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病理或生理性病况的体外模型

阅读:432发布:2022-05-29

专利汇可以提供病理或生理性病况的体外模型专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 总体上涉及模拟体内病理或生理性病况的体外方法。所述方法包括将剪切 力 施加至涂铺于细胞培养容器内的表面上的细胞类型。还描述在这类系统中测试药物或化合物的方法。,下面是病理或生理性病况的体外模型专利的具体信息内容。

1.一种在体外模拟病理或生理性病况的方法,所述方法包括:
将培养基添加至细胞培养容器;
将至少一种因子添加至所述培养基;
将至少一种细胞类型涂铺于所述细胞培养容器内的至少一个表面上;以及
对于所述至少一种涂铺细胞类型施加剪切,所述剪切力通过自喷设备诱导的所述培养基的流动来产生,所述流动模拟在所述病理或生理性病况下所述至少一种细胞类型在体内所暴露的流动,其中:
模拟所述病理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是:
(i)在所述病理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内;或
(ii)在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内;或
模拟所述生理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是:
(i)在所述生理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内;或
(ii)在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内。
2.一种测试药物或化合物对于所述病理或生理性病况的效应的体外方法,所述方法包括:
根据如权利要求1所述的方法来模拟所述病理或生理性病况;
将药物或化合物添加至所述培养基;以及
对于暴露于所述药物或所述化合物的所述至少一种涂铺细胞类型施加所述剪切力;其中在所述药物或所述化合物存在下,所述至少一种涂铺细胞类型的变化指示所述药物或所述化合物对于所述病理或生理性病况具有效应。
3.一种在体外模拟所述肝的病理或生理性病况的方法,所述方法包括:
将培养基添加至细胞培养容器;
将至少一种因子添加至所述培养基;
将至少一种肝细胞类型涂铺于所述细胞培养容器内的至少一个表面上;以及
对于所述至少一种涂铺肝的细胞类型施加剪切力,所述剪切力通过自喷设备诱导的所述培养基的流动来产生,所述流动模拟在所述病理或生理性病况下所述至少一种肝细胞类型在体内所暴露的流动,其中模拟所述病理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是:
(i)在所述病理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内;或
(ii)在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内;或
(iii)在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的病理性病况一段时间,所述相同浓度的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的病理性病况所述一段时间;

模拟所述生理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是:
(i)在所述生理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内;或
(ii)在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内;或
(iii)在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的生理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的生理性病况所述一段时间。
4.一种测试药物或化合物对于病理或生理性病况的效应的体外方法,所述方法包括:
根据如权利要求3所述的方法来模拟所述病理或生理性病况;
将药物或化合物添加至所述培养基;以及
对于暴露于所述药物或所述化合物的所述至少一种涂铺肝细胞类型施加所述剪切力;
其中在所述药物或所述化合物存在下,所述至少一种涂铺肝细胞类型的变化指示所述药物或所述化合物对于所述病理或生理性病况具有效应。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述病理性病况得到模拟。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述培养基中的所述因子的浓度在所述病理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内。
7.如权利要求5所述的方法,其中所述培养基中的所述因子的浓度在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内。
8.如权利要求1、2和5至7中任一项所述的方法,其中与不存在所述剪切力的施加时时的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述标记物的平相比,在施加所述剪切力后的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述病理性病况的所述标记物的水平的变化证实所述病理性病况得到模拟。
9.如权利要求3或4所述的方法,其中所述病理性病况得到模拟,并且所述培养基中的所述因子的浓度在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的病理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的病理性病况所述一段时间。
10.如权利要求3至7和9中任一项所述的方法,其中与不存在所述剪切力的施加时时的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比,在施加所述剪切力后的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述病理性病况的所述标记物的水平的变化证实所述病理性病况得到模拟。
11.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述生理性病况得到模拟。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述培养基中的所述因子的浓度在所述生理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内。
13.如权利要求11所述的方法,其中所述培养基中的所述因子的浓度在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内。
14.如权利要求1、2和11至13中任一项所述的方法,其中与不存在所述剪切力的施加时时的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比,在施加所述剪切力后的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述生理性病况的所述标记物的水平的变化证实所述生理性病况得到模拟。
15.如权利要求3或4所述的方法,其中所述生理性病况得到模拟,并且所述培养基中的所述因子的浓度在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的生理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的生理性病况所述一段时间。
16.如权利要求3、4、11至13和15中任一项所述的方法,其中与不存在所述剪切力的施加时时的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比,在施加所述剪切力后的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述生理性病况的所述标记物的水平的变化证实所述生理性病况得到模拟。
17.如权利要求3、4、11至13和15至16中任一项所述的方法,其中至少一种涂铺肝细胞类型包括肝细胞并且在所述肝细胞中的对于胰高血糖素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实所述生理性病况得到模拟。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述葡萄糖底物包括甘油、乳酸酯、丙酸酯或其组合。
19.如权利要求1至4和11至18中任一项所述的方法,其中所述生理性病况是健康肝,所述因子包括胰岛素和葡萄糖,所述涂铺步骤包括将肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上;以及将所述剪切力间接地施加至所述涂铺肝细胞。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述肝细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述容器的上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
21.如权利要求3至7、9至13和15至18中任一项所述的方法,其中至少一种细胞外
基质组分沉积于多孔膜的第一表面上,所述至少一种肝细胞类型涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上,所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述至少一种细胞外基质组分和所述至少一种肝细胞类型的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述容器的上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
22.一种测试药物或化合物的效应的体外方法,所述方法包括:
将培养基添加至细胞培养容器;
将至少一种细胞类型涂铺于所述细胞培养容器内的至少一个表面上;
将药物或化合物添加至所述培养基,其中所述培养基中的所述药物或化合物的浓度在体内实现所述效应的所述药物或所述化合物的浓度范围内;以及
对于暴露于所述药物或所述化合物的所述至少一种涂铺细胞类型施加所述剪切力,所述剪切力通过自喷设备诱导的所述培养基的流动来产生,所述流动模拟所述至少一种细胞类型在体内所暴露的流动,其中在所述药物或所述化合物存在下,所述至少一种涂铺细胞类型的变化指示所述药物或所述化合物具有所述效应。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述效应包括对于生理性病况的效应。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述效应包括对于病理性病况的效应。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法,其中所述效应包括毒性效应、保护效应、病理效应、疾病促进效应、炎症效应、化效应、内质网应激效应、线粒体应激效应、凋亡效应、坏死效应、重构效应、增殖效应、对于蛋白质活性的效应,或对于基因表达的效应。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述效应包括对于蛋白质活性的效应,所述效应包括抑制所述蛋白质或活化所述蛋白质。
27.如权利要求25所述的方法,其中所述效应包括对于基因表达的效应,所述效应包括所述基因的表达的增加或所述基因的表达的减少。
28.一种在体外模拟所述肝的病理或生理性病况的方法,所述方法包括:
将培养基添加至细胞培养容器;
将至少一种细胞外基质组分沉积于所述细胞培养容器内的表面上:
将肝细胞涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上;以及
将剪切力间接地施加至所述至少一种细胞外基质组分和所述肝细胞上,所述剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生,所述流动模拟肝细胞所述病理或生理性病况下在体内所暴露的流动。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述至少一种细胞外基质组分沉积于多孔膜的第一表面上,所述肝细胞涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上,所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含至少一种细胞外基质组分和所述肝细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述容器的上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
30.一种在体外模拟所述肝的病理或生理性病况的方法,所述方法包括:
将培养基添加至细胞培养容器;
将肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述容器内界定包含所述肝细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积;以及
将剪切力施加于所述容器的上部容积中的所述多孔膜的第二表面,所述剪切力通过自喷设备诱导的所述培养基的流动来产生,所述流动模拟所述肝细胞所述病理或生理性病况下在体内所暴露的流动,其中所述自喷设备包括适于定位于所述容器的上部容积中的所述培养基中的主体和适于使所述主体旋转的电动机
31.一种测试药物或化合物对于所述肝的病理或生理性病况的效应的体外方法,所述方法包括:
根据如权利要求28至30中任一项所述的方法来模拟所述病理或生理性病况;
将药物或化合物添加至所述培养基;以及
对于暴露于所述药物或所述化合物的所述肝细胞施加所述剪切力;其中在所述药物或所述化合物存在下,所述肝细胞的变化指示所述药物或所述化合物对于所述病理或生理性病况具有效应。
32.如权利要求30或31所述的方法,其中所述主体具有锥形表面。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述自喷设备适于将所述主体的锥形表面定位于所述容器中并且与所述细胞培养基接触
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法,其中所述流动从以前测量的血液动力学模式获得并且建模成一组电子指令,所述剪切力基于所述一组电子指令,并且所述自喷设备包括接收所述一组电子指令的电子控制器,所述电动机由所述电子控制器来操作。
35.如权利要求30至34中任一项所述的方法,其中至少一种细胞外基质组分涂铺于所述多孔膜的第一表面上并且所述肝细胞随后涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上。
36.如权利要求29至35中任一项所述的方法,其进一步包括将非实质肝细胞涂铺于所述多孔膜的第二表面上,以及其中将所述剪切应力施加至所述非实质肝细胞。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述非实质肝细胞包括肝窦内皮细胞、肝星形细胞、库柏法细胞或其组合。
38.如权利要求28、29和35至37中任一项所述的方法,其中所述至少一种细胞外基质组分包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。
39.如权利要求28、29和35至38中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括将纤维细胞、软骨细胞或成骨细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上,并且所述至少一种细胞外基质组分由所述涂铺成纤维细胞、软骨细胞或成骨细胞来分泌。
40.如权利要求28至39中任一项所述的方法,其中与不存在所述剪切力的施加时的所述肝细胞或非实质肝细胞或所述培养基中的所述标记物的水平相比,在所述施加剪切力后的所述肝细胞或非实质肝细胞或所述培养基中的病理或生理性病况的标记物的水平的变化证实所述病理或生理性病况得到模拟。
41.如权利要求28至39中任一项所述的方法,其中在所述肝细胞中的对于胰高血糖素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实所述生理性病况得到模拟。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述葡萄糖底物包括甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其组合。
43.如权利要求2、4至21和31至42中任一项所述的方法,其中所述培养基中的所述药物或所述化合物的浓度在体内实现所述效应的所述药物或所述化合物的浓度范围内。
44.如权利要求22至27和43中任一项所述的方法,其中所述培养基中的所述药物或所述化合物的浓度在所述药物或所述化合物的体内治疗C最大的浓度范围内。
45.如权利要求1至27和31至44中任一项所述的方法,其中将至少一种因子添加至
所述培养基的步骤或将药物或化合物添加至所述培养基的步骤包括将来自受试者的血清添加至所述培养基,其中所述血清包括所述因子、所述药物或所述化合物。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述受试者是动物。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述动物是基因修饰动物。
48.如权利要求46所述的方法,其中所述动物是人。
49.如权利要求45至48中任一项所述的方法,其中所述受试者是具有所述生理性病况的受试者或具有所述病理性病况的受试者。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述受试者具有病理性病况,包括晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、纤维化、慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化斑破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血管再狭窄、血管化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
51.如权利要求50所述的方法,其中所述静脉血栓形成包括深静脉血栓形成。
52.如权利要求1至51中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型或所述肝细胞包括原代细胞。
53.如权利要求52所述的方法,其中所述原代细胞包括从干细胞或干细胞样细胞衍生的细胞谱系。
54.如权利要求53所述的方法,其中所述原代细胞包括从干细胞衍生的细胞谱系,所述细胞谱系从包括成人干细胞、胚胎干细胞、可诱导多能干细胞或骨髓衍生干细胞的干细胞来衍生。
55.如权利要求1、2、5至8、11至14和22至27和43至51中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括原代细胞并且所述原代细胞包括从干细胞衍生的细胞谱系,其中从干细胞衍生的细胞谱系包括内皮细胞、平滑肌细胞、心脏肌细胞、肝细胞、神经元细胞、内分泌细胞、胰腺β-细胞、胰腺α-细胞或骨骼肌细胞。
56.如权利要求52或53所述的方法,其中所述原代细胞包括来自具有病理性病况的受试者的可诱导多能干细胞(iPSC)衍生细胞。
57.如权利要求56所述的方法,其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生细胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生肝细胞:家族性高胆固醇血症、糖原贮积病类型I、威尔逊氏病、A1抗胰蛋白酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征、渐进性家族性遗传性胆汁淤积或遗传性酪酸血症类型1。
58.如权利要求56所述的方法,其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生细胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生血管细胞:哈钦森-吉尔福特早衰症、威廉姆斯-博伊伦综合征、法布里氏病、苏萨克氏综合征、全身毛细管渗漏综合征、格菜克综合征、血管内乳突状内皮增生、镰状细胞疾病或肝静脉闭塞疾病。
59.如权利要求58所述的方法,其中所述iPSC衍生血管细胞包括iPSC衍生平滑肌细胞、iPSC衍生内皮细胞或iPSC衍生心内膜细胞。
60.如权利要求1至51中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型或所述肝细胞包括永生细胞。
61.如权利要求52至60中任一项所述的方法,其中所述原代细胞或所述永生细胞包括从具有所述病理或生理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有所述病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述原代细胞或所述永生细胞包括从具有所述病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞,所述风险因素包括吸烟、年龄、性别、种族、表观遗传印记、与所述病理性病况相关的已识别基因型、与所述病理性病况相关的已识别单核苷酸多态性、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肺动脉疾病、肺动脉高压、高脂血症、家族性高胆固醇血症、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化或酒精诱导肝疾病。
63.如权利要求62所述的方法,其中所述静脉血栓形成包括深静脉血栓形成。
64.如权利要求1、2、5至8、11至14、22至27和43至63中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括肾细胞、气道细胞、血脑屏障细胞、血管细胞、肝细胞、胰腺细胞、心脏细胞、肌肉细胞、脾细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞或造血细胞。
65.如权利要求1、2、5至8、11至14、22至27和43至65中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞型包括星形细胞、内皮细胞、肾小球有孔内皮细胞、肾上皮足细胞、α细胞、β-细胞、δ细胞、胰多肽(PP)细胞、ε细胞、神经胶质细胞、肝细胞、神经元、非实质肝细胞、足细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、周细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、白细胞、单核细胞、肌细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T-细胞、B-细胞、内皮祖细胞、干细胞、循环干细胞或循环造血细胞。
66.如权利要求65所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括所述非实质肝细胞,所述非实质肝细胞包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞或库柏法细胞。
67.如权利要求1、2、5至8、11至14、22至27和43至65和H5中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞或肝窦内皮细胞。
68.如权利要求1至67中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型、所述原代细胞、所述肝细胞或所述永生细胞细胞来自动物。
69.如权利要求68所述的方法,其中来自动物的所述细胞是来自基因修饰动物。
70.如权利要求68所述的方法,其中来自动物的所述细胞是来自人的细胞。
71.如权利要求70所述的方法,其中来自人的所述细胞基于年龄、性别、种族、表现遗传学、疾病、民族性或存在或不存在一个或多个单核苷酸多态性来选择。
72.如权利要求1至71中任一项所述的方法,其中所述剪切力间接地施加至所述至少一种涂铺细胞类型、所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述肝细胞。
73.如权利要求1至72中任一项所述的方法,其中将所述剪切力直接地施加至所述至少一种涂铺细胞类型、所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述肝细胞。
74.如权利要求1、2、5至8、10、22、24至27和44至51中任一项所述的方法,其中所述病理性病况包括血管病理性病况,所述因子包括氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、葡萄糖、组织生长因子-β(TGF-β)、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、维生素D、无机磷酸盐、瘦蛋白、脂肪连接蛋白、爱帕琳肽、固酮、血管紧张素II、甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)、氧化高密度脂蛋白(oxHDL)、富含甘油三酯的脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)、胰岛素、脂肪酸或其组合;所述涂铺步骤包括将内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上;并且所述剪切力施加于所涂铺的内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞上。
75.如权利要求74所述的方法,其中所述因子是富含甘油三酯的脂蛋白,所述富含甘油三酯的脂蛋白包括极低密度脂蛋白(vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒或乳糜微粒残余。
76.如权利要求74或75所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括内皮细胞。
77.如权利要求74至76中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括平滑肌细胞。
78.如权利要求74至77中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型包括心内膜细胞。
79.如权利要求74或75所述的方法,其进一步包括将所述心内膜细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,其中将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述心内膜细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
80.如权利要求79所述的方法,其进一步包括将所述内皮细胞涂铺在所述多孔膜的第二表面上,其中所述剪切力施加于所涂铺的内皮细胞上。
81.如权利要求79或80所述的方法,其中所述心内膜细胞包括平滑肌细胞。
82.如权利要求74至81中任一项所述的方法,其中所述血管病况包括心房纤维性颤动,或心房纤维性颤动和相关联的高血压。
83.如权利要求74至82中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者、年老受试者或基因修饰以将糖尿病、高血压或老化建模的动物。
84.如权利要求74至83中任一项所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式从心脏窦或心房纤维性颤动节律获得。
85.如权利要求74至84中任一项所述的方法,其中所述因子包括oxLDL、TNFα、醛固酮、血管紧张素II或其组合。
86.如权利要求74或75所述的方法,其进一步包括将所述平滑肌细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,其中将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述平滑肌细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
87.如权利要求86所述的方法,其进一步包括将所述内皮细胞涂铺于所述多孔膜的第二表面上。
88.如权利要求74或75所述的方法,其进一步包括将所述内皮细胞涂铺于多孔膜的第二表面上,其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述多孔膜的第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述多孔膜的第一表面的下部容积和包含所述内皮细胞的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述内皮细胞。
89.如权利要求88所述的方法,其进一步包括将平滑肌细胞涂铺于所述多孔膜的第一表面上。
90.如权利要求86至89中任一项所述的方法,其中所述血管病况包括晚期炎症。
91.如权利要求90所述的方法,其中所述晚期炎症包括动脉粥样硬化。
92.如权利要求90或91中任一项所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
93.如权利要求90至92中任一项所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
94.如权利要求90至93中任一项所述的方法,其中所述因子包括LDL、oxLDL、TNFα、HDL、富含甘油三酯的脂蛋白或其组合。
95.如权利要求90所述的方法,其中所述晚期炎症包括高甘油三酯血症。
96.如权利要求95所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
97.如权利要求95或96所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
98.如权利要求95至97中任一项所述的方法,其中所述因子包括富含甘油三酯的脂蛋白。
99.如权利要求86至89中任一项所述的方法,其中所述血管病理性病况是腹主动脉瘤。
100.如权利要求99所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者、吸烟者、患有腹主动脉瘤的受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模或修饰以将腹主动脉瘤建模的动物。
101.如权利要求99和100所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式从腹动脉获得或从腹内主动脉瘤节律获得。
102.如权利要求99至101中任一项所述的方法,其中所述因子包括oxLDL、TNFα、葡萄糖、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、血管紧张素II、醛固酮、胰岛素、TGF-β或其组合。
103.如权利要求99至102中任一项所述的方法,其中烟提取物添加至所述培养基。
104.如权利要求86至89中任一项所述的方法,其中所述血管病况包括糖尿病血管病况。
105.如权利要求104所述的方法,其中所述糖尿病血管病况包括糖尿病性肾病、糖尿病神经病或糖尿病视网膜病。
106.如权利要求104或105所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者或基因修饰以将糖尿病建模的动物。
107.如权利要求104至106中任一项所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
108.如权利要求104至107中任一项所述的方法,其中所述因子包括oxLDL、TNFα、葡萄糖、HDL、oxHDL、富含甘油三酯的脂蛋白、胰岛素或其组合。
109.如权利要求86至89中任一项所述的方法,其中所述血管病况包括高血压。
110.如权利要求109所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
111.如权利要求109或110所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性,或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
112.如权利要求109至111中任一项所述的方法,其中所述因子包括oxLDL、TNFα、血管紧张素II、醛固酮或其组合。
113.如权利要求86至89中任一项所述的方法,其中所述血管病况包括动脉钙化。
114.如权利要求113所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
115.如权利要求113或114所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性,或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
116.如权利要求113至115中任一项所述的方法,其中所述因子包括oxLDL、TNFα、维生素D、无机磷酸酯、瘦蛋白、脂肪连接蛋白或其组合。
117.如权利要求86至89中任一项所述的方法,其中所述血管病理性病况包括血栓形成。
118.如权利要求117所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
119.如权利要求117或权利要求118所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性,或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
120.如权利要求117至119中任一项所述的方法,其中所述因子包括TNFα、oxLDL、葡萄糖或其组合。
121.如权利要求1至10、21和24至73中任一项所述的方法,其中所述病理性病况包括脂肪肝疾病。
