微流体系统
阅读：236发布：2020-05-11
专利汇可以提供微流体系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 微 流体 系统 ，微流体系统包括：包含多个两种不混溶流体的元件的微通道，该微通道包括包含 磁性 粒子(M)的液滴(30)；和用于在所述微通道内产生 磁场 的装置，所述装置包含可激活的磁性元件，所述可激活的磁性元件包含尖端(5,6)，所述微流体系统配置成通过流或者通过压 力 差来传送所述液滴。，下面是微流体系统专利的具体信息内容。
1.一种微流体系统(1)，包括：
●微通道(2)，所述微通道(2)包含在周围的不混溶的第二流体中的第一流体的一系列液滴，至少一个所述液滴(30)含有磁性粒子(M)，所述微通道具有小于1mm2的截面，或者具有至少一个小于500μm的横截面尺寸，和
●装置(3)，所述装置(3)用于在所述微通道(2)内产生磁场，所述装置包括可激活的磁性元件(5；6)，所述磁性元件是可逆地可磁化的，所述可激活的磁性元件包括尖端(5a；6a)且还包括芯，
所述微流体系统被配置成通过所述第二流体的流或者通过压力差输送所述液滴，所述可激活的磁性元件的激活允许保留所述液滴(30)的磁性粒子，并且，当另一液滴经过时所述可激活的磁性元件的去激活允许将次级液滴释放到所述另一液滴(33)中，所述次级液滴包含先前通过所述可激活的磁性元件所保持的磁性粒子。
2.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，所述芯(5c；6c)是可逆地可磁化的且所述尖端(5a；6a)与所述芯(5c；6c)磁连接。
3.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，所述芯(5c；6c)被导电线圈(12)环绕，所述导电线圈(12)与电流发生器连接。
4.根据权利要求1所述的系统(1)，还包括微流体装置(20)，所述微流体装置(20)配置成在所述微通道(2)内形成所述一系列液滴(30)，所述微通道(2)将磁性粒子(M)并入在所述第一流体的液滴(30)内。
5.根据权利要求1所述的系统(1)，包括多个可激活的磁性元件，所述可激活的磁性元件位于微通道(2)的多个不同的区域上，或者位于所述微流体系统(1)的多个不同的微通道(2)上。
6.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，所述磁性粒子(M)不包括铁磁粒子。
7.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，所述磁性粒子(M)为表面功能化的。
8.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，所述磁性粒子形成磁性粒子的聚集体(35；
35a)。
9.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，所述微通道(2)包含多个含有磁性粒子(M)的液滴(30)。
10.根据权利要求1所述的系统(1)，其中，用于在所述微通道(2)内产生磁场的所述装置被配置成在所述微通道(2)内形成磁场且捕获所述磁性粒子(M)，所述磁场的磁场线与所述微通道(2)的纵向轴线(X)不共线。
11.根据权利要求1所述的系统(1)，包括用于使所述微通道的内部受到超声波影响的声波发生器。
12.一种组件，包括：
●根据权利要求1所述的系统(1)，和
●检测器(60)，所述检测器(60)被配置成测量存在于所述微通道内的包含磁性粒子的所述液滴的至少一个特征，所述液滴包括磁性粒子(M)的聚集体(35)。
13.一种从在微通道(2)内流动的第一流体的第一初级液滴中提取磁性粒子(M)的方法，所述方法使用根据权利要求1所述的系统(1)或者使用根据权利要求12所述的组件，且所述方法包括：
-通过使所述磁性粒子受到由线圈(12)激发的可激活的磁性元件(5；6)所产生的磁场的作用，而在所述可激活的磁性元件(5；6)附近捕获所述磁性粒子，
-使所述第一初级液滴变形，
-将所述第一初级液滴分裂成第一次级液滴(31)和第二次级液滴(32)，所述第一次级液滴(31)包括所述磁性粒子且保持由所述磁场捕获在所述可激活的磁性元件(5；6)附近，以从所述第一初级液滴中提取所述磁性粒子。
14.一种操控磁性粒子的方法，包括：
-根据权利要求13所限定的方法，从在微通道(2)内流动的第一流体的第一初级液滴中提取所述磁性粒子，和
-通过改变由所述可激活的磁性元件(5；6)形成的磁场的强度和/或梯度，来释放所述磁性粒子。
15.一种操控磁性粒子(M)的方法，所述方法使用根据权利要求1所述的系统(1)或者根据权利要求12所述的组件，所述方法包括：
●通过使液滴(30)内所包含的磁性粒子(M)受到磁场的作用而在至少一个可激活的磁性元件(5；6)附近捕获和聚集所述磁性粒子(M)，所述磁场由线圈(12)所激发的可激活的磁性元件产生，
所述磁性粒子(M)为表面功能化的，每一表面功能化的磁性粒子(M)提供用于靶标(38)的至少一个结合位点(39a)，所述靶标(38)存在于包含所述磁性粒子(M)的所述液滴(30)中。
微流体系统
技术领域
背景技术
[0002] 免疫测定法是一种广泛应用在对于疾病生物标志物筛选的临床研究和医疗诊断中的功能强大的技术。该方法的显著的特异性和灵敏度归因于在样本内的大范围材质中的抗体和其靶标之间的分子识别。大多数测定方法是异质的：免疫复合物形成到固体表面上，通常形成到微量滴定板的底部上，并且在检测之前，通过数次洗涤步骤除去未结合的分子。然而，这种安排呈现出多个缺陷，其中，低的捕获面积和表面与体积之比是最主要的，因为它们与免疫测定方法的灵敏度直接相关。
[0003] 作为用于执行生物标志物捕获的固体载体的磁性微粒子的出现能够克服这些问题中的一个问题。微珠显示出具有重要的粘合能力的大的比表面，该粘合能力提供较好的捕获功效。另外，由于磁性微粒子的超顺磁特性，它们易于处理使多个免疫测定法分离和洗涤步骤更快地实施的情况。由于微流体的样式，随着反应时间的增加，大型捕获区域的联接能够实现在几分钟内以良好的灵敏度检测生物标志物的医疗点平台。
[0004] 免疫凝集是最简易且最快速的一步式免疫测定法之一。它在于：在具有至少两个结合位点的靶标存在的情况下，使用功能化的珠形成聚集体[15]。该简易过程被广泛地应用于免疫诊断学，但仍受聚集体形成的缓慢历程所限制。基于微流体的多个策略已经显示出能够缩短反应时间且提高灵敏度，但是这些过程仍是费力的[16]。
[0005] 目前，在微流体中所进行的大多数珠式ELISA以连续流的形式实施，但是由于处理和抽吸原因导致液体体积不能小于几微升。对于某个临床诊断应用而言，需要减小免疫测定法的体积，在该临床诊断应用中，该体积样本确实可以少量地存在，例如新生儿的血液样本。另外，对于一些应用而言，减小样本体积或试剂体积是重要的，在这些应用中，大量标准或材料或样本需要被筛选，如药物筛选、高通量筛选、组合化学、系统生物学、数字生物学、合成生物学等情况。在大多数国家中已经建立了新生儿疾病的筛选(Clague&Thomas，2002)[5]，但对这些样本的子微升反应会有机会从采集的相同样本体积进行多个分析。液滴微流体能够处理小的自封闭体积。然而，多步骤反应不易于利用常见的液滴控制(例如，合并和分裂)来执行，这是磁性液滴处理提供简易方式以克服这些难题且在数字微流体平台上执行珠式测定的原因。
