确定癌症患者的个性化治疗策略的方法
阅读：898发布：2020-12-10
专利汇可以提供确定癌症患者的个性化治疗策略的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种确定个性化 治疗 策略的强大工具。具体而言，本发明提供了用于确定来自患有实体癌的受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性 信号 通路，确定受试者的 治疗方案 ，选择受试者用于治疗，确定受试者是否易受益于治疗，预测受试者的临床结果，治疗受试者和/或预测实体癌对治疗的敏感性的方法。，下面是确定癌症患者的个性化治疗策略的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于确定来自患有实体癌的受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的体外方法，其包括
a)提供代表一些治疗上可靶向信号通路的基因集合在所述癌症样本中的表达水平；
b)确定步骤a)中提供的每个表达水平相比于相同基因在以下中的表达水平的变化
-在所述癌症起源的器官中，
-在至少一种对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织中，和
-在所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型中；
c)计算所述基因中的每一个的得分，所述得分代表所述基因在所述癌症样本中的表达相比于所述基因在所述癌症起源的器官中、在对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织中以及在所述癌症起源器官的正常细胞亚型中的表达的总体变化幅度；和
d)根据所述计算得分对所述基因进行排序，
其中所述治疗上可靶向显性信号通路对应于排序最高的基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括，在步骤a)之前，确定所述基因集合在所述癌症样本中的表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括，在步骤b)之前，确定所述基因集合在以下中的表达水平
-在所述癌症起源器官的样本中，
-在至少一个对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织的样本中，和/或
-在所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型的样本中。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中通过测量所述基因的mRNA转录物或其蛋白质翻译产物的量，优选通过测量所述mRNA转录物的量来确定所述表达水平。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中通过定量RT-PCR或使用高通量测序技术如RNA-Seq或使用微流体系统的测序技术来确定所述表达水平。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使用以下公式计算所述得分
其中
m和n是正整数并且相同或不同，以及
ΔΔCt(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型)＝ΔCt(癌症样本)-ΔCt(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型)
其中ΔCt(癌症样本)＝Ct(癌症样本中的感兴趣基因)-Ct(癌症样本中的管家基因)，并且ΔCt(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型)＝Ct(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型中的感兴趣基因)-Ct(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型中的管家基因)。
7.一种用于确定患有实体癌的受试者的治疗方案的体外方法，所述方法包括根据权利要求1至6中的任一项所述的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，以及确定靶向至少一种显性信号通路的治疗方案。
8.一种用于选择患有实体癌的受试者用于治疗或确定患有实体癌的受试者是否易受益于治疗的体外方法，所述方法包括根据权利要求1至6中的任一项所述的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，
其中如果所述治疗靶向至少一种显性信号通路则所述受试者被选择用于治疗或者易于受益于所述治疗。
9.一种用于预测患有实体癌的受试者的临床结果的体外方法，其包括根据权利要求1至6中的任一项所述的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，其中如果所述受试者用靶向至少一种显性通路的疗法来治疗，则预后良好。
10.一种预测实体癌对治疗的敏感性的体外方法，其包括根据权利要求1至6中的任一项所述的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，其中如果所述治疗靶向至少一种显性信号通路，则所述癌症对所述治疗敏感。
11.根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中所述癌症选自神经胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、皮肤癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、头颈癌和乳腺癌。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是神经胶质瘤，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化-在正常脑中，
-在II级星形细胞瘤中，和
-在正常脑星形胶质细胞和/或正常脑少突胶质细胞中。
13.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是结肠癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常结肠中和/或在结肠平滑肌细胞中，
-在非癌性息肉或低级别结肠肿瘤中，和
-在正常结肠上皮细胞中。
14.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是前列腺癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常前列腺中，
-在前列腺腺体增生中，和
-在正常前列腺上皮细胞、前列腺微血管内皮细胞和/或前列腺成纤维细胞中。
15.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是皮肤癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常皮肤组织中，
-在至少低级别黑素瘤(0级)中，和
-在至少正常表皮上皮细胞、真皮上皮细胞、角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞和/或皮肤内皮细胞中。
16.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是肺癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常肺中，
-在至少低级别肺肿瘤(I或II级)中，和
-在至少正常肺平滑肌细胞、肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞和/或气管上皮细胞中。
17.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是胰腺癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常胰腺中，
-在至少低级别胰腺肿瘤(I或II级)中，和
-在至少正常胰腺内皮细胞、腺泡细胞、泡心细胞、导管细胞、星状细胞和/或胰岛细胞(朗格汉斯)中。
18.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是肝癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常肝脏中，
-在至少低级别肝脏肿瘤(I或II级)中，和
-在至少正常肝细胞、肝内皮细胞和/或库普弗细胞中。
19.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是肾癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常肾脏中，
-在至少低级别肾脏肿瘤(I或II级)中，和
-在至少正常系膜细胞、基质细胞、肾小球内皮细胞、足细胞、上皮细胞、皮质上皮细胞和/或肾小管细胞中。
20.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是头颈癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常器官或组织中，即在喉、咽喉、唇、口、鼻或唾液腺中，取决于确切的肿瘤位置；
-在至少低级别头颈部肿瘤(I或II级)中，和
-在至少正常口腔细胞、口咽细胞和/或下咽细胞中。
21.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述实体癌是乳腺癌，并且其中在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
-在正常乳房中，
-在至少低级别乳房肿瘤(I或II级)中，和
-在至少正常乳房成纤维细胞和/或上皮细胞中。
22.一种试剂盒，其包含引物对，探针或对于选自表1至4中列出的基因的至少20种基因具特异性的抗体。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物对，探针或对于选自以下的至少20种基因具特异性的抗体：ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
24.根据权利要求22或23所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物对，探针或对于至少HIF1A、SDF1、MMP9、JAG1、BCL2和CD133基因具特异性的抗体。
25.一种包含引物对、探针或对于代表根据权利要求1中所定义的治疗上可靶向信号通路的基因中的每一个具特异性的抗体的试剂盒的用途，其用于(i)确定来自患有实体癌的受试者的癌症样本中的所述治疗上可靶向显性信号通路，(ii)确定患有实体癌的受试者的治疗方案，(iii)选择患有实体癌的受试者用于治疗，(iv)确定患有实体癌的受试者是否易受益于治疗，(v)预测患有实体癌的受试者的临床结果，(vi)治疗癌症患者，和/或(vii)预测实体癌对治疗的敏感性。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述试剂盒是根据权利要求22至24中的任一项所述的试剂盒。
确定癌症患者的个性化治疗策略的方法
技术领域
背景技术
[0002] 复杂性显然是细胞生物学的标志。细胞不断暴露于多种环境信号，从而诱导增殖、迁移、分化或最终细胞死亡。为了对这种无数的信息做出适当响应，细胞建立了由执行动态相互作用的膜蛋白组成的令人难以置信的复杂的信号传导平台。这种相互作用最终触发信号转导通路，即负责将外部信号与细胞行为变化联系起来的细胞通讯高速公路，它们自身被组织为中枢交联通路并由此形成相互作用的细胞内网络。这个过程的固有特征是个体元件不仅能够与相同通路的成分相互作用，而且能够与不同通路的成分相互作用。
[0003] 信号通路经历不断的重塑，这是细胞适应环境变化的直接结果。引人注目的是，这种分子可塑性不限于正常细胞，而是在病理情形下也存在。事实上，这种适应性是肿瘤细胞生存和发育所用的机制之一，尽管选择性抑制重要通路可调节肿瘤生长。一直以来，这些信号通路的鉴定在过去的二十年中深刻地改变了抗癌药物的设计。所谓的靶向疗法导致高效化合物如小分子、肽或人源化抗体的鉴定和验证。然而，这些强效药物中的大多数未能提供明确的治愈效果，导致肿瘤复发。
[0004] 一个实例是神经胶质瘤患者病例，神经胶质瘤是最常见且最严重的原发性脑肿瘤。过去20年来神经胶质瘤的发病率有所增加，并且现在已达到5/100 000。这些肿瘤的分型仍存在困难。WHO分型提供了与肿瘤的侵袭性相关的肿瘤分级(从I到IV)。最严重也是最常见的神经胶质瘤是胶质母细胞瘤(WHO IV级)，总生存期的中位数不超过15个月。这些肿瘤在脑实质中表现出大量的细胞浸润并且高度血管化。标准的一线治疗目前是基于最大限度的手术切除，伴随放化疗(60戈瑞，30次，替莫唑胺75mg/m2/d持续6周)，然后用替莫唑胺进行辅助化疗。
[0005] 与在一些癌症适应症中用抗血管生成药物获得的成功一致，将防止血管内皮生长因子(VEGF)受体结合的人源化重组抗体贝伐单抗用作复发性胶质母细胞瘤患者的二线治疗。抗血管生成治疗已经在30％至60％的复发性胶质母细胞瘤中证实其功效。然而，随着时间的推移，功效仍然不高，因为无进展生存期达到6个月，而生存期不超过9个月(Omuro等,《神经生物学新见(Curr Opin Neurol.)》,2008 21(6):717-9)。各种研究评估了贝伐单抗联合替莫唑胺、伊立替康(包括两项具有相反结果的不同研究)、卡铂、依托泊苷、西妥昔单抗或厄洛替尼，但没有一种组合表现出优于单独贝伐单抗的优势。因此，与过去二十年来其它药物获得的结果相比，贝伐单抗表现为最佳治疗选项，展现出令人印象深刻的效果。该结果因此导致通过将贝伐单抗作为一线治疗来改变临床实践。然而，贝伐单抗功效数据的汇编显示，至多地，应答率范围为11％至79％，中位无进展生存期(PFS)为4.2至7.6个月并且中位总生存期(OS)为4.6至12.6个月(Koukourakis GV《,关于炎症和过敏症药物发现的最新专利(Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov.)》,2012 6(1):70-7)。最近公布的III期试验AVAglio和RTOG证实了贝伐单抗治疗的患者在PFS方面而不是OS方面的显著优势(Soffietti等《, 神经治疗学专家评论(Expert Rev Neurother.)》,2014年1月；14(1):1-3)。总体而言，少于50％的患者似乎受益于贝伐单抗治疗。
[0006] 因此，患者分层(stratification)是改善治疗方案的根本问题。这个问题不限于神经胶质瘤和胶质母细胞瘤患者。事实上，由于治疗手段的扩展，作为男性和女性中第三大常见癌症的结肠直肠癌(CRC)的管理，也正经历着深刻的突变。管理通常遵循根据肿瘤分级的决策树(Stinzing S.,F1000Prime reports,2014)。虽然一线治疗是显而易见的(FOLFOX/FOLFIRI方案)，但二线治疗不太清楚，并且抗血管生成剂的添加令人困惑。在前列腺癌中使用抗血管生成化合物也出现类似的问题(Bilusic和Wong,AS；《男性学杂志(J.Andrology)》,2014)。
[0007] 因此，尽管举例说明了对指导治疗方法的需求，但这些结果说明了开发帮助临床医生对于给定患者选择最佳治疗选项的工具的可能性有多重要。
发明内容
[0008] 本发明人开发了一种强大的工具，该工具帮助确定癌症患者的最佳治疗策略，特别是在可用的治疗手段中。根据患者活检，本发明方法允许确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，从而对患者分层或选择最佳治疗选项。
[0009] 因此，在第一方面，本发明涉及一种用于确定来自患有实体癌的受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的方法，其包括
[0010] a)提供代表一些治疗上可靶向信号通路的基因集合在所述癌症样本中的表达水平；
[0011] b)确定步骤a)中提供的每个表达水平相比于相同基因在以下中的表达水平的变化
[0012] -在所述癌症起源的器官中，
[0013] -在至少一种对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织中，和
[0014] -在所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型中；
[0015] c)计算所述基因中的每一个的得分，所述得分代表所述基因在癌症样本中的表达相比于所述基因在所述癌症起源的器官中、在对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织中和在所述癌症起源器官的正常细胞亚型中的表达的总体变化幅度；和
[0016] d)根据所述计算得分对所述基因进行排序，
[0017] 其中所述治疗上可靶向显性信号通路对应于具有最高次序的基因。
[0018] 所述方法还可包括，在步骤a)之前，确定所述基因集合在所述癌症样本中的表达水平。
[0019] 所述方法还可包括，在步骤b)之前，确定所述基因集合在以下中的表达水平：
[0020] -在所述癌症起源器官的样本中，
[0021] -在对应于所述癌症的至少一个低级别或良性肿瘤组织的样本中，和/或
[0022] -在所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型的样本中。
[0023] 可通过测量所述基因的mRNA转录物或其蛋白质翻译产物的量，优选通过测量所述mRNA转录物的量来确定表达水平。优选地，通过定量RT-PCR来确定表达水平。
[0024] 在步骤c)中，可使用以下公式来计算得分
[0025]
[0026] 其中
[0027] m和n是正整数并且相同或不同，以及
[0028] ΔΔCt(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型)＝ΔCt(癌症样本)-ΔCt(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型)
[0029] 其中ΔCt(癌症样本)＝Ct(癌症样本中的感兴趣基因)-Ct(癌症样本中的管家基因)，并且ΔCt(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型)＝Ct(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型中的感兴趣基因)-Ct(器官、低级别或良性肿瘤组织或细胞亚型中的管家基因)。
[0030] 本发明还涉及一种用于确定患有实体癌的受试者的治疗方案的方法，所述方法包括根据本发明的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，以及确定靶向至少一种显性信号通路的治疗方案。
[0031] 本发明还涉及一种用于选择患有实体癌的受试者用于治疗或确定患有实体癌的受试者是否易受益于治疗的方法，所述方法包括根据本发明的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，其中如果所述治疗靶向至少一种显性信号通路则所述受试者被选择用于治疗或者易于受益于所述治疗。
