官能化的单壁碳纳米管
阅读：500发布：2020-05-11
专利汇可以提供官能化的单壁碳纳米管专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且石墨 纳米管 ，其包括管状的 富勒烯 (通称为“滤线器管”)和原 纤维 ，其通过化学取代或通过官能化 位置 的 吸附 而官能化。更具体地，本 发明 涉及直径小于5纳米的单壁 碳 纳米管，其被化学部分均匀或非均匀地取代或者吸附了某些环状化合物，形成由这些官能化原纤维互相连接而组成的络合结构。本发明也涉及引导这些化合物到所述单壁 碳纳米管 的表面的方法。本发明进一步涉及官能化的 单壁碳纳米管 的用途。，下面是官能化的单壁碳纳米管专利的具体信息内容。
2.一种下列通式物质的组合物：
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个R都相同，并选自SO3H、COOH、NH2、OH、R’CHOH、 CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，
y是等于或小于3的整数，
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、或芳烷基、环芳基、或聚(烷基醚)，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根.
3.一种下列通式物质的组合物：
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个R可相同或不同，并选自SO3H、COOH、NH2、OH、R’CHOH、 CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，
y是等于或小于3的整数，
R’选自氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基、环芳基或聚(烷基醚)，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根，
并且进一步地条件是如果每个R都是包含氧的基团，则不存在 COOH。
4.一种下列通式物质的组合物：
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个R’是烷基、芳基、环烷基、芳烷基、环芳基或聚(烷基醚)，
A选自
或C＝Y,
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、核苷酸、寡核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’N+(R’)3X-、R’SiR’3、 R’Si(OR’)yR’3-y、R’Si(O-SiR’2)OR’、R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、 (C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、R’和
y是等于或小于3的整数，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数。
5.权利要求3的组合物，其中
A是
或
R’是H，并且
Y是选自下列的氨基酸：赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天 冬氨酸和谷氨酸。
6.一种下列通式物质的组合物：
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，a是小 于10的整数，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、核苷酸、寡核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’N+(R’)3X-、R’SiR’3、 R’Si(OR’)yR’3-y、R’Si(O-SiR’2)OR’、R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、 (C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、R’和
y是等于或小于3的整数，
R’是烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
X’是多核芳族、多异核芳族或金属多异核芳族部分或平面的四硫 代草酸金属盐，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数。
7.一种产生下列通式物质的组合物的方法，其中
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基、环芳基或聚(烷基醚)，
所述方法包括下列步骤：在足以形成具有通式
的官能化纳米管的条件下，将表面碳与具有通式R’CH2OH的化合物 在自由基引发剂存在下反应。
8.权利要求6的方法，其中所述自由基引发剂是过氧化苯甲酰。
9.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’N+(R’)3X-、 R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、 R’和
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数，
所述方法包括下列步骤：
(a)将表面碳和至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成具 有通式
的取代的单壁碳纳米管，其中每个R都相同并选自SO3H、COOH、 NH2、OH、CH(R’)OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、 COOR’、SR’、SiR’3、Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、 AlR’2、Hg-X、TlZ2和Mg-X，并且y是等于或小于3的整数；和
(b)将取代的单壁碳纳米管
与至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成通式
的官能化的单壁碳纳米管。
10.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’N+(R’)3X-、 R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、 R’和
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数，
所述方法包括下列步骤：
(a)将表面碳和至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成具 有通式
的取代的单壁碳纳米管，其中每个R选自SO3H、COOH、NH2、OH、 CH(R’)OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、 SiR’3、Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2 和Mg-X，并且y是等于或小于3的整数；和
(b)将取代的单壁碳纳米管
与至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成通式
的官能化的单壁碳纳米管。
11.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’N+(R’)3X-、 R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、 R’和
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数，
所述方法包括下列步骤：将取代的单壁碳纳米管
和至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成通式
的官能化的单壁碳纳米管，其中每个R都相同，并选自SO3H、COOH、 NH2、OH、CH(R’)OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、 COOR’、SR’、SiR’3、Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、 AlR’2、Hg-X、TlZ2和Mg-X，并且y是等于或小于3的整数。
12.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’N+(R’)3X-、 R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、 R’和
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数，
所述方法包括下列步骤：将取代的单壁碳纳米管
和至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成通式
的官能化的单壁碳纳米管，其中每个R都相同，并选自SO3H、COOH、 NH2、OH、CH(R’)OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、 COOR’、SR’、SiR’3、Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、 AlR’2、Hg-X、TlZ2和Mg-X，并且y是等于或小于3的整数。
13.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
R’是烷基、芳基、环烷基、芳烷基、环芳基或聚(烷基醚)，
X是卤化物，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-NH2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’R”、 R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、R’ 和
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根，
所述方法包括下列步骤：将具有式
的取代的单壁碳纳米管和至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形 成具有通式
的官能化的单壁碳纳米管，其中每个R都相同，并选自SO3H、COOH、 NH2、OH、CH(R’)OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、 COOR’、SR’、SiR’3、Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、 AlR’2、Hg-X、TlZ2和Mg-X，并且y是等于或小于3的整数.
14.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
其中n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，a 是0或小于10的整数，
每个R选自SO3H、COOH、NH2、OH、CH(R’)OH、CHO、CN、 COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、Si(-OR’-)yR’3-y、 Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和Mg-X，
y是等于或小于3的整数，
R’是烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
X是卤化物，
X’是多核芳族、多异核芳族或金属多异核芳族部分或平面的四硫 代草酸金属盐，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根，
所述方法包括以下步骤：在足以形成具有通式
的官能化的单壁碳纳米管的条件下，将至少一种适当的大环化合物吸 附到单壁碳纳米管的表面上。
15.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，a是小 于10的整数，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-NH2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’-R”、 R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、R’ 和
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
X’是多核芳族、多异核芳族或金属多异核芳族部分或平面的四硫 代草酸金属盐，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数，
所述方法包括下列步骤：
(a)将至少一种适当的大环化合物吸附到单壁碳纳米管的表面 上，吸附条件足以形成具有通式
的取代的单壁碳纳米管，其中每个R选自SO3H、COOH、NH2、 OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，并且y是等于或小于3的整数；和
(b)将取代的纳米管
与至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成具有通式
的官能化的单壁碳纳米管。
16.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，a是小 于10的整数，
每个A选自
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、寡核苷酸、核苷酸、抗原 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-NH2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’SiR’3、R’-R”、 R’-N-CO、(C2H4O)wH、(C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、R’ 和
R’是烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，
X’是多核芳族、多异核芳族或金属多异核芳族部分或平面的四硫 代草酸金属盐，
Z是羧酸根或三氟乙酸根，且
w是大于1且小于200的整数，
所述方法包括下列步骤：将取代的单壁碳纳米管
和至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成具有通式
的官能化的单壁碳纳米管，其中每个R选自SO3H、COOH、NH2、 OH、CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，并且y是等于或小于3的整数。
17.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
其中n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
R’是烷基、芳基、环烷基或芳烷基，
所述方法包括下列步骤：
将表面碳与至少一种适当的试剂反应，反应条件足以形成具有通 式
的官能化的单壁碳纳米管；
将官能化的单壁碳纳米管与具有2个或多个氨基的化合物反应， 反应条件足以形成具有通式
的官能化的单壁碳纳米管.
18.一种形成下列通式物质的组合物的方法
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个R都相同，并选自SO3H、COOH、NH2、OH、CH(R’)OH、 CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，
y是等于或小于3的整数，
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基或环芳基，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基或氟代芳烷基，
X是卤化物，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根，
所述方法包括下列步骤：将表面碳与至少一种酶反应，该酶能够 作为底物接受单壁碳纳米管并在至少一种酶进行化学反应可接受的条 件下进行化学反应，在水混悬液中形成通式[CnHL]Rm的物质的组合 物。
19.权利要求17的方法，其中Rm是-OH并且酶是细胞色素p450 酶或过氧化酶.
20.一种形成下列通式物质的组合物的方法，
其中碳原子Cn是直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米 管的表面碳，
n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
所述方法包括下列步骤：
将表面碳与硝酸或硫酸反应以形成硝化的单壁碳纳米管；和
还原该单壁碳纳米管以形成
21.一种用官能团均匀取代直径小于5纳米的单壁碳纳米管的表 面的方法，所述方法包括将所述直径小于5纳米的单壁碳纳米管与有 效量的能均匀取代所述单壁碳纳米管表面的官能团的试剂接触.
22.权利要求20的方法，其中试剂是酞菁.
23.权利要求20的方法，其中试剂是酞菁四磺酸镍(II)(四钠盐) 或1，4，8，11，15，18，22，25-八丁氧基-29H，31H-酞菁。
24.通过如下方法制得的直径小于5纳米的表面修饰的单壁碳纳 米管：将所述单壁碳纳米管与有效量的试剂接触，以取代所述单壁碳 纳米管表面的官能团。
25.权利要求23的表面修饰的单壁碳纳米管，其中试剂是酞菁。
26.权利要求23的表面修饰的单壁碳纳米管，其中试剂是酞菁四 磺酸镍(II)(四钠盐)或1，4，8，11，15，18，22，25-八丁氧基-29H，31H-酞菁。
27.一种连接蛋白质和纳米管的方法，所述方法包括下列步骤：
在足以在NHS酯和蛋白质的胺基之间形成共价键的条件下，将 携带NHS酯基的直径小于5纳米的官能化的单壁碳纳米管与蛋白质 接触。
28.一种电极，所述电极包含直径小于5纳米的官能化的单壁碳 纳米管。
29.权利要求27的电极，其中该电极是多孔流通电极。
30.权利要求27所述的电极，其中官能化的单壁碳纳米管是酞菁 取代的纳米管.
31.一种多孔材料，所述材料包含多个官能化的单壁碳纳米管网 状物，其中所述官能化的单壁碳纳米管网状物包含通过至少一个连接 部分与官能团连接的至少两个官能化原纤维，其中所述连接部分是双 功能的或多功能的。
32.一种从样品中分离感兴趣的溶质的方法，所述方法包括下列 步骤：
在足以形成官能化的单壁碳纳米管的条件下，用至少一种适当的 试剂物理或化学修饰直径小于5纳米的单壁碳纳米管；
固定能将感兴趣的溶质结合到官能化的单壁碳纳米管上的物质； 和
在足以使感兴趣的溶质与固定在官能化的单壁碳纳米管上的物质 相结合的条件下，将取代的单壁碳纳米管暴露在含感兴趣的溶质的成 分中。
33.权利要求31的方法，其中感兴趣的溶质是蛋白质.
34.权利要求31的方法，所述方法还包括恢复该官能化的单壁碳 纳米管的步骤。
35.权利要求31的方法，其中官能化的单壁碳纳米管是多孔物的 形式。
36.权利要求31的方法，其中官能化的单壁碳纳米管是填充柱的 形式。
37.权利要求31的方法，其中该结合是可逆的。
38.权利要求31的方法，其中该结合是离子相互作用。
39.权利要求31的方法，其中该结合是疏水相互作用.
40.权利要求31的方法，其中该结合是通过特定的分子识别。
41.一种聚合物珠，所述聚合物珠包含直径小于25μ的基本上球 形的珠，其与多个直径小于5纳米的官能化的单壁碳纳米管相连。
42.权利要求40的聚合物珠，其中该珠是磁性的.
43.一种催化反应的方法，其中至少一种反应物转变成至少一种 产物，所述方法包括下列步骤：
在足以形成官能化的单壁碳纳米管的条件下，用至少一种适当的 试剂物理或化学修饰直径小于5纳米的单壁碳纳米管的表面碳；
固定能催化官能化的单壁碳纳米管上的反应的生物催化剂；和
在足以使试剂转变成产品的条件下，将官能化的单壁碳纳米管与 试剂接触。
44.权利要求42的方法，所述方法还包括在完全反应后恢复官能 化单壁碳纳米管的步骤.
45.权利要求42的方法，其中官能化的单壁碳纳米管是多孔物的 形式.
46.权利要求42的方法，其中官能化的单壁碳纳米管是填充柱的 形式。
47.合成肽的方法，所述方法包括下列步骤：将肽的末端氨基酸 通过可逆的连接子结合到直径小于5纳米的单壁碳纳米管上。
48.权利要求46的方法，其中连接子是4-(羟甲基)苯氧基乙酸。
发明领域
[0002]本发明广义地涉及石墨纳米管，其包括管状的富勒烯(通 称为”滤线器管”)和原纤维，其通过化学取代或通过官能化位置的吸 附而官能化.更具体地，本发明涉及单壁碳纳米管，其被化学部分均 匀或非均匀地取代或者吸附了某些环状化合物，形成由这些官能化原 纤维互相连接而组成的络合结构.本发明也涉及引导这些化合物到单 壁碳纳米管的表面的方法。
发明背景
[0003]本发明属于亚微米的石墨原纤维领域，有时称作蒸汽生长 碳纤维.碳原纤维是蠕虫样的碳沉积物，其直径小于0.1μ，优选小于 0.5μ，甚至更优选小于0.2μ.它们以各种形式存在，通过在金属表 面各种含碳气体催化分解而制得。自从有了电子显微镜，就几乎可以 观测到这些蠕虫样碳沉积物.早期较好的勘查和参照是由Baker和 Harris，Chemistry and Physics of Carbon， Walker and Thrower ed.， Vol.14，1978，p.83发现的，在此通过参考将其引入.也可见于 Rodriguez，N.，J.Mater.Research.Vol.8，p.3233(1993)，通过参 考引入本文.
[0004]在1976年，Endo等人(参见Obelin，A.and Endo，M.， J.of Crystal Growth.Vol.32(1976)，pp.335-349，通过参考引入本文) 阐释了这种碳原纤维生长的基本机理。该过程由金属催化颗粒开始， 在含碳氢化合物的气体的存在下，在碳中变成过饱和.根据Endo等 人，挤出了圆柱状的有序的石墨核心，立即被外层的热解沉积石墨所 包衣。这些具有热解的外包衣的原纤维直径超过了0.1μ，更典型地为 0.2到0.5μ.
[0005]1983年，通过参考引入本文的Tennent的U.S.4,663,230 在生长的圆柱状有序的石墨核心方面取得了成功，其没有被热解碳所 污染。因此Tennent的发明提供了直径更小的原纤维，典型地是35 到700(0.0035到0.070μ)，并得到了有序的，”生长样的”石墨表面。 也生长出了结构完美程度较小的原纤维碳，但也不含热解碳外层。
[0006]在本申请中官能化的原纤维、滤线器管和纳米管是可以与 作为强化材料的商业可用的长碳纤维区别开的.与具有所需的较大但 不可避免地长宽比有限的原纤维相反，长碳纤维的长宽比(L/D)为至少 104，通常为106或更大。长纤维的直径也比原纤维大得多，一般>1.0 μ，典型地是5到7μ。
[0007]长碳纤维是由有机前体纤维，通常是人造丝、聚丙烯腈 (PAN)和pitch的热解而制成的。因此，它们的结构中可以包括杂原子。” 如所制备”的长碳纤维的石墨性质各不相同，但它们都可以用于后续 的石墨化步骤。石墨化程度、定向和石墨平面的结晶度的不同，如果 存在，则杂原子的可能存在和甚至底物直径的局对差异会使长纤维成 为纳米纤维化学的较弱的前体。
[0008]Tennent的U.S.4,663,230描述的碳原纤维，不含长热碳 外包衣并且具有基本上与原纤维轴平行的多个石墨外层.这样，它们 的特征就在于具有c-轴，该轴与石墨弯曲层的切线垂直，基本上与它 们的柱轴垂直。它们一般直径不超过0.1μ，长度于直径的比至少为5。 预计它们基本上不含长热碳外包衣，即由用于制备它们而进料的气体 的热裂化而导致的热解的沉积碳.
[0009]通过参考引入本文的Tennent等人的U.S.5,171,560描述 的碳原纤维，不含热外包衣并具有基本上与原纤维轴平行的石墨层， 以使得所述曾在所述原纤维轴上的投影延伸至少2个原纤维直径的距 离。典型地，这些原纤维基本上是圆柱状，直径基本恒定的石墨纳米 管，包含c-轴基本与圆柱轴垂直的圆柱状石墨片.它们基本上不含热 解沉积的碳，直径小于0.1μ并且长度直径比大于5.本发明主要关 注的正是这些纤维。
[0010]对于碳原纤维聚集物信息的更详细描述可以参见Snyder 等人，1988年1月28日提交的U.S.专利申请序列号149，573，和1989 年1月28日提交的PCT申请US89/00322(”碳原纤维”)WO 89/07163，和Moy等人1989年9月28日提交的，U.S.专利申请序 列号413，837和1990年9月27日提交的PCT申请US90/05498(” 原纤维聚集物及其制备方法”)WO 91/05089，所有这些专利都指定给 了与本发明相同的受让人，在此通过参考将它们引入本文。
[0011]通过参考引入本文的Moy等人1992年5月22日提交的 USSN 07/887,307描述的用聚集物制备的原纤维，该聚集物具有不同 的宏观形态学(通过扫描电子显微镜术确定)，其中它们随机相互缠绕 形成类似于鸟巢(”BN”)的原纤维的缠绕球；或该纤维用下列的聚集 物制备，该聚集物包括从较直到轻微弯曲或扭结的碳原纤维的束，其 中碳原纤维具有基本上相同的相对定向，并具有峡谷纱(”CY”)的现 象，例如每个纤维(弯曲或扭结的沉积个体)的纵轴以与束中外围原 纤维相同的方向延伸；或该纤维用下列的聚集物制备，该聚集物包括 从较直到轻微弯曲或扭结的原纤维，其相互较宽松地缠绕形成”开放 网”(”ON”)结构。在开放网结构中，纤维缠绕的程度大于在峡谷纱聚 集物(其中个体纤维具有基本上相同的相对定向)中所观察到的程度， 但小于鸟巢的缠绕程度。CY和ON聚集物比BN更易于分散，这使 得它们可以用于需要整个结构都具有均匀性质的络合结构中。
[0012]当石墨层在原纤维层在原纤维轴上的投影延伸距离小于2 个原纤维直径时，在横截面中，石墨纳米纤维的碳平面就会出现鱼骨 的形状。这用术语称作鱼骨原纤维。通过参考引入本文的Geus的U.S. 4,855,091提供了制备基本上不含热解外包衣的鱼骨原纤维的方法.这 些原纤维也可以用于实施本发明。
[0013]与上述催化生长的原纤维类似的碳纳米管的形态会在高温 碳弧中生长(Iijima，Nature 354 56 1991)。现在已经普遍接受(Weaver， Science 265 1994)，这些弧-生长的纳米纤维具有与较早的Tennent的 催化生长纤维相同的形态学。弧生长碳纳米纤维在本发明中也是有用 的。
[0014]自1993年”Single-shell碳纳米管of 1-nm diameter”，S Iijima和T Ichihashi，Nature，vol.363，p.603(1993)和”Cobalt- catalysed growth of碳纳米管with single-atomic-layer walls”，D S Bethune，C H Kiang，M S DeVries，G Gorman，R Savoy和R Beyers Nature，vol.363，p.605(1993)报道以来，已经公开了单壁碳纳米管 及其制备方法，在此通过参考将这两篇文章引入本文.
[0015]在Moy的U.S.6,221,330中也披露了单壁碳纳米管， 在此通过参考将其引入本文。Moy公开了制备空心单壁碳纳米管的方 法，包括首先形成气相混合物原料气来催化分解一种或多种气体碳化 合物，其中原料气包含一种或多种气体碳化合物和气相含金属的化合 物，其中每种碳化合物包含1到6个碳原子并仅包含H、O、N、S或 Cl作为杂原子，任选与氢混合，气相含金属的化合物是在反应条件下 对所述分解反应不稳定的化合物，气相含金属的化合物形成的含金属 的催化剂在反应条件下发挥分解催化作用；然后在分解反应条件下进 行所述的分解反应，这样就制成了所述的纳米管.本发明涉及一种气 相反应，其中将气相含金属的化合物引入到也含气态碳源的反应混合 物中。该碳源典型地是具有杂原子H、O、N、S或Cl的C1到C6的 化合物，任选与氢混合物。一氧化碳或一氧化碳和氢气是优选的碳原 料。据信，反应区温度从约400℃提高到1300℃，压力在约0到约100 p.s.i.g.之间，可以使气相含金属的化合物分解成含金属的催化剂。可 以分解成金属原子或部分分解的中间体物质.含金属的催化剂1)催 化CO分解并(2)催化SWNT形成。因此，本发明也涉及通过碳化 合物的催化分解形成SWNT.
[0016]U.S.6,221,330的发明在一些实施方案中使用了气溶胶技 术，其中将含金属的催化剂的气溶胶引入到反应混合物中。制备SWNT 的气溶胶法的优点在于，可以制备均匀大小和比例的催化剂颗粒，这 样该方法就可以用于有效和连续的商业或工业生产。先前讨论的电弧 放电和激光沉积法不能经济地放大，以用于商业或工业生产。在本发 明中有用的含金属的化合物包括金属羰基化合物、金属乙酰基丙酮酸 盐、或其它在分解条件下可以作为蒸汽引入分解形成非载体的金属催 化剂的材料。催化有效的金属包括Fe、Co、Mn、Ni和Mo。钼羰基 化合物和铁羰基化合物是优选的含金属的化合物，其中所述化合物可 以在反应条件下形成蒸气相催化剂。这些固态的金属羟基化合物可以 递送到预处理区，在该位置将它们气化，因此变成催化剂的蒸汽相前 体。据发现，有两种方法都可以用于在非载体的催化剂上形成SWNT。
[0017]第一种方法是直接注射挥发性催化剂。在U.S.申请序列号 08/459,534中描述了该直接注射法，通过参考引入本文。据发现，使 用六羰基钼[Mo(CO)6]和八羰基二钴[CO2(CO)8]直接注射挥发性催化 剂前体会导致SWNT的形成。这两种物质在室温下都是固体，但在 环境压或类似于环境压下会升华—钼化合物对至少150度是热稳定 的，钴化合物分解并升华。(”Organic Syntheses via Metal Carbonyls，”Vol.1，1.Wender and P.Pino，eds.，Interscience Publishers，New York，1968，p.40)。
[0018]第二种方法使用蒸发器来引入含金属的化合物(附图12)。 在本发明一个优选的实施方案中，如附图12所示的蒸发器10包含底 部具有约1”封口的热电偶导管20，而形成第二个隔室。该室具有两 个1/4”的孔穴26，该孔穴是开放的并暴露在反应气体中。将催化剂 置于该隔室中，然后在任何需要的温度下用蒸发器炉32气化。用第 一热电偶22控制该炉。含金属的化合物，优选羰基化合物在其分解 点以下的温度中气化，反应气体CO或CO/H sub.2将前体扫入到反 应区34，通过反应区炉38和第二热电偶42分别控制反应区34。尽 管申请人不希望局限于某一特定的操作理论，但据信在反应温度下， 含金属的化合物部分分解为中间体物质或完全分解为金属原子.这些 中间体物质和/或金属原子合并成较大的聚集颗粒，成为实际上的催化 剂.然后该颗粒生长到合适的大小，就可以催化CO的分解，也可以 促进SWNT生长。在附图11的装置中，在石英棉塞36上收集催化剂 颗粒和所得到的碳的形式.颗粒的生长率取决于气相含金属的中间体 物质的浓度。通过蒸发器中的蒸汽压(和因此得到的温度)来确定该 浓度。如果浓度过高，颗粒生长太快，就会生长出SWNT以外的结 构(例如MWNT，无定形碳、onions等等).将U.S.6,221,330的全 部内容，包括所述的实施例都通过参考引入本文.
[0019]通过参考引入本文的Bethune等人的U.S.5,424,054、描述 了一种制备单壁碳纳米管的方法，包括将碳蒸汽与钴催化剂接触。该 碳蒸汽式通过固体碳的电弧加热得到的，固体碳可以是无定形碳、石 墨、活性碳或脱色碳或其混合物.也讨论了加热碳的其他方法，例如 激光加热、电子束加热和RF感应加热.
[0020]通过参考引入本文的Smalley(Guo，T.，Nikoleev，P.， Thess，A.，Colbert，D.T.，和Smally，R.E.，Chem.Phys.Lett.243： 1-12(1995))描述了一种制备单壁碳纳米管的方法，其中石墨柱和过渡 金属同时通过高温激光来气化.
[0021]通过参考引入本文的Smalley(Thess，A.，Lee，R.， Nikolaev，P.，Dai，H.，Petit，P.，Robert，J.，Xu，C，Lee，Y.H.， Kim，S.G.，Rinzler，A.G.，Colbert，D.T.，Scuseria，G.E.，Tonarek， D.，Fischer，J.E.，和Smalley，R.E.，Science，273：483-487(1996)) 也描述了一种制备单壁碳纳米管的方法，其中包含少量过渡金属的石 墨柱在烘箱中在1200℃下激光气化。所报告的制备单壁纳米管的收 率超过70％。
[0022]用于产生SWNT的载体金属催化剂也是已知的。通过参 考引入本文的Smalley(Dai.，H.，Rinzler，A.G.，Nikolaev，P.，Thess， A.，Colbert，D.T.，and Smalley，R.E.，Chem.Phys.Lett.260：471-475 (1996))描述了载体Co、Ni和Mo催化剂可以用于多壁纳米管和单壁 纳米管从CO的生长，并提出它们产生的机理。
[0023]通过参考引入本文的McCarthy等人1989年3月15提 交的U.S.专利申请序列号351,967描述了一种氧化碳原纤维表面的 方法，包括在反应条件下(例如时间、温度、和压强)将原纤维与氧 化剂接触，氧化剂包括硫酸(H2SO4)和氯酸钾(KClO3)，以充分氧化原 纤维的表面。根据McCarthy等人的方法氧化的原纤维是非均匀氧化 的，也就是说，碳原子被羧基、醛、酮、酚和其他羰基所取代.
[0024]通过硝酸处理也可以非均匀地氧化原纤维。国际申请 PCT/US94/10168披露了包含官能团的混合物的氧化原纤维的产生。 Hoogenvaad，M.S.，等人(”Metal Catalysts supported on a Novel Carbon Support”，Presented at Sixth International Conference on Scientific Basis for the Preparation of Heterogeneous Catalysts， Brussels，Belgium，1994年9月)也发现了，用硝酸和原纤维-载体的 贵金属首先氧化原纤维表面的制备是有利的.用酸预处理是制备碳-载 体贵金属催化剂的标准步骤，其中，该催化剂是通常的碳源，其尽可 能多地清洁不希望物质的表面而使其官能化.
[0025]在已公开的工作中，McCarthy和Bening(Polymer Preprints ACS Div.ofPolymer Chem.30(1)420(1990))制备出了氧化原 纤维的衍生物，以证明表面包含各种的氧化基团.根据它们的分析有 用性例如颜色鲜亮或者显示一些其他的较强和容易鉴别和区分的信 号，选择他们制备的化合物苯腙、杂芳酯、铊盐等等。这些化合物是 未分离的，与没有实施意义的所述衍生物不同。
[0026]如上述涉及的专利和专利申请所述，尽管碳原纤维和碳原 纤维的聚集物已经有了很多的用途，但如果将原纤维表面官能化，则 可以发展出许多不同和重要的用途。均匀或者非均匀的官能化允许官 能化的原纤维与各种底物相互作用而形成具有独特性质物质的独特的 组合物，并能根据原纤维表面官能化位点之间的键而产生原纤维结 构。发明目的
[0027]因此，本发明的首要目的是提供直径小于5纳米的官能化 的单壁碳纳米管，即表面均匀或非均匀修饰以与官能化的化学部分结 合的单壁碳纳米管.
[0028]本发明的进一步和相关的目的是提供直径小于5纳米的单 壁碳纳米管，通过与氧化剂或其他化学介质反应而将表面官能化。
[0030]本发明的进一步目的是提供直径小于5纳米的单壁碳纳米 管，其表面已经例如通过氧化修饰，然后通过与官能团反应而进一步 修饰。
[0031]本发明的进一步和相关的目的是提供直径小于5纳米的单 壁碳纳米管，其表面用一系列的官能团修饰，以使得单壁碳纳米管可 以与各种底物的化学基团进行化学反应或物理结合。
[0032]本发明的进一步和相关的目的是提供直径小于5纳米的单 壁碳纳米管的络合结构，其中单壁碳纳米管上的官能团互相通过大范 围的化学连接子而结合。
[0033]本发明的进一步和相关的目的是提供化学修饰原纤维表面 的方法和物理吸附直径小于5纳米的单壁碳纳米管表面的物质的方 法，以便在这两种情况中都提供与原纤维表面结合的官能化部分。
[0034]本发明的进一步目的是提供基于直径小于5纳米的官能化 的单壁碳纳米管的物质的新组合物。附图简述
[0035]附图1是与平原纤维、羧基原纤维和PEG-修饰的原纤维 结合的BSA进行分析的图形表示。
[0036]附图2是对通过两种不同的方法与羧基原纤维和PEG-修 饰的原纤维结合的β-乳球蛋白分析的图形表示。
[0038]附图4是在季胺原纤维柱上BSA洗脱图的图形表示。
[0039]附图5是制备基于赖氨酸的dendrimeric原纤维的反应顺 序。
[0040]附图6是循环伏安图的图形表示，证明在流动池中使用铁 酞菁修饰原纤维。
[0041]附图7是通过加入Nε-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸制备双功能 原纤维的反应顺序。
[0042]附图8是用原纤维固定的酯酶合成丁酸乙酯的结果的图形 表示。
[0044]附图10是用βG修饰的原纤维从AP和βG的混合物中分 离βG的结果的图形表示。
[0045]附图11显示的是能产生单壁碳纳米管的反应器。
[0046]附图12显示的是附图11所述的反应器的蒸发器组件.发明详述
[0047]本发明涉及组合物，其广义地具有如下通式：[CnHL]Rm
其中n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个R都相同，并选自SO3H、COOH、NH2、OH、R’CHOH、 CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，
y是等于或小于3的整数，
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、或芳烷基、环芳基或聚(烷基醚)，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基、氟代芳烷基或环芳基，
X是卤化物，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根。
其中n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，
每个R都相同，并选自SO3H、COOH、NH2、OH、R’CHOH、 CHO、CN、COCl、卤化物、COSH、SH、COOR’、SR’、SiR’3、 Si(-OR’-)yR’3-y、Si(-O-SiR’2-)OR’、R”、Li、AlR’2、Hg-X、TlZ2和 Mg-X，
y是等于或小于3的整数，
R’是氢、烷基、芳基、环烷基、或芳烷基、环芳基或聚(烷基醚)，
R”是氟代烷基、氟代芳基、氟代环烷基、氟代芳烷基或环芳基，
X是卤化物，且
Z是羧酸根或三氟乙酸根。
[0048]碳原子Cn是直径基本恒定的基本上圆柱状的石墨纳米管 的表面碳。该纳米管包括长度直径比大于5并且直径小于0.5μ，优 选小于0.1μ的那些.该纳米管也可以是基本上圆柱状的石墨纳米管， 其基本上不含热解沉积的碳，更优选特征在于该纳米管是石磨层在原 纤维轴上的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离和/或具有圆柱状石磨 片的那些，其c-轴基本上与其圆柱轴垂直.在一个优选的实施方案中， 碳原子Cn是直径基本恒定的或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单 壁石墨纳米管的表面碳。更优选地，碳原子Cn是直径小于5纳米的 单壁石墨纳米管的表面碳。这些组合物是均匀的，其中每个R是相同 的.
[0049]也可以制备非均匀取代的纳米管.这包括如下通式的组合 物[CnHL]Rm
其中n、L、m、R和纳米管本身如上述定义，条件是每个R都不含 氧，或者如果每个R都是包含氧的基团，则不存在COOH。
其中n、L、m、R和纳米管本身如上述定义，条件是每个R都不含 氧，或者如果每个R都是包含氧的基团，则不存在COOH。
[0050]具有如下通式的官能化纳米管也包括在本发明的范围内[CnHL]Rm
其中n、L、m、R和R’具有与上述同样的含义，碳原子是长度直径 比大于5的鱼骨原纤维的表面碳原子或者是直径小于5纳米的单壁碳 纳米管的碳原子。它们可以是均匀或非均匀取代的，优选地，纳米管 不含热解外包衣并且直径小于0.5μ.
其中n、L、m、R和R’具有与上述同样的含义，碳原子是长度直径 比大于5的鱼骨原纤维的表面碳原子或者是直径小于5纳米的单壁碳 纳米管的碳原子。它们可以是均匀或非均匀取代的，优选地，纳米管 不含热解外包衣并且直径小于0.5μ.
