中生物阳极和生物阴 极并未通过盐桥或聚合物电解质膜分离开来。
48、一种使用权利要求7-47中任一项的生物燃料电池产生电的方 法，其包括
(a)在阳极或生物阳极使燃料流体氧化并且在阴极或生物阴极使氧化剂还 原；
(b)在阴极或生物阴极使氧化剂还原期间使电子介体的还原形式氧化；
(c)使电催化剂氧化；和
(d)在电子导体处使电催化剂还原。
49、一种使用权利要求7-47中任一项的生物燃料电池产生电的方 法，其包括
(a)在阳极或生物阳极使燃料流体氧化并且在阴极或生物阴极使氧化剂还 原；
(b)在阴极或生物阴极使氧化剂还原期间使电子介体的还原形式氧化；和
(c)在电子导体处使电子介体还原。
50、一种固定在胶束疏水改性多糖中的酶，胶束疏水改性多糖能够 使酶固定化和稳定化，胶束疏水改性多糖对比酶小的化合物是可渗透的。
51、权利要求50的固定化的酶，其在包含大于约95重量％或95体 积％乙醇的溶液中。
52、一种固定在胶束疏水改性多阳离子聚合物中的酶，固定化的酶 比置于缓冲液中时的酶更有活性。
53、一种固定在胶束疏水改性多阴离子聚合物中的酶，固定化的酶 比置于缓冲液中时的酶更有活性。
54、权利要求50-53中任一项的固定化的酶，其中酶包括醇脱氢酶、 醛脱氢酶、甲酸盐脱氢酶、甲醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、 乳酸脱氢酶、乳糖脱氢酶、丙酮酸脱氢酶或胆红素氧化酶。
55、权利要求50-52中任一项的固定化的酶，其中多糖或多阳离子 聚合物包括脱乙酰壳多糖。
56、权利要求50、51和53中任一项的固定化的酶，其中多糖或多 阳离子聚合物包括藻酸盐。
57、权利要求50、51、52、54或55中任一项的固定化的酶，其中 胶束疏水改性多糖或胶束疏水改性多阳离子聚合物符合式I
其中n为整数；
R10独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体；且
R11独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体。
58、权利要求57的固定化的酶，其中R10独立地为氢或烷基且R11 独立地为氢或烷基。
59、权利要求57的固定化的酶，其中R10独立地为氢或己基且R11 独立地为氢或己基。
60、权利要求57的固定化的酶，其中R10独立地为氢或辛基且R11 独立地为氢或辛基。
61、权利要求57的固定化的酶，其中R10独立地为氢或疏水氧化还 原介体且R11独立地为氢或疏水氧化还原介体。
62、权利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化还原介体为锇、钌、 铁、镍、铑、铼或钴与1，10-菲咯啉(phen)、2，2’-联吡啶(bpy)或2，2’，2”-三 联吡啶(terpy)、亚甲绿、亚甲蓝、聚(亚甲绿)、聚(亚甲蓝)、鲁米诺、硝基 -芴酮衍生物、吖嗪、锇菲咯啉二酮、儿茶酚-侧基三联吡啶、甲苯蓝、甲 酚蓝、尼罗蓝、中性红、吩嗪衍生物、tionin、天青A、天青B、甲苯胺蓝 O、苯乙酮、金属酞菁、尼罗蓝A、改性过渡金属配位体、1，10-菲咯啉-5，6- 二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen-二酮)(CO)3Cl]、[Re(phen-二 酮)3](PF6)2、聚(金属酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亚胺、二氨基苯、二氨基吡 啶、吩噻嗪、吩噁嗪、甲苯胺蓝、亮甲酚蓝、3，4-二羟基苯甲醛、聚(丙烯 酸)、聚(天青I)、聚(尼罗蓝A)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻 吩并[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-亚乙基二氧吡咯)、聚(异硫茚)、 聚(3，4-亚乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亚甲基-4H-环戊 [2，1-b；3，4-b’]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性红)或其组合的过渡 金属络合物。
63、权利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化还原介体为 Ru(phen)3+2、Fe(phen)3+2、Os(phen)3+2、Co(phen)3+2、Cr(phen)3+2、 Ru(bpy)3+2、Os(bpy)3+2、Fe(bpy)3+2、Co(bpy)3+2、Cr(bpy)3+2、Os(terpy)3+2、 Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4- 甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2 或其组合。
64、权利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化还原介体为 Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4- 甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2 或其组合。
65、权利要求61的固定化的酶，其中疏水氧化还原介体为 Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2。
66、一种胶束疏水改性脱乙酰壳多糖，其具有至少约10％的通过疏 水基团改性的脱乙酰壳多糖的胺官能团。
67、一种具有符合式1A的结构的胶束疏水氧化还原介体改性的脱 乙酰壳多糖
其中n为整数；
R10a独立地为氢或疏水氧化还原介体；和
R11a独立地为氢或疏水氧化还原介体。
68、权利要求67的改性脱乙酰壳多糖，其中疏水氧化还原介体为锇、 钌、铁、镍、铑、铼或钴与1，10-菲咯啉(phen)、2，2’-联吡啶(bpy)或2，2’，2”- 三联吡啶(terpy)、亚甲绿、亚甲蓝、聚(亚甲绿)、聚(亚甲蓝)、鲁米诺、硝 基-芴酮衍生物、吖嗪、锇菲咯啉二酮、儿茶酚-侧基三联吡啶、甲苯蓝、 甲酚蓝、尼罗蓝、中性红、吩嗪衍生物、tionin、天青A、天青B、甲苯胺 蓝O、苯乙酮、金属酞菁、尼罗蓝A、改性过渡金属配位体、1，10-菲咯啉 -5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen-二酮)(CO)3Cl]、[Re(phen-二 酮)3](PF6)2、聚(金属酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亚胺、二氨基苯、二氨基吡 啶、吩噻嗪、吩噁嗪、甲苯胺蓝、亮甲酚蓝、3，4-二羟基苯甲醛、聚(丙烯 酸)、聚(天青I)、聚(尼罗蓝A)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻 吩并[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-亚乙基二氧吡咯)、聚(异硫茚)、 聚(3，4-亚乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亚甲基-4H-环戊 [2，1-b；3，4-b’]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性红)或其组合的过渡 金属络合物。
69、权利要求67的改性脱乙酰壳多糖，其中疏水氧化还原介体为 Ru(phen)3+2、Fe(phen)3+2、Os(phen)3+2、Co(phen)3+2、Cr(phen)3+2、 Ru(bpy)3+2、Os(bpy)3+2、Fe(bpy)3+2、Co(bpy)3+2、Cr(bpy)3+2、Os(terpy)3+2、 Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4- 甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2 或其组合。
70、权利要求67的改性脱乙酰壳多糖，其中疏水氧化还原介体为 Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4- 甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2 或其组合。
71、权利要求67的改性脱乙酰壳多糖，其中疏水氧化还原介体为 Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2。
[0002]本发明通常涉及生物酶基燃料电池(又称作生物燃料电池)及其 制备方法和用途。更具体地说，本发明涉及生物阳极、生物阴极、生物燃 料电池、固定化的酶和包含疏水改性多糖的酶固定化材料及其制造方法和 用途。
[0003]生物燃料电池是一种生物化学装置，其中来自化学反应的能量 通过活细胞和/或它们的酶的催化活性转化为电能。生物燃料电池通常使用 络合物分子在阳极产生将氧还原成水所需的氢离子，而产生用于电应用中 的自由电子。生物阳极是生物燃料电池的电极，其中在燃料氧化时释放电 子并且生物阴极是其中来自阳极的电子和质子被催化剂使用将过氧化物或 氧还原成水的电极。生物燃料电池与常规燃料电池不同之处是用于催化电 化学反应的材料。生物燃料电池不是使用贵金属作为催化剂，而是依赖于 生物分子例如酶来进行反应。发明概述
[0004]本发明的多种方面之一是包含电子导体；至少一种阳极酶；和 酶固定化材料的生物阳极。阳极酶能够与电子介体的氧化形式和燃料流体 反应产生燃料流体的氧化形式和电子介体的还原形式。电子介体的还原形 式能够向电子导体释放电子。酶固定化材料是燃料流体和电子介体可渗透 的并且包含疏水改性多糖。
[0005]在上述阳极的另一个方面中，酶固定化材料包含电子介体。
[0006]又一个方面是包含电子导体；至少一种阳极酶；酶固定化材料； 和电催化剂的生物阳极。阳极酶能够与电子介体的氧化形式和燃料流体反 应产生燃料流体的氧化形式和电子介体的还原形式。酶固定化材料是燃料 流体和电子介体可渗透的并且包含疏水改性多糖。电催化剂邻近电子导体。 电催化剂的氧化形式能够与电子介体的还原形式反应产生电子介体的氧化 形式和电催化剂的还原形式，并且电催化剂的还原形式能够向电子导体释 放电子。
[0007]在上述阳极的另一个方面中，酶固定化材料包含电子介体、电 催化剂、或电子介体和电催化剂。
[0008]另一个方面是包含电子导体；至少一种阴极酶；和酶固定化材 料的生物阴极。阴极酶能够与电子介体的还原形式和氧化剂反应产生电子 介体的氧化形式和水。酶固定化材料包含电子介体，是氧化剂可渗透的， 并且包含疏水改性多糖。电子介体的氧化形式能够从电子导体获得电子产 生电子介体的还原形式。
[0009]本发明的又一个方面是包含电子导体；至少一种阴极酶；和酶 固定化材料的生物阴极。阴极酶能够与电子介体的还原形式和氧化剂反应 产生电子介体的氧化形式和水。酶固定化材料包含电子介体、电催化剂、 或电子介体和电催化剂，是氧化剂可渗透的，并且包含疏水改性多糖。电 催化剂能够从电子导体获得电子产生电催化剂的还原形式，所述电催化剂 的还原形式能够与电子介体的氧化形式反应产生电子介体的还原形式和电 催化剂的氧化形式。
[0010]另一个方面是包含燃料流体；电子介体；如上所述的生物阳极； 和阴极的用于产生电的生物燃料电池。另外，包含燃料流体；电子介体； 阳极；和如上所述的生物阴极的用于产生电的生物燃料电池。以及，包含 燃料流体；电子介体；如上所述的生物阳极；和如上所述的生物阴极的用 于产生电的生物燃料电池。
[0011]又一个方面是使用上述生物燃料电池产生电的方法，所述方法 包括在阳极或生物阳极使燃料流体氧化并且在阴极或生物阴极使氧化剂还 原；在阴极或生物阴极处使氧化剂还原期间使电子介体的还原形式氧化； 使电催化剂氧化；和在电子导体处使电催化剂还原。
[0012]另一个方面是使用上述生物燃料电池产生电的方法，所述方法 包括在阳极或生物阳极使燃料流体氧化并且在阴极或生物阴极使氧化剂还 原；在阴极或生物阴极使氧化剂还原期间使电子介体的还原形式氧化；和 在电子导体处使电子介体还原。
[0013]本发明的另一个方面是固定在疏水改性多糖中的酶。疏水改性 多糖能够使酶固定化和稳定化并且是比酶小的化合物可渗透的。
[0014]另一个方面是固定在胶束疏水改性多阳离子聚合物中的酶，固 定化的酶比置于缓冲液中时的酶更有活性
[0015]另一个方面是固定在胶束疏水改性多阴离子聚合物中的酶，固 定化的酶比置于缓冲液中时的酶更有活性。
[0016]又一个方面是通过疏水基团改性的具有至少约10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48％ 的胺官能团的脱乙酰壳多糖的胶束疏水改性脱乙酰壳多糖。
[0018]图1表示疏水改性脱乙酰壳多糖在Ru(bpy)3+2中的示例性荧光 显微照片。
[0019]图2表示疏水改性脱乙酰壳多糖膜浸入FITC中的示例性荧光显 微照片。
[0020]图3表示咖啡因流过疏水改性脱乙酰壳多糖的通量的KD1/2值与 改性剂的烷基链长和聚合物再悬浮在其中的溶剂的关系。
[0021]图4表示Ru(bpy)3+2迁移过疏水改性脱乙酰壳多糖膜的KD1/2 值。
[0022]图5表示单个功能生物阳极或生物阴极。
[0023]图6表示微流体生物燃料电池。
[0024]图7(a)-(d)表示形成单个微电极的过程。
[0025]图8表示微流体生物燃料电池组。
[0026]图9表示对丁基脱乙酰壳多糖葡糖脱氢酶而言从生产开始不同 日期所收集的一系列功率曲线。
[0027]图10是具有介导(mediated)生物阳极(包含四丁基铵改性的 和NAD+依赖醇脱氢酶)和直接电子转移生物阴极(包含丁基脱乙酰 壳多糖和胆红素氧化酶)的生物燃料电池的功率曲线。
[0028]图11是具有介导生物阳极(包含丁基脱乙酰壳多糖和NAD+依赖 醇脱氢酶)和直接电子转移生物阴极(包含丁基脱乙酰壳多糖和胆红素氧化 酶)的生物燃料电池的功率曲线。
[0029]图12是采用四戊基铵离子改性的低分子量藻酸盐的荧光显微照 片。
[0030]图13是包含空气呼吸阴极的I-电池的示意图。发明详述
