O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复 的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷 二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成 寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚 合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子 [Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染 色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在 志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间 [Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection and Immunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因， 糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O- 抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及 其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转 运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多 糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇 里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不 同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间 的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O- 抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又 具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其 O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应 自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯 一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量 不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、 灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检 测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌 (S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏 菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。 Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的 CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血 清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111 的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111 的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic- Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的 研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的 血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于 wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可 能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的
志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166 种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specific selection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲 缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986) “Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸。 它是大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因 和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的全长核 苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的基 因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy 基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf9、orf10基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O100型的 O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf9、orf10基因；源于编码转运 酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即 wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度 在10-20nt；它们对大肠杆菌O100型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列 出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O100型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡 核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O100型的O-抗原也是 高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反 应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通 过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O100型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌 O100型。
本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的全 序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列， 也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1 所示的分离的核苷酸，全长11717个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失 或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为rmlB rmlD，rmlA，rmlC，orf5，wzx，orf7，wzy，orf9，orf10的10个基因组成，都位于galF 基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具 有高度特异性的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能 的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；变位酶基因，包 括glf基因或与glf有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf9、orf10基 因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的4494至6235碱基的核苷酸； wzy是SEQ ID NO：1中的7449至8618碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1 中的8627至9568碱基的核苷酸；orf10是SEQ ID NO：1中的9584至10723 碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸，其中它还包括源于 所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf9、orf10基因；以及它们的 混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于源 于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的9089至9106碱基的核苷酸 和9350至9367碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8926至8943碱基的核苷 酸和9433至9450碱基的核苷酸。源于orf10基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1 中的10080至10097碱基的核苷酸和10621至10638碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9735至9752碱基的核苷酸和10079至10096碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的 细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过 插入表达而提供表达大肠杆菌O100型的O-抗原，及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于， 它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基 因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征 在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O100型，离心收集细胞； 得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O100型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O100 型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物， 用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物， 并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O- 抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用 实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到 100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的 序列，从而得到大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的orf9、 orf10基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43 株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定orf9、orf10基因对大肠杆菌O100 型的O-抗原的高度特异性；