[0051]本发明也包括具有下列通式的官能化纳米管[CnHL][R’-R]m
其中n、L、m、R和R’具有与上述同样的含义。碳原子Cn是直径基 本恒定的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳。该纳米管的长度直径 比大于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ。该纳米管可以是基本 上不含热解沉积碳的纳米管。此外，该纳米管是石磨层在原纤维轴上 的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离的那些和/或具有圆柱状石磨 片、其c-轴基本上与其圆柱轴垂直的那些。在该优选的实施方案中， 碳原子Cn是直径基本恒定的或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单 壁石墨纳米管的表面碳。更优选地，碳原子Cn是直径小于5纳米的 单壁石墨纳米管的表面碳。
其中n、L、m、R和R’具有与上述同样的含义。碳原子Cn是直径基 本恒定的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳。该纳米管的长度直径 比大于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ。该纳米管可以是基本 上不含热解沉积碳的纳米管。此外，该纳米管是石磨层在原纤维轴上 的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离的那些和/或具有圆柱状石磨 片、其c-轴基本上与其圆柱轴垂直的那些。在该优选的实施方案中， 碳原子Cn是直径基本恒定的或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单 壁石墨纳米管的表面碳。更优选地，碳原子Cn是直径小于5纳米的 单壁石墨纳米管的表面碳。
[0052]在均匀和非均匀取代的纳米管中，表面原子Cn是发生反 应的。在石磨原纤维的表面层的大多数碳原子如同在石墨中一样，是 基面碳。基面碳对于化学攻击是相对惰性的。在缺损位点，例如石磨 面未能完全延伸至原纤维的周围，那么就会有碳原子与石磨面的边缘 碳原子(参见Urry，Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon， Wiley，New York 1989对边缘和基面碳的讨论)类似。
[0053]在缺损位点，纳米管较低较靠内的层的边缘或基面碳可能 会暴露。术语表面碳包括纳米管的最外层的基面和边缘的所有碳，以 及在最外层的缺损位点暴露的较低层的基面和/或边缘碳。边缘碳是有 反应性的，必须包含一些杂原子或基团以满足碳的原子价。
[0054]可以进一步有利地官能化上述的取代的纳米管。这些组合 物包括下列通式的组合[CnHL]Am
其中碳原子是上述纳米管的表面碳，并且n、L和m如上所述， A选自OY、NHY、
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、核苷酸、寡核苷酸、抗原、 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’N+(R’)3X-、R’SiR’3、 R’Si(OR’)yR’3-y、R’Si(O-SiR’2)OR’、R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、 (C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、
并且w是大于1且小于200的整数。碳原子Cn是直径基本恒定 的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳.该纳米管包括长度直径比大 于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ的那些。该纳米管也可以是 基本上圆柱状的石墨纳米管，其基本上不含热解沉积的碳。更优选其 特征在于石磨层在原纤维轴上的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离 和/或它们包括c-轴基本上与其圆柱轴垂直的圆柱状石磨片。优选地， 该纳米管不含热解外包衣并且直径小于0.5μ。此外，该纳米管是直径 基本恒定或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米管。更优选 地，该纳米管是直径小于5纳米的单壁碳纳米管.
其中碳原子是上述纳米管的表面碳，并且n、L和m如上所述， A选自OY、NHY、
或C＝Y，
Y是蛋白质、肽、氨基酸、酶、抗体、核苷酸、寡核苷酸、抗原、 或酶底物、酶抑制剂或酶底物的过渡态类似物的适当官能团或选自 R’-OH、R’-N(R’)2、R’SH、R’CHO、R’CN、R’X、R’N+(R’)3X-、R’SiR’3、 R’Si(OR’)yR’3-y、R’Si(O-SiR’2)OR’、R’-R”、R’-N-CO、(C2H4O)wH、 (C3H6O)wH、(C2H4O)w-R’、(C3H6O)w-R’、
并且w是大于1且小于200的整数。碳原子Cn是直径基本恒定 的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳.该纳米管包括长度直径比大 于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ的那些。该纳米管也可以是 基本上圆柱状的石墨纳米管，其基本上不含热解沉积的碳。更优选其 特征在于石磨层在原纤维轴上的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离 和/或它们包括c-轴基本上与其圆柱轴垂直的圆柱状石磨片。优选地， 该纳米管不含热解外包衣并且直径小于0.5μ。此外，该纳米管是直径 基本恒定或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米管。更优选 地，该纳米管是直径小于5纳米的单壁碳纳米管.
[0055]官能化纳米管的结构[CnHL][R’-R]m
也可以官能化以制备具有下列通式的组合物
[CnHL][R’-A]m
其中n、L、m、R’和A如上定义.碳原子Cn是直径基本恒定 的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳.该纳米管包括长度直径比大 于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ的那些.该纳米管也可以是 基本上圆柱状的石墨纳米管，其基本上不含热解沉积的碳.更优选其 特征在于石磨层在原纤维轴上的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离 和/或具有c-轴基本上与其圆柱轴垂直的圆柱状石磨片。优选地，该纳 米管不含热解外包衣并且直径小于0.5μ.此外，该纳米管是直径基本 恒定或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米管。最优选地， 该碳原子Cn是直径小于5纳米的单壁碳纳米管的表面碳。
也可以官能化以制备具有下列通式的组合物
[CnHL][R’-A]m
其中n、L、m、R’和A如上定义.碳原子Cn是直径基本恒定 的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳.该纳米管包括长度直径比大 于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ的那些.该纳米管也可以是 基本上圆柱状的石墨纳米管，其基本上不含热解沉积的碳.更优选其 特征在于石磨层在原纤维轴上的投影延伸至少2倍原纤维直径的距离 和/或具有c-轴基本上与其圆柱轴垂直的圆柱状石磨片。优选地，该纳 米管不含热解外包衣并且直径小于0.5μ.此外，该纳米管是直径基本 恒定或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳纳米管。最优选地， 该碳原子Cn是直径小于5纳米的单壁碳纳米管的表面碳。
[0056]本发明的组合物也包括其上某些环状化合物被吸附的纳米 管。这包括下列通式的物质的组合物[CnHL][X-Ra]m
其中n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，a是0 或小于10的数字，X’是多核的芳香基、多异核的芳香基或金属多异 核的芳香基部分或平面的四硫代草酸金属盐，并且R如上所述.碳原 子Cn是直径基本恒定的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳.该纳 米管包括长度直径比大于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ的那 些。该纳米管也可以是基本上圆柱状的石墨纳米管，其基本上不含热 解沉积的碳，更优选其特征在于石磨层在原纤维轴上的投影延伸至少 2倍原纤维直径的距离和/或具有c-轴基本上与其圆柱轴垂直的圆柱状 石磨片。优选地，该纳米管不含热解外包衣并且直径小于0.5μ.此外， 该纳米管是直径基本恒定或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳 纳米管.最优选地，该碳原子Cn是直径小于5纳米的单壁碳纳米管 的表面碳。
其中n是整数，L是小于0.1n的数字，m是小于0.5n的数字，a是0 或小于10的数字，X’是多核的芳香基、多异核的芳香基或金属多异 核的芳香基部分或平面的四硫代草酸金属盐，并且R如上所述.碳原 子Cn是直径基本恒定的基本上圆柱状的石墨纳米管的表面碳.该纳 米管包括长度直径比大于5并且直径小于0.5μ，优选小于0.1μ的那 些。该纳米管也可以是基本上圆柱状的石墨纳米管，其基本上不含热 解沉积的碳，更优选其特征在于石磨层在原纤维轴上的投影延伸至少 2倍原纤维直径的距离和/或具有c-轴基本上与其圆柱轴垂直的圆柱状 石磨片。优选地，该纳米管不含热解外包衣并且直径小于0.5μ.此外， 该纳米管是直径基本恒定或直径小于5纳米的基本上圆柱状的单壁碳 纳米管.最优选地，该碳原子Cn是直径小于5纳米的单壁碳纳米管 的表面碳。
[0057]优选的环状化合物是Cotton和Wilkinson，Advanced Organic第76页所述的平面大环化合物。更优选的吸附的环状化合 物是卟啉，酞菁，或Ni、Cu、Pd、Pt或Ag的三硫代草酸盐.
[0058]本发明的组合物也包含直径小于5纳米的单壁碳纳米管， 其中在单壁碳纳米管的壁上吸附了一些平面芳香族化合物.如果所吸 附的分子是本身官能化的，那么就可以有效地官能化侧壁而不改变它 们的物理结构。然后可以进一步加热该官能化的单壁碳纳米管或者将 吸附的分子部分热分解以避免解吸附。可以使用固定所吸附分子的其 他机理例如交联或低聚反应(以降低溶解性)。优选的吸附的平面芳 香族化合物包括卟啉，酞菁，或Ni、Cu、Pd、Pt或Ag的三硫代草 酸盐。
[0059]可以官能化所吸附的环状化合物.这些组合物包括下列通 式的化合物[CnHL][X-Aa]m
其中m、n、L、a、X和A如上述定义，碳是如上所述的基本上圆柱 状的石墨或单壁碳纳米管的表面碳。
其中m、n、L、a、X和A如上述定义，碳是如上所述的基本上圆柱 状的石墨或单壁碳纳米管的表面碳。
[0060]如上所述官能化的碳原纤维可以掺入到基质中。优选地， 该基质是有机聚合物(例如，热固性树脂例如环氧、二马来酰亚胺、 聚酰胺、或聚酯树脂；热塑性树脂；反应注射模制树脂；或弹性体例 如天然橡胶、苯乙烯-丁二烯橡胶、或顺-1，4-聚丁二烯)；无机聚合 物(例如聚合的无机氧化物例如玻璃)，金属(例如铅或铜)，或陶瓷 材料(例如，硅酸盐水泥)。掺入了原纤维的基质可以形成小珠。可 替代地，官能化的原纤维可以结合到官能化小珠的外表面。
[0061]不与特定理论相联系，官能化的原纤维最好分散到聚合物 系统中，因为修饰的表面的性质更与聚合物相容，或者，因为修饰的 官能团(特别是羟基或胺基)直接结合到聚合物上成为末端基团。这 样，聚合物系统例如聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚酯或聚酰胺/酰亚胺 直接与原纤维结合，使得原纤维具有改善的粘性而更易于分散
[0062]本发明也涉及将官能团引入到碳原纤维表面上的方法，包 括将碳原纤维与强氧化剂接触一段时间，以充分地氧化所述原纤维的 表面，进一步将所述原纤维与适合将官能团加到氧化表面的试剂接 触。在本发明一个优选的实施方案中，该氧化剂包括碱金属氯酸盐的 强酸溶液。在本发明的另一个实施方案中，碱金属氯酸盐是氯酸钠或 氯酸钾。在优选的实施方案中，所使用的强酸是硫酸.充分氧化的时 间是约0.5小时到约24小时。
[0063]在一个进一步优选的实施方案中，具有通式[CnHL] [CH(R’)OH]m(14页)，其中n、L、R’和m如上述定义的组合物的形 成，包括将R’CH2OH和纳米管的表面碳在自由基引发剂例如过氧化 苯甲酰的存在下反应.
[0064]本发明也涉及将蛋白质连接到NHS修饰的纳米管上的方 法，包括在NHS酯和蛋白质的氨基之间形成共价键.
[0065]本发明也涉及制备碳原纤维或单壁碳纳米管的网状物的方 法，包括将碳原纤维或单壁碳纳米管与氧化剂接触一段时间以充分氧 化碳原纤维或单壁碳纳米管的表面，将表面已氧化的碳原纤维或单壁 碳纳米管与适合把官能团加到碳原纤维或单壁碳纳米管表面的试剂接 触，进一步将表面官能化的原纤维与交联剂有效地接触，以制备碳原 纤维或单壁碳纳米管的网状物.优选的交联剂是多元醇、聚胺或多聚 羧酸.
[0066]官能化的原纤维和单壁碳纳米管在制备原纤维的硬网状物 或单壁碳纳米管的网状物中也是有用的。酸官能化的原纤维或单壁碳 纳米管的良好分散的三维网状物可以例如通过酸基(原纤维之间)和 多元醇或聚胺的交联形成硬网状物而稳定化。
[0067]本发明也包括三维网状物，其由本发明的官能化的原纤维 或单壁碳纳米管连接而成.这些络合结构包括至少两个官能化的原纤 维或单壁碳纳米管，其通过包含直接键或化学部分的一种或多种连接 子连接.这些网状物包括非常均匀相等孔径的多空介质.它们可以用 作吸附剂、催化剂载体和分离介质.
[0068]尽管原纤维或单臂碳纳米管之间的间隙在大小和形状方面 是不规则的，但可以认为它们是孔穴，特征在于使用该方法来使多孔 介质特征化。在这些网状物中，孔穴的大小可以通过原纤维的浓度和 分散的水平，和交联剂的浓度和链长来控制.这写材料可以作为结构 性的催化剂载体，可以调整以排除或包括一定大小的分子。除了常规 的工业催化，它们可以特别地作为大孔载体应用于生物催化剂。
[0069]硬网状物也可以作为拟生态系统的主链用于分子识别。这 些系统在U.S.5,110,833和国际专利公开号W093/19844中进行了 描述。适当地选择交联剂和络合剂可以用于特定分子框架的稳定化。官能化纳米管的方法
[0070]可以通过磺化作用、亲电子加成到去氧原纤维表面和金属 化来直接制备本发明的均匀官能化的原纤维。当使用弧生长纳米纤维 时，它们可能需要在官能化前广泛纯化。Ebbesen等人(Nature 367 519 (1994))给出了该纯化的方法。
[0071]优选地，在与官能化剂接触前先处理碳原纤维。这些处理 可以包括将原纤维分散到溶剂中。在一些例子中，然后可以过滤碳原 纤维，并在进一步接触前干燥。1.磺化作用
[0072]在March，J.P.，Advanced Organic Chemistry，3rd Ed. Wiley，New York 1985；House，H.，Modern Synthetic Reactions，2nd Ed.，Benjamin/Cumrnings，Menlo Park，CA 1972中对背景技术进 行了描述。
[0073]用发烟硫酸(oleum)可磺化活化的C-H(包括芳香族的C- H)键，发烟硫酸是包含高达20％ SO3的浓硫酸溶液。该常规方法是 经液相在80℃使用发烟硫酸；但是也可以在惰性、非质子溶剂中使 用SO3或在气相中使用SO3来磺化活化的C-H键.该反应是-C-H+SO3---->-C-SO3H
上述反应导致了砜的产生，根据下述反应：
2-C-H+SO3----->-C-SO2-C-+H2O
实施例1
用硫酸活化C-H键
上述反应导致了砜的产生，根据下述反应：
2-C-H+SO3----->-C-SO2-C-+H2O
实施例1
用硫酸活化C-H键
[0074]反应在气相中和溶液中进行，不会使结果产生显著的差 异。蒸汽相反应是在Lindberg炉加热的水平石英管反应器中进行的。 具有气体进口/出口管的装有包含20％SO3的浓硫酸的多颈烧瓶用作 SO3的来源。
[0075]将瓷皿中原纤维(BN或CC)的已称重样品置于具有进 气口的1”管中；出口与浓硫酸气泡捕捉器相连。用氩气将整个反应 器冲刷20分钟以除去所有的气体，将样品加热到300℃ 1小时以除去 残留水粉。干燥后，在氩气下调节温度至反应温度.
[0076]当所需的温度变稳定时，将SO3源于反应器的管相连，用 氩气流将SO3蒸汽带入到石英管反应器中.在所需温度下在所需时间 里进行反应，然后在流动的氩气下冷却反应器.然后在90℃和5”Hg 真空中干燥原纤维，获得干重的增加。通过与0.100N NaOH反应和 用0.100N HCl反滴定，以pH6.0为终点来确定硫酸(-SO3H)的量。
[0077]在具有气体进口/出口管和磁力搅拌器的多颈烧瓶中，在 包含20％SO3的浓硫酸中进行液相反应.将在浓H2SO4(50)中的原纤 维浆体置于烧瓶中。在加入反应器前，发烟硫酸溶液(20cc)预热到- 60℃。反应后，将酸浆体倒入碎冰中，立刻用11DI水稀释。过滤该 固体，用DI水尽力洗涤直至洗脱液pH值无变化。然后在100℃和5”Hg 真空中干燥原纤维。由于过滤的转移损失，无法获得精确的重量增加 值。结果列于表1。
[0078] 表1
反应概述
SAMPLE FIBRIL DRY Wt SO3H CONC
实施例 RUN# REACT Wt.g TYPE T℃ TIME GAIN me/g
1A 118-60A Vap 0.20 CY 110 15m 9.3％ 0.50
1B 118-61A Vap 0.20 BN 100 30m 8.5％ 0.31
1C 118-61B Vap 0.20 BN 65 15m 4.2％ 0.45
1D 118-56A Liq 1.2 CY 50 10m 0.33
1E 118-56B Liq 1.0 CY 25 20m 0.40
反应概述
SAMPLE FIBRIL DRY Wt SO3H CONC
实施例 RUN# REACT Wt.g TYPE T℃ TIME GAIN me/g
1A 118-60A Vap 0.20 CY 110 15m 9.3％ 0.50
1B 118-61A Vap 0.20 BN 100 30m 8.5％ 0.31
1C 118-61B Vap 0.20 BN 65 15m 4.2％ 0.45
1D 118-56A Liq 1.2 CY 50 10m 0.33
1E 118-56B Liq 1.0 CY 25 20m 0.40
[0079]在蒸汽相或液相中反应，硫酸量没有显著的差异。具有温 度效应。较高的反应温度(蒸汽相)得到了较多量的砜。在118-61B 中，4.2％wt的增加与硫酸的量一致(理论上是0.51meq/g)。运行号 60A和61A wt增加太高而无法仅通过硫酸量来计算。因此，推测也 制得了可估量的砜。2.加入到不含氧化物的原纤维表面
[0080]在Urry，G.，Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon，Wiley，New York 1989中对背景技术进行了描述。
[0081]原纤维的表面碳与石墨的性质类似，即，它们都在包含基 面和边缘碳的六棱片中。当基面碳对于化学攻击呈相对惰性时，边缘 碳相对并必须包含一些杂原子或基团以满足碳的原子价.原纤维也有 表面缺损位点，其基本上是边缘碳并包含杂原子或基团.
[0082]结合到原纤维的表面碳上的最常见的杂原子是氢，其是制 备过程中主要的气体组分；氧，由于其高反应性和由于其痕量非常难 以避免；和H2O，由于催化剂的原因其总是存在.在真空中在～1000℃ 热解将会以未知的机理但已知的化学计量在复杂反应中将表面去氧 化。产物是比例为2:1的CO和CO2。所得到的原纤维表面包含以 C1-C4排列的原子团，其与活化的链烃具有很大的反应性。该表面在 真空中或惰性气体存在下是稳定的，但仍保留高反应性，直至暴露于 反应性气体中。因此，在真空或惰性大气～1000℃下可以热解原纤维， 也可以在相同条件下冷却，并在低温下与适当的分子反应得到稳定的 官能团。典型的例子是：然后：
X＝-OH、-Cl、-NH2、-H
RFS+马来酸酐----------->原纤维-R’(COOH)2
RFS+氰-------------->原纤维-CN
RFS+CH2＝CH-CH2X-------------->原纤维-R’CH2X X＝-NH2、-OH、-卤素
RFS+H2O-------------->原纤维＝O(quinoidal)
RFS+CH2＝CHCHO-------------->原纤维-R’CHO(醛)
RFS+CH2＝CH-CN-------------->原纤维-R’CN
其中R’是烃基(烷基、环烷基等等)
实施例2
通过丙烯酸和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
X＝-OH、-Cl、-NH2、-H
RFS+马来酸酐----------->原纤维-R’(COOH)2
RFS+氰-------------->原纤维-CN
RFS+CH2＝CH-CH2X-------------->原纤维-R’CH2X X＝-NH2、-OH、-卤素
RFS+H2O-------------->原纤维＝O(quinoidal)
RFS+CH2＝CHCHO-------------->原纤维-R’CHO(醛)
RFS+CH2＝CH-CN-------------->原纤维-R’CN
其中R’是烃基(烷基、环烷基等等)
实施例2
通过丙烯酸和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
[0083]将瓷皿中的1g BN原纤维置于具有热电偶并位于Lindberg 管形炉中的水平1”石英管中.该末端具有气体进口/出口。用干燥去 氧化的氩气冲洗该管10分钟，然后将炉温升高到300℃，保持30分 钟。然后在连续的氩气流下，以100℃的增量将温度升高到1000℃， 保持16小时。在该段时间结束后，将管在氩气下冷却到室温(RT)。 然后将氩气分流通过50℃的包含纯净丙烯酸和具有气体进口/出口的 多颈烧瓶。将丙烯酸/氩气蒸气流在RT下保持6小时。在这段时间结 束后，除去残留的未反应的丙烯酸，首先用氩气冲洗，然后在5”真 空中在1000℃下真空干燥。通过与过量的0.100N NaOH反应并用 0.100N HCl反滴定至pH7.5的终点来确定羧酸的量。实施例3
通过丙烯酸和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
通过丙烯酸和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
[0084]以与上述方法类似的方式重复该方法，除了在10-4托的 真空中进行热解和冷却。如上述方法用氩气稀释纯净的丙烯酸蒸气。实施例4
通过马来酸和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
通过马来酸和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
[0085]如实施例2重复该方法，除了在RT下试剂是纯净的马来 酸酐(MAN)，其通过在80℃将氩气通过熔化的MAN浴进料到反应 器中。实施例5
通过丙烯酰氯和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
通过丙烯酰氯和无氧化物的原纤维表面的反应制备官能化的原纤维
[0086]如实施例2重复该方法，除了在RT下试剂是纯净的丙烯 酰氯，其通过在25℃将氩气通过纯净的丙烯酰氯MAN进料到反应 器中。通过与过量的0.100N NaOH反应并用0.100N HCl反滴定来确 定丙烯酰氯的量.
[0087]原纤维在真空中的热解使原纤维表面去氧化。在TGA装置 中，在真空或在纯净的Ar流中在1000℃中热解使得BN原纤维的3 个样品平均wt损失了3％。气相色谱分析仅探测到比例分别为～2:1 的CO和CO2。所得到的表面的反应性很大，活化的链烃例如丙烯酸、 丙烯酰氯、丙烯酰胺、丙烯醛、马来酸酐、烯丙胺、烯丙醇或烯丙基 卤化物甚至在室温下反应生成纯净的产物，其仅包含与活化的链烃官 能化结合的物质。因此，通过丙烯酸或马来酸酐反应的包含羧酸的表 面是可用的；通过与丙烯酰氯反应的包含酰基氯的表面是可用的；从 丙烯醛仅得到醛；从烯丙醇仅得到羟基；从烯丙胺仅得到胺，从烯丙 基卤化物仅得到卤化物。3.金属化
[0088]在March，Advanced Organic Chemistry，3rd ed.，p545 中给出了背景技术。
[0089]芳香族的C-H键可以用各种的有机金属试剂金属化而产 生碳-金属键(C-M)。M通常是Li、Be、Mg、Al、或Tl；但是也可以 使用其他金属.该简单反应是通过在活化的芳香族化合物中直接取代 氢：1.原纤维-H+R-Li-------->原纤维-Li+RH
[0090]该反应可能需要其他的强碱，例如叔丁氧钾或螯合的二胺。 非质子溶剂是必需的(石蜡、苯)。2.原纤维-H+AlR3-------->原纤维-AlR2+RH
3.原纤维-H+Tl(TFA)3-------->原纤维-Tl(TFA)2+HTFA
TFA＝三氟乙酸盐 HTFA＝三氟乙酸
3.原纤维-H+Tl(TFA)3-------->原纤维-Tl(TFA)2+HTFA
TFA＝三氟乙酸盐 HTFA＝三氟乙酸
[0091]金属化衍生物是主要的单官能化原纤维的例子。但是，它 们可以进一步反应，得到其他主要单官能化的原纤维。一些反应可以 在相同的装置中急需进行，而不需要分离中间体。4.原纤维-M+O2-------->原纤维-OH+MO M＝Li、Al、H+
原纤维-M+S--------->原纤维-SH+M+
原纤维-M+X2-------->原纤维-X+MX X＝卤素
原纤维-T1(TFA)2+aq.KCN---------->原纤维-CN+TlTFA +KTFA
原纤维-CN+H2---------->原纤维-CH2-NH2
实施例6
原纤维-Li的制备
原纤维-M+S--------->原纤维-SH+M+
原纤维-M+X2-------->原纤维-X+MX X＝卤素
原纤维-T1(TFA)2+aq.KCN---------->原纤维-CN+TlTFA +KTFA
原纤维-CN+H2---------->原纤维-CH2-NH2
实施例6
原纤维-Li的制备
[0092]将1g CC原纤维置于瓷皿中，并插入到包入在Lindberg 管形炉中的1”石英管反应器中.管的末端具有气体进口/出口。在连 续的H2流下，将原纤维加热到700℃ 2小时，以将所有的表面氧化物 转变成C-H键。然后在H2流下冷却反应器至室温。
[0093]然后用干燥的去氧庚烷(和LiAlH4)将氢化的原纤维转移 到装备有纯净氩气清洗系统的1L多颈圆底烧瓶中以除去所有的气体 并保持惰性大气，该圆底烧瓶还具有冷凝器、磁力搅拌器和橡胶隔片， 通过橡胶隔片可以通过注射器加入液体。在氩气大气下，通过注射器 加入包含5mmol丁基锂的2％庚烷溶液，温和回流下搅拌该浆体4 小时。在该时间结束后，通过在氩大气的手套箱中重力过滤分离原纤 维，用干燥去氧的庚烷在过滤器上洗涤数次。将原纤维转移到装有龙 头的50cc r.b.烧瓶中，并在10-4托真空下在50℃下干燥。通过原纤 维的样品与过量的0.100N HCl的DI水反应并用0.100N NaOH反滴 定至pH5.0的终点，来确定锂的浓度.实施例7
原纤维-T1(TFA)2的制备
原纤维-T1(TFA)2的制备
[0094]如实施例5将1g CC原纤维氢化，载入到含HTFA的多 颈烧瓶中，其中已经通过反复的用干燥氩气冲洗给HTFA除气。通过 橡胶隔片向烧瓶中加入2％ 5mmol Tl(TFA)3的HTFA溶液，在温和 回流下搅拌浆体6小时。反应后，收集原纤维并如实施例1干燥。实施例8
原纤维-OH的制备
(仅包含OH官能化的氧化衍生物)
原纤维-OH的制备
(仅包含OH官能化的氧化衍生物)
[0095]用在氩大气的手套袋中的干燥去氧的庚烷将0.5g如实施 例6制备的锂化原纤维转移到具有龙头和磁力搅拌棒的50cc的单颈 烧瓶中。将烧瓶离开手套袋，在磁力搅拌器上搅拌。然后打开龙头通 气，将浆体搅拌24小时。该时间结束后，过滤分离原纤维，并用MeOH 水溶液洗涤，在50℃下在5”真空中干燥.确定OH基的浓度，包括 通过与乙酸酐的二噁烷(0.252M)的标准溶液在80℃下反应将OH基 转变为乙酸酯，这样做会释放1当量的乙酸或1摩尔的已反应的酸酐。 游离乙酸和未反应的乙酸酐的总酸量的确定包括，用0.100N NaOH 滴定至pH7.5的终点.实施例9
原纤维-NH2的制备
原纤维-NH2的制备
[0096]如实施例7制备1g三氟乙酸化的原纤维。在二噁烷中浆 化该原纤维。并加入在二噁烷中的0.5g三苯基磷。在50℃下将该浆 体搅拌数分钟，然后在50℃下加入氨水气体30分钟。然后过滤分离 该原纤维，在二噁烷中、然后在DI水中洗涤，在80℃下和5”真空 中干燥。胺浓度的确定包括与过量乙酸酐反应并用0.100N NaOH反 滴定游离乙酸和未反应的酸酐。4.衍生的多核芳香族、多异核芳香族和平面大环化合物
[0097]原纤维的石磨表面允许芳香族化合物的物理吸附。该吸附 是通过范德华力。这些力在多环异核芳香族化合物和石磨表面的基面 碳之间是重要的。在可能是竞争性的表面吸附或者被吸附物具有较高 的溶解性的条件下，可能发生解吸作用。
[0098]例如，已经发现，可以通过酞菁衍生物的吸附来官能化原 纤维。然后这些酞菁衍生物的原纤维可以作为固体载体用于蛋白质固 定化。仅通过选择酞菁的不同衍生物就可以向原纤维表面引入不同的 化学基团。
[0099]与现有技术中蛋白质固定的方法相比，酞菁衍生物的原纤 维在蛋白质固定中的应用是非常有益的。特别是，它们比共价修饰更 为简单。此外，酞菁衍生物的原纤维具有较高的表面肌，而且在范围 较宽的温度和pH下在大多数溶剂中都是稳定的。实施例10
卟啉和酞菁对原纤维的吸附
[00100]物理吸附原纤维的优选化合物是衍生的卟啉或酞菁，它 们是已知的强烈吸附石磨和碳黑的物质。数种化合物都是可用的，例 如四羧酸卟啉、酞菁钴(II)、或酞菁二钴。后两者可以衍生成羧酸的 形式。
酞菁化二锂
[00101]一般地，通过大多数的金属(特别是多价络合)从酞菁(Pc) 基中取代了2个Li+离子。因此，用与不易变化的配体结合的金属离 子取代2个Li+离子是在原纤维表面置放稳定的官能团的一种方法。 几乎所哟的过渡金属络合物都将从Pc基取代中Li+离子而形成稳定 的、不易变化的螯合物。然后这一点用适当的配体与金属结合。
酞菁钴(II)
[00102]钴(II)络合物对此是特别适合的.Co++离子可以被两个Li+ 取代而形成非常稳定的螯合物。然后Co++离子可以与配体例如烟酸配 位，烟酸包含具有侧羧基的吡啶环，并且已知优先和吡啶基结合。在 过量烟酸的存在下，Co(II)Pc可以电化学氧化成Co(III)Pc，与烟酸的 吡啶部分形成不易变化的络合物。因此，烟酸配体的游离羧酸基牢固 地结合到原纤维的表面。
[00103]其它适当的配体是氨基吡啶或乙二胺茶碱(侧基NH2)、 疏基吡啶(SH)或其它在一个终端包含氨基或吡啶部分并在另一端有所 需的功能的多功能配体。
[00104]卟啉或酞菁的负载能力可以通过当增加加入时溶液的的 脱色来确定。排出深色溶液(对于在MeOH中的四羧酸卟啉是深粉 红色，对于在丙酮或吡啶中的酞菁Co(II)或二锂是深蓝绿色)并通过 在原纤维的黑色表面上吸附来除去该分子。
[00105]通过这种方法来评价负载能力，衍生物的足迹法是由其近 似的测定(～140平方埃)来计算的。对于原纤维的平均表面积250 m2/g，最大的负载是～0.3mmol/g。
[00106]通过滴定来分析四羧酸卟啉。通过在周围和较高温度下 在水系统中色的释放来测试吸附的完整性。
[00107]在开始时混合原纤维浆体(韦林搅拌器)并在负载时搅拌。 当不再释放颜色时，超声处理一些浆体，但是没有效果。
[00108]在负载后，在相同的溶剂中洗涤运行号169-11、-12、-14 和-19-1(见表II)，以除去闭塞的色素。在洗涤洗脱液中得到了连续的 微浅色，这样就难以精确地确定饱和点。运行号168-18和-19-2用于 负载计算量的色素，并在负载后仅非常轻微地洗涤.
[00109]四羧酸卟啉(来自丙酮)和Co酞菁(来自吡啶)负载到原 纤维上用于进一步地记述特征.(运行号169-18和-19-2，分别地).
四羧酸卟啉的分析
[00110]加入过量的碱(pH11-12)导致该滴定浆体立刻变成粉红 色。当这不会与滴定相互作用时，显示了在较高的pH时卟啉解吸附。 通过过量的NaOH反滴定用pH7.5作为终点来确定羧酸的浓度。滴 定给出了1.10meq/g的酸负载，相当于0.275meq/g卟啉.
酞菁二锂或钴的分析
[00111]仅从脱色试验来评价这些被吸附物的浓度，在30分钟后 蓝-绿没有褪色的点就是饱和点。
[00112]在原纤维表面吸附了大量的取代的多核芳香族或多异核 芳香族化合物。为了吸附，芳香环的数量应当大于2个/环或侧官能团。 因此，包含3个稠合环的取代的蒽、菲等或包含4或更多稠合环的多 功能衍生物可以用于取代卟啉或酞菁衍生物.同样地，可以使用包含 4或更多环的取代的芳香杂环例如喹啉、或多取代的杂芳环。
[00113]表2概述了3种卟啉/酞菁衍生物负载试验的结果。
TCAPorph＝四羧酸卟啉 (cal)＝计算
DiLiPhth＝酞菁二锂 (T)＝滴定
CoPhth＝酞菁钴(H)
[00114]下列的实施例11和12说明了将两种不同的酞菁衍生物 吸附到碳纳米管上的方法.