[0032] 本发明还涉及一种用于预测患有实体癌的受试者的临床结果的方法，其包括根据本发明的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，其中如果所述受试者用靶向至少一种显性通路的疗法治疗，则预后良好。
[0033] 本发明还涉及一种预测实体癌对治疗的敏感性的方法，其包括根据本发明的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，其中如果所述治疗靶向至少一种显性信号通路，则所述癌症对所述治疗敏感。
[0035] 在一个实施方案中，所述实体癌是神经胶质瘤，并且在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在正常脑中、在II级星形细胞瘤中以及在正常脑星形胶质细胞和/或正常脑少突胶质细胞中的表达水平的变化。
[0036] 在另一个实施方案中，所述实体癌是结肠癌，并且在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在正常结肠中和/或在结肠平滑肌细胞中、在非癌性息肉或低级别结肠肿瘤中以及在正常结肠上皮细胞中的表达水平的变化。
[0037] 在另一个实施方案中，所述实体癌是前列腺癌，并且在步骤b)中，确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在正常前列腺中、在前列腺腺体增生中以及在正常前列腺上皮细胞、前列腺微血管内皮细胞和/或前列腺成纤维细胞中的表达水平的变化。
[0038] 本发明还涉及一种试剂盒，其包含一对引物，一条探针或对于代表治疗上可靶向信号通路的基因中的每一个具特异性的抗体，以及所述试剂盒用于以下的用途：(i)确定来自患有实体癌的受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，(ii)确定患有实体癌的受试者的治疗方案，(iii)选择患有实体癌的受试者用于治疗，(iv)确定患有实体癌的受试者是否易受益于治疗，(v)预测患有实体癌的受试者的临床结果，(vi)治疗实体癌患者，和/或(vii)预测实体癌对治疗的敏感性。附图说明
[0039] 图1：胶质母细胞瘤活检中的治疗上可靶向显性信号通路的确定。(A)当将数据相对于脑、星形胶质细胞、少突胶质细胞和低级别星形细胞瘤归一化时获得每个基因的得分。(B)然后将所得值排序并转换为任意单位。(C)雷达模式显示归一化得分的对数值。
[0040] 图2：在该研究中仅包含可用药物的靶基因的受限标签(restricted signature)的得分(A)和雷达模式(B)。
[0041] 图3：21例胶质母细胞瘤患者的个人标签(personal signature)的雷达模式。患者HB1至HB12(A)和HB13至HB21(B)。
[0042] 图4：15例结肠直肠癌患者的个人标签的雷达模式。
[0043] 图5：15例前列腺癌患者的个人标签的雷达模式。
[0044] 图6：从GBM活检(HB2)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)和四步归一化(E)的雷达模式。A、B、C和D分别是指通过与脑、星形胶质细胞、少突胶质细胞和低级别星形细胞瘤中的表达相比较的归一化。
[0045] 图7：从GBM活检(HB6)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)和四步归一化(E)的雷达模式。A、B、C和D分别是指通过与脑、星形胶质细胞、少突胶质细胞和低级别星形细胞瘤中的表达相比较的归一化。
[0046] 图8：从GBM活检(HB7)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)和四步归一化(E)的雷达模式。A、B、C和D分别是指通过与脑、星形胶质细胞、少突胶质细胞和低级别星形细胞瘤中的表达相比较的归一化。
[0047] 图9：从CC活检(结肠1)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)和四步归一化(E)的雷达模式。A、B、C和D分别是指通过与正常结肠、人上皮结肠细胞、微血管结肠细胞和低级别结肠肿瘤中的表达相比较的归一化。
[0048] 图10：从CC活检(结肠4)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)和四步归一化(E)的雷达模式。A、B、C和D分别是指通过与正常结肠、人上皮结肠细胞、微血管结肠细胞和低级别结肠肿瘤中的表达相比较的归一化。
[0049] 图11：从CC活检(结肠8)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)和四步归一化(E)的雷达模式。A、B、C和D分别是指通过与正常结肠、人上皮结肠细胞、微血管结肠细胞和低级别结肠肿瘤中的表达相比较的归一化。
[0050] 图12：从前列腺腺癌活检(1)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)、四步归一化(E)和五步归一化(F)的雷达模式。A、B、C、D和E分别是指通过与正常前列腺、上皮细胞、前列腺微血管内皮细胞、前列腺成纤维细胞和低级别前列腺癌中的表达相比较的归一化。
[0051] 图13：从前列腺腺癌活检(2)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)、四步归一化(E)和五步归一化(F)的雷达模式。A、B、C、D和E分别是指通过与正常前列腺、上皮细胞、前列腺微血管内皮细胞、前列腺成纤维细胞和低级别前列腺癌中的表达相比较的归一化。
[0052] 图14：从前列腺腺癌活检(3)获得的个人标签。原始数据(A)、一步归一化(B)、两步归一化(C)、三步归一化(D)、四步归一化(E)和五步归一化(F)的雷达模式。A、B、C、D和E分别是指通过与正常前列腺、上皮细胞、前列腺微血管内皮细胞、前列腺成纤维细胞和低级别前列腺癌中的表达相比较的归一化。
[0053] 图15：从CC模型(CR-IC-028M)获得的个人受限标签的得分(A)和雷达模式(B)。体内CC模型中使用的抑制剂和治疗方案(C)。用曲妥珠单抗、西妥昔单抗、西地尼布或媒介物治疗的小鼠中肿瘤生长的进展(D)。
[0054] 图16：从GBM模型(HB21)获得的个人受限标签的得分(A)和雷达模式(B)。体内GBM模型中使用的抑制剂和治疗方案(C)。SB-3CT、西地尼布和厄洛替尼与TMZ相比的功效(％)(D)。
[0055] 图17：从PC模型(HID-28)获得的个人受限标签的得分(A)和雷达模式(B)。体内PC模型中使用的抑制剂和治疗方案(C)。用西地尼布、厄洛替尼、多西他赛或媒介物治疗的小鼠中肿瘤生长的进展(D)。
[0056] 图18：包含从脑肿瘤样本中获得的22种基因和8种(30种基因)或22种(44种基因)额外基因的标签。
具体实施方式
[0057] 定义
[0058] 如本文所用，术语“样本”是指含有源自受试者的细胞的任何样本，优选含有核酸的样本。所述样本的实例包括流体如血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液和精液样本以及活检组织、器官、组织或细胞样本。样本可在其使用前进行处理。它可能是新鲜的、冷冻的或固定的(例如甲醛或石蜡固定的)样本。
[0059] 术语“癌症样本”或“肿瘤样本”是指含有源自患者的肿瘤细胞的任何样本。优选地，样本仅包含肿瘤细胞。在优选的实施方案中，癌症样本是活检组织或源自在手术期间从患者获得的活检组织。
[0061] 如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”是指存在具有致癌细胞的典型特征例如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速生长和增殖速率以及某些特有的形态学特征的细胞。该术语包括早期、局部化癌症；晚期、局部晚期癌症；和转移期癌症。优选地，该术语是指实体癌。更优选地，所述癌症选自神经胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、胃肠癌、黑素瘤、头颈部肿瘤。甚至更优选地，所述癌症选自神经胶质瘤、前列腺癌和结肠癌。
[0062] 术语“神经胶质瘤”是指由脑或脊髓的神经胶质细胞或其前体产生的肿瘤。神经胶质瘤的组织学定义是基于它们是否主要表现出星形胶质细胞或少突胶质细胞形态，并通过细胞性、核异型性、坏死、有丝分裂象和微血管增殖进行分级。星形细胞瘤有两种主要类型：高级别和低级别。高级别肿瘤生长迅速，充分血管化，并且可以容易地传遍大脑。低级别星形细胞瘤通常是局部化的，并且在长时间内缓慢生长。高级别肿瘤更具侵袭性，需要非常密集的治疗，并且与低级别肿瘤相比，生存期长度较短。这些肿瘤可发生在脑和脊髓中的任何地方。一些较常见的低级别星形细胞瘤是：青少年毛细胞型星形细胞瘤、原纤维型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤和胚胎发育不良性神经上皮瘤。两种最常见的高级别星形细胞瘤是间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤(或胶质母细胞瘤)(GBM)。在优选的实施方案中，所述癌症是神经胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤。
[0063] 术语“前列腺癌”是指前列腺的任何癌症。前列腺癌可以是腺癌、肉瘤、小细胞癌、神经内分泌肿瘤或移行细胞癌。优选地，前列腺癌是腺癌。
[0064] 如本文所用，术语“结肠癌”是指任何组织学类型的大肠(包括结肠和直肠)中出现的癌症，包括但不限于恶性上皮肿瘤。结肠癌可以是腺癌、类癌瘤、粘液腺癌(也称为胶样腺癌)、印戒细胞腺癌、硬皮瘤、单纯癌或肉瘤。优选地，结肠癌是腺癌。
[0065] 如本文所用，术语“皮肤癌”是指任何组织学类型的皮肤中出现的癌症，包括但不限于基底细胞癌、默克尔细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤。优选地，皮肤癌是黑素瘤。
[0066] 如本文所用，术语“肺癌”是指任何组织学类型的肺中出现的癌症，包括但不限于小细胞肺癌或非小细胞肺癌(包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌)。优选地，癌症是非小细胞肺癌。
[0067] 如本文所用，术语“胰腺癌”是指任何组织学类型的胰腺中出现的癌症，包括但不限于外分泌肿瘤和内分泌肿瘤。胰腺肿瘤可以是腺癌、腺泡细胞癌、导管内乳头状粘液性赘瘤、粘液性囊腺癌、胰高血糖素瘤、胰岛瘤、多发性内分泌瘤1型。优选地，胰腺癌是外分泌肿瘤。
[0068] 如本文所用，术语“肝癌”是指任何组织学类型的肝脏中出现的癌症，包括但不限于肝细胞癌、纤维板层癌、胆管癌。优选地，肝癌是肝细胞癌。
[0069] 如本文所用，术语“肾癌”是指任何组织学类型的肾中出现的癌症，包括但不限于肾细胞癌(也称为肾细胞腺癌或肾上腺样瘤)。肾细胞癌可能是透明细胞性肾癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞肾细胞癌。优选地，肾癌是肾细胞癌。
[0070] 如本文所用，术语“头颈癌”是指在头部和颈部的组织和器官中出现的癌症。它们包括任何组织学类型的喉癌、咽喉癌、唇癌、口癌、鼻癌和唾液腺癌。头颈部肿瘤可能是鳞状细胞癌症(鳞状细胞癌)、腺癌或肉瘤。优选地，头颈部肿瘤是鳞状细胞癌。
[0071] 如本文所用，术语“乳腺癌”是指任何组织学类型的乳腺的任何癌症。乳腺癌可能是导管原位癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌。优选地，乳腺癌是浸润性乳腺癌。
[0072] 如本文所用，术语“治疗”或“疗法”是指旨在改善患者健康状况的任何行为，例如治疗、防止、预防和延缓疾病。在某些实施方案中，该术语是指改善或根除疾病或与疾病相关的症状。在其它实施方案中，该术语是指由于将一种或多种治疗剂施用于具有这种疾病的受试者而引起的所述疾病的扩散或恶化的最小化。在优选的实施方案中，疗法是化疗。如本文所用，术语“化学治疗”或“化疗”是指使用化学或生物化学物质，特别是使用一种或几种抗肿瘤剂的癌症治疗性处理。
[0073] “治疗有效量”意指向患者施用足以构成癌症治疗的治疗剂的量。
[0074] 如本文所用，术语“不良预后”是指降低的患者生存期和/或早期疾病进展和/或增加的疾病复发和/或增加的转移形成。相反，术语“良好预后”是指增加的患者生存期和/或延迟的疾病进展和/或减少的疾病复发和/或减少的转移形成。
[0075] 如本文所用，术语“信号通路”是指任何细胞内或细胞间过程，通过该过程，细胞将一种信号或刺激转换为另一种信号或刺激，最通常涉及细胞外和细胞内的生物化学反应的有序序列，所述反应通过酶进行并且通过激素和生长因子(细胞间)以及第二信使(细胞内)连接。
[0076] “治疗上可靶向信号通路”是可以通过治疗手段调节，优选已经可用或正在开发的信号通路。
[0077] 如本文所用的术语“标志物”是指其表达模式可以确定并与已知条件相关，特别是与信号通路的激活相关的差异表达基因。
[0078] 如本文所公开的本发明方法可以是体内、离体或体外方法，优选体外方法。
[0079] 本发明人开发了一种强大的工具，该工具帮助确定癌症患者的最佳治疗策略，特别是在可用的治疗手段中。事实上，该工具旨在为临床医生提供帮助选择为达到最佳治疗效果必须靶向哪个肿瘤信号通路的决策工具。如实验部分中所示，本发明人证实，可通过确定代表治疗上可靶向通路的基因集合的表达水平并施用多步归一化程序而从患者活检获得个人预测分级。他们表明，这种连续归一化必须考虑到肿瘤的异质性和复杂性并提供可靠的结果。
[0080] 因此，在第一方面，本发明涉及一种用于在来自患有癌症的受试者的癌症样本中确定可被治疗靶向的肿瘤中的显性信号通路、即治疗上可靶向显性信号通路的方法。
[0081] 所述方法包括
[0082] a)提供代表一些治疗上可靶向信号通路的基因集合在来自所述受试者的癌症样本中的表达水平；
[0083] b)确定步骤a)中提供的所述基因中的每一个的表达水平相比于所述基因在以下中的表达水平的变化
[0084] -在所述癌症起源的器官中，
[0085] -在至少一种对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织中，和
[0086] -在所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型中；
[0087] c)计算所述基因中的每一个的得分，所述得分代表所述基因在癌症样本中的表达相比于所述基因在所述癌症起源的器官中、在对应于所述癌症的低级别或良性肿瘤组织中和在所述癌症起源器官的正常细胞亚型中的表达的总体变化幅度；和
[0088] d)根据所述计算得分对所述基因进行排序，
[0089] 其中所述治疗上可靶向显性信号通路对应于排序最高的基因。
[0090] 在一个实施方案中，所述方法还包括，在步骤a)之前，在所述癌症样本中确定代表一些治疗上可靶向信号通路的所述基因的表达水平。任选地，所述方法还可包括提供来自受试者的癌症样本，例如在手术期间从患者获得的癌症样本。
[0091] 可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定基因的表达水平。具体而言，可(i)通过测量mRNA的量和/或(ii)通过测量编码蛋白的量来确定表达水平。
[0092] 用于确定mRNA量的方法在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于定量或半定量RT-PCR、实时定量或半定量RT-PCR、Nanostring技术、基于测序的方法或转录组方法。
[0094] 然后可通过杂交(例如Northern印迹分析)和/或扩增(例如RT-PCR)检测提取的mRNA。定量或半定量RT-PCR是优选的。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。优选地，设计引物对以重叠内含子，从而区分cDNA扩增与推定的基因组污染。本领域技术人员可以容易地设计这样的引物。其它扩增方法包括但不限于连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
[0095] 可选地，mRNA的量也可使用Nanostring的NCOUNTERTM数字基因表达系统(Geiss等,2008《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》,26:317-325)测量，该系统捕获mRNA转录物并通过分子条形码技术对各个mRNA转录物计数并且由Nanostring Technologies商业化；或使用 Plex 2.0测定法(Affymetrix)测量。
[0096] mRNA的量还可以使用基于高通量测序技术如RNA-Seq(Wang等《, 自然评论-遗传学(Nat Rev Genet.)》,2009年1月；10(1):57-63)或使用微流体系统的测序技术的方法来确定。
[0097] 基因的表达水平还可以通过转录组方法，特别是通过使用DNA微阵列测量mRNA的量来确定。为了确定基因的表达水平，任选地首先进行逆转录的样本被标记并且在杂交条件下与微阵列接触，导致形成与连接到微阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间的复合物。然后检测被标记的杂交复合物并且可以是定量或半定量的。标记可以通过各种方法来实现，例如通过使用放射性或荧光标记。微阵列杂交技术的许多变体可为本领域技术人员所用。适用于测量感兴趣基因的表达水平的DNA生物芯片的实例包括但不限于人类基因组U133 Plus 2.0阵列(Affymetrix)。
[0098] 也可以使用下一代测序方法(NGS)。
[0099] 在一个具体的实施方案中，通过定量RT-PCR来测量mRNA的量。
[0100] 用于测量编码蛋白的量或活性的方法也是本领域技术人员众所周知的，并且方法的选择取决于编码蛋白。通常，这些方法包括使样本与能够选择性地与样本中存在的蛋白质相互作用的结合搭配物接触。结合搭配物通常是多克隆或单克隆抗体，优选单克隆抗体。通过半定量蛋白质印迹、免疫化学(酶标记的和介导的免疫测定法，例如ELISA、生物素/抗生物素蛋白类型测定法、放射免疫测定法、免疫电泳或免疫沉淀)或通过蛋白质或抗体阵列来测量蛋白质的量。在一个具体的实施方案中，通过反相蛋白质微阵列(RPPM)评估蛋白质表达水平。还可以在癌症样本的组织切片(例如冷冻或福尔马林固定的石蜡包埋材料)上通过免疫组织化学来评估蛋白质表达水平。反应通常包括显示标记，例如荧光、化学发光、放射性、酶标记或染料分子，或用于检测抗原和与其反应的一种或多种抗体之间的复合物形成的其它方法。也可以使用比活性测定法，特别是当编码蛋白是酶时。
[0101] 在优选的实施方案中，通过利用定量RT-PCR测量mRNA的量来确定基因的表达水平。
[0102] 优选地，将步骤a)中提供和/或如上所述测定的基因的表达水平相对于参考表达水平，优选相对于一种或多种管家(或对照或参考)基因的表达水平进行归一化。
[0103] 如本文所用，术语“管家基因”是指涉及维持细胞所需的基本功能的基因。管家基因以相对恒定的水平被转录，因此用于对不同样本之间变化的基因的表达水平进行归一化。管家基因的实例包括但不限于GAPDH(Gene ID NCBI 2597)、核糖体18S基因(RNA18S5，Gene ID NCBI:100008588)、β-葡糖苷酸酶、肌动蛋白、微管蛋白、泛素、RPLPO、HPRT1和B2M基因。
[0104] 在一个具体的实施方案中，通过利用定量RT-PCR测量mRNA的量来确定每个基因的表达水平，并利用2-ΔCt方法相对于管家基因、优选地核糖体18S(R18S)和/或GAPDH参考基因对其进行归一化。