[0031]本发明涉及生物阳极、生物阴极、生物燃料电池和包含疏水改 性多糖，优选疏水改性脱乙酰壳多糖或疏水改性藻酸盐的酶固定化材料。 疏水改性多糖形成在其中具有孔的胶束结构，所述孔有利地适于使酶固定 化。一些所述的疏水改性多糖是多阳离子生物聚合物，所述多阳离子生物 聚合物是生物相容的并且非常适于使在酸性至中性环境中的酶(例如，对于 在pH为约5下是活性的酶而言)固定化。除了它的多阳离子特性以外，疏 水改性多糖可采用各种疏水基团改性，所述疏水基团可改变孔的形状以适 应特定的酶或改变酶固定化材料的电子性能。
[0032]在又一个实施方案中，本发明的生物电极装置具有提高的酶稳 定性。为了在生物阴极或生物阳极中应用，固定化材料形成提供机械和化 学稳定性的阻挡层。因此，酶比先前已知的稳定化更长时间。对于本发明 而言，如果酶在生物燃料电池中持续操作至少约7天至约730天时保留其 初始催化活性的至少约75％，则酶是稳定化的。1.生物燃料电池
[0033]本发明的多个方面之一是生物燃料电池，其通过在其中具有固 定酶的电极处发生的酶介导的氧化还原反应，利用燃料流体产生电。如在 标准电化学电池中，阳极是燃料流体的氧化反应同时释放电子的部位。电 子通过电连接端子从阳极到达某种功率消耗装置。电子通过该装置迁移到 另一个电连接端子，其将电子输送到生物燃料电池的生物阴极，在生物阴 极所述电子被用于使氧化剂还原以产生水。采用这种方式，本发明的生物 燃料电池作为其外部电负荷的能源(电)。为了促进燃料流体的氧化还原反 应，电极包含电子导体、电子介体、用于电子介体的电催化剂、酶和酶固 定化材料。
[0034]根据本发明，电子介体是可以接受电子或者供给电子的化合物。 在目前优选的生物燃料电池中，电子介体的氧化形式与燃料流体和酶反应 以在生物阳极产生燃料流体的氧化形式和电子介体的还原形式。随后或者 同时地，电子介体的还原形式与电催化剂的氧化形式反应产生电子介体的 氧化和电催化剂的还原形式。然后电催化剂的还原形式在生物阳极被氧化 并产生电子，从而产生电。除了燃料流体的氧化以外，生物阳极的氧化还 原反应可以是可逆的，因而并未消耗酶、电子介体和电催化剂。任选地， 如果加入电子介体和/或电催化剂以提供额外的反应物，则这些氧化还原反 应是不可逆的。
[0035]替代性地，可以使用电子导体和酶，其中与生物阳极接触的电 子介体能够在未经改性的电极处在其氧化与还原形式之间转移电子。如果 电子介体能够在未经改性的生物阳极处在氧化与还原形式之间转移电子， 则电催化剂与电子介体之间的随后反应不是必要的并且电子介体自身在生 物阳极被氧化而产生电子，从而产生电。
[0036]在生物阴极处，来自生物阳极的电子流入生物阴极的电子导体 中。在那里，电子与电催化剂的氧化形式组合，其与电子导体接触。该反 应产生电催化剂的还原形式，其又与电子介体的氧化形式反应以产生电子 介体的还原形式和电催化剂的氧化形式。接着，电子介体的还原形式与氧 化剂的氧化形式反应产生电子介体的氧化形式与水。在一个实施方案中， 存在氧化剂可渗透的酶固定化材料，其包含电催化剂和，任选地，电子介 体，并且其能够使酶固定化和稳定化。
[0037]在生物阴极的另外的实施方案中，不存在电催化剂。在该实施 方案中，电子与电子介体的眼花形式组合以产生电子介体的还原形式。然 后，电子介体的还原形式与氧化剂的氧化形式反应产生电子的氧化形式与 水。在一个实施方案中，存在对所述氧化剂可渗透的酶固定化材料，其任 选包含电子介体，并且其能够使所述酶固定化和稳定化。
[0038]本发明的生物燃料电池包含生物阴极和/或生物阳极。通常，生 物阳极包含实现燃料流体氧化从而释放电子并将电子导入外部电负荷的元 件。所产生的电流为电负荷提供动力，随后将电子导入生物阴极，在此处 使氧化剂还原并产生水。A.生物阴极
[0039]根据本发明的生物阴极包含电子导体、固定在酶固定化材料中 的酶、电子介体和电催化剂。在一个实施方案中，这些组件彼此相邻，意 思是它们通过适当的方式在物理或化学上连接。1.电子导体
[0040]电子导体是传导电子的物质。电子导体在性质上可以是有机或 无机的，只要能够通过该材料传导电子。电子导体可以是基于碳的材料、 不锈钢、不锈钢网、金属导体、半导体、金属氧化物、经改性的导体或者 其组合。在优选的实施方案中，电子导体是基于碳的材料。
[0041]特别适合的电子导体是基于碳的材料。示例性基于碳的材料是 碳布、碳纸、碳丝网印刷的电极、碳纸(Toray)、碳纸(ELAT)、碳黑(Vulcan XC-72、E-tek)、碳黑、碳粉、碳纤维、单壁碳纳米管、双壁碳纳米管、多 壁碳纳米管、碳纳米管阵列、金刚石-涂布的导体、玻璃碳和中孔碳。此外， 其它示例性基于碳的材料是石墨、未压缩的石墨蠕虫、分层的经纯化片状 石墨(石墨)、高性能石墨和碳粉(Formula BTTM、石墨)、 高度有序的热解石墨、热解石墨和多晶石墨。优选的电子导体(载体膜)是 一片碳布。可以使用这些碳材料的组合。
[0042]在另一个实施方案中，电子导体可以由金属导体制造。适合的 电子导体可以由金、铂、铁、镍、铜、银、不锈钢、汞、钨和适于电极构 造的其它金属制备。另外，是金属导体的电子导体可以从由钴、碳和其它 适合的金属制成的纳米粒子构成。其它金属电子导体可以是镀银的镍丝网 印刷电极。
[0044]其它电子导体可以是金属氧化物、金属硫化物、主族化合物 (main group compound)(即，过渡金属化合物)、和用电子导体改性的材料。 所述类型的示例性电子导体是纳米孔氧化钛、氧化锡涂布的玻璃、氧化铈 粒子、硫化钼、氮化硼纳米管、用传导材料如碳改性的气凝胶(aerogel)、 用传导材料如碳改性的溶胶凝胶(solgel)、钌碳气凝胶、和用传导材料如碳 改性的中孔硅酸盐。2.电子介体
[0045]电子介体是可以接受或者供给电子的化合物。换句话说，电子 介体具有氧化形式，其可以接受电子以形成还原形式，其中还原形式也可 以供给电子以产生氧化形式。电子介体是可以扩散到固定化材料和/或掺入 到固定化材料中的化合物。
[0047]生物阴极的电子介体可以是蛋白质，如漆树蓝蛋白 (stellacyanin)、蛋白质副产物如胆红素、糖如葡萄糖、固醇如胆固醇、脂 肪酸、金属蛋白或其组合。电子介体还可以是氧化酶的辅酶或者基底。在 一个优选实施方案中，生物阴极的电子介体是胆红素。3.用于电子介体的电催化剂
[0048]通常，电催化剂是通过降低电子介体的标准还原电位以促进电 子导体处的电子释放的物质。
[0049]通常，根据本发明的电催化剂是标准还原电位大于+0.4伏特的 有机金属阳离子。示例性电催化剂是过渡金属络合物，例如锇、钌、铁、 镍、铑、铼和钴络合物。使用这些络合物的优选的有机金属阳离子包含大 的有机芳族配体，所述配体允许大的电子自交换速率。大的有机芳族配体 的实例包括1，10-菲咯啉(phenanthroline)(phen)、2，2’-联吡啶 (bipyridine)(bpy)和2，2’，2”-三联吡啶(terpyridine)(terpy)的衍生物，如 Ru(phen)3+2、Fe(phen)3+2、Ru(bpy)3+2、Os(bpy)3+2、和Os(terpy)3+2。在优 选的实施方案中，电催化剂是钌化合物。最优选地，生物阴极处的电催化 剂是Ru(bpy)3+2(由式2表示)。
[0050]电催化剂以促进电子有效转移的浓度存在。优选地，电催化剂 以使酶固定化材料传导电子的浓度存在。具体地说，电催化剂以约10mM 至约3M，更优选约250mM至约2.25M，较优选约500mM至约2M，且 最优选约1.0M至约1.5M的浓度存在。4.酶
[0051]根据本发明，酶在生物阴极处使氧化剂还原。通常，可以利用 天然存在的酶、人造酶、人工酶和改性的天然存在的酶。另外，可以使用 通过天然或者定向进化改造的工程处理酶。换句话说，在本发明的实施方 案中可以使用模拟酶的性质的有机或无机分子。
[0052]特别地，用于生物阴极的示例性酶是氧化还原酶。潜在的氧化 还原酶包括漆酶(laccase)和氧化酶(oxidase)，如葡萄糖氧化酶、基于醇的氧 化酶、和基于胆固醇的氧化酶。在优选的实施方案中，所述酶是过氧化物 酶或氧氧化还原酶，它们分别催化还原过氧化氢和氧。示例性氧氧化还原 酶包括漆酶、细胞色素c氧化酶、胆红素氧化酶和过氧化物酶。更优选地， 酶是在pH为约6.5至约7.5时具有最佳活性的氧氧化还原酶。在pH为约 6.5至约7.5时具有最佳活性的氧化还原酶对于涉及生理环境，如植物或人 或动物体的应用是有利的。最优选地，酶是胆红素氧化酶。5.酶固定化材料
[0053]在生物燃料电池中于生物阳极和/或生物阴极处使用酶固定化材 料。在一个实施方案中，生物阳极的酶固定化材料对于燃料流体是可渗透 的并且使酶固定化和稳定化。固定化材料对于燃料流体是可渗透的，从而 生物阳极处燃料的氧化反应可以用固定化的酶催化。
[0054]通常，用酶催化生物阴极和/生物阳极处的氧化还原反应。在根 据本发明的生物阳极和/或生物阴极中，酶固定在酶固定化材料中，这样使 酶固定化和稳定化。通常，溶液中游离的酶在数小时至数天内丧失其催化 活性，而适当固定化和稳定化的酶可保留其催化活性至少约7天至约730 天。催化活性的保留定义为具有其初始活性的至少约75％的酶，初始活性 可以通过化学荧光、电化学、UV-Vis、放射化学或者荧光测定法测量。该 酶保持至少约75％的其初始活性，同时该生物燃料电池连续发电至少约7 天到约730天。
[0055]固定化的酶是物理上局限于酶固定化材料的某个区域而保持其 催化活性的酶。存在多种酶固定化方法，包括载体结合、交联和包埋。载 体结合是酶结合到水不溶性载体中。交联是通过双官能或者多官能试剂的 酶的分子间交联。包埋是将酶掺入到半渗透性材料的格栅中。酶固定化的 特定方法不是至关重要的，只要酶固定化材料(1)使酶固定化、(2)使酶稳定 化、和(3)对于燃料流体或者氧化剂是可渗透的。
[0056]关于酶固定化材料对燃料流体或者氧化剂的渗透性和酶的固定 化，在一个实施方案中，所述材料对于小于酶的化合物是可渗透的。换句 话说，该酶固定化材料允许燃料流体或者氧化剂化合物通过，这样该化合 物可以接触酶。可以以一种方式制备酶固定化材料使得它含有内部孔、通 道、开口或者其组合，其允许化合物通过酶固定化材料运动，但是将酶约 束在酶固定化材料的基本相同的空间内。此类约束使得酶保持其催化活性。 在各种优选的实施方案中，酶被限制在与该酶具有基本相同的大小和形状 的空间内，其中该酶基本上保持其所有催化活性。所述孔、通道、或者开 口具有满足上面要求的物理尺度并且取决于待固定化的特定酶的大小和形 状。
[0057]在一个实施方案中，酶优选位于酶固定化材料的孔中并且化合 物通过运输通道进出酶固定化材料。孔和运输通道的相对大小可以为使得 孔足够大以使酶固定化，但是运输通道对于酶太小而不能通过它们移动。 进一步地，运输通道优选具有至少约10nm的直径。在另一个实施方案中， 孔直径与运输通道直径的比为至少约2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、 5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更多。 在又一个实施方案中，优选地，运输通道具有至少约10nm的直径并且孔 直径与运输通道直径比为至少约2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、 5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更多。
[0058]对于酶的稳定化，酶固定化材料提供了防止或者阻止酶变性的 化学或者机械屏障。为此，酶固定化材料在物理上限制该酶，防止该酶解 折叠(unfold)。从折叠的三维结构使酶解折叠的过程是酶变性的一种机理。 在一个实施方案中，固定化材料优选地使酶稳定化，从而使酶保留其催化 活性至少约7天至约730天。催化活性的保留定义为酶作为生物燃料电池 的一部分连续产生电时保留其初始活性的至少约75％的天数。酶活性可以 通过化学荧光、电化学、UV-Vis、放射化学或者荧光测定法测量，其中该 性质的强度在最初时间测量。通常，用荧光测定法测量酶活性。溶液中游 离的酶在数小时至数天内丧失其催化活性。因而，酶的固定化在稳定性方 面提供了显著的优点。在另一个实施方案中，优选地，固定化的酶保留其 初始催化活性的至少约75％至少约5、10、15、20、25、30、45、60、75、 90、105、120、150、180、210、240、270、300、330、365、400、450、 500、550、600、650、700、730天或更多，优选保留其初始催化活性的至 少约80％、85％、90％、95％或更多地至少约5、10、15、20、25、30、 45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330、365、 400、450、500、550、600、650、700、730天或更多。
[0059]在一些实施方案中，酶固定化材料具有胶束或者反向胶束结构。 通常，构成胶束的分子是两亲性的，意思是它们含有极性的亲水基团和非 极性的疏水基团。分子可以聚集以形成胶束，其中极性基团在聚集体和烃 的表面上，非极性基团隔离在聚集体内。反向胶束具有相对方向的极性基 团和非极性基团。构成聚集体的两亲分子可以以多种方式排列，只要极性 基团彼此接近并且非极性彼此接近。而且，分子可以形成非极性基团指向 彼此且极性基团背向彼此的双层。另外，可以形成其中极性基团可以在双 层中彼此指向同时非极性基团彼此背向的双层。
[0060]在一个优选的实施方案中，胶束酶固定化材料是改性的全氟磺 酸-PTFE共聚物(或改性的全氟化离子交换聚合物)(改性的或改性 的)膜。将全氟化离子交换聚合物膜用大于铵(NH4+)离子的疏水阳 离子改性。疏水阳离子提供双重功能：(1)决定膜的孔尺寸和(2)用作化学缓 冲剂以帮助保持孔的pH水平，两功能均使酶稳定化。
[0061]关于疏水阳离子的第一种功能，与疏水阳离子混合物浇铸全氟 磺酸-PTFE共聚物(或全氟化离子交换聚合物)以产生改性的全氟磺酸 PTFE共聚物(或者改性的全氟化离子交换聚合物)(或)膜 提供了酶固定化材料，其中孔尺寸取决于疏水阳离子的大小。因此，疏水 阳离子越大，孔尺寸越大。疏水阳离子的上述功能允许通过改变疏水阳离 子的大小使得孔尺寸更大或更小以适合特定的酶。