122.如权利要求121所述的方法,其中所述至少一种涂铺细胞类型或所述至少一种涂铺肝细胞类型包括肝细胞、非实质肝细胞或其组合。
123.如权利要求122所述的方法,其中所述非实质肝细胞包括肝窦内皮细胞、肝星形细胞、库柏法细胞或其组合。
124.如权利要求122至123中任一项所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式来自正常受试者、患有脂肪肝疾病的受试者或基因修饰以将脂肪肝疾病建模的动物。
125.如权利要求1至10、21和24至73中任一项所述的方法,其中所述病理性病况包括脂肪肝疾病,并且所述涂铺步骤包括将肝细胞或非实质肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上。
126.如权利要求125所述的方法,其进一步包括将所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,其中将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述肝细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
127.如权利要求126所述的方法,其进一步包括将所述非实质肝细胞涂铺于所述多孔膜的第二表面上,其中所述剪切力施加至所述上部容积中的所述非实质肝细胞。
128.如权利要求125所述的方法,其进一步包括将所述非实质肝细胞涂铺于多孔膜的第二表面上,其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述多孔膜的第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述多孔膜的第一表面的下部容积和包含所述非实质肝细胞的上部容积,以及将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述非实质肝细胞。
129.如权利要求126至128中任一项所述的方法,其进一步包括将细胞外基质组分沉积于所述多孔膜的第一表面上,并且随后将肝细胞涂铺于所述细胞外基质组分上。
130.如权利要求125至129中任一项所述的方法,其中所述因子包括胰岛素、葡萄糖或其组合。
131.如权利要求1、2、5至8、24至27和43至73中任一项所述的方法,其中所述病理性病况包括糖尿病,所述涂铺步骤包括将胰腺β-细胞、胰腺α-细胞或其组合涂铺于所述细胞培养容器内的表面上,并且所述因子包括胰岛素、葡萄糖或其组合。
132.如权利要求1、2、5至8、24至27和43至73中任一项所述的方法,其中所述病理性病况包括晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
133.如权利要求132所述的方法,其中所述静脉血栓形成包括深静脉血栓形成。
134.如权利要求1、2、5至8、24至27和43至73中任一项所述的方法,其中所述病理性病况包括解剖学病况。
135.如权利要求134所述的方法,其中所述解剖学病况包括萎缩、结石、迷芽瘤、病理性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器。
136.如权利要求1至135中任一项所述的方法,其中所述流动从以前测量的血液动力学模式获得并且建模成一组电子指令,并且所述剪切力基于所述一组电子指令。
137.如权利要求136所述的方法,其中所述自喷设备包括接收所述一组电子指令的电子控制器;由所述电子控制器操作的电动机;和可操作地连接至所述电动机以便由所述电动机驱动的剪切力施加器。
138.如权利要求137所述的方法,其中所述剪切力施加器包括连接至所述电动机的圆锥体。
139.如权利要求1至138中任一项所述的方法,其进一步包括所述细胞培养容器内的入口和出口。
140.如权利要求136至139中任一项所述的方法,其中所述血液动力学模式从具有所述病理性病况或疾病促进性病况的一个或多个受试者获得。
141.如权利要求140所述的方法,其中所述疾病促进性病况包括萎缩、结石、迷芽瘤、病理性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器。
142.如权利要求136至141中任一项所述的方法,其中所述血液动力学模式从动脉、小动脉、静脉、小静脉或器官的至少一部分获得。
143.如权利要求142所述的方法,其中当所述血液动力学模式从动脉或小动脉的至少一部分获得时,所述动脉或小动脉包括颈动脉、胸动脉、腹部动脉、肺动脉、股动脉、肾输出动脉、肾输入动脉、冠状动脉、肱动脉、乳房内动脉、大脑动脉、主动脉、毛细血管前小动脉、肝动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉、基底动脉、颈外动脉、颈内动脉、脊椎动脉、骨下动脉、主动脉弓、腋动脉、胸廓内动脉、鳃动脉、深鳃动脉、桡侧返动脉、腹壁上动脉、降主动脉、腹壁下动脉、骨间动脉、桡动脉、尺动脉、腕掌弓、腕背弓、掌浅弓或掌深弓、指动脉、降支旋股动脉、膝降动脉、膝上动脉、膝下动脉、胫前动脉、胫后动脉、腓动脉、足底深弓、弓状动脉、颈总动脉、肋间动脉、胃左或右动脉、腹腔干、脾动脉、肝总动脉、肠系膜上动脉、肾动脉、肠系膜下动脉、睾丸动脉、髂总动脉、髂内动脉、髂外动脉、旋股动脉、穿通支、股深动脉、腘动脉、跖背动脉或指背动脉。
144.如权利要求142所述的方法,其中当血液动力学模式从静脉或小静脉的至少一部分获得时,静脉或小静脉包括毛细管后小静脉、隐静脉、肝静脉、上腔静脉、下腔静脉、冠状静脉、心最小静脉、浅静脉、交通静脉、全身静脉、肺静脉、颈静脉、乙状窦、颈外静脉、颈内静脉、甲状腺下静脉、锁骨下静脉、胸廓内静脉、腋静脉、头静脉、鳃静脉、肋间静脉、贵要静脉、肘正中静脉、胸腹壁静脉、尺静脉、前臂正中静脉、腹壁下静脉、掌深弓、掌浅弓、指掌侧静脉、心脏静脉、下腔静脉、肝静脉、肾静脉、腹部腔静脉、睾丸静脉、髂总静脉、穿通支、髂外静脉、骼内静脉、阴部外静脉、股深静脉、大隐静脉、股静脉、附隐静脉、膝上静脉、腘静脉、膝下静脉、大隐静脉、小隐静脉、胫骨前或后静脉、足底深静脉、足背静脉弓或指背静脉。
145.如权利要求142所述的方法,其中当血液动力学模式从器官的至少一部分获得时,所述器官包括肝、肾、肺、脑、胰腺、脾、大肠、小肠、心脏、骨骼肌、眼睛、舌头、生殖器或脐带。
146.如权利要求136至145中任一项所述的方法,其中所述血液动力学模式从分析声波数据获得。
147.如权利要求136至145中任一项所述的方法,其中所述血液动力学模式从分析磁共振成像(MRI)数据获得。
148.如权利要求1至147中任一项所述的方法,其中所述流动或所述血液动力学模式是时间变化的。
149.如权利要求1至148中任一项所述的方法,其中所述流动或所述血液动力学模式可从心腔、窦性节律期间的左心、心房纤维性颤动或心室纤维性颤动获得。
150.如权利要求149所述的方法,其中当所述流动或所述血液动力学模式从心腔获得时,所述心腔包括左心房、右心房、左心室或右心室。
151.如权利要求1至150中任一项所述的方法,其中所述流动或所述血液动力学模式由病理性病况导致的物理变化产生。
152.如权利要求1至150中任一项所述的方法,其中所述流动或血液动力学模式从以下受试者获得,其中与不存在施用药物的受试者的所述流动或所述血液动力学模式相比,作为将所述药物施用至受试者的直接或间接效应,血液流动或血液动力学模式已经改变。
153.如权利要求1至152中任一项所述的方法,其中所述流动或所述血液动力学模式从动物获得。
154.如权利要求153所述的方法,其中所述动物是基因修饰动物。
155.如权利要求153所述的方法,其中所述动物是人。
156.如权利要求2、4至27、31至155中任一项所述的方法,其中所述药物包括抗炎症剂、抗肿瘤剂、抗糖尿病剂、蛋白激酶抑制剂、抗血栓形成剂、血栓溶解剂、抗血小板剂、抗凝血剂、钙通道阻滞剂、螯合剂、rho激酶抑制剂、抗高血脂剂、升高HDL的药剂、抗再狭窄剂、抗生素、免疫抑制剂、抗高血压剂、利尿剂、减食欲剂、食欲抑制剂、抗抑郁剂、精神抑制药、避孕药、拟钙剂、生物医药产品、多发性硬化疗法、止痛药、激素替代疗法、抗痉挛药或其组合。
157.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括抗炎症剂,所述抗炎症剂包括类固醇、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、选择性环氧合酶抑制剂、非选择性环氧合酶抑制剂、免疫选择性抗炎症剂或其组合。
158.如权利要求157所述的方法,其中所述抗炎症剂包括所述类固醇,所述类固醇包括泼尼松、氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松或地塞米松;其中所述抗炎症剂包括所述非类固醇抗炎症药物,所述非类固醇抗炎症药物包括水杨酸盐、布洛芬、对乙酰氨基酚、普生、酮洛芬或双氯芬酸;其中所述抗炎症剂包括所述选择性环氧合酶抑制剂,所述选择性环氧合酶抑制剂包括塞来昔布、罗非昔布或伐地考昔;或其中所述抗炎症剂包括所述免疫选择性抗炎症剂,所述免疫选择性抗炎症剂包括苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸三肽。
159.如权利要求158所述的方法,其中所述水杨酸盐包括乙酰水杨酸。
160.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括抗肿瘤剂,所述抗肿瘤剂包括烷化剂、抗代谢物植物、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素或其组合。
161.如权利要求160所述的方法,其中所述抗肿瘤剂包括所述烷化剂,所述烷化剂包括顺铂、卡波铂、奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或异环磷酰胺;其中所述抗肿瘤剂包括所述抗代谢物,所述抗代谢物包括硫唑嘌呤或巯基嘌呤;其中所述抗肿瘤剂包括所述植物碱,所述植物碱包括紫杉烷、长春花生物碱或鬼臼毒素;其中所述抗肿瘤剂包括所述拓扑异构酶抑制剂,所述拓扑异构酶抑制剂包括伊立替康、拓扑替康或安吖啶;其中所述抗肿瘤剂包括所述细胞毒性抗生素,所述细胞毒性抗生素包括放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星或利福平。
162.如权利要求161所述的方法,其中所述植物碱包括所述紫杉烷,所述紫杉烷包括紫杉醇或多西紫杉醇;其中所述植物碱包括所述长春花生物碱,所述长春花生物碱包括长春新碱、长春碱或长春地辛;或其中所述植物碱包括所述鬼臼毒素,所述鬼臼毒素包括依托泊苷或替尼泊苷。
163.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括抗糖尿病剂,所述抗糖尿病剂包括双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、肠促胰岛素模拟物、二肽基肽酶IV抑制剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂、葡糖激酶活化剂、氯茴苯酸、GPR40激动剂或胰高血糖素受体拮抗剂。
164.如权利要求163所述的方法,其中所述抗糖尿病剂包括所述双胍,所述双胍包括二甲双胍;其中所述抗糖尿病剂包括所述噻唑烷二酮,所述噻唑烷二酮包括罗格列酮、曲格列酮或吡格列酮;其中所述抗糖尿病剂包括所述磺酰脲,所述磺酰脲包括甲苯胺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列齐特、格吡嗪胺或格列喹酮;其中所述抗糖尿病剂包括所述肠促胰岛素模拟物,所述肠促胰岛素模拟物包括伊森泰德、利拉鲁肽或他司鲁泰;其中所述抗糖尿病剂包括所述二肽基肽酶IV抑制剂,所述二肽基肽酶IV抑制剂包括维达列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀、阿格列汀或塞格立汀;其中所述抗糖尿病剂包括所述钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂,所述钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂包括达格列净、坎格列净、帕列净、伊格列净、瑞格列净或舍格列净;其中所述抗糖尿病剂包括所述葡糖激酶活化剂,所述葡糖激酶活化剂包括匹瑞格汀;其中所述抗糖尿病剂包括所述氯茴苯酸,所述氯茴苯酸包括瑞格列奈;或其中所述抗糖尿病剂包括所述GPR40激动剂,所述GPR40激动剂包括TAK-875。
165.如权利要求163所述的方法,其中所述抗糖尿病剂包括噻唑烷二酮与二甲双胍的组合;噻唑烷二酮与格列美脲的组合;二肽基肽酶IV抑制剂与斯达汀的组合;或二肽基肽酶IV抑制剂与二甲双胍的组合。
166.如权利要求165所述的方法,其中所述抗糖尿病剂包括噻唑烷二酮与二甲双胍的组合或噻唑烷二酮与格列美脲的组合,所述噻唑烷二酮包括吡格列酮;其中所述抗糖尿病剂包括二肽基肽酶IV抑制剂与斯达汀的组合,所述二肽基肽酶IV抑制剂包括西他列汀并且所述斯达汀包括辛伐他汀;或其中所述抗糖尿病剂包括二肽基肽酶IV抑制剂与二甲双胍的组合,所述二肽基肽酶IV抑制剂包括西他列汀。
167.如权利要求163所述的方法,其中所述抗糖尿病剂包括达格列净与二甲双胍的组合,或达格列净与沙格列汀的组合。
168.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括蛋白激酶抑制剂,所述蛋白激酶抑制剂包括丝氨酸/苏氨酸特异性激酶抑制剂、酪氨酸特异性激酶抑制剂、表皮生长因子(EGF)受体抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)受体抑制剂、血小板衍生生长因子(PDGF)受体抑制剂或血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂。
169.如权利要求168所述的方法,其中所述蛋白激酶抑制剂包括所述酪氨酸特异性激酶抑制剂,所述酪氨酸特异性激酶抑制剂包括伊马替尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、阿西替尼、拉帕替尼、卢佐替尼、索拉非尼、费斯替尼、巴利替尼或托法替尼。
170.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗血栓形成剂,所述抗血栓形成剂包括双嘧达莫、尿激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、瑞替普酶、阿替普酶、链激酶、rt-PA、TNK-rt-PA、孟替普酶、葡萄球菌激酶、帕米普酶、未分级肝素或APSAC。
171.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述血栓溶解剂,所述血栓溶解剂包括链激酶、尿激酶或组织纤溶酶原活化剂。
172.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗血小板剂,所述抗血小板剂包括糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、凝血烷抑制剂、二磷酸腺苷受体抑制剂、前列腺素类似物或磷酸二酯酶抑制剂。
173.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗血小板剂,所述抗血小板剂包括氯吡格雷、阿昔单抗、替罗非班、奥波非班、珍米洛非班、西拉非班、罗昔非班或噻氯匹定。
174.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗凝血剂,所述抗凝血剂包括维生素K拮抗剂、因子Xa抑制剂或直接凝血酶抑制剂。
175.如权利要求174所述的方法,其中所述抗凝血剂包括维生素K拮抗剂,所述维生素K拮抗剂包括华法林;其中所述抗凝血剂包括所述因子Xa抑制剂,所述因子Xa抑制剂包括阿哌沙班、贝曲西班、依杜沙班、奥米沙班、利伐沙班、磺达肝癸或艾屈肝素;或其中所述抗凝血剂包括所述直接凝血酶抑制剂,所述直接凝血酶抑制剂包括水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、达比加群、希美加群、美拉加群或阿加曲班。
176.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述钙通道阻滞剂时,所述钙通道阻滞剂包括维拉帕米、地尔硫卓、氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、伊拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平或普拉地平。
177.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述螯合剂,所述螯合剂可包括青霉胺、三乙烯四胺盐酸盐、EDTA、DMSA、甲磺酸去胺或巴马司他。
178.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述rho激酶抑制剂,所述rho激酶抑制剂包括Y27632。
179.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗高血脂剂,所述抗高血脂剂包括斯达汀、非诺贝特、膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、前列腺素D2受体拮抗剂、Ω-3-脂肪酸或降胆固醇剂。
180.如权利要求179所述的方法,其中所述抗高血脂剂包括所述斯达汀,所述斯达汀包括阿托伐他汀、西伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀或辛伐他汀;其中所述抗高血脂剂包括所述非诺贝特,所述非诺贝特包括苯扎贝特、苯扎贝特酸、环丙贝特、环丙贝特酸、氯贝特、氯贝酸、吉非贝齐、非诺贝特或非诺贝酸;其中所述抗高血脂剂包括所述膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂,所述膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂包括依折麦布;其中所述抗高血脂剂包括所述胆固醇酯转移蛋白抑制剂,所述胆固醇酯转移蛋白抑制剂包括安塞曲匹、达塞曲匹、托彻普或伊沃曲匹;其中所述抗高血脂剂包括所述前列腺素D2受体拮抗剂,所述前列腺素D2受体拮抗剂包括拉罗皮兰;其中所述抗高血脂剂包括所述Ω-3-脂肪酸,所述Ω-3-脂肪酸包括二十五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA);或其中所述抗高血脂剂包括所述降胆固醇剂,所述降胆固醇剂包括烟酸。
181.如权利要求179所述的方法,其中所述抗高血脂剂包括烟酸与拉罗皮兰的组合或依折麦布与辛伐他汀的组合。
182.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述升高HDL的药剂,所述升高HDL的药剂包括前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)的抑制剂。
183.如权利要求182所述的方法,其中所述PCSK9抑制剂包括AMG145。
184.如权利要求183所述的方法,其中所述药物包括所述抗再狭窄剂,所述抗再狭窄剂包括地塞米松噻氯匹定、氯吡格雷、西罗莫司、紫杉醇、佐他莫司、依维莫司或乌米莫司。
185.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗生素,所述抗生素包括放线菌素-D。
186.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述免疫抑制剂,所述免疫抑制剂包括糖皮质激素、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、更生霉素、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素、环孢素、他克莫司、西罗莫司、干扰素、英利昔单抗、依那西普或阿达木单抗。
187.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗高血压剂,所述抗高血压剂包括β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂或血管紧张素转化酶抑制剂。
188.如权利要求187所述的方法,其中所述抗高血压剂包括所述β肾上腺素受体拮抗剂,所述β肾上腺素受体拮抗剂包括烯丙洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔或奈必洛尔;其中所述抗高血压剂包括所述血管紧张素II受体拮抗剂,所述血管紧张素II受体拮抗剂包括洛沙坦、奥美沙坦、缬沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦;或其中所述抗高血压剂包括所述血管紧张素转化酶抑制剂,所述血管紧张素转化酶抑制剂包括卡托普利、依那普利、赖诺普利、喹那普利、佐芬普利、咪达普利、贝那普利、群多普利或雷米普利。
189.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述利尿剂,所述利尿剂包括呋塞米、阿米洛利、螺内酯或双氢氯噻嗪。
190.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述减食欲剂,所述减食欲剂包括苯丁胺、芬氟拉明、右芬氟拉明、西布曲明、氯卡色林、托吡酯或其组合。
191.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗抑郁剂,所述抗抑郁剂包括丙米嗪、脱甲丙咪嗪、阿米替林、帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀或依地普仑。
192.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述精神抑制药,所述精神抑制药包括阿立哌唑、利培酮、奥氮平、喹硫平、卡利拉、鲁拉西或阿塞那平。
193.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述避孕药,所述避孕药包括β-雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮或屈螺酮。
194.如权利要求193所述的方法,其中所述避孕药包括屈螺酮与乙炔基雌二醇的组合。
195.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述拟钙剂,所述拟钙剂包括西那卡塞。
196.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述生物医药产品,所述生物医药产品包括合成多糖,合成、部分合成或人源化免疫球蛋白,或重组治疗蛋白质。
197.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述多发性硬化疗法,所述多发性硬化疗法包括多发性硬化的口服疗法。
198.如权利要求156或197所述的方法,其中所述药物包括所述多发性硬化疗法,所述多发性硬化疗法包括延胡索酸的甲酯、鞘氨醇-1-磷酸酯(S1P)受体激动剂或免疫调节剂。
199.如权利要求198所述的方法,其中所述多发性硬化疗法包括所述延胡索酸的甲酯,所述延胡索酸的甲酯包括延胡索酸单甲酯或延胡索酸二甲酯;其中所述多发性硬化疗法包括所述S1P受体激动剂,所述S1P受体激动剂包括芬戈莫德;其中所述多发性硬化疗法包括所述免疫调节剂,所述免疫调节剂包括特立氟胺或拉喹莫德。
200.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述止痛药,所述止痛药包括麻醉性止痛药或阿片样肽。
201.如权利要求200所述的方法,其中所述止痛药包括所述麻醉性止痛药,所述麻醉性止痛药包括丙氧芬、芬太尼、吗啡或吗啡代谢物;或其中所述止痛药包括所述阿片样肽,所述阿片样肽包括强啡肽A。
202.如权利要求201所述的方法,其中所述吗啡代谢物包括吗啡3-葡糖苷酸或吗啡
6-葡糖苷酸。
203.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述激素替代疗法,所述激素替代疗法包括偶联雌激素、β-雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮、屈螺酮或睾酮。
204.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括所述抗痉挛药,所述抗痉挛药包括苯巴比妥。
205.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括利尿剂与钙通道阻滞剂的组合;
利尿剂与血管紧张素受体II拮抗剂的组合;利尿剂与β-肾上腺素受体拮抗剂的组合;或利尿剂与血管紧张素转化酶抑制剂的组合。
206.如权利要求205所述的方法,其中所述药物包括利尿剂与钙通道阻滞剂的组合,所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述钙通道阻滞剂包括氨氯地平;其中所述药物包括利尿剂与血管紧张素受体II拮抗剂的组合,所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述血管紧张素受体II拮抗剂包括洛沙坦;其中所述药物包括利尿剂与β-肾上腺素受体拮抗剂的组合,所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述β-肾上腺素受体拮抗剂包括普萘洛尔;或其中所述药物包括利尿剂与血管紧张素转化酶抑制剂的组合,所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述血管紧张素转化酶抑制剂包括卡托普利。
207.如权利要求156所述的方法,其中所述药物包括抗高血脂剂、抗高血压剂、利尿剂和钙通道阻滞剂的组合。
208.如权利要求207所述的方法,其中所述抗高血脂剂包括辛伐他汀,所述抗高血压剂包括洛沙坦,所述利尿剂包括双氢氯噻嗪,并且所述钙通道阻滞剂包括氨氯地平。
209.如权利要求2、4至27和31至155中任一项所述的方法,其中所述药物或所述
化合物包括造影剂放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗药物递送微球体、微珠、纳米颗粒、凝胶或细胞浸渍凝胶或其组合。
210.如权利要求2、4至27和31至155中任一项所述的方法,其中所述化合物能够抑制、活化或改变所述至少一种细胞类型中的蛋白质或基因的功能。
211.如权利要求2、4至27和31至155中任一项所述的方法,其中所述药物或所述化合物针对从血管支架材料上洗脱来评估,并且所述方法进一步包括针对与所述血管支架材料的相容性、细胞粘附或表型调节来测试至少一种细胞类型。
212.如权利要求74至120中任一项所述的方法,其中血管支架材料相邻于内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞。
213.如权利要求2、3至10、21、24至27、31至73、121至130、132、136至140、142、145至145、151至156、163和164中任一项所述的方法,其中所述病理性病况是脂肪肝疾病,所述因子包括胰岛素和葡萄糖,并且所述药物或化合物包括吡格列酮。
214.如权利要求1至213中任一项所述的方法,其进一步包括灌注培养基进入和离开所述细胞容器。
215.如权利要求1至19、22至28、31至34、38至78、82至85、121至125和130至214中任一项所述的方法,其中所述细胞培养容器内的表面包括悬浮于所述细胞培养容器中的多孔膜。
216.如权利要求1至19、22至28、31至34、38至78、82至85、121至125,和130至
214中任一项所述的方法,其中将至少一种细胞类型或肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上的步骤包括将第一细胞类型或所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,并且任选地将第二细胞类型涂铺于所述多孔膜的第二表面上,其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述第一细胞类型的下部容积和包含所述任选第二细胞类型的上部容积,所述多孔膜适于允许所述细胞培养基的流体连通以及所述第一细胞类型的细胞与所述任选第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通;并且将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述第二细胞类型或所述多孔膜的第二表面。
217.如权利要求1至19、22至28、31至34、38至78、82至85、121至125,和130至
214中任一项所述的方法,其中将至少一种细胞类型或肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上的步骤包括将第一细胞类型或所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上,并且将第二细胞类型涂铺于所述多孔膜的第二表面上,其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在所述细胞培养容器内界定包含所述任选第一细胞类型的下部容积和包含所述第二细胞类型的上部容积,所述多孔膜适于允许所述细胞培养基的流体连通以及所述任选第一细胞类型的细胞与所述第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通;并且将所述剪切力施加至所述上部容积中的所述第二细胞类型。
218.如权利要求216或217所述的方法,其进一步包括将培养基灌注进入和离开所述上部容积以及将培养基灌注进入和离开所述下部容积。
219.如权利要求218所述的方法,其中所述方法进一步包括将药物或化合物灌注至所述上部容积和所述下部容积中的至少一个。
220.如权利要求219所述的方法,其中所述方法进一步包括将药物或化合物灌注至所述上部容积中。
221.如权利要求219或220所述的方法,其中所述方法进一步包括将药物或化合物灌注至所述下部容积中。
222.如权利要求216至221中任一项所述的方法,其中所述细胞培养容器进一步包括界定所述上部和下部容积的所述细胞培养容器的部分的入口和出口。
223.如权利要求216至222中任一项所述的方法,其进一步包括针对由所述药物或所述化合物产生的毒性、炎症、渗透性、相容性、细胞粘附、细胞重构、细胞迁移或表型调节来分析所述第一细胞类型或所述第二细胞类型中的至少一种。
224.如权利要求216至223中任一项所述的方法,其进一步包括将第三细胞类型涂铺于所述容器的表面或所述多孔膜的第一表面或第二表面上,将第三细胞类型悬浮于所述上部容积内的所述培养基中,或将第三细胞类型悬浮于所述下部容积内的所述培养基中。
225.如权利要求224所述的方法,其进一步包括将第四细胞类型涂铺于所述容器的表面或所述多孔膜的第一或第二表面上,将第四细胞类型悬浮于所述上部容积内的所述培养基中,或将第四细胞类型悬浮于所述下部容积内的所述培养基中。
226.如权利要求225所述的方法,其进一步包括将第五细胞类型涂铺于所述容器的表面或所述多孔膜的第一或第二表面上,将第五细胞类型悬浮于所述上部容积内的所述培养基中,或将第五细胞类型悬浮于所述下部容积内的所述培养基中。
227.如权利要求224、225或226所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型包括原代细胞。
228.如权利要求227所述的方法,其中所述原代细胞包括从干细胞或干细胞样细胞衍生的细胞谱系。
229.如权利要求228所述的方法,其中所述原代细胞包括从干细胞衍生的细胞谱系,所述细胞谱系从包括成人干细胞、胚胎干细胞、可诱导多能干细胞或骨髓衍生干细胞的干细胞来衍生。
230.如权利要求229所述的方法,其中从干细胞衍生的所述细胞谱系包括内皮细胞、平滑肌细胞、心脏肌细胞、肝细胞、神经元细胞、内分泌细胞、胰腺β-细胞、胰腺α-细胞或骨骼肌细胞。
231.如权利要求227或228所述的方法,其中所述原代细胞包括来自具有病理性病况的受试者的可诱导多能干细胞(iPSC)衍生细胞。
232.如权利要求231所述的方法,其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生细胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生肝细胞:家族性高胆固醇血症、糖原贮积病类型I、威尔逊氏病、A1抗胰蛋白酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征、渐进性家族性遗传性胆汁淤积或遗传性酪氨酸血症类型1。
233.如权利要求232所述的方法,其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生细胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生血管细胞:哈钦森-吉尔福特早衰症、威廉姆斯-博伊伦综合征、法布里氏病、苏萨克氏综合征、全身毛细管渗漏综合征、格菜克综合征、血管内乳突状内皮增生、镰状细胞疾病或肝静脉闭塞疾病。
234.如权利要求233所述的方法,其中所述iPSC衍生血管细胞包括iPSC衍生平滑肌细胞、iPSC衍生内皮细胞或iPSC衍生心内膜细胞。
235.如权利要求224、225或226所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型包括永生细胞。
236.如权利要求227至235中任一项所述的方法,其中所述原代细胞或所述永生细胞包括从具有病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
237.如权利要求236所述的方法,其中所述原代细胞或所述永生细胞包括从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞,其中所述风险因素是吸烟、年龄、性别、种族、表观遗传印记、与所述病理性病况相关的已识别基因型、与所述病理性病况相关的已识别单核苷酸多态性、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肺动脉疾病、肺动脉高压、高脂血症、家族性高胆固醇血症、外周动脉疾病、深静脉血栓形成、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化或酒精诱导肝疾病。
