用于甲硫氨酸的生物生产的组合物和方法
阅读：334发布：2021-10-30
专利汇可以提供用于甲硫氨酸的生物生产的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了用于使用经修饰的氢营养型 微 生物 的组合物和方法，所述经修饰的氢营养型微生物能够任选地在H2的存在下生物利用CO和/或CO2气体或将CO和/或CO2气体转化为甲硫 氨 酸。，下面是用于甲硫氨酸的生物生产的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种非天然经工程改造的氢营养型微生物，其中所述经工程改造的氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸，并且其中所述经工程改造的氢营养型微生物表达经遗传工程改造的内源多肽，所述经遗传工程改造的内源多肽包括：
(a)具有如在SEQ ID NO：4和8中的至少一个中所给出的氨基酸序列的经遗传工程改造的多肽；
(b)具有与SEQ ID NO：4和8中的至少一个包含至少90％的序列同一性的氨基酸序列的经遗传工程改造的多肽，其中所述经工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调；
(c)由与SEQ ID NO：2和6中的至少一个包含至少70％的序列同一性的核酸分子编码的经遗传工程改造的多肽，其中所述经遗传工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调；或者
(d)由在严格条件下与SEQ ID NO：2和6的全长互补序列杂交的核酸分子编码的经遗传工程改造的多肽，其中所述经遗传工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调。
2.根据权利要求1所述的非天然氢营养型微生物，其中所述经工程改造的多肽是海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1359的同源物或直系同源物。
3.根据权利要求2所述的非天然氢营养型微生物，其中所述同源物或直系同源物在残基D439处包含突变，其中所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1359的残基位置。
4.根据权利要求2或3所述的非天然氢营养型微生物，其中所述突变是D439N取代，并且所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1359的残基位置。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述经工程改造的多肽是海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1358的同源物或直系同源物。
6.根据权利要求5所述的非天然氢营养型微生物，其中所述同源物或直系同源物在残基G114处包含突变，并且所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1358的残基位置。
7.根据权利要求5或6所述的非天然氢营养型微生物，其中所述突变是G114E取代，并且所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1358的残基位置。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物还包含失调的天冬氨酸激酶活性、甲硫氨酸合酶或两者。
9.根据权利要求8所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶活性是内源天冬氨酸激酶、外源天冬氨酸激酶或两者。
10.根据权利要求8或9所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶活性是对赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶突变体。
11.根据权利要求8-10所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其组合编码，所述突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其组合各自包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由在苏氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。
13.根据权利要求12所述的非天然氢营养型微生物，其中所述苏氨酸结合位点突变在残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC编码的残基位置。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由在赖氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。
15.根据权利要求14所述的非天然氢营养型微生物，其中所述赖氨酸结合位点突变在残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC编码的残基位置。
16.根据权利要求8-15中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的内源天冬氨酸激酶活性由在赖氨酸和苏氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。
17.根据权利要求16所述的非天然氢营养型微生物，其中所述赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC编码的残基位置。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由在不同于赖氨酸或苏氨酸结合位点的位点处包含突变的突变lysC基因编码。
19.根据权利要求18所述的非天然氢营养型微生物，其中所述不同于赖氨酸和苏氨酸结合位点的位点处的突变在残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC
13032的lysC编码的残基位置。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子。
21.根据权利要求20所述的非天然氢营养型微生物，其中所述来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-反式琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。
22.根据权利要求20所述的非天然氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者，或者所述外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者。
23.根据权利要求22所述的非天然氢营养型微生物，其中所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者过表达，或者其中所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者过表达。
24.根据权利要求22或23所述的非天然氢营养型微生物，其中所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者失调，或者其中所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者失调。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中其中所述外源核酸分子编码甲硫氨酸合酶。
26.根据权利要求25所述的非天然氢营养型微生物，其中与缺乏编码甲硫氨酸合酶的所述外源核酸分子的亲本氢营养型微生物相比，所述甲硫氨酸合酶过表达。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中编码来自赖氨酸生物合成途径的多肽的一种或更多种核酸分子被敲除或具有降低的活性。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中编码来自苏氨酸生物合成途径的多肽的一种或更多种核酸分子被敲除或具有降低的活性。
29.根据权利要求27或28所述的非天然氢营养型微生物，其中编码二氢吡啶二羧酸合酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码活性降低的二氢吡啶二羧酸合酶突变体、高丝氨酸激酶突变体、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。
30.根据权利要求9-29中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子整合在所述非天然氢营养型微生物的基因组中。
31.根据权利要求9-29中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子在所述非天然氢营养型微生物中呈自我复制载体的形式。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。
33.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或两者。
34.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的5-甲基四氢叶酸类咕啉/铁硫蛋白甲基转移酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰辅酶A合酶、增加的天冬氨酸转氨酶活性或其任意组合。
35.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述COx底物是由H2、CO和CO2构成的H2/COx底物。
36.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述COx底物是由合成气或水-气变换过的合成气构成的H2/COx底物。
37.根据权利要求35或36所述的非天然氢营养型微生物，其中CO2与H2的比例范围分别为约1:50至约10:1。
38.根据权利要求35或36所述的非天然氢营养型微生物，其中CO2与H2的比例范围分别为约1:2至约1:4。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中CO的总量不超过约1％。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述氢营养型微生物是产甲烷古细菌。
41.根据权利要求40所述的非天然氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌选自甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、产甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷拟球菌属、甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷热杆菌属、甲烷热球菌属、甲烷热菌属或甲烷炎菌属。
42.根据权利要求40所述的非天然氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌选自由以下组成的组：嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、德氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、伊氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆菌、抗酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、伍氏甲烷短杆菌、沃氏甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、居烂泥甲烷胞菌、马堡甲烷热杆菌、热自养甲烷热杆菌、热弯曲甲烷热杆菌、嗜热甲烷热杆菌、沃氏甲烷热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、筑后甲烷袋状菌、海底甲烷袋状菌、低温产甲烷菌、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌、居蟑螂甲烷微球菌、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌、乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、运动甲烷微菌、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、热自养甲烷热球菌、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌、沸泉甲烷热球菌、印度洋甲烷热球菌、热液口甲烷热球菌、詹氏甲烷热球菌以及火神甲烷热球菌。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌不产生细胞色素。
44.根据权利要求43所述的非天然氢营养型微生物，其中不产生细胞色素的所述产甲烷古细菌是海沼甲烷球菌或万氏甲烷球菌。
45.根据权利要求40-42中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌产生细胞色素。
46.根据权利要求45所述的非天然氢营养型微生物，其中产生细胞色素的所述产甲烷古细菌是巴氏甲烷八叠球菌或马氏甲烷八叠球菌。
47.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物表达或过表达甲硫氨酸的输出者。
48.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物还包含编码甲硫氨酸的输出者的外源核酸分子。
49.根据权利要求47或48所述的非天然氢营养型微生物，其中所述输出者是brnFE或metT基因。
50.一种重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸，其中所述重组氢营养型微生物表达外源多肽，所述外源多肽包括：
(a)具有SEQ ID NO：3、4、7或8中的至少一个中所给出的氨基酸序列的多肽；
(b)具有与SEQ ID NO：3、4、7或8中的至少一个包含至少90％的序列同一性的多肽，其中所述多肽任选地对于一种或更多种反馈抑制剂失调；
(c)由与SEQ ID NO：1、2、5或6中的至少一个包含至少70％的序列同一性的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽任选地对于一种或更多种反馈抑制剂失调；或者
(d)由在严格条件下与SEQ ID NO：1、2、5或6的全长互补序列杂交的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽任选地对于一种或更多种反馈抑制剂失调。
51.根据权利要求50所述的重组氢营养型微生物，其中所述多肽是来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1359的同源物或直系同源物。
52.根据权利要求51所述的重组氢营养型微生物，其中所述同源物或直系同源物在残基D439处包含突变，其中所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1359的残基部分。
53.根据权利要求51或52所述的重组氢营养型微生物，其中所述突变为D439N取代，并且所述残基编号对应于由海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1359编码的残基位置。
54.根据权利要求48-51中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述微生物包含基因的突变，所述基因是来自海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1358的直系同源物。
55.根据权利要求54所述的重组氢营养型微生物，其中所述突变在残基G114处，并且所述残基编号对应于由海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1358编码的残基位置。
56.根据权利要求54或55所述的重组氢营养型微生物，其中所述突变是G114E取代，并且所述残基编号对应于由海沼甲烷球菌S2 DSM14266的MMP1358编码的残基位置。
57.根据权利要求50-56中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物表达经工程改造的失调的内源多肽，所述经工程改造的失调的内源多肽包括：
(a)具有如SEQ ID NO：4和8中的至少一个中所给出的氨基酸序列的多肽；
(b)具有与SEQ ID NO：4和8中的至少一个包含至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调；
(c)由与SEQ ID NO：2和6中的至少一个包含至少70％的序列同一性的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调；或者
(d)由在严格条件下与SEQ ID NO：2和6的互补序列杂交的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调。
58.根据权利要求50-57中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物还包含失调的天冬氨酸激酶活性、甲硫氨酸合酶或两者。
59.根据权利要求58所述的重组氢营养型微生物，其中所述微生物表达失调的内源天冬氨酸激酶活性、失调的外源天冬氨酸激酶活性或两者。
60.根据权利要求59所述的重组氢营养型微生物，其中所述失调的内源天冬氨酸激酶活性是对赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶突变体。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的所述核酸分子编码失调的天冬氨酸激酶突变体。
62.根据权利要求61中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述失调的天冬氨酸激酶突变体对赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性。
63.根据权利要求58-62中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述核酸分子过表达具有天冬氨酸激酶活性的所述多肽。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源天冬氨酸激酶活性、内源天冬氨酸激酶活性或这两者单独地由突变lysC基因编码，或者所述外源天冬氨酸激酶活性单独地由突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其组合编码，所述突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其组合各自包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合。
65.根据权利要求58-64中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源天冬氨酸激酶活性、内源天冬氨酸激酶活性或两者单独地由在苏氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。
66.根据权利要求65所述的重组氢营养型微生物，其中所述苏氨酸结合位点突变在残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC编码的残基位置。
67.根据权利要求58-64中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源天冬氨酸激酶活性、内源天冬氨酸激酶活性或两者单独地由在赖氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。
68.根据权利要求67所述的重组氢营养型微生物，其中所述赖氨酸结合位点突变在残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC编码的残基位置。
69.根据权利要求58-64中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源天冬氨酸激酶活性、内源天冬氨酸激酶活性或两者单独地由在赖氨酸和苏氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。
70.根据权利要求69所述的重组氢营养型微生物，其中所述赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysC编码的残基位置。
71.根据权利要求58-64中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源天冬氨酸激酶活性、内源天冬氨酸激酶活性或两者单独地由在不同于赖氨酸或苏氨酸结合位点的位点处包含突变的突变lysC基因编码。