[0105] 本领域技术人员可以基于以下指示来选择代表治疗上可靶向信号通路的基因集合。任选地，所述方法还可包括，在步骤a)之前，确定代表治疗上可靶向信号通路的基因集合。
[0106] 由于本发明的方法而排序的信号通路可以变化，特别是根据癌症的类型和新的治疗靶标的发展。本领域技术人员可以基于以下来选择代表治疗上可靶向信号通路的基因：i)相关生物学功能的良好知识，ii)表达水平与肿瘤侵袭性之间的相关性，和/或iii)已经临床使用的治疗手段(包括超说明书药物)的存在。
[0107] 优选地，代表治疗上可靶向信号通路的基因集合包括肿瘤状态标志物，包括炎症、癌症干细胞、缺氧、细胞死亡、翻译后修饰和增殖的标志物；样本的血管生成和淋巴管生成状态的标志物，包括微血管密度、内皮干细胞或祖细胞、促血管生成/促淋巴管生成因子和促血管生成/促淋巴管生成受体的标志物；肿瘤微环境的标志物，包括细胞外成分及其受体和细胞外成分调节因子的标志物；以及肿瘤细胞迁移活性的标志物，包括促迁移因子、促迁移因子受体、上皮间质转化以及与细胞迁移相关的肌动蛋白细胞骨架调节因子的标志物。
[0108] 肿瘤状态标志物
[0109] 肿瘤状态标志物反映了样本中的炎症、癌症干细胞、缺氧的水平，细胞死亡水平，翻译后修饰水平和增殖水平。
[0110] 炎症标志物
[0111] 炎症由炎性细胞(T或B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞)和炎症因子(细胞因子、一氧化氮)的存在定义。
[0112] 样本中的炎症水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于SDF1通路成员，例如SDF1、CXCR4、CRCR7、JAK 2、STAT3和NFkB；其它反映炎症水平的分子，例如VCAM-1、ICAM-1、pSelectin、TNFa；肿瘤促进细胞因子，例如IL-6、IL-23、IL-1、IL-13和其它家族成员、IGF-1、BAFF、CSF-1、MSP、TGFb和一氧化氮(NO)；趋化因子，例如CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1b、CCL5或RANTES、CCL8和MCP-2；免疫细胞浸润标志物，例如CD163、CD204、CD4、CD8、CD68、CD66b、CD25、OX40(CD134)、Foxp3和CD20(Grivennikov等《, 细胞(Cell)》,2010,140(6):883-899；Xueqing等《, 癌症与转移综述(Cancer Metastasis Rev.)》,2010年12月；29(4):709-722；Beverly等《, 临床癌症研究(Clin Cancer Res)》；16(11)；2927-31；Shiao等,《基因与发育(Genes and
development)》,2011,25:2559-2572；Pollard《, 自然(Nature 2004)》,71-78；Raposo《, 兽医学杂志(The Veterinary Journal)》,2015,1090-0233；Ino等《, 英国癌症杂志(Br J Cancer)》,2013.,914-23；Ladanyi等《临, 床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,
2004,521-530)。
development)》,2011,25:2559-2572；Pollard《, 自然(Nature 2004)》,71-78；Raposo《, 兽医学杂志(The Veterinary Journal)》,2015,1090-0233；Ino等《, 英国癌症杂志(Br J Cancer)》,2013.,914-23；Ladanyi等《临, 床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,
2004,521-530)。
[0113] 在一个优选的实施方案中，样本中的炎症水平通过测定SDF1的表达水平来评估。SDF1(基质细胞衍生因子-1，也被称为CXCL12；Gene ID：6387)是一种体内平衡的CXCα-趋化因子，一种小的促炎性趋化性细胞因子，其在多种组织类型中表达，包括淋巴细胞、造血干细胞、内皮细胞、上皮细胞和癌细胞。它有助于肿瘤微环境中癌细胞与正常细胞之间的交流。它促进中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在肿瘤微环境内的迁移、浸润、激活。它还介导一些类型的癌症中的肿瘤转移。
[0114] SDF1信号通路可以在治疗上例如用普乐沙福(商品名Mozobil，目前处于与贝伐单抗联合用于复发性高级别神经胶质瘤的临床试验中)靶向，它是一种用于在非霍奇金淋巴瘤患者中刺激干细胞从骨髓释放进入血液中并阻断SDF1受体CXCR4的造血干细胞动员剂(Beverly A.T.,Simon P.F.,《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,16(2010),16:11；Xueqing Sun,Guangcun Cheng等《, 癌症转移综述(Cancer Metastasis Rev.)》,(2010),29(4):709-722)。
[0115] 癌症干细胞标志物
[0116] 癌症干细胞被定义为展现与干细胞共有的标志物或标志物组合的肿瘤细胞的亚群。癌症干细胞限定在大多数癌症类型中具有许多临床意义的癌细胞亚群，所述临床意义包括：引发微观和宏观转移，造成治疗抗性和癌症复发。这些多重功能反映了不同信号通路如Notch、Wnt/β-连环蛋白、TGF-β、刺猬蛋白、PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT通路的激活。
[0117] 癌症干细胞的存在可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于CD133、巢蛋白、CD15、CD24、CD31、CD34、CD44、CD45、CD49f(整联蛋白α6链)、CD166、CD171、CD184(CXCR4)、CD325(N-钙粘蛋白)、CD326(EpCAM)、CD338(ABCG2)、HER-2/neu、Lgr5、Notch1、Notch2、SSEA-1、BMI-1、Β-连环蛋白、CDX-2、双皮质素、EZH2、纤维连接蛋白、GFAP、核干细胞因子(Nucleosemin)、Oct3/4、Sox2、波形蛋白、ALDH1、Trop2、TGFb、Musashi、NRP1、Wnt/β-连环蛋白通路、TGF-β通路、刺猬蛋白通路、PI3K/Akt/mTOR通路和JAK/STAT通路(Klonisch等《, 分子医学趋势(Trends Mol Med.)》,2008,450-60；Wu等《, 实验与临床癌症研究杂志(Journal of Experimental&Clinical Cancer Research)》,2015,34:44；Medema《,自然-细胞生物学(Nat Cell Biol.),2013年4月；15(4):338-44；Dahlrot RH等,《丹麦医学杂志(Dan Med J.)》,2014,B4944；Zhong Li《, 实验血液学和肿瘤学(Experimental Hematology&Oncology)》,(201)3,2:17)。
[0118] 在一个优选的实施方案中，通过测定CD133的表达水平来评估样本的癌症干细胞含量。CD133，也被称为PROM1(GeneID:8842)，是祖细胞和癌症干细胞标志物。它通过抑制分化来维持干细胞特性。它的表达与一些类型的癌症有关。它有助于肿瘤发生、转移、复发、化疗耐药和不良预后。它也涉及转分化。
[0119] CD133信号通路，即Wnt/β-连环蛋白信号通路，可以在治疗上例如用目前处于临床前试验中的端锚聚合酶(Tankyrase)抑制剂XAV939进行靶向。XAV939通过使破坏复合物的浓度限制成分axin稳定化来刺激β-连环蛋白降解(Zhong Li,《实验血液学和肿瘤学(Experimental Hematology&Oncology)》,30(201)3,2:17)。
[0120] 缺氧标志物
[0121] 缺氧(组织缺氧或血液缺氧)是身体或身体某个区域缺乏足够氧气供应的状况。大多数肿瘤产生血管供应不足的区域，因此呈现严重的缺氧。在许多缺氧但存活的区域中，氧分压几乎比正常组织低两个数量级。缺氧细胞对放疗或化疗有抗性，因此是肿瘤复发的来源。
[0122] 样本的缺氧状态可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于HIF及其靶基因、GLUT-1、CA IX碳酸酐酶IX、LDH-5乳酸脱氢酶同工酶5、MCT-1和MCT-4(Vaupel等《, 癌症转移综述(Cancer Metastasis Rev)》,2007,26:225-239；Rademakers等《, BMC癌症(BMC Cancer)》,2011,11:167)。
[0123] 在一个优选的实施方案中，通过测定HIF1α(Gene ID:3091)的表达水平来评估样本的缺氧状态。HIF1A是缺氧诱导因子家族(HIF家族)的成员。它作为缺氧适应性反应的主要转录调节因子，其与恶性进展、侵袭、血管生成、代谢改变和转移风险增加有关。它在抵抗治疗的癌症中也有作用。
[0124] HIF1α信号通路可以在治疗上例如用以下进行靶向：地高辛，一种非特异性HIF1a抑制剂，目前正在肺癌和前列腺癌的早期阶段试验中进行评估；或硼替佐米，其抑制HIF-1α蛋白表达，获准用于治疗多发性骨髓瘤并且目前正在实体瘤的早期阶段试验中进行评估(Favaro等《, 基因组医学(Genome Medicine)》,(2011),3:55))。
[0125] 细胞死亡标志物
[0126] 细胞死亡可以通过根据其性质和生理影响限定的不同机制发生。这包括凋亡、坏死和自噬性细胞死亡。
[0127] 样本中的细胞死亡水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于凋亡标志物，例如BCL-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、A1/Bfl-1、CED-9、cFLIP、PARG、Bax和相关的抗凋亡因子；坏死标志物，例如RIP3和胱天蛋白酶8；自噬标志物，例如PI3K和Beclin1(Portt等《,生物化学与生物物理学报(Biochimica et Bio-physica Acta)》,2011 238-259；Cory等《, 致癌基因(Oncogene)》,2003,22,8590-8607；Liu等《,国际生物化学与分子生物学杂志(Int J Biochem Mol Biol)》,2012,165-178；Su等《,分子癌症(Mol Cancer)》,2015,10.1186)。
[0128] 在一个优选的实施方案中，通过测定BCL-2和/或PARG，优选BCL-2和PARG的表达水平来评估样本中的细胞死亡水平。
[0129] 作为BCL-2家族成员的BCL-2(B细胞淋巴瘤蛋白2；GeneID：596)是一种抗细胞凋亡蛋白并抑制某些形式的坏死性细胞死亡。它在多种人类恶性肿瘤中过表达。BCL-2信号通路可以在治疗上例如用ABT-199进行靶向，所述ABT-199是目前正在白血病和淋巴瘤的临床试验中进行评估的一种有效和选择性的BCL-2抑制剂(KW Yip和JC Reed,《致癌基因(Oncogene)》,(2008)27,6398-6406；Souers等《, 自然医学(Nature Medicine)》,19,202-
208,2013)。
208,2013)。
[0130] PARG(聚ADP-核糖糖水解酶；GeneID：8505)是一种负责催化聚(ADP-核糖)(PAR)聚合物(一种可逆的染色体蛋白质共价调节剂)的形成和降解的主要酶。PARG在DNA修复和损伤，染色质动力学，转录调控和细胞死亡中发挥作用。PARG信号通路可以在治疗上例如用GPI 16552进行靶向，所述GPI 16552目前处于黑素瘤的临床前研究中(Rafiqul I.,Fumiaki K.,24(2014)3802-3806；Lucio T.,Carlo L.《,欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)》,41,(2005)2948-2957)。
[0131] 翻译后修饰标志物
[0133] 样本中的翻译后修饰水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于PARG，PARP 1和2，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)，组蛋白乙酰转移酶(HAT)，组蛋白甲基转移酶，组蛋白脱甲基酶，DNA甲基转移酶(DNMT)，蛋白质甲基转移酶(PMT)，蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)，蛋白质赖氨酸甲基转移酶(PKMT)，赖氨酸脱甲基酶，激酶Aurora-B，SUMO家族和N/O糖基化标志物如凝集素(Nilufer Jasmine Selimah Fauzee和Juan Pan《, 病理学与肿瘤学研究(Pathol.Oncol.Res.)》,(2010)16:469-478；Wan Feng,Bin Zhang等,《癌症通讯(Cancer Letters)》,347(2014)183-190；Debby M.E.I.Hellebrekers,Arjan W.Griffioen等《, 生物化学与生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)》,1775(2007)76-91；Roy M.Pollock,Victoria M.Richon《,今日药物发现：治疗策略(Drug Discovery Today:Therapeutic Strategies)》,(2009)6-2；Robert A Copeland,Edward J Olhava《, 化学生物学最新观点(Current Opinion in Chemical Biology)》,(2010),14:505-510；Ruth G.F.和Frauke M.,《自然评论：分子细胞生物学(Nature Reviews molecular cell biology)》,(2007),8；Niall O'D.《, 生物化学与生物物理学报(Biochimica et Biophysica)》,(2002)336-345)。
[0134] 在一个优选的实施方案中，通过确定PARG的表达水平来评估样本中的翻译后修饰水平。
[0135] 增殖标志物
[0136] 细胞增殖，更特别是不受控制的细胞增殖是癌症进展的非常重要的组成部分。已知许多因素，无论是细胞因子、生长因子、激素等，都直接或间接地调节细胞周期。
[0137] 样本中的增殖水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于PDGFR/PDGF、EGFR/EGF、HER、C-MET/HGF、IGFR/IGF、FGFR/FGF、轴突导向蛋白(Semaphorin)、神经毡蛋白、神经丛蛋白、VEGFR/VEGF、RAS致癌基因和细胞外基质元件(Masaubmi Shibuya《, 血管生成(Angiogenesis)》,(2006)9:225-230；Masaubmi Shibuya等《, 生物化学与分子生物学杂志(Journal of biochemistry and molecular biology)》,5:469-478；Seker和Harvey《, 发育动力学(Dev Dyn)》,(2015)244:323-331；Alexander K.,Satdarshan P.M.《, 基因表达(Gen Expr)》,(2015),16(3):109-127；Juan Carlos Samamé Pérez-Vargas等,《国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)》,2013,14,18056-18077；
Y.Yarden《,欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)》,37(2001)S3-S8；Perez EA等,《癌症治疗综述(Cancer Treat Rev)》,(2014)276-284；Nicholas T.,Richard G.《,自然癌症综述(nature review cancer)》,(2010)10)。
Y.Yarden《,欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)》,37(2001)S3-S8；Perez EA等,《癌症治疗综述(Cancer Treat Rev)》,(2014)276-284；Nicholas T.,Richard G.《,自然癌症综述(nature review cancer)》,(2010)10)。
[0138] 在一个优选的实施方案中，通过测定以下各物的表达水平来评估样本中的增殖水平：EGFR、HER2、PDGFR、Sema3A、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、MMP9、MMP2、TNC、TNW、IntB1、CMET和/或FGF2，优选地EGFR、HER2、PDGFR、Sema3A、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、MMP9、MMP2、TNC、TNW、IntB1、CMET和FGF2，并且更优选地EGFR、HER2、PDGFR、Sema3A、NRP1、NRP2、PlexA1、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、MMP9、MMP2、TNC、IntB1、CMET和FGF2。
[0139] 在一个具体的实施方案中，所述肿瘤状态标志物选自表1中列出的基因。
[0140] 表1：优选的肿瘤状态标志物的列表
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145] 在一个更具体的实施方案中，所述肿瘤状态标志物选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、MMP2、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
[0146] 在一个优选的实施方案中，所述肿瘤状态标志物选自BCL2、CD133(PROM1)、CMET、EGFR、HER2、HIF1A、JAG1、MMP9、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0147] 血管生成和淋巴管生成状态的标志物
[0148] 血管生成和淋巴管生成状态是指样本中的血管或淋巴管内容物，这些血管是由先前存在的血管或淋巴管周围的肿瘤产生的。血管生成和淋巴管生成状态的标志物反映了微血管密度，内皮干细胞或祖细胞的水平，促血管生成/促淋巴管生成因子的水平以及促血管生成/促淋巴管生成受体的表达水平。
[0149] 微血管密度标志物
[0151] 微血管密度可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于CD34、LYVE1、NG2、VE钙粘蛋白、整联蛋白同种型如ITGB1和CD31(Sidney等《,干细胞(stem cells)》,2014,10.1002；Armulik等《,循环研究(Circulation Research)》,2005,10.1161)。