238.如权利要求224至237中任一项所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型包括肾细胞、气道细胞、血脑屏障细胞、血管细胞、肝细胞、胰腺细胞、心脏细胞、肌肉细胞、脾细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞或造血细胞。
239.如权利要求224至237中任一项所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型包括星形细胞、内皮细胞、肾小球有孔内皮细胞、肾上皮足细胞、α细胞、β-细胞、δ细胞、胰多肽(PP)细胞、ε细胞、神经胶质细胞、肝细胞、神经元、非实质肝细胞、足细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、周细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、白细胞、单核细胞、肌细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T-细胞、B-细胞、内皮祖细胞、干细胞、循环干细胞或循环造血细胞。
240.如权利要求239所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型包括所述非实质肝细胞,所述非实质肝细胞包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞或库柏法细胞。
241.如权利要求224至237中任一项所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型包括内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞或肝窦内皮细胞。
242.如权利要求224至241中任一项所述的方法,其中所述第三、第四或第五细胞类型是动物细胞类型。
243.如权利要求242所述的方法,其中所述动物细胞类型是人细胞类型。
244.如权利要求243所述的方法,其中所述人细胞类型基于年龄、性别、种族、表现遗传学、疾病、民族性或存在或不存在一个或多个单核苷酸多态性来选择。
245.如权利要求224至244中任一项所述的方法,其中所述第三细胞类型的细胞、所述第四细胞类型的细胞或所述第五细胞类型的细胞附着至所述容器的底部表面。
246.如权利要求1至245中任一项所述的方法,所述方法进一步包括针对以下项目来分析所述细胞培养基:细胞因子分泌、趋化因子分泌、体液因子分泌、微粒分泌、生长因子分泌、蛋白质从细胞表面脱落、化合物的代谢物、免疫细胞、氮氧化物分泌、血管舒张蛋白质、血管收缩蛋白质、miRNA、分泌蛋白质或分泌生物物质。
247.如权利要求246所述的方法,其中所述细胞培养基针对蛋白质从所述细胞表面的脱落来进行分析,并且所述蛋白质包括血管细胞粘附分子(VCAM)、E-选择素或细胞内粘附分子(ICAM)。
248.如权利要求246所述的方法,其中所述细胞培养基通过测量硝酸盐或亚硝酸盐浓度来针对氮氧化物分泌来进行分析。
249.如权利要求1至248中任一项所述的方法,其进一步包括培养所述细胞类型、细胞类型或肝细胞的步骤。
250.如权利要求2、4至27和31至249中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:
将在所述培养基包括所述药物或所述化合物时,施加所述剪切力一段时间之后的至少一种细胞类型与在所述培养基不包括所述药物或所述化合物时,施加所述剪切力所述一段时间之后的所述至少一种细胞类型进行比较,以确定所述药物或化合物对于所述至少一种细胞类型的效应。
251.如权利要求124至130和134至249中任一项所述的方法,其中所述受试者是动
物。
252.如权利要求251所述的方法,其中所述动物是基因修饰动物。
253.如权利要求251所述的方法,其中所述动物是人。
254.如权利要求3至7、9至13、15至21、28至40、52至63、68至73、121至133、136至
2
210和213至253中任一项所述的方法,其中所述剪切力以约0.1 dyne/cm 至约3.0 dyne/
2
cm 的速率来施加。
2
255.如权利要求254所述的方法,其中所述剪切力以约0.2dyne/cm 至约2.5 dyne/
2
cm 的速率来施加。
2
256.如权利要求254所述的方法,其中所述剪切力以约0.3dyne/cm 至约1.0 dyne/
2
cm 的速率来施加。
2
257.如权利要求254所述的方法,其中所述剪切力以约0.4dyne/cm 至约0.8 dyne/
2
cm 的速率来施加。
2
258.如权利要求254所述的方法,其中所述剪切力以约0.6dyne/cm 的速率来施加。
2
259.如权利要求254所述的方法,其中所述剪切力以约2.0dyne/cm 的速率来施加。

说明书全文

病理或生理性病况的体外模型

技术领域

[0001] 本发明总体上涉及模拟体内病理或生理性病况的体外方法。本发明也涉及在这类系统中测试药物或化合物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 病理或生理性病况的常规体外模型总体上涉及在静态条件下培养一种或多种细胞类型。然而,这类模型通常需要添加比在体内病理或生理性病况下观察到的浓度高得多的浓度下的一种或多种因子。举例来说,为了在静态组织培养物中保持肝细胞,胰岛素和葡萄糖必须以显著高于在健康个体体内观察到的浓度的浓度添加至培养基(对于葡萄糖,大约2至4倍,并且对于胰岛素,约10,000倍至40,000倍)。类似地,在用于将血栓形成建模的内皮细胞的常规静态单一培养物中,需要与在人循环血液中观察到的平相比显著较高水平的TNFα来诱导纤维蛋白沉积。
[0004] 此外,对于在体内诱导响应的浓度下的药物或化合物,常规系统经常不展现响应,而是需要高得多浓度的药物或化合物来诱导相同响应。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明的一方面涉及在体外模拟病理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流动。培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0007] 本发明的另一个方面是测试药物或化合物对于病理性病况的效应的体外方法。所述方法包括模拟病理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物对于病理性病况具有效应。在此测试药物或化合物的体外方法中,病理性病况可通过如上所述的模拟病理性病况的体外方法来模拟。
[0008] 本发明也提供测试药物或化合物的效应的体外方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。培养基中的药物或化合物的浓度在体内实现此效应的药物或化合物的浓度范围内。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内所暴露的流动。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物具有效应。效应可为例如对于生理性病况的效应或对于病理性病况的效应。
[0009] 本发明的另一个方面是在体外模拟生理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流动。培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0010] 本发明也涉及测试药物或化合物对于生理性病况的效应的体外方法。所述方法包括模拟生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物对于生理性病况具有效应。在此测试药物或化合物的体外方法中,生理性病况可通过如上所述的模拟生理性病况的体外方法来模拟。
[0011] 本发明的另一个方面是在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种肝细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案,培养基中的因子的浓度在剪切力下能够保持在体外模拟的病理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不能保持在体外模拟的病理性病况一段时间。模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案,培养基中的因子的浓度在剪切力下能够保持在体外模拟的生理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不能保持在体外模拟的生理性病况一段时间。
[0012] 本发明也提供测试药物或化合物对于病理或生理性病况的效应的体外方法。所述方法包括模拟病理或生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺肝细胞类型的变化指示药物或化合物对于病理或生理性病况具有效应。在此测试药物或化合物的体外方法中,病理性病况可通过如在前一段落中所描述的模拟病理或生理性病况的体外方法来模拟。
[0013] 本发明的另一个方面涉及在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种细胞外基质组分沉积在细胞培养容器内的表面上、将肝细胞涂铺在至少一种细胞外基质组分上并且间接地对于至少一种细胞外基质组分和肝细胞施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟肝细胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。
[0014] 本发明也提供在体外模拟肝的病理或生理性病况的另一种方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器并且将肝细胞涂铺在多孔膜的第一表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在容器内界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面,剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟肝细胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。自喷设备包括适于定位于容器的上部容积中的培养基中的主体和适于使主体旋转的电动机
[0015] 附图简述
[0016] 图1A描绘在静态培养条件下执行的血栓形成测定的示例性方案。
[0017] 图1B和1C展示在静态培养条件下执行的血栓形成测定的示例性荧光显微术结果。
[0018] 图2A示出将动脉粥样硬化易发性(atheroprone)或动脉粥样硬化预防性(atheroprotective)血液动力学流动施加至内皮细胞和平滑肌细胞的共培养物的示例性方案。
[0019] 图2B展示在动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性血液动力学流动条件下生长的内皮细胞和平滑肌细胞中,与血栓形成相关的基因的基因表达的示例性热图。
[0020] 图3A展示在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性方案。
[0021] 图3B展示在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性荧光显微术结果。
[0022] 图4A描绘在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性方案,其中在血形成期间持续施加剪切应力
[0023] 图4B描绘在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性荧光显微术结果,其中在血块形成期间持续施加剪切应力
[0024] 图5展示测定方案,其中内皮细胞与平滑肌细胞的共培养物经受血液动力学预调节,随后用一种或多种因子处理。
[0025] 图6A-F描绘使用oxLDL的测定的示例性基因表达数据。
[0026] 图7A-E示出响应于oxLDL的基因表达的变化。
[0027] 图8描绘展示响应于oxLDL的NFκB活性的示例性数据。
[0028] 图9展示用oxLDL处理的细胞的示例性差异基因调控数据。
[0029] 图10展示显示响应于TNFα的基因表达的示例性数据。
[0030] 图11A-B展示响应于用oxLDL和TNFα处理的示例性基因表达数据。
[0031] 图12A-C描绘展示响应于用葡萄糖和TNFα处理的NFκB活性和涉及炎症信号转导的基因表达变化的示例性数据。
[0032] 图13A-B展示在血液动力学条件下用血管紧张素II处理的内皮细胞和平滑肌细胞的示例性基因阵列数据。
[0033] 图14A-B展示在血液动力学条件下用处理的内皮细胞和平滑肌细胞的示例性基因阵列数据。
[0034] 图15A是肝窦的示意图。
[0035] 图15B描绘锥板式设备和将间接剪切力施加至肝细胞。
[0036] 图15C描绘体外肝模型中的肝细胞的涂铺配置。
[0037] 图16A-F是在静态条件下或在受控血液动力学存在下培养的肝细胞的示例性荧光显微术图像。
[0038] 图17A是在受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性荧光显微术图像。
[0039] 图17B是体内肝的示例性荧光显微术图像。
[0040] 图17C展示在受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性透射电子显微术图像。
[0041] 图18A-B展示在静态条件或受控血液动力学下培养的肝细胞的尿素和白蛋白分泌的示例性数据。
[0042] 图19A-D展示在静态条件或受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性代谢基因表达数据。
[0043] 图20A-B展示在静态条件或受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性细胞色素p450活性数据。
[0044] 图20C是在受控血液动力学下培养的肝细胞中的转运蛋白活性的测定的示例性荧光显微术图像。
[0045] 图21展示体外脂肪肝模型的示例性基因表达数据。
[0046] 图22展示体外脂肪肝模型的示例性基因表达数据。
[0047] 图23是安装在细胞培养皿上并且固定流入和流出导管以灌注上部和下部容积的夹具的透视图。
[0048] 图24展示细胞培养容器内的内皮细胞和平滑肌细胞的示例性涂铺配置。
[0049] 图25A-B展示在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性荧光显微术图像。
[0050] 图26展示高葡萄糖/高胰岛素条件下培养的大鼠肝细胞的透射电子显微术图像。
[0051] 图27A-B展示测量在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的总脂质和总甘油三酯的测定的示例性结果。
[0052] 图28A-B展示在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性基因表达数据。
[0053] 图29A-B提供在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性代谢基因表达数据和细胞色素p450活性数据。
[0054] 图30A-3C展示在健康条件下或在存在或不存在吡格列酮时在模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性荧光显微术图像。
[0055] 图31提供测量在健康条件下或在存在或不存在吡格列酮时在模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的总甘油三酯的测定的示例性结果。
[0056] 图32提供在健康条件下或在存在或不存在吡格列酮时在模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性代谢基因表达数据。
[0057] 图33展示在苯巴比妥或利福平的存在下、在受控血液动力学条件或静态条件下培养的肝细胞的示例性细胞色素活性数据。
[0058] 图34A提供展示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞对于体内血浆C最大浓度下的氯丙嗪的毒性响应的示例性荧光显微术图像。
[0059] 图34B提供展示在受控血液动力学或静态条件下培养并且暴露于变化浓度的氯丙嗪的肝细胞的毒性剂量响应的示例性数据。
[0060] 图35提供展示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞中,响应于氯丙嗪的化应激相关毒性基因(图35A)和代谢基因(图35B)的上调的示例性数据。
[0061] 图36展示在受控血液动力学或静态条件下培养的肝细胞中,通过响应于氯丙嗪的miRNA122的释放来测量的示例性急性毒性数据。
[0062] 图37提供展示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞中,响应于用曲格列酮处理的亚致死毒性和胆汁淤积变化的示例性荧光显微术图像。
[0063] 图38展示显示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞中,响应于用曲格列酮处理的氧化应激相关基因和MRP3和MRP4基因的上调的示例性数据。
[0064] 图39A提供展示在受控血液动力学条件下培养的犬肝细胞中的极化形态的保留的示例性荧光显微术图像。
[0065] 图39B展示显示在受控血液动力学条件或静态条件下培养的犬肝细胞中的CYP1A1和CYP3A1的表达的示例性基因表达数据。
[0066] 图40提供展示在受控血液动力学条件下培养的来自可诱导多能干细胞(iPSC)的肝细胞的极化形态的保留的示例性荧光显微术图像。
[0067] 图41展示显示在受控血液动力学条件下培养的来自iPSC的肝细胞中的代谢基因和分化基因的表达的示例性基因表达数据。
[0068] 在整个附图中对应的参考字符指示对应的部分。
[0069] 优选实施方案的描述
[0070] 本发明提供模拟体内病理或生理性病况的外方法。不同于目前由药物和生物制药行业用作标准体外模型的静态模型,本发明方法将剪切力施加至培养细胞并且使用体内病理或生理浓度的各种因子来复制体内病理或生理性病况。举例来说,已经发现体外肝模型,其中肝细胞可保持在与标准静态模型中使用的浓度相比显著较低的胰岛素和葡萄糖的体内生理浓度下。进一步发现当在这类模型中使用较高浓度的胰岛素和葡萄糖时,肝细胞展现脂肪肝疾病的许多标志。
[0071] 本发明也涉及在体外模拟病理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流动。
[0072] 培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0073] 为了证实体内病理性病况得到模拟,病理性病况的标记物的水平的变化可在本发明的方法与不存在施加剪切力的相同方法之间进行比较。将在施加剪切力后的至少一种涂铺细胞类型或培养基中的标记物的水平与不存在施加剪切力的至少一种涂铺细胞类型或培养基中的标记物的水平进行比较。举例来说,如果已知标记物与病理性病况相关联并且已知其在血清中的浓度当所述条件在体内存在时会增加,那么与不存在施加剪切力的培养基中的标记物的水平相比,施加剪切力的本发明方法的培养基中的标记物的水平增加证实体内病理性病况通过本发明的体外方法来模拟。
[0074] 在描述本发明各种方法之后,用于本发明方法的病理性病况、对于病理性病况的效应、生理性病况、自喷设备、血液动力学模式、细胞类型和包括添加至细胞培养基的因子的细胞培养基在以下详细描述。
[0075] 本发明也涉及测试药物或化合物对于病理性病况的效应的体外方法。所述方法包括模拟病理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物对于病理性病况具有效应。
[0076] 在此测试药物或化合物的体外方法中,病理性病况可通过如上所述的模拟病理性病况的体外方法来模拟。
[0077] 测试药物或化合物的体外方法的病理性病况也可通过涂铺来自具有病理性病况的一个或多个受试者的原代细胞或永生细胞,并且在细胞培养基中培养细胞来模拟。
[0078] 本发明也涉及在体外模拟病理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流动。
[0079] 培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0080] 为了证实体内生理性病况得到模拟,生理性病况的标记物的水平的变化可在本发明的方法与不存在施加剪切力的相同方法之间进行比较。将在施加剪切力后的至少一种涂铺细胞类型或培养基中的标记物的水平与不存在施加剪切力的至少一种涂铺细胞类型或培养基中的标记物的水平进行比较。举例来说,如果已知标记物与生理性病况相关联并且已知其在血清中的浓度当所述条件在体内存在时会增加,那么与不存在施加剪切力的培养基中的标记物的水平相比,施加剪切力的本发明方法的培养基中的标记物的水平增加证实体内生理性病况通过本发明的体外方法来模拟。
[0081] 本发明也涉及测试药物或化合物对于生理性病况的效应的体外方法。所述方法包括模拟生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物对于生理性病况具有效应。
[0082] 在此测试药物或化合物的体外方法中,生理性病况可通过如上所述的模拟生理性病况的体外方法来模拟。
[0083] 测试药物或化合物的此体外方法的生理性病况也可通过涂铺原代细胞或永生细胞,并且在细胞培养基中培养细胞来模拟。原代或永生细胞在以下详细描述。
[0084] 本发明也涉及测试药物或化合物的效应的体外方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。培养基中的药物或化合物的浓度在体内实现此效应的药物或化合物的浓度范围内。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内所暴露的流动。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物具有效应。
[0085] 效应可为对于病理性病况的效应。或者,效应可为对于生理性病况的效应。其它效应在以下详细描述。
[0086] 在任何本发明方法中,所述方法可进一步包括针对以下项目来分析细胞培养基:细胞因子分泌、趋化因子分泌、体液因子分泌、微粒分泌、生长因子分泌、蛋白质从细胞表面脱落、化合物的代谢物、免疫细胞、氮氧化物分泌、血管舒张蛋白质、血管收缩蛋白质、miRNA、分泌蛋白质或分泌生物物质。细胞培养基可通过测量硝酸盐或亚硝酸盐浓度来针对氮氧化物分泌来进行分析。
[0087] 当细胞培养基针对蛋白质从细胞表面脱落来进行分析时,蛋白质可包括血管细胞粘附分子(VCAM)、E-选择素或细胞内粘附分子(ICAM)。
[0088] 在任何本发明方法中,所述方法可进一步包括培养一种或多种细胞类型的步骤。
[0089] 在其中药物或化合物添加至培养基的任何本发明方法中,所述方法可进一步包括以下步骤:将在培养基包括药物或化合物时,施加剪切力一段时间之后的至少一种细胞类型与在培养基不包括药物或化合物时,施加剪切力一段时间之后的至少一种细胞类型进行比较,以确定药物或化合物对于至少一种细胞类型的效应。
[0090] 体外肝模型
[0091] 当测试药物或化合物对于健康肝的效应时,因子包括胰岛素和葡萄糖,将肝细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上,并且将剪切力间接地施加至涂铺肝细胞。
[0092] 举例来说,肝细胞可涂铺于多孔膜的第一表面上。然后,将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定下部容积和上部容积。下部容积包括肝细胞并且上部容积包括多孔膜的第二表面。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面。
[0093] 在任何本发明方法中,在涂铺细胞中,优选使用悬浮于细胞培养容器中的多孔膜。当剪切力施加涂铺细胞或多孔膜的表面时(例如,当剪切施加至不存在涂铺细胞的膜的表面时),剪切力可使得细胞培养基从上部容积灌注至下部容积。这类灌注有利地影响因子从上部容积运输至下部容积,或反之亦然。
[0094] 本发明也涉及在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种肝细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。
[0095] 在此方法中,模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,在此方法中,模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案,在此方法中,模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度在剪切力下能够保持在体外模拟的病理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不能保持在体外模拟的病理性病况一段时间。
[0096] 在此方法中,模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者,在此方法中,模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案,在此方法中,模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度在剪切力下能够保持在体外模拟的生理性病况一段时间,相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不能保持在体外模拟的生理性病况一段时间。
[0097] 在此方法中,如与不存在施加剪切力时的至少一种涂铺肝细胞类型或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的至少一种涂铺肝细胞类型或培养基中的病理或生理性病况的标记物的水平的变化证实病理或生理性病况得到模拟。
[0098] 或者,在此方法中,至少一种涂铺肝细胞类型可包括肝细胞,并且在肝细胞中的对于胰高血糖素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实生理性病况得到模拟。葡萄糖底物可为例如甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其组合(例如,乳酸酯与丙酮酸酯的组合)。
[0099] 本发明也涉及测试药物或化合物对于病理或生理性病况的效应的体外方法。所述方法包括模拟病理或生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下,至少一种涂铺肝细胞类型的变化指示药物或化合物对于病理或生理性病况具有效应。
[0100] 在此测试药物或化合物的体外方法中,病理性病况可通过如上所述的模拟病理或生理性病况的体外方法来模拟。
[0101] 测试药物或化合物的体外方法的病理或生理性病况也可通过涂铺来自具有病理性病况的一个或多个受试者的原代细胞或永生细胞,并且在细胞培养基中培养细胞来模拟。
[0102] 本发明也涉及在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种细胞外基质组分沉积在细胞培养容器内的表面上、将肝细胞涂铺在至少一种细胞外基质组分上并且间接地对于至少一种细胞外基质组分和肝细胞施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟肝细胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。
[0103] 在肝细胞涂铺于多孔膜上的本发明方法中,至少一种细胞外基质组分可涂铺于多孔膜的第一表面上并且肝细胞可随后涂铺于至少一种细胞外基质组分上。任选地,非实质肝细胞(例如,肝窦内皮细胞)可涂铺于多孔膜的第二表面上,并且剪切应力施加至非实质肝细胞。
[0104] 在涉及沉积例如细胞外基质组分的本发明方法中,至少一种细胞外基质组分可沉积于多孔膜的第一表面上。肝细胞类型(例如,肝细胞)随后涂铺于至少一种细胞外基质组分上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定下部容积和上部容积。下部容积包含至少一种细胞外基质组分和肝细胞类型(例如,肝细胞),并且上部容积包含多孔膜的第二表面。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地,非实质肝细胞(例如,肝窦内皮细胞)可涂铺于多孔膜的第二表面上,并且剪切应力施加至非实质肝细胞。
[0105] 本发明也提供在体外模拟肝的病理或生理性病况的另一种方法。所述方法包括将培养基添加至细胞培养容器并且将肝细胞涂铺在多孔膜的第一表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在容器内界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面,剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟肝细胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。自喷设备包括适于定位于容器的上部容积中的培养基中的主体和适于使主体旋转的电动机。优选地,主体具有锥形表面。也优选自喷设备适于将主体的锥形表面定位于容器中并且与细胞培养基接触
[0106] 此方法可进一步包括将非实质肝细胞涂铺于多孔膜的第二表面上,其中剪切应力施加至非实质肝细胞。非实质肝细胞可包括肝窦内皮细胞、肝星形细胞、库柏法细胞或其组合。
[0107] 在模拟肝的病理或生理性病况的体外方法中,病理或生理性病况的标记物的水平的变化可在本发明方法中与不存在施加剪切力的相同方法相比较。如与不存在施加剪切力的肝细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的肝细胞或培养基中的任何一个的标记物的水平的变化证实病理或生理性病况得到模拟。举例来说,如与不存在施加剪切力的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平的变化证实病理或生理性病况得到模拟。
[0108] 或者,当至少一种涂铺肝细胞类型包括肝细胞时,在肝细胞中的对于胰高血糖素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实生理性病况得到模拟。葡萄糖底物可为例如甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其组合(例如,乳酸酯与丙酮酸酯的组合)。
[0109] 病理性病况和相关因子
[0110] 病理性病况包括但不限于晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、纤维化、慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成(例如深静脉血栓形成)、血管再狭窄、血管化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
[0111] 病理性病况可包括解剖学病况,如萎缩、结石、迷芽瘤、病理性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器(例如,左心)。
[0112] 对于血管病理性病况,内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞可涂铺于细胞培养容器内的表面上,并且剪切力施加于涂铺内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞上。
[0113] 对于血管病理性病况,因子可包括氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、葡萄糖、组织生长因子-β(TGF-β)、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、维生素D、无机磷酸盐、瘦蛋白、脂肪连接蛋白、爱帕琳肽、醛固酮、血管紧张素II、甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)、氧化高密度脂蛋白(oxHDL)、富含甘油三酯的脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)、胰岛素、脂肪酸或其组合。
[0114] 富含甘油三酯的脂蛋白可包括极低密度脂蛋白(vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒或乳糜微粒残余。
[0115] 对于其中使用多孔膜的血管病理性病况,心内膜细胞可涂铺于多孔膜的第一表面上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含心内膜细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地,内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上,并且剪切力施加于涂铺内皮细胞上。
[0116] 心内膜细胞可包括平滑肌细胞。
[0117] 当血管病理性病况是心房纤维性颤动,或心房纤维性颤动和相关联高血压时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞、心内膜细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;内皮和平滑肌;心内膜;或心内膜和内皮。
[0118] 对于血管病理性病况如心房纤维性颤动,或心房纤维性颤动和相关联高血压,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者、年老受试者或基因修饰以将糖尿病、高血压或老化建模的动物。
[0119] 当血管病理性病况是心房纤维性颤动,或心房纤维性颤动和相关联高血压时,流动或血液动力学模式可从心脏窦或心房纤维性颤动节律获得。
[0120] 当血管病理性病况是心房纤维性颤动,或心房纤维性颤动和相关联高血压时,因子可包括oxLDL、TNFα、醛固酮、血管紧张素II或其组合。举例来说,因子可包括oxLDL;TNFα;oxLDL和TNFα;醛固酮;血管紧张素II;醛固酮和血管紧张素II;oxLDL、TNFα和血管紧张素II;oxLDL、TNFα和醛固酮;或oxLDL、TNFα、醛固酮和血管紧张素II。