[0006] 多个方法已经被用于控制磁性粒子，以在综合系统内进行生物分析。首先，Shikida等人(Shikida等人，2006a)(Shikida等人，2006b)[6]和[7]介绍了在微流体系统中分散在油中的两个水滴之间的珠转移。由于动磁和闸控结构，通过分裂包含粒子的小液滴来进行提取以在提取期间保持该液滴。液滴体积已经从约40微升减小至几微升，以便进行PCR扩增(Tsuchiya等人，2008)[3]。基于该文献，磁性珠控制的多个示例在数字微流体上得以说明。大多数示例为2D平台，2D平台能够被分为两组：一组为利用可移动磁体从放置到表面上的液滴中提取珠(Zhang等人，2010)[8](Long等人，2009)[9]，另一组为基于电润湿装置，其中，使液滴移动靠近固定磁体(Sista等人，2008)[1]。尽管所有的这些系统都能够执行多个步骤分析测定，但是它们并不是简单且易于操作的，主要是由于液滴形成和定位到表面上和/或要实现的磁体移动。Lehmann等人(Lehmann等人，2006)[10]记录了一种平台，该平台将线圈阵列集成在PCB衬底上，该PCB衬底与疏水性/亲水性表面图案结构联接以分裂液滴。尽管该集成，但是系统复杂性高度地增大且液滴体积和珠数量仍在微升和几百微克的范围内。
[0007] 两相微流体为形成灵活且高通量的分析系统提供了独特能力。将液滴微流体与磁性粒子相结合的平台提供了非均相分析测定的优势，同时能够在不存在小份的分散、混合和合并的情况下进行复杂的操作，例如芯片上输送。基于该策略的关注的应用被提出，尤其对2D载体使用电湿润[1]，但它们是相对低通量的，且电湿润增加了限制生物测定性能的难以区别的污染问题。
[0008] 因此，本发明的一个目的在于克服上述限制。特别地，在本发明的一个方面，本发明涉及基于微毛细管或微通道的具有集成的磁性钳的平台，该平台能够快速且稳健地实施液滴内的复杂的珠式生物测定。因此，该方法能够使我们可靠地分离、运输、混合和合并液滴，同时提供实施生物测定所必需的高通量分析和复用能力。
[0009] 另外，例如在Gu等人(Anal chem，2011，dx.doi.org/10.1021/ac201678g)中所公开的方法在未将超顺磁粒子与铁磁粒子结合的情况下，不可以提供超顺磁粒子的分裂。
[0010] 然而，铁磁粒子在被磁化后不易分离，因此现有技术的这种方法不允许再悬浮、且强烈地限制了方案步骤的数目。亚铁磁粒子、或反铁磁粒子也可能具有这些缺陷。
[0011] 此外，现有的液滴系统不可以提供执行洗涤步骤和洗脱步骤的可能性。
[0012] 在其它已知的方法中[12]，通过水力动力法分裂液滴，磁体被用于优先移动一个子液滴中的磁性粒子。然而，在该情况下，包含粒子的液滴和其它液滴具有类似的尺寸，因此分离能力较差。
[0013] 本发明的另一目的在于增大聚集体形成动力学、减小体积、和提供完全自动化的且低成本的用于免疫凝集的平台。
[0014] 本发明的一个目的在于提供一种用于通过改进的提取过程来实施化学的、生物的、物理的或生化的过程、分析或反应的方法。
[0015] 本发明的一个目的在于提供用于实施化学的、生物的、物理的或生化的过程、分析或反应的改进的方法，其中，超顺磁粒子被包含在容纳在微通道中的液滴中。
[0016] 本发明的一个目的在于提供一种允许阻止包含在液滴内的磁性粒子成为包含最小体积的流体的二级液滴的系统，而不阻止液滴的剩余物。
[0018] 本发明的一个目的在于提供用于在微流体装置中实施可选地包括多个步骤的各种类型的分析测定的系统，其中，液滴通过流动或通过压力差被运输。
发明内容
[0019] 根据本发明的第一方面，本发明涉及一种微流体系统，所述微流体系统包括：
[0020] ●微通道，该微通道尤其包括纵向轴线，和
[0022] “可激活的磁性元件”指能够被可逆地磁化的材料，从而该材料能够在其周围引起磁场。通常，能被直接激活的磁性元件为电磁体的芯。
[0023] 根据本发明的可激活的磁性元件可被间接地激活。可激活的磁性元件的示例为软磁性元件的元件，其包括在机械装置中，在机械装置中，永久磁体能够通过机械部件可逆地靠近所述软磁性元件的一部分，其中，围绕轴线转动的永久磁体能够被转动以使其磁极与芯的一侧接触(在这种情况下，芯被激活)，或者被转动以不再与这种芯接触，在这种情况下，芯未被激活。
[0024] 在优选的实施方式中，可激活的磁性元件包括尖端。
[0025] 在优选的实施方式中，可激活的磁性元件包括芯和尖端。
[0027] 在优选的实施方式中，尖端是磁性元件的组成部分。在其它优选的实施方式中，尖端可由可磁化的材料构成，与磁性元件的芯磁连接，使得在所述芯中形成的磁场线传送到所述尖端中。
[0028] 尖端是指固体材料的末端，该固体材料的末端具有凸形且具有沿着尖端的轴线减小的截面。
[0029] 所述尖端可具有横贯于纵向轴线测量的截面，该截面沿着该纵向轴线减小。
[0030] 该减小的截面可在所述尖端内形成磁场线的聚合，从而可增大磁场在尖端处的绝对值，同时仅仅将磁场集中于小体积上。
[0032] 可间接激活的元件的另一示例为软磁材料件，其尖端面对另一可直接激活的或可间接激活的磁性元件的磁极中的一个磁极。在另一优选的实施方式中，所述磁性元件包括可被可逆磁化的芯和与该芯磁联接的尖端。
[0033] 例如，在优选的实施方式中，所述芯可被导电线圈环绕，该导电线圈与电流发生器连接。
[0034] 在一些优选的实施方式中，尤其用于实现复杂方案的实施方式中，本发明的微流体系统可包括所述可激活的磁性元件中的一些磁性元件，其定位在微通道的多个不同区域上或者定位在微流体系统的多个不同的微通道上。
[0035] 在特别优选的实施方式中，微流体系统至少包括一对可激活的磁性元件，该一对可激活的磁性元件跨过微通道彼此相对。
[0036] 在另一优选的实施方式中，该对彼此相对的磁性元件可包括可直接激活的磁性元件和第二可间接激活的磁性元件，该第二可间接激活的磁性元件“从动于”该可直接激活的磁性元件。
[0037] 这意味着第二磁性元件为可磁化材料，该第二磁性元件的尖端面对跨过微通道的第一磁性元件的尖端且仅仅通过感应磁化而从所述第一磁性元件获取其磁化。
[0038] 该配置的优势在于一对磁性元件，而不存在例如具有两个线圈的成本。
[0039] 在根据本发明的另一优选的实施方式中，系统可包括多个可激活的磁性元件，该多个可激活的磁性元件定位在同一微通道的长度上的不同位置处。
[0040] 由于这点，磁场线可被更好地定位，且磁场梯度可更强。
[0041] 沿着同一微流体通道的长度引入多个可激活的磁性元件，可允许实施液滴之间的复杂操作。
[0042] 特别地，可提供利用第一对可激活的磁性元件将磁性粒子转移到一个液滴内的机会，在液滴仍移动期间等待培养、且使用第二对可激活的磁性元件提取被培养的磁性粒子。因此，这些粒子可以根据需要被培养、洗涤多次。
[0043] 还可使液滴运动的方向反向以使液滴回到同一对的可激活的磁性元件。
[0044] 有利地，本发明可提供这样的方法，在该方法中，液滴运动与粒子处理完全分开。
[0045] 根据另一优选的实施方式，同一微通道或多个微通道可被定位在单个磁性元件的前方、或者定位在一对磁性元件中的两个元件之间。
[0046] 这可使得微通道内或者微通道阵列内具有多个活性区，具有仅一个可激活的磁性结构的成本和复杂性。实施这的一种方式是使用一个或两个刀片状的磁性元件，并且微流体系统包括多个微通道或者一弯曲的微通道，或者可替选地多个管或者单个管，该单个管折叠成线圈以多次在尖端附近经过。
[0047] 有利地，根据本发明的系统包括微流体装置，该微流体装置配置成在微通道内形成一系列的至少两种不混溶流体的多个元件。