实施例11
通过吸附酞菁四磺酸镍(II)官能化原纤维
[00115]将2mg酞菁四磺酸镍(II)(四钠盐)与4.2mg纯原纤维 在1ml dH2O中混合。声处理该混合物50分钟，并在室温下旋转过夜。
[00116]用3 x 1ml dH2O，3 x 1ml MeOH，和3 x 1ml CH2Cl2 洗涤原纤维，并真空干燥.
[00117]在这些酞菁衍生物的原纤维上通过吸附固定嗜热菌蛋白 酶。将0.5mg原纤维悬浮于250μl dH2O中 ，声处理20分钟。排出 上清液，将原纤维悬浮于250μl 0.05M Tris(pH＝8。0)中，与相同缓 冲液制成的250μl 0.6mM嗜热菌蛋白酶溶液混合。混合物在室温下 旋转2小时，在4℃下贮存过夜。然后用1ml 25mM Tris(pH＝8)洗 涤3次。并悬浮于pH7.5的包含40mM Tris和10mM CaCl2的250μl 缓冲液中。
[00118]通过测定原纤维的酶活性来确定原纤维上嗜热菌蛋白酶 的量.嗜热菌蛋白酶可以与底物FAGLA(N-(3-[2-呋喃基]丙酰基)-甘 氨-亮氨酰胺)反应，生成导致在345nm吸光度降低的化合物，消光系 数为-310M-1cm-1。该反应的分析缓冲液条件是40mM Tris，10mM CaCl2和1.75M NaCl，pH为7.5。反应在1ml试管中进行，将5μl FAGLA母液(在dH2O中的25.5mM 30％ DMF)和10μg嗜热菌蛋白 酶原纤维在1ml的分析缓冲液中混合。扫描10分钟以上检测到345nm 处吸光度降低。然后用消光系数为-310M-1cm-1从初始斜度来计算酶 活性(μM/分钟)。每g原纤维中活性嗜热菌蛋白酶的量是0.61μ摩尔。
实施例12
通过吸附1，4，8，11，15，18，22，25-八丁氧基-29H，31H-酞菁官能化原纤维
[00119]取3mg1，4，8，11，15，18，22，25-八丁氧基-29H，31H-酞菁和 5.3mg的纯原纤维在1ml的CHCl3中混合。声处理该混合物50分钟 并在室温下旋转过夜。
[00120]用3 x 1ml的CH2Cl2洗涤该原纤维并真空干燥。
[00121]根据实施例34的方法通过吸附将嗜热菌蛋白酶固定于酞 菁衍生物的原纤维上。每g原纤维中活性嗜热菌蛋白酶的量是0.70μ 摩尔。
实施例13
用酞菁衍生物的原纤维和固定于其上的嗜热菌蛋白酶合成阿司帕坦前 体
[00122]固定了嗜热菌蛋白酶的酞菁衍生物的原纤维可以用于催 化人造甜味剂阿司帕坦的前体的合成.进行该反应，包括使用10μM 固定了嗜热菌蛋白酶的原纤维在乙酸乙酯中与80mM L-Z-Asp和220 mM L-PheOMe混合。通过HPLC检测产物Z-Asp-PheOMe以确定 收率。
5.氯酸或硝酸的氧化
[00123]通过强氧化剂例如在浓硫酸或硝酸中的氯酸钾氧化石墨 的文献，包括R.N.Smith，Quarterly Review 13，287(1959)；MJ.D. Low，Chem.Rev.60.267(1960)).一般地，攻击边缘碳(包括缺失位 点)可以得到羧酸、酚和其他氧化基团的混合物。其机理是复杂的， 包括自由基反应。
实施例14
用氯酸盐制备羧酸官能化的原纤维
[00124]CC原纤维的样品在浓硫酸中浆化，包括用铲混合，然后 转移到具有气体进口/出口和顶搅拌器的反应烧瓶中。在搅拌和缓慢的 氩气流下，在运行期间在RT下分份加入NaClO3.在运行的全过程 中产生了氯蒸汽，将其清除出反应器中进入NaOH trap.水溶液中。 运行结束后，将原纤维浆体倾倒入碎冰中，真空过滤.然后把滤饼转 移到Soxhlet圆筒滤纸上，用DI水在Soxhlet提取器中洗涤，每隔数 小时交换新鲜水。继续洗涤直至原纤维的样品在加入新鲜DI水后不 会改变水的pH。然后过滤分离原纤维，在5”真空和100℃干燥过夜。
[00125]确定羧酸的量，包括讲样品与过量0.100N NaOH反应， 并用0.100N HCl反滴定至pH7.5的终点。结果列于下表。
表III
直接进行氧化的概要
实施例15
用硝酸制备羧酸官能化的原纤维
[00126]在具有顶搅拌器和水冷凝器的圆底多颈有痕的反应烧瓶 中将原纤维的已称重样品与适当强度的硝酸浆化.在恒速搅拌下，调 节温度，并在特定时间进行反应.在温度超过70℃时，不论酸的强 度如何，都立刻释放出了棕色的烟雾。反应后，将浆体倾倒入碎冰中， 并用DI稀释。过滤该浆体，在Soxhlet提取器中洗涤除去过量的酸， 每隔几小时用新鲜的DI水取代容器中的水，直至浆体样品不改变DI 水的pH.在5”真空和100℃将原纤维干燥过夜。已称重部分的原纤 维与标准的0.100N NaOH反应，用0.100N HCl反滴定来确定羧酸 的含量。通过XPS确定表面氧的含量。通过在韦林搅拌器中高速混合 2分钟来确定在水中0.1wt％的可分散性.结果概述于表4中。
表IV
直接进行氧化的概要
P＝差；G＝好
6.原纤维的氨基官能化
[00127]氨基可以直接引入到石墨原纤维上，包括根据如下通式， 用硝酸和硫酸处理原纤维，得到硝化原纤维，然后用还原剂例如低亚 硫酸钠还原该硝化型得到氨基官能化的原纤维：
所得到的原纤具有众多的用途，包括固定蛋白质(例如酶和抗体)、 以及亲和和离子交换色谱。
实施例16
用硝酸制备氨基官能化的原纤维
[00128]向原纤维(70mg)的水1.6ml)和乙酸0.8ml)冷混悬液中 以滴加的方式加入硝酸(0.4ml)。在0℃将反应混合物搅拌15分钟， 在室温下再搅拌1小时。缓慢加入硫酸(0.4ml)和盐酸(0.4ml)的混合 物，在室温下搅拌1小时。停止反应并离心。除去水层，用水(X5)洗 涤原纤维。用10％氢氧化钠(X3)处理残留物，用水(X5)洗涤，得到硝 化的原纤维。
[00129]在0℃下向原纤维s.向硝化原纤维的水(3ml)和氨水 (2ml)的混悬液中分三次加入低亚硫酸钠(200mg)。在室温下搅拌反 应混合物5分钟，在100℃下回流1小时.停止反应，冷却至0℃， 用乙酸(pH4)调节pH，在室温下放置过夜后，过滤该混悬液，用水(X 10)，甲醇(X5)洗涤，真空干燥得到氨基原纤维。
[00130]为了试验氨基官能化的原纤维，将该原纤维与辣根过氧 化物酶结合。然后将与HRP结合的氨基原纤维广泛透析。在透析后， 在下一周里将原纤维洗涤15次。如下分析酶修饰的原纤维：
[00131]结果表明，在保存超过一周以后，与原纤维-NH2结合的 HRP显示了良好的酶活性。
7.用自由基引发剂结合末端的醇
[00132]当其用于苛刻环境中时，碳纳米管的高度稳定性使得它 们难以活化而进一步修饰。现有的方法包括使用强的氧化剂和酸。现 在令人惊奇地发现，用自由基引发剂例如过氧化苯甲酰(BPO)可以把 末端醇结合到碳纳米管上。向碳纳米管上加入通式为RCH2OH的醇， 其中R是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基、芳基、或聚(烷基醚)和 自由基引发剂，并从约60℃加热到约90℃。优选的醇包括甲醇和乙 醇。当足够所有的自由基引发剂分解的时间过去后，过滤反应混合物， 洗涤碳纳米管物质并干燥，得到通式纳米管-CH(R)OH的修饰的纳米 管。该方法也可以用于连接双功能的醇。这就允许一端连接碳纳米管， 而另一端用于与表面的其他物质间接连接。
实施例17
用过氧化苯甲酰制备醇官能化的纳米管
[00133]用探针超声波破碎器将0.277g的碳纳米管分散到MeOH 中。在RT下加入0.126g的BPO，温度升高到60℃，加入0.129g的 BPO原料，混合物在60℃下再保持30分钟。在膜上过滤产品，用 MeOH和EtOH洗涤几次，在90℃的烤箱中干燥。收率是0.285g。 ESCA分析表明，氧含量是2.5％原子，与此相比，在不含BPO的MeOH 中回流的对照样品是0.74％。
实施例18
用过氧化苯甲酰修饰含聚(乙二醇)的碳纳米管
[00134]将0.1g的碳纳米管、0.5g BPO和10g聚(乙二醇)avg.mol. wt.1000(PEG-1000)在室温下混合在一起。温度加热到90℃使PEG 熔化，将混合物保持在90℃反应过夜.然后过滤全部混合物，洗涤 除去过量的PEG，然后干燥.可以使用所得到的物质，或者可以通过 向PEG的自由末端结合感兴趣的物质而进一步修饰。
实施例19
PEG修饰的碳纳米管在减少非特异性结合中的应用
[00135]与表面积较大的碳类物质非特异性结合是普遍存在的. 已经发现，结合亲水性低聚物例如PEG到碳纳米管上可以降低非特 异性结合。此外，已经发现，在碳纳米管的表面结合链样分子例如 PEG，其自由末端可以包含能与其他感兴趣物质结合的官能团，同时 仍保留了PEG(或其他物质)层减少非特异性结合的性质.
PEG修饰的原纤维减少牛血清白蛋白的非特异性结合
[00136]制备0.1mg/ml的未修饰的原纤维、氯酸盐氧化的原纤 维和PEG修饰的原纤维的pH7.0的50mM磷酸氢二钾缓冲液的母分 散液包括将1.0mg的每种物质用声处理分散在10mis的缓冲液中.在 9个聚丙烯管中放入2mis的每种的2倍连续稀释液。向每个管和三个 空白缓冲液中加入100μl 0.2mg/ml牛血清白蛋白的相同缓冲液溶液。 也制备不含蛋白质的三个缓冲液管.所有管都在涡旋混合物上混合， 培养30分钟，其中每10分钟涡旋30秒。离心分离所有的管以分离 原纤维，将1ml等分的上清液转移到新管中，用微BCA蛋白分析法 (Pierce)分析总蛋白含量。在上清液中保留的蛋白质的水平是与原 纤维非特异性结合的量的间接测定值。对于PEG修饰的原纤维，所 有BSA都保留在上清液中，同时它们与未修饰或氯酸盐氧化的原纤 维几乎完全结合(附图1)。
用过氧化苯甲酰制备的PEG修饰的原纤维与通过NHS结合非特 异性结合减少的比较
[00137]用声处理在50mM磷酸氢二钾缓冲液，pH7.0中制备1.0 mg/ml过氯酸盐氧化的原纤维，用过氧化苯甲酰被PEG修饰的原纤 维和过氯酸盐氧化的，通过NHS酯结合被PEG修饰的原纤维的母分 散液.在7个聚丙烯管中放入2mis的每种的3倍连续稀释液。向每 个管和三个空白缓冲液中加入100μl 0.2mg/ml β-乳球蛋白(βLG) 的相同缓冲液溶液.也制备不含蛋白质的三个缓冲液管。所有管都在 涡旋混合物上混合，培养60分钟，其中每10分钟涡旋30秒。离心 分离所有的管以分离原纤维，将1ml等分的上清液转移到新管中，用 微BCA蛋白分析法(Pierce)分析总蛋白含量。在上清液中保留的蛋 白质的水平是与原纤维非特异性结合的量的间接测定值(见附图2). 对于每个管，经NHS酯途径用PEG修饰的原纤维，βLG都保留在上 清液中，表明不存在非特异性结合。经BPO途径用PEG修饰的原纤 维在1.0mg/ml的原纤维最高水平时仅显示βLG轻微的结合(约 10％)，在低水平时则没有显著的结合。相反地，在1.0mg/ml和上述 的原纤维水平时几乎与氯酸盐氧化的原纤维完全结合，在原纤维低至 0.01mg/ml仍基本上结合。
8.官能化纳米管的次级衍生物
羧酸官能化的纳米管
[00138]可以仅由羧酸制备的次级衍生物的数量基本上是无限 的。醇或胺易于与酸结合形成稳定的酯或酰胺.如果醇或胺是部分的 二-或双功能多功能分子，那么通过O-或NH-连接将使其他的功能性 成为侧基。次级试剂的典型实施例是：
通式 侧基 实施例
HO-R，R＝烷基，芳烷基，芳基， R- 甲醇、酚、三氟烃基、OH-末端聚酯、硅醇
氟代醇、聚酯、SiR’3
H2N-RR＝与上述相同 R- 胺、苯胺、氟代胺、硅烷基胺、胺基末端的聚酰胺、蛋白质
Cl-SiR3 SiR3- 氯硅烷
HO-R-OH，R＝烷基， HO- 乙二醇、PEG、五赤藻糖醇、双酚A
芳烷基，CH2O-
H2N-R-NH2，R＝烷基， H2N- 乙二胺氨茶碱、聚乙烯胺
芳烷基
X-R-Y，R＝烷基等； Y- 聚胺酰胺、巯基乙醇
X＝OH或NH2；Y＝SH，CN，
C＝O、CHO、烯、炔、芳基、
杂环
[00139]该反应可以用任何方法来进行，以便用醇或胺酯化或胺 化羧酸。其中，使用H.A.Staab，Anagew.Chem.Intemat.Edit.，(1)， 351(1962)的方法，用N，N’-羰二咪唑(CDI)作为酰化剂制备酯或酰胺； 使用G.W.Anderson，等人，J.Amer.Chem.Soc.86，1839(1964)的 方法，用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧酸以酰胺化。
实施例20
官能化原纤维的次级衍生物的制备
N，N’-羰二咪唑
[00140]该方法需要澄清的、干燥的非质子溶剂(例如甲苯或二 噁烷)。化学量的试剂是足够的。对于酯，羧酸化合物在惰性气体(氩 气)中在甲苯中与化学量的溶解在甲苯中的CDI在RT下反应2小时。 在此期间，释放出CO2。2小时后，加入醇和催化量的乙醇钠，继续 在80℃反应4小时。对于平常的醇，收率是定量的。该反应是：
1.R-COOH+Im-CO-Im---------->R-CO-Im+HIm+CO2，Im＝咪唑，
HIm＝咪唑
2.
[00141]胺的酰胺化在RT下不催化即可发生。该方法的第一步 是相同的。在释放出CO2后，在室温下加入化学量的胺，反应1-2小 时。该反应是定量的。该反应是：
3.R-CO-Im+R’NH2--------------->R-CO-NHR+Him
硅烷基化
[00142]三烷基硅烷基氯或三烷基硅醇与酸性的H立即根据如下 反应式反应：
R-COOH+Cl-SiR’3----------------->>R-CO-SiR’3+HCl
[00143]少量的重氮-1，1，1-二环辛烷(DABCO)用作催化剂。适 当的溶剂是二噁烷和甲苯。
磺酸-官能化的原纤维
[00144]如实施例1制备的芳基磺酸可以进一步反应得到次级衍 生物。磺酸可以被LiAlH4或三苯基膦和碘的组合(March，J.P.，p.1107) 还原成硫醇。它们也可以通过与二烷基醚反应转变成磺酸酯，即原纤 维～SO3H+R-O-R--------->原纤维-SO2OR+ROH
N-羟基琥珀酰亚胺
[00145]用伯胺酰胺化来活化羧酸可以通过N-羟基琥珀酰酯来完 成；碳二亚胺用于阻碍水以取代的脲释放.然后在RT下将NHS酯通 过与伯胺反应而转换成酰胺。该反应是：
1.R-COOH+NHS+碳二亚胺----------->R-CONHS+物质脲
2.R-CONHS+R’NH2-------------->R-CO-NHR’
[00146]该方法特别是可以用于蛋白质和石墨原纤维经蛋白质侧 链的游离NH2共价结合.可以通过该方法固定在原纤维上的蛋白质的 例子包括胰蛋白酶、抗生蛋白链菌素和卵白素。抗生蛋白链菌素(或 卵白素)原纤维为任意的生物素化的底物提供了固体载体。
实施例21
原纤维和蛋白质经NHS酯共价结合
[00147]为了证明蛋白质可以经NHS酯共价结合到原纤维上，按 如下方法将抗生蛋白链菌素、卵白素和胰蛋白酶结合到原纤维上。
[00148]用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤0.5mg的NHS-酯 原纤维，弃去上清液。向原纤维中加入200μl抗生蛋白链菌素溶液(在 相同缓冲液中，1.5mg)，在室温下旋转混合物5.5小时，然后用1ml 下列的缓冲液依次洗涤原纤维：5mM磷酸钠(pH7.1)，PBS(0.1mM磷 酸钠，0.15mM NaCl，pH7.4)，ORIGENTM分析缓冲液(IGEN，Inc.， Gaithersburg，MD)和PBS。抗生蛋白链菌素原纤维贮存在PBS缓冲 液中用于进一步的应用。
[00149]将2.25mg NHS-酯原纤维在500μl的5mM磷酸钠缓 冲液(pH7.1)中声处理40分钟，弃去上清液。将该原纤维悬浮于500 μl的5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)中，加入300μl的卵白素溶液，其 中卵白素溶液是在包含2mg卵白素的相同的缓冲液中制成的 (Sigma，A-9390).在室温下将该混合物旋转2小时，在4℃下贮存 过夜，在室温下再旋转1小时。用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)将原 纤维洗涤4次，用PBS缓冲液洗涤2次.将卵白素原纤维悬浮于200μl PBS缓冲液中贮存。
[00150]胰蛋白酶原纤维的制备，包括将1.1mg NHS-酯原纤维 (如卵白素原纤维处理)和在5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)中制备的 200μl的1.06mM胰蛋白酶溶液混合，在室温下旋转6.5小时。然后 将胰蛋白酶原纤维用1ml的5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤3次， 并悬浮于400μl的相同缓冲液中贮存。
实施例22
原纤维上胰蛋白酶的酶活性的测定
[00151]胰蛋白酶可以与底物L-BAPNA(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸 对硝基苯胺)反应，释放出在410nm吸收光的有色化合物。该反应的 分析缓冲液是0.05M Tris，0.02M CaCl2，pH8.2。该反应在1ml试 管中进行，包括将5μl的L-BAPNA母液(在H2O中50mM的37％ DMSO)和10-25μg的胰蛋白酶原纤维在1ml的分析缓冲液中混合。 在10分钟后，在410nm处检测到吸光度增加.然后从开始的斜度计 算酶活性(μM/分钟)。
[00152]对于共价结合的胰蛋白酶原纤维，该活性是每13μg原 纤维5.24μM/分钟。该结果也可以转变成在原纤维上的活化胰蛋白酶 的量，包括除以已知浓度的胰蛋白酶溶液的活性，已知浓度的胰蛋白 酶溶液在相同分析条件下测定是每1μM胰蛋白酶46μM/分钟。因 此，每g原纤维的活化胰蛋白酶的量是8.3μ摩尔(或195mg)。
实施例23
具有表面硫醇的碳纳米管
[00153]将通过实施例27(下文)制备的用乙二胺氨茶碱修饰的 0.112g的氨基碳纳米管(CN)悬浮于包含50mM EDTA的20mis pH 8.0的0.05M磷酸氢二钾缓冲液。将该混悬液在Branson 450 Watt 探针超声破碎器重声处理5分钟以分散CN。所得到的混悬液是十分 粘稠的。搅拌下通入氩气起泡30分钟.加入50mg的2-亚胺基硫 醇.HCl，将混合物继续搅拌在氩气下继续反应70分钟。在聚碳酸酯 膜过滤器上过滤所得到的物质，用缓冲液洗涤2X，用DI水洗涤1X， 用纯净EtOH洗涤2X，全部在氩气覆盖下进行。硫醇修饰的CN置 于真空干燥器中，抽吸过夜
[00154]最终重量＝0.118g，根据重量增加，转变率为55％。
[00155]用声处理将硫醇化纳米管的10mg样品悬浮于10mis.的 DI水中，在0.45μm尼龙膜上过滤形成毯样的物质。先将该物质部 分贮存在真空干燥器中，然后用ESCA分析，该分析显示有0.46％硫 和1.69％氮，证明成功地转变成了硫醇修饰的CN。
实施例24
硫醇修饰的碳纳米管与含金表面的结合
[00156]用1份30％ H2O2和3份浓硫酸的溶液清洗金箔 (Alfa/Aesar)，2cm x 0.8cm，共10分钟，并用DI水清洗。箔碎片与 Au线头相连并其电化学在1M H2SO4中以50mv/秒的速度在-0.35V vs.Ag/AgCl到1.45V vs.Ag/AgCl之间循环，直至循环伏安图在约10 分钟没有改变为止。然后用DI水清洗并干燥。大的碎片切割成4个0.5 cm x 0.8cm的条。
[00157]将通过氩气冲洗去氧的10mis的纯EtOH分别置于2个 玻璃瓶中。在一个瓶中，悬浮了16mg的硫醇修饰的CN(CN/SH)和 2个Au碎片，而在另一个瓶中用Au的1个碎片和10mg的乙二胺 修饰的CN使得硫醇衍生化。所有的操作都在充满氩气的手套袋中进 行。在氩其中密封该瓶，置于冷冻的超声浴中1小时。将密封的瓶在 RT下放置72小时.从瓶中除去Au样品，用EtOH冲洗3X，空气干 燥并置于保护性的瓶中。
[00158]通过扫描电子显微镜术(SEM)检查暴露在CN/乙二胺氨 茶碱和CN/SH中的Au箔样品来检测表面上CN的存在与否.在 40,000X下的检查表明在暴露于CN/SH的表面上存在CN的分布，但 是在暴露于CN/乙二胺氨茶碱的Au箔样品上没有观测到CN。
实施例25
由氨基原纤维制备马来酰亚胺原纤维
[00159]根据实施例13制备氨基原纤维。然后将氨基原纤维(62.2 mg)在磷酸钠缓冲液(5ml，5mM，pH7.2)中声处理。向原纤维混悬 液中加入Sulfosuccinmidyl-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐 (SMCC；28.8mg，0.66mmols；Pierce，Cat.No.22360).在室温下 搅拌反应混合物果也。用水和甲醇洗涤原纤维，真空干燥产物原纤维。 固定在产物上的抗体证明了马来酰亚胺原纤维的存在.其他具有不同 连接子的马来酰亚胺(例如，磺基-SMCC、succinimidyl 4-[对马来酰 亚胺苯基]丁酸[SMPB]、磺基-SMPB、m-马来酰苄基-N-羟基琥珀酰 亚胺酯[MBS]、磺基-MBS等)原纤维也可以通过相同的方法来制备。
[00160]所得到的马来酰亚胺原纤维可以用作蛋白质例如抗体和 酶的共价固定的固体载体，抗体共价固定于马来酰胺的活化原纤维 上。当使用从硝化/还原法(实施例13)获得的氨基原纤维时，抗体的 容量是每g原纤维1.84mg，而当使用羧基原纤维制备的氨基原纤维时 为每g原纤维0.875mg。
实施例26
从羧酸-官能化的原纤维制备酯/醇类衍生物
[00161]如实施例14制备羧酸官能化的原纤维.羧酸的含量是0.75 meq/g。原纤维与化学量的以甲苯为溶剂的CDI在惰性大气中在室温 下反应，直至CO2停止释放。然后，该浆体在80℃下与10倍摩尔过 量的聚乙烯二醇(MW 600)反应，加入少量NaOEt作为催化剂.反 应2小时后，过滤分离原纤维，用甲苯洗涤，并在100℃干燥。
实施例27
由羧酸官能化的原纤维(177-041-1)制备酰胺/胺衍生物
[00162]搅拌下在具有血清停止器的100ml RB烧瓶中将0.242g 的氯酸盐氧化的原纤维(0.62meq/g)悬浮于20ml无水二噁烷中。加 入20倍摩尔过量的N-羟基琥珀酰亚胺(0.299g)并溶解.然后加入20 倍摩尔过量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)(0.510 g)，继续在室温下搅拌2小时。在这段时间结束后停止搅拌，抽取上 清液，用无水二噁烷和MeOH洗涤固体，在0.45微米的聚砜膜上过 滤。在滤膜上再用MeOH洗涤固体，真空干燥直至观测到重量不再 减少.根据所观测到的重量增加6％，NHS-活化的氧化原纤维的收率 是100％。
[00163]将100μl乙二胺氨茶碱(en)加入到10ml 0.2M NaHCO3 缓冲液中。加入等量的乙酸(HOAc)以维持pH在8左右。在强力搅 拌下加入NHS-活化的氧化原纤维(0.310g)并反应1小时.10分钟 后再加入300μl的en和300μl HOAc。在0.45微米的聚砜膜上过滤 该溶液，并用NaHCO3缓冲液，1％HCl，DI水和EtOH连续洗涤。 真空干燥该固体过夜.通过与NaOH(177-046-1)反应，HCl盐又变 回成游离的胺用于进一步的分析和反应。
[00164]进行ESCA以确定胺化原纤维(GF/NH2)中N的存在量。 177-046-1的ESCA分析表明含有0.90 at％ N(177-059).为了进一步 评价在易受影响和反应性胺基中N的量，制备一种衍生物，包括与五 氟苯甲醛气相反应生成相应的与伯胺基有效连接的Schiff碱。ESCA 分析仍然表明了，如所期望，含0.91 at％N和1.68 at％ F.这可以转 换成在胺化原纤维上作为反应性伯胺存在的N是0.34 at％(每个五氟 苯甲醛分子含5个F)。假设在每个N的游离末端完全反应的话，N的 水平应当是0.45 at％。所观测到的水平表明，N与NHS-活化的原纤 维的反应具有非常高的收率，证明了可用的游离胺基的反应性.
[00165]由ESCA数据计算作为游离胺存在的0.34 at％的N的水 平，通过游离的胺基这几乎是原纤维的全部范围，这就允许与其它物 质连接。
[00166]羧基原纤维也可以转变成氨基原纤维，包括使用单-保护 1，6-二氨基己烷(以中六碳连接子)，而不是乙二胺氨茶碱(一种二 碳连接子)。
实施例28
由羧酸官能化的原纤维制备胺衍生物
[00167]修饰原纤维上的羧基，包括将羧基与具有两个或多个氨 基的化合物(至少一个氨基是没有例如t-Boc或CBZ的基团保护的) 上的一个氨基反应.这样制备的原纤维是酰胺衍生物，其中酰胺羰基 来自原纤维的羧基，酰胺氮被包含一个或多个伯胺的基团(例如烷基) 所取代。然后氨基可以有效地使用或者进一步修饰。
[00168]取1g的碳原纤维置于干燥的scintered玻璃过滤管中， 其出口用橡胶血清隔片紧紧地塞住，加入无水二氯甲烷覆盖。加入N- 甲基吗啉(758μL，7mmol)，用药铲辅助混合混悬液。然后加入氯甲 酸异丁酯(915μL，7mmol)，混悬液定期混合1小时。通过石蜡膜尽 可能多地覆盖以使该混合物远离大气中的水蒸汽。
[00169]同时，盐酸N-boc-l，6-二氨基基烷(1.94g，7.7mmol)在 二氯甲烷(10mL)和1M NaOH(10mL)之间分层。较低的有机相在 无水碳酸钾上干燥，过滤通过包含棉花塞的一次性巴斯德吸管，加入 N-甲基吗啉(758μL，7mmol)。
[00170]从过滤漏斗中除去血清隔片，真空过滤从原纤维中除去 试剂，用无水二氯甲烷洗涤原纤维。将血清隔片放回，向原纤维中加 入N-甲基吗啉和单保护的二氨基己烷。周期性搅拌混合物1小时。然 后，过滤除去试剂，一次用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇和二氯甲烷洗 涤原纤维。
[00171]向原纤维中加入三氟酸和二氯甲烷的50％混合物，周期 性搅拌混合物20分钟。过滤除去溶剂，依次用二氯甲烷、甲醇、水、 0.1M NaOH和水洗涤原纤维。
[00172]为了证明方法的有效性，用氨基原纤维的小样品与被修 饰与氨基特异性反应的”活化的”辣根过氧化物酶(HRP；5mg，Pierce) 反应。在几天内反复洗涤原纤维(混悬、旋转、和在Eppendorf微量 离心管中离心)，同时保持冷却。在洗涤约2周后，用H2O2/ABTS在 甘氨酸缓冲液，pH4.4中分析酶.10分钟内溶液显现绿色，表明了酶 的存在。对照的原纤维(用活化的HRP处理的COOH原纤维并在同 样的时间洗涤)显示，如果有任何的催化活性，也几乎没有酶。
实施例29
由羧酸官能化的原纤维制备硅甲烷衍生物
[00173]在惰性大气中，将如实施例14制备的酸官能化的原纤维 在二噁烷中浆化。搅拌下，加入化学量的氯三乙基硅烷，反应0.5小 时，然后滴加几滴5％DABCO的二噁烷溶液.系统再反应1小时， 然后过滤收集原纤维，在二噁烷中洗涤。该原纤维在100℃5”真空中 干燥过夜。
[00174]表V概述了次级衍生物的制备。通过分析ESCA分析产 物的C、O、N、Si和F的表面含量。
表V
次级衍生物制备的概述
实施例30
由羧酸-官能化的原纤维制备硅烷衍生物
[00175]在惰性大气中，将如实施例14制备的酸官能化的原纤维 在二噁烷中浆化。搅拌下，加入化学量的氯三乙基硅烷，反应0.5小 时，然后滴加几滴5％DABCO的二噁烷溶液。系统再反应1小时， 然后过滤收集原纤维，在二噁烷中洗涤。该原纤维在100℃5”真空中 干燥过夜。
[00176]表VI概述了次级衍生物的制备。通过分析ESCA分析产 物。该分析表明掺入了所需的侧基。通过分析ESCA分析产物的C、 O、N、Si和F的表面含量。
表VI
次级衍生物制备的概述
实施例31
由羧酸官能化原纤维制备叔胺和季胺衍生物
[00177]叔胺和季胺官能团可以经酰胺或酯键经纳米管的羧基和 叔胺和季胺前体的胺或羟基结合到碳纳米管的表面。这些叔胺和季胺 元纤维可以作为色谱基质用于生物分子的分离。叔胺和季胺原纤维可 以装配到盘状的垫中或与常规的色谱基质(例如琼脂糖)混合用于分 离的目的。
碘化三乙基乙醇胺前体的制备
[00178]在100ml圆底烧瓶中，将10g N，N-二乙基乙醇胺(85.3 mmole)与10ml无水甲醇混合。然后用吸量管滴加20g碘乙烷(127.95 mmole)和10ml无水甲醇的混合物。将反应混合物回流30分钟。当 反应混合物冷却至室温时，形成了白色晶体产物。过滤收集白色固体 产物，并用无水甲醇洗涤.产物在干燥器中进一步真空干燥过夜。得 到的产物(10.3g，37.7mmole)收率是33％。
季胺官能化的石墨原纤维的制备
[00179]在真空干燥的25ml Wheaton一次性闪烁瓶中，将100mg 干燥羧基原纤维(每g原纤维约0.7mmole COOH)与2ml无水二甲 基酰胺，将混合物声处理60秒.向反应瓶中加入2L二甲基酰胺二 甲基酰胺，39mg二甲基-氨基吡啶(0.316mmole)，和50μl二异丙基 碳二亚胺(0.316mmole)。在室温下将反应混合物搅拌1小时，然后 向该瓶中加入88mg碘化三乙基乙醇胺(0.316mmole)，反应进行过 夜。所得到的原纤维用20ml二甲基酰胺洗涤3次，用20ml二氯 甲烷洗涤3次，用20ml甲醇洗涤3次，最后用去离子水洗涤3次。 真空干燥该产物.对氮元素分析的结果表明原纤维上约50％的羧基 已经与季胺部分的伯氨基反应
实施例32
在叔胺官能化的石墨原纤维上牛血清白蛋白(BSA)的色谱法
[00180]将包含60mg 2-乙基氨基乙胺修饰的羧基原纤维和180mg 葡聚糖凝胶G-25超精细树脂(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的含水 浆体在室温下保存过夜，以确保固体载体的完全水合。将浆体装入到 1cm x 3.5cm柱中。该柱用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)以0.2ml/分 钟的流速平衡.在柱上负载BSA(0.6mg，在0.1ml去离子水中)。 用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)以0.2ml/分钟的流速洗脱该柱，收集 0.6ml的部分。用UV-可见探测器检测洗脱图，如附图3所示。由于 该探测器表明没有蛋白质从柱中洗脱，通过加入在5mM磷酸钠(pH 7.3)中的1M KCl洗脱结合的BSA。在每个部分中蛋白质的存在可以 通过微BCA分析(Pierce，Rockford，II)来鉴别。
实施例33
在季胺官能化的石墨原纤维上牛血清白蛋白(BSA)的色谱法
[00181]将包含100mg 2-(2-三乙基氨基乙氧基)乙醇修饰的羧基 原纤维和300mg葡聚糖凝胶G-25超精细树脂(Pharmacia， Uppsala，Sweden)的含水浆体在室温下保存过夜。所得到的浆体用于 装入到1cm直径的柱中。该柱用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)以0.1- 0.6ml/分钟的流速平衡。在柱上负载BSA(2.70.6mg，在0.2ml去离 子水中)。用5mM磷酸钠以0.2ml/分钟的流速洗脱该柱，收集0.6ml 的部分。用UV-可见探测器检测洗脱图(附图4).由于该探测器表明 蛋白质不会被5mM磷酸钠缓冲液洗脱，改变溶剂成为5mM磷酸钠 (pH7.3)中的1M KCl。在每个部分中蛋白质的存在可以通过微BCA 分析(Pierce，Rockford，II)来鉴别。
9.石墨碳的酶官能化
[00182]生物催化剂可以用于将官能团引入到石墨碳，特别是碳 纳米管的表面.直到现在，是通过纯化学方法修饰石墨碳(参见例如， 1994年12月8日提交的U.S.申请序列号08/352,400)。这些化学方法 具有如下缺点：(1)条件苛刻(使用极高的温度，极大酸性或毒性的 化学物质)，和(2)缺乏特异性(例如，氧化可以引入COOH、COH、 和CHO基).制备的固体石墨碳(例如碳原纤维；Hyperion，Inc.) 的水混悬液包含一种或多种能作为底物接受石墨碳并进行化学反应形 成化学修饰的石墨碳的酶。将水混悬液保持在酶进行反应可接受的条 件(温度、pH、盐浓度等等)下一段时间，该时间足以使酶催化修饰 石墨碳的表面。在反应期间，继续混合混悬液以使酶通向石墨碳的表 面。在反应达到令人满意的程度可接受的反应时间后，从碳中过滤洗 涤除去酶。
[00183]碳纳米管.迄今为止，使用两种类型的酶：细胞色素p450 酶和过氧化物酶。在两种情况中，对两种类型的酶都进行了良好的研 究，它们接受芳香族类型的底物，并找到了它们最佳的反应条件。两 种类型的酶将羟基引入到它们的底物中，并可以将羟基引入到石墨碳 中.除了酶以外，其他的生物催化剂例如核酶和催化抗体，或酶的非 生物学拟态可以用于催化官能化.