72.根据权利要求71所述的重组氢营养型微生物，其中在不同于赖氨酸和苏氨酸结合位点的位点处的所述突变在残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合处，其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC
13032的lysC编码的残基位置。
73.根据权利要求50-72中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子，并且所述重组氢营养型微生物产生与所述亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
74.根据权利要求73所述的重组氢营养型微生物，其中所述来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种编码多肽选自：天冬氨酸激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-反式琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。
75.根据权利要求73所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者，或者其中第二外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者。
76.根据权利要求75所述的重组氢营养型微生物，其中编码所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者的所述外源核酸分子可操作地连接至核酸表达控制序列。
77.根据权利要求76所述的重组氢营养型微生物，其中所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者过表达，或者其中所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者过表达。
78.根据权利要求75-77中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者失调，或者其中所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者失调。
79.根据权利要求73-78中任一项所述的非天然氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子编码甲硫氨酸合酶。
80.根据权利要求79所述的非天然氢营养型微生物，其中与缺乏编码甲硫氨酸合酶的外源核酸分子的亲本氢营养型微生物相比，所述甲硫氨酸合酶过表达。
81.根据权利要求50-80中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中编码来自赖氨酸生物合成途径的多肽的一种或更多种核酸分子被敲除或具有降低的活性。
82.根据权利要求50-81中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中编码来自苏氨酸生物合成途径的多肽的一种或更多种核酸分子被敲除或具有降低的活性。
83.根据权利要求81或82所述的重组氢营养型微生物，其中编码二氢吡啶二羧酸合酶、苏氨酸激酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码活性降低的二氢吡啶二羧酸合酶突变体、苏氨酸激酶、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。
84.根据权利要求50-83中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子整合在所述重组氢营养型微生物的基因组中。
85.根据权利要求50-83中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述外源核酸分子在所述重组氢营养型微生物中呈自我复制载体的形式。
86.根据权利要求50-85中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体或两者。
87.根据权利要求50-86中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或两者。
88.根据权利要求50-87中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰辅酶A合酶、增加的天冬氨酸转氨酶活性或其任意组合。
89.根据权利要求50-88中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述COx底物是由H2、CO和CO2构成的H2/COx底物。
90.根据权利要求50-89中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述COx底物是由合成气或水-气变换过的合成气构成的H2/COx底物。
91.根据权利要求89或90所述的重组氢营养型微生物，其中CO2与H2的比例范围分别为约1:50至约10:1。
92.根据权利要求89或90所述的重组氢营养型微生物，其中CO2与H2的比例范围分别为约1:2至约1:4。
93.根据权利要求89-92中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中CO的总量不超过约
1％。
94.根据权利要求50-93中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述氢营养型微生物是产甲烷古细菌。
95.根据权利要求94所述的重组氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌选自：甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、甲烷球菌属、甲烷拟球菌属、甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷热杆菌属、甲烷热球菌属、甲烷热菌属或甲烷炎菌属。
96.根据权利要求95所述的重组氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌选自由以下组成的组：嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、德氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、伊氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆、抗酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、伍氏甲烷短杆菌、沃氏甲烷短杆菌、马堡甲烷热杆菌、热自养甲烷热杆菌、热弯曲甲烷热杆菌、嗜热甲烷热杆菌、沃氏甲烷热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、筑后甲烷袋状菌、海底甲烷袋状菌、低温产甲烷菌、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌、居蟑螂甲烷微球菌、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌、乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、运动甲烷微菌、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、热自养甲烷热球菌、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌、沸泉甲烷热球菌、印度洋甲烷热球菌、热液口甲烷热球菌、詹氏甲烷热球菌以及火神甲烷热球菌。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌不产生细胞色素。
98.根据权利要求97所述的重组氢营养型微生物，其中不产生细胞色素的所述产甲烷古细菌是海沼甲烷球菌或万氏甲烷球菌。
99.根据权利要求94-96中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述产甲烷古细菌产生细胞色素。
100.根据权利要求99所述的重组氢营养型微生物，其中产生细胞色素的所述产甲烷古细菌是巴氏甲烷八叠球菌或马氏甲烷八叠球菌。
101.根据权利要求50-100中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物表达或过表达甲硫氨酸的输出者。
102.根据权利要求52-101中任一项所述的重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物还包含编码甲硫氨酸的输出者的外源核酸分子。
103.根据权利要求101或102所述的重组氢营养型微生物，其中所述输出者是brnFE或metT基因。
104.一种用于产生甲硫氨酸的方法，所述方法包括将根据权利要求1-49中任一项所述的非天然氢营养型微生物培养足以产生甲硫氨酸的一段时间，其中所述非天然氢营养型微生物：(a)表达具有与亲本氢营养型微生物相比增加的活性的一种或更多种硫同化多肽；
(b)过表达一种或更多种硫同化多肽；或(c)包含一种或更多种硫同化多肽的改变的调节，其中所述非天然氢营养型微生物产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
105.一种用于制备甲硫氨酸或含有甲硫氨酸的饲料添加剂的方法，所述方法包括在H2/COx底物的存在下和以足以使编码硫同化多肽的外源多肽表达的条件和时间培养根据权利要求50-103中任一项所述的重组的分泌甲硫氨酸的氢营养型微生物，其中甲硫氨酸以与由亲本氢营养型微生物产生的甲硫氨酸相比更高的水平产生并在培养基中积累。
106.一种用于产生甲硫氨酸的系统，其包括：
(a)任选地在H2的存在下包含COx底物的气体源；
(b)包含根据权利要求1-49中任一项所述的非天然氢营养型微生物的生物反应器，所述非天然氢营养型微生物包含编码硫同化多肽的外源核酸分子；和
(c)设置在所述气体源和所述生物反应器之间以使所述气体流入所述生物反应器中的连接器；
其中与亲本氢营养型微生物相比，所述非天然氢营养型微生物代谢所述H2/COx底物以过量产生甲硫氨酸。
107.一种用于产生甲硫氨酸的系统，其包括：
(a)任选地在H2的存在下包含COx底物的气体源；
(b)包含根据权利要求50-103中任一项所述的重组氢营养型微生物的生物反应器，所述重组氢营养型微生物包含编码硫同化多肽的外源核酸分子；和
(c)设置在所述气体源和所述生物反应器之间以使所述气体流入所述生物反应器中的连接器；
其中与亲本氢营养型微生物相比，所述非天然氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物以过量产生甲硫氨酸。
108.根据权利要求106或107所述的系统，其中所述生物反应器是液相、鼓泡塔或滴流床生物反应器。
109.根据权利要求106或107所述的系统，其中所述COx底物是由合成气或水-气变换过的合成气构成的H2/COx底物。
用于甲硫氨酸的生物生产的组合物和方法
[0002] 与本申请相关的序列表以文本格式提供代替纸质副本，并且通过引用在此并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为910215_407WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为30.5KB，创建于2016年5月6日，并通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
[0003] 甲硫氨酸是含硫的必需氨基酸，其可用于食品和医疗行业的各种应用。例如，甲硫氨酸被用作动物饲料和食品中的添加剂，并用作许多药物中的成分。因此，对甲硫氨酸有高的工业需求。
[0004] 为了满足该高需求，已通过复杂的化学合成来以合成方式制造甲硫氨酸，所述化学合成涉及难处理的原料例如甲硫醇、丙烯和氰化氢。甲硫氨酸的合成生产需要严酷的生产环境或产生对环境有害的副产物。
[0005] 由于起始材料的高成本和合成生产的环境影响，优选通过发酵生产甲硫氨酸的方法。然而，甲硫氨酸的高效发酵生产由于甲硫氨酸中硫原子的存在而复杂化。此外，目前的发酵方法利用糖和碳水化合物作为起始碳源。针对全年生产和环境问题寻找可靠的原材料使碳水化合物的使用复杂化。例如，许多碳水化合物废物来源(例如，残留作物生物质)可以被发酵，但是是季节性的。可替代地，可以栽培一些作物以产生用于工业发酵反应的碳水化合物。然而，这些方法减少了可用于食物生产的耕地，而且是昂贵的。
[0006] 鉴于对甲硫氨酸的高需求以及可发酵的碳水化合物的较高成本和不可靠性，本领域需要以成本有效的方式生物生产甲硫氨酸的替代和改进的方法。本公开满足这样的需要，并且还提供了其它相关优点。
[0007] 发明详述
[0008] 本公开提供了用于代谢工程改造(例如，改变基因、基因表达、基因表达调控)氢营养型微生物以产生与野生型或亲本生物体相比更高水平的甲硫氨酸的组合物和方法。
[0009] 作为背景，许多微生物，包括被归类为古细菌和氢营养型微生物的那些，通过生物合成途径产生甲硫氨酸，这些生物合成途径共有数种参与产生其它氨基酸的酶，所述其它氨基酸例如天冬氨酸途径氨基酸。这些氨基酸生物合成酶中的一种或更多种经受反馈调节、基因表达的抑制或两者。例如，天冬氨酸激酶是参与将碳通量引入工业上重要的氨基酸(例如，甲硫氨酸)的生物合成中的第一个定向酶(committed enzyme)，其在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中通过苏氨酸和赖氨酸被别构地抑制使天冬氨酸磷酸化(Sano和Shiio，J.Gen.Appl.Microbiol.16：373,1970；Yoshida等，J.Mol.Biol.368：521,2007)。另一种酶，高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶受甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的反馈调节(Born和Blanchard，Biochem.38：14416,1999)。高丝氨酸脱氢酶是甲硫氨酸/苏氨酸生物合成途径中的第一个定向酶，但是其必须与定向至赖氨酸生物合成途径的第一个酶－二氢吡啶二羧酸合酶竞争天冬氨酰半醛。因此，碳通量是否流向甲硫氨酸或赖氨酸将取决于哪种酶获得底物。
[0010] 本公开涉及如下出乎意料的发现：与野生型(亲本)氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)相比，具有一个或更多个改变的硫同化相关开放阅读框(ORF)(在本文中称为MMP1359和MMP1358)的氢营养型微生物可以过量产生甲硫氨酸。作为进一步的背景，Rauch等(Mol.Microbiol.94：1330，2014)通过双重敲除突变发现被称为MA1821和MA1822 ORF(分别为MMP1359和MMP1358 ORF的同源物)的乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)ORF在缺乏针对高半胱氨酸性形成的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的遗传背景下参与高半胱氨酸生物合成；特别地，通过生物信息学技术鉴定的这些ORF似乎参与在厌氧菌中将硫化物并入高半胱氨酸的过程。虽然Rauch等(2014)发现MA1821和MA1822 ORF共同定位于甲硫氨酸生物合成的基因组上(这对于参与高半胱氨酸生物合成中的基因来说并不罕见)，但是这些ORF在甲硫氨酸生物合成中的作用未被探索。尽管不希望受理论束缚，但是认为本公开表明MMP1359和MMP1358 ORF受到甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制，并且本公开的改变的ORF编码对甲硫氨酸反馈抑制具有抗性的多肽。因此，在某些方面，本公开提供了使用表达失调的或经遗传修饰的MMP1359、MMP1358或两者的经修饰的氢营养型微生物(例如，古细菌)的组合物和方法，以促进气体原料(例如，包含氢气和碳氧化物(例如，CO、CO2)的气体)的代谢以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
[0011] 在更详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可有助于其理解。在本公开中给出了附加的定义。
[0012] 在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围都应被理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，另有说明除外。此外，除非另有说明，否则本文所述涉及任何物理特征(例如聚合物亚单位、大小或厚度)的任何数量范围应被理解为包括所述范围内的任何整数。如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”是指所示范围、值或结构的±20％。术语“基本上由……组成”限制了针对特定材料或步骤的权利要求的范围，或者针对实质上不影响所要求保护的发明的基本特征和新颖特征的那些的权利要求的范围。应当理解，本文所用的“一个”和“一种”是指“一个/种或更多个/种”所列举的组份。替选方案(例如“或”)的使用应被理解为是指替选方案中的一个、两个或其任意组合。如本文所用，术语“包括”、“具有”和“包含”被同义地使用，该术语及变体意在被解释为非限制性的。
[0013] 如本文所用，“天冬氨酸途径氨基酸”或“氨基酸的天冬氨酸家族”是指由天冬氨酸合成的一种或更多种氨基酸，包括赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。虽然氨基酸的天冬氨酸家族的每个氨基酸的生物合成途径的步骤支化和发散，但它们都以用天冬氨酸激酶使天冬氨酸磷酸化开始。在某些实施方案中，氨基酸的天冬氨酸家族的生物合成途径中的天冬氨酸激酶受到赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制。
[0014] 如本文所用，“甲硫氨酸生物合成途径”或“甲硫氨酸途径”是指直接或间接参与用于甲硫氨酸生物合成的甲硫氨酸和前体代谢物(例如，半胱氨酸、高丝氨酸)的生物合成的一种或更多种酶。可以组成甲硫氨酸生物合成途径的示例性酶包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-反式琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)、MMP1358、MMP1359或其任意组合。
[0015] 如本文所用，“H2/COx底物”或“H2/COx原料”是指氢气(H2)与二氧化碳(CO2)或一氧化碳(CO)或两者的混合物，其也可包括各种其它组分，例如氨(NH3)、烃类(例如，甲烷(CH4))、CO2、CO、甲醛(CH2O)、硫化氢(H2S)、羰基硫化物(COS)、氰化氢(HCN)、水蒸气、惰性气体或其它气体。在某些实施方案中，本公开的微生物利用COx底物或原料，所述COx底物或原料任选地在H2的存在下并且还可以包括如上所述的各种其它组分。
[0016] 如本文所用，“合成气体”或“合成气”是指一氧化碳和氢气的混合物，其可以例如通过以下方式来产生：蒸汽重整、干法或CO2重整、自热重整、天然气体或液烃的催化部分氧化或部分氧化、在氢合成中、在氨合成中、在甲醇合成中、通过炼钢或、或通过煤、生物质或废物气化。在某些实施方案中，可通过水-气变换反应进一步调节合成气。合成气还可以包括相对于CO和H2较少量的甲烷、CO2、H2S或其它气体。
[0017] 如本文所用，术语“宿主”是指可以通过突变进行遗传修饰的细胞或微生物(例如，古细菌)：用外源核酸分子产生目标多肽(例如，失调的MMP1358、失调的MMP1359)；通过敲除或其组合来相对于未经修饰的宿主细胞改善甲硫氨酸的产生。在某些实施方案中，宿主细胞可以任选地已经具有赋予与所表达的突变多肽或外源多肽(例如，失调)相关或不相关的期望性质的其它遗传修饰。例如，宿主细胞可以具有或被改变成具有为甲硫氨酸途径赋予额外的或增强的碳通量活性的遗传修饰、竞争性氨基酸的产生减少、高生长、污染物或特定培养条件耐受性、代谢额外碳底物的能力或合成所需产物或中间体的能力。
[0018] 如本文所用，“氢营养型”或“氢营养型的”是指能够消耗H2、使H2氧化或将H2转化成作为其代谢的一部分的另一种化合物的微生物。在某些实施方案中，氢营养型可以是专性或兼性的氢营养型、专性或兼性厌氧菌或其任意组合。例如，兼性氢营养型可以在存在或不存在作为能量源的氢的情况下生长，并且可以利用一种或更多种各种碳源，例如碳水化合物、乙酸盐、甲酸盐、甲醇、甲胺或碳氧化物(例如，产乙酸菌梭菌(Clostridium)可以在不存在H2的情况下生长，并且使用乙酸盐作为能源和碳源两者；马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)可以在不存在H2的情况下通过采用利用例如乙酸盐、甲胺或甲醇的产甲烷的替选代谢途径存活)。示例性氢营养型包括产甲烷菌、产乙酸菌、Knall-gas细菌等。