[0048] 通常，这样的系列可为在周围的不混溶的第二流体中的第一流体的液滴。所述第一流体可为水性的，在这种情况下，所述第二流体为油(氟化的或者非氟化的)或者气体、或者任何与水不混溶的流体。很明显，所述第一流体也可为与水不混溶的流体，且所述第二流体为水性的或者与水不混溶的另一流体，或者第二流体可为与第一流体不混溶的非水性的流体(例如，氢化油和氟化油)、或者任何其它的不混溶流体的组合。
[0049] 在特别有利的实施方式中，所述第一流体为水性的，且所述第二流体为氟化油。
[0050] 为了明确，将被另一不混溶的流体所包围的任何种类的流体团称作“液滴”，不论其形状如何：例如液滴可为漂浮液滴、或者被其容器高度限制的液滴，有时在文献中称作“塞子(plug)”或者“弹丸(slug)”。
[0051] 另外，通过扩展，术语“液滴”在此将包含流体的任何区室化的部分，该任何区室化的部分能够包含磁性粒子并悬浮在流体中，在该流体中，液滴可传输而不发生扩散。例如，液滴包括囊泡或微囊。
[0052] 根据优选的实施方式，用在根据本发明的系统中的磁性粒子为表面功能化的。
[0053] 每个表面功能化的磁性粒子可为靶标提供至少一个结合位点，优选地至少两个结合位点，例如该靶标存在于包含表面功能化的磁性粒子的液滴中。
[0054] 结合位点可包含选自以下列表的要素：抗体；抗原；金属；组氨酸标签；疏水基团；氢结合基团；蛋白A；基于核酸且能够特异结合一些核苷酸序列的配位体；聚合电解质；磷脂；化学物质；药物；核酸；核酸和酶的组合，例如用于DNA扩增的混合物；荧光基团；发光基团；染料；纳米粒子；金纳米粒子；量子点；DNA嵌入染料；适体；或者任何类型的被公认能够影响细胞代谢或者胶体对象的特性(尤其它们的光学特性)的物种；催化剂；或能够使化合物改性的酶；或者其混合物，结合位点优选地包含抗体，靶标为相关的抗原，反之亦然。
[0055] 靶标可在表面功能化的磁性粒子的结合位点上被捕获。
[0056] 当磁性粒子用在根据本发明的系统中时，可形成聚集体。
[0057] “磁性粒子的聚集体”指多个彼此连接的磁性粒子或者彼此接触的磁性粒子。
[0058] 形成聚集体的磁性粒子可通过连接桥彼此连接，该连接桥具有下列结构：第一磁性粒子的结合位点-靶标-第二磁性粒子的结合位点，所述第二磁性粒子的结合位点与第一磁性粒子的结合位点不同。
[0059] 当施加由可激活的磁性元件形成的磁场时，磁性粒子可形成聚集体。
[0060] 然而在磁性粒子未受到可激活的磁性元件形成的磁场的影响的情况下，磁性粒子也可形成聚集体。
[0061] 事实上，有利地，在不同的磁性粒子之间的连接桥的存在允许使磁性粒子保持聚集体的形状，即使是在不存在可激活的磁性元件形成的磁场的情况下。
[0062] (液滴内磁性粒子的质量)/(包含磁性粒子且可选地包含靶标的液滴的体积)的比值可在0.1mg/mL和10mg/mL之间，和/或(液滴内靶标的质量)/(包含磁性粒子和靶标的液滴的体积)的比值可在10ng/mL和1000ng/mL之间。
[0063] 包含磁性粒子的液滴可为油包水型液滴。
[0064] 在一实施方式中，微通道包含多个含有磁性粒子的液滴。
[0065] 根据本发明的另一方面，本发明涉及一组件，该组件包括：
[0066] ●上文限定的系统，和
[0067] ●检测器，该检测器配置成测量存在于微通道内的包含磁性粒子的液滴的至少一种特征，所述液滴优选地包括磁性粒子的聚集体。
[0068] 检测器可为光学检测器且可被配置成测量液滴的至少一种光学特征，优选地光学透射率。
[0070] 根据另一方面，本发明还涉及一种从在微通道内流动的第一流体的第一初级液滴中提取至少一个磁性体的方法，所述方法优选地使用上文所限定的系统，且该方法包括：
[0071] -通过使磁性体受到由至少一个可激活的磁性元件产生的磁场的作用，而在所述可激活的磁性元件附近捕获磁性体，
[0072] -使所述第一初级液滴变形，
[0073] -使所述第一初级液滴分裂成第一次级液滴和第二次级液滴，所述第一次级液滴包括磁性体且通过磁场而保持捕获在可激活的磁性元件附近以从所述第一初级液滴中提取至少一个磁性体。
[0074] 引起粒子捕获和提取的磁力可为磁场强度和磁场梯度二者的函数。
[0075] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种控制至少一个磁性体的方法，包括：
[0076] -根据上文所限定的方法，从在微通道内流动的第一流体的第一初级液滴中提取磁性体，和
[0077] -通过改变由可激活的磁性元件产生的磁场的强度和/或梯度、尤其通过终止由可激活的磁性元件产生的磁场，来释放磁性体。
[0078] 根据本发明的另一方面，本发明涉及一种控制磁性粒子的方法，所述方法优选地使用如上所述的系统或者组件，所述方法包括：
[0079] ●通过使液滴中包含的磁性粒子受到由线圈激发的至少一个可激活的磁性元件、优选地可激活的微流体元件产生的磁场的作用，而在所述可激活的磁性元件附近，捕获和聚集所述磁性粒子，
[0080] 磁性粒子为表面功能化的，每一表面功能化的磁性粒子提供用于靶标的至少一个结合位点、优选地至少两个结合位点，靶标存在于包含磁性粒子的液滴中。
[0081] 有利地，这种方法增强了聚集体形成动力学、减小了体积且提供了完全自动化且低成本的用于免疫凝集的平台。
[0082] 优选地，在捕获和聚集步骤结束之前、更优选地在该步骤开始之前，靶标可被捕获在表面功能化的磁性粒子的结合位点上。
[0083] 形成聚集体的磁性粒子可通过具有下列结构的连接桥彼此连接：第一磁性粒子的结合位点-靶标-第二磁性粒子的结合位点，所述第二磁性粒子的结合位点与第一磁性粒子的结合位点不同。
[0084] (液滴内磁性粒子的质量)/(包含磁性粒子和靶标的液滴的体积)的比值可在0.1mg/mL和10mg/mL之间，和/或(液滴内靶标的质量)/(包含磁性粒子和靶标的液滴的体积)的比值可在10ng/mL和1000ng/mL之间。
[0085] 包含磁性粒子的液滴可为油包水型液滴。液滴在微通道内的流动速率优选地小于1μL/分钟。
[0086] 捕获步骤的时间段可根据样本和粒子的培养所必需的时间而改变。该时间段可在0.1s和1h之间，优选地在1s和30分钟之间，更优选地在10s和10分钟之间。优选地，聚集步骤短于捕获步骤，且与一个液滴面对磁阱的路径有关。聚集步骤可在0.01s和100s之间，优选地在0.1s和10s之间，或者在0.3s和2s之间。所述方法可以还包括通过改变由可激活的磁性元件形成的磁场的强度和/或梯度、尤其通过终止由可激活的磁性元件形成的磁场来释放磁性粒子的聚集体的步骤。
[0087] 在一实施方式中，磁性粒子在释放步骤后仍形成聚集体。
[0088] 在一实施方式中，在释放步骤后，液滴可流动至检测区，在该检测区中，测量液滴的特征，在该测量期间，所述液滴仍包含磁性粒子的聚集体。
[0089] 在该测量期间，形成聚集体的磁性粒子可通过具有下列结构的连接桥彼此连接：第一磁性粒子的结合位点-靶标-第二磁性粒子的结合位点，所述第二磁性粒子的结合位点与第一磁性粒子的结合位点不同。
[0090] 所述特征可为液滴的光学特征，优选地光学透射率。
[0091] 在一实施方式中，当液滴存在于检测区中时，光源照射液滴，在所述检测区中测量来自所述光源的被液滴吸收的光的量。
[0092] 多个包含磁性粒子的液滴可存在于微通道内。
[0093] 在一实施方式中，所述方法还包括通过在导电线圈中引发交流电流而实施的可激活的磁性元件的消磁步骤，其中，该交流电流的强度随着时间减小，所述强度尤其减小为0。
[0094] 沿着微通道的纵向轴线测量的可激活的磁性元件的尖端的厚度小于液滴的长度，优选地以小于1:5的比率、更优选地以小于1:10的比率。
[0095] 微流体系统可被配置成通过流或者压力差来传输液滴。
[0096] 流或者压力差可通过泵或者本领域技术人员已知的任何其它合适的装置来产生。
