蛋白质结晶具有3种主要应用：(1)结构生物学和药物设计、(2) 生物分离、和(3)纯化。在最适宜的条件下，晶体的形成是一个缓慢和 冗长的过程，代表性的是基于晶核形成之后制备一种饱和蛋白溶液。蛋白 质结晶的最适条件包括在饱和溶液里的最佳的蛋白质浓度、pH和温度等， 其中这些条件是由大量的尝试与误差试验确定的。
常规的蛋白质结晶方法和确定促进蛋白质结晶的条件的方法公开于 美国专利US6,596,077、US6,593,116、US6,579,358、US6,500,933、 US6,409,832、US6,268,158、US5,976,325、US5,728,559、US5,271,795、 US5,104,478、US4,737,232和US4,330,363等。
本领域中已知的是生物分子尤其是蛋白质在诸如硅水凝胶(Silica hydrogel)、琼脂糖和聚丙烯酰胺的凝胶中的结晶(例如，CrystalExTM， Hampton Research Corp.)。与从液体溶液中成长(growth)相比，这种方 法被认为是有好处的，因为它避免了考虑浮力、对流和沉降。这种方法还 通过凝胶的粘度调节分子扩散，并因此在许多方面摹拟了在微重力环境如 太空中的晶体成长的有利特性。这种方法的另一个优点是，晶体在环境温 度下保持包被于凝胶中，并且结晶构造甚至能直接用于X-射线衍射。这 种方法主要包括在聚合作用之前或在聚合作用之后，把浓度为10-20 mg/ml的一种蛋白质溶液加到凝胶中，然后在一种控制的温度下保存在胶 中几天至几周，直到发生蛋白质结晶。已经有人表示，使用这种方法能够 得到合适的晶体(Sauter等人，Proteins：Structure，Function and Genetics 48：146-150，2002)，然而，很少采用这种方法进行蛋白质结晶成长，并且 这种方法与本领域中已知的其它方法一样缓慢。
等电聚焦(IEF)技术广泛用于蛋白质分离和纯化，基于它们随着pH 而改变的特有的净电荷。蛋白质置于一个pH梯度中的一种电场下，其中 每种蛋白质向梯度内的一个点移动，在这个点其静电荷为零，这个点称为 “等电点”或‘pI”。
用于蛋白质分离和纯化的IEF技术描述于本发明发明人的专利 WO03/008977、和美国专利US6,537,432、US5,480,562、US5,464,517、 US5,451,662、US5,082,548、US4,971,670、US4,495,279、和US4,243,507 等。
人们有一种未满足的需要，为了克服在晶体成长中遇到的障碍，并提 能够发生结晶尤其是蛋白质结晶的更快速和消耗较少的方法。
发明概要
本发明涉及生物分子快速结晶的方法和设备，典型地在不超过几小时 以内，使用等电聚焦以得到生物分子的浓缩溶液、然后是所述生物分子的 快速结晶。
本发明部分地基于意外地发现，使用任何IEF方法浓缩一种稀的蛋白 质溶液，产生促进溶液中蛋白质快速结晶的一种蛋白质溶液。
根据一个方面，本发明提供一种用于快速结晶生物分子的方法，包括：
(a)提供至少一生物分子种类；
(b)提供至少一个结晶反应器，其包括具有一个pH范围的一种IEF 缓冲液，此pH范围包含至少一类生物分子的pI。
(c)把所述至少一生物分子种类与所述至少一个结晶反应器接触；
(d)向所述至少一个结晶反应器引入电场，从而产生所述至少一生 物分子种类的一种浓缩溶液；以及
(e)在所述至少一个结晶反应器中得到至少一种晶体。
根据另一个实施方案，步骤(c)还包括将至少一个结晶反应器和至 少一生物分子种类放置在电泳缓冲液中。优选地，步骤(c)还包括搅拌 电泳缓冲液。有利地，步骤(e)还包括监控生物分子晶体的形成。
根据又另一个实施方案，结晶在24小时内发生，优选地发生在少于 12小时内。
根据一个可供选择的实施方案，所述至少一生物分子种类在一种介质 中，这种介质选自由溶液、凝胶和悬浮液组成的组。
根据另一个可供选择的实施方案，所述至少一生物分子种类是固定到 一种固体基质上的。
本文使用的术语“结晶反应器”或“反应器”是指预设定体积、密度和粘 度的任何介质，其包括具有一个pH范围的一种IEF缓冲液。根据一些实 施方案，IEF缓冲液还包括至少一种聚合物，其中所得到的结晶反应器具 有一种预设定的多孔度。设计结晶反应器的密度、粘度、孔径大小(当IEF 缓冲液包括一种聚合物的情况)和体积，以使期望的生物分子可以进入反 应器，并且还可以在其中扩散。结晶反应器的体积依赖于使用的期望的生 物分子的量。在所述结晶反应器的体积中发生结晶。优选地，根据本发明 的结晶反应器在电场作用下是功能上稳定的。
本文使用的“IEF缓冲液”是以它最宽泛的含义以表示一种含有成分的 缓冲液，这些成分在下文中也称为缓冲剂，其在所给pH值范围内具有缓 冲能力。可替换地，缓冲液可以包括能够组织以形成pH梯度的成分，所 述成分包括但不限于，两性电解质、安福灵(ampholine)、丙烯酰胺衍 生物或缓冲剂的组合。根据本发明的IEF缓冲液典型地是结晶反应器的一 成分，其形式可为粘液、浆或凝胶。根据本发明，一种生物分子能够穿过 IEF缓冲液，除非所述生物分子的pI落在IEF缓冲液的pH范围内。优选 地，根据本发明的IEF缓冲液在电场作用下功能是稳定的。
根据又另一个实施方案，至少一生物分子种类选自包括化学个体的蛋 白质复合物、肽、蛋白质、多肽、酶、抗体、蛋白质-DNA复合物、多核 苷酸、DNA、RNA、抗原、抗原决定部位及其变体、激素、碳水化合物、 类脂、磷脂和生物素标记探针所组成的组。根据一个优选实施方案，生物 分子是蛋白质。优选地，生物分子选自蛋白质、肽或多肽。
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器设在毛细管内。根据又 另一个实施方案，至少一个结晶反应器是连接、结合或基本上邻接到一种 固体基质。
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器包括一种聚合物，这种 聚合物包括的一种或多种基质选自线型聚合物、支化聚合物、聚丙烯酰胺、 琼脂糖、水凝胶、纤维素、改性纤维素、交联聚乙烯醇、交联聚氧化乙烯 和乙二醇聚合物组成的组。根据又另一个实施方案，用在步骤(b)的基 质包括一种聚合物。
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器还包括一种聚合物，这 种聚合物包括至少一种基质，此基质选自支化聚合物、线型聚合物、聚丙 烯酰胺、琼脂糖、水凝胶、乙二醇聚合物、纤维素、改性纤维素、交联聚 乙烯醇、交联聚氧化乙烯和乙二醇聚合物组成的组。
根据又另一个实施方案，IEF缓冲液具有不超过0.2pH单位的狭窄 pH范围，优选地不超过0.1pH单位，更优选地不超过0.02pH单位。
根据又另一个实施方案，电泳溶液的温度保持在0-30℃的范围内。
根据又另一个实施方案，电泳溶液的温度保持在0-30℃的范围内，并 且电场强度保持在50V/cm至2000V/cm之间。
根据又另一个实施方案，步骤(d)在能够提供电场的装置的存在下 进行，电场以DC或AC提供。
根据某一实施方案，设备包括一阴极电极、一阳极电极和一电压电源。 根据一个实施方案，电极放在结晶反应器的相对的面上，以使电场能够穿 过或者进入反应器。根据另一个实施方案，电极是导线。根据另一个实施 方案，电极是平行放置的导线或者薄板。根据另一个实施方案，电极是由 一种材料制成或涂有一种材料，这种材料选自铂、钛、铬、金、钽、钯、 氧化钯、锗、镍和铑或包含它们的合金组成的组。优选地，电极由钯、铂、 钛、碳或包含它们的合金制成或涂覆。
装置行使功能把生物分子引向结晶反应器。这样，根据又另一个实施 方案，电场选自一种交流电场或者一种直流电场。如果结晶反应器包括在 一种闭合系统中(如，电场不能穿过反应器的一侧并穿出反应器的相对 侧)，那么有利的是，装置能够把电场引进并引出包含缓冲液的结晶反应 器(即，一种交流电场)。
根据另一个实施方案，至少一个结晶反应器能够具有任何期望的形状 和几何形态。
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器具有圆柱的形状。根据 一些实施方案，所述至少一个结晶反应器的直径是从大约20μm至大约 10mm。根据另一些实施方案，所述至少一个结晶反应器的长度是从大约 0.5mm至大约10mm。
根据各种实施方案，本发明所述方法的步骤(a)包括：提供多个结 晶反应器，每个结晶反应器包括一种IEF缓冲液，多个结晶反应器中的IEF 缓冲液是彼此类似或彼此不同的。根据一个优选实施方案，结晶反应器是 互相隔离的。根据某一实施方案，步骤(e)包括：在每个结晶反应器中 得到至少一晶体。根据一个可供选择的实施方案，步骤(e)包括：在多 个结晶反应器中得到多个(种)晶体。
根据一个实施方案，每种IEF缓冲液具有不超过0.2pH单位的狭窄 pH范围，优选地不超过0.1pH单位，更优选地不超过0.02pH单位。根 据另一个实施方案，多个结晶反应器的pH范围不重叠。可选择地，多个 结晶反应器的pH范围部分地重叠。本文使用的术语“部分地重叠”解释为 它最常规的含义，并且是指例如多个pH范围，其中一个pH范围的上限 与至少一个其它pH范围的下限重叠。可替换地，这个术语可以是指多个 pH范围，其中一个pH范围比至少一个其它pH范围宽，这样较宽的pH 范围完全地包含所述的一个其它pH范围。
根据又另一个实施方案，一种或多种IEF缓冲液之间的pH差不超过 0.1pH单位，优选地不超过0.02pH单位。术语“pH差”是指具有不同或部 分不同pH范围的两种不同IEF缓冲液之间pH值的增量差。pH差可以指 一个pH范围的上限与另一个pH范围的下限之间的差值。可替换地，pH 差可以指一个pH范围的pH中值与另一个pH范围的pH中值之间的差值。