(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O100，细菌计数后分别将5×103， 5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌 的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过 的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后 作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O100的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征 在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O100 型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬 细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。 之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入 3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清 再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清 再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用 玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因 组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O100型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O100 型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现 于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计 下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用 Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基 因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃ 退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延 伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及 其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps 纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构 建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中， 随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP， 10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟， 将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其 相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA 尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚 抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时， 总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后 用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物， 再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司 的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul 连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm 的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即 在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、 X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落， 将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培 养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大 小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克 隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序， 序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council) 分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接 和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的核苷酸全 长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O100型的基因 组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基， 保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O100型O-抗原基因簇的核 苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅 读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框 的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基 因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大 肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的orf9、 orf10基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43 株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O100的第13组中得 到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产 物，所以orf9、orf10基因对大肠杆菌O100型的O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g 一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O100的冻存菌液接种到有 20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少 量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用， 取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数， 计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101， 5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过 滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离 心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水 中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用 4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的9089至9106碱基的核苷酸和9350至9367 碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8926至8943碱基的核苷酸和9433至9450 碱基的核苷酸。SEQ ID NO：1中的10080至10097碱基的核苷酸和10621至 10638碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9735至9752碱基的核苷酸和10079 至10096碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl， Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2： 1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃： 45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物 电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。 参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的 PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应 中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌 O100的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O100型的O-抗原基因 簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长11717个碱基； 或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸 功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O100型 的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC， orf5，wzx，orf7，wzy，orf9，orf10的10个基因组成，都位于galF基因和gnd基 因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的基 因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy 基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf9、orf10基因)。它 们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本 发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路 径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、 共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基 因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O100型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中 的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基 因和糖基转移酶基因，包括orf9、orf10基因的寡核苷酸，它们是这些基因中 的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1 中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为 引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进 行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没 有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O100型的O-抗原都是 高度特异的。
所述的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述 步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O100型中的O-抗原基因簇； 3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼 接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是 显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基 转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶基因内一段核苷酸分子，它 们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核 苷酸是源于orf9基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的8627至9568碱基 的核苷酸)；orf10基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的9584至10723碱 基的核苷酸)。源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O100型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突 变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中， 需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发 明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转 运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或 与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来 说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体 地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有 相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗 原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些 抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因 是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基 因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条 件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的 一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O100型。可用PCR 方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如 southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及 细菌。