[0062]关于疏水阳离子的第二种功能，通过使疏水阳离子交换作为全 氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的离子交换聚合物)膜上-SO3-基团的反离 子的质子来改变全氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的离子交换聚合物)膜 的性质。该反离子的改变对pH提供了缓冲效应，因为疏水阳离子对-SO3- 位点比质子有更大的亲和性。膜的这种缓冲效应导致孔的pH随着溶液pH 的改变而基本上保持不变；换句话说，孔的pH对抗了溶液pH的改变。 此外，膜提供了机械屏障，其进一步保护了固定化的酶。为了制备改性的 全氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的离子交换聚合物)膜，第一步是浇铸 与疏水阳离子的溶液的全氟磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的离子交换聚 合物)、尤其是的悬浮液，以形成膜。然后将过量的疏水阳离子和 它们的盐从膜中提取出来，并且将膜再浇铸。在再浇铸时，膜含有与全氟 磺酸-PTFE共聚物(或者全氟化的离子交换聚合物)膜的-SO3-位点结合的疏 水阳离子。从膜中除去疏水阳离子的盐得到更加稳定和可再生产的膜，因 为过量的盐可陷入孔中并在膜中产生孔隙。
[0063]在一个实施方案中，改性的膜通过浇铸与疏水阳离子盐 例如季铵溴化物的溶液的聚合物的悬浮液制备。过量的季铵溴化 物或溴化氢在将膜再浇铸以形成盐提取的膜之前从膜中除去。膜的盐提取 在磺酸交换位点保留了季铵阳离子的存在，而且消除了来自可能陷入孔中 并可能在平衡的膜内产生孔隙的过量的盐的复杂性。盐提取的膜的化学和 物理性能已在酶固定化之前通过伏安法、离子交换能力测量和荧光显微术 表征。示例性疏水阳离子为基于铵的阳离子、季铵阳离子、烷基三甲基铵 阳离子、烷基三乙基铵阳离子、有机阳离子、鏻阳离子、三苯基鏻、吡啶 鎓阳离子、咪唑鎓阳离子、十六烷基吡啶鎓、乙锭(ethidium)、紫精 (viologen)、甲基紫精、苄基紫精、二(三苯基膦)亚胺(iminium)、金属络合 物、联吡啶(bipyridine)金属络合物、基于菲咯啉的金属络合物、[Ru(联吡 啶)3]2+和[Fe(菲咯啉)3]3+。
[0064]在一个优选的实施方案中，疏水阳离子为基于铵的阳离子。特 别地，疏水阳离子为季铵阳离子。在另一个实施方案中，季铵阳离子由式 4表示：
[0065]其中R1、R2、R3和R4独立地为氢、烃基、取代烃基、或杂环， 其中R1、R2、R3和R4的至少之一不是氢。在另一个实施方案中，优选R1、 R2、R3和R4独立地为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、 辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，其中R1、 R2、R3和R4的至少之一不是氢。在又一个实施方案中，R1、R2、R3和R4 相同且为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。在又一个实施方案中， 优选R1、R2、R3和R4为丁基。优选季铵阳离子为四丙基铵(T3A)、四戊 基铵(T5A)、四己基铵(T6A)、四庚基铵(T7A)、三甲基二十烷基铵(TMICA)、 三甲基辛基癸基铵(TMODA)、三甲基己基癸基铵(TMHDA)、三甲基十四 烷基铵(TMTDA)、三甲基辛基铵(TMOA)、三甲基十二烷基铵(TMDDA)、 三甲基癸基铵(TMDA)、三甲基己基铵(TMHA)、四丁基铵(TBA)、三乙基 己基铵(TEHA)、及其组合。
[0066]在其它各种实施方案中，示例性胶束或反向胶束酶固定化材料 是疏水改性多糖，所述多糖选择脱乙酰壳多糖、纤维素、甲壳质、淀粉、 直链淀粉、藻酸盐、及其组合。在各种实施方案中，胶束或反向胶束酶固 定化材料为多阳离子聚合物，特别是疏水改性脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多 糖是聚[β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃型葡萄糖]。脱乙酰壳多糖通常通过甲 壳质(聚[β-(1-4)-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃型葡萄糖])的脱乙酰化制备。典 型的商购脱乙酰壳多糖具有约85％的脱乙酰化。所述脱乙酰的或游离的氨 基基团可进一步采用烃基，特别是烷基官能化。因此，在各种实施方案中， 胶束疏水改性脱乙酰壳多糖符合式1的结构式
其中n为整数；R10独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体； 且R11独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体。在本发明的某 些实施方案中，n为使聚合物分子量为约21,000至约500,000；优选约90,000 至约500,000；更优选约150,000至约350,000；更优选约225,000至约 275,000的整数。在许多实施方案中，R10独立地为氢或烷基且R11独立地 为氢或烷基。替代性地，R10独立地为氢或己基且R11独立地为氢或己基。 任选地，R10独立地为氢或辛基且R11独立地为氢或辛基。
其中n为整数；R10独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体； 且R11独立地为氢、烃基、取代烃基或疏水氧化还原介体。在本发明的某 些实施方案中，n为使聚合物分子量为约21,000至约500,000；优选约90,000 至约500,000；更优选约150,000至约350,000；更优选约225,000至约 275,000的整数。在许多实施方案中，R10独立地为氢或烷基且R11独立地 为氢或烷基。替代性地，R10独立地为氢或己基且R11独立地为氢或己基。 任选地，R10独立地为氢或辛基且R11独立地为氢或辛基。
[0067]在其它各种实施方案中，胶束疏水改性脱乙酰壳多糖是符合式 1A的胶束疏水氧化还原介体改性的脱乙酰壳多糖
其中n为整数；R10a独立地为氢或疏水氧化还原介体；且R11a独立地为氢 或疏水氧化还原介体。
其中n为整数；R10a独立地为氢或疏水氧化还原介体；且R11a独立地为氢 或疏水氧化还原介体。
[0068]另外，在各种实施方案中，胶束疏水改性脱乙酰壳多糖是符合 式1B的改性脱乙酰壳多糖或氧化还原介体改性的脱乙酰壳多糖
其中R11、R12和n如有关式1中所定义。在一些实施方案中，R11和R12 独立地为氢或直链或支化烷基；优选氢、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、十一烷基或十二烷基。在各种实施方案中，R11和R12独立地 为氢、丁基或己基。
其中R11、R12和n如有关式1中所定义。在一些实施方案中，R11和R12 独立地为氢或直链或支化烷基；优选氢、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、十一烷基或十二烷基。在各种实施方案中，R11和R12独立地 为氢、丁基或己基。
[0069]胶束疏水改性脱乙酰壳多糖可以采用疏水基团改性至可变的程 度。疏水改性度通过采用疏水基团改性的游离的氨基与改性脱乙酰壳多糖 中游离的氨基的数量相对比的百分数确定。疏水改性度可由酸-碱滴定和/ 或核磁共振(NMR)，特别是1H NMR数据估算。所述疏水改性度可很大变 化并且为至少约1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、32、 24、26、28、40、42、44、46、48％或更多。优选地，疏水改性度为约10％ 至约45％；约10％至约35％；约20％至约35％；或约30％至约35％。
[0070]在其它各种实施方案中，式1A的疏水氧化还原介体为锇、钌、 铁、镍、铑、铼或钴与1，10-菲咯啉(phen)、2，2’-联吡啶(bpy)或2，2’，2”-三 联吡啶(terpy)、亚甲绿、亚甲蓝、聚(亚甲绿)、聚(亚甲蓝)、鲁米诺、硝基 -芴酮衍生物、吖嗪、锇菲咯啉二酮、儿茶酚-侧基三联吡啶、甲苯蓝、甲 酚蓝(cresyl blue)、尼罗蓝、中性红、吩嗪衍生物、tionin、天青A、天青B、 甲苯胺蓝O、苯乙酮、金属酞菁(metallophthalocyanine)、尼罗蓝A、改性 过渡金属配位体、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(phen- 二酮)(CO)3Cl]、[Re(phen-二酮)3](PF6)2、聚(金属酞菁)、聚(硫堇)、醌、二 亚胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩噁嗪、甲苯胺蓝、亮甲酚蓝、 3，4-二羟基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天青I)、聚(尼罗蓝A)、聚苯胺、聚吡 啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻吩并[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-亚 乙基二氧吡咯)、聚(异硫茚)、聚(3，4-亚乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚 (4-二氰基亚甲基-4H-环戊[2，1-b；3，4-b’]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚 (中性红)或其组合的过渡金属络合物。
[0071]优选疏水氧化还原介体为Ru(phen)3+2、Fe(phen)3+2、 Os(phen)3+2、Co(phen)3+2、Cr(phen)3+2、Ru(bpy)3+2、Os(bpy)3+2、Fe(bpy)3+2、 Co(bpy)3+2、Cr(bpy)3+2、Os(terpy)3+2、Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’- 联吡啶)+2、Co(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基 -4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Fe(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、 Os(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2或其组合。更优选地，疏水氧化 还原介体为Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Co(bpy)2(4-甲基 -4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Cr(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、 Fe(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2、Os(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己 基)-2，2’-联吡啶)+2或其组合。在各种优选的实施方案中，疏水氧化还原介 体为Ru(bpy)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2。
[0072]对于具有疏水氧化还原介体作为改性剂的固定化材料而言，疏 水氧化还原介体通常共价结合到脱乙酰壳多糖或多糖骨架上。通常，在脱 乙酰壳多糖的情况下，疏水氧化还原介体通过-N-C-键共价结合到脱乙酰壳 多糖的一个胺官能团上。在金属络合物氧化还原介体的情况下，金属络合 物通过-N-C-键连接到脱乙酰壳多糖上，所述-N-C-键由脱乙酰壳多糖胺基 团至这样的烷基，即其连接到金属络合物的配位体的一个或多个。符合式 1C的结构为金属络合物连接到脱乙酰壳多糖上的实例，
其中n为整数；R10c独立地为氢或符合式1D的结构；R11c独立地为氢或符 合式1D的结构；m为0至10的整数；且M为Ru、Os、Fe、Cr或Co。
其中n为整数；R10c独立地为氢或符合式1D的结构；R11c独立地为氢或符 合式1D的结构；m为0至10的整数；且M为Ru、Os、Fe、Cr或Co。
[0073]用于改性脱乙酰壳多糖的疏水基团提供双重功能：(1)决定固定 化材料的孔尺寸和(2)改变脱乙酰壳多糖的电子环境以保持适合的孔环境， 两功能均使酶稳定化。关于疏水基团的第一种功能，疏水改性脱乙酰壳多 糖产生了其中孔尺寸取决于疏水基团大小的酶固定化材料。因此，脱乙酰 壳多糖采用疏水基团改性的程度、尺寸和形状影响着孔的尺寸和形状。疏 水基团的这种功能允许孔尺寸变大或变小或具有不同形状以通过改变疏水 基团的大小或支化适应特定的酶。
[0074]关于疏水阳离子的第二种功能，疏水改性脱乙酰壳多糖膜的性 能通过采用疏水基团改性脱乙酰壳多糖得以改变。所述脱乙酰壳多糖的疏 水改性通过增加有效的质子交换位点的数量而影响着孔环境。除了影响材 料的pH以外，脱乙酰壳多糖的疏水改性还提供了是机械屏障的膜，所述 膜进一步保护了固定化的酶。
[0075]表1表示对于疏水改性脱乙酰壳多糖膜而言有效的质子交换位 点的数量。表1：有效的质子交换位点的数量/克脱乙酰壳多糖聚合物
膜 交换位点/克(×10-4molSO3/g) 脱乙酰壳多糖 10.5±0.8 丁基改性 226±21 己基改性 167±45 辛基改性 529±127 癸基改性 483±110
另外，所述多阳离子聚合物能够使酶固定化并且与在缓冲液中相同的酶的 活性相比提高了固定在其中的酶的活性。在各种实施方案中，多阳离子聚 合物是疏水改性多糖，特别是疏水改性脱乙酰壳多糖。例如，对于所指出 的疏水改性，葡萄糖氧化酶的酶活性使用实施例5的方法测量。对于葡萄 糖氧化酶，在悬浮在叔戊醇中的己基改性脱乙酰壳多糖中观察到最高的酶 活性。所述固定化膜在葡萄糖氧化酶活性方面比缓冲液中的酶显示出2.53 倍的提高。表2详细描述了对于各种疏水改性脱乙酰壳多糖的葡萄糖氧化 酶的活性。
表2：对于改性脱乙酰壳多糖的葡萄糖氧化酶的酶活性
膜/溶剂 酶活性(单位/gm)
缓冲液 103.61±3.15
未改性脱乙酰壳多糖 214.86±10.23
己基脱乙酰壳多糖
氯仿 248.05±12.62
叔戊醇 263.05±7.54
50％乙酸 118.98±6.28
癸基脱乙酰壳多糖
氯仿 237.05±12.31
叔戊醇 238.05±10.02
50％乙酸 3.26±2.82
辛基脱乙酰壳多糖
氯仿 232.93±7.22
叔戊醇 245.75±9.77
50％乙酸 127.55±11.98
丁基脱乙酰壳多糖
氯仿 219.15±9.58
叔戊醇 217.10±6.55
50％乙酸 127.65±3.02
膜 交换位点/克(×10-4molSO3/g) 脱乙酰壳多糖 10.5±0.8 丁基改性 226±21 己基改性 167±45 辛基改性 529±127 癸基改性 483±110