实施例34
用大鼠肝微粒体进行酶官能化
[00184]细胞色素p450酶一般认为作为去毒剂在肝中发挥功能(F. Peter Guengerich，American Scientist，81，440-447和F.Peter Guengerich，J.Biol.Chem.，266，10019-10022)。它们将外源性化合 物例如聚芳族毒性化合物羟基化。羟基化使得这些化合物变得能溶于 水，以使得它们可以经过尿从身体排出。在肝中有很多不同的细胞色 素p450酶，每一种都有不同的底物特异性.由于需要去毒的环境毒 素范围广泛，因此人们相信这些较宽范围的特异性是非常重要的。尽 管个体细胞色素p450是商业可用的，但没有关于它们作为底物是否 接受碳纳米管的任何信息。由于这种不确定性，我们决定用包含许多 不同的细胞色素p450的大鼠肝提取物开始培养碳纳米管。
[00185]在其饮用水中给2只大鼠(”试验性”大鼠)施用苯巴比 妥(1g/L，pH7.0)1周，来诱导细胞色素p450酶的表达。另两只大鼠 (”对照”大鼠)给予不含苯巴比妥的水。然后处死大鼠，通过标准方 法(参见，例如Methods in Enzymology，Vol.206)由它们的肝制备 包含细胞色素p450的微粒体.
[00186]线粒体与碳纳米管(原纤维)混合，以使细胞色素p450 与石墨碳反应。在这些试验中，5mg的原纤维(”纯”或非官能化 和”COOH”或氧化的原纤维)与微粒体(试验和对照微粒体)在包含 0.1M Tris，1.0mM NADPH，0.01％ NaN3，10mM葡萄糖-6-磷酸盐， 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1个单位/mL)，pH7.4的缓冲溶液中混合。包 括作为细胞色素p450和葡萄糖-6-磷酸盐的协同底物的NADPH，加 入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以从NADP+中再生(如果NADP+是由细胞色 素p450产生的)。在Eppendorf微量离心管中将反应物在室温下旋转 该混合物约1.5天.在培养后，在去离子水、1M HCl、1M NaOH、 0.05％ Triton X-100、0.05％Tween、甲醇、和1M NaCl广泛洗涤原 纤维。洗涤后，蛋白质(Pierce)的微BCA分析(Pierce)表明，原 纤维看上去仍然具有与它们连接的蛋白质(尽管在洗涤溶液中没有检 测到蛋白质)。
[00187]为了确定羟基是否引入到原纤维的表面，将原纤维与N- FMOC-异亮氨酸反应。不同批次的原纤维(对照和实验)(每组 1.5mg)与333ml的干燥DMF溶液反应，DMF溶液包含4.45mg/mL FMOC-异亮氨酸，1.54mg/mL二甲基氨基吡啶(DMAP)和2.6 mg/mL 1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)。反应两天后(通过连续旋转)， 用DMF、哌啶、甲醇、水、DMF、甲醇、二氯甲烷(每种600ml) 洗涤原纤维.将该洗涤顺序重复3次。将原纤维送入到Galbraith Laboratories(Knoxville，TN)中用于氨基酸分析，用于分析异亮氨酸 的存在.该结果是双关的，因为除了异亮氨酸外可见许多其他的氨基 酸，表明存在于大鼠肝微粒体提取物中的蛋白质、肽和氨基酸不能完 全从原纤维洗去。因此，由于在洗涤和分析方面的技术困难，不能确 定细胞色素p450是否使原纤维官能化。
实施例35
用商业可用的重组细胞色素p450酶官能化原纤维
[00188]为了避免与使用大鼠肝微粒体作为细胞色素p450来源 有关的杂质，购买个体细胞色素p450酶(GENTEST，Woburn，MA)。 由于细胞色素p450酶仅对膜具有活性的，提供这些酶用于微粒体的 制备.用与上述类似的反应方法，我们试验了下列的细胞色素p450： CYPlAl(cat.# Mlllb)、CYP1A2(cat.# M103c)、CYP2B6(cat.# HOa)、 CYP3A4(含还原酶，cat J 107r)。在反应溶液中也可以包括MgCh(0.67 mg/mL)。在该试验中，用Soxhlet装置洗涤原纤维.
[00189]进行引入的羟基的分析，包括细胞色素p450反应、洗 涤的原纤维与显色试剂3，5-二硝基苯甲酸(DNBA)反应.如上所述进 行N-FMOC-异亮氨酸的结合.在与DNBA反应后，用DMF洗涤原 纤维，用6M HCl或46个单位/mL猪肝酯酶(Sigma)水解残留的(共 价结合)DNBA。水解处理后，通过原纤维周围的上清液的HPLC分 析进行释放的DNBA的分析.释放的DNBA的HPLC分析在Waters HPLC系统上进行，该系统装备有Vydac C 18反相分析柱(cat.# 218TP54)和从包含0.1％TFA(溶剂A)的去离子水到包含0.1％TFA (溶剂B)的乙腈的梯度洗脱。
实施例36
用过氧化物酶官能化原纤维
[00190]对过氧化物酶底物特异性的文献描述表明，碳纳米管可 以是这些酶的底物(J.S.Dorick等人，Biochemistry(1986)，25， 2946-2951；D.R.Buhler等人，Arch.Biochem.Biophys.(1961)92， 424-437；H.S.Mason，Adyances in Enzymology,(1957)19，79；G.D. Nordblom等人，Arch Biochem.Biophys.(1976)175，524-533)。为了 确定过氧化物酶(过氧化氢酶，H型，Sigma)是否能将羟基引入到原 纤维的表面，将原纤维(11mg)混合到包含50mM乙酸钠(1.25mL， pH5.0)、辣根过氧化物酶(200nM)的溶液中，在反应的前3小时每 次加入5g二羟延胡索酸(共15mg)。在4℃下反应共进行5小时， 有气体氧断断续续地起泡。反应后，用水、1N NaOH、甲醇、和二 氯甲烷(每种200mL)洗涤原纤维。用已加热灭活的过氧化物酶进行 对照反应(100℃下5分钟).
[00191]为了分析过氧化物酶催化的原纤维羟化作用的程度，将 原纤维与叔丁基二甲基硅烷氯(Aldrich)在干燥DMF中在咪唑存在下 反应。洗涤原纤维后，将原纤维送入Robertson Microlit Laboratories， Inc(Madison，NJ)进行元素分析，分析掺入到原纤维中的硅。分析的 结果对于原纤维表面的硅的存在是双关的。据信，在该试验中使用的 玻璃器皿中的硅以小碎片的形式存在于原纤维中，以供元素分析.这 导致在试验和对照样品中硅的高水平.试验的结论是，过氧化物酶将 羟基引入到了原纤维中，但是技术困难阻碍了我们确定任意引入的羟 基的存在.
10.通过亲电子加成到不含氧的原纤维底物上或通过金属化官能化纳 米管
[00192]通过向不含氧的原纤维表面上加入活化的亲电子试剂获得 的主要产物是侧基-COOH、-COCl、-CN、-CH2NH2、-CH2OH、-CH2- 卤素、或HC＝O.可以根据下列反应式转变成次级衍生物：
原纤维-COOH------------>见上
原纤维-COCl(酰基氯)+HO-R-Y------------>F-COO-R-Y(Sec.4/5)
原纤维-COCl+NH2-R-Y------------>F-CONH-R-Y
原纤维-CN+H2------------>F-CH2-NH2
原纤维-CH2NH2+HOOC-R-Y------------>F-CH2NHCO-R-Y
原纤维-CH2NH2+O＝CR-R’Y------------>F-CH2N＝CR-R’-Y
原纤维-CH2OH+O(COR-Y)2------------>F-CH2OCOR-Y
原纤维-CH2OH+HOOC-R-Y------------>F-CH2OCOR-Y
原纤维-CH2-卤素+Y------------->F-CH2-Y+X-Y-＝NCO-、-OR-
原纤维-C＝O+H2N-R-Y------------>F-C＝N-R-Y
11.树枝状高分子的纳米管
[00193]可以降低纳米管表面的官能团的浓度，包括用一系列的 各代的多功能剂修饰该纳米管，该多功能剂导致用特异性官能团的数 量随着每一代增加，从而形成树枝状高分子样结构。所得到的树枝状 纳米管作为与蛋白质共价固定的固体载体是特别有用的，因为他们增 加了固定在纳米管表面的蛋白质的密度。本发明证明了特异性化学官 能性的高密度可以传递到表面积较高的微粒碳的表面，而这对于先前 的表面积较高的碳是困难的.
实施例37
基于赖氨酸的树枝状高分子的制备
[00194]反应顺序如附图5所示.
[00195]向氨基原纤维(90mg)的碳酸氢钠(5ml，0.2M，pH8.6) 混悬液中加入Nα，Nε-di-t-boc-L-赖氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(120 mg，0.27mmol)的二噁烷(5ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物过 夜。用水、甲醇和二氯甲烷广泛洗涤叔丁氧基保护的赖氨酸原纤维并 真空干燥。然后在室温下用三氟乙酸(5ml)在二氯甲烷(5ml)中处理 该叔丁氧基保护的赖氨酸原纤维2小时.用二氯甲烷、甲醇和水广泛 洗涤该产物氨基赖氨酸原纤维.然后用相同方法制备第二和第三代赖 氨酸原纤维。氨基酸分析数据表明，第一代的赖氨酸原纤维中每g原 纤维包含0.6μmol赖氨酸，第二代的赖氨酸原纤维中每g原纤维包含 1.8μmol赖氨酸，第一代的赖氨酸原纤维中每g原纤维包含3.6μmol 赖氨酸。
[00196]羧基树枝状高分子原纤维可以通过相同方法，使用天冬 氨酸或谷氨酸和羧基原纤维来制备.
实施例38
羧酸盐-末端的树枝状高分子的制备
[00197]具有碳纳米管(CN)核的羧酸盐-末端的树枝状高分子 的制备包括，氨基丁基-氨基三乙酸(NTA)的连续、有序结合，以氯酸 盐氧化的碳纳米管的NHS开始制备.
NTA的制备
[00198]根据Hochuli(E.Hochuli，H.Dobeli，and A.Schacher， J.Chromatography.411，177-184(1987))的方法制备NTA，通过参考 将其内容引入本文.
CN/NHS的制备
[00199]根据实施例20的方法制备CN/NHS。
CN/NTA的制备
[00200]将0.4g的NTA-HCl溶解于25mis的0.2M NaHCO3，pH 8.1中。加入1M NaOH将pH调回到高达7.8。加入0.5g的CN/NHS， 声处理该混合物以分散CN，搅拌下所得到的浆体留在反应中30分钟。 在0.45μm尼龙膜上过滤该浆体，在过滤器上用pH8.1的碳酸盐缓 冲液洗涤2X，用DI水洗涤2X。声处理下将该修饰的CN两次再悬 浮于25mis的MeOH中，过滤得到固体饼，最后在真空干燥器中干 燥。
CN/NTA/NTA的制备
[00201]首先将CN/NTA转变成NHS活性酯.。取0.396g的 CN/NTA在真空干燥器中在90℃干燥30分钟，然后置于装有30mis 无水二噁烷的100ml RB瓶中，并用氩气冲刷。搅拌下加入0.4g的 N-羟基琥珀酰亚胺，然后继续搅拌1小时后加入0.67g的EDC.在 此期间，CN聚集到了一起。排出二噁烷，用20mis的无水二噁烷2X 洗涤固体。在将聚集物打散的时候，用20mis的无水MeOH洗涤固 体。在0.45μm尼龙膜上过滤该固体，悬浮于MeOH中，过滤并在 过滤器上用MeOH洗涤。
[00202]取0.2g的NTA加入到50ml的烧瓶中，并加入10滴 1M NaOH使其溶解。加入pH8.1的20mis 0.2M NaHCO3，然后加入 全部CN/NTA/NHS，用探针超声破碎器轻轻地声处理该溶液.混合 物在室温下留在反应中2.5小时。在0.45μm尼龙膜上过滤该修饰的 CN，用碳酸盐缓冲液洗涤2X，声处理下再悬浮于DI水中，过滤并 用DI水洗涤。然后将它们置于真空干燥器中干燥.
CN/NTA/NTA/NTA的制备
[00203]按照上述的方法，加入添加水平的NTA.
CN/NTA/NTA/NTA/NTA的制备
[00204]按照上述的方法，加入添加水平的NTA。
[00205]声处理下将每个四代NTA添加物样品(约10mg)悬浮 于10mis的DI水中，在0.45μm尼龙膜上过滤形成毯样的物质。该 物质部分贮存于真空干燥器中，通过ESCA分析氮(N)以指示NTA 的相对量。结果显示于下表中。
物质 通过ESCA分析％N
CN/NTA 0
CN/NTA/NTA 1.45
CN/NTA/NTA/NTA 1.87
CN/NTA/NTA/NTA/NTA 2.20
[00206]ESCA结果证实，每个连续代掺入的增加量。
实施例39
碳纳米管树枝状高分子作为蛋白质载体
[00207]通过原纤维衍生具有树枝状高分子可以极大地提高固定在 碳纳米管上的蛋白质的密度。根据如下方法将辣根过氧化物酶(HRP) 固定在碳纳米管上。
[00208]在室温下，将纯原纤维(0.49mg)、氨基原纤维(0.32 mg)、第一代赖氨酸原纤维(0.82mg)、第二代赖氨酸原纤维和第三代 赖氨酸原纤维与碳酸氢钠共轭缓冲液(600μl，0.1M，包含0.9％NaCl) 声处理15分钟。在室温下，它们与HRP的碳酸氢钠共轭缓冲液(490 ml，enzyme stock solution of 5.6mg/ml)溶液培养19小时。用下列缓 冲液(1ml)洗涤固定有HRP的原纤维：包含0.9％ NaCl的10mM NaHCO3缓冲液pH9.5(IX洗涤缓冲液)洗涤7此，在IX洗涤缓冲 液中的0.1％ Triton X-100洗涤5次，在IX洗涤缓冲液中的50％ 二醇洗涤3次。用在甘氨酸分析缓冲液(50mM，pH4.4)中的过氧化 氢溶液(10μl，10mM母液)和2，2-连氮基二(3-乙级苯噻唑啉)-6-磺酸 二铵盐(ABTS，3μl，mM母液)在414nm处分析HRP的活性。结 果显示于下表中：
原纤维 nmol HRP/g原纤维
纯原纤维 3.82
原纤维-NH2 8.58
原纤维-NH-Lys 28.09
原纤维-NH-Lys(Lys)2 28.30
原纤维-NH-Lys(Lys)4 46.28
12.双功能原纤维
[00209]已经发现，一种以上类型的官能团(例如羧基和氨基)可 以同时引入到原纤维上，包括将官能化的碳纳米管例如羧基纳米管， 与氨基酸反应。这些双功能的原纤维可以用于固定多个分子，特别是 以1:1的化学量和以紧密临近的方式。
实施例40
通过加入赖氨酸制备双功能原纤维
Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯的合成
[00210]反应顺序如附图7所示.取Nε-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(2 g，8.12mmol)溶解于甲醇(40ml)和水(40ml)中，用三乙胺调节pH 至8。向上述混合物中加入N-(苄氧羰基-氧)琥珀线亚胺的二噁烷(2.4 g，9.7mmol，在20ml中)的溶液中，用三乙胺维持pH在8-9。搅 拌反应混合物过夜。然后旋转蒸发除去溶剂，得到粗Nα-CBZ-Nε-(叔 丁氧羰基)-L-赖氨酸。用0.2M碳酸钙(4ml)洗涤Nα-CBZ-Nε-(叔丁氧 羰基)-L-赖氨酸，除去水层得到白色固体.该固体悬浮于N，N-二甲 基酰胺(40ml)和苄基溴(1.16ml)。反应混合物室温下搅拌过夜。用乙 酸乙酯和水处理该反应混合物，在硫酸镁上干燥有机层。除去溶剂得 到粗Nα-CBZ-Nε-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸苄酯，用25％己烷的乙酸乙 酯作为溶剂通过硅胶纯化。在0℃下向Nα-CBZ-Nε-(叔丁氧羰基)-L- 赖氨酸苄酯(1g，2.2mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入到三氟乙 酸。反应混合物在0℃搅拌10分钟，然后在室温下再搅拌2.5小时。 除去溶剂，得到粗产物。通过硅胶色谱法获得Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯。
Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维的合成
[00211]向羧基原纤维(300mg)的二氯甲烷(18ml)混悬液中 加入Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯(148mg，0.32mmol在20ml二氯甲烷 和176μl三乙胺中)的溶液.然后加入HOBT(43.3mg，0.32mmol)和 EDC(61.3mg，0.32mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜，获得粗 产物.用甲醇、二氯甲烷和水广泛洗涤产物原纤维，然后真空干燥。
双功能原纤维Fib-Lys(COOH)NH2的合成
[00212]向Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维(113mg)的甲醇(4ml) 中加入氢氧化钠(1N，4ml)，反应混合物搅拌过夜。用水和甲醇广泛 洗涤产物Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维，真空干燥该原纤维。向Nα- CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维(50mg)的乙腈(4ml)混悬液中加入三甲基硅 烷碘(1ml).混合物在40℃下搅拌3小时。用水、甲醇、0.5N氢氧 化钠、乙腈和二氯甲烷广泛洗涤最终的双功能原纤维。氨基酸分析表 明每g原纤维含0.3μmols赖氨酸。
[00213]使用丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，通过与上述方法类似的方 法制备羟基和羧基(或氨基)双功能原纤维.用半胱氨酸可以制备硫 醇化和羧基(或氨基)双功能原纤维.用天冬氨酸和谷氨酸可以制备 羧基和氨基的双功能原纤维。
官能化纳米管的用途
[00214]由于其较高的孔隙率，化学和热稳定性以及较高的表面 积，官能化的石墨纳米管可以在许多生物技术应用中作为固体载体。 已经发现它们适应苛刻的化学和热处理，非常适应于化学官能化.
[00215]例如，酶可以共价固定于修饰的纳米管上，同时保留了 其生物活性。此外，纳米管也适合在生物分子分离中用作亲和色谱的 载体。例如，在多步骤地合成中在纳米管上制备了酶抑制剂，使得这 些固定的抑制剂可以与大分子接近，在蛋白质和修饰的原纤维之间发 生可逆的特异性生物识别.
[00216]纳米管表面的疏水性不足以通过吸附固定高密度的蛋白 质。为了增加纳米管表面的疏水性和把疏水环境从平面膨胀成三维， 将不同长度的烷基链结合到纳米管表面.通过吸附固定在烷基纳米管 上的蛋白质包括胰蛋白酶、碱性磷酸酶、脂肪酶和卵白素.这些固定 的蛋白质的酶活性与游离酶的活性相当，这可以通过在水溶液中对底 物水解的催化效力来证明。
[00217]此外，烷基链的末端苯基加入到烷基纳米管而形成的苯 基-烷基纳米管也已经制备了出来。该修饰通过π-π作用中引入了与蛋 白质的氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸相互作用的芳基结构。在苯 基-烷基纳米管上碱性磷酸酶和脂肪酶的吸附于C8-烷基纳米管上的吸 附相当。
[00218]也已经发现，官能化的原纤维可以用作蛋白质合成的固 体载体。
1.用于酶的作为固体载体的官能化纳米管
实施例41
通过吸附的酶固定
烷基原纤维的制备
[00219]制备烷基原纤维，包括将包含约0.007mmoles的-COOH (10mg原纤维 x 0.7 mmoles-COOH/mg的原纤维＝0.007 mmoles)的 10mg羧基原纤维，与0.14mmoles的烷基胺的1.5ml DMF(N，N-二 甲基酰胺)溶液，用0.14 mmoles的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺)和0.14 mmoles的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)反应。化学 反应如下：
原纤维-COOH+NH2(CH2)nCH2R(R＝H或OH)------------->
原纤维-CONH(CH2)nCH2R
用该方法制备包含不同长度烷基链(n＝5，7，9，17，当n＝5时， R＝OH)的数种不同的烷基原县委。反应后在环境温度下搅拌过夜，用 3 x 25ml CH2Cl2、3 x 25ml MeOH、和3 x 25ml dH2O严格洗涤原纤 维。对该原纤维中的氮含量进行元素分析表明反应的收率是65- 100％。
酶的吸附
[00220]通过吸附将脂肪酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酶和卵白素固定 于该实施例的烷基原纤维上。在室温下混合烷基原纤维和酶3-4个小 时，然后用5mM磷酸钠(pH7.1)洗涤2到4次。碱性磷酸酶固定在 C8-原纤维和C6OH-原纤维上；胰蛋白酶在C6、C8、和C18-原纤维上， 脂肪酶在C6OH-、C8-、C10-和C18-原纤维上，卵白素在C18-原纤维上。 结果见下表。
[00221]发现固定的酶的动力学性质与游离酶相当，结果见下图：
酶 Km(M) Kcat(s-1) Kcat/Km(M-1s-1) 脂肪酶 40 x 10-6 0.040 0.99 x 103 胰蛋白酶 36 x 10-6 0.048 1.34 x 103 碱性磷酸酶 1.2 x 10-3 4.8 4.17 x 103 卵白素 7.9 x 10-3 19.1 2.43 x 103
底物：脂肪酶 1，2-O-二月桂基-rac-甘油-3-戊二酸resorufin酯
胰蛋白酶 N-苯甲酰基-L-精氨酸-对硝基苯胺
实施例42
通过原纤维-脂肪酶催化的纸化作用(丁酸乙酯的合成)
[00222]根据实施例41的方法将脂肪酶固定在C8-烷基原纤维 上。首先用二噁烷洗涤脂肪酶原纤维，然后用二噁烷和己烷的混合物 洗涤，最后用己烷洗涤，以将原纤维分散在己烷中。为合成丁酸乙酯 (一种食品添加剂，提供菠萝-香蕉味)，在含6.2μm原纤维-固定的 脂肪酶的己烷中将乙醇(0.4M)和丁酸(0.25M)混合。室温下搅拌反应 混合物，在7小时收率是60％，这可以通过使用已确认的方法测定反 应混合物种的乙醇浓度来确定。反应和结果如附图8所示。
实施例43
在苯基-烷基原纤维上固定碱性磷酸酶
苯基-烷基原纤维的合成
[00223]原纤维通过两个不同的反应制备苯基-烷基原纤维。反应 1将20mg羧基原纤维(包含约0.014mmoles的-COOH)和0.28 mmoles的4-苯丁胺，0.28mmoles EDC和0.28mmoles DMAP(4-二 甲基氨基吡啶)在1.5ml的DMF(N，N-二甲基酰胺)中混合。反应2 将20mg羧基原纤维和0.28mmoles的6-苯基-1-己醇，0.28mmoles DCC(1，3-二环己基碳二亚胺)和0.28 mmoles DMAP在1.5ml的 DMF中混合。反应在室温下进行，搅拌过夜。然后用3 x 25ml CH2Cl2、 3 x 25ml MeOH、和3 x 25ml dH2O严格冲洗该原纤维。
固定的碱性磷酸酶的制备
[00224l0.5mg的苯基-烷基原纤维悬浮于400μl的0.05M Tris (pH8.6)中并声处理20分钟。向这些原纤维中加入150μl的碱性磷 酸酶溶液(1.67mg/ml在5mM磷酸钠缓冲液中，pH7.0)，然后室温 下将混合物旋转2小时，在4℃下贮存过夜。然后用600μl的5mM磷 酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤原纤维2次，并悬浮于200μl的相同缓冲液 中。
通过测定催化活性定量特异性固定的碱性磷酸酶
[00225]碱性磷酸酶与底物磷酸对硝基苯酯反应，释放出在405nm 处吸收光，消光系数18，200M-1cm-1的有色化合物。该反应的分析缓 冲液条件是10mM Tris、1mM MgCl2和0.1mM ZnCl2，pH＝8.4。 反应在1ml试管中进行，包括将5μl的磷酸对硝基苯酯溶液(0.5M在 33％ DMSO在分析缓冲液中)和13μg的碱性磷酸酶原纤维在1ml 的分析缓冲液中混合。通过在0分钟以上的时间扫描检测405nm处 的吸光度增加。然后用消光系数18，200M-1cm-1从开始时的斜度计算 酶活性(μM/分钟)。
[00226]对于反应1的吸附在苯基原纤维上的碱性磷酸酶，活性 是每13μg原纤维6.95μM/分钟。对于反应2的吸附在苯基原纤维上 的碱性磷酸酶，活性是每13μg原纤维2.58μM/分钟。这些结果转变 为每g原纤维0.63μmoles(或54mg)和0.23μmoles(或20mg)活性 碱性磷酸酶，转变方法是除以已知浓度的碱性磷酸酶溶液，已知浓度 的碱性磷酸酶溶液在相同分析条件下测定为每1μM碱性磷酸酶 879.8μM/分钟。
实施例44
在苯基烷基原纤维上固定脂肪酶
脂肪酶修饰的原纤维的制备
[00227]将0.5mg的苯基-烷基原纤维悬浮于50μl的5niM磷酸 钠缓冲液(pH7.1)中，声处理20分钟。向这些原纤维中加入350μl 的脂肪酶溶液(0.2mM在5mM磷酸钠缓冲液中，pH7.1)，室温下将 混合物旋转5小时，在4℃下贮存过夜。然后用600μl的5mM磷 酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤原纤维3次，并悬浮于200μl的相同缓冲液 中。
通过测定催化活性定量特异性固定的脂肪酶
[00228]脂肪酶可以与底物1，2-o-二月桂基-rac-甘油-3-戊二酸- resorufin酯(Boehringer Mannheim，1179943)反应，产生在572nm 处吸收光，消光系数60,000M-1cm-1的有色化合物。该反应的分析缓 冲液条件是0.1M KH2PO4，pH＝6.8反应在1ml试管中进行，包括 将5μl的底物母液(7.6mM在50％二噁烷在Thesit中)和13μg的 碱性磷酸酶原纤维在1ml的分析缓冲液中混合。通过在10分钟以上 的时间扫描检测572nm处的吸光度增加。然后用消光系数60， 000M-1cm-1从开始时的斜度计算酶活性(μM/分钟).
[00229]对于实施例43的反应1中吸附在苯基烷基原纤维上的脂 肪酶，活性是每13μg原纤维0.078μM/分钟.对于实施例43的反应 2中吸附在苯基烷基原纤维上的脂肪酶，活性是每13μg原纤维0.054 μM/分钟。这些结果转变为每g原纤维4.7μmoles(或564mg)和3.3 μmoles(或396mg)活性碱性磷酸酶，转变方法是除以已知浓度的碱 性磷酸酶溶液，已知浓度的碱性磷酸酶溶液在相同分析条件下测定为 每1μM脂肪酶1.3μM/分钟。
实施例45
在氨基烷基-修饰的原纤维上辣根过氧化物酶(HRP)的固定 羧酸-官能化的原纤维(羧基原纤维)的制备
[00230]通过药铲混合，将10.0g石墨原纤维样品在450mL浓 H2SO4中浆化，然后转移到具有进口/出口和顶搅拌器的反应烧瓶中。 在搅拌和缓慢的氩气流中，在室温下在24小时的时间里按份加入8.68 g的NaClO3。在反应的整个过程中产生的氯蒸汽从反应中排出到 NaOH trap水溶液中。在运行结束后，将原纤维浆体倾倒到碎冰中并 真空过滤。然后把滤饼转移到Soxhlet圆筒滤纸上，在Soxhlet提取器 中用去离子水洗涤，每个几小时换新鲜的水.继续洗涤直至当加入新 鲜的去离子水时，原纤维的样品不会改变水的pH.然后过滤回收羧 酸盐原纤维，在100℃和5”真空中干燥过夜。得到10.0g。
HRP-固定的原纤维的制备
[00231]取用实施例27的方法由1，6-二氨基己烷制备的氨基原 纤维(1.2mg)加入到共轭缓冲液(0.1M NaHCO3，0.9％ NaCl，pH9.5) 中，声处理该混悬液20分钟。然后在Eppendorf微量离心管中用共 轭缓冲液将该原纤维洗涤2次，并悬浮于430μL共轭缓冲液中.取 50-μL等份的该混悬液(0.14mg原纤维)与溶解于50μL去离子水中 的4.0mg活化的HRP(Pierce，Rockford，IL)混合，所得到的混悬液 在4℃旋转过夜。HRP-共轭的原纤维在微量离心管中用下列溶液的 组合广泛洗涤：共轭缓冲液，洗涤缓冲液(20mM KH2PO4，0.45％ NaCl，pH6.2)，包含0.03-0.1％ TritonX-100的洗涤缓冲液和包含50％ 乙二醇的洗涤缓冲液。作为对照，用活化的HRP与纯(未衍生化) 原纤维进行相同的操作，证明了HRP和氨基原纤维的结合的确是特 异性共价键。
通过测定催化活性定量特异性固定的HRP
[00232]广泛洗涤除去大部分的非特异性结合的酶。通过底物翻 转用H2O2和显色底物2，2’-连氮-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)、二铵盐 (ABTS)来定量固定的活化HRP。用100μM H2O2和30μM ABTS作 为底物在414nm处分光光度检测HRP的酶活性。在这些初步研究中， 与氨基原纤维连接的酶的总量是0.0230μmol HRP/g原纤维。作为比 较地，对照(纯原纤维)非特异性结合0.0048μmol HRP/g原纤维。 两个相减，共价(特异性结合)的HRP的量是0.0182μmol/g原纤维。
实施例46
亲和色谱法分离在具有固定的酶抑制剂的原纤维上的碱性磷酸酶(AP) 和β-半乳糖苷酶(βG)
碱性磷酸酶抑制剂原纤维的制备
[00233]根据Brenna等人(1975)，Biochem J.，151：291-296的方 法制备AP-抑制剂。羧酸盐原纤维用于如上述实施例50所述制备NHS 酯原纤维.取NHS酯原纤维(114mg)悬浮于4mL丙酮和加入10倍 当量的(根据每g原纤维0.7meq NHS酯估算)酪胺。加入干燥的三 乙胺(10倍当量)，在室温下将混合物搅拌3小时。真空下在scintered 玻璃漏斗中将该酪胺基原纤维先用丙酮洗涤，然后用去离子水广泛洗 涤。
[00234]取4-(对氨苯基氮)-苯胂酸(66mg)悬浮于4mL的1N HCl中。悬浮液冷却至4℃并与0.36mL的0.5M NaNO2缓慢混合。 15分钟后，向酪胺基原纤维中加入砷酸/NaNO2混合物，将其悬浮于 10mL的0.1M NaCO3(pH10.0)中。反应混合物(pH≈10)在4℃搅 拌过夜.然后用0.1M Na2CO3(pH10.0)、8M胍HCl、25mMNaOH、 和水连续洗涤来处理该原纤维，直至流出液变澄清。通过Galbraith Laboratories(Knoxville，TN)对AP-抑制剂的原纤维中的砷进行原子 吸收分析。通过原子吸收分析，发现包含具有1个砷原子的侧链的AP- 抑制剂的原纤维具有0.4％的总砷含量。这表明，大约10％的已评价 的初始COOH基在多步骤合成中转变成了AP-抑制剂。根据原纤维 的表面积，这意味着每表面积具有1个抑制剂分子(酶结合位 点)。
β-半乳糖苷酶-抑制剂原纤维的制备
[00235]根据Ullman，(1984)Gene，29：27-31的方法制备对氨基 -苯基-β-D-硫代半乳糖苷(TPEG)衍生的原纤维。向在0.2mL去离 子水的8mg的羧酸盐原纤维中加入2.24mg TPEG.用0.1M HCl调 节混悬液的pH值至4.0，加入15mg EDAC。混合物在pH4.0和室 温下搅拌3小时。在Eppendorf微量离心管中快速离心分离来停止反 应，除去液体。通过在去离子水中反复再悬浮和离心将β-半乳糖苷酶 -抑制剂原纤维洗涤5次.