本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时， 寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一 套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码 糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与 wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这 套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O- 抗原是由大肠杆菌O100型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原 的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂 交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基 因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功 能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的 O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌 O100型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可 将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或 荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它 们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个 寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核 苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因 混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当 一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因 簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明 方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、 编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy 基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说 是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细 菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下 至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码 糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx 有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情 况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一 个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O100型。可用本发 明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷 酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的 抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中 的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因 或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。 此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交 到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来 检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗 原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由 于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发 明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的全长序列，而且 可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产 生表达大肠杆菌O100型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1：基因组的提取：
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O100型，离心收集细胞。 用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分 钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml 的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase， 65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶ 异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以 除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％ 乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼 脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O100型中的O-抗原基因簇：
以大肠杆菌O100型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因 簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物 (#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基 因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR 方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94 ℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最 后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司 的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3：构建O-抗原基因簇文库：
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O- 抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。 随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP， 10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟， 将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其 相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA 尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚 抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时， 总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后 用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物， 再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180 rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm 剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离 心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4 ℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体， 于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮 细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏， 时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复 苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上 37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到 含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用 EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌 O100型的O-抗原基因簇文库。
实施例4：对文库中的克隆测序：
从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型 DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆 盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而 得到大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。 序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O100型的基因组作5个 Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个 以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O100型O-抗原基因簇的核苷酸序列 后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O100型的O- 抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1，Orf2，orf3和orf4编码的蛋白与Escherichia coli K12 O-抗原基因簇中rmlB，rmlD，rmlA，rmlC基因编码的蛋白有很高的 氨基酸序列一致性，分别为：86％，85％，93％，68％。通过对Pfam蛋白基 序数据库的搜索，发现上述四个基因编码的蛋白与已知的RmlB，RmlD， RmlA，RmlC的共有序列的同源性预期值非常高(E value分别为3e-208，1.9e-73， 9.5e-118，2e-122)。rmlBDAC负责合成鼠李糖O-抗原中的一种稀有单糖。因此 我们将这四个基因命名为rmlB，D，A，和C。
orf6和orf8是大肠杆菌O100种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的 基因。orf6编码的蛋白与大肠杆菌(BAA15879)的O-抗原转移酶有28％的序 列一致性，54％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其 含有11个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf6为wzx。 orf8编码的蛋白与Shigella flexneri type 2a(CAA50774)的O-抗原聚合酶有30％ 的一致性，47％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现 其含有10个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy 蛋白的典型特征。所以命名orf8为wzy。
orf9，10两个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有35-49％的序列 一致性和58-68％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜 索，这两个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同 源性预期值为2e-19至2.1e-37，因此我们推测这两个基因编码糖基转移酶， 而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆 菌O100的O-抗原的寡糖单位可能由三个单糖组成。由于这两个基因的确切 功能还不能确定，因此我们将这两个基因暂命名为orf9和orf10。
Orf5编码的蛋白与Escherichia coli CFT073 O-抗原基因簇中编码的 glycerol-3-phosphate cytidyltransferase在135个氨基酸中有75％的一致性和87 ％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，这个基因编码的蛋白与 已知的CTP_transf_2的共有序列的同源性预期值为1.1e-15，由于这个基因的 确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf5。Orf7编码的蛋白 与Clostridium perfringens str.13 O-抗原基因簇中编码的glycerol- phosphotransferase在384个氨基酸中有30％的一致性和50％的相似性，通过 对Pfam蛋白基序数据库的搜索，这个基因编码的蛋白与已知的glypho_transf 的共有序列的同源性预期值为4.9e-21，由于这个基因的确切功能还不能确 定，因此我们将这个基因暂命名为orf7。
实施例6：特异基因的筛选：
针对大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的orf9、orf10基因设计引物，在 每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以 确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为 模板进行PCR，除在含大肠杆菌O100的第13组中得到了预期大小的一条带 外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以orf9、orf10基 因对大肠杆菌O100型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列 中的位置见表1。