另外，所述多阳离子聚合物能够使酶固定化并且与在缓冲液中相同的酶的 活性相比提高了固定在其中的酶的活性。在各种实施方案中，多阳离子聚 合物是疏水改性多糖，特别是疏水改性脱乙酰壳多糖。例如，对于所指出 的疏水改性，葡萄糖氧化酶的酶活性使用实施例5的方法测量。对于葡萄 糖氧化酶，在悬浮在叔戊醇中的己基改性脱乙酰壳多糖中观察到最高的酶 活性。所述固定化膜在葡萄糖氧化酶活性方面比缓冲液中的酶显示出2.53 倍的提高。表2详细描述了对于各种疏水改性脱乙酰壳多糖的葡萄糖氧化 酶的活性。
表2：对于改性脱乙酰壳多糖的葡萄糖氧化酶的酶活性
膜/溶剂 酶活性(单位/gm)
缓冲液 103.61±3.15
未改性脱乙酰壳多糖 214.86±10.23
己基脱乙酰壳多糖
氯仿 248.05±12.62
叔戊醇 263.05±7.54
50％乙酸 118.98±6.28
癸基脱乙酰壳多糖
氯仿 237.05±12.31
叔戊醇 238.05±10.02
50％乙酸 3.26±2.82
辛基脱乙酰壳多糖
氯仿 232.93±7.22
叔戊醇 245.75±9.77
50％乙酸 127.55±11.98
丁基脱乙酰壳多糖
氯仿 219.15±9.58
叔戊醇 217.10±6.55
50％乙酸 127.65±3.02
[0076]为了制备本发明具有烷基基团作为改性剂的疏水改性脱乙酰壳 多糖，将脱乙酰壳多糖凝胶悬浮在乙酸中，随后加入醇溶剂。向所述脱乙 酰壳多糖凝胶中加入醛(例如，丁醛、己醛、辛醛或癸醛)，随后加入氰基 硼氢化钠。所得到的产物通过真空过滤分离并采用醇溶剂洗涤。然后将改 性脱乙酰壳多糖在真空烘箱内于40℃下干燥，得到片状白色固体。
[0077]为了制备本发明的具有氧化还原介体作为改性剂的疏水改性脱 乙酰壳多糖，通过使4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶与二异丙基胺锂接触，然后加 入二卤代烷生产4-甲基-4’-(6-卤代烷基)-2，2’-联吡啶衍生得到氧化还原介 体配位体。然后在无机碱的存在下使所述配位体与Ru(联吡啶)2Cl2水合物 接触并且在水-醇混合物中回流直至Ru(联吡啶)2Cl2耗尽。然后将产物用六 氟磷酸铵或任选地钠或钾的高氯酸盐沉淀，随后重结晶。然后使衍生的氧 化还原介体(Ru(联吡啶)2(4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶)+2)与脱乙酰化 的脱乙酰壳多糖接触并加热。然后使氧化还原介体改性的脱乙酰壳多糖沉 淀和重结晶。
[0078]疏水改性脱乙酰壳多糖膜在乙醇中具有有利的不溶性。例如， 上述脱乙酰壳多糖酶固定化材料通常能够在具有最高至大于约99重量％ 或99体积％的乙醇的溶液中使酶固定化和稳定化。在各种实施方案中，脱 乙酰壳多糖固定化材料在具有15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95或更多重量％或体积％乙醇的溶液中起作用。
[0079]在其它实施方案中，胶束或反向胶束酶固定化材料为多阴离子 聚合物，例如疏水改性多糖，特别是疏水改性藻酸盐。藻酸盐是含有β-(1-4)- 连接的D-甘露糖醛酸(mannuronic acid)和α-(1-4)-连接的L-古罗糖醛酸 (guluronic acid)酸残基的线性非支化聚合物。在未质子化的形式中，β-(1-4)- 连接的D-甘露糖醛酸符合式3A的结构
并且呈未质子化的形式，a-(1-4)-连接的L-guluronic酸符合式3B的结构
藻酸盐是由甘露糖醛酸残基的聚合物段和guluronic酸残基的聚合物段构 成的多相聚合物。
并且呈未质子化的形式，a-(1-4)-连接的L-guluronic酸符合式3B的结构
藻酸盐是由甘露糖醛酸残基的聚合物段和guluronic酸残基的聚合物段构 成的多相聚合物。
[0080]藻酸盐聚合物可采用各种方法改性。一种类型是采用大于铵 (NH4+)离子的疏水阳离子改性的藻酸盐。疏水阳离子提供双重功能：(1)决 定聚合物的孔尺寸和(2)用作化学缓冲液以帮助保持孔的pH水平，两功能 均使酶稳定化。关于疏水阳离子的第一种功能，采用疏水阳离子改性藻酸 盐产生其中孔尺寸取决于疏水阳离子大小的酶固定化材料。因此，采用疏 水阳离子改性藻酸盐的程度、尺寸和形状影响着孔的尺寸和形状。疏水阳 离子的这种功能允许孔尺寸变大或变小或具有不同形状以通过改变疏水阳 离子的大小或支化适应特定的酶。
[0081]关于疏水阳离子的第二种功能，藻酸盐聚合物的性能通过使疏 水阳离子交换作为藻酸盐上-CO2-基团的反离子的质子得以改变。所述反离 子交换对pH提供了缓冲效应，因为疏水阳离子对-CO2-位点比质子具有更 大的亲和性。藻酸盐膜的这种缓冲效应导致孔的pH随着溶液pH的改变 基本上保持不变；换句话说，孔的pH对抗了溶液pH变化。另外，藻酸 盐膜提供了机械屏障，其进一步保护了固定化的酶。
[0082]为了制备改性藻酸盐膜，第一步是浇铸与疏水阳离子溶液的藻 酸盐的聚合物的悬浮液形成膜。然后将过量的疏水阳离子及其盐从膜中提 取出来，并且将膜再浇铸。在再浇铸时，膜含有与藻酸盐膜的-CO2-位点结 合的疏水阳离子。从膜中除去疏水阳离子的盐得到更加稳定和可再生产的 膜，因为过量的盐可陷入孔中并在膜中产生孔隙。
[0083]在一个实施方案中，改性的藻酸盐膜通过浇铸与疏水阳离子盐 例如季铵溴化物的溶液的藻酸盐聚合物的悬浮液制备。过量的季铵溴化物 或溴化氢在将膜再浇铸以形成盐提取的膜之前从膜中除去。膜的盐提取在 羧酸交换位点保留了季铵阳离子的存在，但是消除了来自可能陷入孔中并 可能在平衡的膜内产生孔隙的过量的盐的复杂性。示例性疏水阳离子为基 于铵的阳离子、季铵阳离子、烷基三甲基铵阳离子、烷基三乙基铵阳离子、 有机阳离子、鏻阳离子、三苯基鏻、吡啶鎓阳离子、咪唑鎓阳离子、十六 烷基吡啶鎓、乙锭、紫精、甲基紫精、苄基紫精、二(三苯基膦)亚胺、金 属络合物、联吡啶金属络合物、基于菲咯啉的金属络合物、[Ru(联吡啶)3]2+ 和[Fe(菲咯啉)3]3+。
[0084]在一个优选的实施方案中，疏水阳离子为基于铵的阳离子。特 别地，疏水阳离子为季铵阳离子。在另一个实施方案中，季铵阳离子由式 4表示：
其中R1、R2、R3和R4独立地为氢、烃基、取代烃基、或杂环，其中R1、 R2、R3和R4的至少之一不是氢。在另一个实施方案中，优选R1、R2、R3 和R4独立地为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，其中R1、R2、 R3和R4的至少之一不是氢。在另一个实施方案中，R1、R2、R3和R4相同 且为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。在又一个实施方案中，优选 R1、R2、R3和R4为丁基。优选季铵阳离子为四丙基铵(T3A)、四戊基铵 (T5A)、四己基铵(T6A)、四庚基铵(T7A)、三甲基二十烷基(icosyl)铵 (TMICA)、三甲基辛基癸基铵(TMODA)、三甲基己基癸基铵(TMHDA)、 三甲基十四烷基铵(TMTDA)、三甲基辛基铵(TMOA)、三甲基十二烷基铵 (TMDDA)、三甲基癸基铵(TMDA)、三甲基己基铵(TMHA)、四丁基铵 (TBA)、三乙基己基铵(TEHA)、及其组合。
其中R1、R2、R3和R4独立地为氢、烃基、取代烃基、或杂环，其中R1、 R2、R3和R4的至少之一不是氢。在另一个实施方案中，优选R1、R2、R3 和R4独立地为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，其中R1、R2、 R3和R4的至少之一不是氢。在另一个实施方案中，R1、R2、R3和R4相同 且为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。在又一个实施方案中，优选 R1、R2、R3和R4为丁基。优选季铵阳离子为四丙基铵(T3A)、四戊基铵 (T5A)、四己基铵(T6A)、四庚基铵(T7A)、三甲基二十烷基(icosyl)铵 (TMICA)、三甲基辛基癸基铵(TMODA)、三甲基己基癸基铵(TMHDA)、 三甲基十四烷基铵(TMTDA)、三甲基辛基铵(TMOA)、三甲基十二烷基铵 (TMDDA)、三甲基癸基铵(TMDA)、三甲基己基铵(TMHA)、四丁基铵 (TBA)、三乙基己基铵(TEHA)、及其组合。
[0085]研究孔性能并且一种疏水改性藻酸盐膜的结果示于图12中。所 述膜的孔结构对于酶固定化而言是理想的，因为孔是疏水的、在结构上是 胶束、对外部pH变换具有缓冲、并且具有高的孔互连性。
[0086]在另一个实施方案中，将超低分子量藻酸盐和十二烷基胺置于 25％乙醇中并且回流以通过羧酸基团的酰胺化生产十二烷基改性的藻酸 盐。各种烷基胺均可代替十二烷基胺生产具有C4-C16烷基基团连接到藻酸 盐结构的反应性羧酸基团的可变数量的烷基改性藻酸盐。在各种实施方案 中，至少约1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48％或更多的羧酸基团与烷基胺 反应。
[0087]疏水改性藻酸盐膜在乙醇中具有有利的不溶性。例如，上述藻 酸盐酶固定化材料通常用于在具有至少约25重量％或25体积％的乙醇的 溶液中使酶固定化和稳定化。在各种实施方案中，藻酸盐固定化材料在具 有25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多重 量％或体积％乙醇的溶液中起作用。6.生物阴极实施方案
[0088]各种生物阴极可结合到本发明的生物燃料电池中。例如，所述 生物阴极描述于美国专利申请10/931,147(作为美国专利申请公开 2005/0095466公布)，在此将其全文引入以作参考。B.生物阳极
[0089]在一个实施方案中，生物阳极包括电子导体和固定在酶固定化 材料中的酶。在另一个实施方案中，生物阳极任选进一步包含用于电子介 体的电催化剂。当生物阳极接触能够在电子导体处进行可逆氧化还原反应 的电子介体时电催化剂可不存在于生物阳极中。以上确定的生物阳极组件 彼此相邻；意思是它们通过适当方式物理或化学连接。由于组件通常与生 物阴极组件相同，在适当的情况下，以下讨论涉及，各个元件的组成差别 和功能差别。1.电子导体
[0090]如同生物阴极一样，生物阳极的电子导体可以在性质上是有机 或无机的，只要能够通过该材料传导电子。在一个实施方案中，生物阳极 电子导体是碳纸。2.电子介体
[0091]生物阳极电子介体用于接受或者供给电子，易于从氧化态变为 还原态。电子介体是可以扩散到固定化材料中和/或掺入到固定化材料中的 化合物。如同生物阴极一样，优选电子介体的扩散系数最大化。
[0092]示例性电子介体是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，黄素腺嘌呤 二核苷酸(FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADP)、或者吡咯并喹啉 醌(PQQ)、或者每一种的等同物、及其组合。其它示例性电子介体是吩嗪 硫酸甲酯(phenazine methosulfate)、二氯酚靛酚、短链泛醌、铁氰化钾、 蛋白质、金属蛋白、漆树蓝蛋白及其组合。在一个优选的实施方案中，生 物阳极处的电子介体为NAD+。
[0093]当电子介体不能自己在电子导体处进行氧化还原反应时，生物 阳极包含用于电子介体的电催化剂，所述电催化剂促进了电子导体处电子 的释放。或者，将具有0.0V±0.5V的标准还原电势的可逆氧化还原对用作 电子介体。换句话说，可以使用在电子导体表面上提供可逆电化学的电子 介体。电子介体与依赖于该电子介体的天然存在的酶、经改性而依赖于该 电子介体的酶，或者依赖于该电子介体的合成酶偶联。在电子导体表面上 提供可逆电化学的电子介体的实例是吡咯并喹啉醌(PQQ)、吩嗪硫酸甲酯、 二氯酚靛酚、短链泛醌和铁氰化钾。在该实施方案中，用于生物阳极的优 选电子介体是PQQ。由于电子介体能够在电子导体表面提供可逆电化学， 在该实施方案中不必用电催化剂催化氧化还原反应。
[0094]用于通过生物阳极的氧化还原聚合物的电催化的基材的优选化 合物包括还原的腺嘌呤二核苷酸，例如NADH、FADH2和NADPH。3.用于电子介体的电催化剂
[0095]通常，电催化剂是在电子导体处促进电子释放的物质。换句话 说，电催化剂改善了电子介体的还原或者氧化的动力学从而可以在较低的 标准还原电位下发生电子介体氧化或还原。电催化剂可以在生物阳极可逆 地被氧化以产生电子并且，因此产生电。当电催化剂与电子导体相邻时， 电催化剂和电子导体彼此电接触，但是不必彼此物理接触。在一个实施方 案中，电子导体是用于电子介体的电催化剂的部分，与所述电催化剂结合 或者相邻。
[0096]通常，电催化剂可以是吖嗪、导电聚合物或者电活性聚合物。 示例性电催化剂是亚甲绿、亚甲蓝、鲁米诺、硝基-芴酮衍生物、吖嗪、锇 菲咯啉二酮、儿茶酚-侧基三联吡啶、甲苯蓝、甲酚蓝、尼罗蓝、中性红、 吩嗪衍生物、tionin、天青A、天青B、甲苯胺蓝O、苯乙酮、金属酞菁、 尼罗蓝A、改性过渡金属配位体、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6- 二醇、[Re(phen-二酮)(CO)3Cl]、[Re(phen-二酮)3](PF6)2、聚(金属酞菁)、 聚(硫堇)、醌、二亚胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩噁嗪、甲苯 胺蓝、亮甲酚蓝、3，4-二羟基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天青I)、聚(尼罗蓝 A)、聚(亚甲绿)、聚(亚甲蓝)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻 吩并[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-亚乙基二氧吡咯)、聚(异硫茚)、 聚(3，4-亚乙基二氧噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亚甲基-4H-环戊 [2，1-b；3，4-b’]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性红)、蛋白质、金属 蛋白、漆树蓝蛋白或其组合。在一个优选的实施方案中，电子介体的电催 化剂是聚(亚甲绿)。4.酶