[0098] 磁性元件
[0099] 尖端形状
[0101] 尤其用在本发明中的另一类型的尖端为刀片状尖端。
[0102] 在该情况下，当然，尖端仅在一个方向上具有尖锐的顶尖角，即在与刀片的边缘垂直的平面内具有尖锐的顶尖角。根据本发明的刀片状尖端优选地具有小于45°的顶尖角。
[0103] 然而，根据本发明的尖端可具有很多不同的形状。
[0104] 例如，尖端的三维形状可具有更复杂的形状，包括椭圆形刀片、圆形刀片等。
[0105] 还出于机械制造或坚固性的原因，根据本发明的尖端在其最末端可以是钝圆的或平的。然而，如上所述，有利的是它们仍具有总体减小的截面。
[0106] 与尖端的最大截面相比，所述平的或钝圆的部分可仅仅表示小区域，通常小于所述最大截面的10％、优选地小于所述最大截面的5％、且更优选地小于所述最大截面的2％。
[0107] 然而，当技术上可行时，有利地，该尖端可不具有钝圆的或平的端部。
[0108] 在一实施方式中，尖端具有横贯微通道的纵向轴线的纵向轴线、尤其与微通道的纵向轴线垂直的纵向轴线。
[0109] 在一实施方式中，当朝向微通道移动时，尖端的截面在其整个长度或者部分长度上减小。
[0110] 尖端尺寸
[0111] 尖端的典型尺寸可根据应用而变化，尤其根据微通道的尺寸而变化。
[0112] 为了简洁和明确，除非另有说明，“尖端的尺寸”指沿着以下平面的尺寸：在该平面中，尖端的会聚角最小。例如，对于刀片状尖端，将在与刀片边缘垂直的平面中考虑尺寸。
[0113] 除非另有说明，否则“尖端的回转半径”也将指在尖端的会聚角最小的平面内的有效的回转半径。
[0114] 由于技术原因，尖端可以不是十分圆的，如上文陈述，尖端可具有小的钝圆部分或者一些不规则部分，因此使用术语“有效的”，且在该情况下，有效的回转半径为具有最紧密地包围尖端的端部的圆形的平滑部分的半径。
[0115] 磁性元件的尖端可具有比得上微通道的尺寸的尺寸。
[0116] 除非另有说明，否则“微通道的尺寸”指微通道的沿着由尖端和微通道之间的最短距离所限定的线的尺寸。明显地，如果微通道是圆柱形的，则其尺寸是其直径。如果微通道具有矩形的截面，则尺寸指微通道的垂直于尖端轴线而计算的厚度。
[0117] 本发明的另一优势在于，磁性元件可被“大线圈”激活，该“大线圈”可距离微通道本身一定距离而设置。因此，与例如Gijs的EP1974821或者scherrer的WO200361470中所描述的现有技术相比，使加热问题最小化，可使用更高的电流，且可形成更强的磁力。因此，本发明的一个目的在于提供一种微流体系统，该系统包括微通道、在所述微通道内形成一系列的至少两种不混溶流体的多个元件的部件、和至少一个可激活的磁性元件，该可激活的磁性元件的尖端面向所述微通道，其中，所述尖端与磁性芯磁连接，其中，所述磁性芯具有明显大于所述通道且明显大于所述尖端的回转半径的截面。
[0118] 所形成的磁场
[0119] 因此，本发明的另一目的在于提供具有至少一个微通道和可激活的磁性元件的微流体系统，该可激活的磁性元件可在所述微通道的一部分中形成磁场，该磁场的强度在10mT和1T之间、优选地在20mT和100mT之间。
[0120] 因此，本发明的另一目的在于提供具有至少一个微通道和可激活的磁性元件的微流体系统，该可激活的磁性元件可在所述微通道的一部分中形成磁场梯度，尤其沿着微通道的纵向轴线的磁场梯度，该磁场梯度在10T/m和10000T/m之间、更优选在100T/m和200T/m之间、更优选在200T/m和500T/m之间、或者500T/m和1000T/m之间。
[0121] 磁场可是连续的或者交变的，尤其是正弦的。
[0122] 微通道
[0124] 然而，与现有技术中的大多数液滴磁性操控装置(其涉及二维的平面阵列)相反，根据本发明的微通道优选地是单维的，例如它们具有宽度、厚度和长度，该长度远大于所述宽度和所述厚度，为所述宽度和所述厚度的至少10倍、通常100倍或者更多倍。
[0125] 除此之外，有利地，微通道是圆柱形的或者平行六面体形的，但是它们也可具有更复杂的形状(包括楔形、凸起形、凹槽形)、其壁上的微结构、或者可对微流体感兴趣的任何特征。
[0126] 然而，作为总的特征，本发明的微通道具有亚毫米截面，即，本发明的微通道在其长度的至少一部分上、尤其是至少在其长度的面向可激活的磁性元件的部分上、尤其在其至少50％的长度上，具有小于1mm2的截面，或者本发明的微通道具有至少一个小于500μm的横截面尺寸。
[0127] 在不同的优选实施方式中，根据本发明的微通道的在其长度的至少一部分上、尤其在至少其长度的面向可激活的磁性元件的部分上、尤其在其至少50％的长度上、尤其在其整个长度上的横截面在100μm2和1000μm2之间、或者在1000μm2和10000μm2之间、或者在0.01mm2和0.1mm2之间。
[0128] 根据本发明的微流体系统包括至少一个微通道且可包括多个微通道。所述微通道可完全是线型的、或者分支形成网。因此，尽管多数是线型的，但是本发明的微通道可包括分支部分，例如侧分支部分或者交叉分支部分。优选地，分支区域沿着微通道位于与面向可激活的磁性元件的区域远离的区域中。
[0129] 微通道内的液滴
[0130] 液滴的尺寸和液滴产生
[0131] 塞子或液滴的尺寸是极其可变的，例如从1皮升(pL)到2L。
[0132] 然而，有利地，本发明可允许得到在现有技术中不容易获得的尺寸范围内的液滴，尤其在10pL和500nL之间、尤其在10pL和100pL之间、在100pL和1nL之间、在1nL和10nL之间、在10nL和100nL之间或在100nL和500nL之间。
[0133] 现有技术中已知多种在微通道内形成一系列至少两种不混溶流体的多个元件的装置。
[0134] 例如，它们可包括流聚焦装置(Anna等人，Applied Physics Letters、82，第384页、2003(DOI10.1063/1.1537519)；T-接头(Zheng等人，Analytical Chermistry，2004，76，4977-4982)或者两相微吸量管(Chabert等人，Analytical Chemistry，2006，78，7722-
307728)、或者其组合。
307728)、或者其组合。
[0135] 由于这一点且与微通道的总体单维性质结合，本发明可允许通过周围流体的简单流或者压力运输以塞子或液滴的形式的大量的样本或试剂。
[0136] 这缓解了对于将微线圈(例如Elsenhans、Gijs等人的现有技术(例如，EP1974821))或者微电极(如在Pamula等人(WO2010/042637)中)集成到微系统的需要。
[0137] 包含在液滴内的磁性粒子
[0138] 磁性粒子优选地是超顺磁的。
[0139] 磁性粒子的尺寸可极其多样化。
[0140] 粒子的尺寸指所述粒子的最大尺寸。
[0141] 在优选的实施方式中，粒子的平均尺寸在0.5μm和5μm之间。
[0142] 除非另有说明，一组粒子的平均尺寸为以D50的粒度统计尺寸。
[0143] 在另一实施方式中，磁性粒子包括第一组粒子和与所述第一组粒子混合的第二组粒子，所述第一组粒子的平均尺寸在1μm和5μm之间，所述第二组粒子具有较大的平均尺寸，优选地在10μm和50μm之间、或者在50μm和100μm之间、或者在100μm和200μm之间、或者在200μm和500μm之间的平均尺寸。
[0144] 关于磁性粒子的质量，其也可在本发明内变化，但是通常有利的是本发明用于操控小质量的粒子。通常，在一个液滴内包含的磁性粒子的质量将在0.5μg和2μg之间、或者在2μg和8μg之间。