根据又另一个实施方案，多个结晶反应器是连接、结合或基本上邻接 到一种基质。根据一个可供选择的实施方案，结晶反应器以一种空间上可 寻址的方式连接、结合或基本上邻接到一种基质。根据又另一个实施方案， 基质是生物分子不可渗透的。根据又另一个实施方案，基质是离子不可渗 透的。
根据又另一个实施方案，包括多个结晶反应器的基质可以是这样一种 设置，这种设置选自固定化的pH梯度、pH膜和预制凝胶组成的组。
根据本发明的另一个方面，提供了一种方法，用于分类一种包括多种 生物分子的溶液，并把选自其中的至少一生物分子种类快速结晶，此方法 包括：
(a)提供包括多种生物分子的介质；
(b)将多种生物分子在基质上分类，从而基质上得到包括至少一生 物分子种类的至少一个位点；
(c)从所述基质回收一部分，此部分包括至少一个位点；
(d)提供至少一个结晶反应器，此结晶反应器包括具有一个pH范 围的一种IEF缓冲液，所述pH范围包含至少一生物分子种类的pI；
(e)把(c)中的所述部分与至少一个结晶反应器接触；
(f)将一电场引入所述至少一个结晶反应器，从而在所述至少一个 结晶反应器内产生所述至少一生物分子种类的一种浓缩溶液；并且
(g)在所述至少一个结晶反应器中得到至少一生物分子晶体。
根据一个可供选择的实施方案，步骤(b)包括：将多种生物分子在 基质上分类，从而在基质上得到至少一个位点，该位点包括一生物分子种 类。
根据一个实施方案，步骤(b)中的分类是由集合至少一种生物分子 实施的。根据另一个实施方案，步骤(b)是由选自以下组成的组的一种 方法实现的：等电聚焦、薄层色谱法(TLC)、包括高效液相色谱(HPLC) 技术、和凝胶电泳。优选地，这些方法的任何之一都在非变性条件下进行。
根据又另一个实施方案，其中步骤(e)还包括：将所述部分和所述 至少一个结晶反应器放置在电泳缓冲液中。优选地，步骤(e)还包括： 搅拌电泳缓冲液。有利地是，步骤(g)还包括监控和/或检测生物分子晶 体的形成。
根据又另一个实施方案，在24小时内得到晶体，优选地在12小时内。
根据又另一个实施方案，步骤(d)的IEF缓冲液具有不超过0.2pH 单位的一个pH范围，优选地不超过0.1pH单位，更优选地不超过0.02pH 单位。
根据又另一个实施方案，电泳溶液的温度保持在0-30℃的范围内。根 据又另一个实施方案，电泳溶液的温度保持在0-30℃的范围内，并且电场 强度保持在50V/cm至2000V/cm之间。根据又另一个实施方案，电场以 DC或AC提供。
根据又另一个实施方案，步骤(b)中使用的基质是一种凝胶。根据 一个可供选择的实施方案，步骤(b)中使用的基质包括一种聚合物，此 聚合物选自聚丙烯酰胺、琼脂糖、水凝胶、纤维素、硝化纤维素、改性纤 维素、交联聚乙烯醇、交联聚氧化乙烯和乙二醇聚合物组成的组。根据又 另一个实施方案，用在步骤(b)的基质包括一种聚合物，其中步骤(f) 包括：
引入一电场到所述至少一个结晶反应器，从而在所述至少一个结晶反 应器内产生所述至少一生物分子种类的一浓缩带；
根据又另一个实施方案，本发明的方法是自动化的并且适合生物分子 的高-产量结晶，生物分子优选是蛋白质。
本发明的方法优于本领域中已知的蛋白质结晶方法在于，它促进快速 蛋白质结晶，典型地在少于1小时之内。此外，本发明的方法能够得到大 的晶体，并因此适于需要足够大的晶体的应用，例如，收集高质量的X- 射线衍射数据。
根据本发明方法的快速结晶可以使用本领域中已知的许多IEF系统 得到，诸如，固定化的pH梯度(IPG)胶条、pH膜和具有期望的pH范 围的两性电解质在凝胶中的任何组合物，附带条件是这种IEF系统满足， 或被改进以满足，本发明的原理。优选地，根据本发明的一种IEF系统包 括多个不同的实体，术语也称为结晶反应器，每个结晶反应器具有一种IEF 缓冲液，其有一个pH范围。可选择地，结晶反应器互相隔离，这样建立 起多个隔离pH范围的一个系统，可选择地pH范围是具有狭窄的pH范围。 多个隔离的结晶反应器覆盖的pH范围可以重叠或可以不重叠。
本发明方法的另一个特殊优点是，由于本发明的方法包括的等电聚焦 法是针对从杂质分离和溶解蛋白质，所以蛋白质晶体可以从不是高度纯化 的蛋白质的溶液中得到。
根据另一个方面，本发明提供一种适合用于引导生物分子晶体快速形 成的设备，生物分子优选是蛋白质，该设备包括：
(a)缓冲室，其具有一个上侧面和一个下侧面，下侧面用一个底密 封，以使缓冲室围绕了能够存储流体的至少一个缓冲间；
(b)至少一个结晶反应器，此至少一个结晶反应器包括一种IEF缓 冲液，此至少一个结晶反应器被容纳在缓冲室中；
(c)一产生电场的装置；以及可选择地，
(d)用于循环缓冲间里容纳的流体的装置。
根据一个实施方案，本发明的设备还包括一个具有一个上侧面和一个 下侧面的固定器，固定器包括至少一个结晶反应器，或适合支撑包括至少 一个结晶反应器的基质，所述至少一个结晶反应器包括一种IEF缓冲液， 固定器被容纳在缓冲室内。根据另一个实施方案，固定器置于至少一个缓 冲间内。根据某一实施方案，固定器是包括至少一个结晶反应器的毛细管。
根据一个可供选择的实施方案，本发明的设备还包括具有两个末端的 两个盐桥，每个盐桥的一端与固定器的一端接触，每个盐桥的一端被容纳 在所述至少一个缓冲室内。优选地，本发明的设备包括两个缓冲室，这样 每个缓冲室围绕一个盐桥的一端。
根据一个优选实施方案，本发明的设备还包括一个温度控制模块，其 能够控制所述至少一个反应器的温度。
根据一个可供选择的实施方案，固定器包括至少一个腔，此至少一个 腔含有包括一种IEF缓冲液的一个结晶反应器。
根据又另一个实施方案，固定器具有多个腔，这样每个腔都适于含有 一个结晶反应器。根据一些实施方案，一个结晶反应器的温度是与另一个 结晶反应器的温度是不同的。
根据又另一个实施方案，固定器包括一种材料，该材料的电阻比结晶 反应器所含的聚合物的电阻大。
根据又另一个实施方案，固定器包括一种非导体材料。这种非导体材 料可以选自聚-N-甲基甲基丙烯酰胺、丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯 乙烯、陶瓷、玻璃和聚-甲基丙烯酸甲酯组成的组。
根据又另一个实施方案，固定器包括一种对生物分子不可渗透的材 料，以避免蛋白质从一个腔中的结晶反应器扩散到另一个腔中的结晶反应 器。
根据又另一个实施方案，所述至少一个结晶反应器还包括一种聚合 物，这种聚合物包括至少一种基质，此基质选自线型聚合物、支化聚合物、 聚丙烯酰胺、琼脂糖、水凝胶、乙二醇聚合物、纤维素、改性纤维素、交 联聚乙烯醇、交联聚氧化乙烯和乙二醇聚合物组成的组。
根据又另一个实施方案，缓冲室包括一种非导体的材料。
根据又另一个实施方案，本发明的设备适于在显微镜下监控在至少一 个结晶反应器中晶体的形成。
根据另一个实施方案，缓冲间适于存储包括电泳缓冲液和至少一种溶 解在电泳缓冲液里的生物分子的溶液。
根据一个实施方案，本发明提供用于高产量快速大分子结晶的小型化 和自动化的设备和方法。本发明的设备可以构造为具有自动化的互相作用 组件，例如，用于填充腔的滴定器，所述腔具有包括IEF缓冲液(固定化 电解质、两性电解质等)的预-聚合的结晶反应器，用于从腔或结晶反应 器回收蛋白晶体的提取器，及用于监控和记录结晶反应器中蛋白晶体形成 的装置。
本发明的以上所述和其它目标、特征和优点将从以下详细描述和附带 的权利要求中更清楚地看到。
附图说明
图1是各种(A-C)结晶系统的示意图，此结晶系统包括围绕在缓冲 室(2)中的一个缓冲间(1)、一个固定器(3)、电极(6)、一个盐桥 (10)和一个固体支撑(7)、包括一个或多个结晶反应器(5)的一个毛 细管(8)或一个带(14)以及可选的一个装载点(9)。
图2是一种结晶设备的示意图，此结晶设备包括围绕在缓冲室(2) 中的一个缓冲间(1)、一个固定器(3)、包括结晶反应器(5)的多个 腔(4)和电极(6)。
图3(A)是表示蛋白质从包含在固定器(3)的结晶反应器(5)内 的蛋白带(12)移动的图示，(B)是表示包括3个结晶反应器的固定器 (3)的俯视横截面图(左图)和侧视横截面图。
图4表示用IEF在pH范围为3至10的市售IPG条(Amersham Biosciences)分离3个蛋白质样品。
图5表示使用本发明的所述方法，用狭窄pH范围为9.5至9.75的IEF 缓冲液，分离和快速结晶从图1的IPG条得到的一种蛋白质。
图6表示用本发明的方法得到的一种p53晶体(A)和其衍射图形(B)。
图7表示从一个结晶反应器得到的大约100μm长的单个肌红蛋白晶 体的图像(300μm*150μm)(A)，和凝胶中血红蛋白晶体的图像(B)。 中心的狭长物体是400μm长的血红蛋白晶体。
图8表示胶里藻青蛋白晶体的图像(A)和醇脱氢酶晶体的图像(B)。
图9表示从一个腔中的凝胶中提取的谷氨酸脱氢酶(GDH)晶体的图 像(A)和凝胶里水通道蛋白(Aquaporin)3晶体的图像(B)。
图10表示由聚合的IEF缓冲液组成的结晶反应器内碳酸酐酶晶体的 图像(A)和从结晶反应器萃取的晶体的图像(B)。
图11表示胃蛋白酶-4晶体(B)的衍射图形(A)。
图12表示肌酸激酶1晶体的图像(A)、β-人生长因子晶体的图像(B) 和抗生物素蛋白晶体的图像(C)。
图13表示赫赛汀(herceptin)蛋白晶体(A)和Ly1溶菌酶蛋白晶体 (B)。
图14表示溶菌酶晶体的衍射图形(A)和核糖核酸酶-1晶体的衍射 图形(B)。
图15表示前列腺素晶体的衍射图形(A)和由没有蛋白质晶体的聚 合IEF缓冲液组成的结晶反应器的衍射图形(B)。
本发明的详细描述
本发明提供了诱导从蛋白质溶液快速形成蛋白质晶体的方法和设备。 本发明的方法包括等电聚焦并因此形成浓缩的蛋白质溶液或蛋白质带，其 促进快速的蛋白质结晶，典型地在不超过15小时的时间段内。