[0097]酶催化生物阳极处燃料流体的氧化。由于酶还还原生物阴极处 的氧化剂，所以他们更通常在以上I.A.1.d中描述。通常，可以利用天然存 在的酶、人造酶、人工酶和改性的天然存在的酶。此外，可以使用通过天 然或者定向进化工程化的工程处理酶。换句话说，在本发明的实施方案中 可以使用模拟酶的性能的有机或无机分子。
[0099]在另一个优选的实施方案中，所述酶是脱氢酶。该实施方案中 的示例性酶包括醇脱氢酶、醛脱氢酶、甲酸盐脱氢酶、甲醛脱氢酶、葡萄 糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、乳糖脱氢酶、丙酮酸脱氢酶或者 脂肪氧合酶(lipoxygenase)。优选酶为醇脱氢酶(ADH)。
[0100]当使用乙醇作为燃料时，可以使用Krebs cycle的酶。例如，在 生物阳极中可以使用乌头酸酶、富马酸酶、苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、 琥珀酰-CoA合成酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶、柠檬酸合酶及其 组合。
[0101]在当前优选的实施方案中，所述酶是PQQ依赖醇脱氢酶。PQQ 是PQQ依赖ADH辅酶并且保持静电结合到到PQQ依赖ADH并且因此 该酶将保持在膜中，导致生物燃料电池的寿命和活性增加。PQQ依赖醇脱 氢酶从葡萄糖杆菌(gluconobacter)提取。当提取PQQ依赖ADH时，它可 以呈两种形式：(1)PQQ静电结合到PQQ依赖ADH上或者(2)PQQ不静电 结合到PQQ依赖ADH上。对于PQQ不静电结合到PQQ依赖ADH上的 第二种形式，当组装生物阳极时将PQQ加入到ADH中。在当前优选的实 施方案中，从葡萄糖酸菌中提取PQQ静电结合的PQQ依赖ADH。5.酶固定化材料
[0102]如上所述，在生物燃料电池的生物阳极和/或生物阴极处使用酶 固定化材料。关于酶固定化材料的组成和固定化机理的进一步描述可见于 以上I.A.5。在一个实施方案中，生物阳极的酶固定化材料对于燃料流体是 可渗透的并且使酶固定化和稳定化。固定化材料对燃料流体是可渗透的， 从而燃料流体在生物阳极处的氧化可以通过固定化酶催化。优选地，酶固 定化材料是疏水改性多糖，特别是疏水改性脱乙酰壳多糖或疏水改性藻酸 盐。6.生物阳极实施方案
[0103]在另一个实施方案中，电子介体可以物理结合到酶上。物理连 接可以是电子介体与酶之间的共价键或离子键。在另一个实施方案中，如 果电子介体能够在电子导体处进行可逆的电化学反应，那么电子介体可以 物理结合到酶上并且电子介体还可以物理结合到电子导体上。
[0104]在又一个实施方案中，电子介体固定在固定化材料中。在优选 的实施方案中，电子介体是固定在疏水改性脱乙酰壳多糖或疏水改性藻酸 盐膜中的NAD+。在该实施方案中，在向电池中加入燃料流体之后，NAD+ 被还原成NADH并且NADH可以通过疏水改性脱乙酰壳多糖膜或通过疏 水改性藻酸盐膜扩散。
[0105]制备和使用生物阳极的方法是本领域已知的，所述方法可以用 于制造和使用包含本发明的生物阴极的生物燃料电池。优选的生物阳极描 述于美国专利申请10/617,452(作为美国专利申请公开2004/0101741公布) 中，在此将全文引入以作参考。其他可能有用的生物阳极描述于美国专利 6,531,239和6,294,281中，在此也将其引入以作参考。C.燃料流体和氧化剂
[0106]可以在生物阳极处被氧化以产生电子的燃料流体和可以在生物 阴极被还原产生水的氧化剂是本发明的生物燃料电池的组分。
[0107]用于生物阳极的燃料流体在电子介体和固定化酶的氧化反应中 消耗。燃料流体的分子大小足够小，从而通过酶固定化材料的扩散系数很 大。示例性燃料流体是氢、氨、醇(如甲醇、乙醇、丙醇、异丁醇、丁醇和 异丙醇)、烯丙醇、芳基醇、甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖醛酸、醛、糖 类(如葡萄糖、葡萄糖-1、D-葡萄糖、L-葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酯、乳酸酯、 乳酸酯-6-磷酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、果糖、半乳糖-1、半乳糖、醛糖、 山梨糖和甘露糖)、甘油酸酯、辅酶A、乙酰Co-A、苹果酸酯、异柠檬酸 酯、甲醛、乙醛、乙酸酯、柠檬酸酯、L-葡糖酸酯、β-羟基类固醇、α-羟 基类固醇、乳醛(lactaldehyde)、睾酮、葡糖酸酯、脂肪酸、脂类、磷酸甘 油酸酯、视黄醛、雌二醇、环戊醇、十六醇、长链醇、松柏醇、肉桂醇、 甲酸酯、长链醛、丙酮酸酯、丁醛、酰基CoA、类固醇、氨基酸、黄素、 NADH、NADH2、NADPH、NADPH2、烃、胺及其组合。在优选的实施 方案中，燃料流体是醇，更优选甲醇和/或乙醇；且最优选乙醇。
[0108]使用生物阳极提供的电子在电子介体和固定化酶的还原反应中 消耗生物阴极的氧化剂。氧化剂的分子大小足够小，从而通过酶固定化材 料的扩散系数很大。可以利用提供本领域已知的氧化剂来源的多种方法。
[0109]在优选的实施方案中，氧化剂是气体氧，其通过扩散输送到生 物阴极。在另一个优选的实施方案中，氧化剂是过氧化物化合物。
[0110]实施方案的生物燃料电池可以包含(i)如上所述的生物阳极；(ii) 如上所述的生物阴极；(iii)如上所述的生物阳极和生物阴极；(iv)如上所述 的生物阳极和如美国专利申请10/931,147(作为美国专利申请公开 2005/0095466公布)中所述的生物阴极；和(v)如美国专利申请10/617,452(作 为美国专利申请公开2004/0101741公布)中所述的生物阳极和如上所述的 生物阴极。
[0111]本发明的生物燃料电池可包含聚合物电解质膜(“PEM”或盐桥， 例如，117)以将阳极室与阴极室分离。但是，对于具有生物阳极和 生物阴极的实施方案来说，不需要PEM并且产生无膜生物燃料电池。用 于氧化剂或燃料流体反应的催化的用在生物阳极和生物阴极中的酶优选使 得不需要将阳极室与阴极室物理分离。II.微流体生物燃料电池
[0112]本发明的各种方面之一是微流体生物燃料电池，其利用燃料流 体经发生在其中具有固定化酶的微模制的微电极处的酶介导的氧化还原反 应产生电。象在标准生物燃料电池中一样，生物阳极是用于燃料流体氧化 反应同时释放电子的位点。电子从生物阳极通过电连接端子流向某些耗电 器件。电子穿过器件至另一个电连接端子，所述电连接端子将电子输送到 生物燃料电池的阴极，在该处使用电子还原氧化剂产生水。采用这种方式， 本发明的生物燃料电池用作用于外部电力负荷的能源(电)。为了促进燃料 流体的氧化还原反应，微电极包含电子导体、电子介体、用于电子介体的 电催化剂、酶和酶固定化材料。
[0113]但是，与标准生物燃料电池不同，本发明的生物燃料电池至少 利用一个微模制的电极。在一个实施方案中，微模制的电极具有流动通过 结构，该结构允许燃料在微电极中流动。当与常规生物燃料电池电极相比 较时，该结构由于与燃料接触的较大量的微电极表面积而产生较高的电流 密度。在另一个实施方案中，微模制的电极具有不规则的构形。再一次地， 由于与燃料接触的较大量的微电极表面积，微电极的电流密度高于常规生 物燃料电池。该特征与本文所公开的其它特征相结合由尺寸较小的来源产 生了与常规生物燃料电池相比增加的电流密度。最后，本发明的方法可以 有利地经济地用于生产一次性的燃料电池。A.微流动通道
[0114]除了生物阳极和/或生物阴极以外，微流体燃料电池的特征在于 至少一种微流动通道，其在使用中容纳生物阳极和/或生物阴极、燃料流体 和氧化剂。微流动通道的构型可根据应用而变化。在一个实施方案中，微 流动通道可简单地为一个矩形室，其中包含生物燃料电池的生物阳极和/ 或生物阴极。参见图5。在另一个实施方案中，微流动通道的构型可以为 了任何所需目的更加精心设计以便确保生物阳极溶液和生物阴极溶液不会 彼此物理接触。参见图6。
[0115]参见图5和6，燃料流体和/或氧化剂流过微流动通道(34)，越过 或通过微电极，从微流动通道的一端(入口)(33)至相对的一端(出口)(35)。 在图6中，生物阳极由(41)表示且生物阴极由(40)表示。微流动通道应该促 进燃料流体和/或氧化剂在微电极之上地对流，同时抑制其泄漏到微流动通 道(34)以外。B.电连接端子
[0116]电连接端子提供了从微电极至微流体生物燃料电池以外的电力 负荷的电接触。在最通常的意义上，电连接端子可以是促进电子从生物阳 极转移至电力负荷并且回到生物阴极的任何材料和结构。在一个优选的实 施方案中，微流体生物燃料电池的电连接端子提供了连接导线，另一个器 件可对其进行物理和电接触。然后所述另一个器件例如铜线输送电子，所 述电子被输送到外部电力负荷和从外部电力负荷进行输送。
[0117]在一个优选的实施方案中，电连接端子是在其它加工之前在微 流体生物燃料电池的基材上形成的薄层连接端子。在该实施方案中，随后 形成的微电极如此排列，即它们贯穿交叉其各个电连接端子。在另外的实 施方案中，电连接端子是在其加工之后连接到微电极上的导电材料的圆柱 体。III.微流体生物燃料电池的制造
[0118]在制造根据本发明的微流体生物燃料电池中，使用在其上构建 其它生物燃料电池组件的基材。在优选的实施方案中，第一步是形成电连 接端子，随后制造微电极，和确定生物燃料室的任选步骤。在另外的实施 方案中，在其它部件之后形成电连接端子。A.电连接端子的制造
[0119]本发明的微流体生物燃料电池通过提供在其上形成剩余组件的 基材形成。基材可由非导电、不使微电极的导电材料钝化的任何材料制成， 导电材料在加工中粘合到其上，并且模具可以可逆地密封到其上。在一个 实施方案中，基材是玻璃。在优选的实施方案中，基材是聚(二甲基硅氧 烷)(PDMS)。在另一个优选的实施方案中，基材是聚碳酸酯。在一个实施 方案中，基材是平板。在另外的实施方案中，基材可呈有利于适应特殊应 用的几何形状。
[0120]在优选的实施方案中，在基材上形成的第一个生物燃料电池部 件是电连接端子，其可以与完成的生物燃料电池中的微电极电接触以提供 将外部电力负荷连接到微电极的装置。连接端子可以由任何导电材料制成。 示例性材料包括铂、钯、金、那些贵金属的合金、碳、镍、铜和不锈钢。 在优选的实施方案中，电连接端子由铂制成。
[0121]连接端子可以使用硅片工业中已知的常规光刻技术在基材上形 成。例如，为了形成薄层铂电连接端子，首先将钛粘合层溅射到基材上。 随后在钛层上溅射铂层。两种溅射过程均可例如在氩离子溅射体系中进行。 然后通过光刻法形成连接端子，将光刻胶施涂到铂层以保护所需连接端子 位置。采用商购的蚀刻剂化学蚀刻两层随后去除光刻胶得到最终的铂电连 接端子。在另外的实施方案中，电连接端子是最后形成的部件。该实施方 案在下面III.B.6中详细描述。B.微电极的制造
[0122]在生物燃料电池的基材上制造电连接端子之后，下一个步骤是 制造生物阳极和生物阴极。这些可依次或者同时形成。1.生物阳极的制造
[0123]在一个实施方案中，生物阳极和生物阴极在基材上依次形成， 其中形成顺序并不重要。仅仅为了介绍，首先详细描述生物阳极的制造。 制造微尺度的生物阳极的第一步是在浇铸模具的表面中形成微通道图案。 通常，浇铸模具可以由非导电、不使导电材料钝化的任何材料制成并且能 够可逆地密封到基材上，示例性材料包括硅、玻璃和聚合物。浇铸模具优 选由聚合物制成，更优选由PDMS制成。最优选地，浇铸模具由聚碳酸酯 制成。
[0124]在浇铸模具是聚合物的优选实施方中，图案通过使用已知的软 光刻技术形成以在浇铸模具中产生微通道以确定生物阳极的形状和尺寸。 软光刻技术通常需要针对具有所需图案的凸起图像的光刻确定的母片 (master)浇铸预聚物的过程。使用的软光刻技术应该能够在浇铸模具中产 生约1μm至约1mm，约1μm至约200μm，优选约10μm至约200μm，更 优选约10μm至约100μm，且最优选约10μm一样小或更少的微通道。示 例性软光刻技术包括近场相转移光刻、仿形模制、微转移模制(μTM)、溶 剂协助的微接触模制(SAMIM)和微接触印刷(μCP)。优选地，微通道使用 仿形模制形成。
[0125]在浇铸模具中形成微通道之后，浇铸模具的图案侧粘合到基材 上以完成微电极的模制。参见图7(a)。在预先已经在基材上形成电连接端 子(31)的实施方案中，微通道应该沿电连接端子排列以便最终的微电极与 连接端子电接触。此外，将管接头(30)粘合到基材上以保持后期形成入口 贮液池的位置。
[0126]接着，参见图7(b)，电子导体溶液通过在微通道的一端的浇铸 模具中形成的入口贮液池(32)流入浇铸模具的微通道。所述入口贮液池(32) 类似于金属浇铸传统技术中的浇注槽。过量的溶液将在位于入口贮液池对 面的微通道的末端的出口处流出微通道。
[0127]电子导体溶液可以是包含电子导体来源和可以经固化除去得到 固体微电极的液体载体的任何溶液。多种可能的电子导体材料列于以上 I.A.1中。在一个优选的实施方案中，电子导体来源为碳源。在更优选的实 施方案中，电子导体来源为基于碳的油墨。在一个所述实施方案中，液体 载体为基于碳的油墨稀释剂，例如Ercon N160 Solvent Thinner。根据溶液 中液体载体的性质，根据本发明可形成两种类型的微电极结构——固态微 电极或流动通过微电极。采用较低粘度的液体载体，产生固态微电极。这 些微电极基本上是连续的和固态的，并且燃料流体在使用过程中流过所述 微电极。采用较高粘度的液体载体，产生流动通过微电极，其结构使得燃 料流体在使用过程中流过所述微电极，有效地提高了微电极与燃料流体接 触的表面积。
[0128]不考虑特殊结构，根据本发明形成的微电极比使用常规方法形 成的微电极(其必然具有平面构形)具有许多优点。流过常规微电极的任何 流体具有通常为矩形的流动型式并且与通常确定量的微电极表面积接触。 这种平面几何表面积通过将平面微电极的顶面和侧面的矩形表面积相加计 算。由于微电极的电流生产很大程度上通过与燃料流体接触的表面积来决 定，平面微电极电流生产能力仅可通过增加其尺寸来提高。相反，根据本 发明形成的微电极具有高度不规则的三维构形，其产生至少两种明显的优 点。第一，本发明的微电极的有效表面积与平板筛网印刷的微电极相比显 著增加。本文所述微电极的有效表面积是表征微电极构形的各个峰与谷的 表面积之和。计算所述有效表面积的一个精确方法是将根据本发明形成的 微电极的输出电流与相同长度、宽度和高度尺寸的平面微电极相比较。例 如，所述微电极分析已显示，与常规玻璃碳电极的输出电流为 2.06×10-4A/cm2相比，本发明的微电极的输出电流为9.85×10-4A/cm2。进一 步地，微电极的不规则构形可产生流体的湍流。所述流动型式是有利的， 因为它包括在微电极上混合流体，其又提高了流体至微电极的传输速率。 提高流体的传输速率促进了微电极内发生的反应，从而提高了微电极的电 流负载能力。