[0019] 如本文所用，术语“产甲烷菌”或“产甲烷古细菌”是指能够在缺氧条件下利用任何一种或更多种产甲烷途径产生甲烷的古细菌微生物，包括(a)使用各种的一种或两种碳底物(例如，二氧化碳、乙酸盐、甲酸、甲醛、一氧化碳、甲醇、甲胺(例如，甲胺、二甲胺、三甲胺等))中的任一种和氢气；(b)在乙酰化途径中使用乙酸盐，和(c)在甲基营养型产甲烷途径中使用缺少碳-碳键的还原型单碳化合物或多碳化合物。例如，甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的种具有全部三种已知的产甲烷途径，甲烷八叠球菌属的种是能够利用至少九种产甲烷底物(例如甲醇、甲胺、甲硫醇、乙酸盐)的古细菌，尽管乙酸甲烷八叠球菌不能依靠H2/CO2还原生存，因为其缺少功能性H2还原剂，这与马氏甲烷八叠球菌不同(Maeder等，J.Bacteriol.188：7922，2006)。但是，乙酸甲烷八叠球菌可以通过将CO氧化成CO2或通过在产生甲烷时使用乙酸盐作为电子受体将CO代谢成乙酸盐和甲酸盐而生长。在本领域中可以理解，细菌不是古细菌，并且古细菌不是细菌。如本文所用，产甲烷古细菌可以是“专性氢营养型”，其需要氢气来产生甲烷(例如，Methanocella conradii)。产甲烷古细菌可以是“兼性氢营养型”，其能够在不存在氢气的情况下产生甲烷(例如，马氏甲烷八叠球菌)。此外，产甲烷古细菌可以是嗜温的、嗜热的或嗜超热的。
[0020] 如本文所用，“生物质”是指具有生物来源的有机物质，其可以包括全细胞、裂解细胞、细胞外物质、产生的产物或其一部分等。例如，从培养的微生物(例如，细菌或古细菌培养物)收获的物质可以被认为是生物质，其可以包括分泌产物或者可以是分泌产物。
[0021] 如本文所用，也称为多核苷酸的“核酸分子”是指由共价连接的被称为核苷酸的亚单位构成的聚合化合物。核酸分子包括聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，二者都可以是单链的或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、半合成DNA等。
[0022] 如本文所用，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞中的基因、蛋白质、化合物或活性。此外，与亲本基因、蛋白质或活性相比，突变的、过表达的、经改组的、经复制的或以其它方式改变的基因、蛋白质或活性仍被认为对于该特定宿主细胞而言是内源的或天然的。例如，可以使用来自第一基因(例如，启动子、翻译减弱序列)的内源控制序列来改变或调节第二天然基因或核酸分子的表达，其中第二天然基因或核酸分子的表达或调节与亲本细胞中的正常表达或调节不同。
[0023] 如本文所用，“异源”或“外源”核酸分子、构建体或序列是指对于宿主细胞而言是非天然的但是可以与来自宿主细胞的核酸分子或核酸分子的部分同源的核酸分子或核酸分子的部分。异源或外源核酸分子、构建体或序列的来源可以来自不同的属或种。在某些实施方案中，通过例如缀合、转化、转染、电穿孔等将异源或外源核酸分子(即，不是内源的或天然的)加入到宿主细胞或宿主基因组中，其中加入的分子可以整合到宿主基因组中，或作为染色体外遗传物质存在(例如，作为质粒或其它形式的自我复制载体)，并且可以以多个拷贝存在。此外，“异源”是指由被引入宿主细胞的外源核酸分子编码的非天然酶、蛋白质或其它活性，即便宿主细胞编码同源蛋白质或活性。
[0024] 术语“同源的”或“同源物”是指与宿主细胞、物种或菌株中发现的或由其衍生的分子或活性相似的分子或活性。例如，异源或外源核酸分子可以与天然宿主细胞基因同源，并且可任选地具有改变的表达水平、不同的序列、改变的活性或其任意组合。同源多核苷酸或多肽可以具有与参考或亲本野生型序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性的多核苷酸或多肽序列。在某些实施方案中，同源多肽将相对于参考或亲本野生型酶在一个或更多个预定位置处包括至少一个氨基酸取代(例如，至少1、2、3、5、6、7、8、9或10个或更多个或者多至20、25或30个取代)或不超过特定数量的氨基酸取代(例如，不超过1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个取代)，前提是同源蛋白质或多肽保留目标活性(例如，羧化酶、脱羧酶、脱氢酶、差向异构酶、激酶、裂解酶、还原酶、合酶)。
[0025] 如本文所用，术语“非天然”或“非天然经工程改造”是指经遗传工程改造以包括与野生型或亲本细胞或分子不同的至少一种遗传改变的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体。例如，非天然可以指经工程改造(例如，位点特异性或随机突变体，包括自发突变体)使得内源核酸分子或基因的表达或者基因产物的活性与野生型或亲本微生物相比已被改变(例如，增加、降低、失调、活化、削弱、抑制)的微生物或细胞。这样的修饰包括例如改变(增加或减少)基因或操纵子表达的非编码调节区中的那些。“非天然”生物体、微生物或细胞可包括重组生物体、微生物或细胞。
[0026] 如本文所用，术语“重组”是指通过引入外源核酸分子而被修饰的微生物、细胞、核酸分子或载体，或者指被改变成使得内源核酸分子或基因的表达受控制、失调或组成型的微生物或细胞，其中可通过遗传工程改造引入这样的改变或修饰。遗传改变可以包括例如引入编码一种或更多种蛋白质或酶的核酸分子(其可以包括表达控制元件，例如启动子)或其它核酸分子添加、缺失、取代的修饰或者对细胞的遗传物质的其它功能性破坏或添加到细胞的遗传物质中。示例性修饰包括来自参考或亲本微生物的异源或同源多肽的编码区或其功能性片段中的那些修饰。在某些实施方案中，本公开的生物体、微生物或细胞是非天然生物体、微生物或细胞以及重组生物体、微生物或细胞。例如，表达或过表达失调的内源酶(例如，MMP1359、MMP1358、天冬氨酸激酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶)的非天然氢营养型微生物还可以含有一种或更多种外源或异源核酸分子，所述一种或更多种外源或异源核酸分子表达或过表达以产生参与甲硫氨酸生物合成的某些酶活性(例如，天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S甲基转移酶、甲硫氨酸合酶脱氢酶)。
[0027] 如本文所用，“转化”是指将核酸分子(例如，外源或异源核酸分子)引入宿主细胞。经转化的宿主细胞可以在染色体外或整合在染色体中携带外源或异源核酸分子。整合入宿主细胞基因组和自我复制载体通常导致经转化核酸分子的基因稳定遗传。含有经转化核酸的宿主细胞被称为“重组”或“经遗传工程改造”或“经转化”或“转基因”细胞(例如，古细菌)。
[0028] 如本文所用，术语“失调”是指分别与亲本或野生型微生物中的基因表达或活性相比，基因产物的表达降低或增加、或者基因产物(例如，蛋白质、酶)的活性降低或增加。例如，微生物可以被遗传操作(例如，突变、经遗传工程改造)以在操作之前相对于亲本或野生型微生物增加或减少基因产物的表达或者增加或降低基因产物的活性。在某些实施方案中，使靶基因突变以使表达的基因产物具有增加的活性。例如，可以改变靶基因的编码区使得表达的基因产物具有增加的活性；可以增加靶基因的拷贝数以增加活性；可以使靶基因过表达以增加活性，或其任意组合。在其它实施方案中，使靶基因被突变以使得所表达的基因产物具有降低的、最低的或检测不到的对反馈抑制的响应(例如，在诸如甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的一种或更多种反馈抑制剂的存在下，氨基酸生物合成酶，例如MMP1358或MMP1359或两者失调)。在进一步的实施方案中，靶基因被突变使得该基因具有降低的、最低的或检测不到的对表达抑制的响应(例如，在反馈共抑制剂甲硫氨酸的存在下使氨基酸生物合成酶(例如，高丝氨酸脱氢酶)失调)。可替代地，可以例如在选择压力下鉴定微生物以具有上述遗传改变(例如，自发突变)中的任意一种或更多种。任意前述实施方案的失调的基因或基因产物可以是自发的、诱导的或经工程改造的突变体或变体。
[0029] 如本文所用，术语“过表达”是指非天然或重组微生物中的基因表达或基因产物的水平大于在相同的条件下生长时亲本或野生型微生物中所见的基因表达或基因产物的水平。在某些实施方案中，过表达可以在转录水平、翻译水平或两者上发生，这可能是由于改变的调节控制(例如，使用强启动子)或拷贝数增加或两者。
[0030] 术语“同一性”或“同一性百分比”在两个或更多个多肽或核酸分子序列的上下文中是指，当在比较窗口或指定区域针对最大对应进行比较和比对时，如采用本领域中已知的方法(例如，序列比较算法、通过人工比对或通过目测检查)所测量的，相同或在特定区域具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％同一性)。例如，适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法是在默认设置下使用的BLAST 2.0算法，这在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403中有描述。
100％同一性)。例如，适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法是在默认设置下使用的BLAST 2.0算法，这在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403中有描述。
[0031] 也涵盖本公开的多核苷酸或多肽的变体。变体多核苷酸或多肽与本文所述的多核苷酸或多肽之一具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％的同一性。在一些实施方案中，变体多核苷酸是在0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠在约65℃至68℃下或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺在约42℃下的严格杂交条件下与限定序列的多核苷酸杂交的那些(参见，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第
2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。多核苷酸变体保留编码具有本文所述功能性的生物合成酶或其多肽的能力。
2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。多核苷酸变体保留编码具有本文所述功能性的生物合成酶或其多肽的能力。
[0032] 还可以使用更严格的条件(例如，较高的温度、较低的离子强度、较高的甲酰胺或其它变性剂)；然而，杂交速率将受到影响。在涉及脱氧寡核苷酸的杂交的情况下，额外的示例性严格杂交条件包括在如下温度下在6×SSC、0.05％焦磷酸钠中进行洗涤：37℃(对于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(对于23个碱基的寡核苷酸)。
[0033] “突变体”是指与参考核酸分子或氨基酸序列相比，多核苷酸或多肽序列的变化。突变可能是由辐射、病毒、转座子、诱变化学物质、减数分裂或DNA复制期间发生的错误、超突变等引起的。突变可导致数种不同类型的序列变化，包括核苷酸或氨基酸取代、插入、缺失或其任意组合。
[0034] 本领域中认为“保守取代”是将一个氨基酸取代为具有相似性质的另一氨基酸。示例性保守取代在本领域中是公知的(参见，例如WO 97/09433，第10页；Lehninger，Biochemistry，第2版；Worth Publishers，Inc.NY，NY，第71至77页，1975；Lewin，Genes IV，Oxford University Press，NY和Cell Press，Cambridge，MA，第8页，1990)。
[0035] 本文使用的“抑制”或“被抑制”是指相对于对照、内源或参考分子直接或间接改变、减少、下调或消除靶基因表达或靶分子(例如，磷酸烯醇丙酮酸合酶)活性，其中改变、减少、下调或消除在统计学、生物学、工业、或临床上具有显著意义。例如，被抑制的、失活的或活性降低的生物合成酶(例如，经遗传工程改造的)可以与野生型或亲本酶相比具有35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、
1％或更少的活性。
1％或更少的活性。
[0036] 氢营养型微生物-宿主细胞
[0037] 本公开的亲本或起始氢营养型微生物可以是野生型(天然)菌株、突变(非天然)菌株(例如，增加的生长速率、失调或去抑制的生物合成酶)或重组菌株，其中每种均可进一步被修饰以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，氢营养型可以是产甲烷古细菌。
[0038] 在某些实施方案中，本公开提供了氢营养型微生物，所述氢营养型微生物是产甲烷古细菌，例如甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷砾菌属(Methanocalculus)、甲烷热球菌属(Methanocaldococcus)、产甲烷胞菌属(Methanocella)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷拟球菌属(Methanococcoides)、甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)、甲烷泡菌属(Methanofollis)、产甲烷菌属(Methanogenium)、甲烷盐菌属(Methanohalobium)、甲烷嗜盐菌属(Methanohalophilus)、甲烷裂叶菌属(Methanolacinia)、甲烷叶菌属
(Methanolobus)、甲烷食甲基菌属(Methanomethylovorans)、甲烷微菌属
(Methanomicrobium)、甲烷微球菌属(Methanomicrococcus)、甲烷盘菌属
(Methanoplanus)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属
(Methanosaeta)、甲烷咸菌属(Methanosalsum)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、Methanospirillium、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)、甲烷热球菌属(Methanothermococcus)、甲烷热菌属(Methanothermus)、或甲烷炎菌属(Methanotorris)。
(Methanolobus)、甲烷食甲基菌属(Methanomethylovorans)、甲烷微菌属
(Methanomicrobium)、甲烷微球菌属(Methanomicrococcus)、甲烷盘菌属
(Methanoplanus)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属
(Methanosaeta)、甲烷咸菌属(Methanosalsum)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、Methanospirillium、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)、甲烷热球菌属(Methanothermococcus)、甲烷热菌属(Methanothermus)、或甲烷炎菌属(Methanotorris)。
[0039] 在另一些实施方案中，氢营养型微生物是特定的产甲烷古细菌物种。示例性产甲烷古细菌物种包括嗜碱甲烷杆菌(Methanobacterium alcaliphilum)、布氏甲烷杆菌(Methanobacterium bryantii)、刚果甲烷杆菌(Methanobacterium congolense)、德氏甲烷杆菌(Methanobacterium defluvii)、埃斯帕诺拉甲烷杆菌(Methanobacterium espanolae)、甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)、伊氏甲烷杆菌
(Methanobacterium ivanovii)、沼泽甲烷杆菌(Methanobacterium palustre)、热聚甲烷杆菌(Methanobacterium thermaggregans)、泥沼甲烷杆菌(Methanobacterium
uliginosum)、抗酸甲烷短杆菌(Methanobrevibacter acididurans)、嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、戈氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter
gottschalkii)、奥氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter olleyae)、瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、伍氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter woesei)、沃氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter wolinii)、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、居烂泥甲烷胞菌
(Methanocella paludicola)、马堡甲烷热杆菌(Methanothermobacter marburgensis)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicum)、热弯曲甲烷热杆菌
(Methanothermobacter thermoflexus)、嗜热甲烷热杆菌(Methanothermobacter
thermophilus)、沃氏甲烷热杆菌(Methanothermobacter wolfeii)、集结甲烷嗜热菌(Methanothermus sociabilis)、巴伐利亚甲烷粒菌(Methanocorpusculum bavaricum)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum parvum)、筑后甲烷袋状菌(Methanoculleus
chikuoensis)、海底甲烷袋状菌(Methanoculleus submarinus)、低温产甲烷菌
(Methanogenium frigidum)、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌(Methanogenium marinum)、居蟑螂甲烷微球菌(Methanomicrococcus blatticola)、内共生甲烷盘菌(Methanoplanus endosymbiosus)、居泥甲烷盘菌(Methanoplanus limicola)、石油甲烷盘菌(Methanoplanus petrolearius)、坎氏甲烷火菌(Methanopyrus kandleri)、
Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌(Methanosaeta harundinacea)、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌(Methanosaeta
thermophila)、乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、运动甲烷微菌(Methanomicrobium mobile)、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、热自养甲烷热球菌(Methanothermococcus thermolithotrophicus)、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermoautotroiphicus)、沸泉甲烷热球菌(Methanocaldococcus fervens)、印度洋甲烷热球菌(Methanocaldococcus indicus)、热液口甲烷热球菌
(Methanocaldococcus infernus)、詹氏甲烷热球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、以及火神甲烷热球菌(Methanocaldococcus vulcanius)。
(Methanobacterium ivanovii)、沼泽甲烷杆菌(Methanobacterium palustre)、热聚甲烷杆菌(Methanobacterium thermaggregans)、泥沼甲烷杆菌(Methanobacterium
uliginosum)、抗酸甲烷短杆菌(Methanobrevibacter acididurans)、嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、戈氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter
gottschalkii)、奥氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter olleyae)、瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、伍氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter woesei)、沃氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter wolinii)、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、居烂泥甲烷胞菌
(Methanocella paludicola)、马堡甲烷热杆菌(Methanothermobacter marburgensis)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicum)、热弯曲甲烷热杆菌
(Methanothermobacter thermoflexus)、嗜热甲烷热杆菌(Methanothermobacter