[0121] 对于其中使用多孔膜的血管病理性病况,平滑肌细胞可涂铺于多孔膜的第一表面上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含平滑肌细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地,内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。
[0122] 对于其中使用多孔膜的血管病理性病况,内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含内皮细胞的上部容积。剪切力施加至上部容积中的内皮细胞。任选地,平滑肌细胞可涂铺于多孔膜的第一表面上。
[0123] 当血管病理性病况是晚期炎症,如动脉粥样硬化时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0124] 当血管病理性病况是晚期炎症,如动脉粥样硬化时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0125] 当血管病理性病况是晚期炎症,如动脉粥样硬化时,流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性(即,本文中也描述为“健康状态”)、从股动脉获得或从小动脉获得。
[0126] 当血管病理性病况是晚期炎症如动脉粥样硬化时,因子可包括LDL、oxLDL、TNFα、HDL、富含甘油三酯的脂蛋白或其组合。举例来说,因子可包括LDL;LDL和oxLDL;oxLDL;HDL;HDL和oxLDL;TNFα;TNFα和oxLDL;TNFα、oxLDL和HDL;或TNFα、oxLDL和富含甘油三酯的脂蛋白。
[0127] 当血管病理性病况是晚期炎症,如高甘油三酯血症时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0128] 当血管病理性病况是晚期炎症,如高甘油三酯血症时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0129] 当血管病理性病况是晚期炎症,如高甘油三酯血症时,流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
[0130] 当血管病理性病况是晚期炎症如高甘油三酯血症时,因子可包括富含甘油三酯的脂蛋白。
[0131] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0132] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者、吸烟者、患有腹主动脉瘤的受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模或修饰以将腹主动脉瘤建模的动物。
[0133] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时,流动或血液动力学模式可从腹动脉获得或从腹内主动脉瘤节律获得。
[0134] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时,因子可包括oxLDL、TNFα、葡萄糖、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、血管紧张素II、醛固酮、胰岛素、TGF-β或其组合。举例来说,因子可为oxLDL;TNFα;葡萄糖;弹性蛋白降解产物;弹性蛋白酶;血管紧张素II;醛固酮;胰岛素;TGF-β;oxLDL和TNFα;oxLDL和葡萄糖;oxLDL和弹性蛋白降解产物;oxLDL和弹性蛋白酶;oxLDL和血管紧张素II;oxLDL和醛固酮;oxLDL和胰岛素;oxLDL和TGF-β;
TNFα和葡萄糖;TNFα和弹性蛋白降解产物;TNFα和弹性蛋白酶;TNFα和血管紧张素II;TNFα和醛固酮;TNFα和胰岛素;TNFα和TGF-β;葡萄糖和弹性蛋白降解产物;葡萄糖和弹性蛋白酶;葡萄糖和血管紧张素II;葡萄糖和醛固酮;葡萄糖和胰岛素;葡萄糖和TGF-β;弹性蛋白降解产物和弹性蛋白酶;弹性蛋白降解产物和血管紧张素II;弹性蛋白降解产物和醛固酮;弹性蛋白降解产物和胰岛素;弹性蛋白降解产物和TGF-β;弹性蛋白酶和血管紧张素II;弹性蛋白酶和醛固酮;弹性蛋白酶和胰岛素;弹性蛋白酶和TGF-β;
血管紧张素II和醛固酮;血管紧张素II和胰岛素;血管紧张素II和TGF-β;醛固酮和胰岛素;醛固酮和TGF-β;胰岛素和TGF-β;oxLDL、TNFα和葡萄糖;oxLDL、TNFα和弹性蛋白降解产物;oxLDL、TNFα和弹性蛋白酶;oxLDL、TNFα和血管紧张素II;oxLDL、TNFα和醛固酮;oxLDL、TNFα和胰岛素;oxLDL、TNFα和TGF-β;TNFα、葡萄糖和弹性蛋白降解产物;TNFα、葡萄糖和弹性蛋白酶;TNFα、葡萄糖和血管紧张素II;TNFα、葡萄糖和醛固酮;
TNFα、葡萄糖和胰岛素;TNFα、葡萄糖和TGF-β等。
[0135] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时,烟提取物可添加至培养基。
[0136] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况,如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或糖尿病性视网膜病时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0137] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况,如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或糖尿病性视网膜病时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者或基因修饰以将糖尿病建模的动物。
[0138] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况,如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或糖尿病性视网膜病时,流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
[0139] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况,如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或糖尿病性视网膜病时,因子可包括oxLDL、TNFα、葡萄糖、HDL、oxHDL、富含甘油三酯的脂蛋白、胰岛素或其组合。举例来说,因子可包括葡萄糖;葡萄糖和胰岛素;葡萄糖、oxLDL和TNFα;葡萄糖、胰岛素、oxLDL和TNFα;葡萄糖、oxLDL、TNFα和HDL;葡萄糖、oxLDL、TNFα和oxHDL;葡萄糖、oxLDL、TNFα、HDL和oxHDL;葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNFα和HDL;葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNFα和oxHDL;葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNFα、HDL和oxHDL;葡萄糖、oxLDL、TNFα和富含甘油三酯的脂蛋白;或葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNFα和富含甘油三酯的脂蛋白。
[0140] 当血管病理性病况是高血压时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0141] 当血管病理性病况是高血压时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0142] 当血管病理性病况是高血压时,流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
[0143] 当血管病理性病况是高血压时,因子可包括oxLDL、TNFα、血管紧张素II、醛固酮或其组合。举例来说,因子可包括血管紧张素II;醛固酮;血管紧张素II和醛固酮;或血管紧张素II、醛固酮、oxLDL和TNFα。
[0144] 当血管病理性病况是动脉钙化时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0145] 当血管病理性病况是动脉钙化时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0146] 当血管病理性病况是动脉钙化时,流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
[0147] 当血管病理性病况是动脉钙化时,因子可包括oxLDL、TNFα、维生素D、无机磷酸、瘦蛋白、脂肪连接蛋白或其组合。举例来说,因子可包括oxLDL;TNFα;维生素D;无机磷酸;瘦蛋白;脂肪连接蛋白;oxLDL和TNFα;oxLDL和维生素D;oxLDL和无机磷酸;oxLDL和瘦蛋白;oxLDL和脂肪连接蛋白;TNFα和维生素D;TNFα和无机磷酸;TNFα和瘦蛋白;TNFα和脂肪连接蛋白;维生素D和无机磷酸;维生素D和瘦蛋白;维生素D和脂肪连接蛋白;无机磷酸和瘦蛋白;无机磷酸和脂肪连接蛋白;瘦蛋白和脂肪连接蛋白;oxLDL、TNFα和维生素D;oxLDL、TNFα和无机磷酸;oxLDL、TNFα和瘦蛋白;oxLDL、TNFα和脂肪连接蛋白;TNFα、维生素D和无机磷酸;TNFα、维生素D和瘦蛋白;TNFα、维生素D和脂肪连接蛋白等。
[0148] 当血管病理性病况是血栓形成时,细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地,细胞类型是内皮;平滑肌;或内皮和平滑肌。
[0149] 当血管病理性病况是血栓形成时,涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0150] 当血管病理性病况是血栓形成时,流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
[0151] 当血管病理性病况是血栓形成时,因子可包括TNFα、oxLDL、葡萄糖或其组合。举例来说,因子可包括TNFα;oxLDL;葡萄糖;或oxLDL和葡萄糖。
[0152] 当病理性病况是脂肪肝疾病时,细胞类型可包括肝细胞、非实质肝细胞或其组合。非实质肝细胞可包括肝窦内皮细胞、肝星形细胞、库柏法细胞或其组合。
[0153] 当血管病理性病况是脂肪肝疾病时,流动或血液动力学模式可来自正常受试者、患有脂肪肝疾病的受试者或基因修饰以将脂肪肝疾病建模的动物。
[0154] 当病理性病况是脂肪肝疾病并且使用多孔膜时,肝细胞可涂铺于多孔膜的第一表面上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地,非实质肝细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上,并且剪切力施加至上部容积中的非实质肝细胞。任选地,细胞外基质组分可沉积于多孔膜的第一表面上,并且随后肝细胞可涂铺于细胞外基质组分上。
[0155] 当病理性病况是脂肪肝疾病并且使用多孔膜时,非实质肝细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含非实质肝细胞的上部容积。剪切力施加至上部容积中的非实质肝细胞。任选地,细胞外基质组分可沉积于多孔膜的第一表面上,并且随后肝细胞可涂铺于细胞外基质组分上。
[0156] 当血管病理性病况是脂肪肝疾病时,因子可包括胰岛素、葡萄糖或其组合。举例来说,因子可包括胰岛素;葡萄糖;或胰岛素和葡萄糖。
[0157] 当病理性病况是糖尿病时,细胞类型可包括胰腺β-细胞、胰腺α-细胞或其组合;并且因子可包括胰岛素、葡萄糖或胰岛素和葡萄糖。
[0158] 生理性病况
[0159] 可在本发明方法中模拟的生理性病况包括对应于所感兴趣的任何病理性病况的生理性病况,这类病理性病况在本文中描述。举例来说,对应于脂肪肝疾病的生理性病况可为健康肝状态,并且对应于动脉粥样硬化的生理性病况可为动脉粥样硬化预防性状态。
[0160] 自喷设备
[0161] 剪切力可使用能够诱导培养基流动的任何合适自喷设备来施加,其中流动模拟所培养的一种或多种细胞类型在体内病理或生理性病况下暴露的流动。举例来说,自喷设备可为锥板式设备或平行板自喷设备。
[0162] 自 喷 设 备 可 为 大 致 上 如 美 国 专 利 号 7,811,782和Hastings等 人,Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming,AMERICAN J.PHYSIOLOGY&CELL PHYSIOLOGY 293:1824-33(2007)描述的锥板式设备,其内容各自通过引用并入本文。这类设备的实例描绘于图15B中。设备200包括接收一组电子指令的电子控制器、由电子控制器操作的电动机220,和可操作地连接至电动机以便由电动机驱动的剪切力施加器。剪切力施加器可包括连接至电动机的圆锥体230,并且圆锥体可直接由电动机驱动。电动机导致圆锥体在任一方向(顺时针或逆时针)旋转。
[0163] 锥板式设备容纳细胞培养容器,例如皮氏培养皿(例如,75-mm直径皮氏培养皿)。圆锥体适于配合于细胞培养容器内部。因此,例如,在适于与75-mm直径皮氏培养皿一起使用的设备中,圆锥体具有约71.4mm直径。圆锥体总体上具有较浅圆锥。举例来说,圆锥体的表面与皮氏培养皿的表面之间的角度为大约1°。
[0164] 当设备的圆锥体浸没于皮氏培养皿中的培养基中并且由电动机旋转时,圆锥体对于培养基施加旋转力,并且此进而将剪切力施加至细胞培养容器内涂铺的细胞或悬浮于细胞培养容器中的多孔膜的表面。
[0165] 锥板式设备也可包括牢固地保持细胞培养容器的底座。设备也可包括安装于皮氏培养皿上并且固定用于灌注上部和下部容积的流入和流出导管的夹具,如以下进一步描述。
[0166] 流动可由以前测量的血液动力学模式获得,并且可建模成一组电子指令。剪切力基于所述一组电子指令。自喷设备包括接收所述一组电子指令的电子控制器。电动机由电子控制器操作。可操作地连接至电动机的剪切力施加器由电动机驱动。优选地,剪切力施加器包括连接至电动机的圆锥体。
[0167] 自喷设备结合细胞培养容器来使用。细胞培养容器可包括细胞培养基、因子、药物、化合物和其它组分流入细胞培养容器以及从其中流出的入口和出口。
[0168] 自喷设备的入口和出口可通过夹具固定至细胞培养容器。图23描绘这类夹具。每个夹具由三个部分组成:主体1和两段细金属导管2和3,如23图中展示。夹具可通过螺钉4从外部固定至细胞培养皿一侧。举例来说,两个夹具可通过螺钉4从外部连接并且紧固至培养皿一侧,如图24A和B)展示。主体1由经过处理的不锈金属制成并且出于连接和接近目的,围绕培养皿的边缘成一定角度。将每个夹具的两段细金属导管(2和3)弯曲以便接近培养皿以有效地供应并抽吸培养基,而不阻碍圆锥体旋转。主体1的任一侧的定位螺丝5将金属导管2、3固定至主体并且将金属导管保持在适当位置以使得它延伸至培养基内的正确深度。然后,挠性导管在金属导管上滑动,其用于抽吸培养基(例如,经由示例设备中的机械蠕动,从来源瓶子中抽吸至培养皿)。
[0169] 图24A和24B展示定位于细胞培养容器中的夹具。在图24展示的配置中,悬浮的多孔膜悬浮于细胞培养容器中,仅内皮细胞(图24B)或内皮细胞和平滑肌细胞(图24A)涂铺于多孔膜的表面上。
[0170] 血液动力学模式
[0171] 血液动力学模式可从具有病理性病况或疾病促进性病况的一个或多个受试者获得。疾病促进性病况可包括萎缩、结石、迷芽瘤、病理性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器(例如,左心耳)。
[0172] 血液动力学模式可从动脉、小动脉、静脉、小静脉或器官的至少一部分获得。
[0173] 当血液动力学模式从动脉或小动脉的至少一部分获得时,动脉或小动脉可包括颈动脉、胸动脉、腹部动脉、肺动脉、股动脉、肾输出动脉、肾输入动脉、冠状动脉、肱动脉、乳房内动脉、大脑动脉、主动脉、毛细血管前小动脉、肝动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉、基底动脉、颈外动脉、颈内动脉、脊椎动脉、骨下动脉、主动脉弓、腋动脉、胸廓内动脉、鳃动脉、深鳃动脉、桡侧返动脉、腹壁上动脉、降主动脉、腹壁下动脉、骨间动脉、桡动脉、尺动脉、腕掌弓、腕背弓、掌浅弓或掌深弓、指动脉、降支旋股动脉、膝降动脉、膝上动脉、膝下动脉、胫前动脉、胫后动脉、腓动脉、足底深弓、弓状动脉、颈总动脉、肋间动脉、胃左或右动脉、腹腔干、脾动脉、肝总动脉、肠系膜上动脉、肾动脉、肠系膜下动脉、睾丸动脉、髂总动脉、髂内动脉、髂外动脉、旋股动脉、穿通支、股深动脉、腘动脉、跖背动脉或指背动脉。
[0174] 当血液动力学模式从静脉或小静脉的至少一部分获得时,静脉或小静脉可包括毛细管后小静脉、隐静脉、肝静脉、上腔静脉、下腔静脉、冠状静脉、心最小静脉(Thesbian vein)、浅静脉、交通静脉、全身静脉、肺静脉、颈静脉、乙状窦、颈外静脉、颈内静脉、甲状腺下静脉、锁骨下静脉、胸廓内静脉、腋静脉、头静脉、鳃静脉、肋间静脉、贵要静脉、肘正中静脉、胸腹壁静脉、尺静脉、前臂正中静脉、腹壁下静脉、掌深弓、掌浅弓、指掌侧静脉、心脏静脉、下腔静脉、肝静脉、肾静脉、腹部腔静脉、睾丸静脉、髂总静脉、穿通支、髂外静脉、骼内静脉、阴部外静脉、股深静脉、大隐静脉、股静脉、附隐静脉、膝上静脉、腘静脉、膝下静脉、大隐静脉、小隐静脉、胫骨前或后静脉、足底深静脉、足背静脉弓或指背静脉。
[0175] 当血液动力学模式从器官的至少一部分获得时,器官可包括肝、肾、肺、脑、胰腺、脾、大肠、小肠、心脏、骨骼肌、眼睛、舌头、生殖器或脐带。
[0176] 血液动力学模式可从声波数据的分析来获得。
[0177] 血液动力学模式可从磁共振成像(MRI)数据的分析来获得。
[0178] 流动或血液动力学模式可随时间变化。
[0179] 流动或血液动力学模式可从心腔、窦性节律期间的左心耳、心房纤维性颤动或心室纤维性颤动获得。
[0180] 当流动或血液动力学模式从心腔获得时,心腔可包括左心房、右心房、左心室或右心室。
[0181] 流动或血液动力学模式可由病理性病况导致的物理变化产生。
[0182] 流动或血液动力学模式可从以下受试者获得,其中如与不存在施用药物的受试者的流动或血液动力学模式相比,作为将药物施用至受试者的直接或间接效应,血液流动或血液动力学模式已经改变。
[0183] 流动或血液动力学模式可从动物,如基因修饰动物或人获得。优选地,模式从人获得。
[0184] 细胞类型
[0185] 用于本发明方法的细胞类型包括原代细胞和永生细胞。原代细胞或永生细胞可包括从具有病理或生理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0186] 用于涉及生理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞包括从具有生理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0187] 用于涉及病理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞可包括从具有病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0188] 用于涉及病理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞可包括从不具有病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从不具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞、从不具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、从不具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从不具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0189] 用于涉及病理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞可包括从具有不同病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有不同病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞或从具有与不同病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0190] 当从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离细胞时,风险因素可包括但是不限于吸烟、年龄、性别、种族、表观遗传印记、与病理性病况相关的已识别基因型、与病理性病况相关的已识别单核苷酸多态性、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肺动脉疾病、肺动脉高压、高脂血症、家族性高胆固醇血症、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成(例如深静脉血栓形成)、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维症、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化或酒精诱导肝疾病。
[0191] 原代细胞可包括从干细胞(例如,成人干细胞、胚胎干细胞、可诱导多能干细胞或骨髓衍生干细胞)或干细胞样细胞衍生的细胞谱系。从干细胞或干细胞样细胞衍生的细胞谱系可包括内皮细胞、平滑肌细胞、心脏肌细胞、肝细胞、神经元细胞、内分泌细胞、胰腺β-细胞、胰腺α-细胞或骨骼肌细胞。
[0192] 原代细胞可包括来自具有病理性病况的受试者的可诱导多能干细胞(iPSC)衍生细胞。举例来说,来自具有病理性病况的受试者的iPSC衍生细胞可包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生肝细胞:家族性高胆固醇血症、糖原贮积病类型I、威尔逊氏病(Wilson’s disease)、A1抗胰蛋白酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjar syndrome)、渐进性家族性遗传性胆汁淤积或遗传性酪酸血症型1。或者,来自具有病理性病况的受试者的iPSC衍生细胞可包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生血管细胞(例如,iPSC衍生平滑肌细胞、iPSC衍生内皮细胞或iPSC衍生心内膜细胞):哈钦森-吉尔福特早衰症(Hutchinson-Gilford progeria)、威廉姆斯-博伊伦综合征(Williams-Beuren syndrome)、法布里氏病(Fabry’s disease)、苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)、全身毛细管渗漏综合征、格莱克综合征(Gleich syndrome)、血管内乳突状内皮增生、镰状细胞疾病或肝静脉闭塞疾病。
[0193] 用于本发明方法中的细胞类型包括肾细胞、气道细胞、血脑屏障细胞、血管细胞、肝细胞、胰腺细胞、心脏细胞、肌肉细胞、脾细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞或造血细胞。
[0194] 用于方法中的具体细胞类型包括星形细胞、内皮细胞、肾小球有孔内皮细胞、肾上皮足细胞、α细胞、β-细胞、δ细胞、胰多肽(PP)细胞、ε细胞、神经胶质细胞、肝细胞、神经元、非实质肝细胞、足细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、周细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、白细胞、单核细胞、肌细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T-细胞、B-细胞、内皮祖细胞、干细胞、循环干细胞和循环造血细胞。非实质肝细胞包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞和库柏法细胞。优选地,特定细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肝窦内皮细胞或其组合。
[0195] 用于本发明方法中的细胞类型可为动物细胞类型,如来自基因修饰动物的细胞。动物细胞类型优选地是人细胞类型。人细胞类型可基于年龄、性别、种族、表现遗传学、疾病、民族性、存在或不存在一个或多个单核苷酸多态性、如本文描述的风险因素,或与病理或生理性病况相关的一些其它特性来选择。
[0196] 在本发明方法中施加的剪切力可间接地施加至至少一种涂铺细胞类型。
[0197] 在本发明方法中施加的剪切力可直接地施加至至少一种涂铺细胞类型。
[0198] 细胞类型、额外组分如细胞外基质组分和多孔膜在本发明方法中的培养基内(即,以培养基覆盖)。
[0199] 本发明方法可进一步包括针对由药物或化合物产生的毒性、炎症、渗透性、相容性、细胞粘附、细胞重构、细胞迁移或表型调节来分析至少一种细胞类型。
[0200] 细胞培养基
[0201] 标准细胞培养基可用于本发明方法中。
[0202] 添加至细胞培养基的因子
[0203] 可添加至细胞培养基的因子在整个说明书中结合相关联病理或生理性病况来描述。
[0204] 体内因子浓度
[0205] 因子的生理体内浓度以及确定这些体内浓度的方法在本领域中是熟知的。举例来说,健康人和患有动脉粥样硬化的人体内的HDL的相应体内浓度大于30mg/dl至200mg/dl,和少于30mg/dl,如由全血来确定。确定因子的体内浓度的方法可在美国药典和其它文献中获得。
[0206] 因子的所报告体内浓度范围可取决于以下因素来变化:用于确定范围的方法、获得因子的来源(例如,全血或血清)、患者的医学条件(即,是否患者具有病理性病况或生理性病况)和相对于正常睡眠和进食排程的当天时间。然而,本领域普通技术人员已知文献中所报告的体内生理浓度范围以外的浓度是使用为了确定浓度所报告的方法的体内病理浓度。同样地,低于文献中所报告的体内病理浓度范围的下端点或高于其上端点的浓度是使用为了确定浓度所报告的方法的体内生理浓度;是否体内生理浓度低于下端点或高于上端点取决于所述因子。举例来说,因子HDL的体内生理浓度高于范围的上端点,但是因子oxLDL的体内生理浓度低于范围的下端点,如本领域普通技术人员认识到。
[0207] 其它组分
[0208] 细胞外基质组分
[0209] 用于本发明方法中的细胞外基质组分可包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。胶原是优选细胞外基质组分,并且优选地是存在于针对具体病理或生理性病况来涂铺的一种或多种细胞类型的体内环境中的胶原类型。
[0210] 细胞外基质组分可由涂铺于细胞培养容器内的表面上的成纤维细胞、软骨细胞或成骨细胞来分泌。
[0211] 细胞外基质组分尤其适用于涉及肝的本发明方法中。
[0212] 药物或化合物
[0213] 药物或化合物可为抗炎症剂、抗肿瘤剂、抗糖尿病剂、蛋白激酶抑制剂、抗血栓形成剂、血栓溶解剂、抗血小板剂、抗凝血剂、钙通道阻滞剂、螯合剂、rho激酶抑制剂、抗高血脂剂、升高HDL的药剂、抗再狭窄剂、抗生素、免疫抑制剂、抗高血压剂、利尿剂、减食欲剂、食欲抑制剂、抗抑郁剂、精神抑制药、避孕药、拟钙剂(calcimimetic)、生物医药产品、多发性硬化疗法、止痛药、激素替代疗法、抗痉挛药或其组合。
[0214] 当药物是抗炎症剂时,抗炎症剂可包括类固醇(例如,泼尼松(prednisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(prednisolone)、倍他米松(betamethasone)或地塞米松(dexamethasone))、非类固醇抗炎症药物(NSAID)(例如,水杨酸盐如乙酰水杨酸、布洛芬、对乙酰氨基酚、普生(naproxen)、酮洛芬或双氯芬酸)、选择性环氧合酶抑制剂(例如,塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)或伐地考昔(valdecoxib))、非选择性环氧合酶抑制剂、免疫选择性抗炎症剂(例如,苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸三肽)或其组合。
[0215] 当药物包括抗肿瘤剂时,抗肿瘤剂可包括烷化剂(例如,顺铂、卡波铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或异环磷酰胺)、抗代谢物(例如,硫唑嘌呤或巯基嘌呤)、植物(例如,紫杉烷如紫杉醇或多西紫杉醇、长春花生物碱如长春新碱、长春碱,或长春地辛,或鬼臼毒素如依托泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide))、拓扑异构酶抑制剂(例如,伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)或安吖啶(amsacrine))、细胞毒性抗生素(例如,放线菌素、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamysin)、丝裂霉素、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)或利福平(rifampicin)),或其组合。
[0216] 当药物是抗糖尿病剂时,抗糖尿病剂可包括双胍(例如,二甲双胍(metformin))、噻唑烷二酮(例如,罗格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)或吡格列酮(pioglitazone))、磺酰脲(例如,甲苯胺丁脲(tolbutamine)、醋磺己脲(acetohexamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列吡嗪(glipazide)、格列本脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列齐特(gliclazide)、格吡嗪胺(glycopyramide)或格列喹酮(gliquidone))、肠促胰岛素模拟物(例如,伊森泰德(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)或他司鲁泰(taspoglutide))、二肽基肽酶IV抑制剂(例如,维达列汀(vildagliptin)、西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxaglitpin)、利拉利汀(linagliptin)、阿格列汀(alogliptin)或塞格立汀(septagliptin))、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(例如,达格列净(dapagliflozin)、坎格列净(canagliflozin)、帕列净(empagliflozin)、伊格列净(ipragliflozin)、瑞格列净(remogliflozin)或舍格列净(sergliflozin))、葡糖激酶活化剂(例如,匹瑞格汀(piragliatin))、氯茴苯酸(例如,瑞格列奈(repaglinide))、GPR40激动剂(例如,TAK-875)或胰高血糖素受体拮抗剂。
[0217] 抗糖尿病剂也可包括两种或更多种药物的组合。举例来说,抗糖尿病剂可包括噻唑烷二酮(例如,吡格列酮)与二甲双胍的组合;噻唑烷二酮(例如,吡格列酮)与格列美脲的组合;二肽基肽酶IV抑制剂(例如,西他列汀)与斯达汀(例如,辛伐他汀)的组合;或二肽基肽酶IV抑制剂(例如,西他列汀)与二甲双胍的组合。作为进一步实例,抗糖尿病剂可包括达格列净与二甲双胍的组合,或达格列净与沙格列汀的组合。
[0218] 当药物包括蛋白激酶抑制剂时,蛋白激酶抑制剂可包括丝氨酸/苏氨酸特异性激酶抑制剂、酪氨酸特异性激酶抑制剂(例如,伊马替尼(imatinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、阿西替尼(axitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、卢佐替尼(ruxolitinib)、索拉非尼(sorafenib)、费斯替尼(fostimatinib)、巴利替尼(baricitinib)或托法替尼(tofacitinib))、表皮生长因子(EGF)受体抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)受体抑制剂、血小板衍生生长因子(PDGF)受体抑制剂或血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂。
[0219] 当药物包括抗血栓形成剂时,抗血栓形成剂可包括双嘧达莫(dipyridamole)、尿激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、瑞替普酶(reteplase)、阿替普酶(alteplase)、链激酶、rt-PA、TNK-rt-PA、孟替普酶(monteplase)、葡萄球菌激酶、帕米普酶(pamiteplase)、未分级肝素或APSAC。
[0220] 当药物包括血栓溶解剂时,血栓溶解剂可包括链激酶、尿激酶或组织纤溶酶原活化剂。
[0221] 当药物包括抗血小板剂时,抗血小板剂可包括糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、凝血烷抑制剂、二磷酸腺苷受体抑制剂、前列腺素类似物或磷酸二酯酶抑制剂。举例来说,抗血小板剂可包括氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)、替罗非班(tirofiban)、奥波非班(orbofiban)、珍米洛非班(xemilofiban)、西拉非班(sibrafiban)、罗昔非班(roxifiban)或噻氯匹定(ticlopinin)。