亲和分离
[00236]碱性磷酸酶(AP)(来自大肠杆菌，III型；Ullman，(1984) Gene，29：27-31)和β-半乳糖苷酶(BG)(来自大肠杆菌；Calbiochem， La Jolla，CA)在Eppendorf微量离心管中与AP-抑制剂原纤维或βG- 抑制剂原纤维分批发酵而分离。为进行亲和分离，取包含AP(一般约 10个单位)和BG(一般约280个单位)的1.0mL负载缓冲液(20mM Tris，10mM MgCl，1.6M NaCl，10mM半胱氨酸，pH7.4)的溶 液加入到0.8-1.0mg的AP-或BG-抑制剂原纤维中。轻微涡旋所得到 的混悬液，然后在室温下旋转2小时。在酶结合后，通过在台式离心 机中简单离心来沉淀该原纤维，回收包含未结合酶的液相，保存用于 酶分析。通过反复加入缓冲液、轻微涡旋、旋转15分钟、简单离心 和用巴斯德吸管回收溶剂来用负载缓冲液进行洗涤(7 x 1.0mL).在 洗涤7次后，用适当的洗脱缓冲液对βG-抑制剂原纤维(100mM硼 砂，10mM半胱氨酸，10mM半胱氨酸，pH10.0)或AP-抑制剂原 纤维(40mM NaHPO4，10mM Tris，1.0mM MgCl2，0.1mM ZnCl2， pH8.4)重复进行相同的操作。
[00237]分析所有部分(未结合酶、洗涤物、和洗脱物)中的AP 和βG活性。通过在410nm处用分光光度检测500μM磷酸对硝基苯 酯(PNPP)的水解来确定碱性磷酸酶的活性(Δε＝18,000M-1cm-1)。在 pH8.4的10mM Tris，1.0mM MgCl2，和0.1mM ZnCl2中进行碱性 磷酸酶活性的测定.通过分光光度检测酶水解2-硝基-半乳-β-D-吡喃 糖苷(ONPG)的能力来分析β-半乳糖苷酶。5.0mM ONPG的β-半乳糖 苷酶-催化水解的初始速率在405nm处在10mM Tris，10mM MgCl2， 1.6M NaCl，10mM半胱氨酸，pH7.4中进行(Δε＝3500M-1cm-1) 中测定。
[00238]对于AP-抑制剂和βG-抑制剂原纤维，加入AP和βG的 混合物。为了促进特异性结合容量的测定，加入的酶的浓度是相对于 固定的抑制剂浓度极大过量的。对于AP-抑制剂原纤维，结合了0.550 μmol AP/g原纤维(相反地，非特异性结合是0.020Amol βG/g原纤 维).对于βG-抑制剂原纤维，确定其容量是0.093μmol βG/g原纤维 (相反地，非特异性结合是0.012μmol AP/g原纤维)。亲和色谱试验的 结果显示于附图9和10中。AP-抑制剂原纤维丝毫不与βG结合， 但与AP结合，当向缓冲液中加入40mM竞争性的抑制剂磷酸盐时， 其特异性洗脱(附图9).βG衍生的原纤维不和较大量的AP结合，但 与βG结合，当pH升高以弱化酶-抑制剂的结合能力时，其特异性洗 脱。这些结果表明抑制剂成功地与原纤维共价结合，固定的抑制剂与 大分子接近，抑制剂对于特异性酶结合是有用的，以及当特异性洗脱 时，酶仍保留了活性。在附图10中，继续从βG-抑制剂原纤维中滤出 了βG。这可能是天然的较弱的酶-抑制剂亲和力的结果，而不是原纤 维的缺点，因为，在附图9的AP-抑制剂原纤维中没有观察到相同的 现象。
2.官能化碳纳米管作为抗体的固体载体
[00239]已经发现，抗体可以固定于官能化的纳米管上，这些抗体 纳米管对于许多应用具有独特的优点，这是因为他们具有较高的每重 量表面积、导电性和化学和物理稳定性。例如抗体纳米管可以用作分 子分离的亲和试剂。抗体纳米滚也可以用于分析的应用中，包括诊断 免疫测定，例如基于ECL的免疫测定。
[00240]抗体可以通过共价结合或非共价吸附固定。共价固定可以 通过不同的方法来完成：包括抗体糖类基团的还原活化、羧酸盐原纤 维(见实施例27，上文)的NHS酯活化，和用还原或马来酰亚胺修饰 的抗体与硫醇化或马来酰亚胺化的原纤维反应(见实施例23和25， 上文)。
[00241]抗体和纳米管结合的最佳方法将取决于它们的应用。对于 分离的应用，优选的方法可以是非共价结合，因为蛋白质结合的容量 对于此方法是最高的。对于包括ECL的方法，其中原纤维的导电性 是重要的，优选是共价方法(烷基附加物是电的弱导体，可以期望使 原纤维绝缘).还原氨基化是共价结合抗体到原纤维上的最好方法， 因为通过该方法，抗体正确地定向以使得它们的结合位点指向外(远 离原纤维)。
3.向官能化的纳米管上添加NAD+
[00242]已经发现，辅助因子例如NAD+可以加入并用作蛋白质的 生物特异性亲和色谱中的固体载体，其中蛋白质与酶辅助因子结合。 例如，NAD+原纤维已经用作纯化脱氢酶的固体载体.使用原纤维的 主要特定是它们较大量的可及表面积。较高表面积的亲和基质是需要 的，因为它们有较高的潜在容量。原纤维可以松散分散或固定于柱中 或物质中。
实施例47
在NAD+原纤维上脱氢酶的亲和色谱分离
NAD+原纤维的制备
[00243]根据实施例14和15氧化原纤维，以引入羧基。向原纤 维(31mg)的碳酸氢钠溶液(3ml，0.2M，pH8.6)的混悬液中加入 N6-[氨己基]氨甲酰甲基)-辅酶I的锂盐溶液(25mg来自Sigma，在5 ml碳酸氢钠溶液中)。反应混合物在室温下搅拌过夜。产物原纤维用 水、N，N-二甲基酰胺和甲醇广泛洗涤。元素分析数据表明，原纤维 包含，通过氮分析每g产物130mmols的NAD分子磷分析每g原纤 维147mmols的NAD分子.其他具有以氨基为末端的连接子的NAD+ 类似物可以用于制备NAD+原纤维。
亲和分离
[00244]在40℃下，将NAD+固定的原纤维(0.26mg)和纯原纤 维(0.37mg)与0.1％聚乙二醇(PEG，MW 1000)的磷酸钠(1ml， 0.1M，t pH7.1)溶液声处理30分钟，然后在40℃培养30分钟。离 心分离原纤维混悬液，除去上清液。在4℃下，将原纤维与L-乳酸脱 氢酶(LDH)的0.1％PEG(1000)磷酸钠缓冲液(250μl，LDH溶液和 0.1％ PEG缓冲液的比例是1:1)的混合物培养90分钟。然后将混合 物在室温下平衡30分钟。在原纤维与LDH培养后，用0.1％ PEG(1000) 的磷酸钠缓冲液(5 X 1000μl)洗涤原纤维，每次洗涤在旋转下进行15 分钟。用5mM NADH的0.1％ PEG(1000)磷酸钠缓冲液(5mM 3X1000μl)的溶液洗脱LDH.在每次洗脱物洗涤期间，原纤维旋转15 分钟。在洗脱液中LDH的活性的测定包括，测定在还原丙酮酸盐期 间测定340nm处吸光度的改变。该分析混合液包含0.1％ PEG(1000) 的磷酸钠缓冲液(980μl)、丙酮酸盐(3.3μl，100mM母液)，和每个 洗脱部分(16.7μl).镁反应如下所示：
[00245]结果表明，NAD+固定的原纤维上的LDH的容量是每g 原纤维484nmols，在纯原纤维(对照)上的LDH的容量是每g原纤 维3.68nmols。LDH的非特异性结合是5.6％。
官能化纳米管作为蛋白质合成的固体载体
实施例48
官能化的原纤维作为固体载体在肽合成中的应用
[00246]向二氯甲烷(20ml)中的氨基原纤维(400mg)和4-(羟甲 基)-苯氧基乙酸混悬液(255mg，1.4mmol)的混合物中加入1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC，268mg，1.40mmol)和1-羟基 苯并三唑水合物(HOBT，189mg，1.4mmol).反应混合物在氮气下 在室温下搅拌过夜.用二氯甲烷、甲醇和水广泛洗涤产物原纤维.然 后真空干燥得到原纤维。向原纤维的N，N-二甲基酰胺(DMF，2ml) 和二氯甲烷(8ml)的混悬液中加入N-(9-fluorenyl甲氧羰基)-O-丁基 -L-丝氨酸(215mg，0.56mmol)、1，3-二环己基碳二亚胺(DCC， 115mg，0.56mmol)和4二甲基氨基吡啶(DMAP，3.4mg，0.028 mmol).反应混合物在室温下搅拌过夜，用20％吡啶的DMF溶液(5 X 40ml，每次浸湿1分钟)处理产物原纤维。然后用DMF、水、氢氧化 钠(1N)和二氯甲烷广泛洗涤产物原纤维.真空干燥产物Fib-柄- Ser(O+)-COOH(水合茚三酮试验呈阳性).对于二肽的合成，使用相 同的方法加入精氨酸.Fib-柄-Ser(O+)-Arg(Nε-2，2，5，7，8-五甲基 chrornan-6-磺酰基)的氨基酸分析数据表明，它包含6.5μmol/g原纤 维和7.6μmol精氨酸/g原纤维。通过相同方法可以制备任何其他的 肽。
5.生物素酰化的原纤维和生物素酰化的烷基原纤维
[00247]已经发现，可以通过生物素酰化或烷基化和生物素酰化来 官能化原纤维的表面.然后包含这些修饰物的原纤维可以结合任意的 抗生蛋白链菌素共轭的物质例如抗生蛋白链菌素珠和抗生蛋白链菌素 酶。
[00248]由于其较高的表面积，原纤维作为固体载体提供了很大的 益处。可以产生强烈磁性的珠在分离分析中是极其有用的。所述的生 物素酰化的原纤维兼具原纤维和珠的特点.生物素酰化的烷基原纤维 是相同概念的扩展，但也显示了烷基原纤维的吸附性质.
[00249]抗生蛋白链菌素-和生物素-包衣的原纤维可以用于诊断 学，可以作为捕获剂用于分析例如电化学发光分析。
[00250]本发明的新的特征是在一种原纤维上的两种固体载体的组 合，以制成双功能的原纤维.此外，所公开的方法增加了珠的表面积 和放大了原纤维的磁化。
实施例49
生物素酰化的原纤维的制备
[00251]制备生物素酰化的原纤维，包括将如实施例16和19所 述制备的2.4mg的氨基原纤维与9mg的NHS酯长链生物素在pH 8.15的缓冲液0.2M NaHCO3中混合。在室温下旋转混合物4小时， 用相同的缓冲液洗涤2次。
实施例50
生物素酰化的烷基原纤维的制备
[00252]通过两步反应来制备生物素酰化的烷基原纤维。首先， 将4.25mg的双功能原纤维(包含氨基和羧基)和25mg的NHS酯长 链生物素混合。洗涤原纤维并真空干燥.
[00253]第二个反应的进行，包括将4mg的生物素酰化的双功 能原纤维和11mg的EDC(1-乙基-3，3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)，7.5 mg的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)和10μl的NH2(CH2)7CH3的0.5ml DMF溶液混合。该混合物在室温下搅拌过夜。最后用CH2Cl2、MeOH、 和dH2O洗涤最终的生物素酰化的烷基原纤维。
实施例51
生物素酰化的原纤维在分析中作为固体载体
[00254]生物素酰化的原纤维可以用于分析中，该分析包括需要 抗生蛋白链菌素-生物素或卵白素-生物素相互作用的方式。生物素酰 化的原纤维可以例如进一步用抗生蛋白链菌素衍生化。与原纤维共价 结合的生物素(见实施例50)可以形成与抗生蛋白链菌素强烈非共价结 合地相互作用。因为抗生蛋白链菌素是具有4个相同结合位点的四聚 蹄蛋白质，因此与生物素酰化的原纤维结合的抗生蛋白链菌素几乎一 定具有其它生物素酰化剂可以结合的空闲的结合位点.因此，生物素 酰化的原纤维将会转换成抗生蛋白链菌素-包衣的原纤维。
[00255]有很多的分析试验可以与这些原纤维-生物素-抗生蛋白链 菌素(FBS)载体进行.例如，可以在FBS载体上捕获生物素酰化的 抗分析物抗体(在该抗体结合到分析物之前或之后).很好地完成了使 用生物素酰化的抗分析物抗体的分析.这些分析包括竞争性分析，其 中感兴趣的分析物和标记的分析物竞争性地与抗分析物抗体结合。游 离(未结合)的分析物和游离(未结合)的标记分析物可以从原纤维 固定的抗体中洗出。洗涤步骤取决于通过普通实践包括离心、过滤或 通过吸引到磁石上从固相中物理分离.
[00256]除了竞争性分析外，夹层性免疫测定也可以在PBS载体 上进行。夹层免疫分析在诊断学领域是公知的.该分析包括两种抗体 同时结合的分析物；通过例如用生物素标记而在固体表面捕获的第一” 主要”抗体，和不被固体载体捕获但用报道基标记的”次级”抗体.这 种夹层分析可以用作为固体捕获载体的原纤维来进行，其中如上述段 落所述捕获原县委.因此，在这种分析中，原纤维与生物素共价结合， 其与抗生蛋白链菌素结合，其依次与生物素酰化的主要抗体结合，其 与分析物结合(如果存在)，其余标记的次级抗体结合.
[00257]类似地，DNA探针分析可以用FBS载体来进行。生物 素酰化的单键DNA可以与FBS载体结合，竞争性杂交可以发生在补 充的单键分析物DNA分子和补充的标记寡核苷酸之间。
[00258]其他类型的生物素酰化的原纤维、生物素酰化的烷基化 原纤维可以用于免疫分析和DNA分析.如实施例51所述，修饰双功 能原纤维，可以包括生物素与一种类型的官能团和烷基链与其他类型 的官能团共价结合。所得到的烷基化、生物素酰化的原纤维可以用 于与抗生蛋白链菌素或卵白素(经生物素)的特异性结合.也可以用于 蛋白质的吸附(经烷基链)。
[00259]烷基原纤维可以用于与其他固体载体的结合，例如抗生 蛋白链菌素-包衣的磁珠。One advantage of这些珠上的原纤维的一个 优点是，它们具有高得多的表面积(每单位重量)。因此，如果原纤维 可以与磁珠的外表面结合，这将会引人注目地改善表面积，以慈改善 珠的结合容量。可以推断，烷基化、生物素酰化的原纤维可以与c 抗生蛋白链菌素-包衣的珠结合，产生高亲和力的抗生蛋白链菌素(珠)- 生物素(原纤维)相互作用，因此原纤维包衣的珠具有极高的表面积. 因为烷基原纤维可以通过吸附与蛋白质结合，原纤维包衣的珠可以进 一步用吸附的蛋白质包括抗生蛋白链菌素和抗体来衍生化。如上所 述，抗生蛋白链菌素或抗体包衣的原纤维可以用于免疫分析和DNA 分析。因此原纤维包衣的珠可以通过引人注目地增加表面积来改善珠 的性质，以使得在给定的分析中只有很少的珠具有相同的结果。
6.3-维结构
[00260]与未氧化的原纤维相比，氧化的原纤维更易于分散在水 性介质中。具有中和大恐(孔>2nm)稳定的，多空的三维结构作为 催化剂或色谱载体是非常有用的。由于原纤维可以分散在个性化的基 质中，通过交联而稳定化的良好分散的样品使得人们去构造这样的载 体。官能化的原纤维对于该应用是理想的，因为它们以与分散在水性 介质或极性介质中，官能性提供了交联点.此外，官能性提供了负载 催化或色谱位点的点。最后结果是坚硬的三维结构，其具有受官能化 位点影响的总表面积，在官能化位置上支持活性剂.
[00261]这些载体在催化中的典型应用包括它们作为高度多孔载体 在通过浸透装设的金属载体，例如贵金属加氢催化剂中的应用.此外， 通过系住载体，经与结构的非常高的孔隙率的官能性组合系住分子的 催化剂的能力允许我们以不同的方式进行均相反映.系住的分子催化 剂基本上在连续的液相中是摇摆的，与均质反应堆类似，其中它能使 得在均质反应中进行的选择和速率的应用中具有好处。但是，系住的 固体载体使得易于分离和活性恢复，在许多情况下，是非常昂贵的催 化剂。
[00262]这些稳定的、坚硬的结构也允许进行迄今为止非常困难的 反应，例如不对称合成或通过适当的对应体催化剂或选择性底物与载 体结合的亲和色谱。通过金属-Pc或金属卟啉络合的衍生化也允许用 于回收与金属离子结合的配体，以及通过次级衍生化与配体结合的任 何分子。例如，当官能化的原纤维的三维结构是电极或电极的一部分 时，官能化导致了Co(II)Pc的吸附，在烟酸存在下将Co(II)电化氧化 成Co(III)将产生稳定的Co(HI)-吡啶基络合物，其含有羧酸作为侧 基。结合适当的抗原、抗体、催化抗原、或其他位点特异性的捕获剂 将允许选择性地分离用其他方法非常难以分离的分子(亲和色谱法)。 在洗涤电极除去闭塞物质后，包含靶分子的Co(III)络合物可以电化学 还原而回收不稳定的Co(II)络合物。然后在包含靶分子的Co(II)上的 配体可以通过不稳定的Co(II)配体的质量作用取代而回收，因此，影 响了分子的分离和回收，其中该分子用其他方法(例如手性药物)来 完成的话将非常困难和昂贵
[00263]以前，人们相信在官能化谈原纤维物质中的孔太小，而不 能有足够的流动，因此，将不能用于流动通过电极.使用微粒碳或其 他基于碳的物质(例如网状玻璃碳(RVC))作为电极物质也有相关的 问题。例如，多孔的电极物质不能在原处形成，填充得太紧密和形成 孔隙或通道，这使得改变溶剂和流动条件时会发生平面的不稳定性， 而且不能形成非常薄的电极.在流动池中使用官能化的碳原纤维作为 电极解决了这些问题。
[00264]在流动池中用作电极的碳原纤维可以通过电活性剂的表 面处理来修饰。该原纤维也可以用非电活性物质来修饰，该非电活性 物质发挥催化或电催化功能或发挥抑制不希望的反应或抑制从流动中 吸附物质的作用。
[00265]这些流动通过电极在分离技术中是有用的，例如电色谱、 电化学调节亲和色谱、电合成或电化学调节离子交换色谱.它们也可 以用于分离和/或分析陷入在碳原纤维物质上的物质的诊断装置中。
[00266]组合物质包括官能化的碳原纤维，也可以使用其他纤维或 颗粒。这些纤维或颗粒可以加入到混悬液中以改变碳原纤维物质最终 的孔隙率或导电率。
实施例52
酞菁铁官能化的原纤维在流动池中作为电极的应用
[00267]通过吸附铁酞菁-双-吡啶(FePc-2Py)(Aldrich 41，016-0) 修饰石墨原纤维.取0.403g的原纤维和0.130g的FePc-2Py加入到 150mis的纯净EtOH中，用450 Watt Branson探针超声破碎器声处 理5分钟。所得到的浆体在0.45μm MSI尼龙滤器上在47mm微孔 滤膜真空过滤器的管中过滤，用水冲洗，在35℃真空干燥过夜.最 终的重量是0.528g，表明基本上都吸附了。对滤液进行的分光光度分 析来计算剩余的FeP-2Py。
[00268]取5mg FePc-2Py修饰的原纤维在声处理下分散在10mis 的DI水中。将分散液置于一块具有25mm膜过滤管的200目的不锈 钢(SS)针织筛上并在室温下干燥。用弓形打孔器切下直径0.5英寸的SS 筛支持的原纤维物质.
[00269]电化学流动池是用13mm、塑料、Swinney型的膜滤纸夹 制成的，包括将直径13mm的盘状金制筛(400目，Ladd Industries) 置于膜载体的顶部，用铂线与筛发生电性接触，用热收缩管 绝缘，该热收缩管进料通过滤纸夹的壁，以作为三个电极恒电位器回 路的工作电极进行外部连接.用最少量的环氧在外部边缘固定金制 筛。将一条金箔改变为环状，并放置在底部，滤纸夹的下游部分并与 绝缘的Pt线头相连，用作三个电极恒电位器回路的计数电极来连接. 在1M HCl中电化学氧化的直径0.5mm的环状银线用绝缘头置于滤纸 夹的顶部，用作参照电极来连接。
[00270]将直径0.5英寸的FePc-2Py修饰的CN盘置于流动池中， 然后流动池与EG&G PAR 273恒电位器的适当接头相连。流动池与 用在pH7.0的0.1M磷酸氢二钾缓冲液中的0.1M KCl过滤的Sage注 射泵相连.在没有流动(静止)和流动(0.4mls/分钟)下，以20mv/sec 的电位扫描速率记录循环伏安图(CVs)(见附图6)。Cvs在流动和不 流动下基本相等，显示两种持久地、可逆氧化和还原波与表面限制的 FePc-2Py相一致。在流体流动条件下还原峰的持久性表明，FePc-2Py 与碳原纤维强烈结合。使用酞菁铁修饰的原纤维的功能与流动通过电 极物质相同。
[00271]三维结构的其他例子是原纤维-陶瓷的复合物.
实施例53`
氧化铝-原纤维复合物的合成(185-02-01)
[00272]用and U/S粉碎机将1g的硝酸氧化的原纤维(185-01-02) 高度分散在100cc DI水中.加热原纤维浆体至90℃并缓慢加入溶 解在20cc丙醇中的0.04mol三丁氧铝.继续回流4小时，然后除去 冷凝器以排除醇。30分钟后，将冷凝器放回，浆体在100℃回流过夜。 获得具有均匀外观的黑色溶胶。将溶胶冷却至室温，1星期后，形成 具有平滑表面的黑色凝胶。在空气中将该凝胶在300℃加热12小时.
[00273]通过SEM来检查氧化铝-原纤维复合物。裂纹面的纤维 照片表明原纤维在凝胶中均匀分散.
实施例54
硅石-原纤维复合物(173-85-03)的制备
[00274]用超声处理将2g的硝酸氧化的原纤维原纤维(173-83- 03)高度分散在200cc乙醇中。在室温下向该浆体中缓慢加入溶解在 50cc乙醇中的0.1mol正硅酸乙酯，然后加入3cc浓HCl.将混合 物加热至85℃并在该温度下维持，直至体积减小至100cc.冷却该 混合物，放置，直至其形成黑色固体凝胶。在空气中在300℃加热该 凝胶。
[00275]通过SEM来检查硅石-原纤维复合物。裂纹面的纤维照 片表明原纤维在凝胶中均匀分散。
[00276]用其他的陶瓷类物质，例如锆、钛、稀土元素氧化物和 三氧化物可以类似地制备，也可以制备三氧化物.
7.在聚合物珠上掺入石墨纳米管
[00277]聚合物珠，特别是包含Fe3O4核的磁性聚合物珠，例如 由Dynal和其他人制备的那些，在诊断学中有很多的应用。但是，与 纳米管有效表面积相比，这些珠具有较小的表面积.官能化的原纤维 可以掺入到珠的表面，这就使得聚合物/原纤维复合物可以用作份礼或 分析应用(例如电化学发光分析，酶的固定化)中的固体载体。
实施例55
官能化的原纤维与官能化珠的结合
[00278]用0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.5将7.5mg的磁性甲苯基 磺酰-活化的Dynabeads M-450(30mg/ml)珠(Dynal，Oslo，Norway) 洗涤三次。然后向该珠中加入0.9ml的0.1M磷酸钠缓冲液，pH8.4， 然后加入0.1ml的胺原纤维。将混合物在室温下旋转16-24小时。
[00279]当在显微镜下观察时，原纤维表面上具有珠的原纤维团 是非常明显的
[00280]本领域技术人员将会明白，在前述实施例1-55中公开的 任何方法都可以用直径小于5纳米的单壁碳纳米管的例行试验来重 复，从而获得所需的官能化结果.
实施例56
证实亚甲兰的吸附
[00281]用6M HCl处理SWNT(University of Kentucky)72小 时出去所有的金属杂质。用酸洗涤的碳纳米管用声处理分散在DI水 中并过滤。重复冲洗4次至中性pH。
[00282]SWNT再悬浮于DI水中，用声处理分散。将2X连续 稀释液置于8PP离心管中。等量加入亚甲兰，，将管置于旋转器上搅 拌4小时。然后将管在离心机上旋转4分钟，得到沉积在管底部的 SWNT。含有高浓度SWNT的管具有澄清的滤液，具有最低SWNT 浓度的两个管颜色是类似的，以控制MB的溶解。具有中间浓度SWNT 的6个管显示了随着浓度的降低，蓝色增强。
证实酞菁铁吸附
将SWNT(University of Kentucky)用6M HCl处理72小时以除 去任何金属杂质。采用超声将酸洗涤的纳米管分散在DI水中，并且 过滤。将该操作重复4次来洗涤至中性pH。
在超声处理下将7mg Fe酞菁-双吡啶(FePc-2Py)用40ml EtOH 溶解。加入22mg SWNT，并且继续超声处理5分钟。让该溶液冷却， 并且反复超声处理。将热溶液过滤到0.45微米PVDF膜上以干燥， 然后用新鲜的EtOH洗涤。过滤至干.干重＝27mg.将5mg FePc-2Py 吸附到SWNT上。
将具有连接的SWNT/FePC的滤膜置于40ml DI水中，并且超声 处理以把SWNT从滤膜上抬起。将滤膜从悬浮液中取出，并且加入20 mg Whatman #42滤纸。在高功率下(40％占空度)超声2×5’以浆化 WH42纸来起SWNT粘合剂的作用。将悬浮的材料过滤到0.45微米 PVDF滤器上，并且用DI水洗涤3次。过滤至干。在热板@上于150℃ 干燥1小时。将干燥的SWNT/WH42垫作为完整垫-36mm直径， 约25微米厚-从膜上分离下来。测定的片电阻率是1500ohm/平方米 (square)。垫的最终重量是45mg；WH42组分的重量＝20mg；SWNT 的重量＝22mg；估计的吸附到SWNT表面上的FePc-2Py的重量是5 mg.
吸附到SWNT上的FePc-2Py的电化学
通过把垫的区段在400×400目SS筛网之间印刷以起电流收集器 的作用来形成电极。把SS筛网的一个边缘连接到插入玻璃吸移管内 的Cu丝上。用环氧化物将任何暴露的Cu绝缘。将电极在100℃加 热1小时以把环氧化物熟化5分钟。
通过循环伏安法对SS筛网计数器和Ag/AgCl参比电极来测定该 电极。电解质是等渗硼酸盐缓冲盐水。观察到了两个峰，一个是接近 -.-4，其被H2气流遮蔽。第二个峰集中在约+0.1V vs Ag/Ag/Cl。对 于集中在+0.1V vs Ag/AgCl的峰，峰电流随着扫描率是线性的，与表 面限制的电活性物质是一致的。循环伏安图迹线是可重复的，这表明 FePc-2PY被很牢固地限制在电极上，而不是损失到电解质中。
[00288]如上述说明书和实施例所示，本发明涉及种类广泛的官 能化的碳纳米管的形成及其用途。
[00289]所使用的术语和表达是作为说明书的术语使用，而不是 进行限制，而且也不打算使用超出任何作为其一部分所显示和所描述 的特征相同范围以外的术语或表达，应当意识到，各种可能的改变都 在本发明的范围内。
与相关申请的交叉参考
卟啉和酞菁对原纤维的吸附
[00100]物理吸附原纤维的优选化合物是衍生的卟啉或酞菁，它 们是已知的强烈吸附石磨和碳黑的物质。数种化合物都是可用的，例 如四羧酸卟啉、酞菁钴(II)、或酞菁二钴。后两者可以衍生成羧酸的 形式。
酞菁化二锂
[00101]一般地，通过大多数的金属(特别是多价络合)从酞菁(Pc) 基中取代了2个Li+离子。因此，用与不易变化的配体结合的金属离 子取代2个Li+离子是在原纤维表面置放稳定的官能团的一种方法。 几乎所哟的过渡金属络合物都将从Pc基取代中Li+离子而形成稳定 的、不易变化的螯合物。然后这一点用适当的配体与金属结合。
酞菁钴(II)
[00102]钴(II)络合物对此是特别适合的.Co++离子可以被两个Li+ 取代而形成非常稳定的螯合物。然后Co++离子可以与配体例如烟酸配 位，烟酸包含具有侧羧基的吡啶环，并且已知优先和吡啶基结合。在 过量烟酸的存在下，Co(II)Pc可以电化学氧化成Co(III)Pc，与烟酸的 吡啶部分形成不易变化的络合物。因此，烟酸配体的游离羧酸基牢固 地结合到原纤维的表面。
[00103]其它适当的配体是氨基吡啶或乙二胺茶碱(侧基NH2)、 疏基吡啶(SH)或其它在一个终端包含氨基或吡啶部分并在另一端有所 需的功能的多功能配体。
[00104]卟啉或酞菁的负载能力可以通过当增加加入时溶液的的 脱色来确定。排出深色溶液(对于在MeOH中的四羧酸卟啉是深粉 红色，对于在丙酮或吡啶中的酞菁Co(II)或二锂是深蓝绿色)并通过 在原纤维的黑色表面上吸附来除去该分子。
[00105]通过这种方法来评价负载能力，衍生物的足迹法是由其近 似的测定(～140平方埃)来计算的。对于原纤维的平均表面积250 m2/g，最大的负载是～0.3mmol/g。
[00106]通过滴定来分析四羧酸卟啉。通过在周围和较高温度下 在水系统中色的释放来测试吸附的完整性。
[00107]在开始时混合原纤维浆体(韦林搅拌器)并在负载时搅拌。 当不再释放颜色时，超声处理一些浆体，但是没有效果。
[00108]在负载后，在相同的溶剂中洗涤运行号169-11、-12、-14 和-19-1(见表II)，以除去闭塞的色素。在洗涤洗脱液中得到了连续的 微浅色，这样就难以精确地确定饱和点。运行号168-18和-19-2用于 负载计算量的色素，并在负载后仅非常轻微地洗涤.