目前所有用于产生蛋白质晶体的方法都依赖于冗长的对导致晶体形 成的最适条件的“尝试与误差”试验和研究。对影响蛋白质结晶的各种因素 的评论出版于McPHerson，Methods Enzymol.，114，pp.112-20(1985)。 McPHerson and Gilliland，J.Crystal Growth，90，pp.51-59(1988)汇编了已经 结晶的蛋白质和核酸的列表，以及它们结晶的条件。晶体的概述和结晶配 方，以及溶解的蛋白质和核酸的结构的坐标系库，由Brookhaven National Laboratory的蛋白质数据库(Protein Data Bank)保存[http//www.pdb.bnl.gov； Bernstein et al.，J.Mol.Biol.，112，pp.535-42(1977)]。这些参考能够用于确 定蛋白质结晶的必要条件，作为形成合适蛋白质晶体的前奏并指引其它蛋 白质结晶的策略。可替换地，在大多数情况下，一种明智的尝试与误差试 验研究策略可以产生适合于许多蛋白质的结晶的条件，假定这些蛋白质可 以达到一种可接受程度的纯度[见于，例如，C.W.Carter，Jr.and C.W. Carter，J.Biol.Chem.，254，pp.12219-23(1979)]。
总之，通过把将要结晶的蛋白质与一种合适的含水溶剂或含有合适的 结晶剂的含水溶剂结合而产生晶体，合适的结晶剂诸如盐类或有机溶剂。 溶剂与蛋白质结合并可以在一定温度下搅动，这种温度是实验确定的适合 诱导结晶的并对保持蛋白质活性和稳定性是可以接受的。溶剂可选择性地 包括诸如二价阳离子等的共溶质(co-solutes)、辅助因子或离液剂 (chaotropes)、以及用于控制pH的缓冲液种类。对共溶质的需要和它们 的浓度由实验确定以促进结晶。
在工业-规模的生产中，导致结晶的受控沉淀最好可以由蛋白质、沉 淀剂、共溶质以及可选择的缓冲液的简单组合分批实现。对另一种选择， 可以由使用蛋白质沉淀物作为起始材料来结晶蛋白质。在这种情况下，向 结晶溶液加入蛋白质沉淀物，并培养直到形成晶体。也可以采用其他的实 验室结晶方法，诸如透析或蒸汽扩散(vapor diffusion)。McPHerson，ibid and Gilliland，ibid，在他们对结晶文献的评论中包括适合条件的综合列表。
根据本发明的教导，具有一个明确的等电点的任何蛋白质都可以用于 制备蛋白质晶体。然而需要注意的是，结晶的条件，诸如IEF缓冲液的含 量、密度、粘度、和其它特征，以及结晶反应器的温度及其它设置参数， 可以被优化以产生理想质量的晶体。因此，本领域技术人员将会认识到， 对这些特征和条件进行一定程度的调整，以使用本发明的方法和设备得到 晶体，可以是必要的。
本文使用的术语“蛋白质晶体”或“晶体”是可交换的，以描述以晶格排 列的蛋白质分子。蛋白质晶体含有一种特定蛋白-蛋白连接的方式，其周 期地在三维重复。本发明的蛋白晶体不包括蛋白质无定形的固体形式或蛋 白质的沉淀物，诸如由冻干蛋白质溶液得到的。晶体表现特有的特征，包 括晶格结构、特有的形状和光学特性诸如折射率和双折射。晶体由原子组 成，原子排列的方式是在三维上周期性地重复。相反，无定形的材料是物 体的一种非-结晶固体形式，有时是指一种无定形沉淀物。这样的沉淀物 没有结晶固体状态的分子晶格结构特征，也不表现双折射或物质晶形典型 的其他光谱特征。
本文使用的术语“浓缩的蛋白质溶液”或“浓缩溶液”是可交换的，以描 述包括至少一种蛋白质的介质，其中蛋白质的浓度范围从饱和，或甚至过 饱和到相当于50％饱和的浓度。如果IEF缓冲液是聚合的，那么蛋白质在 浓缩时形成一条带，因此使用术语“浓缩蛋白质带”或“浓缩带”。
典型地，根据本发明的蛋白质结晶可以开始于在一种电泳缓冲液中的 一种蛋白质溶液，这种蛋白质溶液包括具有至少一种已知等电点(pI)的 蛋白质。蛋白质溶液可以是稀溶液。引入电场到蛋白质溶液时，蛋白质被 驱动进入一个结晶反应器，此结晶反应器包括具有与蛋白质的pI重合的 一个pH范围的IEF缓冲液。因此，当每个蛋白质分子驱动进入所述反应 器体积内时，释放其电荷并在电场中停止移动，在结晶反应器中得到无电 荷的蛋白质的浓缩溶液或浓缩带。蛋白质从初始的稀溶液的电泳聚集和浓 缩的方法是很快并有效的，典型的发生在以分钟为数量级的时间跨度内， 甚至在几十分钟内。聚集的蛋白质分子在结晶反应器内由扩散而蔓延，导 致快速的晶核形成并在其中生长。
“等电聚焦”或“IEF”是一种常用的分离技术，基于暴露于IEF方法的 分子的静电荷，此分子典型的是蛋白质。蛋白质的静电荷从其氨基酸含量 来确定。在典型蛋白质中发现的20种氨基酸中，在一些pH范围中，4种 (天冬氨酸和谷氨酸、胱氨酸和酪氨酸)携带负电荷，3种(赖氨酸、精 氨酸和组氨酸)携带正电荷。由其特定的氨基酸顺序定义的一种特定蛋白 质，因此可能沿着其长度混合了许多带电基团。每个氨基酸贡献的电荷数 量由环境溶液的主要pH控制，根据相关的电荷和pH的滴定曲线以及所 讨论氨基酸的pK，电荷数量能够从最小值为0向最大值为1变化(正还 是负取决于氨基酸)。在所有氨基酸置于变性的条件下，蛋白质分子的总 电荷近似地由其组成氨基酸的总电荷提供，所有氨基酸都在主要溶液pH 下。
IEF是一种广泛使用的根据蛋白质的等电点分离蛋白质的电泳方法。 IEF包括带电蛋白质在期望的IEF缓冲液建立的pH梯度中的迁移，尤其 是在凝胶中，其中蛋白质迁移是源自电场或者由电场引导。一旦到达pH 梯度凝胶中pH值等于蛋白质pI的位置，具有特定pI的蛋白质失去其电 荷，就停止在凝胶中的迁移。蛋白质聚集在此位置。IEF的优点是将多种 各有特定pI的蛋白质从蛋白质混合物溶液中直接溶解到不连续的带中的 能力。经典IEF方法的最终产出是多个pH带，每个pH带载有具有特定 pI的一种特定蛋白质。具有不同带电氨基酸比例的两种蛋白质可以由于它 们在某些pH的不同静电荷的特征而分离。在施加电场的作用下，带较高 电荷的蛋白质将比具有相同大小和形状的带较低电荷蛋白质移动更快。如 果蛋白质从一个样品区域移动穿过一个非-传导介质(典型的是诸如聚丙 烯酰胺等的凝胶)，将导致一电泳分离。在施加电场下迁移的过程中，如 果蛋白质进入一个区域，此区域pH值是使得此蛋白质的静电荷为零的(等 电pH)，蛋白质将终止相对于介质的迁移。进而，如果此迁移发生在一 种无变化的pH梯度中，蛋白质将会“聚焦”于等电pH值。如果蛋白质朝 着更酸性的pH值移动，它将会带上更多正电荷，合适-导向的电场将驱使 蛋白质回到等电点。类似地，如果蛋白质朝着更碱性的pH值移动，它将 会带上更多负电荷，同样的电场将推动蛋白质回到等电点。这种分离方法， 称为等电聚焦，可以溶解在各自序列的上百氨基酸中区别少于1个带电氨 基酸的两种蛋白质。
等电聚焦法的一个关键要求是形成一种合适的空间pH梯度。这可以 由动力学达到，由把带电分子的多相混合物(两性电解质)包括到起始均 匀分离介质中，或者由静止地把空间梯度的滴定基团结合到发生迁移的凝 胶母体中。前者代表经典的基于两性电解质的等电聚焦，后者代表近来改 进的固定化的pH梯度(IPG)等电聚焦技术。IPG方法的优点是凝胶中的 pH梯度是固定的，而基于两性电解质的方法是随着两性电解质分子在电 场中移动而易于位置漂移的。目前最好的方法学结合了两种方法以提供一 个系统，其中pH梯度是空间固定的，但是存在少量的两性电解质以减少 蛋白质在IPG的带电凝胶母体上的吸收。
形成期望的pH梯度IPG凝胶需要的组成梯度是通常由配制以产生碱 性pH的重凝胶单体(heavy gel monomer)组合物、配制以产生酸性pH 的轻凝胶单体(light gel monomer)组合物、诸如过硫酸铵等的聚合引发 剂、以及诸如四甲基乙二胺(TEMED)等的聚合催化剂而制备的。可以 使用甘油和氧化氚(重水)以增加溶液的密度，由所得到密度梯度与地球 重力之间的相互作用，从而帮助稳定模具中形成的梯度。几份文献描述了 产生聚合单体梯度的自动装置。这样的系统已经用于制造用在蛋白质的分 子量分离的多孔的梯度凝胶。Altland等人(Clin.Chem.30(12Pt 1)：2098-2103，1984)展示了使用这样的系统以产生用于制造IPG凝胶的可 滴定的单体梯度。美国专利4,169,036介绍了装有用于电泳分离的平板- 凝胶固定器的一种系统。产生梯度凝胶的一种自动设备公开于美国专利 4,594,064、6,554,991及其它。
根据本发明的快速结晶需要适合的物理条件以允许本发明的运作。本 发明的方法和设备中的几个因素都影响结晶动力学。
首先，为了确保期望的蛋白质进入适合的结晶反应器，有利的是加速 分子在电泳缓冲液中的动力学，以增加任何分子遇到结晶反应器的概率。
有利地，蛋白质在电泳缓冲液中的移动增加，是根据本发明的方法引 入的电场产生的对流热的结果。可预计的是，增强的蛋白质动力学增加了 任何蛋白质遇到结晶反应器而且被其捕获到其内的概率，结晶反应器是浸 没在电泳缓冲液中的。
根据一个实施方案，蛋白质在电泳缓冲液中的速度由一种循环电泳缓 冲液的装置加速。典型的使用搅拌棒、泵、振荡器例如压力振荡器、搅拌 器、倾斜装置或任何本领域已知的搅动装置和技术来达到循环。在另一个 实施方案中，用于循环的装置可以是用于相对于电泳缓冲液移动IEF缓冲 液或者结晶反应器的一种机械装置。例如，IEF缓冲液或者结晶反应器可 以在电泳缓冲液中旋转。
可替换地，本发明的方法可以没有这种循环装置。在本发明的另一个 实施方案中，由等电聚焦过程中自然产生的对流而提供循环。
根据另一个实施方案，循环生物分子必需的对流能的量是每1cm3电 泳缓冲液10-10焦耳。
根据又另一个实施方案，本发明的方法包括使用根据WO03/008977 所公开原理的一种快速IEF方法。
第二，为了确保期望进入适合的结晶反应器的蛋白质遇到所述反应 器，形成一种浓缩的蛋白质溶液或者浓缩的蛋白质带。典型地，浓缩的蛋 白质溶液/带产生于结晶反应器内，靠近结晶反应器与外部环境之间的界 面的位置，然后蛋白质进入结晶反应器并在其中扩散，然后形成蛋白质晶 体。