[0145] 在一些其它实施方式中，需要高的磁场梯度和至少一个尺寸小于50μm的小的微通道，磁性粒子的质量可在0.01μg和0.1μg之间、或者在0.1μg和0.5μg之间。可替选地，在其它涉及至少一个横向尺寸大于100μm、或者甚至大于300μm的微通道的实施方式中，磁性粒子的质量可在8μg和100μg之间。
[0146] 多种类型的超顺磁粒子被本领域的技术人员所知且可用于本发明。尤其，本发明利用携带配位体的粒子是特别有利的。
[0147] 如本文中所使用的，配位体表示能够与其它物种(尤其被分析物)可逆地或不可逆地连接的物种或官能团。本领域的技术人员已知多个配位体。本发明特别感兴趣的配位体为抗体，例如针对COI的表面抗原的抗体。然而，可使用多种其它配位体，例如金属、组氨酸标签、疏水基团、氢结合基团、蛋白A等。可用于本发明的其它类型的配位体为基于核酸的配位体，且能够与一些核苷酸序列特异性连接。本发明内的配位体，例如聚合电解质、或磷脂，也可由于静电作用而发挥它们的连接作用。
[0148] 配位体还可表示化学物质、药物、核酸、核酸和酶的组合(例如用于DNA扩增的混合物)、抗体、荧光基团、发光基团、染料、纳米粒子、金纳米粒子、量子点、DNA嵌入染料、适体、或者任何类型的被认为能够影响细胞的代谢或根据本发明的胶状对象的特性、尤其是其光学特性的物种。
[0149] 在其它实施方式中，本发明的磁性粒子可支承附接到其表面的能够使化合物改性的表面催化剂、或酶。
[0150] 这样，本发明可被用于以极其小的体积来进行各种类型的反应，尤其ELISA、核酸扩增、测序反应、蛋白消化、或化学反应，尤其催化反应。
[0151] 方法和应用
[0152] 在一些优选的实施方式中，所述多个可激活的元件可同时被激活。
[0153] 但是，在更优选的实施方式中，所述多个可激活的元件中的至少一些可被单独地激活，以拓宽方案的灵活性。
[0154] 尤其，有利地，在包含磁性粒子的一个液滴经过时，将激活可激活的元件以保留所述磁性粒子。
[0155] 相反地，当液滴经过时可激活的磁性元件可被去激活，以使液滴经过而其内容物未变化、或者以将次级液滴释放到所述液滴中，该次级液滴包含先前通过所述可激活的磁性元件所保持的磁性粒子。
[0156] 值得注意的是，所述激活和去激活可手动地、自动地或者根据需求而实施。
[0157] 值得注意的是，所述激活和去激活可与液滴的移位同步进行。在该情况下，在一个或多个可激活的磁性元件附近的液滴的位置可通过不同的装置(例如通过光学装置、通过磁性传感器)或通过阻抗测定来检测。该检测信号然后被发送到自动化系统，例如计算机中的软件。优选地，所述软件能够响应于所述信号来激活磁性元件或去激活磁性元件。在其它实施方式中，与上述技术组合是有利的，所述软件还可控制在微通道内运输液滴的载送流体的运动。
[0158] 在根据本发明的方法中，包含磁性粒子的第一初级液滴可被分裂成第一次级液滴和第二次级液滴，所述第一次级液滴包含大部分所述磁性粒子和在所述第一初级液滴中包含的流体中的小部分流体，所述第二次级液滴包含小部分的所述磁性粒子和在所述第一初级液滴内包含的流体中的大部分流体。
[0159] 优选地，所述第二次级液滴被流运载走，所述第一次级液滴保持面对磁性尖端。
[0160] 优选地，所述第二次级液滴包含所述初级液滴中所包含的磁性粒子中的20％和10％之间、或者10％和5％之间、或者5％和2％之间、或者2％和0.5％之间、或者小于5％的磁性粒子。
[0161] 也优选地，所述第一次级液滴包含最初包含在初级液滴内的流体体积的20％和10％之间、或者10％和5％之间、或者5％和2％之间、或者2％和0.1％之间的流体体积。
[0162] 本发明的另一优势为：由于磁性元件的可激活性质，其还允许将束缚在上述第一次级液滴内的磁性粒子释放到较大体积的第二初级液滴中。
[0163] 因此，本发明的另一目的在于提供一种用于执行化学的、生物的、物理或生物化学的过程、分析或反应的方法，由于再悬浮过程，束缚在第一次级液滴内的磁性粒子被释放到第二初级液滴内，第二初级液滴的体积大于所述第一次级液滴的体积。
[0164] 还优选地，所述第一次级液滴的体积在所述第二初级液滴的体积的50％和20％之间、或者20％和10％之间、或者10％和5％之间、或者5％和2％之间、或者2％和0.1％之间。
[0165] 还有利地，本发明提供了用于有效地将所述磁性粒子混合在所述第二初级液滴内的手段。所述手段可选自：在液滴中简单地使用对流，通过微通道中的弯曲、或者通过微通道中的微结构、或者通过声波或超声波、或者通过流脉动或者压力脉动、或者通过微通道的不均匀直径，来提高该流，这作为非详尽列表。
[0166] 明显地，本发明的具体优势和目的还在于提供用于执行化学的、生物的、物理或生物化学的过程、分析或反应的方法，其中，上述的提取和/或再悬浮的步骤中的几个步骤被组合在同一微流体系统内。
[0167] 在包含本发明的磁性元件的微系统内实施这一点是有利的，该磁性元件面对微流体系统内的多个不同位置。
[0168] 作为另一特殊的实施方式，这种方法可通过使液滴在微通道内来回移动来实施，该微通道面对本发明的一个或多个磁性元件。根据每一尖端内产生的磁场的取向，两个活动尖端的组合可用于捕获和提取珠或者用于引起液滴内的混合。
[0169] 声波，尤其是超声波，可在微通道内传播。这种方法可被用于增强液滴内的混合。然而，必须特别注意系统内的超声波引起的可能的加热效应。
[0170] 在尖端中会观测到剩余磁场的情况下，简单的消磁步骤可通过在线圈中产生交流电流而实施，该交流电流的强度随着时间而减小(至0)。此处为成功使用的一组参数的示例：
[0171] -电流强度：线性衰减3A->0A
[0172] -频率：100Hz
[0173] –成功地使用正弦波信号/方波信号
[0174] -尖端材料：高导磁合金(mu metal)或者AFK502。
[0175] 本发明的方法可为用于检测和/或量化样本内的分析物的方法。
[0176] 对于本领域技术人员清楚的是，根据本发明的方法可用于微反应、免疫反应、酶消化、ELISA、诊断、预后、药物传输、高通量筛选等。
[0179] 另外，本发明的方法可整合成用于诊断、药物发现、靶标发现、药物评估的复杂方案的一部分。
[0180] 当然，本发明的微流体系统和本发明的方法可与本领域中所已知的所有种类的微流体部件或功能相结合、或者包括本领域中所已知的所有种类的微流体部件或功能。
[0181] 此外，由于所使用的样品的小的尺寸，本发明对于细胞测定(尤其是单细胞的筛选)、数字生物学、数字PCR、数字化核算扩增的应用是特别关注的。
[0182] 数字化指对生物对象或化学对象的单份进行的生物操作，与这种对象的整体相对，且其中，对这些单份中的每份的操作的结果可被分离。
[0183] 生物对象或化学对象，指任何分子的、超分子的、晶体的、胶体的、细胞的、亚细胞的对象，作为非详尽列表，包括小细胞、细胞器、病毒、天然的DNA、人工的DNA或改性的DNA、RNA或核酸变种、蛋白质、糖蛋白、磷蛋白、任何被取代的天然的或人工蛋白、脂类、磷脂、有机分子、有机金属分子、大分子、单晶、量子点、纳米粒子、囊泡、微囊等。
[0185] 特别地，本发明可用于与各种光学检测方法组合，尤其光学检测方法，因为通过将磁性粒子保留在第二液滴中，可减小由于这些粒子形成的光线吸收和噪音。
[0188] -图1为根据本发明的微流体装置的局部图解视图；
[0189] -图1A为根据本发明的微流体装置的图解视图；
[0190] -图2图解地示出根据本发明的珠处理方法的不同步骤；
[0191] -图3A和图3B示出说明珠簇提取所需的条件的相图；
[0192] -图4示出根据本发明的方法的示例；