实施例7：引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备 用。将10μl大肠杆菌O100的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶 中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和 107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB 琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5 份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀， 加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。 从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ 超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离 心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中 的9089至9106碱基的核苷酸和9350至9367碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1 中的8926至8943碱基的核苷酸和9433至9450碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1 中的10080至10097碱基的核苷酸和10621至10638碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9735至9752碱基的核苷酸和10079至10096碱基的核苷酸，进行 PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5 μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。 PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃： 5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符 的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102， 5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。 参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上 述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O100的检测灵敏度均为0.25个 菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组 疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反 应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的 将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动 物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993，7：239- 252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王 磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗 STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应 (Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O100的O抗原特异 基因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O100型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片， 将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片 信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定 的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业， 畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完 全相同的条件下就可以产业化。
表1列出了大肠杆菌O100型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖 单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O100型 的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应 的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中 的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列 于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来 源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们 的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O100型的基因组DNA作为阳性对照。以每 组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分 钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟， 这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为 1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电 泳检测扩增出的片段。
对于orf9、orf10基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在 第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有 扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物 带，所以orf9、orf10基因对大肠杆菌O100型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O100型中筛选到对大肠杆菌O100型的O- 抗原高度特异的基因：两个糖基转移酶基因(orf9、orf10基因)。而这些基 因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O100型的O-抗原是特异的， 尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌 O100型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体 和环境中的大肠杆菌O100型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠 杆菌O100型的O-抗原基因簇的结构，共由10个基因组成，每个基因用方 框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放 阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它 们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗 原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列 出了大肠杆菌O100型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准 确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠 杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。
                 SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>对大肠杆菌O100型的O抗原特异的核苷酸
<130>对大肠杆菌O100型的O抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>11717
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcgtt ctggttacgc actcgtccaa gaatgcggtt      60
gaaaaccact tcgacacctc ttacgaactc gaagcgctgc tggagcagcg tgttaaacgt     120
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gccgctgaat tgggttggaa gcctgcagaa acatttgaaa gtggcattcg taagacagtg    2100
gaatggtatt tgagtaacca ggactgggtt aacaacgtta aaagcggtgc ctataagacc    2160
tggatcgaac agaactacgg agaacgataa ctatgaatat tcttctgttc ggcaagacag    2220
ggcaggtggg ttgggaactt cagcgcgcac tcgctccatt aggtaattta attgcccttg    2280
atgtgcattc caaagagtat tgtggtgatt ttagcaatcc ggaagggatt gctgagactg    2340
tccgtgctat caaacctgat gtgatcgtta acgcagcagc tcacactgct gtagataaag    2400
cggaatctga gccagagttt gcgcagttac tgaacgcaac cagcgttgaa gctattgcga    2460
aggaagctgc aaaaattggg gcctgggttg ttcattattc aacagattac gtttttccgg    2520
gcgatggcga taaaccatgg cgtgaaacgg atgcaacagc gcctttgaat gtttatgggc    2580
agactaaacg tgatggtgaa aaagcgctgc aagcatattg ccctaaccat cttattttcc    2640
gtaccagctg ggtctacgcg ggtaaaggta acaatttcgc gaaaaccatg ctgcgtctgg    2700
cgaaagagcg taaagaactt tctgttatca acgatcaggt tggtgcacct acaggtgcag    2760
aattactggc agactgtacc gcgcatgcta ttcgtgtagc gatggtaaaa ccagaagtgg    2820
ctggtcttta tcacttggta gcatccgata cgacaacctg gtatgactat gcagcactgg    2880
tatttgatga agccagaaag gcaggcatcg aactggcgat tgaaaagctc aacgctgtgc    2940
cgacaagcgc ttacccgaca cctgctcgtc ggccgcagaa ttcgcggtta agtacagaga    3000
aattccagca taactttggt ctggtattgc ccgcatggga tgttggcgtg aagcgcatgc    3060
tcgctgagct ttttaccact aaatcacttt aaccattaga taaatgcccg gattcgggca    3120
ttttgcgttt acagagaaat tataatggct acgcgtaaag gtattattct tgctggtgga    3180
tccggcactc gtctctaccc tgtgaccatg gcggtgagta aacaactgct gcccatttac    3240
gacaaaccaa tgatttacta tccgctgtct acgctgatgc tggcagggat taaagacatt    3300
ctgatcatca gtacgccaca ggataccccg cgctttgaac agcttctggg cgacggcagt    3360
cagtgggggt taaaccttca gtataaagta cagccaagcc ctgatggact ggctcaggcc    3420
tttatcattg gcgaagagtt cattggtaac gacagctgtg cgttagtgct gggcgataat    3480
attttctacg gccatgacct gcctaaacag ctggaagccg cagtgagtaa aggcaacggt    3540
gcaactgttt tcgcctatca cgtcaacgat cctgaacgtt atggtgtggt cgagttcgac    3600
aaaaatggta cggccatcag tctggaagag aagccgctgg aacctaaaag caactatgct    3660
gtaacgggtc tctatttcta cgacaatgat gtagtggaaa tggcgaagaa ccttaaacct    3720
tcagcgcgcg gtgagttgga aattaccgat attaaccgta tctacctgga gcaggggcgt    3780
ctgtccgttg cgatgatggg gcgtggctat gcatggctgg atacgggtac tcatcagagc    3840
cttattgagg caagtaattt tattgcgacg attgaagagc gtcaggggct taaggtttct    3900
tgcccggaag agattgcgta tcgcaaaggg tttattgatg cggagcaggt gaagaagctg    3960
gctgagccgc tgaagaaaaa tgcctatggt caatacctgc ttaagatgat taaaggttac    4020
taagacatga atgttattaa aacagatatc ccagatgtac ttatttttga gccaaaagtt    4080