thermophilus)、沃氏甲烷热杆菌(Methanothermobacter wolfeii)、集结甲烷嗜热菌(Methanothermus sociabilis)、巴伐利亚甲烷粒菌(Methanocorpusculum bavaricum)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum parvum)、筑后甲烷袋状菌(Methanoculleus
chikuoensis)、海底甲烷袋状菌(Methanoculleus submarinus)、低温产甲烷菌
(Methanogenium frigidum)、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌(Methanogenium marinum)、居蟑螂甲烷微球菌(Methanomicrococcus blatticola)、内共生甲烷盘菌(Methanoplanus endosymbiosus)、居泥甲烷盘菌(Methanoplanus limicola)、石油甲烷盘菌(Methanoplanus petrolearius)、坎氏甲烷火菌(Methanopyrus kandleri)、
Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌(Methanosaeta harundinacea)、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌(Methanosaeta
thermophila)、乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、运动甲烷微菌(Methanomicrobium mobile)、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、热自养甲烷热球菌(Methanothermococcus thermolithotrophicus)、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermoautotroiphicus)、沸泉甲烷热球菌(Methanocaldococcus fervens)、印度洋甲烷热球菌(Methanocaldococcus indicus)、热液口甲烷热球菌
(Methanocaldococcus infernus)、詹氏甲烷热球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、以及火神甲烷热球菌(Methanocaldococcus vulcanius)。
[0040] 在某些实施方案中，产甲烷古细菌产生细胞色素或不产生细胞色素。例如，不产生细胞色素的产甲烷古细菌包括甲烷球菌或万氏甲烷球菌。不产生细胞色素的示例性产甲烷古细菌是巴氏甲烷八叠球菌或马氏甲烷八叠球菌。
[0041] 在相关实施方案中，产甲烷古细菌可以是嗜温的、嗜热的或嗜超热的。示例性嗜温产甲烷菌包括如下属的一些种：甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、甲烷球菌属、甲烷粒菌属和甲烷八叠球菌属。示例性嗜热产甲烷菌包括如下属的一些种：甲烷盐菌属、甲烷鬃毛状菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷热球菌属。示例性嗜超热产甲烷菌包括如下属的一些种：甲烷热球菌属、甲烷火菌属、甲烷热菌属和甲烷炎菌属。
[0042] 产生甲硫氨酸的氢营养型微生物
[0043] 可以对本公开的氢营养型微生物进行遗传操作(即，经遗传工程改造)、重组修饰或其组合以敲除、减少、表达或过表达目标硫同化多肽，这导致可用于将H2/COx底物的各种成分转化(例如，利用、转化、同化、氧化、还原)为甲硫氨酸或含甲硫氨酸的供料的重组微生物。
[0044] 用于产生非天然氢营养型微生物的遗传操作或工程改造可以包括随机(例如，化学诱导的、自发的)或定点诱变(例如，一个或更多个基因靶标的定点诱变)、与一个或更多个基因靶标的表达相关的调节序列或位点的改变(例如，通过去除强的、弱的、可诱导的、可抑制的或多个启动子，或者通过用具有不同性质的启动子代替这样的启动子)、改变一个或更多个基因靶标的染色体位置、改变与一个或更多个基因靶标相邻的核酸序列(例如，核糖体结合位点或转录终止子)、减少或增加一个或更多个基因靶标的拷贝数、修饰参与一个或更多个基因靶标的转录或者一个或更多个基因产物的翻译的调节蛋白、阻遏蛋白、抑制子、增强子、转录激活子等或者使一个或更多个基因靶标的表达失调的任何其它方法(包括使用反义核酸分子、短干扰核酸分子或用于敲除或阻断靶蛋白表达的其它方法)。
[0045] 在某些实施方案中，遗传操作或工程改造包括一种或更多种自发突变(例如，化学、放射或其它诱变处理)，所述自发突变导致产生与亲本微生物相比更多的甲硫氨酸的非天然氢营养型微生物。这样的自发突变体可以例如通过将微生物置于特定的选择压力下来产生和鉴定，在所述选择压力下只有具有所需表型的突变体将生长(例如，在生长培养基中不存在特定的氨基酸或毒素，存在抗生素，不存在特定代谢物等)。
[0046] 在另一些实施方案中，可以改变编码甲硫氨酸生物合成酶的内源或外源核酸分子，例如具有相对于野生型变化的氨基酸序列。通过这些方法产生的每种变体多肽将保留至少50％的活性(优选100％或更多活性)，并具有与参考或亲本野生型多肽序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，变体多肽将相对于参考或亲本野生型酶在一个或更多个预定位置处包括至少一个氨基酸取代(例如，至少1、2、3、5、
6、7、8、9或10个或更多个或多至20、25或30个取代)或不超过特定数量的氨基酸取代(例如，不超过1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个取代)，前提是变体保留目标活性(例如、羧化酶、脱羧酶、脱氢酶、差向异构酶、激酶、裂解酶、还原酶、合酶)。
6、7、8、9或10个或更多个或多至20、25或30个取代)或不超过特定数量的氨基酸取代(例如，不超过1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个取代)，前提是变体保留目标活性(例如、羧化酶、脱羧酶、脱氢酶、差向异构酶、激酶、裂解酶、还原酶、合酶)。
[0047] 在某些方面，本公开涉及如下出乎意料的结果：由开放阅读框(ORF)MMP1359(GenBank No.NC_005791.1(1337240..1338781，互补序列))；NCBI基因ID：2762444，SEQ ID NO：1)、MMP1358(GenBank No.NC_005791.1(1336828..1337226，互补序列)、NCBI基因ID：2762433；SEQ ID NO：5)编码的硫同化酶或两者参与甲硫氨酸生物合成途径，并受到甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在一些实施方案中，硫同化酶MMP1359、MMP1358或两者来自氢营养型古细菌海沼甲烷球菌。在另一些实施方案中，本公开提供了编码对甲硫氨酸反馈抑制具有抗性的MMP1359的突变ORF(例如，SEQ ID NO：2)、编码对甲硫氨酸反馈抑制具有抗性的MMP1358的突变ORF(例如，SEQ ID NO：6)、或两者，两者导致当由宿主细胞表达时与表达亲本、野生型或参考多肽的宿主细胞相比增加的甲硫氨酸产生。总之，MMP1359和MMP1358多肽或其突变体、变体、同源物或直系同源物在本文中统称为“硫同化多肽”或“甲硫氨酸途径多肽”。
[0048] 在某些实施方案中，MMP1359、MMP1358或两者的同源物或直系同源物可以获自：蒂氏脱硫念珠菌(Desulfomonile tiedjei)、脂肪酸特异互养栖热菌(Syntrophothermus lipocalidus)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Syntrophmonas wolfei、纳汝戈热脱硫菌(Thermodesulfobium
narugense)、Ordoribacter splanchnicus、热泉热袍菌(Thermotoga thermarum)、美拉尼西亚栖热腔菌(Thermosipho melanesiensis)、Sphaerochaeta globosa或其任意组合。
narugense)、Ordoribacter splanchnicus、热泉热袍菌(Thermotoga thermarum)、美拉尼西亚栖热腔菌(Thermosipho melanesiensis)、Sphaerochaeta globosa或其任意组合。
[0049] 因此，本公开提供了这样的氢营养型微生物：其被内源地修饰以失调(例如，不再受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制)或重组表达或过表达(野生型或失调的)参与甲硫氨酸的生物合成的多肽，例如本文公开的失调的硫同化多肽(例如，MMP1359、MMP1358)。此外，本公开的氢营养型微生物可以进一步表达或过表达甲硫氨酸生物合成途径的其它酶，例如天冬氨酸激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶或其组合，其活性可以是内源的、外源的或两者。在某些实施方案中，具有失调或过表达的MMP1359和/或MMP1358和天冬氨酸激酶的氢营养型微生物可以任选地具有内源或重组地增加的高丝氨酸脱氢酶活性。在一些特定实施方案中，氢营养型微生物包含编码对甲硫氨酸反馈抑制具有抗性的突变的MMP1359的多核苷酸(例如SEQ ID NO：2)、编码对甲硫氨酸反馈抑制具有抗性的突变的MMP1358的多核苷酸(例如，SEQ ID NO：6)或两者，并且任选地包含编码甲硫氨酸合酶的异源多核苷酸。
[0050] 用于工程改造和鉴定反馈抗性突变体的方法在本领域中是已知的－例如，认为能够在有毒的氨基酸类似物(例如，赖氨酸类似物S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)或甲硫氨酸类似物DL-乙硫氨酸)的存在下生长的微生物对相应于有毒类似物的氨基酸具有反馈抗性(参见，例如Shiio等，Agric.Biol.Chem.54：3275,1990；Kumar和Gomes，Biotechnology Advances 23：41-61,2005)。
[0051] 本公开的多核苷酸可用于从其它生物体、特别是其它古细菌、更特别地其它产甲烷菌分离相应序列。以这种方式，可以采用诸如PCR、杂交等的方法来基于其序列与本文中给出的MMP1359或MMP1358核酸分子序列的同一性来鉴定这样的序列。本发明涵盖基于其与本文中给出的整个MMP1359或MMP1358 ORF或其变体或片段的序列同一性而分离的核酸分子。这样的序列包括作为所公开序列的同源物或直系同源物的序列。“直系同源物”意在表示衍生自共同祖先编码序列的编码序列，其作为物种形成的结果在不同物种中发现。当在不同物种中发现的编码序列的核苷酸序列或其编码蛋白质序列共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性时，认为其是直系同源物。直系同源物的功能通常在物种间高度保守。因此，本公开涵盖如下分离的多核苷酸，其编码具有硫同化活性或促进甲硫氨酸生物合成(并且任选地失调，例如抗一种或更多种化合物例如，甲硫氨酸或S-腺苷酰甲硫氨酸的反馈抑制)的多肽并在严格条件下与MMP1359或MMP1358 ORF或其变体或片段杂交。
[0052] 在细菌和古细菌的不同种中观察到了密码子使用偏好性的变化，这可能影响异源宿主中的重组蛋白表达(Sharp等，Nucl.Acids Res.33：1141,2005；Emery和Sharp，Biol.Lett.7：131,2011)。在某些实施方案中，如本文所述，核酸分子(例如，编码硫同化多肽或甲硫氨酸生物合成酶的核酸)可以在引入如本文所述的宿主细胞之前进行密码子优化以改善或最大化蛋白质表达。密码子优化是指在核酸分子水平的基因或编码区中密码子序列的改变，以反映宿主细胞更常见的密码子使用而不改变由密码子编码的氨基酸。此前已经描述了用于异源宿主中的基因表达的密码子优化方法(参见，例如Welch等，MethodsEnzymol.498：43，2011；Henry和Sharp，Mol.Biol.Evol.24：10,2007；美国专利公开No.2011/0111413)。
[0053] 在PCR方法中，寡核苷酸引物可以被设计用于PCR反应，以从提取自所感兴趣的任何微生物(例如，古细菌)的cDNA或基因组DNA扩增相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中通常是已知的，并且公开于Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。另参见Innis等编著(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编著(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand编著(1999)PCR Methods Manual (Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0054] 在杂交技术中，将已知多核苷酸的全部或部分用作选择性地与存在于所选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即，基因组或cDNA文库)群体中的其它相应多核苷酸杂交的探针。杂交探针可以基于基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用可检测的基团(例如，32P)或任何其它可检测标记进行标记。因此，例如，可以通过基于本文鉴定的MMP1359或MMP1358多核苷酸标记合成的寡核苷酸来制备用于杂交的探针。用于制备用于杂交的探针和用于构建cDNA和基因组文库的方法在本领域中通常是已知的，并在Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中公开。
[0055] 例如，本文公开的整个MMP1359或MMP1358多核苷酸或其一个或更多个部分可以用作能够与相应的ORF、cDNA或mRNA多核苷酸特异性地杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包括在MMP1359或MMP1358多核苷酸序列中独特的序列，并且最佳长度为至少约10个核苷酸，并且长度为最优选至少约20个核苷酸。这样的探针可用于通过PCR从所选微生物扩增相应的硫同化多核苷酸。该技术可用于从所需的微生物中分离另外的编码序列，以确定氢营养型微生物中编码序列的存在。杂交技术包括铺板DNA文库的杂交筛选(斑块或菌落；参见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
[0056] 这样的序列的杂交可以在严格的条件下进行。“严格的条件”或“严格的杂交条件”是探针将在与其它序列相比可检测地更高的程度(例如，相对于背景至少2倍)下与其靶序列杂交的预期条件。严格的条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针具有100％序列同一性的靶序列。可替代地，可以调整严格的条件以允许序列中的一些错配，使得可以检测到较低程度的相似性(例如，60％至99％的序列同一性)。
[0057] 在某些方面，本公开提供了非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物代谢H2/COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸，并且其中非天然氢营养型微生物表达包括失调的内源硫同化多肽在内的多肽。在一些实施方案中，硫同化多肽包含如SEQ ID NO：4或8中所给出的氨基酸序列。在其它实施方案中，硫同化多肽包含与SEQ ID NO：4或8包含至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，硫同化多肽包含由以下核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子与SEQ ID NO：2或6包含至少70％、
75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中编码的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，硫同化多肽包含由以下核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格条件下与SEQ ID NO：2或6的互补序列杂交，其中编码的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。
75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中编码的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，硫同化多肽包含由以下核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格条件下与SEQ ID NO：2或6的互补序列杂交，其中编码的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。
[0058] 在一些实施方案中，硫同化多肽由包含经工程改造的自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变MMP1359或其同系物或直向同源物编码。在其它实施方案中，硫同化多肽由包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变MMP1358或其同源物或直系同源物编码。在另一些实施方案中，硫同化多肽由包含经工程改造的自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变MMP1359或其同源物或直系同源物编码；以及由包含经工程改造自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变MMP1358或其同源物或直系同源物编码。
[0059] 在某些实施方案中，失调的内源或异源硫同化多肽是MMP1359突变体或其同源物或直系同源物，其对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在其它实施方案中，失调的内源或异源硫同化多肽是对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调的MMP1358突变体或其同源物或直系同源物。在进一步的实施方案中，失调的内源或异源硫同化多肽是对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调的MMP1359突变体或其同源物或直系同源物，以及对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调的MMP1358突变体或其同源物或直系同源物。
[0060] 当提及本公开的MMP1359突变体时，参考对应于海沼甲烷球菌S2(ATCC No.DSM14266)MMP1359蛋白(GenBank登录号NP_988479.1)的氨基酸位置的残基编号。示例性突变包括残基D439处的突变(例如，D439N取代)。当提及本公开的MMP1358突变体时，参考对应于海沼甲烷球菌S2(ATCC No.DSM14266)MMP1358蛋白(GenBank登录号NP_988478.1)的氨基酸位置的残基编号。示例性突变包括残基G114处的突变(例如，G114E取代)。
[0061] 如本文所述，天冬氨酸途径氨基酸(例如，甲硫氨酸)的生物合成中的第一个定向酶是天冬氨酸激酶，其可以受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈调节。例如，大肠杆菌具有三种天冬氨酸激酶同功酶－两种具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的双重功能，其被称为天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I(AK/HD-I；thrA)和天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II(AK/HD-II；metL)，另一种具有单独的天冬氨酸激酶活性，其被称为天冬氨酸激酶III(AK-III；lysC)。AK/HD-I受苏氨酸的反馈调节(以及由苏氨酸和亮氨酸表达的抑制)，而AK/HD-II仅受甲硫氨酸的反馈调节，并且AK-III仅受赖氨酸的反馈调节(参见Patte等，Biochim.Biophys.Acta 136：245，1967；Theze等.，J.Bacteriol.117：133,1974)。相比之下，谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶由赖氨酸和苏氨酸两者反馈抑制(Sano和Shiio，1970；Yoshida等，2007)。参与天冬氨酸途径氨基酸的生物合成的其它酶也受到反馈抑制，例如高丝氨酸O-乙酰基转移酶和高丝氨酸O-反式琥珀酰基转移酶。