[0222] 当药物包括抗凝血剂时,抗凝血剂可包括维生素K拮抗剂(例如,华法林(warfarin))、因子Xa抑制剂(例如,阿哌沙班(apixaban)、贝曲西班(betrixaban)、依杜沙班(edoxaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、磺达肝癸(fondaparinux)或艾屈肝素(idraparinux))、或直接凝血酶抑制剂(例如,水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)、达比加群(dabigatran)、希美加群(ximelagatran)、美拉加群(melagatran)或阿加曲班(argatroban))。
[0223] 当药物包括钙通道阻滞剂时,钙通道阻滞剂可包括维拉帕米(verapamil)、地尔硫卓(diltiazem)、氨氯地平(amlodipine)、阿雷地平(aranidipine)、阿折地 平 (azelnidipine)、巴 尼 地 平 (bamidipine)、贝 尼 地 平(benidipine)、西 尼地 平 (cilnidipine)、氯 维 地 平 (clevidipine)、伊 拉 地 平(isradipine)、依 福地平 (efonidipine)、非 洛 地平(felodipine)、拉 西 地平(lacidipine)、乐 卡地平(lercanidipine)、马 尼 地平(manidipine)、尼卡 地 平(nicardipine)、硝 苯地平(nifedipine)、尼 伐 地 平(nilvadipine)、尼 莫 地平 (nimodipine)、尼 索 地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)或普拉地平(pranidipine)。
[0224] 当药物包括螯合剂时,螯合剂可包括青霉胺、三乙烯四胺盐酸盐、EDTA、DMSA、甲磺酸去胺或巴马司他(batimastat)。
[0225] 当药物包括rho激酶抑制剂时,rho激酶抑制剂可包括Y27632。
[0226] 当药物包括抗高血脂剂时,抗高血脂剂可包括斯达汀(例如,阿托伐他汀(atorvastatin)、西伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐 他汀(mevastatin)、匹伐他 汀(pitavastatin)、普伐他 汀(pravastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)或辛伐他汀(simvastatin))、非诺贝特(fibrate)(例如,苯扎贝特(bezafibrate)、苯扎贝特酸(benzafibric acid)、环丙贝特(ciprofibrate)、环丙贝特酸(ciprofibric acid)、氯贝特(clofibrate)、氯贝酸(clofibric acid)、吉非贝齐(gemfibrozil)、非诺贝特(fenofibrate)或非诺贝酸(fenofibric acid))、膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂(例如,依折麦布(ezetimibe))、胆固醇酯转移蛋白抑制剂(例如,安塞曲匹(anacetrapib)、达塞曲匹(dalcetrapib)、托彻普(torcetrapib)或伊沃曲匹(evacetrapib))、前列腺素D2受体拮抗剂(例如,拉罗皮兰(laropiprant))、Ω-3-脂肪酸(例如,二十五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA))或降胆固醇剂(例如,烟酸)。
[0227] 抗高血脂剂也可包括两种或更多种药物的组合。举例来说,抗高血脂剂可包括烟酸与拉罗皮兰的组合或依折麦布与辛伐他汀的组合。
[0228] 当药物包括升高HDL的药剂,升高HDL的药剂可包括前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)的抑制剂,如AMG145。
[0229] 当药物包括抗再狭窄剂时,抗再狭窄剂可包括地塞米松噻氯匹定(dexamethasone ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、西罗莫司(sirolimus)、紫杉醇(paclitaxel)、佐他莫司(zotarolimus)、依维莫司(everolimus)或乌米莫司(umirolimus)。
[0230] 当药物包括抗生素时,抗生素可包括放线菌素-D。
[0231] 当药物包括免疫抑制剂时,免疫抑制剂可包括糖皮质激素、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、更生霉素、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素、环孢素、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、干扰素、英利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)或阿达木单抗(adalimumab)。
[0232] 当药物包括抗高血压剂时,抗高血压剂可包括β肾上腺素受体拮抗剂(例如,烯丙洛尔(alprenolol)、布新洛尔(bucindolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、拉贝洛尔(labetalol)、纳多洛尔(nadolol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutalol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)、索他洛尔(sotalol)、噻吗洛尔(timolol)、醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、比索洛尔(bisoprolol)、美托洛尔(metoprolol)或奈必洛尔(nebivolol))、血管紧张素II受体拮抗剂(例如,洛沙坦(losartan)、奥美沙坦(olmesartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)、厄贝沙坦(irbesartan)或阿齐沙坦(azilsartan))或血管紧张素转化酶抑制剂(例如,卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、喹那普利(quinapril)、佐芬普利(zofenopril)、咪达普利(imidapril)、贝那普利(benazepril)、群多普利(trandolapril)或雷米普利(ramipril))。
[0233] 当药物包括利尿剂时,利尿剂可包括呋塞米(furoseamide)、阿米洛利(amiloride)、螺内酯(spironolactone)或双氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)。
[0234] 当药物包括减食欲剂时,减食欲剂可包括苯丁胺(phentermine)、芬氟拉明(fenfluramine)、右芬氟拉明(dexfenfluramine)、西布曲明(sibutramine)、氯卡色林(lorcaserin)、托吡酯(topiramate)或其组合。
[0235] 当药物包括抗抑郁剂时,抗抑郁剂可包括丙米嗪(imipramine)、脱甲丙咪嗪(desipramine)、阿米替林(amitryptiline)、帕罗西汀(paroxetine)、西酞普兰(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)或依地普仑(escitalopram)。
[0236] 当药物包括精神抑制药时,精神抑制药可包括阿立哌唑(aripiprazole)、利培酮(risperidone)、奥氮平(olanzapine)、喹硫平(quetiapine)、卡利拉(cariprazine)、鲁拉西(lurasidone)或阿塞那平(asenapine)。
[0237] 当药物包括避孕药时,避孕药可包括β-雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮或屈螺酮。举例来说,避孕药可包括屈螺酮与乙炔基雌二醇的组合。
[0238] 当药物包括拟钙剂时,拟钙剂可包括西那卡塞(cinacalcet)。
[0239] 当药物包括生物医药产品时,生物医药产品可包括合成多糖,合成、部分合成或人源化免疫球蛋白,或重组治疗蛋白质。
[0240] 当药物包括多发性硬化疗法时,多发性硬化疗法可包括多发性硬化的口服疗法。举例来说,多发性硬化疗法可包括延胡索酸的甲酯(例如,延胡索酸单甲酯或延胡索酸二甲酯)、鞘氨醇-1-磷酸酯(S1P)受体激动剂(例如,芬戈莫德(fingolimod)),或免疫调节剂(例如,特立氟胺(teriflunomide)或拉喹莫德(laquinimod))。
[0241] 当药物包括止痛药时,止痛药可包括麻醉性止痛药(例如,丙氧芬(propoxyphene)、芬太尼(fentanyl)、吗啡(morphine),或吗啡代谢物如3-葡糖苷酸或吗啡6-葡糖苷酸)或阿片样肽(例如,强啡肽A)。
[0242] 当药物包括激素替代疗法时,激素替代疗法可包括偶联雌激素、β-雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮、屈螺酮,或睾酮。
[0243] 当药物包括抗痉挛药时,抗痉挛药可包括苯巴比妥(phenobarbital)。
[0244] 所述药物也可包括两种或更多种药物的组合。举例来说,药物可包括利尿剂与钙通道阻滞剂的组合(例如,双氢氯噻嗪与氨氯地平的组合);利尿剂与血管紧张素受体II拮抗剂的组合(例如,双氢氯噻嗪与洛沙坦的组合);利尿剂与β-肾上腺素受体拮抗剂的组合(例如,双氢氯噻嗪与普萘洛尔的组合);或利尿剂与血管紧张素转化酶抑制剂的组合(例如,双氢氯噻嗪与卡托普利的组合)。作为进一步实例,药物可包括抗高血脂剂、抗高血压剂、利尿剂和钙通道阻滞剂的组合(例如,辛伐他汀、洛沙坦、双氢氯噻嗪和氨氯地平的组合)。
[0245] 药物或化合物可包括造影剂放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗药物递送微球体、微珠、纳米颗粒、凝胶或细胞浸渍凝胶或其组合。
[0246] 化合物可能够抑制、活化或改变至少一种细胞类型中的蛋白质或基因的功能。
[0247] 当针对从血管支架材料上洗脱来评估药物或化合物时,所述方法可进一步包括针对与血管支架材料的相容性、细胞粘附或表型调节来测试至少一种细胞类型。血管支架材料可相邻于内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞。
[0248] 在涉及测试药物或化合物的任何方法中,培养基中的药物或化合物的浓度适当地在体内实现此效应的药物或化合物的浓度范围内。举例来说,培养基中的药物或化合物的浓度适当地在药物或化合物的体内治疗C最大的浓度范围内。
[0249] 血清
[0250] 在本文描述的涉及将因子添加至培养基或将药物或化合物添加至培养基的任何方法中,将因子添加至培养基的步骤或将药物或化合物添加至培养基的步骤可包括将受试者的血清添加至培养基,其中血清包含因子、药物或化合物。
[0251] 受试者可为动物,例如基因修饰动物或人。优选地,血清从人受试者获得。
[0252] 血清可来自具有生理性病况的受试者或具有病理性病况的受试者。举例来说,当血清来自具有病理性病况的受试者时,病理性病况可包括晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成(例如深静脉血栓形成)、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
[0253] 对于生理或病理性病况的效应
[0254] 在测试药物或化合物效应的方法,所述效应可包括对于生理性病况的效应或对于病理性病况的效应。举例来说,对于生理性病况或病理性病况的效应可为毒性效应、保护效应、病理效应、疾病促进效应、炎症效应、氧化效应、内质网应激效应、线粒体应激效应、凋亡效应、坏死效应、重构效应、增殖效应、对于蛋白质活性的效应,如抑制蛋白质或活化蛋白质,或对于基因表达的效应,如增加基因表达或减少基因表达。
[0255] 自喷设备的多细胞类型配置
[0256] 本发明方法可进一步包括将培养基、因子、药物或化合物灌注进入和离开细胞容器。
[0257] 当细胞培养容器内的表面包括悬浮于细胞培养容器中的多孔膜时,所述方法可进一步包括将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的表面上包括将第一细胞类型涂铺于多孔膜的第一表面上,和任选地将第二细胞类型涂铺于多孔膜的第二表面上的步骤,其中多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含第一细胞类型的下部容积和包含任选第二细胞类型的上部容积。多孔膜可适于允许细胞培养基的流体连通以及第一细胞类型的细胞与任选第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通。将剪切力施加至上部容积中的第二细胞类型或多孔膜的第二表面。所述方法可进一步包括将培养基灌注进入和离开上部容积以及将培养基灌注进入和离开下部容积。所述方法可进一步包括将药物或化合物灌注至上部容积和下部容积中的至少一个。
[0258] 当细胞培养容器内的表面包括悬浮于细胞培养容器中的多孔膜时,所述方法可进一步包括将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的表面上包括任选地将第一细胞类型涂铺于多孔膜的第一表面上,和任选地将第二细胞类型涂铺于多孔膜的第二表面上的步骤,其中多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含任选第一细胞类型的下部容积和包含第二细胞类型的上部容积。多孔膜可适于允许细胞培养基的流体连通以及任选第一细胞类型的细胞与第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通。剪切力施加至上部容积中的第二细胞类型。所述方法可进一步包括将培养基灌注进入和离开上部容积以及将培养基灌注进入和离开下部容积。所述方法可进一步包括将药物或化合物灌注至上部容积和下部容积中的至少一个。
[0259] 细胞培养容器的入口和出口可在界定上部和下部容积的细胞培养容器部分内。
[0260] 在此部分中描述的方法可进一步包括针对由药物或化合物产生的毒性、炎症、渗透性、相容性、细胞粘附、细胞重构、细胞迁移或表型调节来分析第一细胞类型或第二细胞类型中的至少一个。
[0261] 这些方法可进一步包括将第三细胞类型涂铺于容器的表面或多孔膜的第一表面或第二表面上,将第三细胞类型悬浮于上部容积内的培养基中,或将第三细胞类型悬浮于下部容积内的培养基中。
[0262] 这些方法可进一步包括将第四细胞类型涂铺于容器的表面或多孔膜的第一或第二表面上,将第四细胞类型悬浮于上部容积内的培养基中,或将第四细胞类型悬浮于下部容积内的培养基中。
[0263] 这些方法可进一步包括将第五细胞类型涂铺于容器的表面或多孔膜的第一或第二表面上,将第五细胞类型悬浮于上部容积内的培养基中,或将第五细胞类型悬浮于下部容积内的培养基中。
[0264] 第一、第二、第三、第四和第五细胞类型可为如以上关于细胞类型的部分中所描述的各种原代或永生细胞类型。
[0265] 在这些组合中的每一个中,第三细胞类型的细胞、第四细胞类型的细胞或第五细胞类型的细胞可附着至容器的底部表面。
[0266] 定义
[0267] 出于本文描述的发明目的,术语“疾病促进性病况”是指可促成疾病状态的异常解剖学病况(即,偏离显著医学上公认正常解剖的血管解剖)。
[0268] 术语“因子”是指有助于产生病理或生理性病况的生物物质。优选地,与不存在施加剪切力时的至少一种涂铺细胞类型或培养基中的标记物的水平相比,所述因子提供在施加剪切力后的至少一种涂铺肝细胞类型或培养基中的病理或生理性病况的标记物的水平的变化。
[0269] 术语“血液动力学”是指模拟在体内所感兴趣的组织的血液流动的血液流动。举例来说,当动脉血液流动受到关注时,加速/减速率、逆流、前向基础流动等是表征动脉血液动力学流动的一些参数。在其它组织,如肝中,恒定血液流动可用于表征体内血液动力学。
[0270] 术语“病理性病况”是指异常解剖或生理性病况,包括疾病的客观或主观表现。
[0271] 术语“生理性病况”是指并非病理的正常医学状态,并且可为特征为身体或组织或器官的正常运作或状态或与其一致的医学状态。
[0272] 术语“受试者”是指动物(例如,基因修饰动物或人)。动物可包括小鼠、大鼠、兔、猫、犬或灵长类动物,或通常用于医学研究中的任何动物。
[0273] 以下描述本发明方法尤其在体外模型中的使用。
[0274] 血栓形成
[0275] 本发明方法可用于在体外将血栓形成建模。在凝血级联中,凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白,其沉积在血管表面上以开始血液凝块形成(血栓形成)。TNFα是有效炎症细胞因子。TNFα和其它细胞因子已被证明是体外内皮和平滑肌细胞衍生组织因子的有效介体,所述组织因子介导血管壁中的纤维蛋白沉积。在患有心血管疾病的人体内检测到的TNFα的循环水平为约0.01ng/ml至约0.1ng/ml。在健康个体中,TNFα的循环水平低得多或不可检测到,例如约0ng/ml至约0.001ng/ml。
[0276] 在体外将血栓形成建模的方法中,将内皮细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上。细胞培养容器内的表面可为多孔膜的表面,并且多孔膜可悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容积。或者,内皮细胞涂铺于其上的表面是细胞培养容器的底部。
[0277] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于细胞培养容器中的培养基中。举例来说,平滑肌细胞可涂铺于细胞培养容器内的多孔膜的第一表面上并且内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面和平滑肌细胞的下部容积以及包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容积。
[0278] 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、内皮祖细胞、循环干细胞、循环造血细胞或白细胞可任选地悬浮于上部或下部容积内的细胞培养基中。
[0279] 剪切力施加于涂铺内皮细胞上,剪切力由血液动力学自喷设备诱导的培养基的流动产生。流动模拟在体内血栓形成可能发生的血管区域处内皮细胞暴露的流动。举例来说,流动是动脉粥样硬化易发性血液动力学流动。
[0280] 剪切力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间,然后将一种或多种因子添加至培养基。举例来说,剪切力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、约16小时至约32小时或约18小时至约28小时的时间,然后将一种或多种因子添加至培养基。例如,剪切力可施加至涂铺内皮细胞约24小时,然后添加一种或多种因子。或者,剪切力可与将一种或多种因子添加至培养基同时施加至涂铺内皮细胞。
[0281] 一种或多种因子可添加至培养基。举例来说,添加至培养基的一种或多种因子可为涉及血栓形成发展或进展的因子。一种或多种因子以患有血管疾病的受试者中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。举例来说,TNFα可以患有血管疾病的个体中所观察到的TNFα的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。举例来说,TNFα可以约0.005ng/ml至约0.2ng/ml、约0.01ng/ml至约0.1ng/ml、约0.03ng/ml至约0.07ng/ml或约0.04ng/ml至约0.06ng/ml的浓度添加至培养基。TNFα可以约0.05ng/ml或约0.1ng/ml的浓度添加至培养基。
[0282] 除了TNFα以外,其它因子也可添加至培养基。举例来说,氧化LDL(oxLDL)、葡萄糖或oxLDL和葡萄糖两者可与TNFα组合添加至培养基。这类因子以患有血管疾病的受试者中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。在健康个体中,oxLDL的血浆浓度总体上小于约25μg/ml,而在患有血管疾病的患者中,oxLDL的血浆浓度大于约25至约100μg/ml。因此,例如,oxLDL可以约25μg/ml至约120μg/ml、约30μg/ml至约100μg/ml、约40μg/ml至约80μg/ml或约25μg/ml至约50μg/ml的浓度添加至培养基。
例如,oxLDL可以约25μg/ml或约50μg/ml的浓度添加至培养基。
[0283] 葡萄糖也可添加至培养基。糖尿病和相关联的升高的葡萄糖水平是血栓形成的风险因素。在健康个体中,血糖浓度为约5mM至约10mM,而在糖尿病个体中,血糖浓度在大于约10mM至约20mM范围内。因此,例如,葡萄糖可以约10mM至约25mM、约12mM至约20mM或约14mM至约18mM的浓度添加至培养基。例如,葡萄糖可以约15mM或约17.5mM的量来添加至培养基。
[0284] 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后,将剪切应力施加至涂铺内皮细胞适当地持续一段时间。
[0285] 施加剪切应力可持续例如约12小时至约48小时、约18小时至约36小时或约20至约30小时、约18小时至约72小时或约24小时至约72小时的时间。例如,在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后,剪切应力可持续约24小时。
[0286] 然后,可通过将内皮细胞与无血小板血浆(PLP)、钙和纤维蛋白原一起孵育来诱导血块形成。此孵育可在静态条件下执行。或者,内皮细胞的剪切力施加可在此孵育期间持续。可将细胞培养基从上部容积去除并且内皮细胞可随后与PLP、钙和纤维蛋白原一起孵育,伴以或不伴以持续施加剪切至内皮细胞。或者,PLP、钙和纤维蛋白原可添加至上部容积中的细胞培养基,伴以或不伴以持续施加剪切力。
[0287] 血栓形成的模拟可通过许多方法中的任何一种来评估。通常,如与不存在施加剪切力的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的血栓形成标记物的水平的变化证实血栓形成得到模拟。举例来说,血栓形成的模拟可通过检查纤维蛋白沉积、检查与血栓形成相关的基因或蛋白质和/或分泌微粒或蛋白质的表达,或检查与血栓形成相关的蛋白质的活性来评估。
[0288] 动脉粥样硬化
[0289] 本发明方法也可用于在体外将动脉粥样硬化建模。动脉粥样硬化是以血管区域内的炎症信号转导为标志的局灶性炎症疾病,其中低和振荡剪切应力(动脉粥样硬化易发性剪切应力)使内皮对于炎症响应“预敏化”。炎症响应的重要介体是转录因子NFκB,其通过体内和体外的动脉粥样硬化易发性剪切应力来活化。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是晚期动脉粥样硬化的标志,发现于动脉粥样硬化病灶中,并且在患有心血管并发症的患者的循环中升高。氧化1-棕榈酰-2-花生四烯酸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxPAPC),oxLDL的主要成分,展示不经由典型NFκB途径来起作用,并且虽然oxLDL能够在体外静态单一培养物中增加NFκB依赖性基因的表达,但是与在患有心血管疾病的个体体内所观察到的浓度相比,这经常需要较高浓度的oxLDL(>100μg/ml)。在健康患者中,oxLDL的血浆浓度平均为7μg/ml,而在患有心肌梗塞的患者中,平均血浆浓度为约28至约34μg/ml,并且一些患者具有约60μg/ml的水平。TNFα也在晚期动脉粥样硬化病灶中分泌并且在经历心肌梗塞的患者的循环中升高。TNFα是能够在较高浓度(>1ng/ml)下活化NFκB信号转导的有效、促炎症性细胞因子。
[0290] 以前体外研究全部在内皮细胞的静态单一培养物内执行。在本发明方法中,相比之下,动脉粥样硬化易发性血液动力学剪切力通过启用NFκB信号转导来使内皮细胞的单一培养物或内皮细胞与平滑肌细胞的共培养物“预敏化”,并且添加oxLDL和/或TNFα,和任选地在患有血管疾病的患者中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度的某些其它因子进一步增强NFκB活性和下游炎症信号转导。
[0291] 在体外将动脉粥样硬化建模的本发明方法中,将内皮细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上。细胞培养容器内的表面可为多孔膜的表面,并且多孔膜可悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容积。或者,内皮细胞涂铺于其上的表面是细胞培养容器的底部。
[0292] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于细胞培养容器中的培养基中。举例来说,平滑肌细胞可涂铺于细胞培养容器内的多孔膜的第一表面上并且内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面和平滑肌细胞的下部容积以及包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容积。
[0293] 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、内皮祖细胞、循环干细胞、循环造血细胞或白细胞可任选地悬浮于上部或下部容积内的细胞培养基中。
[0294] 剪切力施加于涂铺内皮细胞上,剪切力由血液动力学自喷设备诱导的培养基的流动产生。流动模拟在体内动脉粥样硬化可能发生的血管区域处内皮细胞暴露的流动。举例来说,流动是动脉粥样硬化易发性血液动力学流动。
[0295] 剪切力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间,然后将一种或多种因子添加至培养基。举例来说,剪切力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、约16小时至约32小时或约18小时至约28小时的时间,然后将一种或多种因子添加至培养基。例如,剪切力可施加至涂铺内皮细胞约24小时,然后添加一种或多种因子。或者,剪切力可与将一种或多种因子添加至培养基同时施加至涂铺内皮细胞。
[0296] 一种或多种因子可添加至培养基。举例来说,添加至培养基的一种或多种因子可为涉及动脉粥样硬化发展或进展的因子。这类一种或多种因子以患有血管疾病的个体中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。
[0297] oxLDL可在患有血管疾病的个体中所观察到的oxLDL的体内浓度范围内的浓度下添加至培养基。因此,例如,oxLDL可以约25μg/ml至约120μg/ml、约30μg/ml至约100μg/ml、约40μg/ml至约80μg/ml或约25μg/ml至约50μg/ml的浓度添加至培养基。
例如,oxLDL可以约25μg/ml或约50μg/ml的浓度添加至培养基。
[0298] 其它因子也可代替或与oxLDL组合来添加至培养基。这些因子包括但不限于;TNFα、高密度脂蛋白(HDL);甘油三酯;包括极低密度脂蛋白(vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒和/或乳糜微粒残余的富含甘油三酯的脂蛋白;低密度脂蛋白(LDL);葡萄糖;胰岛素;脂肪酸;TGFβ或其组合。举例来说,TNFα可代替oxLDL来添加至培养基。或者,oxLDL和TNFα两者可添加至培养基。HDL也可任选地添加至培养基。举例来说,HDL可单独,或与其它因子如TNFα和oxLDL组合添加至培养基。甘油三酯或包括vLDL、vLDL残余、乳糜微粒和/或乳糜微粒残余的富含甘油三酯的脂蛋白也可任选地单独或与一种或多种其它因子组合来添加至培养基。葡萄糖也可任选地添加至培养基。举例来说,葡萄糖可单独,或与其它因子如TNFα组合添加至培养基。LDL或TGFβ也可单独或与其它因子组合来添加至培养基。
[0299] 因子以患有血管疾病的个体中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。因此,例如,TNFα可以约0.005ng/ml至约0.2ng/ml、约0.01ng/ml至约0.1ng/ml、约0.03ng/ml至约0.07ng/ml或约0.04ng/ml至约0.06ng/ml的浓度添加至培养基。例如,TNFα可以约0.05ng/ml或约0.1ng/ml的浓度添加至培养基。
[0300] oxLDL可以约50μg/ml的浓度添加至培养基。
[0301] TNFα可以约0.05ng/ml的浓度添加至培养基。
[0302] HDL可以患有血管疾病的个体或处于血管疾病风险的个体中所观察到的HDL的体内浓度范围内的浓度来添加至培养基。处于血管疾病风险的个体中的HDL浓度总体上小于约300μg/ml,而健康个体中的HDL浓度在大于约300μg/ml直至约2,000μg/ml健康锻炼患者范围内。因此,例如,HDL可以约1μg/ml至约300μg/ml、约10μg/ml至约250μg/ml、约45μg/ml至约200μg/ml或约90μg/ml至约150μg/ml的浓度添加至培养基。例如,HDL可以约45μg/ml或约90μg/ml的浓度添加至培养基。
[0303] HDL可适当地与TNFα和oxLDL组合来添加至培养基。HDL、TNFα和oxLDL适当地各自以患有血管疾病的个体中所观察到的这些因子的体内浓度范围内的浓度存在,例如,以上对于这些组分中的每一种列出的浓度范围。举例来说,HDL以约45μg/ml或约90μg/ml的浓度添加至培养基,TNFα以约0.05ng/ml的浓度添加至培养基,并且oxLDL以约50μg/ml的浓度添加至培养基。
[0304] 甘油三酯或包括极低密度脂蛋白(vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒和/或乳糜微粒残余的富含甘油三酯的脂蛋白,可以患有血管疾病的个体中所观察到的这些因子的体内浓度范围内的浓度来添加至培养基。健康患者中的甘油三酸酯水平在约40mg/dL至约150mg/dL范围内。在患有高甘油三酯血症的患者中,甘油三酯水平在大于约200mg/dL至约1500mg/dL范围内。因此,例如甘油三酯适当地以约175mg/dL至约1600mg/dL、约200mg/dL至约1500mg/dL、约400mg/dL至约1200mg/dL或约600mg/dL至约1000mg/dL的浓度添加至培养基。
[0305] 糖尿病和相关联升高水平的血糖是动脉粥样硬化的风险因素。因此,在体外将动脉粥样硬化建模的本发明方法中,葡萄糖也可适当地添加至培养基。葡萄糖以如患有糖尿病的个体中所观察到的葡萄糖的体内浓度范围内的浓度来添加至培养基。在健康个体中,血糖浓度为约5至约10mM,而在糖尿病个体中,血糖浓度在大于约10mM至约20mM范围内。因此,例如,葡萄糖适当地以约10mM至约25mM、约12mM至约20mM,或约14mM至约18mM的浓度来添加至培养基。例如,葡萄糖可以约15mM或约17.5mM的量来添加至培养基。
[0306] 葡萄糖可连同TNFα一起添加至培养基。葡萄糖和TNFα以患有例如糖尿病或血管疾病的个体中所观察到的葡萄糖和TNFα的体内浓度范围内的浓度添加至培养基,这些组分中的每一种的浓度范围在以上列出。举例来说,葡萄糖适当地以约15mM的浓度添加至培养基并且TNFα适当地以0.05ng/ml的浓度添加至培养基。
[0307] 当葡萄糖和TNFα均添加至培养基时,葡萄糖可添加至培养基并且细胞在葡萄糖存在下培养一段时间,然后施加剪切应力。举例来说,细胞适当地在葡萄糖存在下培养约1至约7天,例如约3至约5天,或约4天,然后施加剪切应力。然后,剪切应力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间,然后将TNFα添加培养基。举例来说,剪切应力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、约16小时至约32小时、约18小时至约28小时或约24小时的时间,然后将TNFα添加至培养基。
[0308] LDL和/或TGFβ可以患有血管疾病的个体中所观察到的LDL或TGFβ的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。在健康个体中,LDL水平总体上在约50mg/dL至约100mg/dL范围内,而在患有动脉粥样硬化的个体中,LDL水平总体上高于约100mg/dL。因此,例如,LDL适当地以约100mg/dL至约500mg/dL、约100mg/dL至约300mg/dL,或约100mg/dL的浓度来添加至培养基。
[0309] 在健康个体中,TGFβ水平总体上小于约30ng/ml,而患有血管疾病的个体中的水平为约30ng/ml至约100ng/ml。因此,TGFβ适当地以约30ng/ml至约150ng/ml、约30ng/ml至约100ng/ml、约50至约100ng/ml或约60至约90ng/ml的浓度添加至培养基。
[0310] 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后,将剪切应力施加至涂铺内皮细胞适当地持续一段时间。施加剪切应力可持续例如约12小时至约48小时、约18小时至约36小时或约20至约30小时、约18小时至约72小时或约24小时至约72小时的时间。例如,在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后,剪切应力可持续约24小时。
[0311] 动脉粥样硬化的模拟可通过许多方法来评估。通常,如与不存在施加剪切力的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的动脉粥样硬化标记物的水平的变化证实动脉粥样硬化得到模拟。举例来说,动脉粥样硬化的模拟可通过检查与动脉粥样硬化相关的基因或蛋白质的表达、检查与动脉粥样硬化相关的蛋白质的活性,或检查分泌细胞因子的水平来评估。
[0312] 高血压
[0313] 本发明的方法也可用于在体外将高血压建模。血管紧张素II(ANG2)水平在患有心血管并发症,如动脉粥样硬化、糖尿病或高血压的患者中增加。在健康患者中,ANG2的典型浓度在约1nM至约5nM范围内,并且在高血压患者中大于约6nM至约20nM。另外,醛固酮是在肾素-血管紧张素系统中的ANG2下游的重要信号转导激素。它的水平可在包括动脉粥样硬化、糖尿病和高血压的多个病状下变化。在健康个体中,醛固酮的浓度为约0.3mM。在患有醛固酮过多症的个体中,醛固酮浓度在约0.8mM至约1mM范围内。