[0129]在一个任选的实施方案中，使底漆流入到浇铸模具的微通道内 并且在加入电子导体溶液之前快速干燥。底漆可以是有助于抑制电子导体 半永久地粘合到浇铸模具上的任何材料。例如，在基于碳的油墨的实施方 案中，基于碳的油墨稀释剂看用作底漆，如果需要的话。
[0130]在溶液填充到浇铸模具的微通道内之后，加热使电子导体溶液 固化。通常，加热应该在足以从溶液中除去液体载体的温度下进行，但应 足够低以便不使微电极受损。在一个优选的实施方案中，加热在约75□C 下发生。而且，加热应该施加足以从溶液中除去基本上所有液体载体的时 间。在一个优选的实施方案中，加热至少约1小时。在另一个优选的实施 方案中，加热在约75℃下发生至少约1小时。参见图7(c)，固化过程产生 固体微电极(36)，由于载体蒸发其比浇铸模具的微通道的原始尺寸小约 20％。
[0131]在根据本发明的方法中，处理微电极赋予其电子介体、用于电 子介体的任选的电催化剂、酶和酶固定化材料以经至少四个实施方案之一 形成生物阳极。在第一个实施方案中，将含有酶的酶固定化材料施涂到固 化的微电极上，随后加入电子介体和任选的电催化剂。为了形成生物阳极， 在使微电极固化之后从基材上除去浇铸模具。参见图7(c)。参见图7(d)， 代替浇铸模具，将具有浇铸模具的微通道约两倍宽度的微通道(34)的透气 模具可逆地密封到微电极上。透气模具可以由非导电、不使电子导体钝化 并促进溶剂蒸发的任何材料制成。优选地，使用硅聚合物，例如PDMS作 为透气模具材料。更优选地，热塑性树脂，例如聚碳酸酯为透气模具材料。 在放置好透气模具之后，将含有生物阳极酶的酶固定化材料施涂到固化的 微电极上。这可以通过将浇铸溶液用注射器送到入口贮液池(33)并通过透 气模具直至出口排气口(35)得以实现。在这一点上，任选包含电催化剂的 电子介体溶液使用如上所述的入口贮液池(33)和排气口(35)液体动力地流 过透气模具的微通道。在微通道的宽度为微电极宽度约两倍的情况下，少 量电子介体溶液不可避免地涂布到基材上；但是，这确保了适当地涂布整 个微电极。然后允许电子介体溶液的溶剂通过透气模具或通过模具中的入 口贮液池和/或排气口蒸发，留下生物阳极。如果需要将电子介体聚合，可 为此使用电聚合方法。如果需要将电子介体电聚合，则并不很需要该技术 方案。对于完成的生物阳极参见图7(d)。
[0132]因此，在更优选的第二个实施方案中，将电子介体和任选的电 催化剂施涂到固体微电极上，如果需要的话将电子介体电聚合，然后将含 有酶的酶固定化材料施涂到微电极上。在第二个实施方案中，在使微电极 固化之后从基材上除去浇铸模具。代替浇铸模具，将如上所述的透气模具 可逆地密封到微电极上。此处，任选包含电催化剂的电子介体使用如上所 述的入口贮液池和排气口液体动力地流过透气模具的微通道。再一次地， 少量电子介体溶液不可避免地涂布到基材上，但这确保了完全涂布整个微 电极。然后允许电子介体溶液的溶剂通过透气模具蒸发，留下电子介体涂 布的微电极。如果需要将电子介体聚合，可为此使用电聚合方法。接着， 将含有生物阳极酶的酶固定化材料施涂到生物阳极上。这通过将含有酶固 定化材料和生物阳极酶的溶液用注射器送到入口贮液池并通过透气模具实 现。
[0133]在更优选的第三实施方案中，电子介体和任选的电催化剂在注 入浇铸模具之前加入到电子导体溶液中，并且在固化之后，将含有酶的酶 固定化材料施涂到固化的微电极上。在第三实施方案中，电子介体和任选 的电催化剂在加入浇铸模具的微通道之前悬浮在电子导体溶液中。然后使 改性的电子导体溶液流入到浇铸模具的微通道并使其固化，如以上III.A 中所述。该实施方案有利地提高了生物阳极的导电性，通过省略工艺步骤 增加了简单性，并且改善了电子介体的迁移效率。该实施方案还产生了具 有各个电子介体的选择性的高导电复合生物阳极，同时还具有迁移效率的 气体扩散形式的阳极。如果需要，可在此时进行电子介体的电聚合。此后， 将含有生物阳极酶的酶固定化材料施涂到改性微电极上以形成生物阳极。 这通过将含有酶固定化材料和生物阳极酶的溶液用注射器送到入口贮液池 并通过透气模具实现。
[0134]在最优选的第四个实施方案中，将电子介体、任选的电催化剂 和含有酶的酶固定化材料在注入浇铸模具中之前都在电子导体溶液中混合 以在固化时生产根据本发明的完整生物阳极。在第四个且最优选的实施方 案中，将电子介体、任选的电催化剂和含有酶的酶固定化材料都在电子导 体溶液中混合。然后如上所述将溶液加入到浇铸模具中。固化改性的溶液 形成根据本发明的完整生物阳极。该实施方案代表最简单的生物阳极形成 技术，省略了其它实施方案需要的额外步骤和模具。
[0135]在所有的实施方案中，酶固定化材料、酶、电子介体和任选的 电催化剂的具体组成在以上I.B.2-I.B.4中描述。用于生物阳极的优选酶固 定化材料是疏水改性多糖，特别是疏水改性脱乙酰壳多糖或疏水改性藻酸 盐。阳极处的优选酶是醇脱氢酶。但使用电子介体/电催化剂组合时，它们 分别优选为NAD+和聚(亚甲绿)。如果使用提供可逆电化学的电子介体，优 选的电子介体为PQQ。而且，在所有的实施方案中浇铸模具可包括多于一 个微通道。2.生物阴极的制造
[0136]为了形成根据本发明的生物阴极，可以使用与用于制造生物阳 极的相同的一般工艺步骤生产生物阴极。采用酶固定化材料、酶、电子介 体和电催化剂的处理生物阴极的四个一般实施方案与用于生物阳极的相 同，尽管省去电催化剂是不适用的。酶固定化材料、酶、电子介体和电催 化剂的具体组成在以上I.A.2-I.A.5中描述。用于生物阴极的优选酶固定化 材料是疏水改性多糖，特别是疏水改性脱乙酰壳多糖或疏水改性藻酸盐。 另外对于阴极而言，优选的酶为胆红素氧化酶，优选的电子介体是胆红素， 且优选的电催化剂是在改性膜中的Ru(bpy)32+。C.形成可使用的生物燃料电池
[0137]在根据本发明形成生物阳极和生物阴极之后，任选除去浇铸模 具或透气模具。在该任选的实施方案中，生物阳极和生物阴极保留在基材 上。在除去浇铸模具或透气模具之后，微流动通道模壳(form)沿生物阳极 和生物阴极排列。对所述模壳微设计以便形成至少一个微流动通道，生物 燃料电池的燃料流体可流过该微流动通道。该模壳可由非导电、不使导电 材料钝化并且将粘合到基材上的任何材料制成。优选地，该模壳为PDMS。 更优选地，该涂层为聚碳酸酯。在该模壳中微通道的微图案可通过使用任 何已知的软光刻技术形成。在一个实施方案中，微流动通道是微电极的约 2至4倍。在另一个实施方案中，微流动通道与微电极尺寸近似相同。所 述模壳的微流动通道基本上划分了电化学池，在其中燃料流体与微电极形 成界面。当使用仅一个微流动通道容纳生物阳极、生物阴极、燃料流体和 氧化剂时，在相同微流体室内的燃料流体和氧化剂的混合物并不损害本发 明的微电极的功能，因为它们的氧化还原反应是选择性的。换句话说，生 物阳极将仅与燃料流体反应并且生物阴极将仅与氧化剂反应，并且不发生 交叉反应。
[0138]在另外的实施方案中，浇铸模具或透气模具保持与基材接触并 用于划分生物燃料电池的微流动通道，用作如上所述的微流动通道模壳。 在该实施方案中，燃料流体通过模具的微通道与生物阳极或生物阴极之间 的空间。在该实施方案中，必须进行随后的加工以在各个生物阳极与生物 阴极微流动通道之间形成连接。为了形成连接，在模具中通过任何适当的 方法，例如向模具的顶端施加垂直的力或者从模具中除去足量的材料，形 成连接各个微流体室的通道。其后，用密封该连接点以抑制操作过程中燃 料流体或氧化剂的泄漏的材料覆盖所述通道。所述材料必须能够与模具材 料结合以形成适当的密封。在一个实施方案中，覆盖材料简单地为一扁平 片模具材料，例如PDMS或聚碳酸酯。D.任选的形成实施方案
[0139]以上III.B.1中所述的微电极制造技术参见如下实施方案，其中 顺序形成生物阳极和生物阴极，随后经微通道连接生物阳极和生物阴极形 成生物燃料电池。在另外的实施方案中，生物阳极和生物阴极可同时形成。 在该实施方案中，使单个浇铸模具形成图案以形成生物阳极和生物阴极。 或者，可使用浇铸模具的组合形成单独的生物阳极和生物阴极。在任一种 情况下，在同时形成生物阳极和生物阴极之后，可通过施加微流动通道模 壳或者改性如以上III.B.3中所述浇铸模具形成可使用的生物燃料电池。
[0140]以上III.A.中所述实施方案描述了在其它工艺步骤之前在基材 上形成电连接端子。在另外的实施方案中，将电连接端子加入到微流体生 物燃料电池中作为最终的工艺步骤。此处，在微流动通道模壳或改性浇铸 模具中形成孔洞以使各个生物阳极和生物阴极的一部分暴露。接着，将电 连接端子物理连接到各个生物阳极和生物阴极的暴露部分。在该实施方案 中，电连接端子可以是使外部电力负荷与生物阳极和生物阴极电接触的任 何结构的任何材料。在一个优选的实施方案中，电连接端子是圆柱状铜体。 进一步地，能够保持电连接端子与生物阳极和生物阴极之间的电接触的任 何连接技术均可使用。在一个优选的实施方案中，可以使用银环氧膏电连 接电连接端子与生物阳极和生物阴极。该实施方案具有提高这些组件之间 的电导率的优点。
[0141]以上实施方案已经描述了生物燃料电池，其中在生物燃料电池 的微通道中容纳有生物阳极和生物阴极。尽管这是优选的实施方案，本发 明的其他实施方案包括位于燃料电池的微通道外面的阳极或阴极。此处， 燃料电池通过将微流体生物阳极或生物阴极与适当地的外部阳极或阴极组 合形成。E.微流体生物燃料电池的用途
[0142]在制造本发明可使用的微流体生物燃料电池完成之后，其可在 分别对于生物阳极和生物阴极而言流体燃料来源和氧化剂均可得到的应用 中利用。在使用中，燃料流体和氧化剂流经微流动通道接触生物阳极和生 物阴极。在那里，发生以上I.中所述的氧化还原反应形成电流来源。本发 明的微流体生物燃料电池可用于需要供电的任何应用中，例如电子器件、 商品玩具、内部医药器件和电动车辆。此外，本发明的微流体生物燃料电 池可植入到生物机体内，其中燃料流体衍生自有机体并且使用电流给植入 到生物机体内的器件供电。
[0143]另外，可将多个本发明的微流体生物燃料电池连接到串连电路 中形成生物燃料电池组。参见图8。串连电池组通过将一个生物燃料电池 的生物阳极(41)电连接到另一个生物燃料电池的生物阴极(40)上，而其又连 接到另一个生物阳极(41)上直至获得所需的电池组而形成。燃料流体和/或 氧化剂流入入口贮液池(33)中的微流体室内。通过形成电池组，微流体生 物燃料电池电路的总电压输出理论上为串连的各个微流体生物燃料电池的 电压输出之和。所述电池组的较大的总电压输出对于向功率要求高于各个 微流体生物燃料电池可提供功率的电子器件、玩具、医药器件和车辆供电 有用。IV.产生电的方法
[0144]本发明包括一种产生电的方法，其包括(a)在阳极使燃料流体氧 化和在阴极使氧化剂还原；(b)在生物阴极使氧化剂还原的过程中的电子介 体的还原形式氧化；(c)使电催化剂氧化；和(d)在电子导体处使电催化剂还 原，其中使用包含如上所述的生物阳极和/或生物阴极的燃料生物电池产生 电。产生电的另一个方法包括(a)在阳极使燃料流体氧化和在阴极使氧化剂 还原；(b)在生物阴极使氧化剂还原的过程中的电子介体的还原形式氧化； 和(c)在电子导体处使电子介体还原，其中使用包含如上所述的生物阳极和 /或生物阴极的燃料生物电池产生电。定义
[0145]本文所用的术语“烃”和“烃基”描述仅由元素碳和氢构成的有机 化合物或基团。这些部分包括烷基、烯基、炔基和芳基部分。这些部分还 包括用其它脂族或者环状烃基团取代的烷基、烯基、炔基和芳基，例如烷 芳基、烯芳基和炔芳基。除非另外指出，这些部分优选包含1至20个碳原 子。
[0146]本文描述的“取代烃基”部分是用至少一个不同于碳的原子取代 的烃基部分，包括其中将碳链原子用杂原子如氮、氧、硅、磷、硼或者卤 素原子取代的部分。这些取代基包括卤素、杂环、烷氧基、烯氧基、炔氧 基、芳氧基、羟基、保护的羟基、酮基、酰基、酰氧基、硝基、氨基、酰 氨基、硝基、氰基、硫羟、缩酮、缩醛、酯和醚。
[0147]除非另外指出，本文描述的烷基优选主链中含有1至8个碳原 子且含有最多20个碳原子的低级烷基。它们可以是直链或者支化或者环状 的并且包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、己基等等。
[0148]除非另外指出，本文描述的烯基优选为主链中含有2至8个碳 原子并且含有最多20个碳原子的低级烯基。它们可以是直链或者支化或者 环状的并且包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、己烯基 等等。
[0149]除非另外指出，本文描述的炔基优选为主链中含有2至8个碳 原子并且含有最多20个碳原子的低级炔基。它们可以是直链或者支化并且 包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、己炔基等等。
[0150]本文所用单独或者作为另一基团的部分的术语“芳基”或者 “ar”部分指的是任选取代的碳环芳基，优选环部分含有6至12个碳原子的 单环或双环基团，例如苯基、联苯基、萘基、取代苯基、取代联苯基或者 取代萘基。苯基和取代苯基是更优选的芳基。
[0151]本文所用单独或者作为另一基团的部分的术语“卤素”或者“卤” 指的是氯、溴、氟和碘。
[0152]本文所用单独或作为另一基团的部分的术语“酰基”指的是从有 机羧酸的基团-COOH除去羟基形成的部分，例如RC(O)-，其中R是R1、 R1O-、R1R2N-或者R1S-，R1是烃基、杂取代烃基，或者杂环，R2是氢、 烃基或者取代烃基。
[0153]本文所用单独或者作为另一基团的部分的术语“酰氧基”指的是 通过氧连接(-O-)结合的如上所述的酰基，例如RC(O)O-，其中R如有关术 语“酰基”中所定义。
[0154]术语“杂原子”将表示不同于碳和氢的原子。本文所用单独或作 为另一基团的部分的术语“杂环”或“杂环的”指的是任选取代的、完全饱和 或者不饱和的、单环或双环、芳族或非芳族基团，其在至少一个环中具有 至少一个杂原子，优选在每个环中有5或6个原子。杂环基团优选在环中 有1或2个氧原子，1或2个硫原子、和/或1至4个氮原子，并且可以通 过碳或杂原子结合到分子的剩余部分。示例性杂环包括杂芳族，例如呋喃 基、噻吩基、吡啶基、噁唑基、吡咯基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基等等。 示例性取代基包括一个或多个如下基团：烃基、取代烃基、酮基、羟基、 保护的羟基、酰基、酰氧基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、卤素、 酰氨基、氨基、硝基、氰基、硫羟、缩酮、缩醛、酯和醚。以下实施例解释说明本发明。
实施例