[0152] 在一个优选的实施方案中，通过测定CD34和/或ITGB1，优选CD34和ITGB1的表达水平来评估样本中的微血管密度。
[0153] CD34(GeneID：947)是造血干细胞和祖细胞的跨膜糖蛋白标志物，也是作为血管内皮祖细胞的非造血细胞类型的标志物。
[0154] ITGB1(或INTB1，GeneID：3688)，即整联蛋白β1，是整联蛋白受体的β亚基，一种基质体成员。它是肿瘤细胞的细胞运动、迁移、血管生成、分化和转移扩散的基础。它以动态的方式参与细胞粘附的周转。它也是EMT(上皮-间质转化)的参与者和肌动蛋白细胞骨架的调节因子。ITGB1信号通路可以在治疗上例如用目前在许多癌症临床研究中的西仑吉肽进行靶向(Timothy ME,S.,Maddy P.,《细胞生物学新见(Current Opinion in Cell Biology)》,(2011),23:562-568)。
[0155] 内皮干细胞或祖细胞的标志物
[0156] 内皮干细胞或祖细胞包括能够产生新血管的造血干细胞和非造血干细胞。
[0157] 内皮干细胞或祖细胞的水平可通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于CD34、CD144、VEGFR2或KDR、CD45、CD133、CD146和NRP1(Urbich等,《循环研究(Circulation Research)》,2004,10.1161；Yoder《, 冷泉港医学展望(Cold Spring Harb Perspect Med.)》,2012,10.1101)。
[0158] 在一个优选的实施方案中，通过测定CD34、NRP1和/或CD133，优选CD34、NRP1和CD133的表达水平来评估样本中内皮干细胞或祖细胞的水平。
[0159] NRP1(神经毡蛋白-1，GeneID：8829)结合许多配体如第3类轴突导向蛋白和血管内皮生长因子，并具有多种类型的共受体。它影响细胞的存活、迁移和吸引。它在神经系统发育、血管生成、肿瘤发生过程中发挥作用。它也是基质体的一部分。
[0160] NRP1信号通路可以在治疗上例如用抗体抗-NRP1或MTP-NRP1(靶向神经毡蛋白-1的肽)进行靶向(Nasarre C等,(2010)《致癌基因(Oncogene)》,29:2381-2392；Lee M.Ellis《, 分子癌症疗法(Mol Cancer Ther)》,(2006)5(5))。
[0161] 促血管生成/促淋巴管生成因子的标志物
[0162] 在血管构建过程中，多种分泌或膜结合因子已经显示促进内皮细胞的增殖、迁移或分化。
[0163] 促血管生成/促淋巴管生成因子的水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于VEGF同种型，PLGF，血管生成素，JAG1,2，NICD，DLL，肝配蛋白，Wnt家族，轴突导向蛋白，白细胞介素，FGF和细胞外基质分子如肌腱蛋白，MMP等(Shibuya《, 生物化学与分子生物学杂志(Journal of Biochemistry and Molecular Biology)》,2006,469-478；Zheng,《临床研究杂志(The Journal of Clinical Investigation)》,2014,10.1172；Carmeliet等《,自然(Nature)》,2011,10.1038；Duong等,《肿瘤学杂志(Journal of oncology)》,2012,10.1155；Weis等《, 自然(Nature)》,2011,
10.1038；Yancopoulos等《, 自然(Nature)》,2000,14；407；Secker等《, 发育动力学(Dev Dyn.)》,2015,10.1002；Andersson等《,自然(Nature)》,2014,10.1038)。
10.1038；Yancopoulos等《, 自然(Nature)》,2000,14；407；Secker等《, 发育动力学(Dev Dyn.)》,2015,10.1002；Andersson等《,自然(Nature)》,2014,10.1038)。
[0164] 在一个优选的实施方案中，通过测定VEGFA、JAG、Sema3A FGF2、TNC、TNW、MMP-2和/或MMP-9，优选VEGFA、JAG、Sema3A FGF2、TNC、TNW、MMP-2和MMP-9的表达水平来评估样本中促血管生成/促淋巴管生成因子的水平。
[0165] VEGFA(血管内皮生长因子A；GeneID：7422)是一种关键的血管生成激活因子。它增加血管渗透性，血管发生，淋巴管生成，和源自动脉、静脉和淋巴的内皮细胞的生长。它在许多类型的癌症中异常过表达。VEGFA信号通路可以在治疗上例如用目前用作胶质母细胞瘤二线治疗的贝伐单抗进行靶向(Napoleone F.,Hns-Peter G.等,(2003)9-6)。
[0166] JAG1(Jagged1；GeneID：182)是促进血管生成的Notch受体配体。它激活内皮细胞的增殖和出芽。它是血管平滑肌细胞覆盖新血管以及CD34介导的内皮细胞和血管周细胞相互作用的关键因子。它也是基质体的一部分。它涉及许多癌症类型。JAG1信号通路可以在治疗上例如用目前处于恶性神经胶质瘤I期和转移性结肠直肠癌II期中的RO4929097进行靶向(Demin Li,Massimo Masiero等,(2004)4 254；Emma R.Andersson,Urban Lendahl《, 药物发现(drug discovery)》,(2014),13)。
[0167] MMP2(基质金属蛋白酶2；GeneID：4313)在调节细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用中起作用。它控制血管生成，细胞分化、增殖、迁移和凋亡。它涉及多种通路，包括在神经系统中的作用，血管生成的调节，和转移。由于其降解细胞外基质成分的能力，它是EMT(上皮间质转化)的参与者，导致许多组织中的细胞迁移。MMP2信号通路可以在治疗上例如用目前处于肺癌III期等中的因环利定(Incyclidine)或马立马司他进行靶向(Jialiang Hu等《,自然评论：药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》,2007年6月；6,480-498；Gillian Murphy《, 医学的分子方面(Mol Aspects Med.)》,2008年10月；29(5):290-308)。
[0168] MMP9(基质金属蛋白酶9；GeneID：4318)在调节细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用中发挥作用。它控制血管生成，细胞分化、增殖、迁移、凋亡和细胞分化。它还涉及胚胎发育，生殖，组织重塑和转移。由于其降解细胞外基质成分的能力，它是EMT(上皮间质转化)的参与者，导致其它组织中的细胞迁移。MMP9信号通路可以在治疗上例如用目前处于前列腺癌I期的马立马司他和PCK 3145进行靶向(Jialiang Hu等《, 自然评论：药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》,2007年6月；6,480-498；Gillian Murphy《, 医学的分子方面(Mol Aspects Med.)》,2008年10月；29(5):290-308)。
[0169] SEMA3A(第3类轴突导向蛋白，GeneID：10371)是轴突导向蛋白家族的成员。它涉及神经系统发育，轴突吸引和排斥，细胞迁移，细胞骨架动力学，免疫应答，细胞凋亡，器官发生，肿瘤抑制和促进，以及脉管系统发育。它也是基质体的成员。
[0170] TNW(也称为TNN或肌腱蛋白N，GeneID：63923)涉及许多细胞机制，例如细胞粘附、运动、增殖、迁移、分化和血管生成。在大多数成人器官中不表达，但在实体瘤中过表达。
[0171] TNC(肌腱蛋白-C；GeneID：3371)是一种参与细胞粘附，组织结构，调节细胞增殖、血管生成和迁移，特别是在发育分化和伤口愈合过程中的细胞外基质糖蛋白。它涉及指导迁移神经元以及发育过程中的轴突，突触可塑性和神经元再生。TNC促进肿瘤进展、传播和转移。TNC信号通路可以在治疗上例如用努拉达布(Neuradiab)(Bradmer Pharmaceuticals,Inc.)进行靶向。
[0172] FGF2(GeneID：2247)是成纤维细胞生长因子(FGFR)家族的配体。它通过参与细胞分裂、存活和迁移以及血管生成而在肿瘤发生中发挥作用。它也是基质体的成员。FGF2信号通路可以在治疗上例如用目前处于肺癌II期的Vargatef或AZD4547进行靶向(Nicholas T.,Richard G.《,自然评论：癌症(nature review cancer)》,(2010)10)。
[0173] 促血管生成受体的标志物
[0174] 促血管生成受体的水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于NOTCH1,2,3,4、VEGFR、TIE、PDGFR、EGFR、神经毡蛋白、JAK、FGFR、WNT、EPHR、神经丛蛋白、Alk受体、CXCR4/12、HER2和整联蛋白(Shibuya《,生物化学与分子生物学杂志(Journal of Biochemistry and Molecular Biology)》,2006,469-478；Zheng《,临床研究杂志(The Journal of Clinical Investigation)》,2014,10.1172；Carmeliet等《,自然(Nature)》,2011,10.1038；Duong等《, 肿瘤学杂志(Journal of oncology)》,2012,10.1155；Weis等《,自然(Nature)》,2011,10.1038；Yancopoulos等《, 自然(Nature)》,2000,
14；407；Secker等,《发育动力学(Dev Dyn)》,2015,10.1002；Andersson等,《自然(Nature)》,2014,10.1038)。
14；407；Secker等,《发育动力学(Dev Dyn)》,2015,10.1002；Andersson等,《自然(Nature)》,2014,10.1038)。
[0175] 在一个优选的实施方案中，通过测定VEGFR1、VEGFR2、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1和/或INTB1，优选VEGFR1、VEGFR2、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1、PlexB1和INTB1的表达水平来评估样本中促血管生成受体的水平。
[0176] VEGFR1(Flt1)在血管生成和血管发生中起重要作用。它促进内皮细胞的增殖、迁移和存活。VEGFR1信号通路可以在治疗上例如用目前处于胶质母细胞瘤临床试验中的凡达特尼、帕唑帕尼、舒尼替尼或阿西替尼进行靶向(Masaubmi Shibuya,《血管生成(Angiogenesis)》,(2006)9:225-230)。
[0177] VEGFR2(KDR/Flk1)是VEGF诱导的内皮增殖、存活、迁移、管状形态发生和出芽的主要介体。它在淋巴脉管系统中也很重要。VEGFR2信号通路可以在治疗上例如用处于胶质母细胞瘤和转移性结肠直肠癌等的临床试验中的帕纳替尼或西地尼布进行靶向(Masabumi Shibuya《, 血管生成(Angiogenesis)》,(2006),5:469-478；Seker和Harvey《, 发育动力学(Dev Dyn)》,(2015)244:323-331)。
[0178] HER2(表皮生长因子受体2)在某些侵袭性类型的乳腺癌和其它癌症的发展和进展中发挥重要作用。它参与细胞存活、迁移和血管生成。HER2信号通路可以在治疗上例如用乳腺癌治疗中使用的拉帕替尼、阿法替尼或曲妥珠单抗 进行靶向(Perez EA等《, 癌症治疗综述(Cancer Treat Rev)》,(2014)276-284)。
[0179] EGFR(表皮生长因子受体)代表着癌症治疗的重要靶标。它导致肿瘤的生长，进展(包括增殖)，迁移，血管生成，侵袭和转移。它与大量癌症相关。它是EMT(上皮-间质转化)的参与者。EGFR信号通路可以在治疗上例如用目前在结肠直肠癌中用作一线治疗的拉帕替尼、阿法替尼或西妥昔单抗 进行靶向(Yarden《, 欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)》,37(2001)S3-S8)。
[0180] PLEXA1(神经丛蛋白A1)是NRP的搭配物并与Rho-GTP酶蛋白相互作用。它触发神经元中的生长锥塌陷，以及迁移和血管生成。它是基质体的一部分。PLEXA1信号通路可以在治疗上例如用目前处于临床前研究中的MTP-PlexA1进行靶向。
[0181] PLEXB1(神经丛蛋白B1)与Rho-GTP酶蛋白相互作用，它在轴突导向、侵袭性生长、细胞迁移和血管生成中发挥作用。它是基质体的一部分。
[0182] NRP2(神经毡蛋白-2)是第3类轴突导向蛋白和血管内皮生长因子的共受体。它在神经元导向中发挥作用。它涉及肿瘤发生和转移。NRP2信号通路可以在治疗上例如用目前处于临床前研究中的MTP-NRP2进行靶向(Parker和Vander Kooin,《分析生物化学(Anal Biochem.)》,2014年5月,15；453:4-6)。
[0183] 在一个具体的实施方案中，所述血管生成和淋巴管生成状态的标志物选自表2中列出的基因。
[0184] 表2：优选的血管生成和淋巴管生成状态的标志物的列表
[0185]
[0186]
[0187]
[0188] 在一个更具体的实施方案中，所述血管生成和淋巴管生成状态的标志物选自BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、FGFR4、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、MMP2、CD34、CXCR4，优选选自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0189] 在一个优选的实施方案中，所述血管生成和淋巴管生成状态的标志物选自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0190] 肿瘤微环境的标志物
[0191] 肿瘤微环境定义为肿瘤发展的细胞和分子环境。一般来说，肿瘤细胞和或周围基质细胞所分泌的任何分子/因子都是肿瘤微环境的一部分。这种微环境既是肿瘤发生的原因又是其后果。肿瘤微环境标志物反映细胞外成分及其受体的水平和细胞外成分调节因子的水平。
[0192] 细胞外成分及其受体的标志物
[0193] 优选地，研究了已知在肿瘤类型中异常表达的细胞外成分及其受体。标志物优选在被定义为包含约300种蛋白质的“基质体”的细胞外基质(ECM)成分列表中选择。
[0194] 细胞外成分及其受体的水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于胶原同种型；细胞外基质糖蛋白如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、肌腱蛋白；蛋白聚糖如基膜蛋白多糖(Perlecan)、核心蛋白聚糖(Decorin)、粘结蛋白聚糖(Syndecan)；和整联蛋白(Langlois等,《肿瘤靶标(Oncotarget)》,2014,10529-10545；Hynes等《, 冷泉港生物学展望(Cold Spring Harb Perspect Biol)》,2012,10.1101；Lu等,《细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)》,2012,10.1083)。
[0195] 在一个优选的实施方案中，通过测定TNC、TNW和/或IntB1，优选TNC、TNW和IntB1的表达水平来评估样本中细胞外成分及其受体的水平。
[0196] 细胞外成分调节因子的标志物
[0197] 细胞外成分调节因子是指已知为ECM修饰酶、ECM结合生长因子和其它ECM相关蛋白的庞大蛋白质集合。细胞外成分调节因子的水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于ECM修饰酶，例如金属蛋白酶如MMP2和MMP9；ECM结合生长因子，例如VEGF同种型、PLGF、血管生成素、FGF和TGF；其它ECM相关蛋白，例如JAG1,2、DLL、肝配蛋白、Wnt家族、轴突导向蛋白、白细胞介素、神经突起生长导向因子(Netrin)和Slit(Egeblad等《,自然(Nature)》,2002,10.10388)。
[0198] 在一个优选的实施方案中，通过测定MMP2、MMP9、FGF2、Sema3A、VEGFA和/或JAG，优选MMP2、MMP9、FGF2、Sema3A、VEGFA和JAG的表达水平来评估样本中细胞外成分调节因子的水平。
[0199] 在一个具体的实施方案中，所述肿瘤微环境的标志物选自表3中列出的基因。
[0200] 表3：优选的肿瘤微环境标志物的列表
[0201]
[0202]
[0203] 在一个更具体的实施方案中，所述肿瘤微环境标志物选自ABL1、ALK、CMET、IntαV(ITGA5)、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、ABL2、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、DDR1和DDR2。
[0204] 在一个优选的实施方案中，所述肿瘤微环境标志物选自CMET、MMP9、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0205] 迁移活性标志物
[0206] 肿瘤细胞迁移是涉及肿瘤周围基质定殖的肿瘤生长的关键步骤。这也包括上皮间质转化和转移产生(即肿瘤细胞在体内传播并最终在多个器官中产生一个或多个肿瘤块)的过程。迁移活性标志物反映了促迁移因子的水平，促迁移因子受体的水平，上皮间质转化的指标水平以及与细胞迁移相关的肌动蛋白细胞骨架调节因子的水平。
[0207] 促迁移因子标志物
[0208] 促迁移因子包括已显示调节细胞迁移的大量可溶性或膜相互作用因子。
[0209] 促迁移因子的水平可通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于ECM因子和调节因子，例如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、MMP、肌腱蛋白；导向分子，例如神经突起生长导向因子、肝配蛋白、轴突导向蛋白、Slit；生长因子，例如TGFα、GDNF、IGF、FGF、VEGF同种型；趋化因子，例如SDF1；和Shh(Dützmann等《, 细胞粘附与迁移(Cell adhesion and migration)》,2010,10.4161；Frield等《, 自然(Nature)》,2013,10.1038；Gaillard等《, 神经学评论(Rev Neurol)》,2005,153-72；Nasarre C等,(2010)《致癌基因(Oncogene)》,29:2381-2392；Nasarre C等《, 细胞粘附与迁移(Cell Adh Migr)》,
2009,3:383-389；Heath G.P.,Yuxiao W.等《,生物物理学与分子生物学进展(Progress in Biophysics and Molecular Biology)》,(2015)1-8)。