[00109]四羧酸卟啉(来自丙酮)和Co酞菁(来自吡啶)负载到原 纤维上用于进一步地记述特征.(运行号169-18和-19-2，分别地).
四羧酸卟啉的分析
[00110]加入过量的碱(pH11-12)导致该滴定浆体立刻变成粉红 色。当这不会与滴定相互作用时，显示了在较高的pH时卟啉解吸附。 通过过量的NaOH反滴定用pH7.5作为终点来确定羧酸的浓度。滴 定给出了1.10meq/g的酸负载，相当于0.275meq/g卟啉.
酞菁二锂或钴的分析
[00111]仅从脱色试验来评价这些被吸附物的浓度，在30分钟后 蓝-绿没有褪色的点就是饱和点。
[00112]在原纤维表面吸附了大量的取代的多核芳香族或多异核 芳香族化合物。为了吸附，芳香环的数量应当大于2个/环或侧官能团。 因此，包含3个稠合环的取代的蒽、菲等或包含4或更多稠合环的多 功能衍生物可以用于取代卟啉或酞菁衍生物.同样地，可以使用包含 4或更多环的取代的芳香杂环例如喹啉、或多取代的杂芳环。
[00113]表2概述了3种卟啉/酞菁衍生物负载试验的结果。
TCAPorph＝四羧酸卟啉 (cal)＝计算
DiLiPhth＝酞菁二锂 (T)＝滴定
CoPhth＝酞菁钴(H)
[00114]下列的实施例11和12说明了将两种不同的酞菁衍生物 吸附到碳纳米管上的方法.
实施例11
通过吸附酞菁四磺酸镍(II)官能化原纤维
[00115]将2mg酞菁四磺酸镍(II)(四钠盐)与4.2mg纯原纤维 在1ml dH2O中混合。声处理该混合物50分钟，并在室温下旋转过夜。
[00116]用3 x 1ml dH2O，3 x 1ml MeOH，和3 x 1ml CH2Cl2 洗涤原纤维，并真空干燥.
[00117]在这些酞菁衍生物的原纤维上通过吸附固定嗜热菌蛋白 酶。将0.5mg原纤维悬浮于250μl dH2O中 ，声处理20分钟。排出 上清液，将原纤维悬浮于250μl 0.05M Tris(pH＝8。0)中，与相同缓 冲液制成的250μl 0.6mM嗜热菌蛋白酶溶液混合。混合物在室温下 旋转2小时，在4℃下贮存过夜。然后用1ml 25mM Tris(pH＝8)洗 涤3次。并悬浮于pH7.5的包含40mM Tris和10mM CaCl2的250μl 缓冲液中。
[00118]通过测定原纤维的酶活性来确定原纤维上嗜热菌蛋白酶 的量.嗜热菌蛋白酶可以与底物FAGLA(N-(3-[2-呋喃基]丙酰基)-甘 氨-亮氨酰胺)反应，生成导致在345nm吸光度降低的化合物，消光系 数为-310M-1cm-1。该反应的分析缓冲液条件是40mM Tris，10mM CaCl2和1.75M NaCl，pH为7.5。反应在1ml试管中进行，将5μl FAGLA母液(在dH2O中的25.5mM 30％ DMF)和10μg嗜热菌蛋白 酶原纤维在1ml的分析缓冲液中混合。扫描10分钟以上检测到345nm 处吸光度降低。然后用消光系数为-310M-1cm-1从初始斜度来计算酶 活性(μM/分钟)。每g原纤维中活性嗜热菌蛋白酶的量是0.61μ摩尔。
实施例12
通过吸附1，4，8，11，15，18，22，25-八丁氧基-29H，31H-酞菁官能化原纤维
[00119]取3mg1，4，8，11，15，18，22，25-八丁氧基-29H，31H-酞菁和 5.3mg的纯原纤维在1ml的CHCl3中混合。声处理该混合物50分钟 并在室温下旋转过夜。
[00120]用3 x 1ml的CH2Cl2洗涤该原纤维并真空干燥。
[00121]根据实施例34的方法通过吸附将嗜热菌蛋白酶固定于酞 菁衍生物的原纤维上。每g原纤维中活性嗜热菌蛋白酶的量是0.70μ 摩尔。
实施例13
用酞菁衍生物的原纤维和固定于其上的嗜热菌蛋白酶合成阿司帕坦前 体
[00122]固定了嗜热菌蛋白酶的酞菁衍生物的原纤维可以用于催 化人造甜味剂阿司帕坦的前体的合成.进行该反应，包括使用10μM 固定了嗜热菌蛋白酶的原纤维在乙酸乙酯中与80mM L-Z-Asp和220 mM L-PheOMe混合。通过HPLC检测产物Z-Asp-PheOMe以确定 收率。
5.氯酸或硝酸的氧化
[00123]通过强氧化剂例如在浓硫酸或硝酸中的氯酸钾氧化石墨 的文献，包括R.N.Smith，Quarterly Review 13，287(1959)；MJ.D. Low，Chem.Rev.60.267(1960)).一般地，攻击边缘碳(包括缺失位 点)可以得到羧酸、酚和其他氧化基团的混合物。其机理是复杂的， 包括自由基反应。
实施例14
用氯酸盐制备羧酸官能化的原纤维
[00124]CC原纤维的样品在浓硫酸中浆化，包括用铲混合，然后 转移到具有气体进口/出口和顶搅拌器的反应烧瓶中。在搅拌和缓慢的 氩气流下，在运行期间在RT下分份加入NaClO3.在运行的全过程 中产生了氯蒸汽，将其清除出反应器中进入NaOH trap.水溶液中。 运行结束后，将原纤维浆体倾倒入碎冰中，真空过滤.然后把滤饼转 移到Soxhlet圆筒滤纸上，用DI水在Soxhlet提取器中洗涤，每隔数 小时交换新鲜水。继续洗涤直至原纤维的样品在加入新鲜DI水后不 会改变水的pH。然后过滤分离原纤维，在5”真空和100℃干燥过夜。
[00125]确定羧酸的量，包括讲样品与过量0.100N NaOH反应， 并用0.100N HCl反滴定至pH7.5的终点。结果列于下表。
表III
直接进行氧化的概要
实施例15
用硝酸制备羧酸官能化的原纤维
[00126]在具有顶搅拌器和水冷凝器的圆底多颈有痕的反应烧瓶 中将原纤维的已称重样品与适当强度的硝酸浆化.在恒速搅拌下，调 节温度，并在特定时间进行反应.在温度超过70℃时，不论酸的强 度如何，都立刻释放出了棕色的烟雾。反应后，将浆体倾倒入碎冰中， 并用DI稀释。过滤该浆体，在Soxhlet提取器中洗涤除去过量的酸， 每隔几小时用新鲜的DI水取代容器中的水，直至浆体样品不改变DI 水的pH.在5”真空和100℃将原纤维干燥过夜。已称重部分的原纤 维与标准的0.100N NaOH反应，用0.100N HCl反滴定来确定羧酸 的含量。通过XPS确定表面氧的含量。通过在韦林搅拌器中高速混合 2分钟来确定在水中0.1wt％的可分散性.结果概述于表4中。
表IV
直接进行氧化的概要
P＝差；G＝好
6.原纤维的氨基官能化
[00127]氨基可以直接引入到石墨原纤维上，包括根据如下通式， 用硝酸和硫酸处理原纤维，得到硝化原纤维，然后用还原剂例如低亚 硫酸钠还原该硝化型得到氨基官能化的原纤维：
所得到的原纤具有众多的用途，包括固定蛋白质(例如酶和抗体)、 以及亲和和离子交换色谱。
实施例16
用硝酸制备氨基官能化的原纤维
[00128]向原纤维(70mg)的水1.6ml)和乙酸0.8ml)冷混悬液中 以滴加的方式加入硝酸(0.4ml)。在0℃将反应混合物搅拌15分钟， 在室温下再搅拌1小时。缓慢加入硫酸(0.4ml)和盐酸(0.4ml)的混合 物，在室温下搅拌1小时。停止反应并离心。除去水层，用水(X5)洗 涤原纤维。用10％氢氧化钠(X3)处理残留物，用水(X5)洗涤，得到硝 化的原纤维。
[00129]在0℃下向原纤维s.向硝化原纤维的水(3ml)和氨水 (2ml)的混悬液中分三次加入低亚硫酸钠(200mg)。在室温下搅拌反 应混合物5分钟，在100℃下回流1小时.停止反应，冷却至0℃， 用乙酸(pH4)调节pH，在室温下放置过夜后，过滤该混悬液，用水(X 10)，甲醇(X5)洗涤，真空干燥得到氨基原纤维。
[00130]为了试验氨基官能化的原纤维，将该原纤维与辣根过氧 化物酶结合。然后将与HRP结合的氨基原纤维广泛透析。在透析后， 在下一周里将原纤维洗涤15次。如下分析酶修饰的原纤维：
[00131]结果表明，在保存超过一周以后，与原纤维-NH2结合的 HRP显示了良好的酶活性。
7.用自由基引发剂结合末端的醇
[00132]当其用于苛刻环境中时，碳纳米管的高度稳定性使得它 们难以活化而进一步修饰。现有的方法包括使用强的氧化剂和酸。现 在令人惊奇地发现，用自由基引发剂例如过氧化苯甲酰(BPO)可以把 末端醇结合到碳纳米管上。向碳纳米管上加入通式为RCH2OH的醇， 其中R是氢、烷基、芳基、环烷基、芳烷基、芳基、或聚(烷基醚)和 自由基引发剂，并从约60℃加热到约90℃。优选的醇包括甲醇和乙 醇。当足够所有的自由基引发剂分解的时间过去后，过滤反应混合物， 洗涤碳纳米管物质并干燥，得到通式纳米管-CH(R)OH的修饰的纳米 管。该方法也可以用于连接双功能的醇。这就允许一端连接碳纳米管， 而另一端用于与表面的其他物质间接连接。
实施例17
用过氧化苯甲酰制备醇官能化的纳米管
[00133]用探针超声波破碎器将0.277g的碳纳米管分散到MeOH 中。在RT下加入0.126g的BPO，温度升高到60℃，加入0.129g的 BPO原料，混合物在60℃下再保持30分钟。在膜上过滤产品，用 MeOH和EtOH洗涤几次，在90℃的烤箱中干燥。收率是0.285g。 ESCA分析表明，氧含量是2.5％原子，与此相比，在不含BPO的MeOH 中回流的对照样品是0.74％。
实施例18
用过氧化苯甲酰修饰含聚(乙二醇)的碳纳米管
[00134]将0.1g的碳纳米管、0.5g BPO和10g聚(乙二醇)avg.mol. wt.1000(PEG-1000)在室温下混合在一起。温度加热到90℃使PEG 熔化，将混合物保持在90℃反应过夜.然后过滤全部混合物，洗涤 除去过量的PEG，然后干燥.可以使用所得到的物质，或者可以通过 向PEG的自由末端结合感兴趣的物质而进一步修饰。
实施例19
PEG修饰的碳纳米管在减少非特异性结合中的应用
[00135]与表面积较大的碳类物质非特异性结合是普遍存在的. 已经发现，结合亲水性低聚物例如PEG到碳纳米管上可以降低非特 异性结合。此外，已经发现，在碳纳米管的表面结合链样分子例如 PEG，其自由末端可以包含能与其他感兴趣物质结合的官能团，同时 仍保留了PEG(或其他物质)层减少非特异性结合的性质.
PEG修饰的原纤维减少牛血清白蛋白的非特异性结合
[00136]制备0.1mg/ml的未修饰的原纤维、氯酸盐氧化的原纤 维和PEG修饰的原纤维的pH7.0的50mM磷酸氢二钾缓冲液的母分 散液包括将1.0mg的每种物质用声处理分散在10mis的缓冲液中.在 9个聚丙烯管中放入2mis的每种的2倍连续稀释液。向每个管和三个 空白缓冲液中加入100μl 0.2mg/ml牛血清白蛋白的相同缓冲液溶液。 也制备不含蛋白质的三个缓冲液管.所有管都在涡旋混合物上混合， 培养30分钟，其中每10分钟涡旋30秒。离心分离所有的管以分离 原纤维，将1ml等分的上清液转移到新管中，用微BCA蛋白分析法 (Pierce)分析总蛋白含量。在上清液中保留的蛋白质的水平是与原 纤维非特异性结合的量的间接测定值。对于PEG修饰的原纤维，所 有BSA都保留在上清液中，同时它们与未修饰或氯酸盐氧化的原纤 维几乎完全结合(附图1)。
用过氧化苯甲酰制备的PEG修饰的原纤维与通过NHS结合非特 异性结合减少的比较
[00137]用声处理在50mM磷酸氢二钾缓冲液，pH7.0中制备1.0 mg/ml过氯酸盐氧化的原纤维，用过氧化苯甲酰被PEG修饰的原纤 维和过氯酸盐氧化的，通过NHS酯结合被PEG修饰的原纤维的母分 散液.在7个聚丙烯管中放入2mis的每种的3倍连续稀释液。向每 个管和三个空白缓冲液中加入100μl 0.2mg/ml β-乳球蛋白(βLG) 的相同缓冲液溶液.也制备不含蛋白质的三个缓冲液管。所有管都在 涡旋混合物上混合，培养60分钟，其中每10分钟涡旋30秒。离心 分离所有的管以分离原纤维，将1ml等分的上清液转移到新管中，用 微BCA蛋白分析法(Pierce)分析总蛋白含量。在上清液中保留的蛋 白质的水平是与原纤维非特异性结合的量的间接测定值(见附图2). 对于每个管，经NHS酯途径用PEG修饰的原纤维，βLG都保留在上 清液中，表明不存在非特异性结合。经BPO途径用PEG修饰的原纤 维在1.0mg/ml的原纤维最高水平时仅显示βLG轻微的结合(约 10％)，在低水平时则没有显著的结合。相反地，在1.0mg/ml和上述 的原纤维水平时几乎与氯酸盐氧化的原纤维完全结合，在原纤维低至 0.01mg/ml仍基本上结合。
8.官能化纳米管的次级衍生物
羧酸官能化的纳米管
[00138]可以仅由羧酸制备的次级衍生物的数量基本上是无限 的。醇或胺易于与酸结合形成稳定的酯或酰胺.如果醇或胺是部分的 二-或双功能多功能分子，那么通过O-或NH-连接将使其他的功能性 成为侧基。次级试剂的典型实施例是：
通式 侧基 实施例
HO-R，R＝烷基，芳烷基，芳基， R- 甲醇、酚、三氟烃基、OH-末端聚酯、硅醇
氟代醇、聚酯、SiR’3
H2N-RR＝与上述相同 R- 胺、苯胺、氟代胺、硅烷基胺、胺基末端的聚酰胺、蛋白质
Cl-SiR3 SiR3- 氯硅烷
HO-R-OH，R＝烷基， HO- 乙二醇、PEG、五赤藻糖醇、双酚A
芳烷基，CH2O-
H2N-R-NH2，R＝烷基， H2N- 乙二胺氨茶碱、聚乙烯胺
芳烷基
X-R-Y，R＝烷基等； Y- 聚胺酰胺、巯基乙醇
X＝OH或NH2；Y＝SH，CN，
C＝O、CHO、烯、炔、芳基、
杂环
[00139]该反应可以用任何方法来进行，以便用醇或胺酯化或胺 化羧酸。其中，使用H.A.Staab，Anagew.Chem.Intemat.Edit.，(1)， 351(1962)的方法，用N，N’-羰二咪唑(CDI)作为酰化剂制备酯或酰胺； 使用G.W.Anderson，等人，J.Amer.Chem.Soc.86，1839(1964)的 方法，用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧酸以酰胺化。
实施例20
官能化原纤维的次级衍生物的制备
N，N’-羰二咪唑
[00140]该方法需要澄清的、干燥的非质子溶剂(例如甲苯或二 噁烷)。化学量的试剂是足够的。对于酯，羧酸化合物在惰性气体(氩 气)中在甲苯中与化学量的溶解在甲苯中的CDI在RT下反应2小时。 在此期间，释放出CO2。2小时后，加入醇和催化量的乙醇钠，继续 在80℃反应4小时。对于平常的醇，收率是定量的。该反应是：
1.R-COOH+Im-CO-Im---------->R-CO-Im+HIm+CO2，Im＝咪唑，
HIm＝咪唑
2.
[00141]胺的酰胺化在RT下不催化即可发生。该方法的第一步 是相同的。在释放出CO2后，在室温下加入化学量的胺，反应1-2小 时。该反应是定量的。该反应是：
3.R-CO-Im+R’NH2--------------->R-CO-NHR+Him
硅烷基化
[00142]三烷基硅烷基氯或三烷基硅醇与酸性的H立即根据如下 反应式反应：
R-COOH+Cl-SiR’3----------------->>R-CO-SiR’3+HCl
[00143]少量的重氮-1，1，1-二环辛烷(DABCO)用作催化剂。适 当的溶剂是二噁烷和甲苯。
磺酸-官能化的原纤维
[00144]如实施例1制备的芳基磺酸可以进一步反应得到次级衍 生物。磺酸可以被LiAlH4或三苯基膦和碘的组合(March，J.P.，p.1107) 还原成硫醇。它们也可以通过与二烷基醚反应转变成磺酸酯，即原纤 维～SO3H+R-O-R--------->原纤维-SO2OR+ROH
N-羟基琥珀酰亚胺
[00145]用伯胺酰胺化来活化羧酸可以通过N-羟基琥珀酰酯来完 成；碳二亚胺用于阻碍水以取代的脲释放.然后在RT下将NHS酯通 过与伯胺反应而转换成酰胺。该反应是：
1.R-COOH+NHS+碳二亚胺----------->R-CONHS+物质脲
2.R-CONHS+R’NH2-------------->R-CO-NHR’
[00146]该方法特别是可以用于蛋白质和石墨原纤维经蛋白质侧 链的游离NH2共价结合.可以通过该方法固定在原纤维上的蛋白质的 例子包括胰蛋白酶、抗生蛋白链菌素和卵白素。抗生蛋白链菌素(或 卵白素)原纤维为任意的生物素化的底物提供了固体载体。
实施例21
原纤维和蛋白质经NHS酯共价结合
[00147]为了证明蛋白质可以经NHS酯共价结合到原纤维上，按 如下方法将抗生蛋白链菌素、卵白素和胰蛋白酶结合到原纤维上。
[00148]用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤0.5mg的NHS-酯 原纤维，弃去上清液。向原纤维中加入200μl抗生蛋白链菌素溶液(在 相同缓冲液中，1.5mg)，在室温下旋转混合物5.5小时，然后用1ml 下列的缓冲液依次洗涤原纤维：5mM磷酸钠(pH7.1)，PBS(0.1mM磷 酸钠，0.15mM NaCl，pH7.4)，ORIGENTM分析缓冲液(IGEN，Inc.， Gaithersburg，MD)和PBS。抗生蛋白链菌素原纤维贮存在PBS缓冲 液中用于进一步的应用。
[00149]将2.25mg NHS-酯原纤维在500μl的5mM磷酸钠缓 冲液(pH7.1)中声处理40分钟，弃去上清液。将该原纤维悬浮于500 μl的5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)中，加入300μl的卵白素溶液，其 中卵白素溶液是在包含2mg卵白素的相同的缓冲液中制成的 (Sigma，A-9390).在室温下将该混合物旋转2小时，在4℃下贮存 过夜，在室温下再旋转1小时。用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)将原 纤维洗涤4次，用PBS缓冲液洗涤2次.将卵白素原纤维悬浮于200μl PBS缓冲液中贮存。
[00150]胰蛋白酶原纤维的制备，包括将1.1mg NHS-酯原纤维 (如卵白素原纤维处理)和在5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)中制备的 200μl的1.06mM胰蛋白酶溶液混合，在室温下旋转6.5小时。然后 将胰蛋白酶原纤维用1ml的5mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤3次， 并悬浮于400μl的相同缓冲液中贮存。
实施例22
原纤维上胰蛋白酶的酶活性的测定
[00151]胰蛋白酶可以与底物L-BAPNA(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸 对硝基苯胺)反应，释放出在410nm吸收光的有色化合物。该反应的 分析缓冲液是0.05M Tris，0.02M CaCl2，pH8.2。该反应在1ml试 管中进行，包括将5μl的L-BAPNA母液(在H2O中50mM的37％ DMSO)和10-25μg的胰蛋白酶原纤维在1ml的分析缓冲液中混合。 在10分钟后，在410nm处检测到吸光度增加.然后从开始的斜度计 算酶活性(μM/分钟)。
[00152]对于共价结合的胰蛋白酶原纤维，该活性是每13μg原 纤维5.24μM/分钟。该结果也可以转变成在原纤维上的活化胰蛋白酶 的量，包括除以已知浓度的胰蛋白酶溶液的活性，已知浓度的胰蛋白 酶溶液在相同分析条件下测定是每1μM胰蛋白酶46μM/分钟。因 此，每g原纤维的活化胰蛋白酶的量是8.3μ摩尔(或195mg)。
实施例23
具有表面硫醇的碳纳米管
[00153]将通过实施例27(下文)制备的用乙二胺氨茶碱修饰的 0.112g的氨基碳纳米管(CN)悬浮于包含50mM EDTA的20mis pH 8.0的0.05M磷酸氢二钾缓冲液。将该混悬液在Branson 450 Watt 探针超声破碎器重声处理5分钟以分散CN。所得到的混悬液是十分 粘稠的。搅拌下通入氩气起泡30分钟.加入50mg的2-亚胺基硫 醇.HCl，将混合物继续搅拌在氩气下继续反应70分钟。在聚碳酸酯 膜过滤器上过滤所得到的物质，用缓冲液洗涤2X，用DI水洗涤1X， 用纯净EtOH洗涤2X，全部在氩气覆盖下进行。硫醇修饰的CN置 于真空干燥器中，抽吸过夜
[00154]最终重量＝0.118g，根据重量增加，转变率为55％。
[00155]用声处理将硫醇化纳米管的10mg样品悬浮于10mis.的 DI水中，在0.45μm尼龙膜上过滤形成毯样的物质。先将该物质部 分贮存在真空干燥器中，然后用ESCA分析，该分析显示有0.46％硫 和1.69％氮，证明成功地转变成了硫醇修饰的CN。
实施例24
硫醇修饰的碳纳米管与含金表面的结合
[00156]用1份30％ H2O2和3份浓硫酸的溶液清洗金箔 (Alfa/Aesar)，2cm x 0.8cm，共10分钟，并用DI水清洗。箔碎片与 Au线头相连并其电化学在1M H2SO4中以50mv/秒的速度在-0.35V vs.Ag/AgCl到1.45V vs.Ag/AgCl之间循环，直至循环伏安图在约10 分钟没有改变为止。然后用DI水清洗并干燥。大的碎片切割成4个0.5 cm x 0.8cm的条。
[00157]将通过氩气冲洗去氧的10mis的纯EtOH分别置于2个 玻璃瓶中。在一个瓶中，悬浮了16mg的硫醇修饰的CN(CN/SH)和 2个Au碎片，而在另一个瓶中用Au的1个碎片和10mg的乙二胺 修饰的CN使得硫醇衍生化。所有的操作都在充满氩气的手套袋中进 行。在氩其中密封该瓶，置于冷冻的超声浴中1小时。将密封的瓶在 RT下放置72小时.从瓶中除去Au样品，用EtOH冲洗3X，空气干 燥并置于保护性的瓶中。
[00158]通过扫描电子显微镜术(SEM)检查暴露在CN/乙二胺氨 茶碱和CN/SH中的Au箔样品来检测表面上CN的存在与否.在 40,000X下的检查表明在暴露于CN/SH的表面上存在CN的分布，但 是在暴露于CN/乙二胺氨茶碱的Au箔样品上没有观测到CN。
实施例25
由氨基原纤维制备马来酰亚胺原纤维
[00159]根据实施例13制备氨基原纤维。然后将氨基原纤维(62.2 mg)在磷酸钠缓冲液(5ml，5mM，pH7.2)中声处理。向原纤维混悬 液中加入Sulfosuccinmidyl-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐 (SMCC；28.8mg，0.66mmols；Pierce，Cat.No.22360).在室温下 搅拌反应混合物果也。用水和甲醇洗涤原纤维，真空干燥产物原纤维。 固定在产物上的抗体证明了马来酰亚胺原纤维的存在.其他具有不同 连接子的马来酰亚胺(例如，磺基-SMCC、succinimidyl 4-[对马来酰 亚胺苯基]丁酸[SMPB]、磺基-SMPB、m-马来酰苄基-N-羟基琥珀酰 亚胺酯[MBS]、磺基-MBS等)原纤维也可以通过相同的方法来制备。
[00160]所得到的马来酰亚胺原纤维可以用作蛋白质例如抗体和 酶的共价固定的固体载体，抗体共价固定于马来酰胺的活化原纤维 上。当使用从硝化/还原法(实施例13)获得的氨基原纤维时，抗体的 容量是每g原纤维1.84mg，而当使用羧基原纤维制备的氨基原纤维时 为每g原纤维0.875mg。
实施例26
从羧酸-官能化的原纤维制备酯/醇类衍生物
[00161]如实施例14制备羧酸官能化的原纤维.羧酸的含量是0.75 meq/g。原纤维与化学量的以甲苯为溶剂的CDI在惰性大气中在室温 下反应，直至CO2停止释放。然后，该浆体在80℃下与10倍摩尔过 量的聚乙烯二醇(MW 600)反应，加入少量NaOEt作为催化剂.反 应2小时后，过滤分离原纤维，用甲苯洗涤，并在100℃干燥。
实施例27
由羧酸官能化的原纤维(177-041-1)制备酰胺/胺衍生物
[00162]搅拌下在具有血清停止器的100ml RB烧瓶中将0.242g 的氯酸盐氧化的原纤维(0.62meq/g)悬浮于20ml无水二噁烷中。加 入20倍摩尔过量的N-羟基琥珀酰亚胺(0.299g)并溶解.然后加入20 倍摩尔过量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)(0.510 g)，继续在室温下搅拌2小时。在这段时间结束后停止搅拌，抽取上 清液，用无水二噁烷和MeOH洗涤固体，在0.45微米的聚砜膜上过 滤。在滤膜上再用MeOH洗涤固体，真空干燥直至观测到重量不再 减少.根据所观测到的重量增加6％，NHS-活化的氧化原纤维的收率 是100％。
[00163]将100μl乙二胺氨茶碱(en)加入到10ml 0.2M NaHCO3 缓冲液中。加入等量的乙酸(HOAc)以维持pH在8左右。在强力搅 拌下加入NHS-活化的氧化原纤维(0.310g)并反应1小时.10分钟 后再加入300μl的en和300μl HOAc。在0.45微米的聚砜膜上过滤 该溶液，并用NaHCO3缓冲液，1％HCl，DI水和EtOH连续洗涤。 真空干燥该固体过夜.通过与NaOH(177-046-1)反应，HCl盐又变 回成游离的胺用于进一步的分析和反应。
[00164]进行ESCA以确定胺化原纤维(GF/NH2)中N的存在量。 177-046-1的ESCA分析表明含有0.90 at％ N(177-059).为了进一步 评价在易受影响和反应性胺基中N的量，制备一种衍生物，包括与五 氟苯甲醛气相反应生成相应的与伯胺基有效连接的Schiff碱。ESCA 分析仍然表明了，如所期望，含0.91 at％N和1.68 at％ F.这可以转 换成在胺化原纤维上作为反应性伯胺存在的N是0.34 at％(每个五氟 苯甲醛分子含5个F)。假设在每个N的游离末端完全反应的话，N的 水平应当是0.45 at％。所观测到的水平表明，N与NHS-活化的原纤 维的反应具有非常高的收率，证明了可用的游离胺基的反应性.