设计结晶反应器的粘性和体积，以使期望的蛋白质能够进入结晶反应 器并在其中扩散，还能在其中结晶。当结晶反应器中的IEF缓冲液是以凝 胶的形式时，还可定制凝胶的孔率以得到期望的晶体。典型的，蛋白质在 凝胶里的扩散常数是使蛋白质的分布扩展0.1mm数量级的距离的扩散时 间是大约1000秒(～20分钟)。这样，具有同等尺寸的晶体的晶体生长 的预定时间是这个数量级的。
另一个影响结晶效率的重要参数，是结晶反应器的pH。略微地改变 结晶反应器的pH使其高于或低于生物分子的pI，将导致生物分子在进入 反应器之后保持带有一种边缘电荷(marginal charge)并因此在结晶反应 器中有一种另外的运动方式。
而且，结晶反应器的结构必须适合分离晶体以进一步应用或/和在结 晶反应器内收集晶体的X-射线衍射数据。
在结晶反应器的构造中可以使用固定化的液膜。尤其是，固定化的液 膜可以用作本发明的结晶反应器的外部被膜，对结晶反应器提供对期望的 生物分子的选择性渗透的边界。固定化的液膜典型地被限制在多微孔的固 体内。制备多孔膜的最广泛使用和最简单的工艺之一是GelgardTM工艺， 其中从融化而挤压出半晶质的膜或纤维。由拉伸固体-状态的聚合物诸如 聚丙烯而带来孔率。多至0.04μm的孔径是可得到的，以及具有100-1500μm ID和25μm壁厚度使用在例如血液充氧器中的中空纤维也是可以得到的。 这样固定化的液膜通常与乙醇、乙二醇、和异丙醇是相容的。另一种广泛 使用的多孔膜的例子是Gore-TexTM，一种多微孔的聚(四氟乙烯)，其也 由拉伸工艺制造，是化学上惰性的并且是一种疏水的合成高分子膜。
结晶反应器的尺寸依赖于使用的期望蛋白质的量和所使用的系统和/ 或设备的类型。结晶反应器的体积可以设计为(1)促进在反应器内形成 浓缩的生物分子溶液/带，典型的是在接近反应器和外部环境的界面的位 置；和(2)使生物分子能够在其中的扩散并从而使所述生物分子能够结 晶。
第三，本发明的方法需要在每个结晶反应器只有一种蛋白质，因为不 相关蛋白质或其它杂质的存在干扰期望的结晶过程。为了确保只有一种蛋 白质进入一个结晶反应器，结晶反应器中由IEF缓冲液覆盖的pH范围包 含该一种蛋白质的pI。然而，本发明的方法促进任何期望类型的蛋白质结 晶，即使所述的类型没有纯化。在提供了一种非-纯化蛋白质溶液的情况， 需要至少一个结晶反应器包括包含期望的类型蛋白质的pI的一种IEF缓 冲液，其中结晶反应器中由IEF缓冲液覆盖的pH范围是十分狭窄的，优 选地极端-窄，这样避免了杂质的结晶。
这样，根据某一个实施方案，每个结晶反应器内的IEF缓冲液具有非 常狭窄的pH范围，如5.50-5.60(0.1pH单位或更小差别)或极端窄的pH范 围，如5.52-5.54(0.02pH单位差别或更小差别)。因为根据本发明的一种 IEF缓冲液可以是一种缓冲剂，其被调整到一定的pH值，所以所述PH 范围是可能的。在这种情况，IEF缓冲液的pH范围相当于一种缓冲剂在 其PH值左右的缓冲能力，缓冲剂被调整到此pH值。根据本发明可以使 用的一种IEF缓冲液的例子是Tris Glycine(pH 8.20+/-0.05，Biorad，目录编 号161-0771)。
术语“pH范围”是指一种IEF缓冲液的最高和最低pH值(如， pH 7.9-pH 8.9)，或者一种IEF缓冲液中最高和最低pH值的差(如，1.0pH 单位)。
根据另一个实施方案，多种结晶反应器的pH范围不重叠。根据又另 一个实施方案，一种或多种IEF缓冲液之间的pH差不超过0.1pH单位， 优选地不超过0.02pH单位。
本文使用的术语“差”或“pH差”是可以互换的，描述具有不同的或部 分不同的pH范围的两种不同的IEF缓冲液之间的pH值的增量差。例如， 如果结晶反应器#1与结晶反应器#2之间的pH差是0.1pH单位，那么结 晶反应器#1的pH梯度开始于pH6.8结束于pH7.8，结晶反应器#2的pH 梯度开始于pH7.9结束于pH8.9(即，结晶反应器#1的下限pH7.9与结晶 反应器#2的上限pH7.8之间的差值，符合0.1pH单位的差值)。
根据多个实施方案，多于两个的结晶反应器之间的pH差不必是均一 的。
根据又另一个实施方案，一个结晶反应器内的间距不必是均一的。术 语“间距”是指IEF缓冲液产生的pH梯度内的pH值之间的增量差别。例 如，在一个结晶反应器内，间距可以小至在该反应器中整个pH范围内的 0.02pH单位(例如，pH6.8、pH6.82、pH6.84、pH6.86等等)
根据一些实施方案，一个结晶反应器内的间距不必是均一的。
根据一个实施方案，一个结晶反应器的一种IEF缓冲液的一pH范围 是相对宽的，例如，超过1个pH单位，可替换地超过2个pH单位。根 据另一个实施方案，一个结晶反应器的一种IEF缓冲液的pH范围是狭窄 的，例如，大约1个pH单位或更小。根据又另一个实施方案，一个结晶 反应器的一种IEF缓冲液的pH范围是极窄的，例如，大约0.2个pH单位 或更小，可替换地大约0.02个pH单位或更小。
根据一个实施方案，一种IEF缓冲液的pH间距是0.1pH单位或更小。 根据另一个实施方案，一种IEF缓冲液的pH间距是0.02pH单位或更小。
根据本发明的一个实施方案，两种或多种IEF缓冲液之间的pH差是 0.01单位或更小。根据本发明的另一个实施方案，两种或多种IEF缓冲液 之间的pH差是0.02单位或更小。
根据一个实施方案，本发明提供了生物分子快速结晶的一种方法，包 括：
(a)提供至少一生物分子种类；
(b)提供至少一个结晶反应器，其包括具有一个pH范围的一种IEF 缓冲液，所述pH范围包含一pH与至少一生物分子种类的pI相符合。
(c)把所述至少一生物分子种类与至少一个结晶反应器接触；
(d)引入电场到所述电泳缓冲液，从而在所述结晶反应器中产生所 述至少一生物分子种类的一种浓缩溶液；并且
(e)允许在浓缩溶液中的所述至少一生物分子种类在至少一个结晶 反应器中结晶。
根据又另一个实施方案，步骤(c)还包括将至少一生物分子种类和 所述至少一个结晶反应器放置于电泳缓冲液中。根据又另一个实施方案， 步骤(c)还包括搅拌电泳缓冲液。有利地，步骤(e)还包括监控和/或 检测生物分子晶体的形成。
根据本发明所述方法的步骤(c)，把至少一生物分子种类与至少一 个结晶反应器的接触可以以多种途径实现。例如，在生物分子提供于一种 溶液中的情况，可以通过把一滴或更多溶液施加于结晶反应器上而实现把 至少一生物分子种类与至少一个结晶反应器的接触。可以施加生物分子到 一膜、一母体或任何其它吸收性物质上，其覆盖、铺设或安置在一个结晶 反应器上，以达到在生物分子和结晶反应器之间的接触。如果以凝胶段提 供生物分子，允许凝胶段接触至少一个结晶反应器。
根据又另一个实施方案，本发明所述方法的步骤(c)还可以包括将 基本上连接生物分子与至少一个结晶反应器放置于电泳缓冲液溶液内。
本文使用的术语“生物分子”是指任何化合物，该化合物是人工制造的 或天然的，对细胞、细胞成分或有机体具有可见效果。这个术语应用于蛋 白质、包括化学个体的蛋白质复合体、蛋白质-DNA复合体、DNA、RNA、 酶、肽、多肽、抗体、抗原、抗原决定部位和其变体、多核苷酸、激素、 碳水化合物、类脂、磷脂和生物素标记探针。术语“生物分子”在优选实施 方案中通常以“蛋白质”作为例子。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地使用，是指任何长度的氨基酸 聚合物。这些术语也适用于氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸残基是 一种对应天然存在氨基酸的人造化学类似物，以及也适用于天然存在的氨 基酸聚合物。一种氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是一种“非 天然”氨基酸，非对应于任何天然存在的氨基酸，也包含在本文的术语“蛋 白质”、“肽”和“多肽”的用途中。
“核酸”或“多核苷酸”是指一种核苷酸序列，包括多个以5’至3’磷酸二 酯键连接的核酸，可以或是DNA或是RNA序列。如果核酸是DNA，核 苷酸序列可以或是单链或是双链的。编码本发明的蛋白质的核酸是RNA 或DNA，其编码一种能够以高亲和力结合纤维素的蛋白质，所述核酸与 编码这种蛋白质的核酸序列互补，或者与编码这种蛋白质的核酸序列杂 交，并在严格(stringent)的条件下保持稳定地与编码这种蛋白质的核酸 序列结合。
根据本发明的方法，任何形式的蛋白质都可以结晶。蛋白质可以是糖 蛋白、磷蛋白、硫蛋白(sulphoproteins)、碘蛋白、甲基化蛋白、未改性 的蛋白质或含有其它修饰的蛋白质。这些蛋白质可以是，例如，治疗蛋白、 包括抗体的预防蛋白、包括去污蛋白的清洗剂蛋白、包括美容蛋白的个人 护理蛋白、兽医蛋白、食物蛋白、饲料蛋白、诊断蛋白和净化蛋白。包括 在这些蛋白质中的有酶，诸如，溶菌酶、脱氢酶、水解酶、异构酶、裂解 酶、连接酶、腺苷酸环化酶、转移酶和氧化还原酶。水解酶的例子包括弹 性蛋白酶、酯酶、脂肪酶、腈水解酶、淀粉酶、果胶酶、乙内酰脲酶 (hydantoinase)、天冬酰胺酶、脲酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和其 它蛋白酶和溶菌酶。裂解酶的例子包括醛缩酶和羟基腈裂解酶 (hydroxynitrile lyase)。氧化还原酶的例子包括过氧化物酶、漆酶、葡糖氧 化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和其它脱氢酶。其它酶包括纤维素酶和氧 化酶。