[0062] 在一些实施方案中，本公开提供了表达失调的MMP1359、MMP1358或两者的非天然经遗传工程改造的氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物进一步表达或过表达失调的天冬氨酸激酶活性或甲硫氨酸合酶，并且其中非天然氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性是内源天冬氨酸激酶、外源天冬氨酸激酶或两者。在某些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性是对赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶突变体。在一些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性由包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的lysC突变基因编码。在某些实施方案中，内源或外源天冬氨酸激酶未失调，并且异源甲硫氨酸合酶(例如，MetE)过表达。
[0063] 在另一些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性由在苏氨酸结合位点、赖氨酸结合位点、赖氨酸和苏氨酸结合位点、除了赖氨酸或苏氨酸结合位点以外的位点或其任意组合处包含突变的突变lysC基因编码。在某些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性由在苏氨酸结合位点处包含突变的突变thrA基因编码。在其它实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性由在甲硫氨酸结合位点处包含突变的突变metL基因编码。
[0064] 当提及本公开的lysC反馈抗性突变体时，参考对应于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032LysC蛋白(GenBank登录号CAF 18822.1)的氨基酸位置的残基编号。示例性苏氨酸结合位点突变包括残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合。示例性赖氨酸结合位点突变包括残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合。
示例性赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处。在除赖氨酸和苏氨酸结合位点之外的位点处的示例性突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述突变中的任何一个或更多个可以包括在本公开的天冬氨酸激酶中，前提是天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
示例性赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处。在除赖氨酸和苏氨酸结合位点之外的位点处的示例性突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述突变中的任何一个或更多个可以包括在本公开的天冬氨酸激酶中，前提是天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
[0065] 为了使甲硫氨酸的生物合成有效发生，一定量的碳通量必须流过甲硫氨酸途径。促进或增强甲硫氨酸生产的一种方法是使进入到甲硫氨酸途径中的碳通量最大化，如本发明所提供。
[0066] 在某些方面，本公开提供了表达失调的MMP1359、MMP1358或两者的非天然氢营养型微生物，其中非天然氢营养型微生物具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性、增加的5-甲基四氢叶酸类咕啉/铁硫蛋白甲基转移酶活性、增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的天冬氨酸氨基转氨酶活性或其任意组合，并且其中非天然氢营养型微生物代谢H2/COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，表达失调的MMP1359、MMP1358或两者的非天然氢营养型微生物具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或两者。在某些其它实施方案中，表达失调的MMP1359、MMP1358或两者的非天然氢营养型微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰辅酶A合酶、增加的天冬氨酸转氨酶活性或其任意组合。
[0067] 在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽(例如，失调的MMP1359、MMP1358或两者)的非天然氢营养型微生物也具有失调的天冬氨酸激酶活性、降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或其任意组合。在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也具有失调的天冬氨酸激活活性、增加的5-甲基四氢叶酸类咕啉/铁硫蛋白甲基转移酶活性、增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰辅酶A合酶、增加的天冬氨酸转氨酶活性或其任意组合。在这些实施方案的每一个中，非天然氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
[0068] 如本文所述，数种生物合成的甲硫氨酸途径酶受到反馈调节(例如，MMP1359、MMP1358、天冬氨酸激酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶)，编码这些酶的一些基因受到抑制(例如，高丝氨酸脱氢酶)，或两者。因此，如本公开所提供的那样，可以通过减轻调节、抑制或两者来提高甲硫氨酸的产生。
[0069] 在另一些方面，本公开提供了非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物包含来自用于生物合成甲硫氨酸的一个或更多个途径的一种或更多种失调和/或去抑制的多肽，并且其中所述非天然氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，表达失调的MMP1359活性、MMP1358活性或两者的非天然氢营养型微生物还具有去抑制、失调或两者的天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶(例如，metB)或其任意组合。
[0070] 除了过量产生甲硫氨酸之外，还可为有利的是避免从微生物中提取或分离产生的甲硫氨酸。因此，本公开提供了用于在培养基中增强甲硫氨酸的生产方法，其中分离或纯化方法被简化。
[0071] 在另一些方面，本公开提供了表达失调的MMP1359、MMP1358或两者的非天然氢营养型微生物，其中所述非天然氢营养型微生物表达或过表达甲硫氨酸的输出者(exporter)，并且其中所述非天然经工程改造或重组的氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，非天然氢营养型微生物表达或过表达甲硫氨酸的输出者，例如与强表达控制序列(例如，nif或tet启动子)可操作地连接的谷氨酸棒杆菌的brnFE或metT(参见，Trotschel等，J.Bacteriol.187：3786-94,2005)。在其它实施方案中，非天然氢营养型微生物的甲硫氨酸的转运者/输入者(transporter/importer)被敲除或抑制。
[0073] 在另一些方面，本公开提供了非天然氢营养型微生物，其中非天然氢营养型微生物是一种或更多种天冬氨酸途径氨基酸的营养缺陷体，并且其中所述非天然氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，非天然氢营养型微生物是高丝氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体或两者。在某些其它实施方案中，非天然氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、异亮氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。在一些实施方案中，非天然氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体或两者。在某些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。
[0074] 在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也是一种或更多种天冬氨酸途径氨基酸的营养缺陷体。在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也是高丝氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体或其任意组合。在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也是赖氨酸营养缺陷体、异亮氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体或两者。在某些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。
[0075] 有时，简单地过表达作为甲硫氨酸途径一部分的一种或更多种生物合成酶在本公开的氢营养型微生物中是有用的。在另一些方面，本公开提供了一种非天然氢营养型微生物，其过表达来自用于生物合成甲硫氨酸的一个或更多个途径中的多肽，并且其中所述非天然氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
[0076] 在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也过表达来自用于生物合成甲硫氨酸的一个或更多个途径中的多肽。在某些另外的实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物也过表达高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶或两者；或者过表达高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者；或者过表达具有天冬氨酸激酶活性的多肽。
[0077] 用于在微生物生物体中表达外源或异源核酸的重组方法在本领域中是公知的。这样的方法可以在例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(2001)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)中找到描述。待表达的示例性外源蛋白质或酶包括参与甲硫氨酸生物合成的那些(例如，天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合)或者影响进入甲硫氨酸生物合成途径的碳通量的酶(例如，丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸合酶、乙酰辅酶A合酶、天冬氨酸转氨酶或其任意组合)。对编码酶的核酸分子或其功能性片段的遗传修饰可为从其天然状态被改变的重组细胞赋予生物化学或代谢能力。
[0078] 本公开的任意氢营养型微生物均可被转化为包含至少一种外源核酸，以向宿主提供新的或增强的活性(例如，酶活性)，或者可以被遗传修饰，以使用本领域已知的各种方法中的任何一种去除或基本上减弱内源基因功能。用于在氢营养型微生物(例如，产甲烷古细菌)中转运和表达异源核酸分子的遗传工具在本领域中是已知的(参见，例如，Rother等，Curr.Opin.Microbiol.8：745,2005；Leigh等，FEMS Microbiol.Rev.35：577,2011)。例如，工具可用于DNA递送(Dodsworth等，Appl.Environ.Microb.76：5644,2010；Metcalf等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94：2626,1997)、用于穿梭载体(Gardner和Whitman，Genetics 152：1439,1999；Metcalf等，1997)、用于异源基因的调控表达(Lie和Leigh，
J.Bacteriol.184：5301,2002；Chaban等，Mol.Microbiol.66：596,2007；Guss等，Archaea
2：193，2008)、以及用于敲入或敲除遗传改变(Moore和Leigh，J.Bacteriol.187：972,2005；
Pritchett等，Appl.Environ.Microb.70：1425,2004)。因此，可以使用用于在氢营养型微生物中失活、敲除或缺失内源基因功能的各种方法。
J.Bacteriol.184：5301,2002；Chaban等，Mol.Microbiol.66：596,2007；Guss等，Archaea
2：193，2008)、以及用于敲入或敲除遗传改变(Moore和Leigh，J.Bacteriol.187：972,2005；
Pritchett等，Appl.Environ.Microb.70：1425,2004)。因此，可以使用用于在氢营养型微生物中失活、敲除或缺失内源基因功能的各种方法。
[0079] 在某些实施方案中，启动子、密码子优化或两者可用于在宿主氢营养型微生物中编码氨基酸生物合成途径酶的外源核酸分子的高度组成型表达。还可以利用外源核酸分子在宿主氢营养型微生物(例如，产甲烷古细菌)中的受调节的表达。在某些实施方案中，可能期望编码氨基酸生物合成酶的外源核酸分子的受调节的表达，以优化非天然或重组的氢营养型微生物的生长速率。用于响应H2/COx底物的存在的编码氨基酸生物合成酶的核酸分子的受控表达可以基于可用的H2/COx底物的各种不同的来源或比例来改善生长。
[0080] 如本文所述，可以将多于一种的异源或外源核酸分子作为单独的核酸分子、作为多个单独受控的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单个核酸分子或其任意组合引入宿主细胞中。例如，如本文所公开的，任选地在H2的存在下代谢COx底物的微生物可以被修饰成表达两种或更多种异源或外源核酸分子，所述两种或更多种异源或外源核酸分子编码甲硫氨酸生物合成途径的所需酶(例如，天冬氨酰激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶)。当将两种或更多种外源核酸分子引入宿主H2/COx代谢微生物中时，可以理解的是，两种或更多种外源核酸分子可以作为单个核酸分子单独引入(例如，在单一载体上)、在分开的载体上、在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中。所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数量是指编码核酸分子的数量或蛋白质活性的数量，而不是引入宿主细胞中的单独的核酸分子的数量。
[0081] 例如，可以重组转化氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)以产生能够以与亲本微生物相比更高的水平将H2/COx底物(例如，H2与CO2、CO或两者)利用、转化或代谢成甲硫氨酸的多肽。在本文所述的任意实施方案中，可以重组转化氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)以产生能够任选地在H2的存在下利用、转化或代谢COx底物的多肽。
[0082] 在另一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子，并且如本文所述，所述非天然经改造的氢营养型微生物以与亲本氢营养型微生物相比更高的水平产生甲硫氨酸。在另一些实施方案中，来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶(例如，metB)、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。在一些特定实施方案中，第一外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者，其中高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者均任选地过表达、失调或两者。
[0083] 在某些其它实施方案中，外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者，其中高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者均任选地过表达、失调或两者都过表达。在其它实施方案中，第一外源核酸分子编码大肠杆菌ThrA(AK/HD-I)、大肠杆菌MetL(AK/HD-II)、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其组合，其中AK/HD-I、AK/HD-II、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或其组合任选地过表达、失调或两者都过表达。在一些特定实施方案中，大肠杆菌ThrA(AK/HD-I)是失调突变体，其中AK/HD-I在氨基酸位置G330、S345、S352和G433中的任意一个或更多个处突变。
[0084] 在一些实施方案中，表达失调的内源硫同化多肽的非天然经工程改造的氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子，并且还具有(a)一种或更多种被敲除或具有降低的活性的赖氨酸生物合成途径多肽；(b)被敲除或具有降低的活性的一种或更多种苏氨酸生物合成途径多肽；(c)被敲除或具有降低的活性的一种或更多种甘氨酸生物合成途径多肽；(d)一种或更多种甲硫氨酸降解途径多肽(例如，metK)，或(e)其任意组合。在某些实施方案中，编码二氢吡啶二羧酸合酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸脱水酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码降低的活性。
[0085] 在任意上述非天然经改造的氢营养型微生物中，外源核酸分子被整合到基因组中，或者外源核酸分子在自我复制载体中。另外，在任意上述非天然氢营养型微生物中，非天然氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。
[0086] 在某些方面，本公开提供了重组氢营养型微生物，其中所述重组氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸，并且其中所述重组氢营养型微生物表达或过表达包括外源硫同化多肽的多肽。在一些实施方案中，硫同化多肽包含如SEQ ID NO：3、4、7或8中任一个中给出的氨基酸序列。在其它实施方案中，硫同化多肽包含与SEQ ID NO：3、4、7或8中的任一个包含至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，硫同化多肽包含由与SEQ ID NO：1、2、5或6中的任一个包含至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，硫同化多肽包含由在严格条件下与SEQ ID NO：1、2、5或6中的任一个的互补序列杂交的核酸分子编码的氨基酸序列，其中编码的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。
[0087] 在一些实施方案中，硫同化多肽是包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变MMP1359或其同源物或直系同源物。在一些实施方案中，硫同化多肽是包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变MMP1358或其同源物或直系同源物。在某些实施方案中，硫同化多肽是针对一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调的MMP1359突变体或其同源物或直系同源物。在某些实施方案中，硫同化多肽是针对一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调的MMP1358突变体或其同源物或直系同源物。
[0088] 在一些实施方案中，重组氢营养型微生物还包含失调的内源硫同化多肽。在一些实施方案中，内源硫同化多肽包含SEQ ID NO:4和8中任一个所给出的氨基酸序列。在其它实施方案中，内源硫同化多肽包含与SEQ ID NO:4或8中的任一个包含至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，内源硫同化多肽包含由与SEQ ID NO:2或6中的任一个包含至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。在另一些实施方案中，内源硫同化多肽包含由在严格条件下与SEQ ID NO:2和6中的任一个的互补序列杂交的核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述多肽对于一种或更多种反馈抑制剂(例如，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)失调。
[0089] 在某些实施方案中，重组氢营养型微生物还包含失调的内源天冬氨酸激酶活性、编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的外源核酸分子或两者。