[00165]由ESCA数据计算作为游离胺存在的0.34 at％的N的水 平，通过游离的胺基这几乎是原纤维的全部范围，这就允许与其它物 质连接。
[00166]羧基原纤维也可以转变成氨基原纤维，包括使用单-保护 1，6-二氨基己烷(以中六碳连接子)，而不是乙二胺氨茶碱(一种二 碳连接子)。
实施例28
由羧酸官能化的原纤维制备胺衍生物
[00167]修饰原纤维上的羧基，包括将羧基与具有两个或多个氨 基的化合物(至少一个氨基是没有例如t-Boc或CBZ的基团保护的) 上的一个氨基反应.这样制备的原纤维是酰胺衍生物，其中酰胺羰基 来自原纤维的羧基，酰胺氮被包含一个或多个伯胺的基团(例如烷基) 所取代。然后氨基可以有效地使用或者进一步修饰。
[00168]取1g的碳原纤维置于干燥的scintered玻璃过滤管中， 其出口用橡胶血清隔片紧紧地塞住，加入无水二氯甲烷覆盖。加入N- 甲基吗啉(758μL，7mmol)，用药铲辅助混合混悬液。然后加入氯甲 酸异丁酯(915μL，7mmol)，混悬液定期混合1小时。通过石蜡膜尽 可能多地覆盖以使该混合物远离大气中的水蒸汽。
[00169]同时，盐酸N-boc-l，6-二氨基基烷(1.94g，7.7mmol)在 二氯甲烷(10mL)和1M NaOH(10mL)之间分层。较低的有机相在 无水碳酸钾上干燥，过滤通过包含棉花塞的一次性巴斯德吸管，加入 N-甲基吗啉(758μL，7mmol)。
[00170]从过滤漏斗中除去血清隔片，真空过滤从原纤维中除去 试剂，用无水二氯甲烷洗涤原纤维。将血清隔片放回，向原纤维中加 入N-甲基吗啉和单保护的二氨基己烷。周期性搅拌混合物1小时。然 后，过滤除去试剂，一次用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇和二氯甲烷洗 涤原纤维。
[00171]向原纤维中加入三氟酸和二氯甲烷的50％混合物，周期 性搅拌混合物20分钟。过滤除去溶剂，依次用二氯甲烷、甲醇、水、 0.1M NaOH和水洗涤原纤维。
[00172]为了证明方法的有效性，用氨基原纤维的小样品与被修 饰与氨基特异性反应的”活化的”辣根过氧化物酶(HRP；5mg，Pierce) 反应。在几天内反复洗涤原纤维(混悬、旋转、和在Eppendorf微量 离心管中离心)，同时保持冷却。在洗涤约2周后，用H2O2/ABTS在 甘氨酸缓冲液，pH4.4中分析酶.10分钟内溶液显现绿色，表明了酶 的存在。对照的原纤维(用活化的HRP处理的COOH原纤维并在同 样的时间洗涤)显示，如果有任何的催化活性，也几乎没有酶。
实施例29
由羧酸官能化的原纤维制备硅甲烷衍生物
[00173]在惰性大气中，将如实施例14制备的酸官能化的原纤维 在二噁烷中浆化。搅拌下，加入化学量的氯三乙基硅烷，反应0.5小 时，然后滴加几滴5％DABCO的二噁烷溶液.系统再反应1小时， 然后过滤收集原纤维，在二噁烷中洗涤。该原纤维在100℃5”真空中 干燥过夜。
[00174]表V概述了次级衍生物的制备。通过分析ESCA分析产 物的C、O、N、Si和F的表面含量。
表V
次级衍生物制备的概述
实施例30
由羧酸-官能化的原纤维制备硅烷衍生物
[00175]在惰性大气中，将如实施例14制备的酸官能化的原纤维 在二噁烷中浆化。搅拌下，加入化学量的氯三乙基硅烷，反应0.5小 时，然后滴加几滴5％DABCO的二噁烷溶液。系统再反应1小时， 然后过滤收集原纤维，在二噁烷中洗涤。该原纤维在100℃5”真空中 干燥过夜。
[00176]表VI概述了次级衍生物的制备。通过分析ESCA分析产 物。该分析表明掺入了所需的侧基。通过分析ESCA分析产物的C、 O、N、Si和F的表面含量。
表VI
次级衍生物制备的概述
实施例31
由羧酸官能化原纤维制备叔胺和季胺衍生物
[00177]叔胺和季胺官能团可以经酰胺或酯键经纳米管的羧基和 叔胺和季胺前体的胺或羟基结合到碳纳米管的表面。这些叔胺和季胺 元纤维可以作为色谱基质用于生物分子的分离。叔胺和季胺原纤维可 以装配到盘状的垫中或与常规的色谱基质(例如琼脂糖)混合用于分 离的目的。
碘化三乙基乙醇胺前体的制备
[00178]在100ml圆底烧瓶中，将10g N，N-二乙基乙醇胺(85.3 mmole)与10ml无水甲醇混合。然后用吸量管滴加20g碘乙烷(127.95 mmole)和10ml无水甲醇的混合物。将反应混合物回流30分钟。当 反应混合物冷却至室温时，形成了白色晶体产物。过滤收集白色固体 产物，并用无水甲醇洗涤.产物在干燥器中进一步真空干燥过夜。得 到的产物(10.3g，37.7mmole)收率是33％。
季胺官能化的石墨原纤维的制备
[00179]在真空干燥的25ml Wheaton一次性闪烁瓶中，将100mg 干燥羧基原纤维(每g原纤维约0.7mmole COOH)与2ml无水二甲 基酰胺，将混合物声处理60秒.向反应瓶中加入2L二甲基酰胺二 甲基酰胺，39mg二甲基-氨基吡啶(0.316mmole)，和50μl二异丙基 碳二亚胺(0.316mmole)。在室温下将反应混合物搅拌1小时，然后 向该瓶中加入88mg碘化三乙基乙醇胺(0.316mmole)，反应进行过 夜。所得到的原纤维用20ml二甲基酰胺洗涤3次，用20ml二氯 甲烷洗涤3次，用20ml甲醇洗涤3次，最后用去离子水洗涤3次。 真空干燥该产物.对氮元素分析的结果表明原纤维上约50％的羧基 已经与季胺部分的伯氨基反应
实施例32
在叔胺官能化的石墨原纤维上牛血清白蛋白(BSA)的色谱法
[00180]将包含60mg 2-乙基氨基乙胺修饰的羧基原纤维和180mg 葡聚糖凝胶G-25超精细树脂(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的含水 浆体在室温下保存过夜，以确保固体载体的完全水合。将浆体装入到 1cm x 3.5cm柱中。该柱用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)以0.2ml/分 钟的流速平衡.在柱上负载BSA(0.6mg，在0.1ml去离子水中)。 用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)以0.2ml/分钟的流速洗脱该柱，收集 0.6ml的部分。用UV-可见探测器检测洗脱图，如附图3所示。由于 该探测器表明没有蛋白质从柱中洗脱，通过加入在5mM磷酸钠(pH 7.3)中的1M KCl洗脱结合的BSA。在每个部分中蛋白质的存在可以 通过微BCA分析(Pierce，Rockford，II)来鉴别。
实施例33
在季胺官能化的石墨原纤维上牛血清白蛋白(BSA)的色谱法
[00181]将包含100mg 2-(2-三乙基氨基乙氧基)乙醇修饰的羧基 原纤维和300mg葡聚糖凝胶G-25超精细树脂(Pharmacia， Uppsala，Sweden)的含水浆体在室温下保存过夜。所得到的浆体用于 装入到1cm直径的柱中。该柱用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)以0.1- 0.6ml/分钟的流速平衡。在柱上负载BSA(2.70.6mg，在0.2ml去离 子水中)。用5mM磷酸钠以0.2ml/分钟的流速洗脱该柱，收集0.6ml 的部分。用UV-可见探测器检测洗脱图(附图4).由于该探测器表明 蛋白质不会被5mM磷酸钠缓冲液洗脱，改变溶剂成为5mM磷酸钠 (pH7.3)中的1M KCl。在每个部分中蛋白质的存在可以通过微BCA 分析(Pierce，Rockford，II)来鉴别。
9.石墨碳的酶官能化
[00182]生物催化剂可以用于将官能团引入到石墨碳，特别是碳 纳米管的表面.直到现在，是通过纯化学方法修饰石墨碳(参见例如， 1994年12月8日提交的U.S.申请序列号08/352,400)。这些化学方法 具有如下缺点：(1)条件苛刻(使用极高的温度，极大酸性或毒性的 化学物质)，和(2)缺乏特异性(例如，氧化可以引入COOH、COH、 和CHO基).制备的固体石墨碳(例如碳原纤维；Hyperion，Inc.) 的水混悬液包含一种或多种能作为底物接受石墨碳并进行化学反应形 成化学修饰的石墨碳的酶。将水混悬液保持在酶进行反应可接受的条 件(温度、pH、盐浓度等等)下一段时间，该时间足以使酶催化修饰 石墨碳的表面。在反应期间，继续混合混悬液以使酶通向石墨碳的表 面。在反应达到令人满意的程度可接受的反应时间后，从碳中过滤洗 涤除去酶。
[00183]碳纳米管.迄今为止，使用两种类型的酶：细胞色素p450 酶和过氧化物酶。在两种情况中，对两种类型的酶都进行了良好的研 究，它们接受芳香族类型的底物，并找到了它们最佳的反应条件。两 种类型的酶将羟基引入到它们的底物中，并可以将羟基引入到石墨碳 中.除了酶以外，其他的生物催化剂例如核酶和催化抗体，或酶的非 生物学拟态可以用于催化官能化.
实施例34
用大鼠肝微粒体进行酶官能化
[00184]细胞色素p450酶一般认为作为去毒剂在肝中发挥功能(F. Peter Guengerich，American Scientist，81，440-447和F.Peter Guengerich，J.Biol.Chem.，266，10019-10022)。它们将外源性化合 物例如聚芳族毒性化合物羟基化。羟基化使得这些化合物变得能溶于 水，以使得它们可以经过尿从身体排出。在肝中有很多不同的细胞色 素p450酶，每一种都有不同的底物特异性.由于需要去毒的环境毒 素范围广泛，因此人们相信这些较宽范围的特异性是非常重要的。尽 管个体细胞色素p450是商业可用的，但没有关于它们作为底物是否 接受碳纳米管的任何信息。由于这种不确定性，我们决定用包含许多 不同的细胞色素p450的大鼠肝提取物开始培养碳纳米管。
[00185]在其饮用水中给2只大鼠(”试验性”大鼠)施用苯巴比 妥(1g/L，pH7.0)1周，来诱导细胞色素p450酶的表达。另两只大鼠 (”对照”大鼠)给予不含苯巴比妥的水。然后处死大鼠，通过标准方 法(参见，例如Methods in Enzymology，Vol.206)由它们的肝制备 包含细胞色素p450的微粒体.
[00186]线粒体与碳纳米管(原纤维)混合，以使细胞色素p450 与石墨碳反应。在这些试验中，5mg的原纤维(”纯”或非官能化 和”COOH”或氧化的原纤维)与微粒体(试验和对照微粒体)在包含 0.1M Tris，1.0mM NADPH，0.01％ NaN3，10mM葡萄糖-6-磷酸盐， 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1个单位/mL)，pH7.4的缓冲溶液中混合。包 括作为细胞色素p450和葡萄糖-6-磷酸盐的协同底物的NADPH，加 入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以从NADP+中再生(如果NADP+是由细胞色 素p450产生的)。在Eppendorf微量离心管中将反应物在室温下旋转 该混合物约1.5天.在培养后，在去离子水、1M HCl、1M NaOH、 0.05％ Triton X-100、0.05％Tween、甲醇、和1M NaCl广泛洗涤原 纤维。洗涤后，蛋白质(Pierce)的微BCA分析(Pierce)表明，原 纤维看上去仍然具有与它们连接的蛋白质(尽管在洗涤溶液中没有检 测到蛋白质)。
[00187]为了确定羟基是否引入到原纤维的表面，将原纤维与N- FMOC-异亮氨酸反应。不同批次的原纤维(对照和实验)(每组 1.5mg)与333ml的干燥DMF溶液反应，DMF溶液包含4.45mg/mL FMOC-异亮氨酸，1.54mg/mL二甲基氨基吡啶(DMAP)和2.6 mg/mL 1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)。反应两天后(通过连续旋转)， 用DMF、哌啶、甲醇、水、DMF、甲醇、二氯甲烷(每种600ml) 洗涤原纤维.将该洗涤顺序重复3次。将原纤维送入到Galbraith Laboratories(Knoxville，TN)中用于氨基酸分析，用于分析异亮氨酸 的存在.该结果是双关的，因为除了异亮氨酸外可见许多其他的氨基 酸，表明存在于大鼠肝微粒体提取物中的蛋白质、肽和氨基酸不能完 全从原纤维洗去。因此，由于在洗涤和分析方面的技术困难，不能确 定细胞色素p450是否使原纤维官能化。
实施例35
用商业可用的重组细胞色素p450酶官能化原纤维
[00188]为了避免与使用大鼠肝微粒体作为细胞色素p450来源 有关的杂质，购买个体细胞色素p450酶(GENTEST，Woburn，MA)。 由于细胞色素p450酶仅对膜具有活性的，提供这些酶用于微粒体的 制备.用与上述类似的反应方法，我们试验了下列的细胞色素p450： CYPlAl(cat.# Mlllb)、CYP1A2(cat.# M103c)、CYP2B6(cat.# HOa)、 CYP3A4(含还原酶，cat J 107r)。在反应溶液中也可以包括MgCh(0.67 mg/mL)。在该试验中，用Soxhlet装置洗涤原纤维.
[00189]进行引入的羟基的分析，包括细胞色素p450反应、洗 涤的原纤维与显色试剂3，5-二硝基苯甲酸(DNBA)反应.如上所述进 行N-FMOC-异亮氨酸的结合.在与DNBA反应后，用DMF洗涤原 纤维，用6M HCl或46个单位/mL猪肝酯酶(Sigma)水解残留的(共 价结合)DNBA。水解处理后，通过原纤维周围的上清液的HPLC分 析进行释放的DNBA的分析.释放的DNBA的HPLC分析在Waters HPLC系统上进行，该系统装备有Vydac C 18反相分析柱(cat.# 218TP54)和从包含0.1％TFA(溶剂A)的去离子水到包含0.1％TFA (溶剂B)的乙腈的梯度洗脱。
实施例36
用过氧化物酶官能化原纤维
[00190]对过氧化物酶底物特异性的文献描述表明，碳纳米管可 以是这些酶的底物(J.S.Dorick等人，Biochemistry(1986)，25， 2946-2951；D.R.Buhler等人，Arch.Biochem.Biophys.(1961)92， 424-437；H.S.Mason，Adyances in Enzymology,(1957)19，79；G.D. Nordblom等人，Arch Biochem.Biophys.(1976)175，524-533)。为了 确定过氧化物酶(过氧化氢酶，H型，Sigma)是否能将羟基引入到原 纤维的表面，将原纤维(11mg)混合到包含50mM乙酸钠(1.25mL， pH5.0)、辣根过氧化物酶(200nM)的溶液中，在反应的前3小时每 次加入5g二羟延胡索酸(共15mg)。在4℃下反应共进行5小时， 有气体氧断断续续地起泡。反应后，用水、1N NaOH、甲醇、和二 氯甲烷(每种200mL)洗涤原纤维。用已加热灭活的过氧化物酶进行 对照反应(100℃下5分钟).
[00191]为了分析过氧化物酶催化的原纤维羟化作用的程度，将 原纤维与叔丁基二甲基硅烷氯(Aldrich)在干燥DMF中在咪唑存在下 反应。洗涤原纤维后，将原纤维送入Robertson Microlit Laboratories， Inc(Madison，NJ)进行元素分析，分析掺入到原纤维中的硅。分析的 结果对于原纤维表面的硅的存在是双关的。据信，在该试验中使用的 玻璃器皿中的硅以小碎片的形式存在于原纤维中，以供元素分析.这 导致在试验和对照样品中硅的高水平.试验的结论是，过氧化物酶将 羟基引入到了原纤维中，但是技术困难阻碍了我们确定任意引入的羟 基的存在.
10.通过亲电子加成到不含氧的原纤维底物上或通过金属化官能化纳 米管
[00192]通过向不含氧的原纤维表面上加入活化的亲电子试剂获得 的主要产物是侧基-COOH、-COCl、-CN、-CH2NH2、-CH2OH、-CH2- 卤素、或HC＝O.可以根据下列反应式转变成次级衍生物：
原纤维-COOH------------>见上
原纤维-COCl(酰基氯)+HO-R-Y------------>F-COO-R-Y(Sec.4/5)
原纤维-COCl+NH2-R-Y------------>F-CONH-R-Y
原纤维-CN+H2------------>F-CH2-NH2
原纤维-CH2NH2+HOOC-R-Y------------>F-CH2NHCO-R-Y
原纤维-CH2NH2+O＝CR-R’Y------------>F-CH2N＝CR-R’-Y
原纤维-CH2OH+O(COR-Y)2------------>F-CH2OCOR-Y
原纤维-CH2OH+HOOC-R-Y------------>F-CH2OCOR-Y
原纤维-CH2-卤素+Y------------->F-CH2-Y+X-Y-＝NCO-、-OR-
原纤维-C＝O+H2N-R-Y------------>F-C＝N-R-Y
11.树枝状高分子的纳米管
[00193]可以降低纳米管表面的官能团的浓度，包括用一系列的 各代的多功能剂修饰该纳米管，该多功能剂导致用特异性官能团的数 量随着每一代增加，从而形成树枝状高分子样结构。所得到的树枝状 纳米管作为与蛋白质共价固定的固体载体是特别有用的，因为他们增 加了固定在纳米管表面的蛋白质的密度。本发明证明了特异性化学官 能性的高密度可以传递到表面积较高的微粒碳的表面，而这对于先前 的表面积较高的碳是困难的.
实施例37
基于赖氨酸的树枝状高分子的制备
[00194]反应顺序如附图5所示.
[00195]向氨基原纤维(90mg)的碳酸氢钠(5ml，0.2M，pH8.6) 混悬液中加入Nα，Nε-di-t-boc-L-赖氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(120 mg，0.27mmol)的二噁烷(5ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物过 夜。用水、甲醇和二氯甲烷广泛洗涤叔丁氧基保护的赖氨酸原纤维并 真空干燥。然后在室温下用三氟乙酸(5ml)在二氯甲烷(5ml)中处理 该叔丁氧基保护的赖氨酸原纤维2小时.用二氯甲烷、甲醇和水广泛 洗涤该产物氨基赖氨酸原纤维.然后用相同方法制备第二和第三代赖 氨酸原纤维。氨基酸分析数据表明，第一代的赖氨酸原纤维中每g原 纤维包含0.6μmol赖氨酸，第二代的赖氨酸原纤维中每g原纤维包含 1.8μmol赖氨酸，第一代的赖氨酸原纤维中每g原纤维包含3.6μmol 赖氨酸。
[00196]羧基树枝状高分子原纤维可以通过相同方法，使用天冬 氨酸或谷氨酸和羧基原纤维来制备.
实施例38
羧酸盐-末端的树枝状高分子的制备
[00197]具有碳纳米管(CN)核的羧酸盐-末端的树枝状高分子 的制备包括，氨基丁基-氨基三乙酸(NTA)的连续、有序结合，以氯酸 盐氧化的碳纳米管的NHS开始制备.
NTA的制备
[00198]根据Hochuli(E.Hochuli，H.Dobeli，and A.Schacher， J.Chromatography.411，177-184(1987))的方法制备NTA，通过参考 将其内容引入本文.
CN/NHS的制备
[00199]根据实施例20的方法制备CN/NHS。
CN/NTA的制备
[00200]将0.4g的NTA-HCl溶解于25mis的0.2M NaHCO3，pH 8.1中。加入1M NaOH将pH调回到高达7.8。加入0.5g的CN/NHS， 声处理该混合物以分散CN，搅拌下所得到的浆体留在反应中30分钟。 在0.45μm尼龙膜上过滤该浆体，在过滤器上用pH8.1的碳酸盐缓 冲液洗涤2X，用DI水洗涤2X。声处理下将该修饰的CN两次再悬 浮于25mis的MeOH中，过滤得到固体饼，最后在真空干燥器中干 燥。
CN/NTA/NTA的制备
[00201]首先将CN/NTA转变成NHS活性酯.。取0.396g的 CN/NTA在真空干燥器中在90℃干燥30分钟，然后置于装有30mis 无水二噁烷的100ml RB瓶中，并用氩气冲刷。搅拌下加入0.4g的 N-羟基琥珀酰亚胺，然后继续搅拌1小时后加入0.67g的EDC.在 此期间，CN聚集到了一起。排出二噁烷，用20mis的无水二噁烷2X 洗涤固体。在将聚集物打散的时候，用20mis的无水MeOH洗涤固 体。在0.45μm尼龙膜上过滤该固体，悬浮于MeOH中，过滤并在 过滤器上用MeOH洗涤。
[00202]取0.2g的NTA加入到50ml的烧瓶中，并加入10滴 1M NaOH使其溶解。加入pH8.1的20mis 0.2M NaHCO3，然后加入 全部CN/NTA/NHS，用探针超声破碎器轻轻地声处理该溶液.混合 物在室温下留在反应中2.5小时。在0.45μm尼龙膜上过滤该修饰的 CN，用碳酸盐缓冲液洗涤2X，声处理下再悬浮于DI水中，过滤并 用DI水洗涤。然后将它们置于真空干燥器中干燥.
CN/NTA/NTA/NTA的制备
[00203]按照上述的方法，加入添加水平的NTA.
CN/NTA/NTA/NTA/NTA的制备
[00204]按照上述的方法，加入添加水平的NTA。
[00205]声处理下将每个四代NTA添加物样品(约10mg)悬浮 于10mis的DI水中，在0.45μm尼龙膜上过滤形成毯样的物质。该 物质部分贮存于真空干燥器中，通过ESCA分析氮(N)以指示NTA 的相对量。结果显示于下表中。
物质 通过ESCA分析％N
CN/NTA 0
CN/NTA/NTA 1.45
CN/NTA/NTA/NTA 1.87
CN/NTA/NTA/NTA/NTA 2.20
[00206]ESCA结果证实，每个连续代掺入的增加量。
实施例39
碳纳米管树枝状高分子作为蛋白质载体
[00207]通过原纤维衍生具有树枝状高分子可以极大地提高固定在 碳纳米管上的蛋白质的密度。根据如下方法将辣根过氧化物酶(HRP) 固定在碳纳米管上。
[00208]在室温下，将纯原纤维(0.49mg)、氨基原纤维(0.32 mg)、第一代赖氨酸原纤维(0.82mg)、第二代赖氨酸原纤维和第三代 赖氨酸原纤维与碳酸氢钠共轭缓冲液(600μl，0.1M，包含0.9％NaCl) 声处理15分钟。在室温下，它们与HRP的碳酸氢钠共轭缓冲液(490 ml，enzyme stock solution of 5.6mg/ml)溶液培养19小时。用下列缓 冲液(1ml)洗涤固定有HRP的原纤维：包含0.9％ NaCl的10mM NaHCO3缓冲液pH9.5(IX洗涤缓冲液)洗涤7此，在IX洗涤缓冲 液中的0.1％ Triton X-100洗涤5次，在IX洗涤缓冲液中的50％ 二醇洗涤3次。用在甘氨酸分析缓冲液(50mM，pH4.4)中的过氧化 氢溶液(10μl，10mM母液)和2，2-连氮基二(3-乙级苯噻唑啉)-6-磺酸 二铵盐(ABTS，3μl，mM母液)在414nm处分析HRP的活性。结 果显示于下表中：
原纤维 nmol HRP/g原纤维
纯原纤维 3.82
原纤维-NH2 8.58
原纤维-NH-Lys 28.09
原纤维-NH-Lys(Lys)2 28.30
原纤维-NH-Lys(Lys)4 46.28
12.双功能原纤维
[00209]已经发现，一种以上类型的官能团(例如羧基和氨基)可 以同时引入到原纤维上，包括将官能化的碳纳米管例如羧基纳米管， 与氨基酸反应。这些双功能的原纤维可以用于固定多个分子，特别是 以1:1的化学量和以紧密临近的方式。
实施例40
通过加入赖氨酸制备双功能原纤维
Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯的合成
[00210]反应顺序如附图7所示.取Nε-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(2 g，8.12mmol)溶解于甲醇(40ml)和水(40ml)中，用三乙胺调节pH 至8。向上述混合物中加入N-(苄氧羰基-氧)琥珀线亚胺的二噁烷(2.4 g，9.7mmol，在20ml中)的溶液中，用三乙胺维持pH在8-9。搅 拌反应混合物过夜。然后旋转蒸发除去溶剂，得到粗Nα-CBZ-Nε-(叔 丁氧羰基)-L-赖氨酸。用0.2M碳酸钙(4ml)洗涤Nα-CBZ-Nε-(叔丁氧 羰基)-L-赖氨酸，除去水层得到白色固体.该固体悬浮于N，N-二甲 基酰胺(40ml)和苄基溴(1.16ml)。反应混合物室温下搅拌过夜。用乙 酸乙酯和水处理该反应混合物，在硫酸镁上干燥有机层。除去溶剂得 到粗Nα-CBZ-Nε-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸苄酯，用25％己烷的乙酸乙 酯作为溶剂通过硅胶纯化。在0℃下向Nα-CBZ-Nε-(叔丁氧羰基)-L- 赖氨酸苄酯(1g，2.2mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入到三氟乙 酸。反应混合物在0℃搅拌10分钟，然后在室温下再搅拌2.5小时。 除去溶剂，得到粗产物。通过硅胶色谱法获得Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯。
Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维的合成
[00211]向羧基原纤维(300mg)的二氯甲烷(18ml)混悬液中 加入Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯(148mg，0.32mmol在20ml二氯甲烷 和176μl三乙胺中)的溶液.然后加入HOBT(43.3mg，0.32mmol)和 EDC(61.3mg，0.32mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜，获得粗 产物.用甲醇、二氯甲烷和水广泛洗涤产物原纤维，然后真空干燥。
双功能原纤维Fib-Lys(COOH)NH2的合成
[00212]向Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维(113mg)的甲醇(4ml) 中加入氢氧化钠(1N，4ml)，反应混合物搅拌过夜。用水和甲醇广泛 洗涤产物Nα-CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维，真空干燥该原纤维。向Nα- CBZ-L-赖氨酸苄酯原纤维(50mg)的乙腈(4ml)混悬液中加入三甲基硅 烷碘(1ml).混合物在40℃下搅拌3小时。用水、甲醇、0.5N氢氧 化钠、乙腈和二氯甲烷广泛洗涤最终的双功能原纤维。氨基酸分析表 明每g原纤维含0.3μmols赖氨酸。
[00213]使用丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，通过与上述方法类似的方 法制备羟基和羧基(或氨基)双功能原纤维.用半胱氨酸可以制备硫 醇化和羧基(或氨基)双功能原纤维.用天冬氨酸和谷氨酸可以制备 羧基和氨基的双功能原纤维。
官能化纳米管的用途
[00214]由于其较高的孔隙率，化学和热稳定性以及较高的表面 积，官能化的石墨纳米管可以在许多生物技术应用中作为固体载体。 已经发现它们适应苛刻的化学和热处理，非常适应于化学官能化.
[00215]例如，酶可以共价固定于修饰的纳米管上，同时保留了 其生物活性。此外，纳米管也适合在生物分子分离中用作亲和色谱的 载体。例如，在多步骤地合成中在纳米管上制备了酶抑制剂，使得这 些固定的抑制剂可以与大分子接近，在蛋白质和修饰的原纤维之间发 生可逆的特异性生物识别.
[00216]纳米管表面的疏水性不足以通过吸附固定高密度的蛋白 质。为了增加纳米管表面的疏水性和把疏水环境从平面膨胀成三维， 将不同长度的烷基链结合到纳米管表面.通过吸附固定在烷基纳米管 上的蛋白质包括胰蛋白酶、碱性磷酸酶、脂肪酶和卵白素.这些固定 的蛋白质的酶活性与游离酶的活性相当，这可以通过在水溶液中对底 物水解的催化效力来证明。
[00217]此外，烷基链的末端苯基加入到烷基纳米管而形成的苯 基-烷基纳米管也已经制备了出来。该修饰通过π-π作用中引入了与蛋 白质的氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸相互作用的芳基结构。在苯 基-烷基纳米管上碱性磷酸酶和脂肪酶的吸附于C8-烷基纳米管上的吸 附相当。
[00218]也已经发现，官能化的原纤维可以用作蛋白质合成的固 体载体。
1.用于酶的作为固体载体的官能化纳米管
实施例41
通过吸附的酶固定
烷基原纤维的制备
[00219]制备烷基原纤维，包括将包含约0.007mmoles的-COOH (10mg原纤维 x 0.7 mmoles-COOH/mg的原纤维＝0.007 mmoles)的 10mg羧基原纤维，与0.14mmoles的烷基胺的1.5ml DMF(N，N-二 甲基酰胺)溶液，用0.14 mmoles的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺)和0.14 mmoles的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)反应。化学 反应如下：
原纤维-COOH+NH2(CH2)nCH2R(R＝H或OH)------------->
原纤维-CONH(CH2)nCH2R
用该方法制备包含不同长度烷基链(n＝5，7，9，17，当n＝5时， R＝OH)的数种不同的烷基原县委。反应后在环境温度下搅拌过夜，用 3 x 25ml CH2Cl2、3 x 25ml MeOH、和3 x 25ml dH2O严格洗涤原纤 维。对该原纤维中的氮含量进行元素分析表明反应的收率是65- 100％。
酶的吸附
[00220]通过吸附将脂肪酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酶和卵白素固定 于该实施例的烷基原纤维上。在室温下混合烷基原纤维和酶3-4个小 时，然后用5mM磷酸钠(pH7.1)洗涤2到4次。碱性磷酸酶固定在 C8-原纤维和C6OH-原纤维上；胰蛋白酶在C6、C8、和C18-原纤维上， 脂肪酶在C6OH-、C8-、C10-和C18-原纤维上，卵白素在C18-原纤维上。 结果见下表。
[00221]发现固定的酶的动力学性质与游离酶相当，结果见下图：
酶 Km(M) Kcat(s-1) Kcat/Km(M-1s-1) 脂肪酶 40 x 10-6 0.040 0.99 x 103 胰蛋白酶 36 x 10-6 0.048 1.34 x 103 碱性磷酸酶 1.2 x 10-3 4.8 4.17 x 103 卵白素 7.9 x 10-3 19.1 2.43 x 103
底物：脂肪酶 1，2-O-二月桂基-rac-甘油-3-戊二酸resorufin酯
胰蛋白酶 N-苯甲酰基-L-精氨酸-对硝基苯胺
实施例42
通过原纤维-脂肪酶催化的纸化作用(丁酸乙酯的合成)
[00222]根据实施例41的方法将脂肪酶固定在C8-烷基原纤维 上。首先用二噁烷洗涤脂肪酶原纤维，然后用二噁烷和己烷的混合物 洗涤，最后用己烷洗涤，以将原纤维分散在己烷中。为合成丁酸乙酯 (一种食品添加剂，提供菠萝-香蕉味)，在含6.2μm原纤维-固定的 脂肪酶的己烷中将乙醇(0.4M)和丁酸(0.25M)混合。室温下搅拌反应 混合物，在7小时收率是60％，这可以通过使用已确认的方法测定反 应混合物种的乙醇浓度来确定。反应和结果如附图8所示。
实施例43
在苯基-烷基原纤维上固定碱性磷酸酶
苯基-烷基原纤维的合成
[00223]原纤维通过两个不同的反应制备苯基-烷基原纤维。反应 1将20mg羧基原纤维(包含约0.014mmoles的-COOH)和0.28 mmoles的4-苯丁胺，0.28mmoles EDC和0.28mmoles DMAP(4-二 甲基氨基吡啶)在1.5ml的DMF(N，N-二甲基酰胺)中混合。反应2 将20mg羧基原纤维和0.28mmoles的6-苯基-1-己醇，0.28mmoles DCC(1，3-二环己基碳二亚胺)和0.28 mmoles DMAP在1.5ml的 DMF中混合。反应在室温下进行，搅拌过夜。然后用3 x 25ml CH2Cl2、 3 x 25ml MeOH、和3 x 25ml dH2O严格冲洗该原纤维。
固定的碱性磷酸酶的制备
[00224l0.5mg的苯基-烷基原纤维悬浮于400μl的0.05M Tris (pH8.6)中并声处理20分钟。向这些原纤维中加入150μl的碱性磷 酸酶溶液(1.67mg/ml在5mM磷酸钠缓冲液中，pH7.0)，然后室温 下将混合物旋转2小时，在4℃下贮存过夜。然后用600μl的5mM磷 酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤原纤维2次，并悬浮于200μl的相同缓冲液 中。
通过测定催化活性定量特异性固定的碱性磷酸酶
[00225]碱性磷酸酶与底物磷酸对硝基苯酯反应，释放出在405nm 处吸收光，消光系数18，200M-1cm-1的有色化合物。该反应的分析缓 冲液条件是10mM Tris、1mM MgCl2和0.1mM ZnCl2，pH＝8.4。 反应在1ml试管中进行，包括将5μl的磷酸对硝基苯酯溶液(0.5M在 33％ DMSO在分析缓冲液中)和13μg的碱性磷酸酶原纤维在1ml 的分析缓冲液中混合。通过在0分钟以上的时间扫描检测405nm处 的吸光度增加。然后用消光系数18，200M-1cm-1从开始时的斜度计算 酶活性(μM/分钟)。
[00226]对于反应1的吸附在苯基原纤维上的碱性磷酸酶，活性 是每13μg原纤维6.95μM/分钟。对于反应2的吸附在苯基原纤维上 的碱性磷酸酶，活性是每13μg原纤维2.58μM/分钟。这些结果转变 为每g原纤维0.63μmoles(或54mg)和0.23μmoles(或20mg)活性 碱性磷酸酶，转变方法是除以已知浓度的碱性磷酸酶溶液，已知浓度 的碱性磷酸酶溶液在相同分析条件下测定为每1μM碱性磷酸酶 879.8μM/分钟。
实施例44
在苯基烷基原纤维上固定脂肪酶
脂肪酶修饰的原纤维的制备
[00227]将0.5mg的苯基-烷基原纤维悬浮于50μl的5niM磷酸 钠缓冲液(pH7.1)中，声处理20分钟。向这些原纤维中加入350μl 的脂肪酶溶液(0.2mM在5mM磷酸钠缓冲液中，pH7.1)，室温下将 混合物旋转5小时，在4℃下贮存过夜。然后用600μl的5mM磷 酸钠缓冲液(pH7.1)洗涤原纤维3次，并悬浮于200μl的相同缓冲液 中。
通过测定催化活性定量特异性固定的脂肪酶
[00228]脂肪酶可以与底物1，2-o-二月桂基-rac-甘油-3-戊二酸- resorufin酯(Boehringer Mannheim，1179943)反应，产生在572nm 处吸收光，消光系数60,000M-1cm-1的有色化合物。该反应的分析缓 冲液条件是0.1M KH2PO4，pH＝6.8反应在1ml试管中进行，包括 将5μl的底物母液(7.6mM在50％二噁烷在Thesit中)和13μg的 碱性磷酸酶原纤维在1ml的分析缓冲液中混合。通过在10分钟以上 的时间扫描检测572nm处的吸光度增加。然后用消光系数60， 000M-1cm-1从开始时的斜度计算酶活性(μM/分钟).