[0314] 在体外将高血压建模的方法中,将内皮细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上。细胞培养容器内的表面可为多孔膜的表面,并且多孔膜可悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容积。或者,内皮细胞涂铺于其上的表面可为细胞培养容器的底部。
[0315] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于细胞培养容器中的培养基中。举例来说,平滑肌细胞可涂铺于细胞培养容器内的多孔膜的第一表面上并且内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面和平滑肌细胞的下部容积以及包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容积。
[0316] 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、内皮祖细胞、循环干细胞、循环造血细胞或白细胞可任选地悬浮于上部或下部容积中的细胞培养基中。
[0317] 剪切力施加于涂铺内皮细胞上,剪切力由血液动力学自喷设备诱导的培养基的流动产生。流动模拟在体内高血压中内皮细胞暴露的流动。
[0318] 剪切力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间,然后将一种或多种因子添加至培养基。举例来说,剪切力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、约16小时至约32小时或约18小时至约28小时的时间,然后将一种或多种因子添加至培养基。例如,剪切力施加至涂铺内皮细胞约24小时,然后添加一种或多种因子。或者,剪切力与将一种或多种因子添加至培养基同时施加至涂铺内皮细胞。
[0319] 一种或多种因子可添加至培养基。举例来说,添加至培养基的一种或多种因子可为涉及高血压发展或进展的因子。一种或多种因子以患有血管疾病的受试者中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。举例来说,血管紧张素适当地以约5.5nM至约25nM、约6nM至约20nM、约8nM至约15nM,或约9nM至约12nM的浓度,例如,约10nM的浓度添加至培养基。
[0320] 血管紧张素可单独或与另一种因子如醛固酮组合来添加至培养基。或者,醛固酮可单独地或与除了血管紧张素以外的因子组合来添加至培养基。当醛固酮添加至培养基时,它适当地以约0.5mM至约1.5mM,或约0.8mM至约1mM的浓度,例如,约1mM的浓度存在。
[0321] 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后,将剪切应力施加至涂铺内皮细胞适当地持续一段时间。施加剪切应力可持续例如约12小时至约48小时、约18小时至约36小时或约20至约30小时、约18小时至约72小时或约24小时至约72小时的时间。例如,在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后,剪切应力可持续约24小时。
[0322] 动脉粥样硬化的模拟可通过许多方法来评估。通常,如与不存在施加剪切力的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的动脉粥样硬化标记物的水平的变化证实动脉粥样硬化得到模拟。举例来说,动脉粥样硬化的模拟可通过检查与动脉粥样硬化相关的基因或蛋白质和/或分泌微粒或蛋白质的表达、检查与动脉粥样硬化相关的蛋白质的活性,或检查分泌细胞因子、趋化因子或生长因子的水平来评估。
[0323] 生理肝模型
[0324] 本发明方法也可用于产生肝的生理体外模型。在这类方法中,肝细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上,并且剪切力间接地施加至涂铺肝细胞。举例来说,肝细胞适当地涂铺于多孔膜的第一表面上,其中将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面。因此,设备中的细胞的配置(图15C)基于肝小叶的体内微体系结构(图15A)。
[0325] 如图15A展示,在体内肝小叶中,肝细胞条带100通过肝窦内皮细胞的过滤层110和细胞外基质层140与肝窦血液流动150分离。细胞外基质层140提供肝细胞的锚定,涉及信号转导,并且提供细胞因子和生长因子的库。肝细胞110具有极化形态并且胆小管120存在于肝细胞层中。肝窦血液流动150和间隙血液流动130提供氧和营养物运输。
[0326] 图15B和15C描绘用于本发明体外肝模型中的示例性配置。如图15B的插图和图15C中展示,肝细胞260涂铺于悬浮于细胞培养容器240中的多孔膜250上,并且剪切力施加器(在图15B和15C中展示为圆锥体230)用于将剪切力施加至多孔膜的相反侧。剪切力由细胞培养容器中的培养基的流动产生。多孔膜与存在于肝中的肝窦内皮细胞过滤层类似地来起作用。肝细胞被屏蔽以避免流动的直接效应的影响,如其在体内那样。细胞培养容器内的上部和下部体积的入口和出口270允许连续灌注培养基和灌注药物或化合物进入和离开细胞培养基。施加剪切力产生受控血液动力学,其调控间隙流动和溶质转移穿过多孔膜。在本发明的体外模型中,肝细胞保持其极化形态和胆小管。
[0327] 如图15C中示出,一种或多种细胞外基质组分280(例如,胶原凝胶)的至少一个层可适当地沉积于多孔膜的第一表面上。然后,肝细胞260涂铺于细胞外基质组分上。然后,细胞外基质组分的一个或多个额外层可沉积于肝细胞的顶部,以使得肝细胞大致上由细胞外基质组分来包围。细胞外基质组分适当地包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。举例来说,细胞外基质组分可包括胶原。
[0328] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于培养基中。举例来说,非实质肝细胞适当地涂铺于多孔膜的第二表面上,并且剪切力施加至涂铺非实质细胞。非实质细胞可包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞、库柏法细胞或其组合。肝细胞和非实质肝细胞适当地为从动物的肝,例如人的肝分离的原代细胞。或者,肝细胞和/或非实质肝细胞是永生细胞。
[0329] 培养基适当地连续灌注于多孔膜的两侧上,同时由一系列生理血液流动值获得的剪切力连续施加至多孔膜的第二表面或施加至涂铺非实质肝细胞。施加至多孔膜的第二2
表面的剪切力模拟在体内发生的穿过肝窦的流动。剪切速率适当地为约0.1dyne/cm 至
2 2 2 2 2
约3.0dyne/cm、约0.2dyne/cm 至约2.5dyne/cm、约0.3dyne/cm 至约1.0dyne/cm 或约
2 2 2
0.4dyne/cm 至约0.8dyne/cm。举例来说,剪切速率可为约0.6dyne/cm。或者,剪切速率
2
可为约2.0dyne/cm。
[0330] 在生理体外肝模型中,一种或多种因子存在于培养基中。这些一种或多种因子可以在剪切力下能够保持体外生理肝条件的模拟一段时间的浓度添加至培养基,其中相同浓度的这些因子在不存在剪切力下不能保持体外生理肝条件的模拟一段时间。举例来说,因子可包括胰岛素、葡萄糖或胰岛素与葡萄糖的组合。如与通常用于静态培养物中的浓度(约17.5mM葡萄糖和约2μM胰岛素)相比,葡萄糖和胰岛素适当地以降低的浓度存在。举例来说,葡萄糖可以约5mM至约10mM的浓度,或约5.5至约7mM的浓度,例如,约5.5mM的浓度存在于培养基中。胰岛素可以约0.05nM至约5nM的浓度,例如约0.1nM至约3nM,或约0.5至约2.5nM,例如,约2nM的浓度存在于培养基中。一种或多种因子适当地在施加剪切力之前或同时添加至培养基。
[0331] 一种或多种因子的浓度适当地能够保持体外生理肝条件的模拟至少约7天、至少约14天、至少约21天、至少约30天或更长。
[0332] 生理肝条件的模拟可通过许多方法来评估。通常,如与不存在施加剪切力的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的生理肝条件的标记物的水平的变化证实生理肝条件得到模拟。举例来说,可评估生理肝条件的模拟,通过针对涉及将肝保持于生理状态下的基因或蛋白质的表达(例如,在肝细胞中,代谢和胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因)来检查肝细胞或非实质肝细胞;针对脂质积累来检查肝细胞;针对分化功能的变化(例如,在肝细胞中,测量尿素和白蛋白分泌)来检查肝细胞或非实质肝细胞;针对代谢活性(例如,在肝细胞中,使用细胞色素p450测定)或转运蛋白活性的变化来检查肝细胞或非实质肝细胞;或针对形态变化来检查肝细胞或非实质肝细胞。也可评估肝的生理性病况,通过将肝细胞或非实质肝细胞对于异生物质、营养物、生长因子或细胞因子的响应与对于相同异生物质、营养物、生长因子或细胞因子的体内肝响应进行比较。
[0333] 如以下实施例4中进一步描述,不同于在静态条件下培养的肝细胞,本发明的生理体外肝模型中培养的肝细胞保持其对于胰高血糖素、胰岛素和葡萄糖底物的响应性。因此,对于胰高血糖素、胰岛素或一种或多种葡萄糖底物的响应性(例如,使用糖质新生测定)也可用于评估生理肝条件的模拟。合适葡萄糖底物包括甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其组合(例如,乳酸酯与丙酮酸酯的组合)。此外,因为肝细胞保持对于胰高血糖素的响应性,所以本发明的生理体外肝模型可用于体外测试与胰高血糖素受体相互作用的药物(例如,胰高血糖素受体拮抗剂)。
[0334] 另外,与静态培养系统相比,在本发明的生理体外肝模型中培养的肝细胞在更接近于体内和临床C最大水平的浓度下显示对于药物的诱导和毒性响应。因此,此模型可用于在体内实现效应的药物或化合物的浓度范围内的浓度下来体外测试药物和化合物。
[0335] 脂肪肝
[0336] 本文描述的方法也可用于产生脂肪肝疾病的体外模型。肝细胞内的脂质调控是复杂和动态的过程。甘油三酯积累可由于高脂肪饮食导致脂肪酸吸收增加、外周脂肪分解增加,或重新脂肪生成增加而发生。胰岛素和葡萄糖是重新脂肪生成的关键调控剂并且有助于通过刺激甘油三酯合成以及抑制经由β氧化的脂肪酸代谢来增加肝细胞内的甘油三酯含量。
[0337] 非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)与在存在胰岛素抵抗下的肥胖症、II型糖尿病和代谢综合征相关联。NAFLD的特征为肝脂肪变性(肝中的过量脂质积累),如果保持不治疗,会进展至炎症性变化(脂肪性肝炎)和肝硬化。许多动物模型经由高血糖-高胰岛素环境来诱导脂肪变性(例如,经由使用低脂肪/高碳水化合物饮食来刺激脂肪生成)。然而,当前体外肝细胞模型缺乏诱导脂肪变性的足够胰岛素-葡萄糖响应,大概是因为在静态条件下保持培养物中的肝细胞需要超生理水平的胰岛素/葡萄糖。这类体外模型未能诱导经由胰岛素和葡萄糖实现的肝细胞的脂肪变化,或许归因于在静态培养条件下肝细胞的胰岛素响应性被削弱和在体外肝细胞的快速去分化。
[0338] 相比之下,如上相对于生理肝模型所述,在存在受控肝衍生血液动力学和运输下培养的肝细胞在生理葡萄糖和胰岛素水平下保持分化功能、形态和响应。在此系统中,引入高浓度的胰岛素和葡萄糖(“疾病环境”)诱导肝细胞的脂肪变化。因此,受控血液动力学和运输在肝细胞中产生对于胰岛素和葡萄糖的更多生理响应,从而在高胰岛素、高血糖环境中诱导与脂肪变性相关联的脂肪变化,如通常最初在糖尿病的胰岛素抗性条件下所见。另外,与静态培养系统相比,在存在受控血液动力学和运输的情况下培养的肝细胞在更接近于体内和临床C最大水平的浓度下显示对于药物的诱导和毒性响应。因此,本发明系统提供脂肪肝疾病的体外模型。
[0339] 在此模型中,肝细胞总体上以与如上对于生理肝模型所述相同的方式来涂铺。肝细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上,并且剪切力间接地施加至涂铺肝细胞。举例来说,肝细胞适当地涂铺于多孔膜的第一表面上,其中将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系,从而在细胞培养容器内界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面。
[0340] 一种或多种细胞外基质组分的至少一个层可适当地沉积于多孔膜的第一表面上。然后,肝细胞涂铺于细胞外基质组分上。然后,细胞外基质组分的一个或多个额外层可沉积于肝细胞的顶部,以使得肝细胞大致上由细胞外基质组分来包围。细胞外基质组分适当地包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。举例来说,细胞外基质组分可包括胶原。
[0341] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于培养基中。举例来说,非实质肝细胞适当地涂铺于多孔膜的第二表面上,并且剪切力施加至涂铺非实质细胞。非实质细胞可包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞、库柏法细胞或其组合。肝细胞和非实质肝细胞适当地为从动物的肝,例如人的肝分离的原代细胞。或者,肝细胞和/或非实质肝细胞是永生细胞。
[0342] 培养基适当地连续灌注于多孔膜的两侧上,同时由一系列生理血液流动值获得的剪切力连续施加至多孔膜的第二表面或施加至涂铺非实质肝细胞。施加至多孔膜的第二2
表面的剪切力模拟在体内发生的穿过肝窦的流动。剪切速率适当地为约0.1dyne/cm 至
2 2 2 2 2
约3.0dyne/cm、约0.2dyne/cm 至约2.5dyne/cm、约0.3dyne/cm 至约1.0dyne/cm 或约
2 2 2
0.4dyne/cm 至约0.8dyne/cm。举例来说,剪切速率可为约0.6dyne/cm。或者,剪切速率
2
可为约2.0dyne/cm。
[0343] 在体外脂肪肝模型中,一种或多种因子存在于培养基中。这些一种或多种因子以在剪切力下能够保持体外脂肪肝疾病的模拟一段时间的浓度添加至培养基,其中相同浓度的因子在不存在剪切力下不能保持脂肪肝疾病的模拟一段时间。因子可包括例如胰岛素、葡萄糖或其组合。葡萄糖适当地以约10mM至约25mM、约12mM至约20mM,或约14mM至约18mM,例如,约17.5mM的浓度存在于培养基中。胰岛素适当地以约1μM至约3μM、约1.5μM至约2.5μM,或约1.8μM至约2.2μM,例如,约2μM的浓度存在于培养基中。一种或多种因子适当地在施加剪切力之前或同时添加至培养基。
[0344] 一种或多种因子的浓度适当地能够保持体外脂肪肝疾病的模拟至少约7天、至少约14天、至少约21天、至少约30天或更长。
[0345] 脂肪肝疾病的模拟可通过许多方法来评估。通常,如与不存在施加剪切力的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平相比,在施加剪切力后的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的脂肪肝疾病的标记物的水平的变化证实脂肪肝疾病得到模拟。举例来说,可评估脂肪肝疾病的模拟,通过针对涉及脂肪肝疾病状态的基因或蛋白质的表达(例如,在肝细胞中,代谢和胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因)来检查肝细胞或非实质肝细胞;针对脂质积累来检查肝细胞(例如,在肝细胞中,测量甘油三酯水平或观测脂质小滴);针对分化功能的变化(例如,在肝细胞中,测量尿素和白蛋白分泌)来检查肝细胞或非实质肝细胞;针对代谢活性(例如,在肝细胞中,使用细胞色素p450测定)或转运蛋白活性的变化来检查肝细胞或非实质肝细胞;或针对形态变化来检查肝细胞或非实质肝细胞。也可评估脂肪肝变化的后遗症,通过测量肝细胞的氧化状态的变化和周围细胞外基质组合物和量的变化。
[0346] 本发明已详细描述,在不脱离附加的权利要求界定的本发明范畴情况下,可能的改良和变化是显而易见的。实施例
[0347] 实施例1:动脉和静脉血栓形成的体外模型
[0348] 在凝血级联中,凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白,其沉积在血管表面上以开始血液凝块形成(血栓形成)。TNFα是有效炎症细胞因子。TNFα和其它细胞因子已被证明是体外内皮和平滑肌细胞衍生组织因子的有效介体,所述组织因子介导血管壁中的纤维蛋白沉积。在患有心血管疾病的人体内检测到的TNFα的循环水平为约0.01ng/ml至约0.1ng/ml。在健康个体中,TNFα的循环水平低得多或不可检测到,例如约0ng/ml至约0.001ng/ml。
[0349] 方法:
[0350] 在存在或不存在人衍生、区域特异性血液动力学的情况下,人内皮细胞与或不与平滑肌细胞一起共培养。内皮细胞暴露于各种浓度的TNFα并且在补充有ALEXA FLUOR488(A488,荧光染料)标记纤维蛋白原的人、无血小板血浆中孵育。A488-纤维蛋白原至A488-纤维蛋白的转化并在内皮上的沉积通过共焦显微术来量化。
[0351] (i)静态单一培养物血栓形成测定
[0352] 对于内皮细胞的静态单一培养物,内皮细胞以100,000个细胞/cm2涂铺于盖片上并允许粘附24小时。24小时之后,将培养基更换成含有0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml或20ng/ml TNFα的培养基。在37℃下孵育细胞4小时。孵育之后,将培养基去除并且细胞用PBS洗涤两次。然后,细胞在37℃下用补充有37.5μg/mL ALEXA-488人纤维蛋白原、20μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂和10mM钙的人无血小板血浆(PFP)再孵育15分钟。此方案描绘于图1A中。15分钟之后,细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定并且用10mM Tris、1mM EDTA缓冲液中的0.5nM SYTO83(荧光核酸染色剂)染色45分钟。盖片使用FLUOROMOUNT-G(封固剂)封固至盖玻片上并成像。
[0353] (ii)使用剪切应力的单一培养物血栓形成测定
[0354] 内皮细胞以100,000个细胞/cm2的涂铺密度涂铺于TRANSWELL(聚碳酸酯,10μm厚度和0.4μm孔径,no.3419,Corning)的多孔膜上,并经受使用锥板式设备的动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性血液动力学模式。
[0355] 24小时剪切应力施加(动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性)之后,培养基用0.05ng/mL或0.10ng/mL浓度下的TNFα补充并且剪切应力继续再进行24小时,如图3A展示。然后,将培养基从上部和下部腔室去除,并且内皮细胞用PBS洗涤两次。然后,内皮细胞在37℃下与补充有37.5μg/mL ALEXA-488人纤维蛋白原、20μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂和10mM钙的PFP一起孵育15分钟。15分钟之后,细胞用4%PFA固定并且用10mM Tris、1mM EDTA缓冲液中的0.5nM SYTO83染色45分钟。使用FLUOROMOUNT-G将小部分多孔膜封固至盖玻片上并成像。
[0356] (iii)使用剪切应力的共培养物血栓形成测定-方案A
[0357] 平滑肌细胞以20,000个细胞/cm2的涂铺密度涂铺于TRANSWELL的多孔膜的第一表面并且允许粘附至膜两小时。然后,将TRANSWELL翻转并且细胞在减少血清生长培养基(补充有2%FBS、2mML-谷酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的M199)中孵育四十八小时。然2
后,在相同培养基条件下,将内皮细胞以100,000个细胞/cm 的密度涂铺于TRANSWELL多孔膜的第二表面上,并且再孵育二十四小时,然后施加剪切应力。
[0358] 24小时剪切应力施加(动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性)之后,培养基用0.05ng/mL或0.10ng/mL浓度下的TNFα补充并且剪切应力继续再进行24小时,如图3A展示。然后,将培养基从上部和下部腔室去除,并且内皮细胞和平滑肌细胞用PBS洗涤两次。然后,内皮细胞在37℃下与补充有37.5μg/mLALEXA-488人纤维蛋白原、20μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂和10mM钙的PFP一起孵育15分钟,并且如上对于单一培养物所述来固定并成像。
[0359] (iv)使用剪切应力的共培养物血栓形成测定-方案B
[0360] 将平滑肌细胞和内皮细胞涂铺,经受动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性剪切应力,并且如上对于方案A所述用TNFα处理。补充有37.5μg/mL ALEXA-488人纤维蛋白原和20μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂的PFP添加至上部容积以产生大约27%的PFP的最终浓度。PFP进一步用钙补充至PFP/培养基组合中的10mM钙的最终浓度。然后,内皮细胞在37℃下再孵育15分钟并且如上所述来固定并成像。
[0361] (v)使用剪切应力的共培养物血栓形成测定-方案C
[0362] 将平滑肌细胞和内皮细胞涂铺,经受动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性剪切应力,并且如上对于方案A所述用TNFα处理。然后,将锥板式设备的圆锥体抬高约2mm并且将流入/流出夹具去除。然后,圆锥体降低回到操作高度。补充有37.5μg/mL ALEXA-488人纤维蛋白原、20μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂的PFP添加至上部容积以产生大约27%的PFP的最终浓度。PFP进一步用钙补充至PFP/培养基组合中的10mM钙的最终浓度。然后,在施加动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性剪切应力的情况下,将共培养物再孵育30分钟,如图4A展示。30分钟之后,将细胞培养皿从设备上去除并且培养基从下部容积去除。然后,如上所述将内皮细胞固定并成像。
[0363] 结果:
[0364] (i)静态内皮细胞单一培养物
[0365] 在静态条件下培养24小时并用TNFα处理4小时的内皮细胞的培养物中,用1ng/ml TNFα处理的样品展示最小纤维蛋白沉积,而用10ng/ml或20ng/ml处理的样品展示稠密纤维蛋白网络(分别为1.17e5相比于2.69e7相比于3.61e7平均荧光强度)(图1B;插图为彩色图像)。如图1B的下部中间图中展示,具有从左至右的“x轴”和上下走向的“z轴”的血块的横截面叠加成像,以测量表面上方的血块的高度(z轴)。平均灰度值是细胞表面上方的指定高度的堆叠的每个图像的荧光强度(图1B的下部最右侧图)。
[0366] 纤维蛋白沉积是组织因子依赖性的并且由抗-CD142抗体阻断。图1C的上图展示在针对组织因子的抗体(抗-CD142,左侧)或对照抗体(IgG1K,右侧)存在下的纤维蛋白沉积。下图展示相同场中的细胞核的染色,证明细胞的存在。
[0367] 因此,在静态条件下,内皮细胞需要由TNFα活化以启始凝血级联。此活化取决于组织因子活性和比生理水平高大约200倍的TNFα浓度。
[0368] (ii)经受剪切的内皮细胞/平滑肌细胞共培养物
[0369] 图2B描绘内皮和平滑肌细胞(在动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性条件下生长;参见图2A)中的与血栓形成相关的若干基因的相对基因表达的热图。组织因子(F3)和凝血调节蛋白(THBD)的基因表达的相对变化呈现于热图下方。与动脉粥样硬化预防性剪切应力相比,动脉粥样硬化易发性血液动力学将组织因子(F3)上调。此外,结合凝血酶并且抑制凝血级联的凝血调节蛋白得以下调。另外,TNFα刺激减少内皮和平滑肌细胞中的组织因子通道抑制剂(TFPI)。
[0370] 从颈内动脉窦获得并且用0.05ng/ml TNFα处理的用炎症易发性血液动力学预敏化的内皮/平滑肌细胞共培养物沉积稠密纤维蛋白网络(1.9e7平均荧光强度)(图3B;数据使用如上所述方案A来产生)。因此,动脉粥样硬化易发性血液动力学将内皮层预敏化以便对于细胞因子活化更具有响应性,如与静态培养物相比,允许100至200倍更低水平的TNFα来诱导纤维蛋白沉积。
[0371] 只培养内皮细胞的相同实验产生类似结果(数据未展示),证明结果是血液动力学特异性的并且不是存在平滑肌细胞的结果。
[0372] 图4B展示如上所述根据方案C执行的实验的结果,其中剪切应力在血块形成期间保持,从而更接近地模拟生理性病况。图4B的两个上图展示每个条件的叠加图像并稍微成角度以展示血块形态。图4B中的条形图展示细胞表面上方的指示距离处的这些图像中的每一个的荧光强度。细胞表面上方6μm和21μm处的代表性图像展示于图4B的下部右侧图中。
[0373] 结论:
[0374] 内皮细胞的静态单一培养物需要与人循环血液浓度不相关的显著升高水平的TNFα以便诱导纤维蛋白沉积。与动脉粥样硬化预防性血液动力学相比,动脉粥样硬化易发性血液动力学上调凝血因子并下调凝血抑制剂。在体外内皮细胞的血液动力学预敏化将对于TNFα的剂量依赖性纤维蛋白沉积响应移位至与患有心血管疾病的人中所观察到的TNFα的循环水平类似的浓度范围中,比在静态内皮细胞培养物中诱导纤维蛋白沉积所需要的水平低两个数量级。
[0375] 实施例2:动脉粥样硬化的体外模型
[0376] (i)血液动力学环境中的oxLDL的效应
[0377] (a)方法
[0378] 为了氧化LDL,天然LDL(nLDL)用PBS渗析24小时以去除EDTA。然后,LDL在含有13.8μM CuSO4的PBS中渗析3天。然后,LDL用含有50μM EDTA的PBS再渗析24小时。
相对电泳迁移数量用于证实每个批次的氧化水平。在氧化结束后,oxLDL在氮下在4℃下存储直到使用为止。
[0379] 平滑肌细胞以20,000个细胞/cm2的涂铺密度涂铺于TRANSWELL(聚碳酸酯,10μm厚度和0.4μm孔径,no.3419,Corning)的多孔膜的第一表面并且允许粘附至膜两小时。然后,将TRANSWELL翻转并且细胞在减少血清生长培养基(补充有2%FBS、2mM L-谷酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的M199)中孵育四十八小时。然后,在相同培养基条件下,将内
2
皮细胞以100,000个细胞/cm 的密度涂铺于TRANSWELL多孔膜的第二表面上,并且再孵育二十四小时,然后施加剪切应力。
[0380] 用动脉粥样硬化预防性或动脉粥样硬化易发性血液动力学力来剪切应力预调节16-24小时之后,oxLDL以10-50μg/ml的浓度添加至上部容积(含有内皮细胞)(图5)。
在未接收oxLDL的设备中,nLDL以相同浓度添加至上部容积并且用作媒介物对照。oxLDL的此浓度类似于在患有心血管疾病的患者中所观察到的oxLDL的血浆浓度。在oxLDL存在下,剪切应力施加再继续24小时。
[0381] 在内皮细胞和平滑肌细胞中的动脉粥样硬化易发性血液动力学环境内,五种不同供体对用于分析与nLDL(50μg/ml)相比的oxLDL(50μg/ml)响应。在实验结束后,收集RNA以进行基因阵列分析。有效基因使用0.01的FDR来考虑。基因表达结果以与β-2微球蛋白(B2M)的表达相比的基因的相对表达来报告。蛋白质表达结果以与肌动蛋白的表达相比的蛋白质的相对表达来报告。NFκB的活性使用在EC和SMC中感染的腺病毒NFκB-荧光素酶(Ad-NFκB-luc)报告物来评估。
[0382] (b)结果
[0383] 如图6展示,不同浓度的oxLDL对于基因表达的效应在动脉粥样硬化易发性血液动力学环境与传统静态培养物之间进行比较。这些数据进一步与没有oxLDL的“健康”血液动力学条件比较。(在图6中,“健康”指示施加动脉粥样硬化预防性血液动力学,“动脉粥样硬化易发性”指示施加动脉粥样硬化易发性血液动力学;并且“传统”指示施加静态培养条件。平均值±SE,n=4,*p<0.05,t-测试。)血液动力学环境显著调控许多促和抗炎症基因(IL8、E-选择素(SELE)、KLF2、eNOS)。与nLDL相比,对于添加oxLDL的响应产生取决于血液动力学环境的基因表达的剂量依赖性变化。
[0384] 具体地说,传统静态培养物中的以前公开的研究展示HO-1和ATF3是“典型”oxLDL敏感基因。如图6A和6B展示,与传统静态条件相比,oxLDL在动脉粥样硬化易发性条件下以高得多的水平活化这些基因。
[0385] 只有动脉粥样硬化易发性条件才有的,还发现oxLDL活化炎症基因如IL8和E-选择蛋白(SELE),这些基因在传统静态培养物中未得到调控(图6C和6D)。有趣地,oxLDL减少动脉粥样硬化预防性信号转导(eNOS和KLF2)(图6E和6F)。
[0386] 图7示出在动脉粥样硬化易发性血液动力学环境中的响应于oxLDL处理的蛋白质表达的变化。与基因表达一致,oxLDL处理导致VCAM-1蛋白质表达升高(促炎症性;图7A)和动脉粥样硬化预防性eNOS信号转导的磷酸化减少(图7B)。此外,oxLDL处理导致分泌细胞因子,如IL6、IL8和MCP-1的水平增加(图7C-7E)。在图7中,平均值±SE,n=4,*p<0.05,t-测试。
[0387] 因为许多受oxLDL影响的基因和蛋白质是NFκB依赖性的,所以NFκB活性在内皮细胞和平滑肌细胞中使用荧光素酶报告物来评估。图8展示在内皮细胞中(图8A),与健康条件相比,动脉粥样硬化易发性血液动力学使细胞对于升高的NFκB活性“预敏化”。此响应通过用oxLDL处理来进一步增强。同样地,平滑肌细胞(图8B)通过用oxLDL处理展示升高的NFκB信号转导(虽然oxLDL添加至只包含内皮细胞的上部容积)。在图8中,平均值±SE,n=4,*p<0.05,t-测试。
[0388] 完全基因组阵列用于调查50μg/ml nLDL与50μg/ml oxLDL之间的在动脉粥样硬化易发性条件内的EC和SMC的基因表达差异。图9展示5个供体(内皮细胞)或4个供体(平滑肌细胞)的在两个不同条件下的基因表达的热图。使用严格统计截止标准(SAM和wLPE方法),如与用nLDL处理的细胞相比,688个基因在内皮细胞中得到调控并且304个基因在平滑肌细胞中得到调控。这些基因图富集有剪切应力调控、促-(VCAM、E-选择蛋白)和抗-(KLF2、eNOS)炎症基因。
[0389] 总而言之,在传统静态培养物中,已知oxLDL活化一些途径(HO-1、ATF3),但是不活化其它途径(E-选择蛋白、IL6)。在这里,发现在动脉粥样硬化易发性血液动力学环境内添加oxLDL优先减少内皮“动脉粥样硬化预防性”信号转导(KLF2、eNOS表达和磷酸化),并且进一步活化促炎症性信号转导,包括粘附分子表达和细胞因子分泌。虽然未直接暴露于动脉粥样硬化易发性剪切应力或LDL,许多基因在此共培养系统中的潜在SMC中受这些条件调控,包括炎症基因。调查生理剪切应力情形内的oxLDL的作用发现增强动脉粥样硬化易发性调控基因谱朝向更加促炎症性的表型。这些条件模拟存在于人动脉中的血管壁炎症并且提供测试旨在处理晚期动脉粥样硬化的药物的理想环境。
[0390] (ii)血液动力学环境中的TNFα的效应
[0391] (a)方法
[0392] TNF-α是有效炎症细胞因子。TNF-α的浓度按照患有慢性心力衰竭的患者的严重程度来调节至~0.02ng/ml的水平,而在健康个体中,TNF-α通常低得多或不可检测到。如以上提及,在患有心血管疾病的人体内检测到的TNFα的循环水平为约0.01ng/ml至约0.1ng/ml。在健康个体中,TNFα的循环水平低得多或不可检测到,例如约0ng/ml至约
0.001ng/ml。相比之下,静态体外实验通常使用1-10ng/ml的TNFα浓度。
[0393] 平滑肌细胞和内皮细胞以与如上对于oxLDL实验所述的相同的方式涂铺于TRANSWELL的多孔膜的第一和第二表面。
[0394] 用动脉粥样硬化预防性或动脉粥样硬化易发性血液动力学力来剪切应力预调节24小时之后,TNFα以0.05-1ng/ml的浓度添加至上部容积(含有内皮细胞)(参见图5)。
TNFα的此浓度类似于在患有心血管疾病的患者中所观察到的TNFα的血浆浓度。在TNFα存在下,剪切应力施加再继续24小时。
[0395] (b)结果
[0396] 如图10展示,发现与传统静态培养物相比,血液动力学预敏化18-24小时使内皮细胞和平滑肌细胞对于较低水平TNFα敏化。用0.1-1ng/ml TNFα处理内皮细胞诱导在相同水平下未见于静态培养物中的炎症响应,如经受动脉粥样硬化易发性血液动力学力的培养物中的E-选择蛋白、ICAM、VCAM和IL8的表达增加所示出。在图10中,“传统”指示细胞在静态条件下培养,并且“疾病”指示细胞经受动脉粥样硬化易发性血液动力学力。图10中的数据展示为平均值±SE,n=4,*p<0.05,t-测试。
[0397] (iii)血液动力学环境中的oxLDL和TNFα的效应
[0398] (a)方法
[0399] 为了模拟动脉粥样硬化的更多炎症阶段,需要将多个循环因子组合以更好地模拟存在于人血管中的复杂性。对于这些实验,内皮细胞和平滑肌细胞以如上所述相同的方式涂铺并且经受动脉粥样硬化易发性剪切应力预调节18-24小时。然后,将上部容积中的培养基更换成含有0.05ng/ml TNFα和50μg/ml oxLDL的培养基。只含有50μg/ml nLDL的培养基用作对照。
[0400] 用动脉粥样硬化预防性或动脉粥样硬化易发性血液动力学力24小时剪切应力预调节之后,将50μg/ml oxLDL和0.05ng/ml TNFα添加至上部容积(含有内皮细胞)。TNFα的此浓度类似于在患有心血管疾病的患者中所观察到的TNFα的血浆浓度。在未接收oxLDL的设备中,nLDL以相同浓度添加至上部容积并且用作媒介物对照。在TNF-α和oxLDL存在下,剪切应力施加再继续24小时(参见图5)。基因表达分析使用RT-PCR来执行。
[0401] (b)结果
[0402] 这些因子的组合(oxLDL和TNFα)在基因和蛋白质表达中展示协同增加,同时与单独oxLDL或TNFα相比,也提供更广泛的信号转导活化。图11A展示与单独oxLDL相比,E-选择蛋白(SELE),一种促炎症性粘附分子的基因表达升高。因此,类似于图6展示的结果,与用nLDL处理的对照相比,oxLDL导致更高水平的E-选择蛋白基因表达。添加TNFα与oxLDL导致甚至更大水平的炎症基因表达。