2009,3:383-389；Heath G.P.,Yuxiao W.等《,生物物理学与分子生物学进展(Progress in Biophysics and Molecular Biology)》,(2015)1-8)。
[0210] 在一个优选的实施方案中，通过测定SDF1、VEGFA、MMP2、MMP9、TNC、TNW、FGF2和/或Sema3A，优选SDF1、VEGFA、MMP2、MMP9、TNC、TNW、FGF2和Sema3A的表达水平来评估样本中促迁移因子的水平。
[0211] 促迁移因子受体标志物
[0212] 与促迁移因子的多样性一致，许多受体参与促迁移因子的结合和信号传导。促迁移因子受体的水平可通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于神经丛蛋白、神经毡蛋白、EGRF、FGFR、VEGFR、PDGFR、HER2、DCC/UNC5、整联蛋白、钙粘蛋白、EPH受体、C-MET和CXCR4(Dützmann等,《细胞粘附与迁移(Cell adhesion and migration)》,2010,10.4161；Frield等《, 自然(Nature)》,2013,10.1038；Gaillard等《, 神经学评论(Rev Neurol)》,2005,153-72；Nasarre C等,(2010)《致癌基因(Oncogene)》,29:
2381-2392；Nasarre C等《, 细胞粘附与迁移(Cell Adh Migr)》,2009,3:383-389；Heath G.P.,Yuxiao W.等《, 生物物理学与分子生物学进展(Progress in Biophysics and Molecular Biology)》,(2015)1-8)。
2381-2392；Nasarre C等《, 细胞粘附与迁移(Cell Adh Migr)》,2009,3:383-389；Heath G.P.,Yuxiao W.等《, 生物物理学与分子生物学进展(Progress in Biophysics and Molecular Biology)》,(2015)1-8)。
[0213] 在一个优选的实施方案中，通过测定VEGFR1、VEGFR2、INTB1、CMET、PDGFRA、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1和/或PlexB1，优选VEGFR1、VEGFR2、INTB1、CMET、PDGFRA、HER2、EGFR、NRP1、NRP2、PlexA1和PlexB1的表达水平来评估样本中促迁移因子受体的水平。
[0214] PDGFRα(血小板衍生生长因子α，也称为PDGFR2，GeneID 5156)是PDGFR家族的同种型。它参与细胞增殖、存活、迁移、分化、生长和肿瘤进展。它在EMT(上皮间质转化)中也起作用。它涉及一些癌症。PDGFRα信号通路可以在治疗上例如用目前用于慢性粒细胞白血病和胃肠道间质肿瘤的阿西替尼或伊马替尼 进行靶向(Kikuchi和Monga《,基因表达(Gene Expression)》,(2015),16(3):109-127)。
[0215] cMET(也称为MET，GeneID：4233)在一些生物活性如运动、增殖、迁移、细胞存活、血管生成中起着关键的作用。它是EMT(上皮-间质转化)的参与者。它参与许多不同肿瘤类型的发展和转移进展。cMET信号通路可以在治疗上例如用目前用作非小细胞肺癌治疗的SU11274或克唑替尼 进行靶向(Juan Carlos Samamé Pérez-Vargas等《,国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)》,2013,14,18056-18077)。
[0216] EMT标志物
[0217] 如上所述，EMT是上皮细胞失去其细胞极性和细胞-细胞粘附并获得迁移和侵入性质的过程。EMT指标的水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于平滑肌肌动蛋白SMA，波形蛋白，结蛋白，IGFR/IGF，C-MET/HGF，EGFR/EGF，PDGFR/PDGF，TGFb，整联蛋白，Alk-5，b-连环蛋白，Slug，钙粘蛋白，Wnt，Notch，基质降解酶如MMP2和MMP9，以及紧密连接蛋白(Kalluri等《, 临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,2000,10.1172；Heerboth等,《临床和转化医学(Clinical and Translational Medicine)》,
2015,10.1186；Li等《, 药理学和治疗学(Pharmacology&Therapeutics)》,2015,33-46；
Samatov等《, 分子癌症(Molecular Cancer)》,2013,12:107；Margadant等《, 细胞生物学新见(Current Opinion in Cell Biology)》,2011,10.1016)。
2015,10.1186；Li等《, 药理学和治疗学(Pharmacology&Therapeutics)》,2015,33-46；
Samatov等《, 分子癌症(Molecular Cancer)》,2013,12:107；Margadant等《, 细胞生物学新见(Current Opinion in Cell Biology)》,2011,10.1016)。
[0218] 在一个优选的实施方案中，可通过测定INTB1、MMP2和/或MMP9，优选INTB1、MMP2和MMP9的表达水平来评估样本中的EMT指标水平。
[0219] 肌动蛋白细胞骨架调节因子的标志物
[0220] 细胞迁移过程涉及细胞肌动蛋白细胞骨架的连续重构。该过程由不同家族的肌动蛋白-调节蛋白或与肌动蛋白-调节蛋白结合的蛋白质(如表16中所述)的复杂作用产生。肌动蛋白细胞骨架调节因子的水平可以通过本领域技术人员已知的任何标志物来评估，所述标志物包括但不限于α-辅肌动蛋白、神经丛蛋白、RHO-GTP酶、RAC、CDC42、肌球蛋白轻链、整联蛋白和原肌球蛋白(Shankar等,《癌细胞(Cancer Cells)》,PLOS ONE 2015,10.1371；Rottner等《, 细胞生物学新见(Current Opinion in Cell Biology)》,2011,10.1016)。
[0221] 在一个优选的实施方案中，通过测定PLEXA1、PLEXB1和/或INTB1，优选PLEXA1、PLEXB1和INTB1的表达水平来评估样本中肌动蛋白细胞骨架调节因子的水平。
[0222] 在一个具体的实施方案中，所述迁移活性标志物选自表4中列出的基因。
[0223] 表4：优选的迁移活性标志物的列表
[0224]
[0225]
[0226]
[0227] 在一个更具体的实施方案中，所述迁移活性标志物选自ABL1、ALK、BRAF、CMET、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、DDR1、DDR2、HMGB1、TGFb
1、TGFb 2(LDS4)、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4和CXCL10。
1、TGFb 2(LDS4)、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4和CXCL10。
[0228] 在一个优选的实施方案中，所述迁移活性标志物选自CMET、EGFR、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0229] 在一个具体的实施方案中，所述基因集合包含
[0230] (i)样本的肿瘤状态的标志物，其包含
[0231] -至少一种炎症标志物，
[0232] -至少一种癌症干细胞标志物，
[0233] -至少一种缺氧标志物，
[0234] -至少一种细胞死亡标志物，
[0235] -至少一种翻译后修饰标志物，和
[0236] -至少一种增殖标志物；
[0237] (ii)样本的血管生成和淋巴管生成状态的标志物，其包含
[0238] -至少一种微血管密度标志物，
[0239] -至少一种内皮干细胞或祖细胞的标志物，
[0240] -至少一种促血管生成/促淋巴管生成因子的标志物，和
[0241] -至少一种促血管生成/促淋巴管生成受体的标志物；
[0242] (iii)样本的肿瘤微环境的标志物，其包含
[0243] -至少一种细胞外成分及其受体的标志物，和
[0244] -至少一种细胞外成分调节因子的标志物；和
[0245] (iv)样本的肿瘤细胞的迁移活性的标志物，其包含
[0246] -至少一种促迁移因子标志物，
[0247] -至少一种促迁移因子受体标志物，
[0248] -至少一种上皮间质转化标志物，和
[0249] -至少一种与细胞迁移相关的肌动蛋白细胞骨架调节因子的标志物。
[0250] 在另一个具体实施方案中，所述基因集合包含
[0251] (i)至少一种、两种、三种或四种，优选至少5、6、7、8、9、10或11种，更优选至少12种肿瘤状态标志物，其选自表1中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、MMP2、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A，更优选选自BCL2、CD133(PROM1)、CMET、EGFR、HER2、HIF1A、JAG1、MMP9、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0252] ii)至少一种、两种、三种或四种，优选至少5、6、7或8种，更优选至少9种血管生成和淋巴管生成状态标志物，其选自表2中列出的基因，优选选自BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、FGFR4、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、MMP2、CD34、CXCR4，优选选自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2，更优选选自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0253] iii)至少一种或2种，优选至少3或4种，更优选至少5种肿瘤微环境标志物，其选自表3中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、CMET、IntαV(ITGA5)、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、ABL2、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、DDR1和DDR2，更优选选自CMET、MMP9、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；和
[0254] iv)至少一种、两种、三种或四种，优选至少5、6、7或8种，更优选至少9种细胞迁移活性标志物，其选自表4中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、BRAF、CMET、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、DDR1、DDR2、HMGB1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4和CXCL10，优选选自CMET、EGFR、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0255] 这些标志物中的任一个都可能被另一个反映相同通路或相同靶标的标志物代替。
[0256] 应注意到，相同的基因可以是不同特征的标志物。
[0257] 选择包括在所述集合中的基因优选编码可以被治疗剂靶向的蛋白质。特别是，所述基因集合必须包括必须确定预测功效排序的治疗靶标。优选地，治疗靶标选自编码酪氨酸激酶受体或其配体的标志物。
[0258] 然而，所述基因集合还可以包括不可靶向的基因，即仅代表信号通路的基因，所述信号通路包含治疗靶标。
[0259] 在一个实施方案中，所述基因集合包含
[0260] -SDF1、BCL2、CD133、HIF1A和/或PARG，优选SDF1、BCL2、CD133和/或HIF1A作为肿瘤状态标志物，
[0261] -CD34、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，优选VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，更优选CD34、VEGFA、VEGFR2和/或JAG1作为血管生成和淋巴管生成状态标志物，
[0262] -MMP9、MMP2、TNC、TNW和/或INTB1，优选MMP9、MMP2、TNC和/或INTB1，更优选MMP9和/或MMP2作为肿瘤微环境标志物，和/或
[0263] -cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1和/或PLEXB1，优选cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2和/或PLEXA1，更优选cMET、PDGFRA、HER2和/或EGFR作为迁移活性标志物。
[0264] 在一个具体的实施方案中，所述基因集合包含SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、PARG、CD34、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、TNC、TNW、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、PLEXB1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和/或FGF2，优选SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、PARG、CD34、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、TNC、TNW、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、PLEXB1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和FGF2，更优选SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、PARG、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、TNC、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和/或FGF2，并且甚至更优选SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、PDGFRA、c-MET、EGFR和/或HER2。这些标志物中的任一个可被另一个反映相同通路或相同靶标的标志物代替。
[0265] 在另一个具体的实施方案中，所述基因集合包含(i)至少HIF1A、SDF1、MMP9、JAG1、BCL2和CD133基因，和(ii)肿瘤状态、血管生成和淋巴管生成状态、肿瘤微环境和迁移活性的其它标志物，其优选选自表1至4中列出的基因，更优选选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BRAF、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
[0266] 在一个优选的实施方案中，所述基因集合包含至少20、30、40、50、60、70、80或90种基因，其选自表1至4中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。在一个更具体的实施方案中，所述基因集合包含所有这些基因。这些标志物中的任一个可被另一个反映相同通路或相同靶标的标志物代替。
[0267] 在优选的实施方案中，提供或确定表达水平的基因集合包含少于10 000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000种不同基因，优选少于900、800、700、600、
500、400、300、200、150、120或100种基因，并且更优选少于90、80、70、60、50、40或30种基因。
具体而言，标签中包括的基因集合可包含10至1000种基因，更特别是10、12、14、16、18、20、
22、24、26、30、40、50、60、70、80、90至200种基因，并且甚至更特别是10、20、30、40、50、60、
70、80、90至150或100种基因。
500、400、300、200、150、120或100种基因，并且更优选少于90、80、70、60、50、40或30种基因。
具体而言，标签中包括的基因集合可包含10至1000种基因，更特别是10、12、14、16、18、20、
22、24、26、30、40、50、60、70、80、90至200种基因，并且甚至更特别是10、20、30、40、50、60、
70、80、90至150或100种基因。
[0268] 如实验部分中所示，表达水平的原始数据(例如表示为2-ΔCt，其中ΔCt对应于给定基因表达相比于两种内部参考基因18S和GAPDH的平均表达的变化)不允许确定癌症样本中的显性信号通路。
[0269] 本发明人表明这些通路可以通过归一化过程来揭示，所述归一化过程被定义为感兴趣基因在参考正常组织、低级别或良性肿瘤组织和所述组织的主要细胞类型中的表达的多轮比较。
[0270] 因此，在本发明方法的步骤b)中，将步骤a)中提供的每个表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0271] -在所述癌症起源的器官中，即在对应于所述癌症或与所述癌症组织学匹配的正常组织中，
[0272] -在至少一种低级别或良性的，优选低级别的对应于所述癌症或与所述癌症组织学匹配的肿瘤组织中，和
[0273] -在所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型，即可见于与所述癌症组织学匹配的组织中的至少一种正常细胞亚型中。
[0274] 参考的组织和细胞类型取决于癌症的类型并且可以由本领域技术人员容易地限定。
[0275] 本发明的方法还可包括，在步骤b)之前，提供
[0276] -所述癌症起源器官的样本，即对应于所述癌症或与所述癌症组织学匹配的正常组织的样本，
[0277] -低级别或良性的，优选低级别的对应于所述癌症或与所述癌症组织学匹配的肿瘤组织的样本，和/或
[0278] -所述癌症起源器官的至少一种正常细胞亚型的样本。
[0279] 参考的组织和细胞类型的样本可以从癌症患者，另一受试者或健康受试者(即没有患癌症的受试者)提供。参考的组织和细胞类型的样本也可以从组织库提供。
[0280] 所述方法还可包括确定代表一些治疗上可靶向信号通路并且如上所述的基因集合在所述样本中的表达水平。
[0281] 正常组织或器官不含任何肿瘤细胞，并且优选包含多种细胞亚型，优选全部或几乎全部的可产生癌症的细胞亚型。在转移的情况下，癌症起源的器官可能不同于肿瘤的最终定位。