[00229]对于实施例43的反应1中吸附在苯基烷基原纤维上的脂 肪酶，活性是每13μg原纤维0.078μM/分钟.对于实施例43的反应 2中吸附在苯基烷基原纤维上的脂肪酶，活性是每13μg原纤维0.054 μM/分钟。这些结果转变为每g原纤维4.7μmoles(或564mg)和3.3 μmoles(或396mg)活性碱性磷酸酶，转变方法是除以已知浓度的碱 性磷酸酶溶液，已知浓度的碱性磷酸酶溶液在相同分析条件下测定为 每1μM脂肪酶1.3μM/分钟。
实施例45
在氨基烷基-修饰的原纤维上辣根过氧化物酶(HRP)的固定 羧酸-官能化的原纤维(羧基原纤维)的制备
[00230]通过药铲混合，将10.0g石墨原纤维样品在450mL浓 H2SO4中浆化，然后转移到具有进口/出口和顶搅拌器的反应烧瓶中。 在搅拌和缓慢的氩气流中，在室温下在24小时的时间里按份加入8.68 g的NaClO3。在反应的整个过程中产生的氯蒸汽从反应中排出到 NaOH trap水溶液中。在运行结束后，将原纤维浆体倾倒到碎冰中并 真空过滤。然后把滤饼转移到Soxhlet圆筒滤纸上，在Soxhlet提取器 中用去离子水洗涤，每个几小时换新鲜的水.继续洗涤直至当加入新 鲜的去离子水时，原纤维的样品不会改变水的pH.然后过滤回收羧 酸盐原纤维，在100℃和5”真空中干燥过夜。得到10.0g。
HRP-固定的原纤维的制备
[00231]取用实施例27的方法由1，6-二氨基己烷制备的氨基原 纤维(1.2mg)加入到共轭缓冲液(0.1M NaHCO3，0.9％ NaCl，pH9.5) 中，声处理该混悬液20分钟。然后在Eppendorf微量离心管中用共 轭缓冲液将该原纤维洗涤2次，并悬浮于430μL共轭缓冲液中.取 50-μL等份的该混悬液(0.14mg原纤维)与溶解于50μL去离子水中 的4.0mg活化的HRP(Pierce，Rockford，IL)混合，所得到的混悬液 在4℃旋转过夜。HRP-共轭的原纤维在微量离心管中用下列溶液的 组合广泛洗涤：共轭缓冲液，洗涤缓冲液(20mM KH2PO4，0.45％ NaCl，pH6.2)，包含0.03-0.1％ TritonX-100的洗涤缓冲液和包含50％ 乙二醇的洗涤缓冲液。作为对照，用活化的HRP与纯(未衍生化) 原纤维进行相同的操作，证明了HRP和氨基原纤维的结合的确是特 异性共价键。
通过测定催化活性定量特异性固定的HRP
[00232]广泛洗涤除去大部分的非特异性结合的酶。通过底物翻 转用H2O2和显色底物2，2’-连氮-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)、二铵盐 (ABTS)来定量固定的活化HRP。用100μM H2O2和30μM ABTS作 为底物在414nm处分光光度检测HRP的酶活性。在这些初步研究中， 与氨基原纤维连接的酶的总量是0.0230μmol HRP/g原纤维。作为比 较地，对照(纯原纤维)非特异性结合0.0048μmol HRP/g原纤维。 两个相减，共价(特异性结合)的HRP的量是0.0182μmol/g原纤维。
实施例46
亲和色谱法分离在具有固定的酶抑制剂的原纤维上的碱性磷酸酶(AP) 和β-半乳糖苷酶(βG)
碱性磷酸酶抑制剂原纤维的制备
[00233]根据Brenna等人(1975)，Biochem J.，151：291-296的方 法制备AP-抑制剂。羧酸盐原纤维用于如上述实施例50所述制备NHS 酯原纤维.取NHS酯原纤维(114mg)悬浮于4mL丙酮和加入10倍 当量的(根据每g原纤维0.7meq NHS酯估算)酪胺。加入干燥的三 乙胺(10倍当量)，在室温下将混合物搅拌3小时。真空下在scintered 玻璃漏斗中将该酪胺基原纤维先用丙酮洗涤，然后用去离子水广泛洗 涤。
[00234]取4-(对氨苯基氮)-苯胂酸(66mg)悬浮于4mL的1N HCl中。悬浮液冷却至4℃并与0.36mL的0.5M NaNO2缓慢混合。 15分钟后，向酪胺基原纤维中加入砷酸/NaNO2混合物，将其悬浮于 10mL的0.1M NaCO3(pH10.0)中。反应混合物(pH≈10)在4℃搅 拌过夜.然后用0.1M Na2CO3(pH10.0)、8M胍HCl、25mMNaOH、 和水连续洗涤来处理该原纤维，直至流出液变澄清。通过Galbraith Laboratories(Knoxville，TN)对AP-抑制剂的原纤维中的砷进行原子 吸收分析。通过原子吸收分析，发现包含具有1个砷原子的侧链的AP- 抑制剂的原纤维具有0.4％的总砷含量。这表明，大约10％的已评价 的初始COOH基在多步骤合成中转变成了AP-抑制剂。根据原纤维 的表面积，这意味着每表面积具有1个抑制剂分子(酶结合位 点)。
β-半乳糖苷酶-抑制剂原纤维的制备
[00235]根据Ullman，(1984)Gene，29：27-31的方法制备对氨基 -苯基-β-D-硫代半乳糖苷(TPEG)衍生的原纤维。向在0.2mL去离 子水的8mg的羧酸盐原纤维中加入2.24mg TPEG.用0.1M HCl调 节混悬液的pH值至4.0，加入15mg EDAC。混合物在pH4.0和室 温下搅拌3小时。在Eppendorf微量离心管中快速离心分离来停止反 应，除去液体。通过在去离子水中反复再悬浮和离心将β-半乳糖苷酶 -抑制剂原纤维洗涤5次.
亲和分离
[00236]碱性磷酸酶(AP)(来自大肠杆菌，III型；Ullman，(1984) Gene，29：27-31)和β-半乳糖苷酶(BG)(来自大肠杆菌；Calbiochem， La Jolla，CA)在Eppendorf微量离心管中与AP-抑制剂原纤维或βG- 抑制剂原纤维分批发酵而分离。为进行亲和分离，取包含AP(一般约 10个单位)和BG(一般约280个单位)的1.0mL负载缓冲液(20mM Tris，10mM MgCl，1.6M NaCl，10mM半胱氨酸，pH7.4)的溶 液加入到0.8-1.0mg的AP-或BG-抑制剂原纤维中。轻微涡旋所得到 的混悬液，然后在室温下旋转2小时。在酶结合后，通过在台式离心 机中简单离心来沉淀该原纤维，回收包含未结合酶的液相，保存用于 酶分析。通过反复加入缓冲液、轻微涡旋、旋转15分钟、简单离心 和用巴斯德吸管回收溶剂来用负载缓冲液进行洗涤(7 x 1.0mL).在 洗涤7次后，用适当的洗脱缓冲液对βG-抑制剂原纤维(100mM硼 砂，10mM半胱氨酸，10mM半胱氨酸，pH10.0)或AP-抑制剂原 纤维(40mM NaHPO4，10mM Tris，1.0mM MgCl2，0.1mM ZnCl2， pH8.4)重复进行相同的操作。
[00237]分析所有部分(未结合酶、洗涤物、和洗脱物)中的AP 和βG活性。通过在410nm处用分光光度检测500μM磷酸对硝基苯 酯(PNPP)的水解来确定碱性磷酸酶的活性(Δε＝18,000M-1cm-1)。在 pH8.4的10mM Tris，1.0mM MgCl2，和0.1mM ZnCl2中进行碱性 磷酸酶活性的测定.通过分光光度检测酶水解2-硝基-半乳-β-D-吡喃 糖苷(ONPG)的能力来分析β-半乳糖苷酶。5.0mM ONPG的β-半乳糖 苷酶-催化水解的初始速率在405nm处在10mM Tris，10mM MgCl2， 1.6M NaCl，10mM半胱氨酸，pH7.4中进行(Δε＝3500M-1cm-1) 中测定。
[00238]对于AP-抑制剂和βG-抑制剂原纤维，加入AP和βG的 混合物。为了促进特异性结合容量的测定，加入的酶的浓度是相对于 固定的抑制剂浓度极大过量的。对于AP-抑制剂原纤维，结合了0.550 μmol AP/g原纤维(相反地，非特异性结合是0.020Amol βG/g原纤 维).对于βG-抑制剂原纤维，确定其容量是0.093μmol βG/g原纤维 (相反地，非特异性结合是0.012μmol AP/g原纤维)。亲和色谱试验的 结果显示于附图9和10中。AP-抑制剂原纤维丝毫不与βG结合， 但与AP结合，当向缓冲液中加入40mM竞争性的抑制剂磷酸盐时， 其特异性洗脱(附图9).βG衍生的原纤维不和较大量的AP结合，但 与βG结合，当pH升高以弱化酶-抑制剂的结合能力时，其特异性洗 脱。这些结果表明抑制剂成功地与原纤维共价结合，固定的抑制剂与 大分子接近，抑制剂对于特异性酶结合是有用的，以及当特异性洗脱 时，酶仍保留了活性。在附图10中，继续从βG-抑制剂原纤维中滤出 了βG。这可能是天然的较弱的酶-抑制剂亲和力的结果，而不是原纤 维的缺点，因为，在附图9的AP-抑制剂原纤维中没有观察到相同的 现象。
2.官能化碳纳米管作为抗体的固体载体
[00239]已经发现，抗体可以固定于官能化的纳米管上，这些抗体 纳米管对于许多应用具有独特的优点，这是因为他们具有较高的每重 量表面积、导电性和化学和物理稳定性。例如抗体纳米管可以用作分 子分离的亲和试剂。抗体纳米滚也可以用于分析的应用中，包括诊断 免疫测定，例如基于ECL的免疫测定。
[00240]抗体可以通过共价结合或非共价吸附固定。共价固定可以 通过不同的方法来完成：包括抗体糖类基团的还原活化、羧酸盐原纤 维(见实施例27，上文)的NHS酯活化，和用还原或马来酰亚胺修饰 的抗体与硫醇化或马来酰亚胺化的原纤维反应(见实施例23和25， 上文)。
[00241]抗体和纳米管结合的最佳方法将取决于它们的应用。对于 分离的应用，优选的方法可以是非共价结合，因为蛋白质结合的容量 对于此方法是最高的。对于包括ECL的方法，其中原纤维的导电性 是重要的，优选是共价方法(烷基附加物是电的弱导体，可以期望使 原纤维绝缘).还原氨基化是共价结合抗体到原纤维上的最好方法， 因为通过该方法，抗体正确地定向以使得它们的结合位点指向外(远 离原纤维)。
3.向官能化的纳米管上添加NAD+
[00242]已经发现，辅助因子例如NAD+可以加入并用作蛋白质的 生物特异性亲和色谱中的固体载体，其中蛋白质与酶辅助因子结合。 例如，NAD+原纤维已经用作纯化脱氢酶的固体载体.使用原纤维的 主要特定是它们较大量的可及表面积。较高表面积的亲和基质是需要 的，因为它们有较高的潜在容量。原纤维可以松散分散或固定于柱中 或物质中。
实施例47
在NAD+原纤维上脱氢酶的亲和色谱分离
NAD+原纤维的制备
[00243]根据实施例14和15氧化原纤维，以引入羧基。向原纤 维(31mg)的碳酸氢钠溶液(3ml，0.2M，pH8.6)的混悬液中加入 N6-[氨己基]氨甲酰甲基)-辅酶I的锂盐溶液(25mg来自Sigma，在5 ml碳酸氢钠溶液中)。反应混合物在室温下搅拌过夜。产物原纤维用 水、N，N-二甲基酰胺和甲醇广泛洗涤。元素分析数据表明，原纤维 包含，通过氮分析每g产物130mmols的NAD分子磷分析每g原纤 维147mmols的NAD分子.其他具有以氨基为末端的连接子的NAD+ 类似物可以用于制备NAD+原纤维。
亲和分离
[00244]在40℃下，将NAD+固定的原纤维(0.26mg)和纯原纤 维(0.37mg)与0.1％聚乙二醇(PEG，MW 1000)的磷酸钠(1ml， 0.1M，t pH7.1)溶液声处理30分钟，然后在40℃培养30分钟。离 心分离原纤维混悬液，除去上清液。在4℃下，将原纤维与L-乳酸脱 氢酶(LDH)的0.1％PEG(1000)磷酸钠缓冲液(250μl，LDH溶液和 0.1％ PEG缓冲液的比例是1:1)的混合物培养90分钟。然后将混合 物在室温下平衡30分钟。在原纤维与LDH培养后，用0.1％ PEG(1000) 的磷酸钠缓冲液(5 X 1000μl)洗涤原纤维，每次洗涤在旋转下进行15 分钟。用5mM NADH的0.1％ PEG(1000)磷酸钠缓冲液(5mM 3X1000μl)的溶液洗脱LDH.在每次洗脱物洗涤期间，原纤维旋转15 分钟。在洗脱液中LDH的活性的测定包括，测定在还原丙酮酸盐期 间测定340nm处吸光度的改变。该分析混合液包含0.1％ PEG(1000) 的磷酸钠缓冲液(980μl)、丙酮酸盐(3.3μl，100mM母液)，和每个 洗脱部分(16.7μl).镁反应如下所示：
[00245]结果表明，NAD+固定的原纤维上的LDH的容量是每g 原纤维484nmols，在纯原纤维(对照)上的LDH的容量是每g原纤 维3.68nmols。LDH的非特异性结合是5.6％。
官能化纳米管作为蛋白质合成的固体载体
实施例48
官能化的原纤维作为固体载体在肽合成中的应用
[00246]向二氯甲烷(20ml)中的氨基原纤维(400mg)和4-(羟甲 基)-苯氧基乙酸混悬液(255mg，1.4mmol)的混合物中加入1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC，268mg，1.40mmol)和1-羟基 苯并三唑水合物(HOBT，189mg，1.4mmol).反应混合物在氮气下 在室温下搅拌过夜.用二氯甲烷、甲醇和水广泛洗涤产物原纤维.然 后真空干燥得到原纤维。向原纤维的N，N-二甲基酰胺(DMF，2ml) 和二氯甲烷(8ml)的混悬液中加入N-(9-fluorenyl甲氧羰基)-O-丁基 -L-丝氨酸(215mg，0.56mmol)、1，3-二环己基碳二亚胺(DCC， 115mg，0.56mmol)和4二甲基氨基吡啶(DMAP，3.4mg，0.028 mmol).反应混合物在室温下搅拌过夜，用20％吡啶的DMF溶液(5 X 40ml，每次浸湿1分钟)处理产物原纤维。然后用DMF、水、氢氧化 钠(1N)和二氯甲烷广泛洗涤产物原纤维.真空干燥产物Fib-柄- Ser(O+)-COOH(水合茚三酮试验呈阳性).对于二肽的合成，使用相 同的方法加入精氨酸.Fib-柄-Ser(O+)-Arg(Nε-2，2，5，7，8-五甲基 chrornan-6-磺酰基)的氨基酸分析数据表明，它包含6.5μmol/g原纤 维和7.6μmol精氨酸/g原纤维。通过相同方法可以制备任何其他的 肽。
5.生物素酰化的原纤维和生物素酰化的烷基原纤维
[00247]已经发现，可以通过生物素酰化或烷基化和生物素酰化来 官能化原纤维的表面.然后包含这些修饰物的原纤维可以结合任意的 抗生蛋白链菌素共轭的物质例如抗生蛋白链菌素珠和抗生蛋白链菌素 酶。
[00248]由于其较高的表面积，原纤维作为固体载体提供了很大的 益处。可以产生强烈磁性的珠在分离分析中是极其有用的。所述的生 物素酰化的原纤维兼具原纤维和珠的特点.生物素酰化的烷基原纤维 是相同概念的扩展，但也显示了烷基原纤维的吸附性质.
[00249]抗生蛋白链菌素-和生物素-包衣的原纤维可以用于诊断 学，可以作为捕获剂用于分析例如电化学发光分析。
[00250]本发明的新的特征是在一种原纤维上的两种固体载体的组 合，以制成双功能的原纤维.此外，所公开的方法增加了珠的表面积 和放大了原纤维的磁化。
实施例49
生物素酰化的原纤维的制备
[00251]制备生物素酰化的原纤维，包括将如实施例16和19所 述制备的2.4mg的氨基原纤维与9mg的NHS酯长链生物素在pH 8.15的缓冲液0.2M NaHCO3中混合。在室温下旋转混合物4小时， 用相同的缓冲液洗涤2次。
实施例50
生物素酰化的烷基原纤维的制备
[00252]通过两步反应来制备生物素酰化的烷基原纤维。首先， 将4.25mg的双功能原纤维(包含氨基和羧基)和25mg的NHS酯长 链生物素混合。洗涤原纤维并真空干燥.
[00253]第二个反应的进行，包括将4mg的生物素酰化的双功 能原纤维和11mg的EDC(1-乙基-3，3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)，7.5 mg的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)和10μl的NH2(CH2)7CH3的0.5ml DMF溶液混合。该混合物在室温下搅拌过夜。最后用CH2Cl2、MeOH、 和dH2O洗涤最终的生物素酰化的烷基原纤维。
实施例51
生物素酰化的原纤维在分析中作为固体载体
[00254]生物素酰化的原纤维可以用于分析中，该分析包括需要 抗生蛋白链菌素-生物素或卵白素-生物素相互作用的方式。生物素酰 化的原纤维可以例如进一步用抗生蛋白链菌素衍生化。与原纤维共价 结合的生物素(见实施例50)可以形成与抗生蛋白链菌素强烈非共价结 合地相互作用。因为抗生蛋白链菌素是具有4个相同结合位点的四聚 蹄蛋白质，因此与生物素酰化的原纤维结合的抗生蛋白链菌素几乎一 定具有其它生物素酰化剂可以结合的空闲的结合位点.因此，生物素 酰化的原纤维将会转换成抗生蛋白链菌素-包衣的原纤维。
[00255]有很多的分析试验可以与这些原纤维-生物素-抗生蛋白链 菌素(FBS)载体进行.例如，可以在FBS载体上捕获生物素酰化的 抗分析物抗体(在该抗体结合到分析物之前或之后).很好地完成了使 用生物素酰化的抗分析物抗体的分析.这些分析包括竞争性分析，其 中感兴趣的分析物和标记的分析物竞争性地与抗分析物抗体结合。游 离(未结合)的分析物和游离(未结合)的标记分析物可以从原纤维 固定的抗体中洗出。洗涤步骤取决于通过普通实践包括离心、过滤或 通过吸引到磁石上从固相中物理分离.
[00256]除了竞争性分析外，夹层性免疫测定也可以在PBS载体 上进行。夹层免疫分析在诊断学领域是公知的.该分析包括两种抗体 同时结合的分析物；通过例如用生物素标记而在固体表面捕获的第一” 主要”抗体，和不被固体载体捕获但用报道基标记的”次级”抗体.这 种夹层分析可以用作为固体捕获载体的原纤维来进行，其中如上述段 落所述捕获原县委.因此，在这种分析中，原纤维与生物素共价结合， 其与抗生蛋白链菌素结合，其依次与生物素酰化的主要抗体结合，其 与分析物结合(如果存在)，其余标记的次级抗体结合.
[00257]类似地，DNA探针分析可以用FBS载体来进行。生物 素酰化的单键DNA可以与FBS载体结合，竞争性杂交可以发生在补 充的单键分析物DNA分子和补充的标记寡核苷酸之间。
[00258]其他类型的生物素酰化的原纤维、生物素酰化的烷基化 原纤维可以用于免疫分析和DNA分析.如实施例51所述，修饰双功 能原纤维，可以包括生物素与一种类型的官能团和烷基链与其他类型 的官能团共价结合。所得到的烷基化、生物素酰化的原纤维可以用 于与抗生蛋白链菌素或卵白素(经生物素)的特异性结合.也可以用于 蛋白质的吸附(经烷基链)。
[00259]烷基原纤维可以用于与其他固体载体的结合，例如抗生 蛋白链菌素-包衣的磁珠。One advantage of这些珠上的原纤维的一个 优点是，它们具有高得多的表面积(每单位重量)。因此，如果原纤维 可以与磁珠的外表面结合，这将会引人注目地改善表面积，以慈改善 珠的结合容量。可以推断，烷基化、生物素酰化的原纤维可以与c 抗生蛋白链菌素-包衣的珠结合，产生高亲和力的抗生蛋白链菌素(珠)- 生物素(原纤维)相互作用，因此原纤维包衣的珠具有极高的表面积. 因为烷基原纤维可以通过吸附与蛋白质结合，原纤维包衣的珠可以进 一步用吸附的蛋白质包括抗生蛋白链菌素和抗体来衍生化。如上所 述，抗生蛋白链菌素或抗体包衣的原纤维可以用于免疫分析和DNA 分析。因此原纤维包衣的珠可以通过引人注目地增加表面积来改善珠 的性质，以使得在给定的分析中只有很少的珠具有相同的结果。
6.3-维结构
[00260]与未氧化的原纤维相比，氧化的原纤维更易于分散在水 性介质中。具有中和大恐(孔>2nm)稳定的，多空的三维结构作为 催化剂或色谱载体是非常有用的。由于原纤维可以分散在个性化的基 质中，通过交联而稳定化的良好分散的样品使得人们去构造这样的载 体。官能化的原纤维对于该应用是理想的，因为它们以与分散在水性 介质或极性介质中，官能性提供了交联点.此外，官能性提供了负载 催化或色谱位点的点。最后结果是坚硬的三维结构，其具有受官能化 位点影响的总表面积，在官能化位置上支持活性剂.
[00261]这些载体在催化中的典型应用包括它们作为高度多孔载体 在通过浸透装设的金属载体，例如贵金属加氢催化剂中的应用.此外， 通过系住载体，经与结构的非常高的孔隙率的官能性组合系住分子的 催化剂的能力允许我们以不同的方式进行均相反映.系住的分子催化 剂基本上在连续的液相中是摇摆的，与均质反应堆类似，其中它能使 得在均质反应中进行的选择和速率的应用中具有好处。但是，系住的 固体载体使得易于分离和活性恢复，在许多情况下，是非常昂贵的催 化剂。
[00262]这些稳定的、坚硬的结构也允许进行迄今为止非常困难的 反应，例如不对称合成或通过适当的对应体催化剂或选择性底物与载 体结合的亲和色谱。通过金属-Pc或金属卟啉络合的衍生化也允许用 于回收与金属离子结合的配体，以及通过次级衍生化与配体结合的任 何分子。例如，当官能化的原纤维的三维结构是电极或电极的一部分 时，官能化导致了Co(II)Pc的吸附，在烟酸存在下将Co(II)电化氧化 成Co(III)将产生稳定的Co(HI)-吡啶基络合物，其含有羧酸作为侧 基。结合适当的抗原、抗体、催化抗原、或其他位点特异性的捕获剂 将允许选择性地分离用其他方法非常难以分离的分子(亲和色谱法)。 在洗涤电极除去闭塞物质后，包含靶分子的Co(III)络合物可以电化学 还原而回收不稳定的Co(II)络合物。然后在包含靶分子的Co(II)上的 配体可以通过不稳定的Co(II)配体的质量作用取代而回收，因此，影 响了分子的分离和回收，其中该分子用其他方法(例如手性药物)来 完成的话将非常困难和昂贵
[00263]以前，人们相信在官能化谈原纤维物质中的孔太小，而不 能有足够的流动，因此，将不能用于流动通过电极.使用微粒碳或其 他基于碳的物质(例如网状玻璃碳(RVC))作为电极物质也有相关的 问题。例如，多孔的电极物质不能在原处形成，填充得太紧密和形成 孔隙或通道，这使得改变溶剂和流动条件时会发生平面的不稳定性， 而且不能形成非常薄的电极.在流动池中使用官能化的碳原纤维作为 电极解决了这些问题。
[00264]在流动池中用作电极的碳原纤维可以通过电活性剂的表 面处理来修饰。该原纤维也可以用非电活性物质来修饰，该非电活性 物质发挥催化或电催化功能或发挥抑制不希望的反应或抑制从流动中 吸附物质的作用。
[00265]这些流动通过电极在分离技术中是有用的，例如电色谱、 电化学调节亲和色谱、电合成或电化学调节离子交换色谱.它们也可 以用于分离和/或分析陷入在碳原纤维物质上的物质的诊断装置中。
[00266]组合物质包括官能化的碳原纤维，也可以使用其他纤维或 颗粒。这些纤维或颗粒可以加入到混悬液中以改变碳原纤维物质最终 的孔隙率或导电率。
实施例52
酞菁铁官能化的原纤维在流动池中作为电极的应用
[00267]通过吸附铁酞菁-双-吡啶(FePc-2Py)(Aldrich 41，016-0) 修饰石墨原纤维.取0.403g的原纤维和0.130g的FePc-2Py加入到 150mis的纯净EtOH中，用450 Watt Branson探针超声破碎器声处 理5分钟。所得到的浆体在0.45μm MSI尼龙滤器上在47mm微孔 滤膜真空过滤器的管中过滤，用水冲洗，在35℃真空干燥过夜.最 终的重量是0.528g，表明基本上都吸附了。对滤液进行的分光光度分 析来计算剩余的FeP-2Py。
[00268]取5mg FePc-2Py修饰的原纤维在声处理下分散在10mis 的DI水中。将分散液置于一块具有25mm膜过滤管的200目的不锈 钢(SS)针织筛上并在室温下干燥。用弓形打孔器切下直径0.5英寸的SS 筛支持的原纤维物质.
[00269]电化学流动池是用13mm、塑料、Swinney型的膜滤纸夹 制成的，包括将直径13mm的盘状金制筛(400目，Ladd Industries) 置于膜载体的顶部，用铂线与筛发生电性接触，用热收缩管 绝缘，该热收缩管进料通过滤纸夹的壁，以作为三个电极恒电位器回 路的工作电极进行外部连接.用最少量的环氧在外部边缘固定金制 筛。将一条金箔改变为环状，并放置在底部，滤纸夹的下游部分并与 绝缘的Pt线头相连，用作三个电极恒电位器回路的计数电极来连接. 在1M HCl中电化学氧化的直径0.5mm的环状银线用绝缘头置于滤纸 夹的顶部，用作参照电极来连接。
[00270]将直径0.5英寸的FePc-2Py修饰的CN盘置于流动池中， 然后流动池与EG&G PAR 273恒电位器的适当接头相连。流动池与 用在pH7.0的0.1M磷酸氢二钾缓冲液中的0.1M KCl过滤的Sage注 射泵相连.在没有流动(静止)和流动(0.4mls/分钟)下，以20mv/sec 的电位扫描速率记录循环伏安图(CVs)(见附图6)。Cvs在流动和不 流动下基本相等，显示两种持久地、可逆氧化和还原波与表面限制的 FePc-2Py相一致。在流体流动条件下还原峰的持久性表明，FePc-2Py 与碳原纤维强烈结合。使用酞菁铁修饰的原纤维的功能与流动通过电 极物质相同。
[00271]三维结构的其他例子是原纤维-陶瓷的复合物.
实施例53`
氧化铝-原纤维复合物的合成(185-02-01)
[00272]用and U/S粉碎机将1g的硝酸氧化的原纤维(185-01-02) 高度分散在100cc DI水中.加热原纤维浆体至90℃并缓慢加入溶 解在20cc丙醇中的0.04mol三丁氧铝.继续回流4小时，然后除去 冷凝器以排除醇。30分钟后，将冷凝器放回，浆体在100℃回流过夜。 获得具有均匀外观的黑色溶胶。将溶胶冷却至室温，1星期后，形成 具有平滑表面的黑色凝胶。在空气中将该凝胶在300℃加热12小时.
[00273]通过SEM来检查氧化铝-原纤维复合物。裂纹面的纤维 照片表明原纤维在凝胶中均匀分散.
实施例54
硅石-原纤维复合物(173-85-03)的制备
[00274]用超声处理将2g的硝酸氧化的原纤维原纤维(173-83- 03)高度分散在200cc乙醇中。在室温下向该浆体中缓慢加入溶解在 50cc乙醇中的0.1mol正硅酸乙酯，然后加入3cc浓HCl.将混合 物加热至85℃并在该温度下维持，直至体积减小至100cc.冷却该 混合物，放置，直至其形成黑色固体凝胶。在空气中在300℃加热该 凝胶。
[00275]通过SEM来检查硅石-原纤维复合物。裂纹面的纤维照 片表明原纤维在凝胶中均匀分散。
[00276]用其他的陶瓷类物质，例如锆、钛、稀土元素氧化物和 三氧化物可以类似地制备，也可以制备三氧化物.
7.在聚合物珠上掺入石墨纳米管
[00277]聚合物珠，特别是包含Fe3O4核的磁性聚合物珠，例如 由Dynal和其他人制备的那些，在诊断学中有很多的应用。但是，与 纳米管有效表面积相比，这些珠具有较小的表面积.官能化的原纤维 可以掺入到珠的表面，这就使得聚合物/原纤维复合物可以用作份礼或 分析应用(例如电化学发光分析，酶的固定化)中的固体载体。
实施例55
官能化的原纤维与官能化珠的结合
[00278]用0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.5将7.5mg的磁性甲苯基 磺酰-活化的Dynabeads M-450(30mg/ml)珠(Dynal，Oslo，Norway) 洗涤三次。然后向该珠中加入0.9ml的0.1M磷酸钠缓冲液，pH8.4， 然后加入0.1ml的胺原纤维。将混合物在室温下旋转16-24小时。
[00279]当在显微镜下观察时，原纤维表面上具有珠的原纤维团 是非常明显的
[00280]本领域技术人员将会明白，在前述实施例1-55中公开的 任何方法都可以用直径小于5纳米的单壁碳纳米管的例行试验来重 复，从而获得所需的官能化结果.
实施例56
证实亚甲兰的吸附
[00281]用6M HCl处理SWNT(University of Kentucky)72小 时出去所有的金属杂质。用酸洗涤的碳纳米管用声处理分散在DI水 中并过滤。重复冲洗4次至中性pH。
[00282]SWNT再悬浮于DI水中，用声处理分散。将2X连续 稀释液置于8PP离心管中。等量加入亚甲兰，，将管置于旋转器上搅 拌4小时。然后将管在离心机上旋转4分钟，得到沉积在管底部的 SWNT。含有高浓度SWNT的管具有澄清的滤液，具有最低SWNT 浓度的两个管颜色是类似的，以控制MB的溶解。具有中间浓度SWNT 的6个管显示了随着浓度的降低，蓝色增强。
证实酞菁铁吸附
将SWNT(University of Kentucky)用6M HCl处理72小时以除 去任何金属杂质。采用超声将酸洗涤的纳米管分散在DI水中，并且 过滤。将该操作重复4次来洗涤至中性pH。
在超声处理下将7mg Fe酞菁-双吡啶(FePc-2Py)用40ml EtOH 溶解。加入22mg SWNT，并且继续超声处理5分钟。让该溶液冷却， 并且反复超声处理。将热溶液过滤到0.45微米PVDF膜上以干燥， 然后用新鲜的EtOH洗涤。过滤至干.干重＝27mg.将5mg FePc-2Py 吸附到SWNT上。
将具有连接的SWNT/FePC的滤膜置于40ml DI水中，并且超声 处理以把SWNT从滤膜上抬起。将滤膜从悬浮液中取出，并且加入20 mg Whatman #42滤纸。在高功率下(40％占空度)超声2×5’以浆化 WH42纸来起SWNT粘合剂的作用。将悬浮的材料过滤到0.45微米 PVDF滤器上，并且用DI水洗涤3次。过滤至干。在热板@上于150℃ 干燥1小时。将干燥的SWNT/WH42垫作为完整垫-36mm直径， 约25微米厚-从膜上分离下来。测定的片电阻率是1500ohm/平方米 (square)。垫的最终重量是45mg；WH42组分的重量＝20mg；SWNT 的重量＝22mg；估计的吸附到SWNT表面上的FePc-2Py的重量是5 mg.
吸附到SWNT上的FePc-2Py的电化学
通过把垫的区段在400×400目SS筛网之间印刷以起电流收集器 的作用来形成电极。把SS筛网的一个边缘连接到插入玻璃吸移管内 的Cu丝上。用环氧化物将任何暴露的Cu绝缘。将电极在100℃加 热1小时以把环氧化物熟化5分钟。
通过循环伏安法对SS筛网计数器和Ag/AgCl参比电极来测定该 电极。电解质是等渗硼酸盐缓冲盐水。观察到了两个峰，一个是接近 -.-4，其被H2气流遮蔽。第二个峰集中在约+0.1V vs Ag/Ag/Cl。对 于集中在+0.1V vs Ag/AgCl的峰，峰电流随着扫描率是线性的，与表 面限制的电活性物质是一致的。循环伏安图迹线是可重复的，这表明 FePc-2PY被很牢固地限制在电极上，而不是损失到电解质中。
[00288]如上述说明书和实施例所示，本发明涉及种类广泛的官 能化的碳纳米管的形成及其用途。
[00289]所使用的术语和表达是作为说明书的术语使用，而不是 进行限制，而且也不打算使用超出任何作为其一部分所显示和所描述 的特征相同范围以外的术语或表达，应当意识到，各种可能的改变都 在本发明的范围内。
与相关申请的交叉参考
[0001]本申请是2004年4月30日提交的美国申请序列号[代理 人摘要号100647-3583]的后续部分申请，其100647-3583是现在已经 放弃的1997年3月6日提交的美国申请序列号08/812,856的后续， 而08/812,856是现在已经放弃的1996年3月6日提交的美国申请序 列号08/611,368的后续，08/611,368要求1996年9约25日提交的临 时申请号60/037,238的优先权.本申请也是2000年6月6日提交的 美国申请序列号09/594,673的后续部分申请，09/594,673是1994年12 月8日提交的美国申请号08/352,400、现在是U.S.6,203,814的一部分。 在此将上述申请的每篇内容都通过参考引入本文。
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