tttggtgacg atcgtggttt tttctttgag agtttcagcc agaaagtatt cgaagaggca    4140
gtagggcgaa aagttgagtt tgtacaggat aatcattcta aatcctgcaa gggtgtgctt    4200
cgcggtttac attatcaact ggaaccgtat gcgcagggaa aactggtgcg ctgtgttgct    4260
ggtgaagtat ttgatgttgc ggtcgatatt cgtaaatcct ctccgacttt tggaaaatgg    4320
gttggcgtga atctttccgc tgagaataaa cgtcagttgt ggatcccaga agggtttgct    4380
catgggtttc ttgtgctgag taatattgct gaatttgtat ataaaactac aaattactac    4440
caccctgaaa gcgatagggg gcttatctgg aatgatcgtg atataggtat tgtatggggt    4500
gatacagata atgtcctact ttcagaaaaa gaccaaaaac agccttctct tactgaactt    4560
ttaaaccaac aataggatgt gctgcactat gaaacgaatt attacttttg gcacatttga    4620
tgtatttcat gtaggccaca tcaatattat tgagagagcg aaaaagctag gtgattactt    4680
aattgtaggg gtctcttcag acgagcttaa ttttagcaaa aaacagcgat atccaatata    4740
taaccaaact gatcgtttaa aaataattag ttcaatgaaa tgtgttgatg aggttttcat    4800
tgaggaatct ttggagttga aattagagta cataaaaaaa tacaaagctg acattttggt    4860
tatgggagat gattggactg gaaggtttga ttgggtaaaa acagattgcg aagtgattta    4920
tttaccaaga acaccttcgg tttcaaccac agaaattata gaaatcgtta aatccattta    4980
gtggaagaca attgtgccaa aaaaaaatgt tgtagaaaat attatttttt tatcaataat    5040
tcaattcgcc aattatcttg cacctttgat ggtcttacct ttcctcagtc gcactttggg    5100
cgtggagggg tttgggctca ttatggtagc attttctgca tgtacattat gttttctcct    5160
cactgatttt ggctttaatt tatctgctcc atattggata gctaggaatt caaattatag    5220
gaatagagtg tcgcgaacaa taggcgctat atttttaatt aaatttataa tattactaat    5280
tataggatta atacttttct tgtatgtatt attcttaacg agtaacacga tgcatatgag    5340
attaatgtat acaataattt attgtatagc tattgcacaa gcattccaac cagtatggtt    5400
ttttcagggg gttgagaaaa tgaaaaatgt gaccatattt atggtcactg caaagttatc    5460
ttatttaata cttatatttc tctttgtgag aaataaagaa gatgaccttc tggttctgtt    5520
atgcttcttt ataagtaatt ttattgcaac gattattggt gtcgggctta tctggggggc    5580
aggttataaa atcatgattc cgacaaaaaa aatcattgcc gatactttca aagcaagttc    5640
ctccttcttc ctttcaagat tggcagtcgg tgtttataca aatgctagca cactgattgt    5700
tggtgcagct tcgggtgtgg ttcaagcggg tttgtattca agtgcggaaa aattatatca    5760
agcaggtcaa aatttaacat ctccaataag ccaggcattg tatccatatg ttgcaagaac    5820
aggaaataaa aatattcttt tcaaaacgat cttactactt ttgattccaa tgatattggg    5880
ctgctcaatc tgttttattt acgcagccga aataatcaaa ttaatatatg gtgccagttt    5940
tgttaatgca caacatgtat taagaatatt tttgataata tcaataatta cttttgttag    6000
tataaatttg ggttatcctg cctttgcggc aatggggaga gttaatctgg ctaattatac    6060
agtaatgctt ggtgggatcg tgcaagtttt actgttagcg atactttata ctataaatag    6120
tattaatgct gtgaatgttg ctttgtctgt acttacgaca gaaattatag ttttagccgt    6180
aagaatatta ttacttataa aaccaaatat taatactcat gaagaatatc gttaaaatac    6240
cggttaaatt tgtggctgta tgcgctcgga tgctatcaat aactttggca tgtcttatac    6300
caaaagaaaa aaaactctgg gtttttggtg gatggtatgg acaacgaatt tctgacaacc    6360
caaaatactt actccaatac gtaaataaat atcacgcgaa aaatattcga gctgtttgga    6420
tttataaaaa tgctaatgtt aaagcagagg cattgaagct tggtatcgaa gcgtatcatt    6480
ataagagtat taaaggaaaa ctcatacaac ttcgtatact tctggtttta tttacacata    6540
caatacacac agatttaaat tcaaagtgta tctcctggaa tacaaaacgt atacaaatgt    6600
ggcacggtat acctcttaaa aaaataggat ttgatgataa cttcacagct tcaaaactta    6660
agaaaagtaa gctgtataga tttacactca acgacattaa ttcttatgtg ttaagttcag    6720
gaaacgccgt atcgaaaatc tttcaatctg cttttgatga atcacttgga aaaatggctg    6780
aaactggctt tccgagaaat gatgtttttt tcaataagca acaccagaaa ataagtggta    6840
aatataatgt cttgtatatg ccaaccttaa gggctggtta tggagcaacg tttaatttat    6900
tggataaaag atatgatttc cagttcgaag aaatagattc ttttttaaag gagcatgata    6960
taacactgac attgagaatt caccctgcaa ataatcctga tgctaaaatg gttgaactga    7020
tagcagcaag tgacagtata aaaatgtcat cgtcggatga tgtttgtgat gaaattggga    7080
tgtatgattg tttgattacc gattattcaa gtataatgtt tgattttgca ctgagtcata    7140
aaccaattat ctttgctgct tttgatatta aagattatct cagagacgac agaggtatgt    7200
attttaatta cgaagatatt gctagtaata acatcgcctt tagttggcaa gatgttatgt    7260
tttcattaaa agaaaatata aatgtacgag aacatcaaga ttataaattt cttttacaat    7320
tccatgacga tcaaaattta ctcggtaaag aacattatta ctcacgtaag gtttatgaat    7380
tcttaattga aaagttaaat attcatgttt cttagtccaa atgagctact tcacgagtct    7440
ctattaaaat ggcattcatt agattcgtta attttctgat tatctttttc atttctatcg    7500
atatgggggg cgaattaggt attaggaatg tttcatttct cttgttggta ttattaattg    7560
cctattatat cgtcacttgc aaaaaaatca aatttaggct gccttacgta ctccttatta    7620
tattgttttt aggataccct gttgcatctt tatttattgg gatgtctaat aattttgatg    7680
cagatactgg catatcacaa atcagtatat ttgtttttgc atttttatac tttctaaaaa    7740
ggataatcga agaggataat aatttacctc tgatgccgat acaatatttt aataatgcga    7800
tgctgattat ctctttgttc tatgtcttaa tgcttatttc gtatcaattt ttcccttcta    7860
ttttcaatag tattgctctt tacatacacg atagaggtgc tggttttgct ggcgtaagaa    7920
ctgaaaatgg agttggtttt gctaatattt atcttaaatc tagccttttt ttaatattta    7980
cttattgctg ttttttgaag agaaatacca ttaaggctgc tattataata ttggctactg    8040
tgattacgac atctaaagcg cttctattaa cagaagtatt acttcttgta accaaattaa    8100
agggtagatt gatttctgtt gttgtttttg tttcggcttt gttgttattt attgcaattt    8160
atttcgatga aatcatggtt gtattcaact acatgaatga aacattgcaa ggcaatagcg    8220
aaacatattt ggttagagtg catcactttg aagatctagt tgcgcttttc tcggaaaatc    8280
caattaattt tctttttggt tttggtgcag gaagttcatt tttctcatcg tattatggga    8340
agtacatatt taatatagaa ttagaccatc taaacgcgat tagaaagttt ggcctcatct    8400
ggtttttatc ttttatgtgg cttgtattct ttaatattat ccaacttgtt agattaaaaa    8460
gaaatgaatt ggctcttggg ctttttcttt ctttcgtcct ggcaggtacc aacccagtat    8520
tactgagccc tatattcttt atattattaa tcgaatgtca tttattgaca cttaaagtac    8580
catgttcaac tagtgggcta cacaatagta aggtgtaatt ctttttatgt ttaataaatc    8640
taaaaagtta gctattttac tttccagtta taatggcgag caatttatag aacaacaact    8700
acaatctctt atcgacatga aggctgattt cattttcgat attcatatta gagatgatgg    8760
ttcaagtgat aaaacttgtg aaactattaa gaagttttcc cagaaacatg ctaacattca    8820
tttatacgaa gagaataatg ttggagttat tgcaagtttt ctttggcttg tagaaaaagt    8880
atcaggctat gattattatg ctttttgcga tcaagatgat ttttggcaac cattgaaagc    8940
cttggcagca attgataaat ttgaaaaaca cgaggaaata actccgctgg tgtattgctc    9000
agcttatgat tacgtcgatc aaaatcttaa ctttattggt cgctttactt ccaaaagtaa    9060
tttttcccct agtaatctgt taatagaaaa ttgtgctcct ggttgtacga tgttattcaa    9120
ttcagcgctg cgagaaaaat atttaagcat aagtgctgca aatataagta atcgagttgt    9180
gatgcatgat tggctttttt tattattggg ccttcatttc ggaatggtaa tttatgacag     9240
aaattcctat ttattatata ggcaacatgc aaacaatgtt ataggtaaaa aatctgggtt     9300
gctgcctatc tttagatcca agtataagca attcatcaaa gaatgtaaaa gaccgcagca     9360
tttactttat cttcaaaacg aattgttctc tgatatcacc tctggacaag taaattcctt     9420
aacgcataaa ctaagttgta gtttcgtttc cgctcaaaga aatttttact ctagagctaa     9480
atttgccttt agcgggaaaa taaagcgtat ccgaaaagtt gatgatttaa tatttaagat     9540
tttatttgtt tttggatatt ataaataata tggtttggaa tcaatgagtc aacttaaaaa     9600
attacatatt gtccttgtag gtaatacatt atggtcagtt tataatttcc gtagaggtct     9660