[0193] -图5至图8示出通过根据本发明的方法所获得的结果；
[0194] -图9图解地示出根据本发明的另一珠处理方法的不同步骤；
[0195] -图10示出液滴中磁性珠的凝集的明视场显微图；
[0196] -图11示出磁场强度对图9中所描述的方法的影响；
[0197] -图12至图14和图15至图15F图解地示出可用于根据本发明的方法中的微流体装置的变型的细节；
[0198] -图16A和图16B示出可激活的磁性元件的示例；和
[0199] -图17示出根据本发明的微通道的实施方式。
具体实施方式
[0200] 可仅利用一个与电磁线圈连接的磁性尖端来成功地进行提取。此处给出了描述该尖端几何结构的示意说明(以虚线的线圈嵌入)：
[0201] 在本系统中使用的材料为高导磁合金或AFK502或AFK01(Arcelor金属)。使用自制的圆柱形电磁线圈，其由大约1000匝的绝缘铜线(0.8mm直径)构成。所使用的电流强度从0A到4A。
[0202] 面向第一尖端的第二尖端可被加入，以形成一对可激活的磁性元件。
[0203] 该第二尖端有助于使磁场线聚焦，从而增大微流体通道内的磁场梯度。因此，可以以较小的磁性粒子含量或者以较低的场强度(即，较小的电流)来实施液滴分裂。
[0204] 在另一配置中，第二尖端可与附加的电磁线圈连接。
[0205] 这可被完成以增大场强度，从而更促进液滴分裂和粒子提取。
[0206] 图1示出了微流体系统1，其包括沿着纵向轴线X延伸的微通道2和用于产生磁场以捕获磁性体且实施如图2所示的根据本发明的方法的捕获装置3。
[0207] 装置3包括至少一个可激活的磁性元件5，且在所示的示例中，装置3包括两个可激活的磁性元件5、6。这对元件5、6也被称作“磁性钳”。
[0208] 磁性元件5和磁性元件6彼此相对且沿着轴线Y延伸，该轴线Y横穿轴线X、优选地与轴线X垂直。磁性元件5和磁性元件6分别包括对应的具有与轴线Y垂直的横截面的尖端5a和尖端6a，该横截面朝向另一尖端减小。当尖端5a和尖端6a朝向所示的微通道2移动时，其横截面变小。
[0209] 在所示的示例中，每一尖端具有细长的横截面且各自的在与轴线X垂直的平面内延伸的边缘5b或边缘6b。
[0210] 两个边缘5b、6b可平行于彼此延伸，如图所示，该两个边缘相隔一定的距离，例如该距离不超过微通道在方向Y上的厚度的5倍。
[0211] 边缘5b和边缘6b可接触限定微通道的壁，同时通过这些壁与在微通道内流动的流体分隔开。
[0212] 尖端5a和尖端5b的宽度可大于微通道的宽度，如图所示。
[0213] 尖端5a和尖端6a优选地由软磁材料(例如μ金属)制成，以在激发后不具有剩磁或具有少量剩磁。
[0214] 尖端5a和尖端6a可与相对应的芯5c或芯6c一体制成。
[0215] 激励线圈12绕着芯5c缠绕以产生与轴线Y共线的感应。
[0216] 如图1A所示，线圈12与控制器15连接，该控制器15可包括运行软件的计算机，该软件配置成基于各种输入数据且例如基于光学液滴检测而激发线圈12。
[0217] 摄像机16可监控微通道且向控制器15提供液滴检测信息。当液滴位于磁性元件5附近时，该信息能够使得自动激发线圈12以执行例如图2中所示的方法。
[0218] 本发明的系统还包括微流体装置20，其用于产生微通道2内的液滴。
[0219] 装置20包括例如Chabert等人在[2]中所公开的形成液滴的器件。
[0220] 装置20还能够借助泰勒锥(Taylor cone)现象来产生液滴，如在WO2004/091763中公开的。这两个出版物在此通过引用方式并入本文中。
[0221] 当激发线圈12时，通过尖端5a产生磁场，且该磁场在尖端5a和尖端6a之间的间隙内延伸。磁场在尖端5a和尖端6a之间是强磁场且非常窄，这能够捕获如图2所示的液滴内的磁性珠。
[0222] 所捕获的磁性珠为超顺磁粒子。
[0223] 通过利用降低幅值的交流电流对线圈12通电，控制器15被配置成对可激活的磁性元件5和磁性元件6周期性去磁。
[0224] 在图1所示的示例中，只有可激活的磁性元件5设置有线圈。在未示出的变型中，相对的元件6也设置有激励线圈。
[0225] 线圈12可通过DC或AC电流激发。
[0226] 优选地，如图所示，线圈12与尖端的边缘隔开，例如隔开至少1cm或2cm，这可减少热从线圈朝向微通道的转移。
[0227] 在下文中将详细描述所获得的实验结果。
[0228] 示例
[0229] 示例1：粒子提取
[0230] 利用两种类型的装置来进行实验。装置1由单个软磁合金(AFK502R，Imphy Alloys Arcelor Mittal)制成的磁性尖端构成。由1000圈的铜线制成的电磁线圈(直径33.5mm)被用于控制一个尖端的磁化。该磁性尖端被放置成与特氟隆管(300μm ID和600μm OD，Sigma-Aldrich)垂直。
[0231] 使用自制的圆柱形电磁线圈，其由大约1000匝的绝缘铜线(直径0.8mm)构成。所使用的电流强度从0A到4A。
[0232] 在第二类型的装置(装置2)中，与第一尖端相对的第二尖端可被添加，以形成磁性钳构型(反射对称)。
[0233] 在图2中示出了所实施的方法的不同步骤。
[0234] 使用自动吸管机器人系统，在特氟隆管中产生液滴串。
[0235] 在具有3％的表面活性剂(1H,1H,2H,2H-全氟癸基-1-醇，Fluorochem)的氟化油40(FC-40，3M)中形成水滴30。考虑100nL液滴，引入1μg的粒子M(1μm，Dynal MyOne COOH粒子)。
[0236] 系统由通过XYZ位移台而承载的、且与NeMesys注射泵系统(Cetoni)连接的吸取尖端(特氟隆管Sigma)构成，XYZ位移台和NeMesys注射泵系统都由图形化编程软件Labview(美国国家仪器公司(National Instrument))控制。样本被储存在微量滴定板内。在每一孔内，水性的样本被氟化油覆盖。系统顺序地吸取每一孔内的水性的溶液和氟化油，以便按照150nL的间隔产生定制的一连串的80nL的液滴30。在液滴形成期间，包含磁性粒子悬浮物的管至少每5分钟就混合一次，以避免珠沉淀。
[0237] 液滴串的通常速率为1mm/s。在整个实验期间，油流动速率保持恒定。
[0238] 当经过磁性钳5、6时，电磁体中的电流强度对于装置2从0A切换至1.5A、对于装置1从0A切换至2A。所形成的磁场产生朝向激活的尖端的吸力。产生磁性珠簇35。当液滴30在磁性钳之间通过时，磁性珠簇35保持不动直到其到达液滴的水/油交界面处。当到达液滴的前沿时，作用在珠簇上的磁性拉力被转移到水/油交界面上，从而使液滴变形。高于一定阈值时，磁力克服了毛细作用力且使包含粒子的液滴31从母体液滴中分离出来。母体液滴32被油流拖走，而所提取的液滴31保留在诱捕器中。很明显，如果所得到的液滴的尺寸(其主要由粒子簇的体积来决定)小于内部的毛细管尺寸，则满足该条件。在本实验中，被提取的液滴的体积为1nL。
[0239] 簇液滴31可保持限制在磁性钳5、6内，直到新的塞33自发地接触和合并。
[0240] 在图2中图解地示出了这些不同步骤。
[0241] 在合并后，根据待实施的操作，磁场可：
[0242] a)维持有效，以当液滴通过时保持粒子诱捕在该诱捕器内；
[0243] b)释放，以使粒子再悬浮在新的液滴34中。在该情况下，由液滴运动而产生的再循环流导致内部的水动力再循环流，这促进了样本和粒子的混合。