[0403] 另外,经由eNOS转录(NOS3)的动脉粥样硬化预防性信号转导在炎症条件下大大减少。此响应通过动脉粥样硬化易发性剪切应力+oxLDL+TNFα的组合来放大(图11B)。因此,eNOS基因表达(NOS3)通过oxLDL来减少,但是使用TNF-α与oxLDL的组合,动脉粥样硬化预防性信号转导甚至进一步被抑制。最终产物是与单独动脉粥样硬化易发性相比,具有较高基础水平的炎症信号转导的系统。
[0404] (iv)血液动力学环境中的高密度脂蛋白(HDL)的效应
[0405] (a)方法
[0406] 不同于nLDL或oxLDL的血浆胆固醇的额外组分是HDL。为了评估血液动力学环境中的HDL的效应,内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来涂铺并且经受使用动脉粥样硬化易发性血液动力学力的24小时剪切应力预调节。然后,将HDL以45-1,000μg/ml的浓度添加至上部容积。此广泛范围反映可存在于人患者体内的广泛范围的HDL浓度。处于血管疾病风险的个体中的HDL浓度总体上小于约300μg/ml,而健康个体中的HDL浓度在大于约300μg/ml直至约2,000μg/ml健康锻炼患者范围内。
[0407] 在额外实验中,将如上所述来涂铺的内皮细胞/平滑肌细胞共培养物在血液动力学剪切应力下预处理16小时。从16-24小时,在上部容积中,细胞另外用0.05ng/ml TNFα和50μg/ml oxLDL预敏化(与含有50μg/ml nLDL的媒介物对照相比)。在24小时,将45μg/ml或90μg/ml HDL添加至上部容积中的培养基并且血液动力学剪切应力再持续24小时(24-48小时)。
[0408] (b)结果
[0409] 添加45μg/ml或90μg/ml的HDL活化许多动脉粥样硬化预防性基因,同时阻断促炎症性基因和蛋白质的活化。
[0410] (v)血液动力学环境中的含有脂蛋白的甘油三酯的效应
[0411] 甘油三酯(TG)是心血管疾病的重要生物标记物。包括极低密度脂蛋白(vLDL)和vLDL残余以及乳糜微粒(CM)残余的富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)的一些物质,似乎与LDL独立地促进动脉粥样化形成。健康患者中的TG水平在约40至约150mg/dL范围内。在患有高甘油三酯血症的患者中,TG水平在大于约200mg/dL至约1500mg/dL范围内。
[0412] 内皮细胞/平滑肌细胞共培养物可如上所述来涂铺并且用动脉粥样硬化易发性剪切应力预处理24小时。含有TG的脂蛋白,包括极低密度脂肪蛋白(vLDL)、乳糜微粒(CM)以及vLDL和CM的残余颗粒可以500mg/dL,代表在患有高甘油三酯血症的患者中所见的水平的浓度,添加至系统。每个组分的处理浓度基于这些组分中的每一种所代表的TG的分率:对于高甘油三酯血症条件,vLDL构成约53%的TG,因此0.53x500mg/dL=265mg/dL;CM构成约38%的TG,因此0.38x500mg/dL=190mg/dL。这可与基于150mg/dL的甘油三酯的循环水平(代表在健康患者中所见的水平)的对照条件相比较,其中对于vLDL为80mg/dL并且对于CM为57mg/dL。24小时血液动力学预调节之后,对于实验的剩余24小时,可添加vLDL、CM或vLDL+CM。vLDL和CM残余样蛋白质(RLP)可通过用脂蛋白脂肪酶(LPL)处理以上列出的相同浓度来产生。RLP可个别地或与vLDL和/或CM组合来添加。
[0413] (vi)血液动力学环境中的葡萄糖与TNFα组合的效应
[0414] (a)方法
[0415] 糖尿病是特征在于胰岛素和葡萄糖稳态发生改变的疾病。在健康个体中,血糖浓度为约5至约10mM,而在糖尿病个体中,血糖浓度在大于约10mM至约20mM范围内。糖尿病和相关联的升高的葡萄糖水平是动脉粥样硬化的风险因素。
[0416] 内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来涂铺。施加剪切应力之前四天时间,内皮细胞和平滑肌细胞在发现于大多数培养基制剂中的升高葡萄糖(15mM)或基础葡萄糖(5mM)条件的存在下培养,所述培养基制剂补充有作为葡萄糖的媒介物对照的甘露糖以考虑到渗透性的潜在变化。然后,培养物在动脉粥样硬化易发性血液动力学下预处理24小时,随后再暴露于0.05ng/ml TNFα(类似于患有心血管疾病的患者中所观察到的循环水平的浓度)24小时。在实验结束后,收集RNA以经由RT-PCR来进行基因表达分析。在一些实验中,内皮细胞用具有NFκB-荧光素酶构建体的腺病毒来感染,所述构建体经由荧光素酶测定来测量NFκB活性。评估NFκB活性以及促炎症性基因(E-选择素和ICAM)和抗炎症基因(KLF2和eNOS)。
[0417] (b)结果
[0418] 细胞长期暴露于升高水平的葡萄糖,然后针对血液动力学实验来涂铺。对于图12展示的实验,对于实验的剩余部分,在升高的葡萄糖存在下,内皮细胞使用动脉粥样硬化易发性血液动力学力来预处理。在实验结束时,评估随着葡萄糖处理与TNFα而变化的基因表达和NFκB活性。
[0419] 虽然升高的葡萄糖对于基础水平的基因(未处理)没有效应,但是与甘露糖对照相比,用动脉粥样硬化易发性剪切应力和TNF-α处理的样品在用升高的葡萄糖预处理时具有较高水平炎症信号转导。图12A和12B表明升高的葡萄糖增加炎症信号转导的活化,包括NFκB(图12A)活性和粘附分子E-选择蛋白和ICAM的下游基因活化(图12B)。与甘露糖处理的对照相比(图12C),升高的葡萄糖也导致动脉粥样硬化预防性信号转导(eNOS、KLF2)的较大减少。图12中的结果呈现为平均值±SE,n=4,*p<0.05,t-测试。
[0420] 实施例3:高血压的体外模型
[0421] (i)血管紧张素II(ANG2)
[0422] 血管紧张素II(ANG2)水平在患有心血管并发症,如动脉粥样硬化、糖尿病或高血压的患者中增加。在健康患者中,ANG2的典型浓度在约1nM至约5nM范围内,并且在高血压患者中大于约6nM至约20nM。
[0423] 为了评估血液动力学环境中的ANG2的效应,内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来涂铺并且经受使用健康和动脉粥样硬化易发性血液动力学力的24小时剪切应力预调节。10nM(10.46ng/ml)浓度的ANG2或DMSO媒介物对照(VEH)添加至上部容积并且收集RNA以进行基因阵列分析。
[0424] 与DMSO媒介物对照相比的此条件的基因阵列分析显示通过ANG2上调的许多显著炎症基因。图13展示在健康和动脉粥样硬化易发性(疾病)条件下用ANG2处理的内皮细胞(图13A)和平滑肌细胞(图13B)的基因表达热图。如图13所见,许多基因通过ANG2来显著调控并且ANG2条件以公正的方法分选在一起。
[0425] (ii)醛固酮
[0426] 醛固酮是在肾素-血管紧张素系统中的ANG2下游的重要信号转导激素。它的水平可在包括动脉粥样硬化、糖尿病和高血压的多个病状下变化。在健康个体中,醛固酮的浓度为约0.3mM。在患有醛固酮过多症的个体中,醛固酮浓度在约0.8mM至约1mM范围内。
[0427] 为了评估血液动力学环境中的醛固酮的效应,内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来涂铺并且经受使用健康和动脉粥样硬化易发性血液动力学力的24小时剪切应力预调节。1mM浓度的醛固酮或媒介物对照(VEH)添加至上部容积并且收集RNA以进行基因阵列分析。
[0428] 与DMSO媒介物对照相比的此条件的基因阵列分析显示通过醛固酮上调的许多显著炎症基因。图14展示在健康和动脉粥样硬化易发性(疾病)条件下用醛固酮(醛)处理的内皮细胞和平滑肌细胞的基因表达热图。许多显著基因通过这些条件来调控,其中大部分调控基因存在于动脉粥样硬化易发性血液动力学环境中。
[0429] 实施例4:生理体外肝模型
[0430] 静态肝细胞培养方法受不佳的体外体内相关性影响,部分地归因于缺乏在体内随着时间的推移保持代谢表型的生理参数。本发明人现在发现与标准静态肝细胞胶原凝胶配置相比,恢复生理血液动力学和运输保持体外肝细胞表型和功能。
[0431] 为了重新产生具有类似于体内肝循环的流体力学和运输的肝细胞系统,使用基于锥板式设备的技术,其广泛用于重新建立体内血管细胞表型,通过在体外重新产生血管内皮细胞暴露于人衍生血液动力学血液流动力。此技术描述于美国专利号7,811,782中,其内容通过引用并入本文。此技术(图15B)经过调适和修改以设计大鼠肝单一培养物系统,其采用反映体内肝循环值的血液动力学流动和运输条件。设备中的细胞的配置(图15C)基于肝小叶的体内微体系结构(参见图15A),其中肝细胞条带通过内皮细胞过滤层与肝窦血液流动分离。此设计使用悬浮于细胞培养容器中的多孔聚碳酸酯膜,其中在多孔膜的一侧上,原代大鼠肝细胞夹在胶原凝胶中。多孔膜与存在于肝中的肝窦内皮细胞过滤层类似地来起作用。培养基连续灌注于多孔膜的两侧,同时从一系列生理血液流动值获得的血液动力学力连续施加至多孔膜的非细胞侧。整个设置容纳于具有5%CO2和37℃的受控环境中。有效地建立基于流动的培养系统,由此肝细胞被屏蔽以避免受流动的直接效应影响,如其在体内那样。通过再现血液动力学并且在被设计来模拟肝窦的微观结构的系统中导致稳定保留与体内肝的表型类似的分化肝和代谢表型。
[0432] 方法
[0433] (i)动物手术和肝细胞分离
[0434] 用于实验的所有动物根据由HemoShear动物护理和使用委员会(HemoShear’s Animal Care&Use Committee)批准的方案来处理。通过修改的Seglen两步胶原酶灌注程序使用20mL/min流动速率将肝细胞与雄性Fischer大鼠(250g-350g)分离(Seglen,Hepatocyte Suspensions and Cultures as Tools in Experimental Carcinogegnesis,J.Toxicology&Environmental Health,5(2-3):551-560(1979),其内容通过引用并入本文)。简单地说,将大鼠用异氟醚麻醉,之后将腹腔切割并且下腔静脉插套管,同时切除制成++门静脉以便流出。肝分两步灌注,首先用无Ca -的缓冲液以冲掉血液并且分裂细胞间结,++
随后用含Ca -缓冲液中的胶原酶以消化细胞外胶原基质。肝适当地灌注之后,将它切除并且在无菌罩下的皮氏培养皿中从被膜中释放。富集肝细胞群体(~95%纯度)通过各自10分钟的两个依序65g离心和洗涤循环,随后使用90%PERCOLL(涂布有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的15-30nm直径的胶颗粒(水中的23%w/w);用于建立可用于分离细胞的密度梯度)的10分钟旋转来获得。肝细胞的生存力通过锥虫蓝排除测试来确定并且使用具有
85%生存力的细胞。
[0435] (ii)细胞培养和设备操作条件
[0436] 肝细胞培养基:对于图16-20展示的数据,大鼠肝细胞培养基包含基础培养基DMEM/F12,其含有高葡萄糖(17.5mM),补充有胎血清(在涂铺时为10%并且24小时之后减少至2%以便维持)。培养基还包含庆大霉素(50μg/ml)、ITS(胰岛素浓度2μMol)、1%NEAA、1%GLUTAMAX和地塞米松(在涂铺时1μM并且24小时之后,250nM以便维持)。
[0437] 对于表4和图36和37中展示的数据,大鼠肝细胞培养基包含基础培养基DMEM/F12,其含有低葡萄糖(5.5mM),补充有HEPES(3%vol/vol)和胎牛血清(在涂铺时为10%vol/vol并且24小时之后减少至2%以便维持)。培养基还包含庆大霉素(50μg/ml)、ITS(胰岛素浓度2nMol)、1%NEAA、1%GLUTAMAX和地塞米松(在涂铺时1μM并且24小时之后,100nM以便维持)。
[0438] 为了培养人或犬肝细胞,培养基包含基础培养基DMEM/F12,其含有低葡萄糖(5.5mM),补充有HEPES(3%vol/vol)和胎牛血清(在涂铺时为10%vol/vol并且24小时之后减少至2%以便维持)。培养基还包含庆大霉素(50μg/ml)、ITS(胰岛素浓度2nMol),和地塞米松(在涂铺时1μM和24小时之后为100nM以便维持)。
[0439] 胶原涂布和涂铺:胶原溶液通过在预定比率的无菌蒸馏水、10X磷酸缓冲盐水(PBS)和0.2N氢氧化钠中混合I型大鼠尾部胶原来制成(为了构成1ml,组分分别为440μl、375μl、100μl和85μl)。
[0440] 对于经受静态条件的培养物,100mm组织培养物处理的无菌细胞培养皿用7μl/2
cm 胶原溶液涂布。对于经受受控血液动力学的培养物,75mm TRANSWELLS(聚碳酸酯,10μm
2
厚度和0.4μm孔径,no.3419,Corning)的多孔膜的下表面用7μl/cm 胶原溶液涂布。允
2
许溶液胶凝一小时之后,表面用DPBS洗涤,肝细胞以125,000个活细胞/cm 的接种密度涂铺,并且4小时之后添加第二层胶原凝胶。1小时之后,将TRANSWELLS翻转并且安置于细胞培养皿中,并且添加培养基(下部容积中9ml和上部容积中6ml)。7ml培养基添加至用于静态培养的组织培养皿。24小时之后,培养基转换成维持培养基(含有2%FBS),并且将含有TRANSWELLS的细胞培养皿安置于锥板式设备中。受控血液动力学施加至上部容积中的TRANSWELL的多孔膜的表面。
[0441] 冷冻保存的人肝细胞从商业供应商(Kaly-Cell,France)采购并且根据供应商规定方案来解冻。对于涂铺人肝细胞,我们遵循如上对于大鼠肝细胞所述的类似程序,但是使用有限细胞接种区域。第二层胶原如上所述来施加。
[0442] 来自小猎犬的新鲜分离犬肝细胞从商业供应商(Triangle Research Laboratories,Research Triangle Park,North Carolina)采购并且根据供应商规定方案来处理。对于涂铺犬肝细胞,我们遵循如上对于大鼠肝细胞所述的类似程序,但是使用有限细胞接种区域。第二层胶原如上所述来施加。
[0443] 操作条件:基于牛顿流体压力驱动流动穿过滚筒的公式来计算典型肝窦的以2
dyne/cm(τ)为单位的剪切应力,
[0444]
[0445] 使用来自文献的跨越肝窦的压力梯度(ΔP)、肝窦半径(r)和肝窦长度(1)的参考值。作为最初优化过程的一部分,通过改变培养基粘度和圆锥体速度来获得的一系列施加剪切应力条件被发现与跨越膜的辣根过氧化物酶染料的不同运输概况相关联,所述一系列施加剪切应力条件产生从文献预测的值的一个数量级内的速率。这些剪切应力条件在培养7天后针对肝细胞的基因表达谱来加以测试(数据未展示)。在静态培养物与仅灌注而未施加任何剪切的培养物之间未观察到差异,并且基于基因表达谱,对于在此实例中描述的
2
所有实验选择0.6dyne/cm 的操作剪切速率。
[0446] (iii)表型、功能、代谢和毒性参数的评估
[0447] RT-PCR:通过培养期结束时(7或14天)从来自在健康和脂肪肝条件下运作的设备的肝细胞中提取RNA并且对于此RNA执行RT-PCR来评估代谢、毒性和胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因的变化。将TRANSWELLS从设备中去除并且用PBS洗涤,然后将细胞从多孔膜上刮掉。总RNA使用PURELINK RNA微型试剂盒(用于从细胞纯化总RNA的试剂盒)来分离并且使用ISCRIPT cDNA合成试剂盒(cDNA合成试剂盒)来逆转录至cDNA。对于代谢基因CYP1A1、CYP1A2、CYP3A2、MDR和GST以及胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因GPAT、ACC1、IRS-2、PPAR-γ、SREBP、ChREBP、LXR、SCD1、CPT1来设计引物。引物序列展示于下表1中:
[0448] 表1:大鼠引物序列
[0449]
[0450] RNA表达通过使用IQ SYBR Green Supermix(RT-PCR的PCR试剂混合物)和具有C1000热循环仪的CFX96实时系统(RT-PCR检测系统和热循环仪)的实时RT-PCR来分析。RNA数据针对β2-微球蛋白的内源性表达来标准化并且作为与健康培养物相比的相对数量来报告。
[0451] 针对代谢和毒性实验来评估的人基因包含CYP1A1.CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、GSTA1、UGT1A1、GSR、SORD、TXNRD1和APEX1。这些基因的引物序列展示于表2中。针对代谢来评估的犬基因包括CYP1A1和CYP3A12(引物序列展示于表3中)。
[0452] 表2:人引物序列
[0453]基因 正向(SEQ ID NO.) 反向(SEQ ID NO.)
CYP1A1 GGACCTGAATGAGAAGTTCTACAGC(43) AGCTCCAAAGAGGTCCAAGACGAT(44)
CYP2A6 TCATAGCCAAGAAGGTGGAGCACA(45) CCCAATGAAGAGGTTCAACGTGGT(46)
CYP2B6 GGGCACACAGGCAAGTTTACAA(47) AGAGCGTGTTGAGGTTGAGGTTCT(48)
CYP2C9 TGACTTGTTTGGAGCTGGGACAGA(49) ACAGCATCTGTGTAGGGCATGT(50)
CYP2D6 ACGACACTCATCACCAACCTGTCA(51) AGGTGAAGAAGAGGAAGAGCTCCA(52)
CYP3A4 CTGCATTGGCATGAGGTTTGCTCT(53) AAATTCAGGCTCCACTTACGGTGC(54)
CYP3A5 CTGCATTGGCATGAGGTTTGCTCT(55) AGGGTTCCATCTCTTGAATCCACC(56)
GSTA1 GATGCCAAGCTTGCCTTGAT(57) AGGGAAGCTGGAGATAAAGACTGGA(58)
UGT1A1 GGCCCATCATGCCCAATATGGTTT(59) GCATCAGCAATTGCCATAGCTTTC(60)
SORD TAGCGCCACCAGAAGCGACCAAA(61) TCATTTGGGCCTGGTTCAGGGATA(62)
APEX1 CCAGCCCTGTATGAGGACC(63) GGAGCTGACCAGTATTGATGAGA(64)
GSR CACTTGCGTGAATGTTGGATG(65) TGGGATCACTCGTGAAGGCT(66)
TXNRD1 ATATGGCAAGAAGGTGATGGTCC(67) GGGCTTGTCCTAACAAAGCTG(68)
[0454] 表3:犬引物序列
[0455]基因 正向(SEQ ID NO.) 反向(SEQ ID NO.)
CYP1A1 CACCATCCCCCACAGCACAACAAA(69) GCTCTGGCCGGAATGCAAATGGAT(70)
CYP3A12 GAGAGAATGAAGGAAAGTCGCC(71) GCCACCAGCTCCAAATCAGA(72)
B2MG TCCTCATCCTCCTCGCT(73) TTCTCTGCTGGGTGTCG(74)
[0456] 尿素和白蛋白测定:在不同时间点从静态培养物和设备收集的培养基使用基于大鼠特异性ELISA的试剂盒(Bethyl Laboratories)根据制造商方案针对白蛋白来进行测定。尿素使用标准比色测定(QUANTICHROM尿素测定试剂盒,DIUR-500,Gentaur)从培养基样品来估计。系统之间的所有测量标准化成每百万个细胞/日速率以便基于所灌注培养基的体积和最初涂铺细胞的数量来进行比较。
[0457] 蛋白质印迹:施加受控血液动力学之后,TRANSWELL的多孔膜的1/3涂铺表面(~180万个细胞)针对蛋白质来收获于含有新鲜150mM DTT和蛋白酶抑制剂(HALT蛋白酶抑制剂混合物(Pierce)+1mM PMSF+200mM DTT)的150μl 1X RIPA缓冲液中。样品在上以
5×1秒脉冲超声波处理,允许在冰上静置30分钟并且在冷却微型离心机中以17,000×g离心10分钟。蛋白质测定使用A660nm蛋白质试剂(Pierce)来进行。样品在70℃下煮沸10分钟,然后在7.5%TGX凝胶(预模制聚丙烯酰胺凝胶,BioRad)上运作,然后湿转移至0.2μm PVDF膜并且在室温下在5%脱脂乳中阻断10分钟。膜在4℃下在兔抗UGT抗体(Cell Signaling,1∶500稀释)中孵育过夜。二级抗体(Santa Cruz,山羊抗兔HRP,
1∶5000稀释)在室温下孵育一小时。化学发光信号使用SUPERSIGNAL WEST PICO(辣根过氧物酶的化学发光底物,Pierce)试剂来显影并且使用Innotech ALPHAEASE成像系统来捕获。对于标准化,凝胶针对小鼠抗β-肌动蛋白(Sigma A1978,1∶2000稀释)来探测,随后针对次级山羊抗小鼠HRP(Santa Cruz sc-2005,1∶10,000稀释)来探测。
[0458] 免疫染色和胆活性染色:所使用的抗体:Hnf4a(Santa Cruz sc-8987)、E-钙粘着蛋白(Santa Cruz sc-71009)和抗-Mrp2(Abcam ab3373)。在实验设计中的选定时间点,经受受控血液动力学的一个或多个静态培养物用1xPBS轻轻地洗涤,然后其用4%多聚甲醛固定30分钟。样品在4℃下存储在PBS中直到其免疫染色为止。对于免疫染色,样品首先用0.1%TRITON X(非离子表面活性剂)渗透20分钟,然后用PBS洗涤并且用5%山羊血清阻断。与一级抗体一起孵育是以1∶100稀释度历时1小时。用具有1%BSA的PBS洗涤3次之后,二级抗体再以1∶500的稀释度添加一小时。然后,样品用PBS加上1%BSA洗涤,然后封固用于共焦成像。
[0459] 对于小管结的胆活性的成像,TRANSWELL的多孔膜的切片用PBS洗涤并且用含有10μM羧基-2,7-二氯荧光素双醋酸酯(CDFDA)的培养基孵育10分钟。然后,样品用PBS洗涤并且安置于载玻片上用于共焦成像。
[0460] 透射电子显微术:透射电子显微术如下实施例5中所述来执行。
[0461] 细胞色素活性测定:肝细胞在锥板式设备中在静态或受控血液动力学条件下培养五天,然后用0.1%二甲亚砜(DMSO)或细胞色素酶的已知诱导剂(3-甲基胆蒽和地塞米2
松)处理48小时。将大约2cm 面积的多孔膜片段切除并且转移至标准24孔板与相应静态培养物置于一起。细胞用含有制造商建议浓度下的来自商购P450-GLO试剂盒(用于发光细胞色素p450测定的试剂盒)的底物的500μl肝细胞培养基来孵育。4小时之后,培养基转移至96孔板并且根据制造商方案来测定发光代谢物以反映细胞色素p450活性。然后,相同多孔膜片段或静态孔中的细胞的ATP含量通过CELLTITER-GLO测定(用于发光细胞生存力测定的试剂盒)使用制造商方案来估计,并且细胞色素值针对ATP含量标准化。
[0462] 为了评估人肝细胞的CYP活性和诱导响应,将细胞涂铺并培养于锥板式设备中并且在如上所述的操作条件下经受受控血液动力学或在静态条件(对照)下培养7天,然后暴露于0.1%DMSO或已知CYP诱导剂药物苯巴比妥(对于静态为500μM并且对于设备为50μM)或利福平(对于静态为25μM并且对于设备为2.5μM)72小时。然后,肝细胞用含有CYP底物的混合物[(乙氧基试卤灵(10μM)、咪达唑仑(3μM)、丁呋洛尔盐酸盐(10μM)、(S)-美芬妥英(50μM)、安非他酮盐酸盐(100μM)和双氯芬酸钠(10μM)]的培养基孵育
4小时。然后,将培养上清液收集并且通过HPLC分析代谢物的形成以评估特定CYP酶的比活性。所有值针对细胞的蛋白质含量来标准化。
[0463] 糖质新生测定:如上所述来分离并且涂铺的原代大鼠肝细胞在锥板式设备中在受控血液动力学下培养7天。肝细胞用PBS洗涤并且在存在或不存在调控性激素胰岛素(2nM)或胰高血糖素(100nM)下在无葡萄糖培养基中孵育,并且添加底物甘油(2mM)或乳酸酯(20mM)和丙酮酸酯(2mM)。4小时之后,将上清液收集并且使用比色AMPLEX RED试剂盒(葡萄糖/葡萄糖氧化酶测定试剂盒,Life Technologies)根据制造商说明书来测定葡萄糖含量。葡萄糖值针对细胞裂解物的蛋白质含量来标准化。
[0464] MTT测定:为了评估人肝细胞的毒性响应,将细胞涂铺并且在锥板式设备中在血液动力学条件下使用如上所述的操作条件培养或在静态条件(对照)下培养7天,然后暴露于0.1%DMSO或已知毒性药物氯丙嗪(0.1μM、1μM和10μM)72小时。然后,肝细胞用含有1mg/ml MTT试剂(噻唑基四唑蓝溴化物)的培养基孵育1小时,然后细胞在DMSO中裂解以释放所形成的甲臜蓝染料。将溶液转移至96孔板并且吸光度在595nm下读取。
[0465] 活-死染色:为了评估人肝细胞的毒性响应,将细胞涂铺并且在锥板式设备中在血液动力学条件下使用如上所述的操作条件培养7天或在静态条件(对照)下培养,然后暴露于0.1%DMSO或已知毒性药物氯丙嗪(0.1μM、1μM和10μM)72小时。治疗期结束时,肝细胞用PBS洗涤,然后在2μM钙黄绿素AM和4μM乙锭同型二聚体-1(EthD-1)的浓度的LIVE/DEAD生存力/细胞毒性试剂(Invitrogen)中孵育30分钟。然后,将细胞封固在盖玻片之间并且使用共焦显微镜成像。
[0466] miRNA122测定:将大鼠肝细胞涂铺并在锥板式设备中在受控血液动力学下培养或在静态条件(对照)下使用如上所述的操作条件培养7天。然后,肝细胞用PBS洗涤并且用具有或不具有两种不同浓度(1μM和10μM)的已知毒性药物氯丙嗪(CPZ)的无血清肝细胞培养基孵育4小时。将来自细胞的上清液收集并且微小RNA提取使用MIRNEASY血清/血浆试剂盒(用于提取微小RNA的试剂盒,Qiagen)来执行。cDNA通过使用MISCRIPTII RT试剂盒(用于制备cDNA的试剂盒,Qiagen)来制备并且样品使用MISCRIPT SYBR GREEN PCR试剂盒(用于量化cDNA的试剂盒,Qiagen)遵循制造商说明书来量化。
[0467] 结果
[0468] (i)相对于传统静态单一培养物条件,受控血液动力学保持肝细胞表型、极化形态和转运蛋白定位。
[0469] 获得新鲜分离的大鼠原代肝细胞并且涂铺于多孔膜上的胶原凝胶夹层中。1天之后,培养物在37℃的CO2恒温箱中在标准静态条件下继续或引入血液动力学流动技术中并2
且以0.6dyne/cm 的预定间接剪切速率保持于受控血液动力学下。培养基在静态培养物中每48小时更换并且将设备连续灌注。7天之后,将培养物去除并且用4%多聚甲醛固定,然后用肝细胞分化标志物E-钙粘着蛋白和HNF-4α的抗体来免疫染色,并且通过共焦显微术来观测。静态胶原凝胶夹层培养物(图16A)中的E-钙粘着蛋白染色模式显示较高水平的胞质E-钙粘着蛋白,其通过形态测定分析(相邻图)和被破坏的外周膜分布来证实并量化。在受控血液动力学下(图16B),肝细胞展示更分化形态,其特征在于不同外周膜定位和较低胞质水平的E-钙粘着蛋白。HNF4α的染色模式示出定位模式的明显差异,其中静态培养物中的细胞到第7天具有更分散染色模式(图16C),同时受控血液动力学下的细胞保持局限于细胞核的染色(图16D),类似于在体内所见。α在胶原凝胶夹层中培养5-7天之后出现的转运蛋白多药物抗性蛋白质-2(MRP-2)的极化形态和小管定位在静态培养物中到第14天丧失(图16E),但是小管网络模式在受控血液动力学下是稳定和广泛的(图16F)。
针对MRP-2和HNF-4α共染色的保持于受控血液动力学下的第14天培养物(图17A)以及来自大鼠体内肝的切片(图17B)展示非常相似的染色模式。受控血液动力学下的第7天培养物的透射电子显微术图像(图17C)证明除了证实存在胆小管和紧密结以外,亚细胞组分如粗糙和光滑内质网和线粒体得以保留。
[0470] (ii)受控血液动力学导致在14天内,相对于静态培养物,在胶原凝胶配置中大鼠肝细胞中的肝细胞特定功能得以保留。
[0471] 肝细胞在静态或受控血液动力学(0.6dyne/cm2)下培养2周并且培养基在第4、7、11和14天取样。对于培养基执行尿素和白蛋白的测定并且将值标准化成基于最初涂铺细胞数量的每百万细胞的24小时内产生速率。通过从14天内的不同时间点的培养基
6
样品估计并且表达为μg/10 涂铺肝细胞/天的分泌白蛋白反映的肝细胞功能(图18A)示出如与静态培养物相比(虚线),在受控血液动力学下(实线)显著较高水平(3-4倍)(第7天:97.96±11.34相比于25.84±8.22,p=0.00001;第14天:87.80±8.62相比
6
于33.93±4.39,p=0.0001)。表达为μg/10 涂铺肝细胞/天的肝细胞的尿素分泌(图
18B)与静态培养物相比(虚线),在受控血液动力学下(实线)也发现在两周培养始终为-9
4-5倍更高水平(第7天:622.78±33.96相比于139.76±13.37,p=2.7x10 ;第14天:
-6
667.71±84.37相比于178.68±6.13,p=1x10 )。
[0472] (iii)与静态培养物相比,受控血液动力学差异地调控I期和II期代谢基因和蛋白质的表达。
[0473] 肝细胞在静态或受控血液动力学(0.6dyne/cm2)下培养7天。在第7天针对这些条件对于RNA样品执行选择代谢基因的QRT-PCR(表1)。所有值针对第7天静态培养物来标准化。在受控血液动力学下培养的肝细胞导致与静态培养物相比基因表达水平始终较高(n=11,相对于静态培养物的倍数变化:Cyp1A1~54,p=0.0003;Cyp1A2~64,p=0.005,Cyp2B1~15,p=0.001:图19A,Cyp2B2~2.7,p=0.09并且Cyp3A2~4,p=
0.075:图19B)并且更接近于体内水平。有趣地,已知在静态培养物中随着时间的推移而增加的II期酶GST的Pi亚单位的基因的表达水平,与静态培养物相比(图19C),在体内肝(-4.9倍,p=0.152)和在受控血液动力学下培养的肝细胞(-2.3倍,p=0.025)中均较低。
[0474] 肝细胞静态或受控血液动力学(0.6dyne/cm2)下培养。将细胞培养物在第4、7、11和14天卸下并且如方法部分所描述中获得细胞裂解物,针对总蛋白质来标准化,并且将等效样品加载和运作于SDS page凝胶上,然后使用II期酶UGT1A1和β-肌动蛋白(用于标准化)的抗体来探测。蛋白质印迹(图19D)证明在2周培养的所有时间点,与静态条件相比,UGT1 A1在受控血液动力学下上调。在相同实验中,受控血液动力学下的14天培养物的TRANSWELL的多孔膜的一部分用4%多聚甲醛固定并且针对HNF-4a和小管转运蛋白MRP-2来染色,证明MRP-2沿着肝细胞之间的小管结的保留和定位(图17A)。从设备去除之后,将膜的其余部分切除并且直接与底物羧基-2,7-二氯荧光素双醋酸酯(CDFDA)一起孵育。细胞在20分钟时窗内通过共焦显微术成像以观察底物分解成羧基-2,7-二氯荧光素(CDF)和其主动分泌至胆小管结构中(于图17C中发现)。模式非常类似于用MRP-2和HNF-4a的抗体免疫染色的体内肝的切片样品的模式(图17B)。
[0475] (iv)在更多体内类似浓度下,与静态培养物相比,在受控血液动力学下培养的大鼠肝细胞显示较高水平的基础和可诱导细胞色素p450活性。
[0476] 为了证实代谢基因和蛋白质的增加转化成代谢活动的变化,原代大鼠肝细胞如先2
前所描述在锥板式设备中在受控血液动力学(0.6dyne/em)下和在静态胶原凝胶培养物中培养。5天之后,其保持未处理或用0.1%DMSO、1A/1B诱导剂3-甲基胆蒽(3-MC,在静态中为1μM并且在受控血液动力学下为0.1μM)或3A诱导剂地塞米松(在静态中为50μM并且在受控血液动力学下为02.5μM)处理。48小时之后,在第7天,将来自含有在受控血
2
液动力学下培养的肝细胞的设备的大约2.0cm 面积的多孔膜片段切除并且转移至标准24孔板并且与用不同试剂处理的相应静态培养物并行地用底物Cyp p450酶处理。细胞色素p450测定在第7天使用商购P450-GLO试剂盒来进行。4小时之后,培养基转移至96孔板并且测定发光代谢物以反映细胞色素p450活性。值针对通过CELLTITER-GLO测定来评估的细胞的ATP含量来标准化以便获得活细胞的精确表示并且避免胶原凝胶对于总蛋白质测量的任何混淆效应。
[0477] 与静态相比,未处理培养物中的细胞色素p450酶(图20A)的基础活性水平通过受控血液动力学来上调(1A~15倍,1B~9倍和3A~5倍)。尽管较高水平的基础活性,在受控血液动力学下对于经典诱导剂的响应(图20B)较好地保持(对于DMSO相比于3-MC的1A/1B响应-4.87相比于133.06;对于DMSO相比于地塞米松的3A响应-11.64相比于57.53)。
[0478] 虽然最初测量Cyp活性以证实增强基因表达在受控流动下是显著的,但是对于诱导静态培养物所建议的浓度50μM地塞米松在此系统中是有毒的。因此,地塞米松的浓度降低至1μg/ml以便获得诱导响应,其为与在大鼠体内所见的血浆浓度较好相关的水平。类似地,对于3-MC的诱导响应也在受控血液动力学下以10倍更低水平观察到。
[0479] 为了证实在受控血液动力学下转运蛋白活性的存在,来自设备的TRANSWELL过滤器片段与底物羧基-2,7-二氯荧光素双醋酸酯(CDFDA)一起孵育。将化合物分解成荧光形式CDF羧基-2,7-二氯荧光素,其主动地分泌至小管空间,证明有效小管运输(图20C)。
[0480] 如上所述的数据是所执行用以评估将肝细胞暴露于受控血液动力学以便恢复其与体内观察到的表型更类似的表型的效应的实验的结果。这些实验使用在静态培养物中常规使用的标准培养基制剂以便允许与静态胶原凝胶培养物并排比较并且识别受控血液动力学的选择性益处。在这些实验期间,这些受控血液动力学条件下培养的肝细胞证明增强的体内类似表型和功能并且对于诱导剂如地塞米松和3-MC更具有响应性。然而,脂质的一些积累也在以静态系统测定中常规使用的浓度的葡萄糖(17.5mM)和胰岛素(2μMol)来培养的肝细胞中观察到。现在发现当肝细胞在如本文描述的受控血液动力学条件下培养时,可使用类似于在健康个体体内观察到浓度的低得多的浓度的葡萄糖和胰岛素。数据指示这些较低浓度的葡萄糖(5.5mM)和胰岛素(2nM)进一步增强肝细胞功能和代谢活动。此外,肝细胞可在受控血液动力学下在含有较高浓度葡萄糖和胰岛素的培养基中培养以便产生脂肪肝疾病模型,如以下实施例中进一步解释。
[0481] (v)在受控血液动力学下培养的原代大鼠肝细胞证明对于胰岛素和胰高血糖素的响应性。
[0482] 如上所述来分离并涂铺的原代大鼠肝细胞在锥板式设备中在受控血液动力学下培养7天,然后用PBS洗涤并且在存在或不存在调控激素胰岛素(2nM)或胰高血糖素(100nM)的情况下与底物甘油(2mM)或乳酸酯(20mM)和丙酮酸酯(2mM)一起孵育。4小时之后通过AMPLEX RED测定在上清液中测量的葡萄糖水平示出在不存在底物的情况下,胰岛素降低葡萄糖水平27%,同时胰高血糖素将它增加51%。在存在底物甘油的情况下,由肝细胞产生的葡萄糖增加67%。添加胰高血糖素使葡萄糖水平进一步增加15%,而胰岛素使葡萄糖水平降低38%。当乳酸酯和丙酮酸酯用作底物时,肝细胞产生的葡萄糖在胰高血糖素存在下增加80%,而胰岛素使葡萄糖水平降低25%。这些数据总结于表4中。
[0483] 表4.