aattcaaagc tttatgagca atggtcatag agtgacaata gttggaccta aggatgagtt     9720
tactgagaaa ttagagggat taggctgtga tgttgttgat attcctattt catcgcaagg     9780
taaaaatcct tttattgaca tgctacttat aaatcgactg agagttgttt ataaaaggat     9840
taaaccggat tttgtttttc actatactat aaagccaaat atatatggct cgattgctgc     9900
tggcttgtct cgaacaaaat caatagctat tactaccggg cttggttatg ttttcaataa     9960
ctcttcattt ttcactcaca taatttcaca tttgtactgc tttgcattta aattcgcaaa    10020
agaagtctgg tttttgaatg aagatgatag aaatgtgttt atacaaagag gtattatctc    10080
acctggcaag actcatattc ttgatggcga aggtgtcgat actagtttct tcattcctag    10140
ggcaaaacct atttcgcata aaaaatcaaa agttacgttt ttgctcgttg caaggatgct    10200
gtgggacaaa ggtgttggga tatacgttga tgcggctcgt aaactaaaag aacagtaccc    10260
agatactgaa tttcagttgt taggggcctg cgatgtcgat aatccgagcg caattccacg    10320
tgatattata gataattggc atgaagaggg tgtagttaat tatttgggaa tgacgaatga    10380
tgtgcgcacc gttgtatccc aagccgactg taatgtattg ccttcttatt atcgcgaggg    10440
agttcctcga acattgatgg aagcagcatc aatgggcaaa ccagtactta cgaccgataa    10500
tgtcggatgt agaaatgttg ttatagaagc gcaaacaggt tttttatgca agacaaaaga    10560
tgtcgatagt ttagttgacg ctatgaataa gattctccat ttaacccctg aggaacgtag    10620
cgaaatgggt ctaaatggtc gggattatat gataagccgc ttcgatgaaa gggttattat    10680
tgctgattat tataatgcta ttcaaaaata tgttgaagta tagttgcccc taaggatttg    10740
tttatctact gaccatccgt atttgtataa agcatcttcc gctatccatg atgacttaac    10800
ctgagttaac atcaggtata cattcaagcc gcgcacagtt acggcgaaca cacctgacag    10860
gagtatgtaa tgtccaagca acagatcggc gttgtcggta tggcagtgat ggggcgcaac    10920
ctggcgctca acatcgaaag ccgcggttat accgtctccg ttttcaaccg ctcccgtgat    10980
aagaccgaag aagtcatcgc tgagaatccg ggtaagaaac tggttccttt ctatacggtt    11040
aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct cgtcgtatcc tgttaatggt gaaagcgggc    11100
gcaggtaccg atgcagccat cgattccctg aaaccttatc tggaaaaagg agacatcatc    11160
attgatggtg gcaacacctt cttccaggac accattcgtc gtaaccgtga actctctgct    11220
gaaggtttca acttcatcgg taccggtgtc tccggtggtg aagagggcgc cctgaaaggc    11280
ccatctatca tgcctggtgg ccagaaagaa gcgtatgaac tggttgcgcc aatcctgacc    11340
aaaatcgctg cggttgcgga agatggtgag ccgtgtgtga cctatatcgg tccggacggt    11400
gcaggccact atgttaagat ggttcacaac ggcatcgaat acggcgatat gcagctgatt    11460
gctgaagctt actctctgct gaagggctga gtaaacaact gctgcccatt tacgacaaac    11520
caatgattta ctatccgctg tctacgctga tgctggcagg gattaaagac attctgatca    11580
tcagtacgcc acaggatacc ccgcgctttg aacagcttct gggcgacggc agtcagtggg    11640
ggttaaacct tcagtataaa gtacagccaa gccctgatgg actggctcag gcctttatca    11700
ttggcgaact atagtat                                                   11717
表1 大肠杆菌O100型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的 引物及PCR数据     基因     功能   基因的碱基   位置   正向引物   反向引物     PCR产物     的长度   产生正确   大小电泳   带的组数   PCR的退   火温度   (℃)     Orf9     糖基转移酶   8627-9568   9089-9106   9350-9367     279bp   0*   56   8926-8943   9433-9450     525bp   0*   56     Orf10     糖基转移酶   9584-10723   10080-10097   10621-10638     559bp   0*   56   9735-9752   10079-10096     362bp   0*   56
*只在大肠杆菌O100型中得到正确的一条带
表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号                 该组中含有的菌株                                               来源
1、野生型大肠杆菌    O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，    IMVSa
                     O19ab，O20，O21，O22，O23，O24
2、野生型大肠杆菌    O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，    IMVSa
                     O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43
3、野生型大肠杆菌    O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，    IMVSa
                     O57，O58，O60，O61，O62，O53
4、野生型大肠杆菌    O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，        IMVSa
                     O79，O80，O81，O82，O83，O68
5、野生型大肠杆菌    O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，        IMVSa
                     O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97
6、野生型大肠杆菌    O107，O108，O110，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，           IMVSa
                     O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117
7、野生型大肠杆菌    O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，         IMVSa
                     O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140
8、野生型大肠杆菌    O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，         IMVSa
                     O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                 b
9、野生型大肠杆菌    O168，O169，O170，O171，O1 72，O173，                          c
   痢疾志贺氏菌      D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13         d
10、鲍氏志贺氏菌     B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d
                     B16，B17，B18
11、福氏志贺氏菌     F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，     d
                     DS，DR
12、野生型大肠杆菌   O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O114，O151，O155，      IMVSa
                     O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119
13、第12组菌株加上大肠杆菌标准菌株O100                                              IMVSa
为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为对照
a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia
b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3 大肠杆菌O100型O抗原基因结构图
                 E.coli O100 O-antigen gene cluster

 galF        rmlB     rmlD    rmlA   rmlC orf5    wzx       orf7      wzy        orf9     orf10     gnd
 G+C％       50.2     48.2    49.0   40.3 33.1    32.8      31.8      31.5       31.9     37.0
表4 大肠杆菌O100型O抗原基因簇基因位置
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCGTT CTGGTTACGC ACTCGTCCAA GAATGCGGTT      60
GAAAACCACT TCGACACCTC TTACGAACTC GAAGCGCTGC TGGAGCAGCG TGTTAAACGT     120
CAATTGCTGG CGGAAGTGCA GTCTATTTGT CCTCCTGGCG TGACCATCAT GAACGTCCGT     180
CAGGCGCAAC CGCTGGGCCT GGGTCACTCC ATCCTGTGTG CTCGTCCGGT CGTGGGCGAC     240
AACCCGTTCA TCGTGGTCCT GCCTGATATC ATCATCGATA CCGCTTCTGC GGATCCGCTG     300
CGCTACAACC TGGCGGCGAT GGTGGCGCGT TTCAACGAAA CAGGCCGCAG CCAGGTGCTG     360
GCGAAACGCA TGAAAGGCGA TCTCTCTGAG TACTCTGTAA TCCAGACTAA AGAAGCGCTG     420
GAGACAGAAG GGCAGGTGAG CCGCATCGTT GAGTTTATCG AAAAGCCGGA TCAGCCACAG     480
ACGCTGGATT CCGACCTCAT GGCGGTTGGC CGTTATGTCC TGAACGCGGA TATCTGGGCC     540
GAGCTGGGAA AAACCAAACC AGGCGCCTGG GACCGTATCC AGTTGACCGA TGCGATTGCC     600
GAGCTGGCGA AAAAGCAGTC TGTTGACGCG ATGCTGATGA CCGGTGAGAG CTACGACTGC     660
GGTAAAAAGC TGGGCTATAT GCAGGCATTT GTGAACTATG GACTGCGTAA CCTGAAGGAA     720
GGGGCGAAGT TCAGAAGCCG GATTGAGAAG TTGTTAGCTA ACGACTGATT TTATCTTACT     780
TGATTTACGC AAGCGGCAGT CATCATTGGG TATGTTGCAA CATAACCAAA ATGATGACTG     840
CCGTTTTTCG TTATTAATTC TAATGATAAC ATGGATTTTG GTCAGATTTG TGACGATTTG     900
TGCTTGTTTC TGAGGTCATT TAGGACGACA ATTAACGCCA GTTTTTGTCT GAATCCAGAC     960
CAGAAAAATC ATTTATTCAA ACTTCGCTCA GTGCACTGGT AGCTGTTAAG CCAGCGGCGG    1020
TAGCGTGCAA AATTTCTGAA GCCGATATTA ATTACCCGGT ATCAGAACGC CAATATCTCG    1080
                             orf1的起始