[0244] 该策略提供了对于次微升样本体积中的生物测定所需的全部基本功能，即粒子洗涤、提取和培养。受约束的液滴的操控是有利的，由于液滴具有小的体积、容易空间处理和时间处理，且引起促进样本混合的内部水力再循环流。与较早的操作相比较，碳氟化合物毛细管中的氟化油的使用避免了与水塞和表面之间的接触相关的污染。使用电磁致动的钳，利用极短的响应时间，包含磁性粒子的液滴可单独地被控制。例如与文献[3、4]中的记载相比，该新的方法允许更好的提取效率和更小的样本体积，并且，当与自动化的液滴形成平台[2]组合时(该平台允许形成包含任意地选自微量滴定板的任意数量的液滴的“串”的形成)，该新的方法允许容易且灵活地实施复杂的方案。
[0245] 在下文中将给出关于根据本发明的方法的多个细节。
[0246] 捕获特征
[0247] 用于从液滴中提取磁性粒子簇的磁力Fm与磁场梯度有关：
[0248]
[0250] 将第二尖端添加到管的另一侧能够集中磁场线。因此，在管内可实现梯度场的更高的局部值，即使第二尖端未被线圈磁化。
[0251] 当磁性珠被尖端吸引时，磁性珠对液滴侧产生压力，从而导致表面变形。珠的提取源自磁力和毛细作用力之间的平衡。Fm需要足够强以克服由液滴表面变形而形成的毛细作用力(图2)，以打破表面。毛细作用力Fc与水和油之间的估计为10mN.m-1的表面张力γ(Dorfman等人，2005)[13]、以及珠簇的尺寸有关。通过以下公式给出毛细作用力(Shikida等人，2006)。
[0252]
[0253] 珠簇提取所需的条件
[0254] 对于约300μm/s(其对应于0.02μL/s的流速)的液滴速率，研究了磁性线圈中的电流强度和粒子负荷对珠簇提取的相对影响。在图3A中示出了结果。
[0255] 对于0.8μg/液滴的粒子负荷，研究了磁性线圈中的电流强度和液滴速率对珠簇提取的相对影响。在图3B中示出了结果。
[0256] 观察到液滴速度对捕获磁性珠的能力的影响小。
[0257] 当液滴移动过快时，缩减了形成靠近尖端的珠簇的时间。
[0258] 在一些情况下，所形成的珠簇不包含全部量的珠。由于提取珠所必需的磁性力不能够克服毛细作用力，故这可具有一些后果，从捕获效率的下降(一些珠保留在液滴内)到提取的损失。对于高通量应用，流与系统的测量能力直接相关。因此，必须将磁场调成确保所有的珠被提取。
[0259] 合并和混合
[0260] 一旦珠被提取，所形成的小液滴由磁性粒子和剩余液体构成。通过测量该液滴的尺寸且已知簇内的珠量，对于包含0.8μg珠的初始80nL液滴，剩余液体的体积被估计为1nL。
[0261] 当小簇与另一液滴接触时，总是发生合并。
[0262] 事实上，当表面之间的油膜足够薄且珠悬浮在液滴内而不形成聚集体时，两个液滴合并。磁性粒子分散在液体中，对于剩余液体，产生80倍稀释因子。因此，对于免疫测定法所需的洗涤步骤可仅仅通过连续地合并和捕获缓冲液滴内的珠来实施，其耗时小于1s。
[0263] 当粒子从簇悬浮到移动的液滴中时，粒子被挤压在液滴端的三角形的区域中。然而，由于塞在管内移动而不湿润壁，在油内产生再循环流，从而在液滴内也产生再循环流，故珠混合是高效的(Song等人，2003)[14]。以这种方式，珠被沿着那些流向线拖动，这引起整个液体中的有效混合(图2)。
[0264] 珠捕获效率
[0265] 在上文中已经讨论了珠提取的驱动力和条件。在此，关注本发明系统的捕获效率。为了量化珠，通过利用生物素atto550浸透抗生蛋白链菌素包覆的珠，来制备荧光磁性粒子。图8示出了在捕获和释放过程后每一塞的荧光图。
[0266] 由于磁性珠挤压在末端液滴处以及由于在管后面进行荧光观测，强度级别在该区域中部达到了恒定最大值。由于MP量与该区域的尺寸比与最大荧光强度更为相关，故在液滴长度上总计荧光性。以这种方式，能够辨别包含在每一液滴内的珠的量。但是总计的荧光与MP数量之间的关系不直接成比例，这是初始液滴荧光和最终液滴荧光之间的比率并不是不变的原因。由于MP挤压导致珠的真实数量的低估，来自初始液滴和空的液滴的荧光信号的比较给出高于99％的捕获效率，其实际上低于真实值。剩余的磁性粒子似乎困在液滴末端处的弯液面处。然而，该捕获效率值高得足以计划以多个步骤实施方式使用该系统，例如夹心免疫测定法，而不损失生物材料。
[0267] 示例2：液滴内的免疫测定
[0268] 如先前所述(示例1)，对于免疫测定法所需的基本操作单元可使用液滴平台实施：珠限制、珠洗涤、在给定液滴内的珠释放和混合、以及连续的荧光监控。
[0269] 在本示例中形成的免疫测定法为夹心免疫测定，其中，捕获抗体嫁接在磁性粒子(从微粒子至纳米粒子)上。第二抗体(检测抗体)可被荧光标记(FITC,Alexa…)或者与酶结合(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)。免疫测定法基于通过嫁接在珠上的捕获抗体来捕获感兴趣的分析物，同时使用靶向不同表位的次级抗体来进行检测。分析物量化基于可检测到的次级抗体的量。使用本文中研发的磁性液滴平台，能够利用样本培养珠、执行洗涤步骤、利用次级抗体培养珠、洗涤珠、执行检测或者利用将转变成荧光产物的酶底物培养珠。
[0270] 实验性
[0271] 现在给出一些更具体的方案细节。
[0272] 形成液滴免疫测定法以量化100nL子血清样本中的促甲状腺激素(TSH)，TSH作为用于先天性甲状腺功能低下症的新生儿诊断的生物标志物。磁性珠和所有的免疫测定试剂都来自Immunometrics TSH试剂盒，除了MUP来自Sigma。捕获抗体和检测抗体为靶向不同TSH表位的单克隆抗体。
[0273] 如下进行液滴免疫测定法：
[0274] -生成8个液滴的串(每一液滴100nl)，其包含对于实施如图4所示的TSH量化所需的全部试剂。小体积的液滴使用自动化的注射器[2]生成，然后通过全氟-烷氧基毛细管(300μm ID，Sigma)内的全氟油运输。通过注射泵(Nemesys，Cetoni)确保液滴驱动。
[0276] -在培养时间5分钟后，固定在磁性珠M上的免疫复合物(捕获抗体/TSH)50被磁性钳5、6磁性诱捕。
[0277] -因此，通过使TBS(Tris缓冲盐水：50mM Tris·HCl，pH7.4和150mM NaCl)液滴流过珠簇35来洗涤珠，以避免蛋白在免疫载体上的非特异性吸附。
[0278] -使用第二组磁性钳7、8，这些珠被磁性限定且释放在包含次级抗体的液滴内，该次级抗体与碱性磷酸酶结合(培养时间5分钟)。
[0279] -最后，在利用3个TBS液滴进行第二洗涤步骤以除去未结合的次级抗体后，使用第三组磁性钳7a、8a以将粒子释放在酶底物(4-甲基伞形酮磷酸酯)液滴中以进行检测。
[0280] 通过使用一组微加工的尖端(AFK502，Imphy Alloys)将磁性粒子从一个液滴转移到下一液滴内，始终沿着液滴串来操控磁性粒子，其中，该尖端的顶点曲率半径小于50μm且根据需求利用自制的线圈进行磁化。
[0281] 检测原理
[0283] 例如，在本示例中，标记有PA的抗体与MUP一起用作底物。重点注意，为了使用PA，所有使用的缓冲剂应不包含磷酸盐，以避免磷酸盐与底物竞争。使用如先前所述的TBS缓冲液。使用具有高灵敏度的摄像机和二色性装置的落射荧光显微镜来监控荧光信号。所使用的滤波器为“DAPI(二脒基苯基吲哚)”滤波器(λexc＝358nm和λem＝461nm)。从落射荧光显微镜物镜实时直接地测量在芯片中所观测到的荧光，该荧光表示4-甲基伞形酮的产生。
[0284] 量化的原理
[0285] 存在两种主要的不同样式以监控ELISA反应：终点ELISA和动态ELISA。动态ELISA与终点ELISA不同，这是因为动态ELISA基于酶底物反应动力学。事实上，当底物过量存在时，酶浓度和底物转换的速率之间呈线性关系。这两种ELISA样式都可使用这样的平台进行。