[0090] 在一些实施方案中，重组氢营养型微生物表达或过表达失调的内源天冬氨酸激酶活性，其中所述重组氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性是对赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶突变体。在其它实施方案中，失调的天冬氨酸激酶由包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变lysC基因编码。
[0091] 在另一些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性由在苏氨酸结合位点、赖氨酸结合位点、赖氨酸和苏氨酸结合位点、除了赖氨酸或苏氨酸结合位点以外的位点或其任意组合处包含突变的突变lysC基因编码。在某些实施方案中，失调的天冬氨酸激酶活性由在苏氨酸结合位点处包含突变的突变thrA基因编码。在其它实施方案中，失调的天冬氨酸激酶由在甲硫氨酸结合位点处包含突变的突变metL基因编码。
[0092] 当提及本公开的lysC反馈抗性突变体时，参考对应于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032LysC蛋白(GenBank登录号CAF 18822.1)的氨基酸位置的残基编号。示例性苏氨酸结合位点突变包括残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合。示例性赖氨酸结合位点突变包括残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合。
示例性赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处。在除赖氨酸和苏氨酸结合位点之外的位点处的示例性突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述突变中的任意一个或更多个可以包括在本公开的天冬氨酸激酶中，前提是天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
示例性赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处。在除赖氨酸和苏氨酸结合位点之外的位点处的示例性突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述突变中的任意一个或更多个可以包括在本公开的天冬氨酸激酶中，前提是天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
[0093] 在一些实施方案中，重组氢营养型微生物包含编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第二外源核酸分子，其中所述重组氢营养型微生物能够任选地在H2的存在下同化COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在一些实施方案中，第二外源核酸分子过表达具有天冬氨酸激酶活性的多肽，或者第二外源核酸分子编码失调的外源天冬氨酸激酶活性，例如对赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性的外源天冬氨酸激酶突变体。在一些实施方案中，失调的外源天冬氨酸激酶活性由突变的大肠杆菌天冬氨酸激酶基因(例如，突变的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I蛋白(GenBank登录号BAB96579.2))、突变的天冬酰胺激酶II-高丝氨酸脱氢酶II蛋白(GenBank登录号BAE77370.1)或突变的天冬氨酸激酶III蛋白(GenBank登录号BAE78026.1)编码。在一些特定实施方案中，通过在氨基酸位置G330、S345、S352和G433中的任意一个或更多个处突变的大肠杆菌天冬氨酸激酶ThrA蛋白(GenBank登录号BAB96579.2)或由在氨基酸位置T342处突变的突变大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC蛋白(GenBank登录号BAE78026.1)提供失调的外源天冬氨酸激酶活性。在其它实施方案中，失调的外源天冬氨酸激酶活性、内源天冬氨酸激酶活性或两者单独地由突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其任意组合编码，所述突变基因各自包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合。
[0094] 在另一些实施方案中，外源天冬氨酸激酶单独地由在苏氨酸结合位点、赖氨酸结合位点、赖氨酸和苏氨酸结合位点、不同于赖氨酸或苏氨酸结合位点的位点或其任意组合处包含突变的突变lysC基因编码。示例性苏氨酸结合位点突变包括残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合。示例性赖氨酸结合位点突变包括残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合。示例性赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处。在除赖氨酸和苏氨酸结合位点之外的位点处的示例性突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述突变中的任意一个或更多个可以包括在本公开的天冬氨酸激酶中，前提是天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
[0095] 在其它方面，本公开提供了重组氢营养型微生物，其包含编码具有丙酮酸激酶活性的多肽的外源核酸分子、编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的外源核酸分子、编码具有天冬氨酸转氨酶活性的多肽的外源核酸分子或其任意组合，任选地具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性，其中所述重组氢营养型微生物能够同化H2/COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，重组氢营养型微生物具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或两者。在某些其它实施方案中，重组氢营养型微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰辅酶A合酶、增加的天冬氨酸转氨酶活性或其任意组合。
[0096] 在另一些方面，本公开提供了一种重组氢营养型微生物，其包含编码甲硫氨酸的输出者的外源核酸分子，其中所述重组氢营养型微生物能够同化H2/COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，重组氢营养型微生物还包含编码甲硫氨酸的输出者、例如brnFE或metT输出者的外源核酸分子。在其它实施方案中，非天然氢营养型微生物的甲硫氨酸的转运者/输入者被敲除或抑制。
[0097] 在另一些方面，本公开提供了重组氢营养型微生物，其包含用于敲除一种或更多种天冬氨酸途径氨基酸的生物合成的遗传修饰，其中重组氢营养型微生物是一种或更多种天冬氨酸途径氨基酸的营养缺陷体，并且能够同化H2/COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，重组氢营养型微生物是高丝氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。在某些其它实施方案中，重组氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、异亮氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。在一些实施方案中，重组氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。
[0098] 在某些其它方面，本公开提供了重组氢营养型微生物，其包含编码来自用于生物合成甲硫氨酸的一种或更多种途径的多肽的一种或更多种外源核酸分子，其中所述一种或更多种经编码的多肽被过表达，并且所述重组氢营养型微生物能够任选地在H2的存在下同化COx底物，以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
[0099] 在某些实施方案中，天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或其任意组合被过表达；或者高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者均被过表达；或者具有天冬氨酸激酶活性的多肽被过表达。
[0100] 在另一些实施方案中，具有编码硫同化多肽的外源核酸分子的重组氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子，并且所述重组氢营养型微生物产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸，如本文所述。在另一些实施方案中，来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种经编码的多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-反式琥珀酰基转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶(例如，metB)、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。在一些特定实施方案中，第二外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者，其中高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者均任选地被过表达、可操作地连接至核酸表达控制序列、失调或其任意组合。
在某些其它实施方案中，外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者，其中高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者任选地被过表达、可操作地连接至核酸控制序列、失调或其任意组合。
在某些其它实施方案中，外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者，其中高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者任选地被过表达、可操作地连接至核酸控制序列、失调或其任意组合。
[0101] 在一些实施方案中，具有编码硫同化多肽的外源核酸分子的重组氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子，并且还具有(a)被敲除或具有降低的活性的一种或更多种赖氨酸生物合成途径多肽；(b)被敲除或具有降低的活性的一种或更多种苏氨酸生物合成途径多肽；(c)被敲除或具有降低的活性的一种或更多种甘氨酸生物合成途径多肽；或(d)其任意组合。在某些实施方案中，编码二氢吡啶二羧酸合酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码具有降低的活性的二氢吡啶二羧酸合酶突变体、高丝氨酸激酶突变体、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。
[0102] 在任意上述重组氢营养型微生物中，第一外源核酸分子被整合到基因组中，或者第一外源核酸分子在自我复制载体中。此外，在任意上述重组氢营养型微生物中，重组氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。
[0103] 在某些实施方案中，本文所述的氢营养型微生物可以被工程改造成表达或过量产生具有MMP1359活性或甲硫氨酸反馈抑制抗性MMP1359活性的突变硫同化多肽。在一些实施方案中，本文所述的氢营养型微生物可以被工程改造成表达或过量产生具有MMP1358活性或甲硫氨酸反馈抑制抗性MMP1358活性的突变硫同化多肽。在某些实施方案中，本文所述的氢营养型微生物可以被工程改造成表达或过量产生具有甲硫氨酸反馈抑制抗性MMP1359活性的突变硫同化多肽和具有甲硫氨酸反馈抑制抗性MMP1358活性的突变硫同化多肽。在任意上述实施方案中，经工程改造的氢营养型微生物还包含编码外源甲硫氨酸合酶活性的多核苷酸，其中与缺少外源甲硫氨酸合酶的亲本细胞相比，细胞过量产生甲硫氨酸合酶活性。
[0104] 例如，为了表达或过量产生具有对应于MMP1359的活性的硫同化多肽，可以将来自海沼甲烷球菌、乙酸甲烷八叠球菌、居烂泥甲烷胞菌、蒂氏脱硫念珠菌、脂肪酸特异互养栖热菌、伍氏醋酸杆菌、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Syntrophomonas wolfei、纳汝戈热脱硫菌、Ordoribacter splanchnicus或Sphaerochaeta globose的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中以及在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生与MMP1359或其功能性片段同源的多肽，其任选地被失调(即，对甲硫氨酸反馈抑制具有抗性)。在某些实施方案中，本文公开的组合物和方法的MMP1359多肽来自海沼甲烷球菌(NC_05791.1；MMP1359)、乙酸甲烷八叠球菌(NC_003552.1；ORF 1821)、居烂泥甲烷胞菌(NC 013665.1；ORF 0132)、蒂氏脱硫念珠菌(NC_018025.1；ORF
2525)、脂肪酸特异互养栖热菌(NC_014220.1；ORF0735)、伍氏醋酸杆菌(NC_016894.1；
ORFc28040)、Tepidanaerobacter acetatoxydans(NC_019954.2；ORF2794)、
Syntrophomonas wolfei(NC_008346.1；ORF1441)、纳汝戈热脱硫菌(NC_015499.1；ORF
0230)、Ordoribacter splanchnicus(NC_015160.1；ORF 3419)或Sphaerochaeta globose(NC_015152.1；ORF0032)。
2525)、脂肪酸特异互养栖热菌(NC_014220.1；ORF0735)、伍氏醋酸杆菌(NC_016894.1；
ORFc28040)、Tepidanaerobacter acetatoxydans(NC_019954.2；ORF2794)、
Syntrophomonas wolfei(NC_008346.1；ORF1441)、纳汝戈热脱硫菌(NC_015499.1；ORF
0230)、Ordoribacter splanchnicus(NC_015160.1；ORF 3419)或Sphaerochaeta globose(NC_015152.1；ORF0032)。
[0105] 在一些实施方案中，硫同化多肽氨基酸序列或其功能性片段基于来自海沼甲烷球菌S2的MMP1359氨基酸序列，并且与GenBank登录号NP_988479.1中给出的序列或其功能性片段具有至少75％、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的MMP1359具有针对宿主细胞进行了密码子优化或与GenBank登录号NP_988479.1中给出的序列相同的氨基酸序列。在特定实施方案中，MMP1359氨基酸序列是在氨基酸位置D439(例如，天冬酰胺)处突变的海沼甲烷球菌蛋白(GenBank登录号NP_988479.1)。
[0106] 例如，为了表达或过量产生具有与MMP1358相对应的活性的硫同化多肽，可以将来自海沼甲烷球菌、乙酸甲烷八叠球菌、居烂泥甲烷胞菌、蒂氏脱硫念珠菌、脂肪酸特异互养栖热菌、伍氏醋酸杆菌、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Syntrophomonas wolfei、纳汝戈热脱硫菌、Ordoribacter splanchnicus或Sphaerochaeta globose的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中以及在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生与MMP1358或其功能性片段同源的失调的多肽或其功能性片段。在某些实施方案中，本文公开的组合物和方法的硫同化多肽来自海沼甲烷球菌(NC_05791.1；MMP1358)、乙酸甲烷八叠球菌(NC_003552.1；ORF 1822)、居烂泥甲烷胞菌(NC_013665.1；ORF 0133)、蒂氏脱硫念珠菌(NC_018025.1；ORF 2526)、脂肪酸特异互养栖热菌(NC_014220.1；ORF0736)、伍氏醋酸杆菌(NC_016894.1；ORFc28030)、Tepidanaerobacter acetatoxydans(NC_019954.2；ORF2795)、Syntrophomonas wolfei(NC_008346.1；ORF1440)、纳汝戈热脱硫菌(NC_015499.1；ORF 0231)、Ordoribacter splanchnicus(NC_015160.1；ORF 3418)或Sphaerochaeta globose(NC_015152.1；
ORF0033)。
ORF0033)。
[0107] 在一些实施方案中，硫同化多肽氨基酸序列或其功能性片段基于来自海沼甲烷球菌S2的MMP1358氨基酸序列，并且与GenBank登录号NP_988478.1中给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的MMP1358具有针对宿主细胞进行了密码子优化或与GenBank登录号NP_988478.1中给出的序列相同的氨基酸序列。在特定实施方案中，MMP1358氨基酸序列是在氨基酸位置G114(例如，谷氨酸)处突变的海沼甲烷球菌蛋白(GenBank登录号NP_988478.1)。
[0108] 在一些实施方案中，硫同化多肽被表达或过表达，具有对应于MMP1359和MMP1358两者的活性。例如，可以将来自Termotogathermanrum或Termosipho melanesiensis的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中以及在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生与MMP1359和MMP1358同源的失调的多肽或其功能性片段。在某些实施方案中，本文公开的组合物和方法的硫同化多肽来自Termotoga thermanrum(NC_015707.1；ORF0529)或Termosipho melanesiensis(NC_009626.1；ORF0733)。
[0109] 在一些实施方案中，硫同化多肽氨基酸序列或其功能性片段基于来自Termotoga thermanrum或Termosipho melanesiensis的GenBank登录号NC_015707.1；ORF0529或NC_009626.1；ORF0733氨基酸序列，并且与GenBank登录号NC_015707.1；ORF0529或NC_
009626.1；ORF073中给出的序列具有至少75％、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的硫同化多肽具有针对宿主细胞进行了密码子优化或与GenBank登录号NC_015707.1；ORF0529或NC_009626.1；ORF073中给出的序列相同的氨基酸序列。
009626.1；ORF073中给出的序列具有至少75％、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的硫同化多肽具有针对宿主细胞进行了密码子优化或与GenBank登录号NC_015707.1；ORF0529或NC_009626.1；ORF073中给出的序列相同的氨基酸序列。
[0110] 在某些实施方案中，本文所述的营养型微生物可以被工程改造成表达或过量产生硫同化多肽，并且任选地被工程改造成也表达或过量产生天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)、天冬氨酰半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)、高丝氨酸O-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.31，高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶(例如，metA；EC 2.3.1.46)、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶(例如，metB；EC 2.5.1.48)、胱硫醚γ-合酶(EC 2.5.1.48)、胱硫醚β-裂解酶(EC 4.4.1.8)、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(EC 2.5.1.49)、高半胱氨酸S-甲基转移酶(EC 2.1.1.10)或其任意组合。