治疗蛋白或预防蛋白的例子包括激素，诸如胰岛素、胰高血糖素样肽 -1(glucogon-like peptide-1)和甲状旁腺激素、抗体、抑制剂、生长因子、 postridical激素、神经生长激素、凝血因子、粘合分子、骨骼发生蛋白(bone morphogenic protein)和外源凝集素营养因子(lectins trophic factor)、细 胞因子(cytokines)诸如TGF-β、IL-2、IL-4、α-IFN、β-IFN、γ-IFN、TNF、 IL-6、IL-8、淋巴细胞毒素、IL-5、移动抑制因子、GMCSF、IL-7、IL-3、 单核细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、多药物抗性蛋 白、其它淋巴因子、类毒素、促红细胞生成素、VIII因子、支链淀粉、TPA、 脱氧核糖核酸酶-α、α-1-antitripsin、人生长激素、神经生长激素、骨形态 形成性蛋白质、脲酶、类毒素、生育激素(fertility hormones)、FSH和 LSH。
治疗蛋白诸如以下蛋白，也包括：白细胞标记，诸如CD2、CD3、CD4、 CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD18、 CD19、CE20、CD22、CD23、CD27和其配体、CD28和其配体B7.1、B7.2、 B7.3、CD29和其配体、CD30和其配体、CD40和其配体gp39、CD44、 CD45和异构重整体(isoforms)、Cdw52(Campath抗原)、CD56、CD58、 CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR组织相容性抗原，诸如MHC I类 或II类抗原、Lewis Y抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb；粘合素(integrin)， 诸如VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6和LFA-1；粘合 分子，诸如Mac-1和p150、95；选择凝集素(selectin)，诸如L-选择凝集 素、P-选择凝集素和E-选择凝集素和它们相对的受体VCAM-1、ICAM-1、 ICAM-2和LFA-3；白细胞介素，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15；白细胞介素受体， 诸如IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-10R、 IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R、IL-15R；趋化因子(chemokines)， 诸如PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ和IL-8；生 长因子，诸如TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、PTHrP、EGF家族、EGF、 PDGF家族、内皮素(endothelin)和促胃酸激素释放肽(GRP)；生长因子 受体，诸如TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、PGFR、EGFR、 PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R；GCSF-R和其它造血受体；干扰素受体， 诸如IFNαR、IFNβR和IFNγR；免疫球蛋白和其受体，诸如IgE、FceRI 和FceRII；血液因子，诸如补体C3b、补体C5a、补体C5b-9、Rh因子、 纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘质关联的生长抑制剂。
根据本发明方法结晶的蛋白质可以是任何天然的、合成的或重组蛋白 抗原，包括例如，破伤风类毒素、白喉类毒素(diptheria toxoid)、病毒 表面蛋白、诸如CMV糖蛋白B、H、和gCIII、HIV-1被膜糖蛋白、RSV 被膜糖蛋白、HSV被膜糖蛋白、EBV被膜糖蛋白、VZV被膜糖蛋白、HPV 被膜糖蛋白、流感病毒糖蛋白、肝炎家族表面抗原；病毒结构蛋白、病毒 酶、寄生虫蛋白、寄生虫糖蛋白、寄生虫酶和细菌蛋白。还包括肿瘤抗原， 诸如her2-neu、粘蛋白、CEA和内皮唾液酸蛋白(endosialin)。也包括变 态反应原，诸如室内尘螨抗原、lol p1(草)抗原和漆酚。还包括毒素， 诸如假单胞杆菌内毒素和骨桥蛋白/尿桥蛋白、蛇毒和蜂毒。还包括糖蛋 白肿瘤-相关抗原，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、her-2/neu和前 列腺-特异性抗原(PSA；Henderson et al.，Advances in Immunology，62，pp. 217-56，1996)。
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器包括一种聚合物，此聚 合物包括一种或多种选自线型高聚物、支化聚合物、聚丙烯酰胺、琼脂糖、 水凝胶、纤维素、改性纤维素、交联聚乙烯醇、交联聚氧化乙烯和乙二醇 聚合物组成的组。除了常规的丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液或琼脂糖溶液之 外，结晶反应器可以包括各种单体。常规化学聚合胶中已知的是使用甲基 丙烯酸羟乙酯(hydroxyethylmethacrylate)和其它低-分子量丙烯酸酯类型的 化合物作为单体；已经有出售的“Lone-Ranger”凝胶。文献中也已经介绍了 使用以一种或多种丙烯酸酯-类基团取代的聚合物(Zewert and Harrington， ElectropHoresis 13：824-831，1992)，尤其适合于水与可混溶有机溶剂诸如 乙醇或丙酮的混合溶剂中的分离。形成单体的凝胶也可以是任何含有一个 光聚合活性基团的基本上水溶的分子，这种分子与能可以成交联的一种材 料组合，一旦聚合，这种组合就形成一种适合于特定类型电泳的凝胶。可 以添加到IEF缓冲液中的范例性的材料包括丙烯酰胺、与亚甲基-双-丙烯 酰胺或其它已知交联剂的组合；甲基丙烯酸羟乙酯和丙烯酸的其它低-分 子量(小于大约300道尔顿)衍生物、异丁烯酸、及其烷基-取代的衍生 物，诸如巴豆酸；乙烯基吡咯烷酮和其它低-分子量乙烯基和烯丙基化合 物；非-离子聚合物的乙烯衍生物、烯丙基衍生物、丙烯酸衍生物和甲基 丙烯酸衍生物，包括琼脂糖的这类衍生物(“Acrylaide”交联剂，FMC Corp.)、葡聚糖、和其它多糖和衍生物，诸如包括羟甲基纤维素的纤维 素等衍生物；聚乙烯醇；单体的、寡聚的和聚合的乙二醇衍生物，包括环 氧乙烷聚合物、1，2-环氧丙烷聚合物、环氧丁烷的聚合物，及其共聚物； 其它水-相容聚合物的丙烯酰基衍生物、乙烯基衍生物或烯丙基衍生物， 诸如聚HEMA(聚丙烯酸羟乙酯)、聚合N-异丙基丙烯酰胺(其是温度 敏感的)、马来酸聚合物和共聚物、部分水解的EVAC(乙烯与乙烯基乙 酸酯的聚合物)、乙烯亚胺、聚氨基酸、多聚核苷酸等、及这些亚基彼此 的共聚物和这些亚基与多种疏水化合物的共聚物，此疏水化合物诸如吡 啶、吡咯烷酮、噁唑烷、苯乙烯、和羟基酸等。可聚合的材料不必是完全 水溶性的，尤其是当凝胶形成的溶液中包括溶剂或表面活性剂时。
此外或者可替换地，IEF缓冲液可以包括可以由本领域中已知方法制 备的普通聚合物的衍生物。例如，向羟基附加烯丙基缩水甘油醚是已知的， 这是羟基与酸、酐或酰氯，诸如丙烯酸酐。胺易于用酰酐或氯化物衍生。
候选的非-丙烯酰胺单体可以包括，例如，烯丙基醇、HEMA([甲基] 丙烯酸羟乙酯)、聚乙二醇单丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇单 丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、乙烯基己内酰胺、乙烯基吡咯烷酮、烯丙 基缩水甘油葡聚糖、聚乙烯醇和纤维素的烯丙基缩水甘油衍生物以及衍生 物、乙烯基乙酸酯、和其它含有一个或多个丙烯酰基、乙烯基或烯丙基的 分子。
根据一个实施方案，包含一种聚合的IEF缓冲液的结晶反应器的尺寸 为，如大约20μm至大约5mm；长度为大约0.5mm至大约10mm。优选地， 包含一种聚合的IEF缓冲液的结晶反应器在浸没到缓冲室的缓冲溶液中 时保持其结构，尤其在缓冲溶液受电场作用时所述结晶反应器保持其结 构。
对结晶反应器包括一种聚合的IEF缓冲液的情况，在IEF过程中，如 果生物分子种类的等电点(pI)落在此IEF缓冲液覆盖的pH范围内，在 临近结晶反应器与外部环境之间的界面的位置形成一生物分子种类的浓 缩带。然后带中的此生物分子种类在结晶反应器内扩散，并且意想不到地 开始快速晶体生长。
如上所述，结晶反应器的聚合物可以是任何熟知和典型的胶凝剂，其 已知适合用于电泳目的。这种材料包括胶凝聚合物，其是充分地化学反应 性的以保证引导可电离的原子团，即酸性基团，诸如羧基团、硫酸基团、 磷酸基团等和含氮的碱性基团诸如氨基等。典型的合适材料是羟基聚合 物，包括纤维素、改性纤维素、交联聚乙烯醇和交联聚环氧乙烷。也可以 使用适宜的化学改性的交联聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶或琼脂糖凝胶。包 含一种聚合的IEF缓冲液的结晶反应器通常可以由提供一种缓冲液而制 备，此缓冲液由使用电泳领域中已知的聚合物和方法，添加一种聚合物而 聚合。见于例如Sambrook等人.(1989)ElectropHoresis buffers in Molecular Cloning(Nolan，C.ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，pp.B. 23-24.