实施例1：制备烷基改性脱乙酰壳多糖
实施例
实施例1：制备烷基改性脱乙酰壳多糖
[0155]将中分子量脱乙酰壳多糖(购自Aldrich)(0.500g)通过快速搅拌 溶解到15mL 1％的乙酸中。这得到凝胶状溶液并且随后加入15mL甲醇。 将脱乙酰壳多糖凝胶搅拌约15分钟，然后将20mL醛(丁醛、己醛、辛醛 或癸醛)加入到脱乙酰壳多糖凝胶中，随后加入1.25g氰基硼氢化钠。将凝 胶继续搅拌直至悬浮液冷却至室温。所得到的产物通过真空过滤分离并用 150mL递增的甲醇洗涤三次。然后将改性脱乙酰壳多糖在真空烘箱内于 40℃下干燥两小时，留下薄片状白色固体。在50％乙酸、氯仿和叔戊醇中 形成各个聚合物的1重量％悬浮液。实施例2：制备Ru(联吡啶)2(4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶)+2改性的脱 乙酰壳多糖
[0156]Ru(联吡啶)2(4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶)+2改性的脱乙酰 壳多糖的制备以合成取代联吡啶，4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶开始。 为了制备取代联吡啶，将50mL含有1.69g 4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶的THF 在30分钟内逐滴加入到4.1mL含有9.1mmol二异丙基胺锂的THF中。将 所述混合物搅拌1.5小时，然后冷却至0℃，随后在搅拌下逐滴加入9.2mmol 所需链长的二溴烷烃。将该混合物搅拌1.5小时，用冰水骤冷，并用醚萃 取。将残余物从醋酸乙酯中重结晶3次。一旦制备了4-甲基-4’-(6-溴己 基)-2，2’-联吡啶，通过在60mL的2:3甲醇-水溶液中使1.315g Ru(bpy)2Cl2(呈其水合物形式)、0.8201g 4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶和 0.76g碳酸氢钠回流直至Ru(bpy)2Cl2消耗使其反应形成Ru(联吡啶)2(4-甲 基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶)+2。Ru(bpy)2Cl2的消耗通过UV-Vis吸收数据 确定。所得到的络合物通过加入4mL 3M六氟磷酸铵(或钠或钾的高氯酸盐) 沉淀，随后从丙酮/CH2Cl2中重结晶。该反应顺序产生77％的Ru(联吡 啶)2(4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联吡啶)+2。
[0157]制备之后，将137mg Ru(联吡啶)2(4-甲基-4’-(6-溴己基)-2，2’-联 吡啶)+2溶解在5mg脱乙酰化脱乙酰壳多糖在1％乙酸和DMF(1:1，1mL) 中的混合物中。将该混合物在90℃下加热12小时。反应之后，加入乙腈 使Ru(联吡啶)2(4-甲基-4’-(6-己基)-2，2’-联吡啶)+2改性的脱乙酰壳多糖沉 淀。收集沉淀物并通过溶解在1％乙酸中纯化，随后在甲醇中重结晶并在 减压下干燥。实施例3：疏水改性脱乙酰壳多糖的荧光成像
[0158]将2微升的各个聚合物悬浮液浇铸到玻璃载玻片(Fisher)上开且 在干燥器内干燥。将20μL体积的0.01mM Ru(bpy)32+或者0.01mM FITC 用移液管吸取到聚合物浇铸体上并使其浸泡2分钟。浸泡之后，将载玻片 用18MΩ水清洗并且使其在干燥器内干燥。使用Olympus BX60M表面荧 光(epifluorescence)显微镜(Melville，NY)使聚合物成像。采用摄像机(Sony SSC-DC50A)在40倍超长焦点距离的镜头下观察聚合物。激发荧光使用汞 灯实现。使用帧接收器卡片(integral Technologies，Inc.，Indianapolis，IN) 获得图像，并且在Dell PC上使用SPOT软件(Diagnostic Instruments，Inc.) 分析图像。进行各个疏水改性聚合电解质在Ru(bpy)3+2和荧光素中的荧光 成像以确定疏水改性的形态影响。图1为疏水改性脱乙酰壳多糖在 Ru(bpy)3+2中的代表性荧光显微照片。可以看出在疏水改性脱乙酰壳多糖 中形成聚集体并且形态随烷基链长而改变。丁基改性脱乙酰壳多糖看上去 具有小的纤维状相互连接，而己基改性脱乙酰壳多糖具有含有较小的胶束 区域的大的区域。随着烷基链长的增加，胶束区域的数目减少，但区域的 尺寸增加。未改性脱乙酰壳多糖的荧光显微照片未显示出明显的区域，因 此对于未改性脱乙酰壳多糖而言未观察到胶束结构。图2为浸泡在FITC 中的疏水改性脱乙酰壳多糖膜的代表性荧光显微照片。采用阳离子或阴离 子荧光染料均可观察到相同的形态改变。实施例4：疏水改性脱乙酰壳多糖的电化学测量
[0159]玻璃状碳工作电极(直径3mm，CH Instruments)在Buehler抛 光布上采用0.05微米的氧化铝抛光并且在18MΩ水中清洗。将两微升各个 聚合物悬浮液浇铸到玻璃状碳电极表面上并且在真空干燥器中干燥直至使 用。使用循环伏安法测量在电极表面通过聚合物膜的氧化还原物质的通量。 在作为支持电解质的含有0.1M硫酸钠的1.0mM氧化还原物质溶液中平衡 工作电极连同铂网反电极并以饱和甘汞参比电极为标准进行测量。所研究 的氧化还原物质为咖啡因、铁氰化钾和Ru(bpy)32+。收集数据并在连接到 CH Instruments稳压器型号810上的De]l计算机上分析。在0.05V/s至 0.20V/s的扫描速率下进行循环伏安法。所有的试验重复进行三次并且记录 相应于一个标准偏差的不确定性。
[0160]两种疏水改性聚合电解质的循环伏安法研究以疏水改性的烷基 链长为函数进行。所有的循环伏安法试验显示线性ip对v1/2曲线，表示迁 移限制的电化学。由于电化学通量是如等式2中所示的浓度的函数，此处 报道的KD1/2值作为比较通量(flux)的独立于浓度的方法。 等式2
其中i为峰值电流，n为迁移的电子数，F为Faraday常数，A为电极面积， C＊为氧化还原物质的浓度，v为扫描速率，K为提取系数(extration coeifficient)，且D为扩散系数。图3表示咖啡因流过疏水改性脱乙酰壳多 糖的通量的KD1/2值与改性剂的烷基链长和聚合物再悬浮在其中的溶剂的 关系。溶剂决定了聚合物在再浇铸过程中的溶胀度。大部分关于脱乙酰壳 多糖和脱乙酰壳多糖衍生物的文献研究使用乙酸作为再悬浮的溶剂，但是， 重要的是注意到对于氯仿的KD1/2值提供了较高的平均通量。未改性的脱 乙酰壳多糖仅在乙酸溶液中可溶。未改性脱乙酰壳多糖在咖啡因中的KD1/2 值为5.52(±0.14)×10-3。脱乙酰壳多糖的疏水改性明显可减少咖啡因的通 量，但是不能得到明显的通量增加。
其中i为峰值电流，n为迁移的电子数，F为Faraday常数，A为电极面积， C＊为氧化还原物质的浓度，v为扫描速率，K为提取系数(extration coeifficient)，且D为扩散系数。图3表示咖啡因流过疏水改性脱乙酰壳多 糖的通量的KD1/2值与改性剂的烷基链长和聚合物再悬浮在其中的溶剂的 关系。溶剂决定了聚合物在再浇铸过程中的溶胀度。大部分关于脱乙酰壳 多糖和脱乙酰壳多糖衍生物的文献研究使用乙酸作为再悬浮的溶剂，但是， 重要的是注意到对于氯仿的KD1/2值提供了较高的平均通量。未改性的脱 乙酰壳多糖仅在乙酸溶液中可溶。未改性脱乙酰壳多糖在咖啡因中的KD1/2 值为5.52(±0.14)×10-3。脱乙酰壳多糖的疏水改性明显可减少咖啡因的通 量，但是不能得到明显的通量增加。
[0161]另一方面，孔结构/尺寸小的小的改变可大大影响大的疏水离子， 如Ru(bpy)3+2的迁移。图4表示Ru(bpy)3+2迁移过疏水改性脱乙酰壳多糖 膜的KD1/2值。Ru(bpy)3+2迁移过未改性脱乙酰壳多糖膜的KD1/2值为 2.17(±0.33)×10-4。脱乙酰壳多糖的疏水改性在所有情况下明显使Ru(bpy)3+2 的迁移增加，对于再悬浮在叔戊醇中的辛基改性脱乙酰壳多糖膜而言，增 加了11.1倍。实施例5：制备电极
[0162]将2重量％疏水改性脱乙酰壳多糖聚合物的溶液悬浮在叔戊醇 中并且加入葡萄糖氧化酶的溶液。将该溶液用移液管吸取到电极材料上。 所述电极材料通常为碳布或者其它碳材料。实施例6：对于疏水改性脱乙酰壳多糖而言葡萄糖氧化酶的活性试验
[0163]葡萄糖氧化酶(GOx)催化了β-D-葡萄糖氧化为D-葡糖酸-δ-内 酯，同时是放出过氧化氢。它对β-D-葡萄糖特别有效并且并不作用于α-D- 葡萄糖。在过氧化物酶的存在下，过氧化氢进入包括对羟基苯甲酸和4-氨 基安替比林的测试的第二反应，形成定量的醌亚胺(quinoneimine)染料络合 物，其在510nm测量。在疏水改性Nafion和脱乙酰壳多糖膜中各自测量 GOx酶的活性。将GOx酶固定在疏水改性脱乙酰壳多糖膜中并将其在塑 料小瓶中浇铸之后在510nm下测量针对水的吸收。所有的试验重复进行三 次并且记录相应于一个标准偏差的不确定性。
[0164]如以上所述和表2中所列，在悬浮在叔戊醇中的己基改性脱乙 酰壳多糖中对于葡萄糖氧化酶观察到最高的酶活性。这些固定化膜在GOx 酶活性方面比悬浮液中的酶增加了2.53倍。实施例7：脱乙酰壳多糖-丁基生物阳极
[0165]葡萄糖脱氢酶。阳极由1cm2AvCarbTM碳纸制备。阳极在0.4mM 亚甲绿、0.1M硝酸钠和10mM硼酸钠中通过在扫描速率为0.05V/s下针对 12个扫描部分进行由-0.3V至1.3V的循环伏安法使阳极电聚合。然后将它 们清洗并且使其在真空干燥器内完全干燥。脱乙酰壳多糖混合物通过将 0.01g疏水改性脱乙酰壳多糖(丁基、己基、辛基或癸基)与1mL DE520混合并且采用混合珠粒涡旋1小时制备。然后将40μL等分试样的 脱乙酰壳多糖/混合物与20μL等分试样的葡萄糖脱氢酶(1mg酶在 10mL pH 7.15磷酸盐缓冲液中)混合1分钟。然后将脱乙酰壳多糖/酶混合 物用移液管吸取到阳极上并使其在真空干燥器中完全干燥。
[0166]使用I-cell装置(图13)以便燃料电池是依赖于阳极并且铂阴极不 会由于浸没在缓冲液中而中毒。I-cell使得铂电极以空气呼吸模式操作。图 13是用于本试验的I-cell的示意图。在图13中，玻璃管50包含燃料溶液 52和浸渍在燃料溶液中的生物阳极51。玻璃管50通过O型环53连接到 聚合电解质膜54上并且燃料溶液52也接触聚合电解质膜 54。聚合电解质膜54与20％铂气体扩散电极阴极55接触，所述 阴极55使用O型环56连接到另一个玻璃管58上。空气59可以接触20％ 铂气体扩散电极阴极55并且通过稳压器57由阴极55至生物阳极51存在 电连接。开始，使用的燃料是具有1mM NAD+的1mM葡萄糖，但是一周 之后，燃料浓度增加至具有1mM NAD+的100mM葡萄糖。针对丁基脱乙 酰壳多糖生物阳极的功率曲线(图9)通过首先使燃料电池平衡并达到开路 电势获得。
[0167]醇脱氢酶。含有醇脱氢酶的生物阳极通过以上针对葡萄糖脱氢 酶所述相同的方法制备，除了用醇脱氢酶代替葡萄糖脱氢酶。在pH8和室 温和湿度下在单个分隔室(compartment cell)内具有丁基脱乙酰壳多糖生 物阳极、铂阴极和1mM乙醇燃料溶液的生物燃料电池是使用期限研究的 主题。在聚合物电解质膜中涂覆铂阴极。研究数据列于下表。 使用期限 (天) 温度(℃)/ 湿度(％) 开路电势 (V) 电流密度 (A) 功率密度 (W) 1 22/55 0.6628 4.60＊10-3 2.93＊10-3 2 21/55 0.6585 5.47＊10-3 3.06＊10-3 3 21/54 0.6940 4.20＊10-3 2.50＊10-3 4 22/64 0.7054 4.48＊10-3 2.72＊10-3 5 32/54 0.6143 5.35＊10-3 2.75＊10-3 10 21/58 0.6675 6.00＊10-3 3.41＊10-3 15 22/56 0.6554 5.75＊10-3 3.20＊10-3 20 20/53 0.7252 6.456＊10-3 4.04＊10-3 25 21/57 0.6780 1.019＊10-2 5.89＊10-3 35 21/55 0.6542 6.32＊10-3 3.45＊10-3 45 19/50 0.6450 5.00＊10-3 2.23＊10-3 50 20/53 0.4775 1.434＊10-3 8.21＊10-4 55 20/40 0.6282 8.680＊10-4 4.58＊10-4
实施例8：脱乙酰壳多糖-丁基生物阴极
实施例8：脱乙酰壳多糖-丁基生物阴极
[0168]胆红素氧化酶。脱乙酰壳多糖混合物通过将0.01g疏水改性脱乙 酰壳多糖(丁基、己基、辛基或癸基)与1mL DE520混合并且采用 混合珠粒涡旋1小时制备。然后将40μL等分试样的脱乙酰壳多糖/ 混合物与20μL等分试样的胆红素氧化酶(1mg酶在10mL pH 7.15磷酸盐 缓冲液中)混合1分钟。然后将脱乙酰壳多糖/酶混合物用移液管吸取到 1cm2的碳纸片上以制备阴极并且使其在真空干燥器中完全干燥。针对与(1) TBA改性 NAD+依赖醇脱氢酶阳极(图10)或(2)丁基脱乙酰壳多糖 NAD+依赖醇脱氢酶阳极(图11)组合的丁基-脱乙酰壳多糖胆红素氧化酶阴 极收集功率曲线数据。
[0169]而且，进行研究确定操作各种生物燃料电池的最佳温度。针对 (1)TBA改性 NAD+依赖醇脱氢酶阳极和丁基脱乙酰壳多糖胆红素 氧化酶阴极、(2)丁基脱乙酰壳多糖NAD+依赖醇脱氢酶阳极和TBA改性的 胆红素氧化酶阴极和(3)丁基脱乙酰壳多糖NAD+依赖醇脱氢酶阳 极和丁基脱乙酰壳多糖胆红素氧化酶阴极在各种温度下测量最大开路电势 (V)、最大电流密度(mA/cm2)和最大功率密度(mW/cm2)。所述温度数据列 于下表：表.NAD+依赖TBAB改性阳极和丁基脱乙酰壳多糖胆红素氧化酶 阴极
表.丁基脱乙酰壳多糖阳极和TBAB改性的胆红素氧化酶阴极
表.丁基脱乙酰壳多糖阳极和丁基脱乙酰壳多糖胆红素氧化酶阴极
实施例9：制备烷基改性藻酸盐
表.丁基脱乙酰壳多糖阳极和TBAB改性的胆红素氧化酶阴极
表.丁基脱乙酰壳多糖阳极和丁基脱乙酰壳多糖胆红素氧化酶阴极
实施例9：制备烷基改性藻酸盐
[0170]结合有季铵溴化物的藻酸盐膜通过将季铵溴化物与3重量％藻 酸盐悬浮液共浇铸形成。使用的聚合物是超低、低或中分子量藻酸盐。混 合物浇铸溶液通过将季铵溴化物添加到3重量％悬浮液中制备。制备所有 的混合物浇铸溶液，因而季铵溴化物的浓度超过藻酸盐悬浮液中羧酸位点 的浓度。选择最佳条件之后，确定了最稳定且可再生的膜具有的季铵溴化 物浓度是交换位点浓度的三倍。