[0111] 例如，为了表达或过量产生天冬氨酸激酶，可以将来自大肠杆菌(thrA)、大肠杆菌(metL)、大肠杆菌(lysC)、谷氨酸棒杆菌(lysC)或海沼甲烷球菌(lysC)的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中和在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源天冬氨酸激酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的天冬氨酸激酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAF18822.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号CAF30573.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00291.1)、瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47522.1)、大肠杆菌K-12亚株W3110thrA(GenBank登录号BAB96579.2)；大肠杆菌K-12亚株W3110metL(GenBank登录号BAE77370.1)；大肠杆菌K-12亚株W3110lysC(GenBank登录号BAE78026.1)。
[0112] 在一些实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列或其功能性片段基于来自大肠杆菌K-12亚株W3110的thrA、metL或lysC氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号BAB96579.2、BAE77370.1或BAE78026.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的天冬氨酸激酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化或与Genbank登录号BAB96579.2、BAE77370.1或BAE78026.1中所给出的序列相同、或包含这些天冬氨酸激酶的共有序列或包含多种已知的天冬氨酸激酶多肽的共有序列。在特定实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列是在氨基酸位置G330、S345、S352和G433(例如，天冬氨酸、苯丙氨酸或精氨酸)中的任意一个或更多个处突变的大肠杆菌ThrA蛋白(GenBank登录号BAB96579.2)，或者是在氨基酸位置T342(例如，异亮氨酸)处突变的大肠杆菌LysC蛋白(GenBank登录号BAE78026.1)。
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的天冬氨酸激酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化或与Genbank登录号BAB96579.2、BAE77370.1或BAE78026.1中所给出的序列相同、或包含这些天冬氨酸激酶的共有序列或包含多种已知的天冬氨酸激酶多肽的共有序列。在特定实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列是在氨基酸位置G330、S345、S352和G433(例如，天冬氨酸、苯丙氨酸或精氨酸)中的任意一个或更多个处突变的大肠杆菌ThrA蛋白(GenBank登录号BAB96579.2)，或者是在氨基酸位置T342(例如，异亮氨酸)处突变的大肠杆菌LysC蛋白(GenBank登录号BAE78026.1)。
[0113] 在某些实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号CAF18822.1或CAF30573.1中给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的天冬氨酸激酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化或与Genbank登录号CAF18822.1、CAF30573.1、AFD00291.1或ADC47522.1中给出的序列相同，或者包含这些氨基酸激酶的共有序列或者包含多个已知天冬氨酸激酶多肽的共有序列。
[0114] 例如，为了表达或过量产生天冬氨酰半醛脱氢酶，可以将来自谷氨酸棒杆菌(asd)或大肠杆菌K12(asd)的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中并在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源天冬氨酰半醛脱氢酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的天冬氨酰半醛脱氢酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAA40504.1)或大肠杆菌K12(Genbank登录号CAA23511.1)。
[0115] 在某些实施方案中，天冬氨酰半醛脱氢酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或大肠杆菌K12的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号CAA40504.1或CAA23511.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的天冬氨酰半醛脱氢酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化或与Genbank登录号CAA40504.1或CAA23511.1中所给出的序列相同、或者包含这些天冬氨酰半醛脱氢酶的共有序列或者包含多个已知的天冬氨酰半醛脱氢酶多肽的共有序列。
[0116] 例如，为了表达或过量产生高丝氨酸脱氢酶，可以将来自谷氨酸棒杆菌(hom)或海沼甲烷球菌(hom)的一个或更多个基因引入氢氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中并在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源高丝氨酸脱氢酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的高丝氨酸脱氢酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号：BAB98576.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号：CAF31258.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00624.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC46990.1)。
[0117] 在某些实施方案中，高丝氨酸脱氢酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号BAB98576.1或CAF31258.1或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的高丝氨酸脱氢酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化或与Genbank登录号BAB98576.1、CAF31258.1、AFD00624.1或ADC46990.1中所给出的序列相同或包含这些高丝氨酸脱氢酶的共有序列或包含多个已知高丝氨酸脱氢酶多肽的共有序列。
[0118] 例如，为了表达或过量产生高丝氨酸O-乙酰基转移酶，可以将来自谷氨酸棒杆菌(metX)或热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus，metX)的一个或更多个基因引入氢氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中并在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源高丝氨酸O-乙酰基转移酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号AAC06035.1)或热自养甲烷热杆菌ATCC 29096(Genbank登录号AAB86286.1)。
[0119] 在某些实施方案中，高丝氨酸O-乙酰基转移酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或热自养甲烷热杆菌的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号AAC06035.1或AAB86286.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的高丝氨酸O-乙酰基转移酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化、或者与Genbank登录号AAC06035.1或AAB86286.1中所给出的序列相同、或者包含这些高丝氨酸O-乙酰基转移酶的共有序列或者包含多个已知高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的共有序列。
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的高丝氨酸O-乙酰基转移酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化、或者与Genbank登录号AAC06035.1或AAB86286.1中所给出的序列相同、或者包含这些高丝氨酸O-乙酰基转移酶的共有序列或者包含多个已知高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的共有序列。
[0120] 例如，为了表达或过量产生高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶，可以将来自大肠杆菌(metA)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,metA)的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中并在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶多肽来自大肠杆菌菌株K12(Genbank登录号CAA32654.1)或空肠弯曲杆菌菌株NCTC 11168(Genbank登录号
NO.CAL35820.1)。
NO.CAL35820.1)。
[0121] 在某些实施方案中，高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号BAB98576.1或CAF31258.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化、或者与Genbank登录号BAB98576.1、CAF31258.1、AFD00624.1或ADC46990.1中所给出的序列相同、或者包含这些高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的共有序列或者包含多个已知高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶多肽的共有序列。
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化、或者与Genbank登录号BAB98576.1、CAF31258.1、AFD00624.1或ADC46990.1中所给出的序列相同、或者包含这些高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的共有序列或者包含多个已知高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶多肽的共有序列。
[0122] 例如，为了表达或过量产生O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶，可以将来自大肠杆菌(metB)或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,metB)的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中并在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶多肽来自大肠杆菌菌株K12(Genbank登录号AAA24167.1)或幽门螺杆菌菌株ATCC 700392(Genbank登录号AAD07176.1)。
[0123] 在某些实施方案中，O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶氨基酸序列或其功能性片段基于大肠杆菌或幽门螺杆菌的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号AAA24167.1或AAD07176.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化、或者与Genbank登录号AAA24167.1或AAD07176.1中所给出的序列相同、或者包含这些O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶的共有序列或者包含多个已知O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶多肽的共有序列。
[0124] 例如，为了表达或过量产生胱硫醚β-裂解酶，可以将来自谷氨酸棒杆菌(metC)或大肠杆菌(metC)的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中并在氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)中表达或过表达，从而产生或过量产生外源外源胱硫醚β-裂解酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的胱硫醚β-裂解酶多肽来自谷氨酸棒杆菌(Genbank登录号AAK69425.1)或大肠杆菌(Genbank登录号AAA24158.1)。
[0125] 在某些实施方案中，胱硫醚β-裂解酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号AAK69425.1或AAA24158.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的胱硫醚β-裂解酶具有如下氨基酸序列：针对宿主细胞进行了密码子优化、或者与Genbank登录号AAK69425.1或AAA24158.1中所给出的序列相同，或者包含这些胱硫醚β-裂解酶的共有序列或者包含多个已知的胱硫醚β-裂解酶多肽的共有序列。
[0126] 在某些实施方案中，氢营养型微生物可以直接将硫源(例如H2S)整合到甲硫氨酸生物合成途径中。由氢营养型微生物产生或存在供氢营养型微生物使用的任何硫化物都可以进入高半胱氨酸生物合成途径，其中O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶将H2S并入O-乙酰高丝氨酸以产生高半胱氨酸，高半胱氨酸可通过甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)进一步转化为甲硫氨酸。
[0127] 例如，本文所述的氢营养型微生物可以被工程改造成表达或过量产生O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(EC 2.5.1.49)，所述酶可以将H2S并入入O-乙酰高丝氨酸中以产生高半胱氨酸，并且任选地被工程改造成表达或过量产生钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶(EC 2.1.1.13)或钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶(也称为高半胱氨酸甲基转移酶)
(EC2.1.1.14)，以将高半胱氨酸转化为甲硫氨酸。
(EC2.1.1.14)，以将高半胱氨酸转化为甲硫氨酸。
[0128] 为了表达或过量产生O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，可以将基于来自Methanocella conradii或瘤胃甲烷短杆菌的那些的一个或更多个基因引入本公开的氢营养型微生物(例如，非天然或重组产甲烷菌)中并在其中表达或过表达，从而产生或过量产生外源O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶可以来自Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00350.1)、瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47419.1或
ADC46998.1)、艰难梭菌(Clostridium difficile)T19(Genbank登录号编号ERM48664.1)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A菌株ATCC 3502(Genbank登录号CAL83417.1)、迈氏钩端螺旋体(Leptospira meyeri)(Genbank登录号P94890.1)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroide)2.4.1(Genbank登录号YP_351901.2)。
ADC46998.1)、艰难梭菌(Clostridium difficile)T19(Genbank登录号编号ERM48664.1)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A菌株ATCC 3502(Genbank登录号CAL83417.1)、迈氏钩端螺旋体(Leptospira meyeri)(Genbank登录号P94890.1)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroide)2.4.1(Genbank登录号YP_351901.2)。
[0129] 在某些实施方案中，O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶氨基酸序列或其功能性片段基于Methanocella conradii HZ254或瘤胃甲烷短杆菌M1的氨基酸序列并且与Genbank登录号AFD00350.1或ADC47419.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化，或者与Genbank登录号AFD00350.1、ADC47419.1、ADC46998.1、CCL83415.1或CAL83417.1中给出的序列相同，或者包含这些O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的共有序列或者包含多个已知的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的共有序列。
97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化，或者与Genbank登录号AFD00350.1、ADC47419.1、ADC46998.1、CCL83415.1或CAL83417.1中给出的序列相同，或者包含这些O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的共有序列或者包含多个已知的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的共有序列。
[0130] 在任意上述O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶中，非天然或重组的氢营养型微生物被进一步工程改造成表达、过表达或过量产生如本文所述的高丝氨酸O-乙酰基转移酶。
[0131] 在另一些实施方案中，如本文所述的氢营养型微生物可以被工程改造成表达或过量产生钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶(EC 2.1.1.13)或钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶(也称为高半胱氨酸甲基转移酶)(EC 2.1.1.14)，并且任选地被工程改造成也可以表达或过量产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
[0132] 例如，为了表达或过量产生钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶，可以将来自大肠杆菌(metH)、谷氨酸棒杆菌(MetH)或艰难梭菌的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，非天然嗜甲烷细菌)并在其中表达或过表达，从而产生或过量产生外源钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶多肽来自大肠杆菌K-12亚株MG1655(Genbank登录号AAC76832.1)、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号BAB98900.1)、艰难梭菌F665(Genbank登录号ERM51559.1)或恶臭假单胞菌(Psuedomonas putida)GB-1(Genbank登录号ABY97885.1)。