[0282] 低级别或良性肿瘤组织根据科学和医学组织(即世界卫生组织WHO；国际癌症控制联盟UICC；美国癌症联合委员会)所定义和使用的国际公认的命名法来选择。优选地，如本文所用，“低级别肿瘤”是指I级和II级肿瘤或根据TNM癌症分期标记系统的O或I期。术语“良性肿瘤”在本文中用于指非恶性的，即不以无限的侵略性方式生长，不侵入周围组织并且不转移的肿瘤。本领域技术人员可以根据癌症类型容易地选择低级别或良性肿瘤。一种或几种(例如2或3种)低级别和/或良性肿瘤可以用作参考。
[0283] 根据癌症的类型，可以使用一种、两种、三种或更多种主要组织细胞亚型作为参考。细胞亚型优先反映癌症起源的非肿瘤组织或器官的正常组成。例如，对于脑肿瘤，细胞亚型可能是神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞和/或小胶质细胞。本领域技术人员可根据癌症类型，特别是根据所述癌症起源的细胞类型，容易地选择组织细胞亚型。一种或几种(例如2、3或4种)细胞类型可以用作参考。优选地，至少一种细胞类型是所述癌症起源或所述癌症疑似起源的细胞类型。
[0284] 在一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自神经胶质瘤，优选来自胶质母细胞瘤，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基因在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0285] -在正常脑，即所述癌症起源的正常器官中，
[0286] -在至少低级别神经胶质瘤例如I或II级星形细胞瘤，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0287] -在至少正常脑星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元细胞，优选正常脑星形胶质细胞和少突胶质细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0288] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自结肠癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基因在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0289] -在正常结肠中或在结肠平滑肌细胞即正常组织或器官中，
[0290] -在至少非癌性息肉或低级别结肠肿瘤(I或II级)，优选息肉，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0291] -在至少正常结肠上皮细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0292] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自前列腺癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0293] -在正常前列腺，即正常器官或组织中，
[0294] -在至少低级别前列腺肿瘤(I或II级)或良性前列腺增生，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0295] -在至少正常前列腺上皮细胞、前列腺微血管内皮细胞和/或前列腺成纤维细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0296] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自皮肤癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0297] -在正常皮肤组织，即正常器官或组织中，
[0298] -在至少低级别黑素瘤(0级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0299] -在至少正常表皮上皮细胞、真皮上皮细胞、角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞和/或皮肤内皮细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0300] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自肺癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0301] -在正常肺，即正常器官或组织中，
[0302] -在至少低级别肺肿瘤(I或II级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0303] -在至少正常肺平滑肌细胞、肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞和/或气管上皮细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0304] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自胰腺癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0305] -在正常胰腺，即正常器官或组织中，
[0306] -在至少低级别胰腺肿瘤(I或II级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0307] -在至少正常胰腺内皮细胞、腺泡细胞、泡心细胞、导管细胞，星状细胞和/或胰岛细胞(朗格汉斯)，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0308] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自肝癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0309] -在正常肝脏，即正常器官或组织中，
[0310] -在至少低级别肝脏肿瘤(I或II级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0311] -在至少正常肝细胞、肝内皮细胞和/或库普弗(Kupffer)细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0312] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自肾癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0313] -在正常肾脏，即正常器官或组织中，
[0314] -在至少低级别肾脏肿瘤(I或II级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0315] -在至少正常系膜细胞、基质细胞、肾小球内皮细胞、足细胞、上皮细胞、皮质上皮细胞和/或肾小管细胞，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0316] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自头颈癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0317] -在正常器官或组织中，即在喉、咽喉、唇、口、鼻或唾液腺中，取决于确切的肿瘤位置；
[0318] -在至少低级别头颈部肿瘤(I或II级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0320] 在另一个具体的实施方案中，所述癌症样本来自乳腺癌，并且在本发明方法的步骤b)中，将所述集合的每个基团在癌症样本中的表达水平与相同基因在以下中的表达水平进行比较：
[0321] -在正常乳房，即正常器官或组织中，
[0322] -在至少低级别乳房肿瘤(I或II级)，即低级别或良性肿瘤组织中，和
[0323] -在至少正常乳房成纤维细胞和/或上皮细胞(例如导管细胞、小叶细胞)，即所述癌症起源器官的正常细胞亚型中。
[0324] 任选地，浸润感兴趣器官的免疫细胞可以进一步包括为正常细胞亚型。
[0325] 这些参考组织或细胞类型中的集合的每个基因的表达水平可以通过上述任何方法确定，优选通过与癌症样本所用相同的方法确定。
[0326] 在优选的实施方案中，通过定量RT-PCR确定每个基因在这些参考组织或细胞类型中的表达水平。
[0327] 将本发明方法的步骤a)中提供的集合的每个基因的表达水平的变化与所述基因在上述每种参考组织或细胞类型中的表达水平进行比较。
[0328] 在优选的实施方案中，通过定量RT-PCR来确定表达水平，并且通过通常称为ΔΔCt方法的方法来获得变化：
[0329] ●ΔΔCt(器官)＝ΔCt(癌症样本)-ΔCt(器官样本)
[0330] 其中
[0331] ΔCt(癌症样本)＝Ct(癌症样本中的靶基因)-Ct(癌症样本中的管家基因)，和[0332] ΔCt(器官样本)＝Ct(癌症起源器官样本中的靶基因)-Ct(癌症起源器官样本中的管家基因)
[0333] ●ΔΔCt(低级别或良性肿瘤组织)＝ΔCt(癌症样本)-ΔCt(低级别或良性肿瘤组织样本)
[0334] 其中
[0335] ΔCt(癌症样本)＝Ct(癌症样本中的靶基因)-Ct(癌症样本中的管家基因)，和[0336] ΔCt(低级别或良性肿瘤组织样本)＝Ct(低级别或良性肿瘤组织样本中的靶基因)-Ct(低级别或良性肿瘤组织样本中的管家基因)
[0337] ●ΔΔCt(正常细胞亚型)＝ΔCt(癌症样本)-ΔCt(正常细胞亚型)
[0338] 其中
[0339] ΔCt(癌症样本)＝Ct(癌症样本中的靶基因)-Ct(癌症样本中的管家基因)，和[0340] ΔCt(正常细胞亚型样本)＝Ct(正常细胞亚型样本中的靶基因)-Ct(正常细胞亚型样本中的管家基因)
[0341] 在癌症样本中获得的集合的每个基因的表达水平相比于所述基因在参考组织或细胞类型中(即在癌症起源器官样本中，在对应于所述癌症或与所述癌症组织学匹配的低级别或良性肿瘤组织的样本中，以及在所述癌症起源器官的正常细胞亚型的样本中)的表达水平相比的变化因此可以通过取2-ΔΔCt获得。
[0342] 在本发明方法的步骤c)中，对于所述集合的每个基因计算得分，并且其表示所述基因在癌症样本中的表达相比于在正常器官或组织、低级别或良性肿瘤组织以及组织细胞亚型中的表达的总体变化幅度。所述得分与基因表达的总体变化幅度的绝对值成比例。
[0343] 在一个实施方案中，每个基因的得分通过将在每个参考组织或细胞类型中确定的变化相加而获得。
[0344] 在优选的实施方案中，通过定量RT-PCR确定表达水平，并且如下获得每个基因的得分：
[0345]
[0346] 其中n和m是正整数并且相同或不同。
[0347] 因此通过将对于每个参考组织或细胞类型获得的2-ΔΔCt值相加来获得每个基因的得分(即得分＝2-ΔΔCt(参考组织或细胞类型1)+2-ΔΔCt(参考组织或细胞类型2)+...+2-ΔΔCt(参考组织或细胞类型n))。
[0348] 在一个具体的实施方案中，如下获得每个基因的得分：
[0349] 得分＝2-ΔΔCt(器官)+2-ΔΔCt(低级别或良性肿瘤组织1)+...+2-ΔΔCt(低级别或良性肿瘤组织n)+2-ΔΔCt(细胞亚型1)+...+2-ΔΔCt(细胞亚型m)
[0350] 其中n和m是正整数并且相同或不同。
[0351] 在优选的实施方案中，m是1或2并且n是1或2。
[0352] 在其它优选的实施方案中，使用允许在给定样本(例如nanostring或微流体PCR)中直接定量每个RNA分子的技术来确定表达水平并且可使用以下计算获得在癌症样本中获得的所述集合的每个基因的表达水平相比于所述基因在参考组织或细胞类型中的表达水平的变化：
[0353] 基因在癌症样本中的表达水平相比于所述基因在参考组织或细胞类型中的表达水平的变化＝|癌症样本中的RNA量-参考组织或细胞类型中的RNA量|
[0354] 其中癌症样本中以及参考组织或细胞类型中的RNA量优选用一种或两种管家基因的RNA量进行归一化。
[0355] 在这些实施方案中，通过将相比于正常器官或组织、低级别或良性肿瘤组织和组织细胞亚型的变化相加来获得每个基因的得分。
[0356] 如实验部分中所示，获得的得分对于每个患者是特定的。
[0357] 任选地，可以通过将任意值归属于最高得分而对关于所述集合的每个基因获得的得分进行归一化。
[0358] 在本发明方法的步骤d)中，所述集合的基因(即代表治疗上可靶向信号通路)根据计算得分进行排序，从而允许确定癌症样本的显性信号通路，即对应于排序最高的基因的通路。这些显性通路被认为是最佳治疗靶标。
[0359] 优选地，前三个治疗上可靶向基因被认为是显性信号通路并且因此作为最佳治疗靶标。
[0360] 在另一个实施方案中，前两个治疗上可靶向基因被认为是显性信号通路。
[0361] 在另一个实施方案中，排序第一的治疗上可靶向基因决定显性信号通路和最佳治疗靶标。
[0362] 基于这些结果，可以考虑单药治疗(例如靶向排序第一的治疗上可靶向信号通路之一，例如三种排序第一的治疗上可靶向信号通路之一，优选排序第一的治疗上可靶向信号通路)或联合治疗(例如靶向排序第一的治疗上可靶向信号通路中的一种、两种或全部，例如前三种通路)。
[0363] 因此，在第二方面，本发明涉及一种用于确定患有癌症的受试者的治疗方案的方法，所述方法包括根据如上文所公开的本发明方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，以及确定靶向这些显性通路中的至少一种，优选前三种治疗上可靶向通路或基因中的至少一种，更优选前两种治疗上可靶向通路或基因中的至少一种，并且甚至更优选至少排序第一的治疗上可靶向通路或基因的治疗方案。
[0364] 在一个优选的实施方案中，所述治疗方案被设计来靶向两个或三个显性通路，尤其是两个或三个治疗上可靶向基因，优选使用联合治疗。
[0365] 可用于靶向标签基因的治疗剂的实例呈现于下表1中。这些实例应被认为是说明性而不是限制性的。
[0366] 表5：靶向代表信号通路的基因的治疗剂的实例
[0367]
[0368]
[0369]
[0370]
[0371]
[0372]
[0373] 在这个方面也考虑了公开用于确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的方法的所有实施方案。
[0374] 在一个实施方案中，所述方法还包括提供来自受试者的癌症样本并确定代表一些治疗上可靶向显性信号通路的基因集合的表达水平的步骤。
[0375] 在另一方面，本发明还涉及用于选择患有癌症的受试者用于治疗或确定患有癌症的受试者是否易受益于治疗的方法，所述方法包括根据如上文所公开的本发明方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路。
[0376] 在该方法中，所述受试者被选择用于治疗，或者如果治疗靶向至少一个显性通路，优选两个或三个显性通路，则所述受试者易受益于治疗。
[0377] 在一个优选的实施方案中，所述受试者被选择用于治疗，或者如果治疗至少靶向排序第一的治疗上可靶向通路或基因，则所述受试者易受益于治疗。
[0378] 在这个方面也考虑了公开用于确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的方法的所有实施方案。
[0379] 在一个实施方案中，所述方法还包括提供来自受试者的癌症样本并确定代表一些治疗上可靶向显性信号通路的基因集合的表达水平的步骤。
[0380] 在另一方面，本发明涉及一种用于预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，其包括根据本发明的方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路。
[0381] 在该方法中，如果受试者用靶向至少一个显性通路，优选两个或三个显性通路的疗法来治疗，则预后良好。
[0382] 在一个优选的实施方案中，如果受试者用至少靶向排序第一的治疗上可靶向通路或基因的疗法来治疗，则预后良好。
[0384] 在这个方面也考虑了公开用于确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的方法的所有实施方案。
[0385] 在一个实施方案中，所述方法还包括提供来自受试者的癌症样本并确定代表一些治疗上可靶向显性信号通路的基因集合的表达水平的步骤。
[0386] 在另一方面，本发明涉及一种预测癌症对治疗的敏感性的方法，其包括根据如上文所公开的本发明方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路。如果所述治疗靶向至少一个显性通路，优选两个或三个显性通路，则所述癌症被认为可能对该治疗敏感。
[0387] 在一个优选的实施方案中，如果所述治疗至少靶向排序第一的治疗上可靶向通路或基因，则所述癌症被认为可能对该治疗敏感。
[0388] 在这个方面也考虑了公开用于确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的方法的所有实施方案。
[0389] 在一个实施方案中，所述方法还包括提供来自受试者的癌症样本并确定代表一些治疗上可靶向显性信号通路的基因集合的表达水平的步骤。
[0390] 在另一方面，本发明涉及一种治疗癌症患者的方法，其包括
[0391] 根据如上文所公开的本发明方法确定来自所述受试者的癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，以及
[0392] 施用治疗有效量的靶向至少一个显性通路的疗法。
[0393] 优选地，所述疗法是靶向至少两个或三个显性通路的组合疗法。
[0394] 在一个具体的实施方案中，所述疗法至少靶向排序第一的治疗上可靶向通路或基因。
[0395] 在这个方面也考虑了公开用于确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路的方法的所有实施方案。
[0396] 在一个实施方案中，所述方法还包括提供来自受试者的癌症样本并确定代表一些治疗上可靶向显性信号通路的基因集合的表达水平的步骤。
[0397] 本发明还涉及一种用于筛选或鉴定适合于治疗癌症的分子的方法，其包括
[0398] 根据如上文所公开的本发明方法确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路；
[0399] 将来自所述癌症样本的肿瘤细胞移植到非人类动物模型中；
[0400] 将一种或几种候选分子施用于所述模型并分析对疾病进展的影响。
[0402] 该方法允许建立特定肿瘤标签与治疗功效之间的相关性。由于该方法而选择的候选分子因此可用于患有展现类似显性信号通路的癌症的患者。
[0403] 在另一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含引物、探针和/或对所述集合的基因(即代表治疗上可靶向显性信号通路的基因)具特异性的抗体，以及任选地提供使用这种试剂盒的指南的活叶。
[0404] 特别是，所述试剂盒可包含
[0405] -至少一对引物，探针或对如上所述的炎症标志物具特异性的抗体，
[0406] -至少一对引物，探针或对如上所述的癌症干细胞标志物具特异性的抗体，
[0407] -至少一对引物，探针或对如上所述的缺氧标志物具特异性的抗体，
[0408] -至少一对引物，探针或对如上所述的细胞死亡标志物具特异性的抗体，