ACAAATTCAA TAGACGGAAC AGATCAC GTG AAAATTCTTG TGACGGGCGG GGCCGGCTTT  1140
ATCGGCTCAG CAGTGGTACG ACATATTATT AAAAATACCC AGGATGAAGT CGTCAATGTG    1200
GATAAACTGA CGTATGCCGG TAACCTTGAG TCGCTTACCG AAGTGAGTGA TAGCGCCAGA    1260
TATGTCTTTG AGCATGCGGA CATTTGCGAC AAGAGTGCCA TGGATCGTAT CTTTGCTGAG    1320
CATAAGCCGG ATGCCGTTAT GCACCTGGCG GCTGAGAGTC ATGTCGATCG TTCCATCACC    1380
GGCCCGGCCG CGTTTATTGA AACCAATATC GTCGGTACCT ATGTATTGCT TGAAGCGGCT    1440
CGTGCTTACT GGTCCACTTT AGATGATGTA GCGAAGAAGG CGTTTCGTTT CCATCATATC    1500
TCGACCGATG AAGTGTATGG CGATTTGCCG CACCCGGACG AGCATCCGGT TTCTACCGAT    1560
CTGCCGCTCT TTACCGAAAC CACAGCTTAT GCGCCAAGCA GCCCGTATTC TGCTTCAAAA    1620
GCTTCCAGCG ATCATCTGGT TCGCGCCTGG CTGCGTACCT ATGGGTTCCC AACCATCGTC    1680
ACTAACTGCT CCAATAACTA CGGCCCGTAT CATTTCCCTG AGAAACTGAT CCCGCTGGTC    1740
ATCCTGAATG CGCTCGATGG CAAACCACTG CCAATTTATG GCAAAGGTGA CCAGATCCGC    1800
GACTGGTTGT ATGTTGAAGA TCATGCTCGT GCGCTCTACA CCGTCGTAAC CCAGGGTAAG    1860
CCGGGTGAAA CTTACAACAT TGGTGGTCAT AACGAGAAGA AAA CCTCGA GGTGGTTCAT    1920
ACCATCTGCG ATCTGCTGGA TGAAATTGTT CCGAAAGAGG GCTCTTATCG CGACCAGATC    1980
ATGTATGTTG CCGATCGTCC AGGCCACGAT CGCCGCTATG CTGTCGACGC ACATAAGATT    2040
GCCGCTGAAT TGGGTTGGAA GCCTGCAGAA ACATTTGAAA GTGGCATTCG TAAGACAGTG    2100
GAATGGTATT TGAGTAACCA GGACTGGGTT AACAACGTTA AAAGCGGTGC CTATAAGACC    2160
                         orf1的终止orf2的起始
TGGATCGAAC AGAACTACGG AGAACGA TAA CT ATGAATAT TCTTCTGTTC GGCAAGACAG2220
GGCAGGTGGG TTGGGAACTT CAGCGCGCAC TCGCTCCATT AGGTAATTTA ATTGCCCTTG    2280
ATGTGCATTC CAAAGAGTAT TGTGGTGATT TTAGCAATCC GGAAGGGATT GCTGAGACTG    2340
TCCGTGCTAT CAAACCTGAT GTGATCGTTA ACGCAGCAGC TCACACTGCT GTAGATAAAG    2400
CGGAATCTGA GCCAGAGTTT GCGCAGTTAC TGAACGCAAC CAGCGTTGAA GCTATTGCGA    2460
AGGAAGCTGC AAAAATTGGG GCCTGGGTTG TTCATTATTC AACAGATTAC GTTTTTCCGG    2520
GCGATGGCGA TAAACCATGG CGTGAAACGG ATGCAACAGC GCCTTTGAAT GTTTATGGGC    2580
AGACTAAACG TGATGGTGAA AAAGCGCTGC AAGCATATTG CCCTAACCAT CTTATTTTCC    2640
GTACCAGCTG GGTCTACGCG GGTAAAGGTA ACAATTTCGC GAAAACCATG CTGCGTCTGG    2700
CGAAAGAGCG TAAAGAACTT TCTGTTATCA ACGATCAGGT TGGTGCACCT ACAGGTGCAG    2760
AATTACTGGC AGACTGTACC GCGCATGCTA TTCGTGTAGC GATGGTAAAA CCAGAAGTGG    2820
CTGGTCTTTA TCACTTGGTA GCATCCGATA CGACAACCTG GTATGACTAT GCAGCACTGG    2880
TATTTGATGA AGCCAGAAAG GCAGGCATCG AACTGGCGAT TGAAAAGCTC AACGCTGTGC    2940
CGACAAGCGC TTACCCGACA CCTGCTCGTC GGCCGCAGAA TTCGCGGTTA AGTACAGAGA    3000
AATTCCAGCA TAACTTTGGT CTGGTATTGC CCGCATGGGA TGTTGGCGTG AAGCGCATGC    3060
                               orf2的终止
TCGCTGAGCT TTTTACCACT AAATCACTT T AACCATTAGA TAAATGCCCG GATTCGGGCA  3120
                          orf3的起始
TTTTGCGTTT ACAGAGAAAT TATA ATGGCT ACGCGTAAAG GTATTATTCT TGCTGGTGGA  3180
TCCGGCACTC GTCTCTACCC TGTGACCATG GCGGTGAGTA AACAACTGCT GCCCATTTAC    3240
GACAAACCAA TGATTTACTA TCCGCTGTCT ACGCTGATGC TGGCAGGGAT TAAAGACATT    3300
CTGATCATCA GTACGCCACA GGATACCCCG CGCTTTGAAC AGCTTCTGGG CGACGGCAGT    3360
CAGTGGGGGT TAAACCTTCA GTATAAAGTA CAGCCAAGCC CTGATGGACT GGCTCAGGCC    3420
TTTATCATTG GCGAAGAGTT CATTGGTAAC GACAGCTGTG CGTTAGTGCT GGGCGATAAT    3480
ATTTTCTACG GCCATGACCT GCCTAAACAG CTGGAAGCCG CAGTGAGTAA AGGCAACGGT    3540
GCAACTGTTT TCGCCTATCA CGTCAACGAT CCTGAACGTT ATGGTGTGGT CGAGTTCGAC    3600
AAAAATGGTA CGGCCATCAG TCTGGAAGAG AAGCCGCTGG AACCTAAAAG CAACTATGCT    3660
GTAACGGGTC TCTATTTCTA CGACAATGAT GTAGTGGAAA TGGCGAAGAA CCTTAAACCT    3720
TCAGCGCGCG GTGAGTTGGA AATTACCGAT ATTAACCGTA TCTACCTGGA GCAGGGGCGT    3780
CTGTCCGTTG CGATGATGGG GCGTGGCTAT GCATGGCTGG ATACGGGTAC TCATCAGAGC    3840
CTTATTGAGG CAAGTAATTT TATTGCGACG ATTGAAGAGC GTCAGGGGCT TAAGGTTTCT    3900
TGCCCGGAAG AGATTGCGTA TCGCAAAGGG TTTATTGATG CGGAGCAGGT GAAGAAGCTG    3960
GCTGAGCCGC TGAAGAAAAA TGCCTATGGT CAATACCTGC TTAAGATGAT TAAAGGTTAC    4020
orf3的终止orf4的起始
TAAGAC ATGA ATGTTATTAA AACAGATATC CCAGATGTAC TTATTTTTGA GCCAAAAGTT4080
TTTGGTGACG ATCGTGGTTT TTTCTTTGAG AGTTTCAGCC AGAAAGTATT CGAAGAGGCA    4140
GTAGGGCGAA AAGTTGAGTT TGTACAGGAT AATCATTCTA AATCCTGCAA GGGTGTGCTT    4200
CGCGGTTTAC ATTATCAACT GGAACCGTAT GCGCAGGGAA AACTGGTGCG CTGTGTTGCT    4260
GGTGAAGTAT TTGATGTTGC GGTCGATATT CGTAAATCCT CTCCGACTTT TGGAAAATGG    4320
GTTGGCGTGA ATCTTTCCGC TGAGAATAAA CGTCAGTTGT GGATCCCAGA AGGGTTTGCT    4380
CATGGGTTTC TTGTGCTGAG TAATATTGCT GAATTTGTAT ATAAAACTAC AAATTACTAC    4440
CACCCTGAAA GCGATAGGGG GCTTATCTGG AATGATCGTG ATATAGGTAT TGTATGGGGT    4500
GATACAGATA ATGTCCTACT TTCAGAAAAA GACCAAAAAC AGCCTTCTCT TACTGAACTT    4560
         orf4的终止orf5的起始
TTAAACCAAC AA TAGG ATGT GCTGCACTAT GAAACGAATT ATTACTTTTG GCACATTTGA4620
TGTATTTCAT GTAGGCCACA TCAATATTAT TGAGAGAGCG AAAAAGCTAG GTGATTACTT    4680
AATTGTAGGG GTCTCTTCAG ACGAGCTTAA TTTTAGCAAA AAACAGCGAT ATCCAATATA    4740
TAACCAAACT GATCGTTTAA AAATAATTAG TTCAATGAAA TGTGTTGATG AGGTTTTCAT    4800
TGAGGAATCT TTGGAGTTGA AATTAGAGTA CATAAAAAAA TACAAAGCTG ACATTTTGGT    4860
TATGGGAGAT GATTGGACTG GAAGGTTTGA TTGGGTAAAA ACAGATTGCG AAGTGATTTA    4920
                                                         orf5的终止
TTTACCAAGA ACACCTTCGG TTTCAACCAC AGAAATTATA GAAATCGTTA AATCCATT TA  4980
              orf6的起始
GTGGAAGACA ATT GTGCCAA AAAAAAATGT TGTAGAAAAT ATTATTTTTT TATCAATAAT5040
TCAATTCGCC AATTATCTTG CACCTTTGAT GGTCTTACCT TTCCTCAGTC GCACTTTGGG    5100
CGTGGAGGGG TTTGGGCTCA TTATGGTAGC ATTTTCTGCA TGTACATTAT GTTTTCTCCT    5160
CACTGATTTT GGCTTTAATT TATCTGCTCC ATATTGGATA GCTAGGAATT CAAATTATAG    5220
GAATAGAGTG TCGCGAACAA TAGGCGCTAT ATTTTTAATT AAATTTATAA TATTACTAAT    5280
TATAGGATTA ATACTTTTCT TGTATGTATT ATTCTTAACG AGTAACACGA TGCATATGAG    5340
ATTAATGTAT ACAATAATTT ATTGTATAGC TATTGCACAA GCATTCCAAC CAGTATGGTT    5400
TTTTCAGGGG GTTGAGAAAA TGAAAAATGT GACCATATTT ATGGTCACTG CAAAGTTATC    5460
TTATTTAATA CTTATATTTC TCTTTGTGAG AAATAAAGAA GATGACCTTC TGGTTCTGTT    5520
ATGCTTCTTT ATAAGTAATT TTATTGCAAC GATTATTGGT GTCGGGCTTA TCTGGGGGGC    5580
AGGTTATAAA ATCATGATTC CGACAAAAAA AATCATTGCC GATACTTTCA AAGCAAGTTC    5640
CTCCTTCTTC CTTTCAAGAT TGGCAGTCGG TGTTTATACA AATGCTAGCA CACTGATTGT    5700
TGGTGCAGCT TCGGGTGTGG TTCAAGCGGG TTTGTATTCA AGTGCGGAAA AATTATATCA    5760
AGCAGGTCAA AATTTAACAT CTCCAATAAG CCAGGCATTG TATCCATATG TTGCAAGAAC    5820
AGGAAATAAA AATATTCTTT TCAAAACGAT CTTACTACTT TTGATTCCAA TGATATTGGG    5880
CTGCTCAATC TGTTTTATTT ACGCAGCCGA AATAATCAAA TTAATATATG GTGCCAGTTT    5940
TGTTAATGCA CAACATGTAT TAAGAATATT TTTGATAATA TCAATAATTA CTTTTGTTAG    6000
TATAAATTTG GGTTATCCTG CCTTTGCGGC AATGGGGAGA GTTAATCTGG CTAATTATAC    6060
AGTAATGCTT GGTGGGATCG TGCAAGTTTT ACTGTTAGCG ATACTTTATA CTATAAATAG    6120
TATTAATGCT GTGAATGTTG CTTTGTCTGT ACTTACGACA GAAATTATAG TTTTAGCCGT    6180
                                        orf7的起始      orf6的终止
AAGAATATTA TTACTTATAA AACCAAATAT TAATACTC AT GAAGAATATC GT TAAAATAC6240
CGGTTAAATT TGTGGCTGTA TGCGCTCGGA TGCTATCAAT AACTTTGGCA TGTCTTATAC    6300
CAAAAGAAAA AAAACTCTGG GTTTTTGGTG GATGGTATGG ACAACGAATT TCTGACAACC    6360
CAAAATACTT ACTCCAATAC GTAAATAAAT ATCACGCGAA AAATATTCGA GCTGTTTGGA    6420
TTTATAAAAA TGCTAATGTT AAAGCAGAGG CATTGAAGCT TGGTATCGAA GCGTATCATT    6480