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器是与一种固体基质连接 的。方便地，结晶反应器可以被支撑在一种基质上以提供足够的强度，基 质例如，多孔的载体基质诸如滤纸、棉或亚麻织物等、或其它合适的网状 材料。此外，也建议使用琼脂或琼脂糖凝胶的一些交联物以经得住电场的 作用。
根据又另一个实施方案，至少一个结晶反应器设在毛细管中。通常， 用于由X-射线结晶学收集衍射花样的晶体是小心地从其结晶介质分离并 插到毛细管中。使用牙蜡或硅脂将管和其内少量的用于保持水合的结晶介 质一起密封以隔绝空气(McPHerson et al.，Krieger Publishing，Malabar，p. 214，1989)。由使用毛细管中的结晶反应器而应用本发明的方法可不必如 此。
根据又另一个实施方案，本发明的方法包括提供多个结晶反应器。根 据又另一个实施方案，多个结晶反应器是连接的、结合的、或者以空间可 寻址的方式基本上接近固体基质。根据又另一个实施方案，本发明的方法 包括得到多个晶体，其中多个晶体可以在同一个结晶反应器中形成，也可 以在一个设备中包含的不同结晶反应器中形成。在一个设备中包含的不同 结晶反应器中的多个晶体可以是基本上同时形成和/或基本上在同一结晶 装置下形成。这样，本发明的方法和设备适合各种生物分子同时和/或在 类似条件和/或装置下高产量结晶。
本文使用的“固体基质”或“固定器”或“母体”是可互换的，是指一种惰 性的支撑元件，其包括至少一个结晶反应器。这个元件可以是一个带、膜、 芯片、片或任何其它包括至少一个结晶反应器的支撑构造。
根据又另一个实施方案，固定器包括一种材料，其电阻比结晶反应器 内包含的聚合物的电阻大。
根据又另一个实施方案，固定器包括一种非-传导材料。这种非-传导 材料可以选自聚-N-甲基异丁烯酰胺、丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯 乙烯组成的组。
根据另一个实施方案，固定器包括一种材料，其对生物分子是不可渗 透的，以避免蛋白质从一个腔中的结晶反应器扩散到任何其它腔中的结晶 反应器。
根据本发明的一个固定器是一种固体材料或半-固体材料，例如陶瓷、 玻璃、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)诸如甲基丙烯酸甲酯或凝胶，其 可以包含一个或多个结晶反应器，或者包含一个或多个适合包含结晶反应 器的腔。根据一个实施方案，形成固定器的材料是低传导性的。根据另一 个实施方案，固定器是部分地或整体地由一种对生物分子和离子都不可渗 透的材料制成。结晶反应器可以设置在固定器的表面，例如作为凝胶或作 为凝胶连接、结合或基本上邻接到基质，或者可以设置在固定器上蚀刻的 槽中，或者可以延伸穿过固定器，只要此结晶反应器可以接触电泳缓冲液。 固定器是可移动的或者固定在本发明设备的缓冲室中。
根据本发明的一个实施方案，如果结晶反应器延伸穿过母体，那么结 晶反应器的一侧面与电泳缓冲液接触，优选地用一种生物材料-不可渗透 的材料制成的层覆盖所述侧面。
包括多个腔的固定器，其中每个腔必要的含有一个结晶反应器，所述 腔可以由例如在固定器的一侧凿孔或通道穿到固定器的相对侧，用诸如琼 脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的聚合物填充此通道，与一种具有一预设pH范围 的凝固在凝胶中的IEF缓冲液混合而制造。固定器上的凹槽可以不延伸穿 过到固定器的相对侧。凹槽可以制造在固定器的任意一侧上。根据一个实 施方案，凹槽在固定器的一个侧面上。
根据又另一个实施方案，本发明的方法包括提供多个结晶反应器，它 们包括类似的或不同的IEF缓冲液。根据又另一个实施方案，多个结晶反 应器的pH范围不重叠。
根据又另一个实施方案，包括多个结晶反应器的固体基质选自由以下 组成的组：固定化的pH梯度(IPG)条，诸如ProteomIQTMIPG条(Proteome systems)、Servalyt PrecotesTM凝胶(Invitrogen，Inc.)、pH膜和出售的预 -制凝胶(如，Invitrogen，Inc.，Amersham PHarmacia Biotech，Stratagene， Ameresco Inc.，Bio-Rad Laboratories及其它)，附带条件是多个结晶反应 器的排列满足，或被改进以满足本发明的原理。优选地，根据本发明多个 结晶反应器形成一个非-连续的反应器列，每个反应器包括一种具有一个 pH范围的一种IEF缓冲液，其中每种IEF缓冲液覆盖的pH范围与非-连 续的反应器列中另一种IEF缓冲液的pH范围可以重合或可以不重合。
根据一些实施方案，本发明的方法提供了包括聚合的IEF缓冲液的多 个结晶反应器。多个结晶反应器可以是相同的，或者每个结晶反应器可以 包含不同的凝胶(聚合物)。任意地，多个结晶反应器包括不同浓度的同 一聚合物，导致多个结晶反应器表现不同的渗透性(例如，不同孔径)、 结构和粘度等。
可以使用市售的IPG条来实现本发明，假定每个IPG条包括多个隔 离的pH带，每个pH带包括一pH范围。然而，市售IPG条的缺点是， 每个隔离的pH带的体积和形状通常不适合晶体的形成，尤其是因为生物 分子的扩散限制在带内。这样，定制的IPG条是尤其适用于根据本发明的 原理得到晶体的。优化定制IPG条的设计，以促进其内生物分子的浓缩、 扩散和结晶。
定制IPG条典型的根据目前制备薄平面IPG凝胶结构的实践而制备， 此薄平面IPG凝胶结构连接于一个惰性基质，典型地是一片Mylar塑料， 其已经被处理以化学连接于一种丙烯酰胺凝胶(例如，GelbondTM PAG膜， FMC Corporation)。IPG凝胶典型的形成为矩形片，0.5mm厚、10-30cm 长(在分离方向上)和10cm宽。在平行通道施加多个样品到这样的凝胶 上，伴随的问题是蛋白质在各通道之间的扩散产生交叉污染。此情况下重 要的是在给定通道施加的所有蛋白质都在此通道中回收(这种情况下典型 的以2-D电泳)，已经有人证明把此凝胶分成窄条(典型的是3mm宽) 是必要的，然后其中每个窄条能作为单独凝胶跑电泳。因为一种样品的蛋 白质这样限制在此表现为单个条的凝胶的体积内，它将在此条中回收。IPG 技术中蛋白质的等电聚焦分离在此领域中广泛地描述了。IPG的概念公开 于美国专利No.4,130,470，并在之后的大量出版物中进一步描述。
可替换地，包括一种聚合IEF缓冲液的结晶反应器可以由连接剂连接 于固定器，诸如在美国专利No.4,243,507中所公开的。
本文使用的术语“IEF缓冲液”是指一种缓冲液，其含有在一个给定pH 值附近有缓冲能力(缓冲剂)的成分，或有机化以形成pH梯度的成分(例 如，两性电解质、固定化电解质或缓冲剂的组合)。
根据本发明的IEF缓冲液可以以粘性液体或浆或凝胶的形式，这样蛋 白质可以在电场中移动穿过IEF缓冲液，除非蛋白质的pI在IEF缓冲液 的pH范围内。根据本发明的一种IEF缓冲液可以包括其它成分，诸如尿 素、清洁剂和如所需的还原剂。令人满意的是，根据本发明的IEF缓冲液 在电场作用下功能稳定。
本文使用的术语“粘性液体”是指一种液体或其它介质，其具有一种优 化的粘度，其促进大分子在粘性液体中的扩散，并带有最小的对流运动， 优选没有对流运动，以及最小的无效沉降。
IEF缓冲液和含有它的结晶反应器可以由手工或由各种装置形成。例 如，IEF缓冲液可以被沉积(如，涂覆、印刷或点样)在基质表面上，或 者可以被固定在基质表面上，或者沉积在基质的槽或沟槽中。基质可以是 母体，诸如膜、或与母体同样材料制成的珠粒。
IEF缓冲液可以由一种装置制成，此装置混合一种酸性溶液和一种碱 性溶液以形成一种具有所需的pH值的缓冲液(“滴定仪”)。基于聚合的 目的，缓冲液还可以结合单体(如，丙烯酰胺)和聚合剂并载入另一个装 置(如，一个腔)，此装置把IEF缓冲液置于需要的位置。
根据一个实施方案，用于产生本发明的IEF缓冲液的两性电解质是一 套各种寡-氨基酸和/或寡羧酸，其是两性的(即，在酸性介质中带正电而 在碱性介质中带负电)、可溶的并且Mr值从大约300至1000u。用在本 发明的两性电解质可以制备或购买。例如，本领域中已知几种载体两性电 解质(如，pages 31-50，Righetti，P，G.，(1983)Isoelectric Focusing：Theory， Methodology and Applications，Eds.，Work and Burdon，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；美国专利3,485,736)。可替换地，购买的两性 电解质包括AmpHolines(LKB)、Servalytes(Serva)、Biolytes或 PHarmalytes(Amersham PHarmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。
固定化电解质(Immobilines)也可以用于制造本发明的IEF溶液。固 定化电解质是通式为CH2＝CH-CO-NH-R的非-两性的、双功能的丙烯酰胺 衍生物。根据本发明的使用的固定化电解质可以制备或购买。本领域中已 知的合成固定化电解质的方法，例如，Bjellquist et al.，(J.Biochem.BiopHys. Methods，6：317，1983)。固定化电解质可以与丙烯酰胺共聚以形成由固定 化的pH梯度组成的结晶反应器。根据本发明的pH梯度可以由混合两性 的或非-两性的缓冲液而形成。例如，这样的缓冲液组合描述于Allen，RC 等人，Gel ElectropHoresis and Isoelectric Focusing of Proteins：Selected Techniques，Berlin：Walter de Gruyter & Co.(1984)和美国专利 5,447,612(Bier)中。一些IEF缓冲剂包括的成分选自(1)50mM甘氨酸、 14mM NaOH；(2)50mM HEPES、12mM NaOH；(3)50mM THMA、 44.6mM HCl；(4)52mM柠檬酸、96mM Na2HPO4；(5)50mM BICINE、 18mM NaOH；(6)50mM DMGA、40mM NaOH组成的组。IEF缓冲液 在每个小室中产生的pH梯度可以具有狭窄的或宽的pH范围(如，分别 为pH6.8-pH7.8或pH6.8-pH12.8)。
本发明的方法中使用的电场由本发明的设备和方法的电源产生，可以 是此方法和设备能够容忍的任何电压，如100至10000伏，或500至10000 伏，或500至5000伏，假定产生的热可以在包含电泳缓冲液的整个缓冲 间中驱散，并且能由合适的冷却而调节。提供的电压可以是DC或AC。 可以提供DC和AC电流的电源和电极是市场上有售的并且是本领域中已 知的。
根据一个实施方案，电泳溶液的温度保持在0-30℃的范围内，电场在 50V/cm至2000V/cm之间。
根据又另一个实施方案，电场选自交流电场、直流电场组成的组。如 果含有IEF缓冲液的结晶反应器是闭合的，从而阻止电流从它进入结晶反 应器的的相对面穿出，那么根据一个实施方案，电场是可逆的。如果结晶 反应器是打开的，那么电场可以或者是直流的即单向的，或者是交流的。