[0286] 本示例记录了通过动态ELISA对液滴内的TSH量化。图6记录了液滴内的荧光信号随着不同的初始TSH浓度的时间变化。如从酶反应预计到，对于给定的时间段，荧光信号随着时间线性地增加，而在后期，荧光产物的浓度达到稳定时期，而反应曲线的斜率随着TSH浓度而增大。
[0287] 通过绘制初始的酶速率对TSH浓度得到免疫测定校准曲线(图5)。背景信号的三标准偏差(three standard deviation)所限定的检测限度为等于1.8pM(Planells1975)的2mIU/L，1.8pM与常规的比色的动态ELISA(2.3mIU/L)相当。与常规的ELISA所需的2小时30分钟相比，在不到10分钟完成整个免疫测定。
[0288] 一旦在液滴串上完成第一步骤，由于磁性钳单独受到控制，则能够开始第二分析。以这种方式，免疫测定法输出受到液滴串长度控制。对于100nL子样品，这导致每小时120个分析物的分析通量。
[0289] 结果和讨论
[0290] 该策略被应用于致力于先天性甲状腺功能低下症(CH)的新生儿诊断的免疫测定，先天性甲状腺功能低下症是高发生率疾病(1：2000到1：4000新生儿)。早期治疗的婴儿的预后是极好的，而未治疗的CH导致严重的发展问题。
[0291] CH的临床诊断主要基于促甲状腺激素的升高浓度(TSH>30mIU/L血清)。使用该微流体平台，在10分钟内以100nL子体积的样本完成整个免疫测定(与常规ELISA的2小时30分钟和200μL比较)，这些是对于新生儿诊断的必需标准。在图4中给出了夹心ELISA的分析次序。通过连续地监控根据底物培养时间的荧光性的增加而执行量化。
[0292] 因此，通过与酶初始速率相对应的反应曲线的斜率来确定TSH浓度(图6)。限定为背景信号的三标准偏差的检测限度为等于1.8pM(图5)的2mIU/L，1.8pM与常规的比色的ELISA相当，且满足了先天性甲状腺功能低下症诊断的标准。
[0293] 图7示出了微流体液滴的结果实现了对于TSH检测所需的标准灵敏度(标准阈值30mIU/L，血清中)。结果(标准化的)与常规的比色的批处理分析相比较。误差条涉及三次测量结果。
[0294] 更一般地，在皮摩尔范围内的灵敏度为生物基质内该浓度范围中存在的疾病生物标志物的大量分析铺平道路。目前对复用的调查表明，一旦启用，该平台允许连续的液滴串的产生以及大于120分析/小时的最大分析速率相关的分析，且对于高通量策略的研发是非常诱人的。
[0295] 结论
[0296] 成功地开发了基于受约束的液滴和磁性粒子处理的灵活的免疫测定平台。本发明工作适于先天性甲状腺功能低下症诊断，但也可扩展至几乎任何免疫测定。本发明的结果显示，与批处理方案相比的类似的灵敏度性能，同时提供了1000倍的体积减小和总分析时间从2小时30分缩短至10分钟。该方法为自动的且高通量的筛选少量样本上的生物标志物铺平了道路。
[0297] 示例3：基于磁性珠的在受约束的液滴内的免疫凝集测定
[0298] 如图9所示，在油包水型液滴30内实施凝集步骤，且该步骤由磁约束产生以增强磁性珠(MB)M碰撞频率，从而促进聚集体形成[17]。
[0299] 在氟化油内收约束的液滴30[18、19]允许单个区室化，防止交叉污染。此外，在“管线”形式中大量产生液滴的可能性能够以简单芯片设计实现可靠的且高通量的分析。
[0300] 使用抗生蛋白链菌素包覆的MB(1μm)M(表面功能化的磁性粒子)和生物素化的碱性磷酸酶(b-PA)(靶标：38)作为模型实施该测定的第一证明(图9)。如下文所详细描述，磁性粒子M提供了多个结合位点39a。
[0301] 通过顺序地从微量滴定板吸取限定体积的油和样本(分别包含MB M和靶标38)而在特氟隆管内生成液滴30。由MB M的混合物生成(1)液滴30，该混合物首先利用b-PA38培养5分钟然后被运送至特氟隆管内。靶标38因此可在粒子M的结合位点39a上被捕获。包含自由MB的液滴进一步被朝向磁性钳(2)5和6运送。当在磁性钳5和6之间通过时，MB被磁性约束以促进聚集体35形成。
[0302] 一旦经过磁性钳5和6，液滴内的内部再循环流引起促进MB再分散的剪切力。该过程防止非特异性凝集，但保持粒子之间的特异性交互作用，粒子保持聚集的状态且仍形成聚集体35a(图9、图10A和图10B)。从图9可见，聚集的磁性粒子通过桥39彼此连接，该桥39具有以下结构：第一磁性粒子的结合位点39a–靶标38–第二磁性粒子的结合位点39b，所述第二磁性粒子的结合位点与第一磁性粒子的结合位点不同。
[0303] 图10示出了在0(A)和100ng/mL(B)的靶标下的液滴内的MB凝集的明场显微照片。对于空白(S空白)和测定(S测定)实验的集成透射光的变化使用简易可视的廉价USB摄像机60在透射光下监控。信号被定义为(1-S测定/S空白)。C)对于三个不同MB浓度：1mg/mL(红)、2mg/mL(蓝)、3mg/mL(绿)，得到在5分钟培养后用于b-PA靶标的校准曲线。插图集中于0ng/mL-
80ng/mL靶标浓度范围。
80ng/mL靶标浓度范围。
[0304] 组件包括配置成照射液滴的光源61、配置成测量来自光源的被液滴吸收的光的量的光学检测器60。
[0305] 光源61和摄像机60允许微通道的检测区70的内容物可视化。
[0306] 检测在于，测量由凝集过程诱导的通过液滴的总和光吸收的变化。聚集态的珠在与观测方向垂直的液滴内占据较小的面积，从而凝集增大传输信号。
[0307] 当存在于检测区70时，至少10％、优选50％、优选70％、更优选80％的包含在液滴内的磁性粒子可为聚集的形式。
[0308] 图11强调了B的应用强烈地增加了聚集动力学。使用1mg/mL的MB，检测限为大约100pM(图10C)，其符合多数免疫诊断的要求。
[0309] 该基于液滴的平台提供了高通量(每小时300分析物)和低成本的分析。该装配由简单的项目组成，而液滴形式将样本体积减少至80nL。此外，磁性钳的集成允许MB从一个液滴到另一液滴的提取和转移，从而允许测定步骤的完全自动化。
[0310] 在变型中，可激活的磁性元件5或磁性元件6可具有在图12至图14、图15至图15F中所示的几何形状。
[0311] 如图12和图13所示，可激活的磁性元件5包括尖端5a，其宽度w和厚度t沿着尖端5的纵向轴线Y减小。所示的可激活的磁性元件5为凸形。
[0312] 图15所示，磁性元件5可具有平行六面体形状，当其尖端朝向微通道移动时具有减小的截面。尖端5a如所示横贯微通道的轴线X延伸，尤其垂直于微通道的轴线X延伸。
[0313] 在变型中，磁性元件具有立方体形状。
[0314] 图16A还示出可直接激活的磁性元件的实施方式，该磁性元件为电磁体的芯。
[0315] 图16B示出用作可激活的磁性元件的软磁性元件的示例，其中，永久磁体可通过机械部件很靠近所述软磁性元件。
[0316] 永久磁体可被转动以使其磁极与芯的一侧接触，在这种情况下，芯被激活；或者永久磁体被转动以不再与该芯接触，在这种情况下，芯未被激活。
[0317] 图17还示出了微通道的实施方式，其包括分支，例如侧分支101、或者交叉分支102。分支区域沿着微通道被定位在远离面对所示的可激活的磁性元件5和磁性元件6的区域的区域中。
[0318] 参考文献
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[0338] 表述“包括/包含”应被理解成“包括至少一个/包含至少一个”，除非另有说明。
[0339] 表述“形成一”应被理解成“形成至少一个”，除非另有说明。
[0340] 表述“包含在…和…之间”应被理解成包含边界值，除非另有说明。
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