ATAAGAGTAT TAAAGGAAAA CTCATACAAC TTCGTATACT TCTGGTTTTA TTTACACATA    6540
CAATACACAC AGATTTAAAT TCAAAGTGTA TCTCCTGGAA TACAAAACGT ATACAAATGT    6600
GGCACGGTAT ACCTCTTAAA AAAATAGGAT TTGATGATAA CTTCACAGCT TCAAAACTTA    6660
AGAAAAGTAA GCTGTATAGA TTTACACTCA ACGACATTAA TTCTTATGTG TTAAGTTCAG    6720
GAAACGCCGT ATCGAAAATC TTTCAATCTG CTTTTGATGA ATCACTTGGA AAAATGGCTG    6780
AAACTGGCTT TCCGAGAAAT GATGTTTTTT TCAATAAGCA ACACCAGAAA ATAAGTGGTA    6840
AATATAATGT CTTGTATATG CCAACCTTAA GGGCTGGTTA TGGAGCAACG TTTAATTTAT    6900
TGGATAAAAG ATATGATTTC CAGTTCGAAG AAATAGATTC TTTTTTAAAG GAGCATGATA    6960
TAACACTGAC ATTGAGAATT CACCCTGCAA ATAATCCTGA TGCTAAAATG GTTGAACTGA    7020
TAGCAGCAAG TGACAGTATA AAAATGTCAT CGTCGGATGA TGTTTGTGAT GAAATTGGGA    7080
TGTATGATTG TTTGATTACC GATTATTCAA GTATAATGTT TGATTTTGCA CTGAGTCATA    7140
AACCAATTAT CTTTGCTGCT TTTGATATTA AAGATTATCT CAGAGACGAC AGAGGTATGT    7200
ATTTTAATTA CGAAGATATT GCTAGTAATA ACATCGCCTT TAGTTGGCAA GATGTTATGT    7260
TTTCATTAAA AGAAAATATA AATGTACGAG AACATCAAGA TTATAAATTT CTTTTACAAT    7320
TCCATGACGA TCAAAATTTA CTCGGTAAAG AACATTATTA CTCACGTAAG GTTTATGAAT    7380
                                   orf7的终止
TCTTAATTGA AAAGTTAAAT ATTCATGTTT CT TAGTCCAA ATGAGCTACT TCACGAGTCT  7440
        orf8的起始
CTATTAAA AT GGCATTCATT AGATTCGTTA ATTTTCTGAT TATCTTTTTC ATTTCTATCG  7500
ATATGGGGGG CGAATTAGGT ATTAGGAATG TTTCATTTCT CTTGTTGGTA TTATTAATTG    7560
CCTATTATAT CGTCACTTGC AAAAAAATCA AATTTAGGCT GCCTTACGTA CTCCTTATTA    7620
TATTGTTTTT AGGATACCCT GTTGCATCTT TATTTATTGG GATGTCTAAT AATTTTGATG    7680
CAGATACTGG CATATCACAA ATCAGTATAT TTGTTTTTGC ATTTTTATAC TTTCTAAAAA    7740
GGATAATCGA AGAGGATAAT AATTTACCTC TGATGCCGAT ACAATATTTT AATAATGCGA    7800
TGCTGATTAT CTCTTTGTTC TATGTCTTAA TGCTTATTTC GTATCAATTT TTCCCTTCTA    7860
TTTTCAATAG TATTGCTCTT TACATACACG ATAGAGGTGC TGGTTTTGCT GGCGTAAGAA    7920
CTGAAAATGG AGTTGGTTTT GCTAATATTT ATCTTAAATC TAGCCTTTTT TTAATATTTA    7980
CTTATTGCTG TTTTTTGAAG AGAAATACCA TTAAGGCTGC TATTATAATA TTGGCTACTG    8040
TGATTACGAC ATCTAAAGCG CTTCTATTAA CAGAAGTATT ACTTCTTGTA ACCAAATTAA    8100
AGGGTAGATT GATTTCTGTT GTTGTTTTTG TTTCGGCTTT GTTGTTATTT ATTGCAATTT    8160
ATTTCGATGA AATCATGGTT GTATTCAACT ACATGAATGA AACATTGCAA GGCAATAGCG    8220
AAACATATTT GGTTAGAGTG CATCACTTTG AAGATCTAGT TGCGCTTTTC TCGGAAAATC    8280
CAATTAATTT TCTTTTTGGT TTTGGTGCAG GAAGTTCATT TTTCTCATCG TATTATGGGA    8340
AGTACATATT TAATATAGAA TTAGACCATC TAAACGCGAT TAGAAAGTTT GGCCTCATCT    8400
GGTTTTTATC TTTTATGTGG CTTGTATTCT TTAATATTAT CCAACTTGTT AGATTAAAAA    8460
GAAATGAATT GGCTCTTGGG CTTTTTCTTT CTTTCGTCCT GGCAGGTACC AACCCAGTAT    8520
TACTGAGCCC TATATTCTTT ATATTATTAA TCGAATGTCA TTTATTGACA CTTAAAGTAC    8580
                                      orf8的终止  orf9的起始
CATGTTCAAC TAGTGGGCTA CACAATAGTA AGGTG TAATT CTTTTT ATGT TTAATAAATC 8640
TAAAAAGTTA GCTATTTTAC TTTCCAGTTA TAATGGCGAG CAATTTATAG AACAACAACT     8700
ACAATCTCTT ATCGACATGA AGGCTGATTT CATTTTCGAT ATTCATATTA GAGATGATGG     8760
TTCAAGTGAT AAAACTTGTG AAACTATTAA GAAGTTTTCC CAGAAACATG CTAACATTCA     8820
TTTATACGAA GAGAATAATG TTGGAGTTAT TGCAAGTTTT CTTTGGCTTG TAGAAAAAGT     8880
ATCAGGCTAT GATTATTATG CTTTTTGCGA TCAAGATGAT TTTTGGCAAC CATTGAAAGC     8940
CTTGGCAGCA ATTGATAAAT TTGAAAAACA CGAGGAAATA ACTCCGCTGG TGTATTGCTC     9000
AGCTTATGAT TACGTCGATC AAAATCTTAA CTTTATTGGT CGCTTTACTT CCAAAAGTAA     9060
TTTTTCCCCT AGTAATCTGT TAATAGAAAA TTGTGCTCCT GGTTGTACGA TGTTATTCAA     9120
TTCAGCGCTG CGAGAAAAAT ATTTAAGCAT AAGTGCTGCA AATATAAGTA ATCGAGTTGT     9180
GATGCATGAT TGGCTTTTTT TATTATTGGG CCTTCATTTC GGAATGGTAA TTTATGACAG     9240
AAATTCCTAT TTATTATATA GGCAACATGC AAACAATGTT ATAGGTAAAA AATCTGGGTT     9300
GCTGCCTATC TTTAGATCCA AGTATAAGCA ATTCATCAAA GAATGTAAAA GACCGCAGCA     9360
TTTACTTTAT CTTCAAAACG AATTGTTCTC TGATATCACC TCTGGACAAG TAAATTCCTT     9420
AACGCATAAA CTAAGTTGTA GTTTCGTTTC CGCTCAAAGA AATTTTTACT CTAGAGCTAA     9480
ATTTGCCTTT AGCGGGAAAA TAAAGCGTAT CCGAAAAGTT GATGATTTAA TATTTAAGAT     9540
                           orf9的终止         orf10的起始
TTTATTTGTT TTTGGATATT ATAAA TAATA TGGTTTGGAA TCA ATGAGTC AACTTAAAAA 9600
ATTACATATT GTCCTTGTAG GTAATACATT ATGGTCAGTT TATAATTTCC GTAGAGGTCT     9660
AATTCAAAGC TTTATGAGCA ATGGTCATAG AGTGACAATA GTTGGACCTA AGGATGAGTT     9720
TACTGAGAAA TTAGAGGGAT TAGGCTGTGA TGTTGTTGAT ATTCCTATTT CATCGCAAGG     9780
TAAAAATCCT TTTATTGACA TGCTACTTAT AAATCGACTG AGAGTTGTTT ATAAAAGGAT     9840
TAAACCGGAT TTTGTTTTTC ACTATACTAT AAAGCCAAAT ATATATGGCT CGATTGCTGC     9900
TGGCTTGTCT CGAACAAAAT CAATAGCTAT TACTACCGGG CTTGGTTATG TTTTCAATAA     9960
CTCTTCATTT TTCACTCACA TAATTTCACA TTTGTACTGC TTTGCATTTA AATTCGCAAA    10020
AGAAGTCTGG TTTTTGAATG AAGATGATAG AAATGTGTTT ATACAAAGAG GTATTATCTC    10080
ACCTGGCAAG ACTCATATTC TTGATGGCGA AGGTGTCGAT ACTAGTTTCT TCATTCCTAG    10140
GGCAAAACCT ATTTCGCATA AAAAATCAAA AGTTACGTTT TTGCTCGTTG CAAGGATGCT    10200
GTGGGACAAA GGTGTTGGGA TATACGTTGA TGCGGCTCGT AAACTAAAAG AACAGTACCC    10260
AGATACTGAA TTTCAGTTGT TAGGGGCCTG CGATGTCGAT AATCCGAGCG CAATTCCACG    10320
TGATATTATA GATAATTGGC ATGAAGAGGG TGTAGTTAAT TATTTGGGAA TGACGAATGA    10380
TGTGCGCACC GTTGTATCCC AAGCCGACTG TAATGTATTG CCTTCTTATT ATCGCGAGGG    10440
AGTTCCTCGA ACATTGATGG AAGCAGCATC AATGGGCAAA CCAGTACTTA CGACCGATAA    10500
TGTCGGATGT AGAAATGTTG TTATAGAAGC GCAAACAGGT TTTTTATGCA AGACAAAAGA    10560
TGTCGATAGT TTAGTTGACG CTATGAATAA GATTCTCCAT TTAACCCCTG AGGAACGTAG    10620
CGAAATGGGT CTAAATGGTC GGGATTATAT GATAAGCCGC TTCGATGAAA GGGTTATTAT    10680
                                             orf10的终止
TGCTGATTAT TATAATGCTA TTCAAAAATA TGTTGAAGTA  TAGTTGCCCC TAAGGATTTG  10740
TTTATCTACT GACCATCCGT ATTTGTATAA AGCATCTTCC GCTATCCATG ATGACTTAAC    10800
CTGAGTTAAC ATCAGGTATA CATTCAAGCC GCGCACAGTT ACGGCGAACA CACCTGACAG    10860
GAGTATGTAA TGTCCAAGCA ACAGATCGGC GTTGTCGGTA TGGCAGTGAT GGGGCGCAAC    10920
CTGGCGCTCA ACATCGAAAG CCGCGGTTAT ACCGTCTCCG TTTTCAACCG CTCCCGTGAT    10980
AAGACCGAAG AAGTCATCGC TGAGAATCCG GGTAAGAAAC TGGTTCCTTT CTATACGGTT    11040
AAAGAGTTTG TTGAATCTCT GGAAACGCCT CGTCGTATCC TGTTAATGGT GAAAGCGGGC    11100
GCAGGTACCG ATGCAGCCAT CGATTCCCTG AAACCTTATC TGGAAAAAGG AGACATCATC    11160
ATTGATGGTG GCAACACCTT CTTCCAGGAC ACCATTCGTC GTAACCGTGA ACTCTCTGCT    11220
GAAGGTTTCA ACTTCATCGG TACCGGTGTC TCCGGTGGTG AAGAGGGCGC CCTGAAAGGC    11280
CCATCTATCA TGCCTGGTGG CCAGAAAGAA GCGTATGAAC TGGTTGCGCC AATCCTGACC    11340
AAAATCGCTG CGGTTGCGGA AGATGGTGAG CCGTGTGTGA CCTATATCGG TCCGGACGGT    11400
GCAGGCCACT ATGTTAAGAT GGTTCACAAC GGCATCGAAT ACGGCGATAT GCAGCTGATT    11460
GCTGAAGCTT ACTCTCTGCT GAAGGGCTGA GTAAACAACT GCTGCCCATT TACGACAAAC    11520
CAATGATTTA CTATCCGCTG TCTACGCTGA TGCTGGCAGG GATTAAAGAC ATTCTGATCA    11580
TCAGTACGCC ACAGGATACC CCGCGCTTTG AACAGCTTCT GGGCGACGGC AGTCAGTGGG    11640
GGTTAAACCT TCAGTATAAA GTACAGCCAA GCCCTGATGG ACTGGCTCAG GCCTTTATCA    11700
TTGGCGAACT ATAGTAT                                                   11717
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上 的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。