本文使用的术语“缓冲液”或“缓冲溶液”或“电泳缓冲液”是可交换的， 用以描述一种溶液，它一方面或者包括一种弱酸(诸如碳酸)和此酸的一 种盐或者一种弱酸的至少一种酸性盐；另一方面或者包括一种弱碱(如氨) 和此碱的一种盐。具有了这些成分的一种缓冲液能够根据每种成分的浓度 建立起此溶液的pH。即使在由于其电阻而改变氢-离子浓度而添加酸或碱 之后，缓冲液还能够保持建立起的pH。一种所给缓冲液建立并保持一pH 的能力也称为“缓冲能力”。
根据又另一个实施方案，一种分离的基本纯的蛋白质的溶液可以用在 本发明中以得到蛋白质晶体。可以由任何合适的本领域中已知的蛋白纯化 方法得到纯的蛋白质，包括那些描述于Deutscher(Meth.Enzymology， 182： 83-89，1990)和Scopes(Protein Purification：Principles and Practice， Springer-Verlag，N.Y.，1982)中的方法。蛋白质纯化包括从其它生物材料中 分离所需的蛋白质，诸如从用编码所需蛋白质的重组核酸转化的细胞的细 胞成分中分离。例如，可以采用免疫亲和色谱法达到纯化，如，使用特异 性结合所需蛋白的抗体。
本文使用的术语“非纯化蛋白质”和“非高度纯化蛋白质”是可互换的， 以描述一种蛋白质，其还没有完全从成分中分离出，此成分不是其结构的 一部分，或者此成分在其天然状态中不是伴随此蛋白质的。典型地，一种 纯化的蛋白质在一蛋白样品中含有大约60至90％W/W的纯蛋白质、大约 95％和大约99％。用在本发明中的蛋白质在IEF步骤之前不必是高度纯 化的。
根据一个实施方案，本发明提供了一种溶解多种蛋白质和快速结晶一 种所选蛋白质的方法，包括：
(a)提供含有至少一生物分子种类的溶液；
(b)由电泳溶解此溶液在一种基质上，从而在基质上得到对应于至 少一生物分子种类的至少一带；
(c)从基质上分离一部分，此部分包括(b)中溶解的至少一带；
(d)提供至少一个结晶反应器，包括具有一pH范围的一种IEF缓 冲液，所述pH范围包含所述至少一带的pI；
(e)把所述至少一带与所述至少一个结晶反应器连接；
(f)引入电场到电泳缓冲液，从而在所述至少一个结晶反应器中产 生(b)中溶解的至少一生物分子种类的一种浓缩溶液；及
(g)允许(f)中浓缩溶液中的所述至少一生物分子种类在至少一个 结晶反应器中结晶。
根据又另一个实施方案，步骤(e)还包括将连接到至少一个结晶反 应器的至少一带放置在电泳缓冲液中。优选地，步骤(e)还包括搅拌电 泳缓冲液。有利地，步骤(g)还包括监控和/或检测蛋白质晶体的形成。
监控和/或检测晶体的形成可以由以下之一的装置达到：一种检测结 晶反应器中生物分子样品的装置；一种接收来自检测装置的数据的装置； 和一个用于处理收到的数据的装置。根据一个实施方案，一个扫描显微光 密度计检测、接收和处理来自结晶反应器的信号。
必要的用于检测结晶反应器中生物分子样品、接收来自检测装置的数 据、并处理收到的数据的一个或多个装置可以装配进一个计算机中。
可以设计一种检测装置以发射电磁辐射，其是同时或按顺序地发射到 一个通道上的一个范围的波长、多个波长、或一个波长。根据一个实施方 案，照明光源是单色的。例如，检测装置可以是一种定制的光度计，其在 对每个反应器发射一窄光谱的光之后，快速、连续地读出每个结晶反应器 在特定波长的吸收值。可替换地，可以设计检测装置以同时读出每个反应 器和/或对涉及每个反应器在多个波长下发射的电磁辐射的读数。
合适的检测装置包括，但不限于，肉眼、分光光度的检测装置、化学 发光的(chemiluminescent)检测装置、光度的/密度的检测装置、电化学 的或放射化学的检测工具，其依赖于生物分子是否标记以及标记的类型。 标记可以需要其它的成分以引起反应，此反应产生一个信号或者增强根据 上述方法的可检测的信号。合适信号产生的系统的详细描述可以见于美国 专利No.5,185,243。附加标记的技术细节是本领域中已知的，见于例如， Matthews，等人，Anal.Biochem.(1985)151：205-209和欧洲专利申请No. 0302175。
根据又另一个实施方案，步骤(b)的溶液由等电聚焦溶解在一种基 质上，从而在基质内得到对应于至少一生物分子的等电点的至少一个带。
根据又另一个实施方案，步骤(d)的IEF缓冲液的pH范围不超过 0.2pH单位，优选地不超过0.1pH单位，更优选地不超过0.02pH单位。
根据一个实施方案，实施本发明的方法，保持电泳溶液的温度在 0-30℃范围内。根据另一个实施方案，电泳溶液的温度保持在0-30℃的范 围内，电场在50V/cm至2000V/cm之间。
根据又另一个实施方案，本发明提供了多个结晶反应器，其中每个结 晶反应器的温度是独立于任何其它结晶反应器的温度的，优选地是不同 的。温度是可以调节以在本发明的方法中优化扩散和晶体生长的参数之
各种市售的温度-控制模块可以适用于本发明的上下文。适合模块的 范例是设计用于机器人的聚合酶链式反应(PCRs)的自动热循环装置， 其可以被调整以符合本发明的需要。例如，MJ Research的热循环装置 (MJR，Waltham，Mass.；如DNA EngineTM、DyadTM、Mini-Cycler、 PTC-100TM、TetradTM)以珀尔帖效应(Peltier)加热和AlpHaTM模块为 特征，其是可互换的并允许使用者快速地改变样品规格的加热块。一些这 样的循环装置以Hot BonnetTM加热的盖为特征，并且能用于多种样品规 格，包括微孔盘和平坦的显微镜载物片。另一种适合的系统是Smart Cyclerinstrument(CepHeid，Sunnyvale，Calif.)。此系统是基于company’s I-CORE微观流体基技术的、温度-控制模块，其允许每个样品处于不同的 实践条件下。Stratagene’s RoboCycler(La Jolla，Calif.)提供了另一种合适的 温度控制模块。RoboCycler特色为4种程序块并提供了一种简化优化的 梯度特征。这种循环装置的独特在于它采用一个机械臂来从一个块向另一 个块移动样品，其中每个块中的温度是不同的。
已经有一系列公开文件涉及开口(“样品井”)的各种构造，此开口用 于装载大分子和含有-大分子的样品到凝胶的表面，平板凝胶最通常地用 于蛋白质或核酸分离。在每个例子中，设计这些样品井，在所述大分子迁 移穿过溶解的凝胶之前，浓缩样品中的大分子到一个薄的起始区域。以下 的参考描述了装置的应用，其放置在相对于凝胶的位置以形成井：美国专 利No.5,304,292描述了可压缩的垫片在一个平板顶部上形成井壁的应用， 此处这些片的末端接触板的顶部边缘。美国专利No.5,164,065描述了与 DNA序列凝胶一起使用的一种鲨鱼齿梳。
快速结晶的设备
本发明也提供了用于快速结晶的设备。根据又另一个实施方案，本发 明提供了适于引导快速形成蛋白质晶体的一种设备，包括：
(a)至少一个结晶反应器，此至少一个结晶反应器包括一种IEF缓 冲液，此至少一个结晶反应器被包含在缓冲室中；
(b)产生电场的装置；以及可选的，
(c)用于循环包含在缓冲间中流体的装置。
根据一个实施方案，本发明的设备包括一个固定器，此固定器具有一 个上面和一个下面，此固定器包括至少一个结晶反应器，或者适于支撑包 括至少一个结晶反应器的基质，所述至少一个结晶反应器含有一种IEF缓 冲液，固定器包含在缓冲室中。根据另一个实施方案，固定器配置在至少 一个缓冲间中。根据某一实施方案，固定器是含有至少一个结晶反应器的 毛细管。
根据又另一个实施方案，本发明的设备还包括两个具有两个末端的盐 桥，每个盐桥的一个末端与固定器的一个末端接触，以及每个盐桥的一个 末端包含在至少一个缓冲室中。优选地，本发明的设备包含两个缓冲室， 这样每个缓冲室围绕一个盐桥的一个末端。
典型地，盐桥起到一个离子导体的作用，并且通常设在至少一个结晶 反应器和缓冲间内的缓冲液之间，结晶反应器包括一种生物分子溶液或含 有所述生物分子溶液的元件诸如固定器和/或基质。适于本发明的设备的 盐桥的例子包括玻璃、陶瓷材料或装满离子导体的塑料管，此离子导体可 以由溶解一种电解质诸如氯化钾或硝酸钾到琼脂中而得到。
根据另一个实施方案，缓冲间适于储存一种溶液，此溶液包括一种电 泳缓冲液和至少一类溶解在此电泳缓冲液中的生物分子。
根据又另一个实施方案，固定器具有至少一个腔，其中此至少一个腔 适于放置包含一种IEF缓冲液和一种聚合物的一个结晶反应器。
根据又另一个实施方案，固定器包括多个腔，每个腔包括一个包含一 种IEF缓冲液和一种聚合物的结晶反应器。
根据又另一个实施方案，多个结晶反应器中IEF缓冲液的pH范围不 重叠。
在描述的这类设备中的包括多个结晶反应器的固定器，可以以任何所 需的构造布置，例如水平串联的结晶反应器并排排列，并由惯用的间隔物 分开，或者垂直串联。
现在参照图1，本发明的设备包括一个缓冲室，其含有一对电极，即 阳极和阴极，以及电泳缓冲液。设备还含有结晶反应器，其包括一种固定 化的缓冲液(图1A)、毛细管中的结晶反应器(图1B)或包括多个不同 的和隔离的pH带的定制的IPG条(图1C)。
现在参照图2和图3，本发明的设备包括封闭于一个缓冲室(2)内 的一个缓冲间(1)、一个固定器(3)、多个包括结晶反应器(5)和电 极(6)的腔(4)。
根据一个实施方案，本发明的设备包括多个结晶反应器，每个结晶反 应器包括一种IEF缓冲液，任意地此IEF缓冲液是聚合的。多种IEF缓冲 液产生的pH范围的上限和下限可以是不同或可以是相同的。例如，结晶 反应器#1中的IEF缓冲液的pH范围可以开始于pH6.8结束于pH7.8，及 结晶反应器#2中的IEF缓冲液的pH范围可以开始于pH7.9结束于pH8.9。 而且结晶反应器#1与结晶反应器#2中IEF缓冲液之间的pH差可以是不 同的或可以是相同的pI单位。
根据又另一个实施方案，IEF缓冲液的pH范围可以是宽的、窄的或 极窄的，如覆盖0.1pH单位或更少、0.02pH单位或更少、或0.01pH单位 或更少。
根据又另一个实施方案，使用本发明的设备进行IEF步骤，其中缓冲 间包括电泳缓冲液，还包括一个包含多个腔固定器，所述腔含有多个结晶 反应器，此结晶反应器中含有IEF缓冲液。使用此装备，多个腔由物理分 离彼此分离，其基本上阻止了生物分子不是穿过电泳缓冲液而是直接从一 个结晶反应器移动向另一个。这样，生物分子主要是穿过电泳缓冲液从一 个结晶反应器向另一个移动。在另一个实施方案中，结晶反应器包括同样 的或者不同的pH范围。在另一个实施方案中，本发明包括大量的不连续 的、隔离的结晶反应器，其具有基本上不-重叠的pH范围，这样可以使用 一个单独装备结晶多种不同的蛋白质。而且，使用本发明的设备、系统和 方法，其中结晶反应器包括具有狭窄、优选地极其窄的pH范围的IEF缓 冲液，由于本发明方法的大的溶解能力，尤其是与常规的IEF凝胶比较， 可行的是在一个装备中结晶多个pI值差距为0.02pH单位或更小的不同蛋 白质。