[0484]
[0485] (vi)在受控血液动力学下培养的冷冻保存人肝细胞证明在体内水平浓度下对于苯巴比妥和利福平的诱导响应。
[0486] 人肝细胞在锥板式设备中在受控血液动力学下在如上所述的操作条件下培养或在静态条件(对照)下培养7天,然后暴露于已知CYP诱导剂药物苯巴比妥(在静态条件中为500μM并且在受控血液动力学条件下为50μM)或利福平(在静态条件下为25μM并且在受控血液动力学条件下为2.5μM)历时72小时。然后,肝细胞用PBS洗涤并且与含有如上所述的CYP底物混合物的培养基一起孵育4小时。然后,将培养上清液收集并且分析代谢物的形成以评估特定CYP酶的比活性。结果针对细胞的蛋白质含量来标准化并且表达为pmol/min/mg蛋白质。如与静态条件相比,具有DMSO 0.1%的媒介物处理对照在受控血液动力学条件下展示较高水平的CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4(分别为7.7相比于4.6、4.6相比于0.5和7.6相比于0.7pmol/min/mg蛋白质)。与在静态条件下的较高浓度(500μM)相比,在受控血液动力学条件下用较低浓度(50uM)的苯巴比妥处理也导致可比较的或较高水平的酶活性CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4(分别为45.9相比于34.3、16.3相比于0.9和16.3相比于3.8pmol/min/mg蛋白质)。类似地,与在静态条件下的较高浓度(25μM)相比,在受控血液动力学条件下用较低浓度(2.5μM)的利福平处理也导致可比较的或较高水平的酶活性CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4(分别为87.3相比于131.1、1.4相比于16.0和11.5相比于23.1pmol/min/mg蛋白质)。这些结果描绘于图33中。
[0487] (vii)在受控血液动力学下培养的冷冻保存人肝细胞证明在体内水平浓度下对于氯丙嗪的毒性响应。
[0488] 如上所述来解冻并涂铺的冷冻保存原代人肝细胞在锥板式设备中在受控血液动力学下培养或在静态条件下培养(对照)7天,然后暴露于不同浓度的氯丙嗪(0.1μM、1μM和10μM)或媒介物对照历时72小时。活-死染色对于肝细胞使用乙锭-钙黄绿素染色剂来执行。肝细胞也与MTT试剂一起孵育1小时以评估生存力。从额外片段提取RNA并且执行RT-PCR以评估选定毒性和代谢基因。在静态条件下培养的肝细胞在所有测试浓度下未展现任何毒性。然而在受控血液动力学下培养的肝细胞证明剂量依赖性毒性,在1μM为30.3%毒性并且在10μuM下为46.4%毒性(图34,右图)。在1μM下,在设备受控血液动力学下培养的肝细胞的毒性也通过活-死染色检测到(图34,左图)。
[0489] RT-PCR证明相对于静态对照,在受控血液动力学条件下,在1μM氯丙嗪下各种氧化应激相关毒性基因上调(对于谷胱甘肽还原酶(GSR)为8.3倍,对于硫氧还蛋白还原应力酶1(TXNRD1)为5.5倍,对于山梨糖醇脱氢酶(SORD)为6.9倍,并且对于APEX核酸酶(多功能DNA修复酶)为2.8倍)。同时,相对于静态对照,某些代谢基因也在受控血液动力学条件下上调(对于细胞色素p450家族1成员A2(CYP1A2)为17.8倍,对于细胞色素p450家族1成员A1(CYP1A1)为8.4倍,并且对于细胞色素p450家族2成员B6(CYP2B6)为5.6倍。这些结果描绘于图35中。图35中展示的结果使用来自KalyCell供体#B0403VT的原代人肝细胞。
[0490] 这些数据表明在受控血液动力学条件下,原代人肝细胞显示临床血浆C最大浓度的氯丙嗪的毒性响应。这些毒性响应与氧化应激相关基因和某些代谢基因的上调相关联。
[0491] (viii)在受控血液动力学下培养的原代大鼠肝细胞响应于体内水平浓度的氯丙嗪暴露而展现急性毒性并且释放miRNA122。
[0492] 如上所述来分离并涂铺的原代大鼠肝细胞在锥板式设备中在受控血液动力学条件下培养或在静态条件下培养(对照)7天。肝细胞用PBS洗涤并且直接与媒介物(蒸馏水)或氯丙嗪(1μM)孵育4小时。将上清液收集并且miRNA 122水平如上所述来测量。发现与媒介物对照相比,在静态条件下,1μM的氯丙嗪不导致上清液中的miRNA 122水平的任何变化。相反,在受控血液动力学条件下培养并且与氯丙嗪(1μM)一起孵育4小时的肝细胞释放显著较高水平的miRNA(超过媒介物对照6倍)。这些结果描绘于图36中。
[0493] (ix)在受控血液动力学下培养的原代大鼠肝细胞响应于体内水平浓度的曲格列酮暴露展现亚致死的毒性并且显示胆汁淤积变化。
[0494] 如上所述来分离并涂铺的原代大鼠肝细胞在锥板式设备中在受控血液动力学条件下培养5天,然后暴露于4μM或40uM曲格列酮48小时。肝细胞用PBS洗涤并且直接与底物10uM羧基-2,7-二氯荧光素双醋酸酯(CDFDA)一起孵育。在20min暴露于非荧光底物CDFDA以允许底物水解成高度荧光Mrp-2底物羧基-2,7-二氯荧光素(CDF)并且其主动分泌至胆小管结构中期间,细胞通过共焦显微术来成像。在4uM下,发现曲格列酮导致具有明显膨胀小管结构的小管模式的变化。在40uM曲格列酮下,这些变化更加显著和广泛得多(图37)。当在受控血液动力学条件下培养时,大鼠肝细胞对于体内/临床血浆C最大浓度的曲格列酮的毒性响应与氧化应激相关基因的上调和MRP3和MRP4基因的补偿性上调相关联(图38)。
[0495] (x)在受控血液动力学下培养的原代犬肝细胞展现极化形态的保留并且显示相对于静态培养物的关键代谢基因的较高表达。
[0496] 新鲜分离的犬肝细胞在锥板式设备中、在受控血液动力学条件下、在与如上对于人肝细胞所述的操作条件类似的操作条件下培养或在静态条件下培养(对照)。7天之后,培养物固定并且分别针对肌动蛋白细胞骨架和细胞核来用鬼笔环肽和Draq5染色。将RNA从细胞收集并且对于特定代谢基因执行RT-PCR。发现犬肝细胞在第7天保持具有多边形形状的极化形态并且与静态对照相比,以显著较高水平来表达CYP1A1和CYP3A12(分别为6.7和7.4倍)。这些结果描绘于图39中。
[0497] 实施例5:脂肪肝疾病的体外模型
[0498] 非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)是肝功能异常的最常见病因并且与肥胖症、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关联。脂肪肝的变化从肝细胞内的早期脂肪囊泡累积(肝脂肪变性)进展到随后丧失肝代谢功能和炎症变化,最后导致纤维化和肝硬化。脂肪肝疾病的动物体内模型已经成功使用高脂肪饮食或低脂肪、高碳水化合物饮食,所述饮食诱导高血糖症和高胰岛素血症以反映诱导甘油三酯积累的糖尿病环境。然而,体外模型通常只使用自由脂肪酸(油酸、棕榈酸或亚油酸)的过载来诱导脂肪变化并且可不能捕获可在疾病的发病机理中发挥关键作用的对于高水平葡萄糖和胰岛素的重新肝细胞响应。也已知静态肝细胞培养物具有显著降低的胰岛素响应,并且标准培养基通常需要较高非生理水平的激素用于基本肝细胞存活和功能。相反,本文描述的模型维持对于药物和激素的更多生理肝细胞响应并且允许我们在更接近体内浓度水平的葡萄糖和胰岛素下保持基本肝功能(如上在实施例4中所述),并且此外允许我们通过产生特征为较高葡萄糖和胰岛素水平的糖尿病样环境来引起在脂肪肝中发现的病理响应。
[0499] 方法:
[0500] (i)动物手术和肝细胞分离
[0501] 动物手术和肝细胞分离如上在实施例4中所述来执行。
[0502] (ii)细胞培养和设备操作条件
[0503] 健康肝细胞培养基:健康肝细胞培养基包含基础培养基DMEM/F12,其含有低葡萄糖(5.5mM),补充有胎牛血清(在涂铺时为10%并且24小时之后减少至2%以便维持)。另外,培养基包含庆大霉素(50μg/ml)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒;胰岛素浓度为2nM)、1%非必需氨基酸(NEAA)、1%GLUTAMAX(含有L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺的培养基补充物)和地塞米松(对于图21和22展示的数据,在涂铺时为1μM并且24小时之后为250nM用于维持;对于图25-32展示的数据,在整个实验中为100nM)。
[0504] 诱导脂肪肝变化的培养基(“脂肪肝培养基”):用于诱导脂肪肝变化的培养基包含基础培养基DMEM/F12,其含有高葡萄糖(17.5mM),补充有胎牛血清(在涂铺时为10%并且24小时之后减少至2%用于维持)。培养基也包含庆大霉素(50μg/ml)、ITS(胰岛素浓度2μMol)、1%NEAA,1%GLUTAMAX,和地塞米松(对于图21和22展示的数据,在涂铺时为1μM并且24小时之后为250nM用于维持;对于图25-32展示数据,在整个实验中为100nM)。
[0505] 胶原涂布和涂铺:胶原溶液如上在实施例4所述来制成。75mm TRANSWELLS(聚碳酸酯,10μm厚度和0.4μm孔径,no.3419,Corning)的多孔膜的下表面涂布有300μl胶2
原溶液。允许溶液胶凝一小时之后,表面用DPBS洗涤,肝细胞以125,000个活细胞/cm 的接种密度涂铺,并且4小时之后添加第二层胶原凝胶。1小时之后,将TRANSWELLS翻转并且安置于细胞培养皿中,并且添加培养基(下部容积中9ml和上部容积中6ml)。24小时之后(即,在实验第2天),培养基更换为维持培养基(如上所述的健康或脂肪肝培养基)并且将皮氏培养皿安置于锥板式血液动力学自喷设备中,并且受控血液动力学施加至上部容积中的TRANSWELL的多孔膜的表面。在一些实验中,维持培养基包含0.1%DMSO媒介物中的1.5μM吡格列酮或单独0.1%DMSO媒介物。细胞在受控血液动力学下培养直到第7天为止,此时肝细胞使用以下描述的测定来检查。
[0506] 操作条件:剪切应力如上在实施例4中所述来计算。使用通过改变培养基粘度和圆锥体速度来产生的并且导致从文献预测的值的一个数量级内的速率的一系列施加剪切2
应力条件(0.1至6dyne/cm)。这些施加剪切应力条件与跨越膜的参考染料辣根过氧化物酶染料的不同运输概况相关。培养物运作7天并且评估脂肪肝变化。
[0507] (iii)测量脂肪肝变化:
[0508] 为了检查在脂肪肝模型中相对于健康对照发生的变化,进行以下评估:
[0509] (a)代谢和胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因的变化(RT-PCR);
[0510] (b)通过油红O测定、尼罗红染色和测量总甘油三酯的肝细胞内的细胞内脂质积累;
[0511] (c)肝细胞分化功能的变化(尿素和白蛋白分泌);
[0512] (d)代谢活动的变化(细胞色素p450测定);和
[0513] (e)通过透射电子显微术(TEM)的肝细胞内的形态变化。
[0514] RT-PCR和尿素和白蛋白测定如上在实施例4中所述来执行。
[0515] 染色方法:肝细胞TRANSWELL膜切片在稀释于PBS中的0.1%Triton-X中渗透20分钟并且在PBS中洗涤三次各自历时五分钟。然后,将样品在5%山羊血清、0.2%印迹等级脱脂奶粉阻滞剂和PBS中的1%BSA中阻断45分钟。然后,将样品在PBS中的0.1%BSA中洗涤三次并且与1∶5000稀释度的尼罗红(1mM储备物)、1∶1000DRAQ5(荧光DNA染料;Cell Signalling)、1∶500ALEXA FLUOR 488偶联鬼笔环肽(Life Technologies),和PBS中的1%BSA一起孵育三十分钟并且避光。将样品在PBS中的0.1%BSA中洗涤三次,每次五分钟并且使用PROLONG GOLD抗褪色封固培养基(抗褪色试剂;Invitrogen)封固于盖玻片。样品在Nikon C1+共焦系统显微镜上成像。
[0516] 透射成像显微术(TEM):含有在健康或脂肪肝条件下培养7天的肝细胞的TRANSWELLS的多孔膜片段用PBS洗涤,然后在含有4%多聚甲醛和2%戊二醛的溶液中固定1小时。然后,将样品发送以便在弗吉尼亚大学(University of Virginia)成像中心TEM处理。TEM图像针对肝细胞内的脂质积累、亚细胞的细胞器如线粒体和平滑和粗糙内质网的出现、极化形态的保留和胆小管来进行评估。
[0517] 油红O测定:肝细胞内的细胞内脂质的积累通过调适并修改商购脂肪变性比色测定试剂盒(Cayman Chemical)来评估。在培养期结束时,将含有来自设备的健康和脂肪肝2
条件下的肝细胞的2cm 大小的多孔膜片段用PBS洗涤并且在4%多聚甲醛中固定30分钟。
然后,这些多孔膜片段用PBS洗涤、完全干燥并且在24孔板中与300μl油红O工作溶液一起孵育20分钟。然后,多孔膜片段用蒸馏水反复洗涤7-8次,随后用在脂肪变性比色测定试剂盒中提供的洗涤溶液洗涤两次各历时五分钟。染料提取溶液(300μl)添加至每个孔并且板在不断搅动下在定轨振荡器中孵育15-30分钟。然后,将溶液转移至透明96孔板并且在分光光度计下,吸光度在490-520nm读取。
[0518] 测量总甘油三酯:甘油三酯含量使用商购比色测定试剂盒(Cayman甘油三酸酯比色测定试剂盒,目录号10010303)来评估。在治疗期结束时,通过用橡胶淀帚和PBS刮落来从多孔膜收集细胞,然后将其离心(在4℃下,2,000x g历时10分钟)。细胞球团重新悬浮于甘油三酯测定试剂盒的100μl冷稀释标准稀释剂中并且以一秒脉冲猝发来超声波处理20次。然后,细胞悬浮液在4℃下以10,000xg离心10分钟。将上清液去除并且根据制造商方案用于测定并且针对来自相同样品的蛋白质含量来标准化。
[0519] 细胞色素活性测定:肝细胞在锥板式设备中、在健康和脂肪肝条件下培养7天。2
将大约2cm 面积的多孔膜片段切除并且转移至标准24孔板与相应静态培养物置于一起。
细胞用含有制造商建议浓度下的来自商购P450-GLO试剂盒的底物的500μl健康肝细胞培养基来孵育。4小时之后,培养基转移至96孔板并且根据制造商方案来测定发光代谢物以反映细胞色素p450活性。然后,相同多孔膜片段或静态孔中的细胞的ATP含量通过CELLTITER-GLO测定使用制造商方案来估计,并且细胞色素值针对ATP含量来标准化。
[0520] 结果:
[0521] 尼罗红染色:图25A和B展示在健康(图25A)或脂肪肝(图25B)培养基中培养的肝细胞用尼罗红、鬼笔环肽和DRAQ5染色。如图25B中可以看出,在脂肪肝培养基(含有高浓度葡萄糖和胰岛素)中培养的肝细胞积累很多脂质小滴。
[0522] 透射电子显微术:在脂肪肝培养基中培养的肝细胞也通过透射电子显微术来检查。如图26展示,在这些条件下培养的肝细胞积累脂质。较大脂质小滴在图像左侧的肝细胞上指示。也展示两个肝细胞之间的空隙结,证明极化形态。
[0523] 总脂质和总甘油三酯:如图27展示,总脂质(图27A)和总甘油三酯(图27B)在肝衍生血液动力学存在下、在高葡萄糖/高胰岛素脂肪肝条件下培养的肝细胞中均显著增加。油红O量化指示如与健康培养物相比,总脂质在疾病培养物中升高约3倍。
[0524] 基因表达:甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是涉及甘油三酯合成并且已知上调并造成脂肪变性和脂肪肝的关键酶。如图21展示,在设备中的受控血液动力学下培养的原代大鼠肝细胞在暴露于病理性病况(n=9)的高胰岛素(2μMol)和高葡萄糖(17.5mMol)时,与培养基中的健康生理水平(n=6)的胰岛素(2nMol)和葡萄糖(5.5mMol)下培养的表达相比,展现GPAT基因的显著较高表达(p=0.04)。结果表达为超过胶原凝胶夹层中的标准静态培养物的倍数增加(2μMol胰岛素和17.5mMol葡萄糖)。
[0525] 在图28B中展示在含有较低浓度地塞米松的健康或脂肪肝培养基中在受控血液动力学下培养的肝细胞的类似结果。如与含有较低水平胰岛素和葡萄糖的健康培养基中培养的肝细胞相比,在高胰岛素/高葡萄糖(脂肪肝)培养基中培养的肝细胞展示显著较高水平的GPAT表达。如图28A展示,如与健康培养基中培养的肝细胞相比,在高胰岛素/高葡萄糖培养基中、在受控血液动力学下培养的肝细胞也展示固醇调控元件结合蛋白(SREBP),另一种负责脂肪生成的关键基因的显著较高水平表达。
[0526] 这些脂肪肝变化伴随有同时出现的代谢变化。在所有关键代谢酶中,细胞色素p450 3A家族负责代谢大部分药物。如图22展示,在培养基中具有健康生理水平(n=6)的胰岛素(2nMol)和葡萄糖(5.5mMol)的设备中受控血液动力学下培养的原代大鼠肝细胞,与具有高胰岛素(2μMol)和高葡萄糖(17.5mMol)水平的病理性病况(n=9)下培养的那些原代大鼠肝细胞相比,展现显著较高表达水平的关键代谢酶细胞色素p450 3a2(Cyp3A2;p=0.03)。与胶原凝胶夹层中的静态培养物相比,受控流动下的健康和病理脂肪肝水平高许多倍(2μM胰岛素和17.5mMol葡萄糖)。
[0527] 类似地,如图29A展示,涉及药物代谢的许多I期酶的表达在低和高葡萄糖/胰岛素条件下差异性调控。在血液动力学流动下,健康培养基条件下的肝细胞保持高水平的Cyp1a1、Cyp 2b1、2b2、Cyp3a2的mRNA表达(分别比传统静态培养物高20、90、30和40倍),而与健康相比,在脂肪肝培养基中培养的肝细胞的Cyp 2b2和Cyp 3a2水平降低9和12倍。
[0528] Cyp活性:如图29B展示,如p45glo测定测量,与健康的相比,在高胰岛素/葡萄糖脂肪肝条件下,CYP3A2和CYP1A1的活性也减少3-6倍。
[0529] 吡格列酮处理:吡格列酮,一种用于治疗脂肪变性的药物,在脂肪肝模型中测试以确定是否它可逆转由高胰岛素/葡萄糖脂肪肝培养基诱导的脂质积累和代谢变化。吡格列酮以1.5μM的浓度,即基于对体内吡格列酮观察到的治疗性C最大来选择的浓度来添加至培养基。吡格列酮有效降低脂质积累和甘油三酯含量,同时恢复疾病条件下的代谢基因表达。如图30展示,尼罗红染色指示用体内治疗浓度的吡格列酮处理可减少脂肪肝条件下的脂质小滴形成。吡格列酮也将在高胰岛素/葡萄糖培养基中培养的肝细胞的总甘油三酯含量减少至与健康条件下培养的肝细胞中出现的水平类似的水平(图31)。此外,如图32展示,吡格列酮恢复高胰岛素/葡萄糖疾病条件抑制的代谢基因如Cyp3A2的表达。
[0530] 结论:
[0531] 总之,开发一种维持体内类似肝细胞表型和响应的系统,以通过在高葡萄糖/胰岛素环境存在下诱导病理脂肪肝变化来产生肝脂肪变性模型。在受控血液动力学下的大鼠肝细胞保持其对于胰岛素和葡萄糖的响应,并且在血液动力学流动下培养的肝细胞在高葡萄糖和胰岛素(‘疾病’)条件下培养时出现脂肪肝变化。脂肪变性经由两个关键基因(SREBP和GPAT)上调的重新脂肪生成来介导,并且脂质积累和甘油三酯含量的增加伴随有同时出现的代谢基因表达和活性降低。与PPAR-γ激动剂吡格列酮处理有助于在高葡萄糖和胰岛素条件下防止脂质积累和代谢活动损失。这些数据展现目前不存在的饮食诱导非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的新颖和重要的新体外模型。
[0532] 实施例6:可诱导多能干细胞(iPSC)衍生的人肝细胞系统
[0533] 从可诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肝细胞提供消除药物响应的变化性并研究基因型变异的潜在解决方案但是由于其在标准、静态培养系统中展现的胎表型和不充分代谢概况而未被广泛接受。如上在实施例4中所述的数据证明已知在静态培养条件下快速去分化的原代大鼠和人肝细胞在受控血液动力学条件下培养时稳定地保持成熟分化表型,产生更多生理药物和激素响应。本发明人已经发现在保持生理性质如流动、血液动力学和运输时iPSC类似地响应,并且展现分化肝表型和其在体内展现的对于药物的响应。
[0534] 方法
[0535] (i)iPSC衍生肝细胞
[0536] iPSC衍生肝细胞购自Cellular Dynamics International。
[0537] (ii)iPSC衍生肝细胞培养基
[0538] 静态培养物的iPSC衍生肝细胞培养基根据供应商建议。对于在受控血液动力学条件下在锥板式设备中培养的细胞,使用在涂铺时补充有胎牛血清(10%)和地塞米松(1μM)的基础培养基Williams E培养基。24小时之后使用不含有FBS但是补充有牛血清清蛋白(0.125%)的维持培养基。培养基也包含庆大霉素(25μg/ml)、ITS(胰岛素浓度2nMol)、1%NEAA、1%GLUTAMAX、HEPES(30mM)和地塞米松(100nM)。
[0539] (iii)胶原涂布和涂铺
[0540] 胶原涂布和涂铺条件与如上在实施例4中对于原代人肝细胞所述的条件相同。iPSC衍生肝细胞根据供应商方案使用建议培养基来解离并涂铺。iPSC衍生肝细胞在静态条件下培养或在24小时之后转移至锥板式设备以进一步在受控血液动力学条件下培养。
[0541] 结果
[0542] (i)从在受控血液动力学条件下培养的可诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肝细胞保持极化形态并且展现相对于静态培养物的关键代谢基因的较高表达。
[0543] 在锥板式设备中、在受控血液动力学下培养10天的iPSC衍生肝细胞保持极化形态(图40)并且展现相对于静态培养物的关键代谢基因的较高表达(对于CYP1A1为104倍,对于CYP1A2为91倍,对于CYP3A4为8.8倍,对于CYP2B6为8.2倍,对于CYP2C9为2.3倍并且对于CYP2D6为3倍)。组成性雄烷受体CAR的表达比在静态条件下培养的细胞高6.0倍并且肝特异性蛋白质白蛋白的水平比在静态条件下培养的细胞高2.2倍。这些结果描绘于图41中。
[0544] 当介绍本发明的要素或其优选实施方案时,冠词“一个(种)”、“所述”意图意味存在所述要素中的一个或多个。术语“包含”、“包括”和“具有”意图是包括性的且意味可能存在除所列要素以外的其它要素。
[0545] 鉴于上文,将会看出,本发明的几个目标得到实现并且获得其它有利的结果。
[0546] 因为可在上文中在不背离本发明范围的情况下做出各种改变,所以以上说明书中所包含的并且在附图中示出的所有内容均应理解为是说明性的并且不具有限制意义。
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