[0409] -至少一对引物，探针或对如上所述的翻译后修饰标志物具特异性的抗体，
[0410] -至少一对引物，探针或对如上所述的增殖标志物具特异性的抗体，
[0411] -至少一对引物，探针或对如上所述的微血管密度标志物具特异性的抗体，
[0412] -至少一对引物，探针或对如上所述的内皮干细胞或祖细胞的标志物具特异性的抗体，
[0413] -至少一对引物，探针或对如上所述的促血管生成/促淋巴管生成因子标志物具特异性的抗体，
[0414] -至少一对引物，探针或对如上所述的促血管生成/促淋巴管生成受体标志物具特异性的抗体，
[0415] -至少一对引物，探针或对如上所述的细胞外成分及其受体的标志物具特异性的抗体，
[0416] -至少一对引物，探针或对如上所述的细胞外成分调节因子的标志物具特异性的抗体，
[0417] -至少一对引物，探针或对如上所述的促迁移因子标志物具特异性的抗体，
[0418] -至少一对引物，探针或对如上所述的促迁移因子受体标志物具特异性的抗体，[0419] -至少一对引物，探针或对如上所述的上皮间质转化标志物具特异性的抗体，和/或
[0420] -至少一对引物，探针或对如上所述的与细胞迁移相关的肌动蛋白细胞骨架调节因子的标志物具特异性的抗体。
[0421] 在一个具体的实施方案中，所述试剂盒包含
[0422] -一对引物，探针或对HIF1A具特异性的抗体，
[0423] -一对引物，探针或对SDF1具特异性的抗体，
[0424] -一对引物，探针或对MMP9具特异性的抗体，
[0425] -一对引物，探针或对JAG1具特异性的抗体，
[0426] -一对引物，探针或对BCL2具特异性的抗体，和/或
[0427] -一对引物，探针或对CD133基因具特异性的抗体。
[0428] 所述试剂盒还可包含一对引物，探针或对至少一种基因具特异性的抗体，所述基因选自PARG、CD34、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、MMP2、TNC、TNW、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、PLEXB1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和FGF2，优选选自PARG、VEGFR1、VEGFR2、VEGFA、MMP2、TNC、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1、INTB1、PDGFRA、c-MET、EGFR、HER2和FGF2，优选一对引物，探针或对这些基因中的每一个具特异性的抗体。
[0429] 在另一个实施方案中，所述试剂盒包含
[0430] (i)引物对，探针或对至少一种、两种、三种或四种，优选至少5、6、7、8、9、10或11种，更优选至少12种肿瘤状态标志物具特异性的抗体，所述肿瘤状态标志物选自表1中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、MMP2、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A，更优选选自BCL2、CD133(PROM1)、CMET、EGFR、HER2、HIF1A、JAG1、MMP9、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0431] ii)引物对，探针或对至少一种、两种、三种或四种，优选至少5、6、7或8种，更优选至少9种血管生成和淋巴管生成状态标志物具特异性的抗体，所述血管生成和淋巴管生成状态标志物选自表2中列出的基因，优选选自BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、FGFR4、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、MMP2、CD34、CXCR4，优选选自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2，更优选选自EGFR、HER2、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；
[0432] iii)引物对，探针或对至少一种或2种，优选至少3或4种，更优选至少5种肿瘤微环境标志物具特异性的抗体，所述肿瘤微环境标志物选自表3中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、CMET、IntαV(ITGA5)、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、RET、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、ABL2、HER4(ERBB4)、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、DDR1和DDR2，更优选选自CMET、MMP9、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2；和
[0433] iv)引物对，探针或对至少一种、两种、三种或四种，优选至少5、6、7或8种，更优选至少9种细胞迁移活性标志物具特异性的抗体，所述细胞迁移活性标志物选自表4中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、BRAF、CMET、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、C-RAF(RAF1)、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、mTOR、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、DDR1、DDR2、HMGB1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4和CXCL10，优选选自CMET、EGFR、JAG1、MMP9、PDGFRA、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)和MMP2。
[0434] 在另一个实施方案中，所述试剂盒包含
[0435] -引物对，探针或对SDF1、BCL2、CD133、HIF1A和/或PARG，优选SDF1、BCL2、CD133和/或HIF1A具特异性的抗体，
[0436] -引物对，探针或对CD34、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，优选VEGFA、VEGFR1、VEGFR2和/或JAG1，更优选CD34、VEGFA、VEGFR2和/或JAG1具特异性的抗体，
[0437] -引物对，探针或对MMP9、MMP2、TNC、TNW和/或INTB1，优选MMP9、MMP2、TNC和/或INTB1，更优选MMP9和/或MMP2具特异性的抗体，和
[0438] -引物对，探针或对cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2、PLEXA1和/或PLEXB1，优选cMET、FGF2、PDGFRA、HER2、EGFR、SEMA3、NRP1、NRP2和/或PLEXA1，更优选cMET、PDGFRA、HER2和/或EGFR具特异性的抗体。
[0439] 在另一个具体的实施方案中，所述试剂盒包含引物对，探针或对选自SDF1、BCL2、CD133、HIF1A、VEGFR2、VEGFA、JAG1、MMP2、MMP9、PDGFRA、c-MET、EGFR和HER2的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种基因具特异性，优选对所有这些基因具特异性的抗体。
[0440] 在另一个具体的实施方案中，所述试剂盒包含(i)引物对，探针或对至少HIF1A、SDF1、MMP9、JAG1、BCL2和CD133基因具特异性的抗体，和(ii)引物对，探针或对肿瘤状态、血管生成和淋巴管生成状态、肿瘤微环境和迁移活性的其它标志物具特异性的抗体，所述标志物优选选自表1至4中列出的基因，更优选选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。
[0441] 在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含引物对，探针或对至少20、30、40、50、60、70、80或90种基因具特异性的抗体，所述基因选自表1至4中列出的基因，优选选自ABL1、ALK、B7-H3(CD276)、BCL2、BRAF、CD133(PROM1)、CMET、CTLA4、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、ERBB3、HIF1A、IGF1R、IntαV(ITGA5)、JAG1、MEK 1(MAP2K1)、MEK 2(MAP2K2)、MMP9、PDGFRA、PDGFRB、PDL1(CD274)、RET、CXCL12(SDF1)、VEGFA、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT4)、CEACAM-1、CEACAM-5、PI3Kα(PIK3CA)、AKT1、AR(雄激素受体)、HDAC1、HDAC2、C-RAF(RAF1)、PD1、MDM2、CDK4、CDK6、IDO1、ABL2、FGFR4、HER4(ERBB4)、KIT、EZH2、IDH1、IDH2、VHL、mTOR、TRAIL-R1(TNFRSF10A)、TRAIL-R2(TNFRSF10B)、CD39(ENTPD1)、CREBBP、EP300、BRD4、GRB2、NOTCH 1、NOTCH 2、EPHA1、ANGPT1、Tie2(TEK)、RHOA、ROCK 1、ROCK 2、MMP2、CD34、DDR1、DDR2、KDM1A(LSD1)、FOXP3、CD27、ICOS(CD278)、IL4、IL13、HMGB1、FPR1、TGFb 1、TGFb 2(LDS4)、CD40、IL6、CTNNB1、MYC、WNT 2、WNT 3、CXCR4、CXCL10、TLR4、IL2RB、PDL2(PDCD1LG2)和KIR2DL5A。在一个更具体的实施方案中，所述试剂盒包含引物对，探针或对所有这些基因具特异性的抗体。
[0442] 在优选的实施方案中，所述试剂盒包含引物对，探针或对少于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000种不同基因，优选少于900、800、700、600、500、400、
300、200、150、120或100种基因并且更优选少于90、80、70、60、50、40或30种基因具特异性的抗体。
300、200、150、120或100种基因并且更优选少于90、80、70、60、50、40或30种基因具特异性的抗体。
[0443] 优选地，所述试剂盒包含一种阵列，其中对代表如上所述的治疗上可靶向显性信号通路的基因具特异性的探针被固定。所述探针可由本领域技术人员容易地设计。
[0444] 任选地，所述试剂盒还可包含至少一对引物，探针或对例如上述管家基因具特异性的抗体。
[0445] 所述试剂盒还可包含其它试剂，例如缓冲剂、酶或核苷酸。
[0446] 本发明还涉及根据本发明并且如上文所公开的试剂盒的用途，其根据如上文所公开的本发明方法用于(i)确定癌症样本中的治疗上可靶向显性信号通路，(ii)确定患有癌症的受试者的治疗方案，(iii)选择患有癌症的受试者用于治疗，(iv)确定患有癌症的受试者是否易受益于治疗，(v)预测患有癌症的受试者的临床结果，(vi)治疗癌症患者和/或(vii)预测癌症对治疗的敏感性。
[0447] 在这个方面也考虑了对于本发明方法所公开的所有实施方案。
[0448] 将在下面的实施例中描述本发明的其它方面和优点，所述实施例应被认为是说明性而非限制性的。
[0449] 实施例
[0450] 材料和方法
[0451] 肿瘤样本收集
[0452] 在Strasbourg Hautepierre医院(法国)的神经外科部门收集了21例患者胶质母细胞瘤活检组织。仅使用了肿瘤诊断或组织收集所不需要的手术剩余材料。获得患者同意书并由CRB(Centre de resources biologiques)系统地维护，并且从神经病理学部门获得患者诊断。研究样本是匿名的研究。在手术期间直接收集活检组织，储存在具有10％FBS(胎牛血清；10270-106)、100U/mL青霉素-100μg/mL链霉素的4℃DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基高葡萄糖L0104-500)细胞培养基中，然后立即机械解离。活检组织的一部分保存在-80℃。使细胞悬浮液通过由100μm直径孔制成的筛，以800rpm离心5分钟。除去上清液，加入20mL培养基以悬浮细胞沉淀，并以800rpm离心5分钟。该步骤重复3次以洗涤细胞悬浮液并消除红血球。然后将细胞重悬于5mL PBS 1x中，保留3mL用于RNA提取并且将2mL用于小鼠中的异种移植。
[0453] 在小鼠中异种移植并经皮下连续传代的来自15个确定患者源结肠直肠肿瘤的冷冻片段由Oncodesign提供。(CR-IC-004M-P4/CRIC-006M-P3/CR-IC-007M-P4/CR-IC-009M-P3/CR-IC-0013M-P3/CR-IC-0021M-P4/CRIC-0025M-P3/CR-IC-0028M-P3/CR-IGR-002M-P4/CR-IGR-0023M-P3/CR-IGR-048M-P3/CR-IGR-052C-P4/CR-LRB-008M-P4/CR-LRB-009C-P4/CR-LRB-019C-P5)。对于每个模型，将用液氮在DMSO/SVF/RPMI 1640培养基(10/10/80)中冷冻的来自人类原发肿瘤的片段在37℃解冻5分钟，在RPMI 1640培养基中冲洗两次，然后植入9只CB17 SCID小鼠的右侧腹。
[0454] 我们还收集了来自10个I或IV级结肠肿瘤的RNA(BIOSERVE；Z5ALYRSH/OQMNOR32/FC1AVRAA/4QDH8RIJ/RVBKJR34/EK21MRMMZ/R5NSMRQV/565HFAF2/65SVOR2E/38U4VRSY)。所述RNA样本储存在-20℃。
[0455] 我们还收集了来自4个前列腺腺癌的RNA(CLINISCIENCE；CR561921/CR559759/CR562458/CR560249)、来自5个PDX的RNA(由XENTECH提供的患者源异种移植物，PAC120/HID28/HID28-CAS/HID110-CAS/HID115-CAS)，和来自6个II、III或IV期前列腺肿瘤的RNA(BIOSERVE；GT55QRIQ；T523WRU4；1XYXGRIR；VRS8ER21；PR3CURKH；MBUQ4RW3)。所有ARN样本储存在-20℃。
[0456] RNA提取
[0457] 对于前列腺的5个PDX，首先将肿瘤样本粉碎。将样本放置在具有(MOLECULAR RESEARCH CENTER；RNA/DNA分离试剂；TR118)和5个珠粒(BERTIN
TECHNOLOGIES；2.8mm氧化锆珠粒039661-1-102)的管(BERTIN TECHNOLOGIES；Precellys
24裂解试剂盒KT03961-1-403.2)中。管在15秒内用组织裂解器(BERTIN TECHNOLOGIES；
Precellys 24)在6500次振荡/分钟下振荡，在4℃下在14分钟内以14 000rpm离心
(EPPENDORF；Eppendorf离心机5417R)。保持水相以提取RNA。
TECHNOLOGIES；2.8mm氧化锆珠粒039661-1-102)的管(BERTIN TECHNOLOGIES；Precellys
24裂解试剂盒KT03961-1-403.2)中。管在15秒内用组织裂解器(BERTIN TECHNOLOGIES；
Precellys 24)在6500次振荡/分钟下振荡，在4℃下在14分钟内以14 000rpm离心
(EPPENDORF；Eppendorf离心机5417R)。保持水相以提取RNA。
[0458] 总RNA用Tri (MOLECULAR RESEARCH CENTER；RNA/DNA分离试剂；TR118)提取。加入200μL氯仿(VWR Chemicals，22706.292)；将样本剧烈混合并在室温下温育15分钟，然后在4℃以12000g离心15分钟。将水相转移到新管中并加入500μL异丙醇(VWR Chemicals，20839.366)，将样本混合，并且在室温下10分钟后，将它们在4℃以12000g短暂离心8分钟。将RNA沉淀与1mL 75％乙醇混合并在4℃以7500g离心5分钟。该步骤重复3次。除去乙醇(VWR Chemicals，20821.365)，将RNA沉淀风干30分钟至1小时，然后溶于超纯水中，并在50-60℃温育10分钟。短暂离心后，用nanodrop 5(Thermo Scientific；Nanodrop 1000分光光度计)测量ARN浓度。RNA在-20℃储存直至使用。
[0459] 逆转录
[0460] 高容量cDNA逆转录试剂盒(APLLIED BIOSYSTEM；4368814)用于进行RNA的逆转录。将RNA以2μg/10μL稀释并在由7.8μL超纯水、2μL 10X DNASE I反应缓冲液、0.2μL DNASE(10U/μL)组成的RNA MIX溶液中在室温下温育15分钟，然后在85℃下温育10分钟。然后将样本冷却，混合并旋转。将样本的一半与2μL RT缓冲液10X、0.8μL DNTP混合物、2μL随机引物
10X、4.2μL水和1μL逆转录酶一起温育。样本在25℃温育10分钟，37℃温育2小时，以及85℃温育5分钟。然后将cDNA以1/50稀释于超纯水中并在-20℃保存。
10X、4.2μL水和1μL逆转录酶一起温育。样本在25℃温育10分钟，37℃温育2小时，以及85℃温育5分钟。然后将cDNA以1/50稀释于超纯水中并在-20℃保存。
[0461] RTqPCR
[0462] 使用Applied Biosystems(APPLIED；Custom TaqMan Array Plates)专门为此项目生产的定制微孔板从患者活检组织新鲜制备的RNA提取物来确定构成肿瘤标签的靶基因的表达水平。这个项目使用了3个不同的批次。
[0463] 表6
[0464]
[0465]
[0466] 将27μL cDNA与 主混合溶液(APPLIED BIOSYSTEM；4369016)混合，获得每20μL反应物1至100ng的浓度。将TaqMAn平板以1000rpm短暂离心1分钟，然后将盖从平板上移去，并将20μL cDNA和主混合溶液分配在平板的适当孔中。使用 光学粘性
膜(APPLIED BIOSYSTEM；4311971)覆盖平板并以1000rpm短暂离心(EPPENDORF离心机
5417R)1分钟，使溶液到达孔的底部。使用7500实时PCR系统进行RTqPCR。
膜(APPLIED BIOSYSTEM；4311971)覆盖平板并以1000rpm短暂离心(EPPENDORF离心机
5417R)1分钟，使溶液到达孔的底部。使用7500实时PCR系统进行RTqPCR。
[0467] 归一化过程
[0468] 定量RT-qPCR提供靶基因相比于2种管家基因核糖体18S和GAPDH的相对表达水平(ΔCt，ΔCt(癌症样本)＝Ct(癌症样本中的靶基因)-平均Ct(癌症样本中的管家基因)；ΔCt(参考组织或细胞类型)＝Ct(参考组织或细胞类型中的靶基因)-平均Ct(参考组织或细胞类型中的管家基因))。