根据此系统的一个结构，通过使用本发明的设备，假定含有结晶反应 器的固定器包括一种对生物分子是不可渗透的材料，避免了生物分子从一 个结晶反应器向一相邻的结晶反应器的扩散，如，在含有略微不同的pH 范围的IEF缓冲液的结晶反应器之间。
当以下术语出现在整个说明书和权利要求中，它们用于本发明的设备 的各元件，这些术语如下：术语“缓冲室”或“电泳缓冲室”是可互换地使用， 表示存储含有蛋白质溶液的缓冲液的容器或储蓄器。术语“母体”或“芯片” 或“阵列”或“固定器”是可互换地使用的，表示含有结晶反应器的元件。
快速结晶的应用
快速大分子结晶是对贮藏、药物设计和药物运输有很大工业价值的。 工业上也需要制备大量的结晶的大分子。本领域中没有已知的结晶工艺适 于工业-规模的生产，因为通常有晶体不生长的风险，和晶体事实上开始 生长了但需要很长时间以得到理想大小的晶体的不切实可行的情况。
产生快速有效的用于大-规模的大分子结晶尤其是蛋白质结晶的技术 的动机在于：
首先，期望产生纯的结晶状态的大分子。这种晶体构成蛋白质或核酸 用于治疗和疫苗的配药制剂的尤其有利的形式。本发明提供了结晶大分子 的快速方法。可以引导大-规模结晶作为临床制造工艺的最终纯化步骤和/ 或浓缩步骤，诸如用于制造治疗剂和疫苗的工艺。而且，大-规模结晶可 以代替制造工艺中的一些纯化步骤。例如，蛋白质结晶可以使蛋白质制剂 的生产流线化而使得它的可提供性更强。
第二，贮存大分子晶体比贮存溶液有利，由于所有反应率的明显减少， 溶液中发生的大分子的相互作用在晶体状态被阻止或显著减少了。这样， 结晶状态尤其适于贮存生物大分子的混合物。晶体的保存期可以通过把晶 体封装在一种母体中而进一步延长，此母体含有一种聚合载体以形成如美 国专利6,541,606公开的组合物。此组合物增强保存蛋白质的天然的生物 活性的三级结构并产生一种储蓄器，其在需要的时间和位置缓慢地释放活 性蛋白质。
第三，能够容易地再生固体结晶制品以产生易于使用的具有较高蛋白 质浓度的非肠道制剂。当制剂打算用于皮下给药时，认为这种蛋白质浓度 是尤其有用的，见于例如国际专利出版物No.WO97/04801。用于皮下给 药，注射体积1.5ml或更少是较好地耐受性的。因此，对给药剂量为每周 1mg/kg的蛋白质，需要蛋白质浓度为至少50mg/ml，优选地是 100-200mg/ml。由于聚集问题，在液体制剂中难以达到这样的浓度。使用 本发明方法得到的蛋白质晶体能容易地达到这样的浓度。
第四，蛋白质晶体也成为用于药物剂量制剂的一种尤其有利的形式。 晶体可以用作体内缓慢释放制剂的一个基础。本领域技术人员将认识到， 颗粒大小对晶体的分解和活性的释放是重要的。人们也已经知道，如果晶 体具有大致均匀的颗粒大小并且不含有无定形沉淀，释放率将更可预测， 例如见于欧洲专利No.265,214。这样，在可植入装置中可有利地使用蛋 白质晶体，例如见于国际专利出版物No.WO96/40049。植入的储蓄器通 常为25-250μl的数量级。在这种体积限制下，优选的是高浓度(大于10％) 和量最小的悬浮载体的制剂。由本发明方法得到的蛋白质晶体可以容易地 在非-含水悬浮液中以这样的高浓度配制。
第五，晶体的另一个优点是可以操纵一些变量以调节大分子随着时间 的释放。例如，晶体大小、形状、带有影响溶解的赋形剂的制剂、交联、 交联的水平和在聚合物母体中的封装，以上这些都可以调节以产生生物分 子的运输载体。
本发明提供了上述的需要。本发明方法的以下优点使它适于大分子的 高产量工业结晶：
1.从少量稀的、不必纯化的蛋白质样品生长晶体的能力。
2.在几小时甚至几分钟内，快速地产生浓缩的蛋白质溶液或浓缩蛋 白质带。
3.集聚在结晶反应器中的大分子是不带电或带有很小电荷的，这样 静电排斥是可以忽略或不存在的。
4.在形成浓缩的大分子溶液或形成晶体过程中不发生沉积、对流或 沉淀。
5.晶体生长可以是极其快的，以分钟或小时为数量级的时间内。
6.由此方法的IEF元件在结晶过程中的蛋白质样品加工中的纯化， 排除了杂质和其它异构重整形式的可能污染物，这样本方法相对于现有的 结晶方法能够以较不纯的蛋白样品操作。
7.选择应用本发明的方法，使用毛细管中的结晶反应器尤其适于结 晶学，因为不需要从反应器转移晶体到另一个不同环境。这样的转移有破 坏晶体的结构和稳定性的风险。
本发明方法的前述优点使它适于对所给蛋白质的单独异构重整形式 同时分离和结晶。
根据一个实施方案，本发明提供了用于高产量快速大分子结晶的小型 化和自动的设备和方法。可以构造本发明的设备以具有自动的互相作用元 件，例如，用于用包括IEF缓冲液(固定化电解质、两性电解质等)的预 -聚合的结晶反应器以填充腔的滴定器、用于从腔或结晶反应器回收蛋白 晶体的提出器、和用于监控和记录结晶反应器中蛋白晶体形成的装置。
据本发明的原理形成的晶体的进一步稳定性由用于此目的的本领域 中任何已知方法来达到。例如，晶体可以被封装如在美国专利6,541,606 中公开的，或者插入到一个毛细管中，然后使用牙蜡或硅脂把毛细管和其 内少量的保持水合的结晶介质一起密封以隔绝空气(McPHerson et al.， ibid)。
根据本发明的方法和设备的结晶工艺的最优化，可以通过一个单个试 验得到，此试验使用带有不同凝胶浓度(孔径、扩散常数)和各种蛋白稀 释物的多个结晶反应器。每个结晶反应器也可以置于不同温度下。
实施例
实施例1-结晶p53蛋白的一成分
提供3种蛋白样品：
(a)p53人DBD[pI(理论的)＝8.83]
(b)来自秀丽线虫(C Elegans)的β-转录因子[pI(理论的)＝5.98]
(c)人类β-转录因子-[pI(理论的)＝5.5]
所有三种样品都在pH3-10的市售IPG条(Amersham)上以起始IEF分 析确定特定蛋白质的pH(图4)。如图4中可见，发现三种“纯化的”蛋白 质溶液中的每一种都被发现具有大量不同蛋白质带。
用于根据本发明方法结晶，选择了一条相应于特定蛋白质某一pI的 带。使用自制的pH值邻近理论pI的IPG条和设备来实现结晶，如图4C 所示。快速地形成很少的晶体。晶体从IPG凝胶萃取出，在2.8埃分辨率 从p53样品得到的散射图形是典型的多-晶体样品。
实施例2-由使用一种IPG缩放条结晶一种IEF分离的蛋白质的可行性示 范
因为我们的结晶技术只需要微克量的蛋白质，由IEF分离可以作为得 到晶体的材料来源。对从p53样品分离得到的带之中的一条进行这样的实 验，如图5所见。
采用以下的步骤：从我们选择的IPG条切下在pH～9.6的带，选择使 用图4C表示的系统来结晶。为了这个目的，制备范围在9.5-9.75、差为 0.05的短IPG缩放条。用标准密度梯度法制备此条。从IEF试验切下的蛋 白质带用聚丙烯酰胺粘到靠近IPG条边缘上。此条放在图4C所示电泳室 顶部上。标准IEF步骤得到分离片段的聚焦和结晶，此分离片断产生高质 量晶体，如图6A所示。分辨率为2.4埃的衍射花样表现于图6B。
实施例3-肌红蛋白结晶
在1.5ml水中溶解马心脏肌红蛋白(75μg)，并导入结晶设备中。此 溶液作为IEF步骤的电泳缓冲液(pH＝7.00)。ImmobilineTM缓冲液 (Amersham)聚合到10％聚丙烯酰胺凝胶圆柱形腔中，其直径1mm、深 1mm(pH＝6.80)。在以下条件下进行IEF分离：1200V、30min、电极间距 离为0.5cm。
在4℃强烈摇动的设备中进行IEF，以促进蛋白质在缓冲溶液中的迁 移。对IEF步骤进行的有效标准表明，在凝胶腔中聚集的蛋白质的量，是 溶液中总蛋白质的大约50％。
在显微镜下对凝胶腔的检查表明凝胶中有高度形成的结晶结构(图 7A)。
实施例4-血红蛋白S结晶
血红蛋白S的溶液(水中1μg/ml；Sigma)、pI＝7.0，通过等电聚焦 浓缩到一种pH范围为6.9-7.05的pH缓冲液(4％聚丙烯酰胺凝胶中的 ImmobilineTM)中。在25℃下，施加1000V/cm的电场30分钟。30分钟 后得到一种400μm长的晶体(图7B)。
实施例5-藻青蛋白结晶
在1μg/ml的市售的藻青蛋白(1μg；Sigma)溶液中，pI大约为4.5， 置于pH范围为4.4-4.6的pH缓冲液(4％聚丙烯酰胺胶中的ImmobilineTM) 中进行IEF步骤。等电聚焦条件是：25℃、100V/cm的电场、30分钟试 验时间。30分钟后得到晶体(图8A)。
类似地，得到醇脱氢酶(图8B)和谷氨酸脱氢酶(GDH；图9A)的 晶体。
实施例6-水通道蛋白3结晶
通常认为膜蛋白对结构确定最重要的蛋白质。不幸地，用于蛋白质结 晶的大多数标准方法没能产生膜蛋白的晶体。本实施例证明了本发明的方 法使水通道蛋白结晶的能力，水通道蛋白是最重要的膜蛋白之一。
pI＝6.7的鼠水通道蛋白3的溶液(1μg/ml；Alpha Diagnostic International)在含有水和AmpholinTM(Amersham)的电泳缓冲液中，用 于结晶步骤。在pH凝胶腔(4％聚丙烯酰胺凝胶，pH 6.65-6.8)中蛋白质 的浓缩步骤由IEF进行，使用以下条件：试验时间40分钟、25℃和 100V/cm。得到的晶体展示于图9B。
实施例7-牛碳酸酐酶结晶
牛碳酸酐酶的溶液(1μg；Sigma)，pI为5.95，通过IEF浓缩到 pH5.8-6.0的pH凝胶间(腔；4％聚丙烯酰胺)中。此浓缩步骤在25℃和 100V/cm电场中耗时40分钟。40分钟后，得到晶体(图10)。
实施例8-胃蛋白酶-4、肌酸激酶1、β-人生长因子、抗生物素蛋白、赫赛 汀、Ly1溶菌酶、核糖核酸酶-1和前列腺素结晶
胃蛋白酶-4、肌酸激酶(CK)、β-人类生长因子(βhGF)、抗生物素蛋 白、赫赛汀、Ly1溶菌酶、核糖核酸酶-1(RNAse-1)和前列腺素的蛋白质结 晶，操作如表1详述。所得到的晶体和/或结晶蛋白质的衍射片断见于图 11-15。
表1：   蛋白质   pI   反应成分   电场   (V/cm)   晶体形成   时间(h)   胃蛋白酶   1.0   4％PAAG1水   1000   2   CK   6.57   6％PAAG谷氨酸   -Tris(1mM)   1000   3   β-hGF   4.5   4％PAAG谷氨酸   -HEPES(1mM)   1000   2   抗生物素   蛋白   10.0   6％PAAG   0.1％载体两性电解质   (pH8-11)   500   4   赫赛汀   9.4   4％PAAG   0.1％载体两性电解质   (pH8-11)   500   4   Ly1   10.7   6％PAAG   0.1％载体两性电解质   (pH8-11)   1000   2   RNAse-1   7.8   4％PAAG谷氨酸   -HEPES(1mM)   500   7   前列腺素   4.6   6％PAAG谷氨酸   -HEPES(1mM)   1000   10
1聚丙烯酰胺胶
特定实施方案的以上描述将十分完全地揭示本发明的一般性质，以至 于其他人可以通过采用现有的知识易于调整和/或适于这样的实施方案的 各种应用，而没有不适当试验和没有偏离一般概念，因此这样的调适和改 进应该并且倾向于包括在所公开的实施方案的等价的意义和范围内。需要 人们理解的是，本文采用的措词和术语学是为了描述本发明而非限制本发 明。用于实现各种所公开的功能的工具、材料、和步骤可以采用各种可替 换的形式而不偏离本发明。