[0171]将1毫升浇铸溶液置于称量船中并使其干燥。将7.0mL18MΩ 水加入到称量船中并使其浸泡过夜。除去水并用18MΩ水彻底清洗薄膜并 干燥。然后，将薄膜再悬浮在1.0mL甲醇中。使用四丙基铵(T3A)、四戊 基铵(T5A)、四己基铵(T6A)、四庚基铵(T7A)、三甲基二十烷基铵(TMICA)、 三甲基辛基癸基铵(TMODA)、三甲基己基癸基铵(TMHDA)、三甲基十四 烷基铵(TMTDA)、三甲基辛基铵(TMOA)、三甲基十二烷基铵(TMDDA)、 三甲基癸基铵(TMDA)、三甲基己基铵(TMHA)、四丁基铵(TBA)、三乙基 己基铵(TEHA)的铵溴化物盐作为藻酸盐改性剂，观察哪一个可产生最好的 胶束结构。胶束结构对于酶的有效固定化而言很重要。
[0172]为了确定孔特征，然后将三滴每种聚合物置于载玻片上并静置 干燥。在完全干燥之后，将它们浸泡在1mM在乙醇中的Ru(bpy)3+2中至 少3小时。在用乙醇冲洗之后，在采用荧光显微镜照相以观察胶束结构之 前将聚合物静置干燥。结构的实例示于图12。
[0173]在另一个试验中，将超低分子量藻酸盐和十二烷基胺置于25％ 乙醇中并且回流以通过羧酸基团的酰胺化生产十二烷基改性的藻酸盐。实施例10：制备藻酸盐电极
[0174]将3重量％的实施例9中所述采用疏水铵阳离子改性的藻酸盐 聚合物的溶液悬浮在叔戊醇中并加入酶(例如，醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、 胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶)的溶液。将所述溶液用移液管吸取到电极材 料上。所述电极材料通常是碳布或者其它碳材料。实施例11：藻酸盐生物燃料电池
[0175]具有固定在疏水改性藻酸盐中的阳极酶的生物燃料电池通过将 疏水改性藻酸盐与酶和缓冲液的溶液并用移液管吸取到碳布上混合物浇 铸，从而形成类似于以上实施例10中所述的生物阳极来制备。可使用以上 所述和在美国专利申请10/931,147(作为美国专利申请公开2005/0095466公 布)中的包含疏水改性膜的生物阴极形成具有生物阳极和生物阴极 的生物燃料电池。或者，具有固定在疏水改性藻酸盐中的阴极酶的生物燃 料电池通过将疏水改性藻酸盐与酶和缓冲液的溶液并用移液管吸取混合物 到碳布上混合物浇铸，从而形成生物阴极来制备。可使用以上所述且在美 国专利申请10/617,452(作为美国专利申请公开2004/0101741公布)中的包 含疏水改性膜的生物阳极形成具有生物阳极和生物阴极的生物燃 料电池。在另一个实施方案中，可以制备具有固定在如上所述制备的疏水 改性藻酸盐中的阴极酶和具有固定在如上所述制备的疏水改性藻酸盐中的 阳极酶的生物阳极的生物燃料电池。实施例12：微流体生物燃料电池
[0176]用于制备PDMS微模制通道的母片通过使用用于微模制通道旋 涂机(Brewer Science，Rolla，MO)在旋转程序为1000rpm下操作30秒采用 SU-810负型光刻胶涂布4英寸的硅片制备。对于流动通道，用于SU-850 负型光刻胶下使用旋转程序为1750rpm秒。在采用近UV泛光灯源 (Autoflood 1000，Optical Associates，Milpitas，CA)通过含有微模制通道或 流动通道图案结构的负型薄膜(Jostens，Topeka，KS)UV曝光4分钟之前将 光刻胶在90℃下预烘烤5分钟。透明片由Freehand(PC Version 8.0， Macromedia Inc.，San Francisco，CA)中绘制的计算机图案制成。将图案使 用分辨率为2400dpi的图像调节器(image setter)通过打印设备(Jostern， Topeka，KS)转印到透明片上。上述曝光之后，硅片在90℃下后烘烤5分 钟并且在Nano Su-8显像仪上显像。将含有所需图案的硅片用丙酮和异丙 醇清洗以除去可能残留在硅片上的过量未曝光的光刻胶。光刻胶的厚度采 用表面光度仪(Alpha Step-200，Tencor Instruments，Mountain View，CA)测 量，该厚度相应于PDMS结构的通道深度。
[0177]然后将除去气体的Sylgard 184弹性体与固化剂10:1的混合物浇 注到硅片上并使其在75℃下固化约2小时。通过围绕边缘切割从母片硅片 上除去PDMS并且使PDMS从硅片上剥离。为了产生多个PDMS通道的 复制品可以再次使用母片。所得到的PDMS流动通道为200mm宽、100mm 深和3.0cm长。
[0178]从当地玻璃店购得钠钙玻璃(soda-lime glass)板。该玻璃板7cm 宽、10cm长和1.54mm厚。将玻璃板通过在piranha溶液(70％浓 H2SO4/30％ H2O2)中浸泡15分钟进行清洗以除去有机杂质。然后将玻璃用 Nanopure(18MΩ-cm)水彻底清洗并在氮气下干燥。使用常规光刻和溅射方 法，在玻璃上制造特定图案的钯电极。每个板可容纳多个流动通道与电极。 更具体的说，这可通过氩离子溅射钛层(为了粘合性)和钯层实现。为了实 现该目的，将玻璃置于薄膜沉积系统(Thin Film Deposition System，Kurt J. Lesker Co.)内用以沉积金属。金属的厚度使用石英晶体沉积监控器(Inficon XTM/2，Leybold Inficon)监控。钛从钛靶以速率～2.3埃/s沉积至深度为200 埃。钯由Pd靶以速率～1.9埃/g沉积至2000埃。AZ 1518正型光刻胶动态 分配到钯涂布的玻璃上。在95℃下预曝光烘烤1分钟之后，通过正型薄膜 紫外曝光9秒。除去薄膜并将玻璃置于商购的显像仪(AZ 300 MIF显像仪) 中45秒。用水清洗并在氮气下干燥之后，将玻璃在95℃下后烘烤1分钟。 利用湿蚀刻从玻璃上使用王水(8:7:1的H2O:HCl:HNO3)除去不需要的钯和 使用钛蚀刻剂除去不需要的钛。一旦结束，将玻璃用丙酮和异丙醇清洗以 除去残余的光刻胶并在氮气下干燥。
[0179]在浸渍在水下的同时采用1mm金刚石钻头和Dremel旋转工具 (Dremel)通过每个玻璃板钻一个流体出入口。采用Dremel旋转工具和附带 的园盘刀将leur适配器的注射器连接器除去。用磨砂盘抛光之后，将leur 适配器用J.B.Weld固定到玻璃板上。在使用之前在烘箱内(75℃)使环氧树 脂固化2小时。通过铜线和凝胶银连接钯电极。
[0180]为了制备碳墨微电极，首先将PDMS微模制通道密封到与已经 彻底清洗的钯引线(leur装配连接)接触的玻璃板上。PDMS通道首选用溶 剂稀释剂(N-160)涂底漆。稀释剂通过向一个贮液池施加真空除去。稀释剂 一除去，就将商购的碳墨与溶剂稀释剂的混合物加入到通道中并通过向相 对的一端施加真空(经吸水器)使其穿过通道。制备碳墨/稀释剂混合物以使 添加的稀释剂的体积为初始碳墨重量的0.2％(v/w)。用碳墨填充通道之后， 已施加真空的贮液池填充有碳墨/稀释剂溶液并且整个芯片在烘箱内于 75℃下放置1小时。这段时间之后，PDMS能够从玻璃上除去，留下连接 到玻璃表面上的碳微电极。最后的固化/调理(conditioning)步骤通过将芯片 在12℃下置于独立的烘箱内1小时实现。碳微电极的高度采用表面光度仪 测量并且宽度经显微镜法测量。
[0181]为了进一步表征碳墨电极，利用循环伏安法并且在3个电极结 构中使用CH Instruments 810双稳压器(Austin，TX)进行。碳微电极是具有 银/氯化银参比电极和铂线作为辅助电极的工作电极。用于循环伏安法的静 态电池通过在较大块PDMS(2cm×3m)切下来小部分(1cm×2cm)在一块 PDMS中形成；然后将该块PDMS密封到碳电极之上以使电极的整个长度 暴露在溶液中。对于流动试验，将PDMS微通道(～200mm宽、100mm深 和～2cm长)密封到碳电极上，因而整个电极密封在微通道之内。通过使用 电化学电池座(CH Instruments)将辅助和参比电极包含在出口贮液池内。
[0182]碳工作电极在亚甲绿下电聚合。亚甲绿是公知的NADH用电催 化剂。聚(亚甲绿)薄膜通过在10mM硼酸钠中含有0.4mM亚甲绿和0.1M 硝酸钠的溶液中使用CH Instruments Model 810稳压器(Austin，TX)在扫 描速率为0.05V/s下从-0.3V至1.3V进行循环伏安法7个扫描循环形成。 使用一块PDMS在整个碳电极上划分出电化学池。甘汞参比电极与铂线辅 助电极完成了电化学池。清洗电极并且随后在进一步改性之前使其干燥过 夜。
[0183]在玻璃板内钻的流体出入口使得从注射器泵(Pump 11，Harbard Apparatus，Holliston，MA)接触流体。注射器填充有选定的溶液并且置于注 射器泵中。在使用高压配合件、leur适配器和Teflon PEEK管的情况下， 注射器连接到玻璃微芯片上。通过200μm宽的PDMS流动通道的流速在 0μL/min至15μL/min内变化，所述流动通道盐一端在流体出入口处对齐。 通道直接密封到电极上。在通道的另一端，通过穿孔机形成贮液池并且贮 液池是放置阴极或参比电极和反电极的地方。
[0184]碳墨电极通常是55μm宽且87μm高的2.5cm长的电极。使用 1mM三(2，2’-联吡啶基)二氯化钌(II)六水合物和0.1M硫酸钠的溶液作为电 解质使用循环伏安法表征电极响应。随着流速增加，电流密度增加，这是 由于随着流速增加分析物达到电极表面加快而预期的。开始，通过在0.05M 磷酸盐缓冲液(pH7.4)中施加1.5V3分钟利用电化学预处理清洗电极。
[0185]亚甲绿使用从-0.3V至1.5V的扫描部分固定到碳微电极上，相 同的方法用于大尺寸碳电极。使用商购的微配合件，可以通过 3cm×240mm×100mm PDMS通道泵送流速达到20mL/min，所述通道可逆 地密封到碳微电极上。NADH通过PDMS流动通道在0.5mL/min至 15.0mL/min的各种流速下泵送。
[0186]以上的方法明显的改进是简化了形成包含电子导体和酶固定化 材料的电极的方法。为此，对电子导体溶液改性以包含酶固定化材料。另 外的材料通过加入疏水改性脱乙酰壳多糖在叔戊醇中的2重量％的溶液制 备或者疏水改性藻酸盐在醇溶液中3重量％的溶液悬浮在Ercon N160溶剂 稀释剂中并且彻底涡旋。最后，将1mL所述改性稀释剂添加到0.5g Ercon E-978(l)基于碳的油墨中。然后使所述改性电子导体溶液流过由浇铸模具和 基材形成的模腔并且根据本实施例中以上所述方法使其固化。
[0187]为了形成根据本发明的生物阳极，使用以上本实施例中的一般 方法，通过使另外的材料在其固化和活化步骤之后流过电子导体完成阳极。 为此，通过注射器泵送经过电子导体制备亚甲绿溶液。然后在扫描速率为 50mV/s下使溶液电聚合从-0.3V至1.3V 14个扫描部分。接着，通过将疏 水改性脱乙酰壳多糖在叔戊醇中的2重量％的溶液或者疏水改性藻酸盐在 醇中的3重量％的溶液、酶溶液和在低级脂肪醇中的电子介体混合形成剩 余的阳极元件的浇铸溶液。然后将所述溶液一起彻底涡旋并且在流速为约 1mL/min下泵送通过约100mm的微通道。然后使电子导体和浇铸溶液干 燥过夜。
[0188]对于生物阴极，微芯片和通道母片如本实施例以上所述使用光 刻法制造。由微模制方法产生的碳墨微电极可采用以上所述疏水改性脱乙 酰壳多糖膜或者疏水改性藻酸盐混合物进一步改性。
[0189]将碳微电极改性用作生物阳极。在PDMS中穿孔形成围绕微电 极放置并且包括Ag/AgCI参比电极和铂线作为辅助电极的大贮液池。具体 地说，这是一个静态池。将0.4mM亚甲绿和0.1M硝酸钠在10mM硼酸钠 中的溶液用移液管吸取到PDMS贮液池中。亚甲绿经循环伏安法的聚合使 用CH Instruments 650稳压器(Austin，TX)在扫描速率为50mV/s下从 -0.3V至1.3V进行14个扫描部分。亚甲绿溶液用移液管从贮液池吸取出来 并除去PDMS。然后用18MΩ(Nanopure)水清洗聚(亚甲绿)改性的碳墨微 电极并使其干燥过夜。
[0190]酶/疏水改性脱乙酰壳多糖混合物或酶/疏水改性藻酸盐混合物 使用可逆地密封到微电极上的微通道并且流体动力流动固定在碳微电极 上。所述流动通道的尺寸是这样的，即可以在微电极上对齐但不可比电极 宽很多。为了实现这一点，将PDMS微通道(130mm宽、100mm深和～2cm 长)密封到碳电极(～40mm宽、～2cm长和～100mm高)上，以便整个电极密 封在微通道之内。制备具有1mg用于各个20mL疏水改性脱乙酰壳多糖混 合物(或疏水改性藻酸盐混合物)的电子介体的2:1比率的酶和水改性脱乙 酰壳多糖混合物(或疏水改性藻酸盐混合物)并且使其涡旋直至充分混合。 将混合物使用注射器泵(Harvard Apparatus，Brookfield，OH)通过注射器 在1.0mL/min下加入到通道内。一旦混合物流过整个长度的通道(目测监 控)，则使溶剂在室温下蒸发。这一点由于PDMS透气因而是可能的。在 蒸发完成之后，除去PDMS，留下经涂布的生物阳极。
[0191]为了形成根据本发明的生物阴极，使用本实施例中所述的一般 步骤，通过使另外的材料在其固化和活化步骤之后流过电子导体完成生物 阴极。
[0192]为了改性生物导体，将胆红素、胆红素氧化酶和疏水改性脱乙 酰壳多糖(或疏水改性藻酸盐混合物)的浇铸溶液一起涡旋约20分钟。接着， 在流速为约1.0mL/min下将溶液泵送经过约100mm的微通道。然后使电 子导体和浇铸溶液干燥过夜。一旦干燥，则将电极浸泡在Ru(bpy)3+2和硫 酸钠的溶液中约24小时。
[0193]采用与以上所述生物阳极类似的方式形成生物阴极。将PDMS 微通道密封到碳墨微电极上。将疏水改性脱乙酰壳多糖(或疏水改性藻酸盐) 与电子介体和阴极酶混合。然后在1mL/min下将混合物泵送经过通道直至 它达到通道的末端，该时间之后使溶剂蒸发。三(2，2’-联吡啶基)二氯化钌(II) 六水合物在膜内通过使其1.0mM溶液在流速为0.5mL/min下流动5小时 进行交换。之后，除去PDMS流动通道，留下用作生物阴极的经涂布的电 极。
[0194]综上所述，可以看出实现了本发明的多个目的并且获得了其它 有利的结果。
[0196]在本文权利要求范围内的其它实施方案对于本领域技术人员而 言考虑到本文所公开的本发明的说明书或实践是显而易见的。意指说明书 与实施例在实施例之后的权利要求书所表示的本发明的范围和精神内近考 虑为示例性的。
[0001]本发明根据由美国海军研究局授予的资助项目3-00475、由高级 防御研究计划机构授予的资助项目3-00487和由美国中央情报局授予的资 助项目300477在政府的支持下进行。美国政府在本发明中拥有某些权利。
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