[0469] 归一化过程是基于癌症样本中的表达水平与靶基因在每种肿瘤类型(正常组织、低级别或良性肿瘤组织和组织细胞亚型)的特定参考中的表达水平的多轮比较。
[0470] 计算所有中间相对表达水平(2-ΔΔCt，2-ΔΔCt＝2-ΔCt(癌症样本)-2-ΔCt(参考组织或细胞类型))并相加(加和＝2-ΔΔCt(参考组织或细胞类型1)+2-ΔΔCt(参考组织或细胞类型2)+...+2-ΔΔCt(参考组织或细胞类型n))。
[0471] 在对每个靶标的得分进行排序之后，假定1000分为最高水平来确定归一化得分。
[0472] 胶质母细胞瘤的参考是来自正常脑(AGILENT TECHNOLOGIES；540005)、星形细胞瘤(CLINISCIENCES；CR562205)、星形胶质细胞(SCIENCELL；1805)和少突胶质细胞(BIOCHAIN；R1234045-10)的总RNA。
[0473] 结肠肿瘤的参考是来自人类结肠平滑肌细胞(CLINISCIENCES；2945-SC)、人结肠上皮细胞(CLINISCIENCES；2955-SC)和息肉的总RNA。
[0474] 前列腺肿瘤的参考是来自前列腺上皮细胞(CLINISCIENCES；4405-SC)、前列腺微血管内皮细胞(CLINISCIENCES；4415-SC)、前列腺成纤维细胞(CLINISCIENCES；4435-SC)、正常范围内的前列腺(CLINISCIENCES；CR559759)和前列腺腺体增生(CLINISCIENCES；CR560153)的总RNA。
[0475] 将利用不同参考样本获得的中间相对表达水平2-ΔΔCt相加，然后对基因进行降序排列以计算得分。将得分最高的基因设定为1000分的任意单位，并且利用该值对其它基因进行归一化。每个基因得到[0；1000]之间的得分。(图1)。
[0476] 体内实验：胶质母细胞瘤模型
[0477] 所有使用动物的程序都已提交给动物护理和使用委员会并获得批准。
[0478] 在0.5L O2下用3％异氟烷(BAXTER)麻醉免疫受损小鼠，并接受皮下注射1％1.5mL/Kg酮洛芬(MERIAL)。切开头皮，并且在注射器引入后5分钟，将100 000个解离胶质母细胞瘤活检组织细胞用安装在立体定位仪(HARVARD APPARATUS)上的2μL Hamilton注射器(HARVARD APPARATUS；HAM-88400)在以下坐标从前囟植入：x:-2mm；y:+1mm；z:-3.5mm，速度为0.66μl/min。注射后，将注射器原位保持5分钟，然后每分钟提高1mm。用7.5mm Michel不锈钢伤口夹(A75，PERFECT)缝合头皮。使动物在加热灯下恢复几分钟，然后将它们放回笼中。
[0479] 在肿瘤发展52天后，将小鼠随机分为4组治疗。第一组用静脉内40mg/kg替莫唑胺(n＝9)治疗连续5天，第二组用口服25mg/kg SB-3CT(n＝9)治疗10天，在5天后以2天洗脱中断，第三组用口服6mg/kg西地尼布(n＝10)治疗10天，在5天后以2天洗脱中断，最后一组用每周1次口服50mg/kg厄洛替尼(n＝9)治疗3周。施用量是100μL。在终止当天(第一次治疗后21天)，通过颈椎脱臼处死所有小鼠，移出大脑(总共38个样本)，并且包含在低温包埋培养基 中并储存在-80℃。
[0480] 用安装在刀片(Superfrost Super Plus)上的低温恒温器(LEICA CM 3050S)将大脑切成20μm切片，并储存于-20℃。为了使肿瘤可视化，将脑切片在蒸馏水中解冻，并用2％稀释的Giemsa染色剂(SUBRA；RAL diagnostic 320310-1000)在蒸馏水中于37℃染色2小时。然后将切片用蒸馏水冲洗，在0.5％乙酸水溶液(SIGMA；33209-12)中温育15秒，在甲苯(VWR Chemicals；28676.297)中的70％、95％和100％ETOH浴中快速脱水，并固定在盖玻片(KNITTEL GLASS)下。通过将每个部分体积相加来计算肿瘤体积：[V总＝Σ部分体积＝Σd1x(S1+S2)/2+d2x(S2+S3)/2+...+dnx(Sn+Sn+1)]。通过用ZEN软件包围每个脑切片的肿瘤界限来获得所有表面。
[0481] 体内实验：结肠直肠肿瘤模型
[0482] 所有使用动物的程序都提交给法国当局同意的Oncodesign(Oncomet)动物护理和使用委员会。
[0483] 在结肠直肠癌肿瘤动物模型中测试计算得分的预测值。将小肿瘤片段(CR-IC-004M-P4/CR-IC-006M-P3/CR-IC-007M-P4/CR-IC-009M-P3/CR-IC-0013M-P3/CR-IC-0021M-P4/CR-IC-0025M-P3/CR-IC-0028M-P3/CRIGR-002M-P4/CR-IGR-0023M-P3/CR-IGR-048M-P3/CR-IGR-052C-P4/CR-LRB-008MP4/CR-LRB-009C-P4/CR-LRB-019C-P5)皮下植入
CB17SCID小鼠的右侧腹。当肿瘤达到200-300mm3的平均体积时，开始治疗。使用Vivo软件(Biosystemes,Couternon,France)将动物根据其个别肿瘤体积随机分为2
组。进行统计检验(方差分析)以检验各组间的同质性。第一组用每周1次腹膜内12.5mg/kg西妥昔单抗(n＝10)治疗3周，第二组用西妥昔单抗0.9％NaCl媒介物治疗。通过[(a x b2)/
2]计算肿瘤体积，其中a是最大肿瘤直径，b是用卡尺测量的垂直肿瘤直径。
CB17SCID小鼠的右侧腹。当肿瘤达到200-300mm3的平均体积时，开始治疗。使用Vivo软件(Biosystemes,Couternon,France)将动物根据其个别肿瘤体积随机分为2
组。进行统计检验(方差分析)以检验各组间的同质性。第一组用每周1次腹膜内12.5mg/kg西妥昔单抗(n＝10)治疗3周，第二组用西妥昔单抗0.9％NaCl媒介物治疗。通过[(a x b2)/
2]计算肿瘤体积，其中a是最大肿瘤直径，b是用卡尺测量的垂直肿瘤直径。
[0484] 在根据所得标签选择的一个PDX模型(ONCODESIGN；CR-IC-028M)中测试了标签的预测值，并且先前的结果证明这两个模型对西妥昔单抗没有响应。将小肿瘤片段皮下植入9只CB17SCID小鼠的右侧腹。当肿瘤大小达到500-700mm3时，手术切除肿瘤并将小肿瘤片段皮下植入52只受者SWISS裸鼠的右侧腹。
[0485] 当肿瘤达到平均体积200-300mm3时开始治疗。使用Vivo 软件(Biosystemes,Couternon,France)将40只动物根据其个别肿瘤体积随机分为4组，每组10只动物。进行统计检验(方差分析)以检验各组间的同质性。
[0486] 模型CR-IC-028M的第一组用每周1次腹膜内12.5mg/kg西妥昔单抗(n＝10)治疗3周，第二组用每周两次腹膜内1mg/kg曲妥珠单抗(n＝10)治疗3周，第三组用口服6mg/kg西地尼布(n＝10)治疗10天，在5天后以2天洗脱中断。最后一组，即对照组，接受西妥昔单抗和西地尼布的媒介物的混合物。两个模型的施用量是10mL/kg(200μL/20g小鼠)，根据小鼠的最近个体体重进行调整。
[0487] 通过[(a x b2)/2]计算肿瘤体积，其中a是最大肿瘤直径并且b是每3天用卡尺测量的垂直肿瘤直径。
[0488] 在终止当天(第一次治疗后31天)，通过气体麻醉超剂量(异氟烷)处死小鼠(总共40个样本)，然后颈椎脱臼或放血并且从所有小鼠收集肿瘤。
[0489] 体内实验：前列腺肿瘤模型
[0490] 通过The Direction des Services Vétérinaires,Ministère de l'Agriculture et de la Pêche,France获得在CERFE设施中使用动物的授权。动物护理和圈养符合法国关于实验动物保护的监管法规。所有实验都是根据法国关于保护实验室动物的法规以及根据法国农业和渔业部颁布的关于脊椎动物实验的现行有效许可证进行的。
[0491] 根据所得标签选择一种PDX模型(XENTECH；HID-28，激素难治性前列腺癌(HRPC)变体)，并且先前的结果证明该模型对多西他赛有响应。将小肿瘤片段皮下植入无胸腺裸鼠的侧腹。当肿瘤大小达到1000至2000mm3时，手术切除肿瘤并将小肿瘤片段(大约40mm3)植入82只裸鼠的肩胛间区域的皮下组织中。本研究纳入36只具有确定生长的肿瘤并且肿瘤体积范围为60至200mm3的小鼠，并根据其个别肿瘤体积随机分为4组，每组9只小鼠。肿瘤标签在扩增期间以及植入后得到验证。
[0492] 第一组用每周1次口服50mg/kg厄洛替尼(n＝9)治疗3周，第二组用口服6mg/kg西地尼布(n＝9)治疗3个5天周期，其中以2天洗脱中断，第三组用厄洛替尼和西地尼布的媒介物混合物(0.5％羧甲基纤维素钠、15％captisol、1％DMSO和0.5％甲基纤维素)治疗，并且最后一组用腹膜内20mg/kg多西他赛(n＝9)治疗2个周期，每3周1次注射。
[0493] 每两周通过用卡尺测量肿瘤直径来评估肿瘤体积。将使用公式TV(mm3)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2，其中长度和宽度分别是肿瘤的最长和最短直径。
[0494] 在终止当天(第一次治疗后28天)，通过颈椎脱臼处死小鼠，从所有小鼠收集肿瘤(总共36个肿瘤样本)，并且从每组5只小鼠收集血清(总共20个血清样本)。
[0495] 药物和制剂
[0496] 将Temodal(Selleckchem)溶于20％DMSO中，在30％DMSO中制备SB-3CT(Selleckchem)。将西地尼布(Selleckchem)溶于0.5％甲基纤维素中。将厄洛替尼
(Selleckchem)溶于0.5％羧甲基纤维素钠、15％captisol(Cydex pharmaceuticals)、1％DMSO中。所有药物都用PBS 1X稀释。将西妥昔单抗溶于0.9％NaCl(Aguettant,Lyon,France)中。曲妥珠单抗在0.9％NaCl(75mg/mL)中制备。在研究的整个持续时间内，储备溶液保持在+4℃。对小鼠施用的每一天，储备溶液用0.9％NaCl稀释。多西他赛在12％乙醇和
0.9％NaCl中制备。
(Selleckchem)溶于0.5％羧甲基纤维素钠、15％captisol(Cydex pharmaceuticals)、1％DMSO中。所有药物都用PBS 1X稀释。将西妥昔单抗溶于0.9％NaCl(Aguettant,Lyon,France)中。曲妥珠单抗在0.9％NaCl(75mg/mL)中制备。在研究的整个持续时间内，储备溶液保持在+4℃。对小鼠施用的每一天，储备溶液用0.9％NaCl稀释。多西他赛在12％乙醇和
0.9％NaCl中制备。
[0497] 结果
[0498] 个人标签的确定：
[0499] 本发明旨在为临床医生提供患者个人分子标签，其允许确定实体癌的最佳治疗。这里阐述了包括脑胶质母细胞瘤(GBM)、结肠癌(CC)和前列腺癌(PC)的三种代表性实体肿瘤的概念验证。经过不同轮归一化后获得个人标签，其比较靶基因在活检组织中与如上所述的不同参考样本中的表达。最终标签显示由于每个靶标的不同比较而产生的药物功效预测排序。如图1中关于GBM活检所示，通过将数据相对于脑(中间相对表达1)、星形胶质细胞(中间相对表达2)、少突胶质细胞(中间相对表达3)和低级别星形细胞瘤(中间相关表达4)归一化时获得的值(2-ΔΔCt)相加来获得得分。然后将所得值转换为任意单位，设置最高得分为1000分。数据最终以雷达模式表示，其显示归一化得分的对数值(图1)。
[0500] 最佳治疗靶标被认为是归一化后显示最高得分的靶标。然后可以从该列表中提取受限标签。该受限列表仅由保留可用药物的靶基因限定。在这种情况下，得分最高的靶基因被设定为1000分，然后以雷达模式表示数据，其显示最佳可用治疗工具/药物得分的对数值(图2)。
[0501] 如图3中关于21例GBM患者所示，所有标签都彼此不相同。在一些情况下，所述标签在得分最高的基因方面有相似之处，但总是存在具有特定得分的基因，与所有其他患者不同(图3A、图3B)。
[0502] 对15例CC患者进行了类似的研究(图4)。在这种情况下，从患者源异种移植活检收集RNA样本。对于该肿瘤类型，通过将数据相对于正常结肠(中间相对表达1)、人上皮结肠细胞(中间相对表达2)、微血管结肠细胞(中间相对表达3)和低级别结肠肿瘤(中间相对表达4)归一化时获得的值(2-ΔΔCt)相加来获得得分。图4示出不同的标签。虽然表现出较小的变异性，但每个标签再次显示出每个靶基因的高度特异性和个别表达水平，产生每个患者特异性的个体标签。因此，我们对9例PC患者进行了分析(4例活检和5例患者源异种移植活检)。对于该肿瘤类型，通过当将数据相对于正常前列腺(中间相对表达1)、上皮细胞(中间相对表达2)、前列腺微血管内皮细胞(中间相对表达3)、前列腺成纤维细胞(中间相对表达
4)和低级别前列腺癌(中间相对表达5)归一化时获得的值(2-ΔΔCt)相加来获得得分。此外，每个患者都展示了最终共有一些靶基因的共同特性的个人标签(图5)。
4)和低级别前列腺癌(中间相对表达5)归一化时获得的值(2-ΔΔCt)相加来获得得分。此外，每个患者都展示了最终共有一些靶基因的共同特性的个人标签(图5)。
[0503] 归一化过程的验证：
[0504] 使用在本实施例中包括4-5个步骤(对于GBM和CC是4个步骤，对于PC是5个步骤)的归一化过程来获得个人标签。每个步骤对应于靶基因的表达水平与该基因在如本文所述定义的参考样本中的表达水平的比较。为了验证归一化的不同步骤的重要性，通过一步归一化(与参考A、B、C或D进行比较)或两个步骤的组合(与AD、AC、BC、BD、CD进行比较)或三个步骤的组合(与参考ABC、ABD、ADC、BCD进行比较)或全部4步归一化(ABCD)获得的标签呈现于图6至图14中。在PC的情况下，该过程包括5个归一化步骤，其需要更多组合(A、B、C、D、E)或(AB、AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE)或(ABC、ABD、ABE、BCD、BCE、CDE)或(ABCD、ABCE、ABDE、ACDE、BCDE)或(ABCDE)。引人注目的是，中间标签(具有1、2、3、4或5个归一化步骤)的总体分析揭示了最终标签(包括所有轮归一化)不同于所有中间(部分)标签(对于PC，仅具有1、2或3轮归一化或者1、2、3和4轮归一化)。在所有情况下，重要的是要注意最终标签总是不同于用原始数据获得的标签，即未经归一化的基因表达水平。相反，在第一轮归一化之后，无论使用什么参考样本，标签都改变。在整个过程中都可以看到这种演变，其中靶基因作为参考样本和/或归一化轮数的函数而出现高或低表达。在大多数情况下，从第3轮归一化获得的标签与最终标签类似，但它们总是保留一些特定的变化，从而表明每个步骤和每个参考样本对于得到具有药物功效预测值的最终标签的重要性。这里呈现3例GBM(图6-8)、3例CC(图
9-11)和3例PC(图12-14)的详细和系统分析，但适用于所有处理样本。
9-11)和3例PC(图12-14)的详细和系统分析，但适用于所有处理样本。
[0505] 排序的预测值的验证
[0506] 归一化过程允许根据靶基因的表达水平与各种参考样本进行比较而对其进行排序。每个靶标所获得的排序是从这一点反映了肿瘤中激活的信号通路的层级。因此，当考虑到最高排序对应于肿瘤生长期间最重要的信号通路时，这种层级限定了选择最佳治疗选项的一个客观标准。
[0507] 激发结肠癌患者CR-IC-028M中的标签：
[0508] 为了进一步验证排序的该预测值，我们在群组中选择了第二患者源活检组织，其也对西妥昔单抗无应答。在该测定中，从在裸鼠中生长的患者源异种移植物重新确定标签以扩增肿瘤样本并产生移植有所述肿瘤样本的小鼠以进行功能测定(40只小鼠)。在样本的RNA提取和质量控制之后，对于满足上述标准的基因集合确定标签。先前的结果表明，这种CC模型对护理标准物西妥昔单抗(靶向EGFR)耐药。事实上，如图15所示，在归一化过程之后，EGFR排序仅为潜在治疗靶标的7/9。然而，我们发现CMET、VEGFR1和VEGFR2是得分最高的靶标。我们决定使用单一药物(西地尼布)阻断VEGFR1和VEGFR2。我们决定通过用西地尼布(抑制VEGFR1和VEGFR2分别排序为2/9和3/9)治疗带有CC肿瘤的动物与西妥昔单抗治疗动物(排序为7/9并且预计应答很小或无应答)相比来激发获得的标签。因此，我们还用曲妥珠单抗阻断HER2(一种具有中间排序的靶基因)来治疗动物。正如所预期，西妥昔单抗治疗对肿瘤生长没有影响。类似地，曲妥珠单抗在阻断肿瘤发展方面无效。然而，西地尼布在该模型中表现出非常显著的抗肿瘤活性。它降低了肿瘤体积(-50％，p＝0.01，在方案终点的T检验)和肿瘤生长进展(P<0.0001)。该实验证实，本发明的方法允许在一系列可用药物中选择最佳治疗选项。
[0509] 激发胶质母细胞瘤患者HB21的标签
[0510] 在该测定中，对于一名诊断为GBM的74岁患者确定标签。在样本的RNA提取和质量控制之后，对于满足上述标准的基因集合确定标签。活检组织的第二部分被用于移植40只小鼠以复制患者的肿瘤来进行功能性生长测定(植入脑中的原位肿瘤)。如图16所示，我们发现MMP9和VEGFR2表现出最高排序。我们决定用护理标准物(替莫唑胺，一种将甲基递送至DNA的嘌呤碱基的烷基化剂前药)处理来产生4组荷瘤小鼠(原位移植纹状体中的肿瘤细胞)，一组接受MMP9抑制剂(SB-3CT)，一组接受VEGFR2抑制剂并且一组接受EGFR抑制剂(厄洛替尼，EGFR的选择性抑制剂)。结果表明，抑制MMP9或VEGFR2可诱导肿瘤生长抑制，这与用护理标准物获得的肿瘤生长抑制相同(图16)。这证实了归一化过程能够鉴定对于肿瘤生长而言重要的靶基因，并且阻断这些靶标能够减少肿瘤生长。引入注目的是，尽管没有显著差异，但用EGFR抑制剂获得了更差的抗肿瘤作用(与所有其它药物相比为-60％功效)，所述靶标具有比MMP9和VEGFR2更低的排序。因此，该功能测定证实，靶向归一化后排序最高者产生显著的抗肿瘤作用。因为替莫唑胺并非靶向治疗，所以不可能将其靶标整合在标签中来计算相应的得分并将它与其它靶标进行比较。
[0511] 激发前列腺癌中的标签
[0512] 为了验证在前列腺癌中的排序预测值，我们在群组中选择了患者源活检组织，其对当前的护理标准物多西他赛有应答。
[0513] 在该测定中，从在裸鼠中生长的患者源异种移植物重新确定标签以扩增肿瘤样本并产生移植有所述肿瘤样本的小鼠以进行功能测定。在样本的RNA提取和质量控制之后，对于满足上述标准的基因集合确定标签。我们发现VEGFR2是排序最高的靶标。我们决定通过用西地尼布(抑制VEGFR2排序为1/9)治疗带有PC肿瘤的动物与多西他赛治疗动物相比(非靶向治疗作为护理标准并且已知其对该PDX模型有效)来激发所获得的标签。因此，我们还用厄洛替尼阻断排序较低的靶基因EGFR(排序为4/9)来治疗动物。正如所预期，通过用多西他赛治疗可抑制肿瘤生长。厄洛替尼在阻断肿瘤发展方面无效。然而，西地尼布在该模型中表现出非常显著的抗肿瘤活性。它降低了肿瘤体积(-78％，p＝0.002，方案终点的T检验)和肿瘤生长进展(P<0.0001)。该实验证实，本发明的方法允许在前列腺癌的一系列可用药物中选择最佳治疗选项。(图17)。
[0514] 本发明人进一步证实，可以在不改变先前存在基因的相对排序的情况下扩展代表治疗上可靶向信号通路的基因列表。
[0515] 从如上所述的脑肿瘤样本获得包含22种基因的标签。然后通过添加8种和14种新基因来扩大基因列表。如图18所示，在添加这些新基因之前存在的基因的相对层级没有改变，即新基因被插入排序中而不改变先前存在基因的相对位置。
[0516] 这个结果表明，可以容易地扩展代表治疗上可靶向信号通路的基因列表，以便添加治疗靶标和/或信号通路。
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