[0133] 在某些实施方案中，钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶氨基酸序列或其功能性片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的氨基酸序列，并且与Genbank登录号BAB98900.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶具有如下氨基酸序列：针对宿主细胞进行了密码子优化，或与Genbank登录号No.AAC76832.1、
BAB98900.1、ERM51559.1或ABY97885.1中所给出的序列相同，或者包含这些钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的共有序列或者包含多种已知的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶多肽的共有序列。
BAB98900.1、ERM51559.1或ABY97885.1中所给出的序列相同，或者包含这些钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的共有序列或者包含多种已知的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶多肽的共有序列。
[0134] 在其它实施方案中，例如，为了表达或过量产生甲硫氨酸合酶，可以将来自大肠杆菌(metE或metB 12)、谷氨酸棒杆菌(MetE)或海沼甲烷球菌(metE))的一个或更多个基因引入氢营养型微生物(例如，非天然或重组的产甲烷菌)中并在其中表达或过表达，从而产生或过量产生外源钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶或其功能性片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶多肽来自大肠杆菌K-12亚株MG1655(Genbank登录号AAC76832.1)、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAF19845.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号NP_987521.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00421.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47470.1)。
[0135] 在某些实施方案中，钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶氨基酸序列或其功能性片段基于海沼甲烷球菌S2或瘤胃甲烷短杆菌M1的氨基酸序列，并且分别与Genbank登录号NP_987521.1或ADC47470.1中所给出的序列或其功能性片段具有至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、或至少99％的同一性。在其它实施方案中，重组编码的钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶具有如下氨基酸序列：其针对宿主细胞进行了密码子优化，或者与Genbank登录号AAC76832.1、CAF 19845.1、NP_987521.1，AFD00421.1或ADC47470.1中所给出的序列相同，或者包含这些钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶的共有序列，或者包含多种已知的钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶多肽的共有序列。
[0136] 在任意上述甲基转移酶实施方案中，如本文所述，非天然或重组的氢营养型微生物进一步被工程改造成表达、过表达或过量产生O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
[0137] 在任意上述非天然或重组的氢营养型微生物实施方案中，本公开提供了作为产甲烷古细菌的氢营养型微生物，例如甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、产甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷拟球菌属、甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷热杆菌属、甲烷热球菌属、甲烷热菌属、或甲烷炎菌属。
[0138] 在任意上述非天然或重组的氢营养型微生物实施方案中，本公开提供了作为特定产甲烷古细菌种的氢营养型微生物。示例性产甲烷古细菌种例如嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、德氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、伊氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆、抗酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、伍氏甲烷短杆菌、沃氏甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、居烂泥甲烷胞菌、马堡甲烷热杆菌、热自养甲烷热杆菌、热弯曲甲烷热杆菌、嗜热甲烷热杆菌、沃氏甲烷热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、筑后甲烷袋状菌、海底甲烷袋状菌、低温产甲烷菌、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌、居蟑螂甲烷微球菌、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌、乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、运动甲烷微菌、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、热自养甲烷热球菌、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌、沸泉甲烷热球菌、印度洋甲烷热球菌、热液口甲烷热球菌、詹氏甲烷热球菌以及火神甲烷热球菌。
[0139] 在任意前述非天然或重组的氢营养型微生物实施方案中，本公开提供了氢营养型微生物，其包括产生细胞色素或不产生细胞色素的产甲烷古细菌。不产生细胞色素的示例性产甲烷古细菌包括海沼甲烷球菌或万氏甲烷球菌。产生细胞色素的示例性产甲烷球菌是巴氏甲烷八叠球菌或马氏甲烷八叠球菌。
[0140] H2/COx底物
[0141] 氢产生涉及一系列重整、调节和分离步骤，其中这些步骤中的数个(例如，蒸汽重整、自热重整、高温漂移、低温漂移、CO2洗涤和压力回转吸收)可以提供原料，该原料本身或与一种或更多种其它气流的组合可以提供H2/COx底物，该H2/COx底物可用作氢营养型微生物和本公开的方法的原料。在某些实施方案中，本公开的微生物可以任选地在H2的存在下利用COx底物。
[0142] 作为背景，氢产生可涉及与高温水气变换(HTS)反应、低温水气变换(LTS)反应、或两者相结合的单步骤或多步骤重整、部分氧化或气化，以产生H2/COx底物例如合成气。在一些方法中，通过使用分子筛采用压力回转吸附(PSA)来除去碳氧化物，这将基本上纯的氢(H2)气流与包含一些残余H2气体与各种量的二氧化碳(CO2)、一氧化碳(CO)和甲烷(CH4)的尾气分离。在某些实施方案中，可以任选地在将气体(例如，合成气)经受PSA之前任选地洗涤掉二氧化碳。根据所使用的合成气产生过程和二氧化碳是否被洗涤，尾气将包括不同比例的H2、CO2、CO和CH4。在一些实施方案中，用于本公开的方法的H2/COx底物是包含PSA尾气和H2气体的混合物的气流掺和物。
[0143] 例如，与HTS组合的甲烷蒸汽重整将产生具有大部分H2(约75％)和CO2(约20％)和一些CH4(约5％)以及非常少或不含CO的气流。在另一个实例中，与LTS组合的甲烷蒸汽重整将产生具有大部分H2(约75％)和CO(约10％))和一些CO2(约5％)及CH4(约1％)的气流。在另一个实例中，与HTS和PSA组合的甲烷蒸汽重整将产生具有大部分H2(约30％)和CO2(约45％)和相当量的CO(约10％)及CH4(约15％)的尾气。在最后一个实施方案中，如果包括CO2洗涤步骤，则尾气将包含大部分H2(约50％)、CH4(约30％)和CO(约20％))、少量的CO2(约1％)。在某些实施方案中，将PSA尾气与由PSA产生的管道H2混合以产生目标H2/COx底物，例如具有约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的H2:CO2比例的H2/COx底物。
[0144] 甲烷的蒸汽重整可以提供范围分别为约1:7至约1:15的CO2与H2的原料比，其中其它组分可包括CO、CH4和H2O。可替代地，甲烷可以用CO2重整，这被称为干重整。甲烷的干重整可提供范围分别为约1:5至约1:15的CO2与H2的原料比，其中其它组分可包括CO、CH4和H2O。
[0145] 部分氧化(催化或非催化)和自热重整使用氧作为天然气代替水的共反应物。部分氧化和自热重整可以提供约1:20的CO2与H2的原料比，其中其它组分可以包括CO、CH4和H2O。
[0146] 气化，即含空气或氧的含碳物质(例如，天然气液体、石脑油、沥青、煤、生物质等)的部分氧化可以提供用于本公开的氢营养型微生物及方法的H2/COx原料。例如，煤的气化提供范围分别为约1:1.1至约1:11的CO2与H2的原料比，其中其它组分可包括CO、CH4、N2和H2O。
[0147] 氨合成涉及一系列重整和调节步骤，其中这些步骤中的四步(蒸汽重整、自热重整、高温变换、低温变换)可以提供用于本公开的氢营养型微生物和方法的H2/COx原料。对于这些不同工艺中的每一种，分别提供了范围分别为约1:3至约1:10的CO2与H2的原料比，其中其它组分可包括CO、CH4、N2和H2O。
[0148] 甲醇合成涉及低温重整、蒸汽重整和自热重整步骤，所有这些步骤都可以提供用于本公开的氢营养型微生物和方法的H2/COx原料。对于这三种工艺中的每一种，产生了范围分别为约1:7至约1:12的CO2与H2的原料比，其中其它组分可包括CO、CH4和H2O。
[0149] 一体化钢铁厂结合了各种工艺，包括焦炉(以由煤制造焦炭)、高炉(以制造生铁)和氧炉(以制造钢)。在某些实施方案中，一体化钢铁厂的直接还原使用经重整的天然气作为还原剂(代替焦炭)来制造生铁。这些炉中的每一个以及直接还原重整(其产生顶部气体)可以产生范围分别为约8:1(来自鼓风或氧炉)至约1:32(来自焦炉)的CO2与H2的原料比，其中其它组分可以包括CO、CH4、C2H6、C3H8、N2和H2O。
[0150] 在任意上述H2/COx底物源中，如此生产的H2/COx原料可以混合任何其它产生的H2/COx原料，或与H2、CO2、CO或其任意组合混合以产生目标H2/COx底物，例如具有约4:1或3:1的H2:CO2比例的底物。在某些实施方案中，用于例如产甲烷菌的H2/COx底物包含约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的H2:CO2比例，并且任选地，CO的总量不超过约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、
0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、
8.0％、9.0％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或20％。在其它实施方案中，用于例如梭菌属的H2/COx底物包含约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的H2：(CO2+CO)比例，并且任选地，CO的总量为至少约1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在这些实施方案中的任意一个中，H2/COx底物可包含PSA尾气与H2气体的混合物。
0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、
8.0％、9.0％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或20％。在其它实施方案中，用于例如梭菌属的H2/COx底物包含约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的H2：(CO2+CO)比例，并且任选地，CO的总量为至少约1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在这些实施方案中的任意一个中，H2/COx底物可包含PSA尾气与H2气体的混合物。
[0151] 在任意上述非天然或重组氢营养型微生物实施方案中，本公开提供了利用、代谢、氧化或转化由H2与CO2或CO或两者以及任选的各种如本文所述的其它组分构成的H2/COx底物的氢营养型微生物。在某些实施方案中，H2/COx底物是H2、CO2和CO和任选地与本文所述的各种其它组分，其中CO比CO2多。在另一些实施方案中，H2/COx底物是H2、CO2和CO和任选的如本文所述的各种其它组分，其中CO2比CO多。在另一些实施方案中，H2/COx底物是H2、CO2和CO和任选的如本文所述的各种其它组分，其中CO比CO2和H2两者都多。在某些情况下，代谢H2/COx的微生物可以使用H2作为能量来源，并且使用COx作为碳源(其中x为1或)2，或者使用H2和COx作为能量源，并且使用COx作为碳源。
[0152] 在任意上述非天然或重组的氢营养型微生物实施方案中，本公开提供了可以通过例如以下产生的H2/COx底物：通过蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化天然气或液烃(例如，乙烷、丙烷、石脑油)、在氢气生产中、在氨合成中、在甲醇合成中、通过炼钢或通过煤、石脑油、渣油、生物质或废物的气化。在某些实施方案中，通过任意上述重整方法产生的H2/COx底物可进一步通过水气变换反应进行调节。另外，可以将通过任意上述方法产生的一种或更多种气流与氢、一氧化碳或二氧化碳源的其它来源掺和以产生或制备包括以下的H2/COx底物：管道氢、管道二氧化碳、二氧化碳洗涤器废气、烟气、乙烷裂化器废气、重整器废气或氯合成废气。在一些实施方案中，CO2与H2的原料比例范围分别为约1:50至约10:1。在另一些实施方案中，CO2与H2的原料比例范围分别为约1:3至约1:5。
[0153] 培养方法
[0154] 各种培养方法可以用于本文所述的非天然或重组的氢营养型微生物(例如细菌、产甲烷古细菌)。例如，可以通过分批培养或连续培养方法来使氢营养型微生物生长。在某些实施方案中，在受控的培养单元中使培养物生长，所述受控的培养单元例如发酵器、生物反应器、中空纤维膜生物反应器、鼓泡塔生物反应器、滴流床生物反应器等。
[0155] 经典的分批培养方法是封闭系统，在该封闭系统中，培养基的组成在培养开始时设置，并且在培养过程中不受外部改变。因此，在培养过程开始时，用所需的氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)接种培养基，并且使得发生生长或代谢活动，而不向系统添加任何物质。通常，“分批”培养是就添加碳源、气体原料和培养基组分而言的分批，其中允许废气排出，并且经常在控制其它因素例如pH的情况下进行尝试。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断变化直到培养终止时。在分批培养物中，细胞温和地通过静态滞后期到高生长对数期并且最后到达生长速率降低或停止的稳定期。如果未经处理，处于稳定期的细胞将最终死亡。处于对数生长期的细胞通常负责一些系统中的终产物或中间体的批量生产。在其它系统中可以获得稳定期或指数期后生产。
[0156] 补料分批系统是标准分批系统的变化形式。补料分批培养方法包括分批系统，其中修改是随着培养进程，底物和可能的培养基组分以增量增加。当分解代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢以及在培养基中需要有限量的底物时，补料分批系统是有用的。在气体底物发酵中，系统相对于气体底物是连续的(因为可以除去废气)，并且补料分批相对于液体(培养基)是连续的。分批和补料分批培养方法在本领域中是常见和已知的(参见，例如Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA；Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36：227,1992)。
[0157] 连续培养是“开放”系统，其中将限定的培养基连续地添加到生物反应器中，并同时除去等量的条件培养基(具有或不具有生物质或细胞保留)以供进行处理。连续培养物通常将细胞保持在恒定的高液相密度，其中细胞主要处于对数生长期。可替代地，连续培养可以涉及生物质、细胞保留或细胞固定，其中连续添加原料和营养物质，并且可以从细胞团块中连续除去有价值的产物、副产物和废物。细胞保留可以通过多种方法进行，例如通过过滤、离心或沉降。细胞固定可以使用由天然和/或合成材料构成的广泛范围的固体支持物进行。
[0158] 连续或半连续培养使得能够调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任何数量的因素。例如，一种方法可以以固定的速率维持有限的营养物质(例如，碳源、氮水平、氢水平、磷水平)并且使得能够调节所有其它参数。在其它系统中，可以连续改变影响生长的许多因素，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。在某些实施方案中，限制氢营养型生物质的生长以增加产物与生物质的比例。用于调节连续培养过程的营养物质和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在本领域中是公知的(参见Brock，1989)。
[0159] 液相生物反应器(例如，搅拌釜、填充床、一个液相、两个液相、中空纤维膜)在本领域中是公知的，并且可用于氢营养型微生物的生长。
[0160] 多相生物反应器可在本公开的方法中使用(例如，鼓泡塔反应器、滴流床反应器(固定或填充床)、流化床反应器)。鼓泡塔是鼓泡形式的气体与液体在其中接触的装置。滴流床反应器使用气体和液体的并流或逆流来使培养物生长。流化床反应器包括使流体(气体或液体)以足够高的速度流过颗粒状固体材料以悬浮固体并使其表现得像流体一样。多相生物反应器的一个目的是混合液相和气相，其中根据质量转移(mass transfer)和化学反应的强度，氢营养型微生物以更大或更小的程度消耗气体。各种类型的多相生物反应器在本领域中是公知的，并且可用于本公开的方法中的氢营养型微生物的生长。
[0161] 本公开描述的氢营养型微生物可以作为分离的纯培养物与可能有助于生长的异源非氢营养型微生物一起生长，或者与一种或更多种不同的氢营养型微生物的菌株或种组合以产生混合的培养物。
[0162] 在其它方面，本公开提供了一种用于产生甲硫氨酸或含有甲硫氨酸的饲料添加剂的方法，该方法包括将任意上述非天然或重组的氢营养型微生物培养足以产生甲硫氨酸的一段时间，其中所述非天然或重组的氢营养型微生物：(a)表达与亲本氢营养型微生物相比具有增加的活性的一种或更多种硫同化多肽；(b)过表达一种或更多种硫同化多肽；或(c)包括一种或更多种硫同化多肽的改变的调节，其中所述非天然氢营养型微生物产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸。
[0163] 在某些实施方案中，本公开提供了一种用于制备甲硫氨酸或含甲硫氨酸的饲料添加剂的方法，该方法包括在H2/COx底物的存在条件下培养本公开的重组的、分泌甲硫氨酸的氢营养型微生物足以使编码来自硫同化多肽的多肽的外源多核苷酸表达的一段时间，其中产生甲硫氨酸并且甲硫氨酸以与由亲本氢营养型微生物产生的甲硫氨酸相比更高的水平在培养基中积累。
[0164] 在任意上述方法中，可以在发酵罐或生物反应器例如液相、鼓泡塔或滴流床生物反应器中培养氢营养型微生物。
[0165] 在如本文所公开的使用非天然或重组的氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)产生甲硫氨酸的任意上述方法中，气体原料是H2/COx底物，其中原料包含H2与CO2或CO或两者以及任选地如本文所述的各种其它组分。在某些实施方案中，H2/COx底物是合成气，例如通过以下方式产生的合成气：蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化天然气或液烃、通过水气变换反应调节、通过氨合成、通过甲醇合成、通过炼钢、或通过煤、生物质或废物的气化。
[0166] 在如本文所公开的使用非天然或重组的氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)产生甲硫氨酸的任意前述方法中，气体底物是H2/COx底物，其可以例如通过以下方式产生：蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化天然气或液烃(例如，乙烷、丙烷、石脑油)、通过水气变换反应调节、在氢产生中、在氨合成中、在甲醇合成中、通过炼钢、或通过煤、生物质或废物的气化。在某些实施方案中，H2/COx底物是如此产生的任何气流与氢、二氧化碳、一氧化碳或其任意组合的一种或更多种其它来源的掺和物，包括管道氢、管道二氧化碳、二氧化碳洗涤废气、烟气、乙烷裂解物废气、重整器废气、氯合成废气或其任意组合。
[0167] 在如本文所公开的使用非天然或重组的氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)产生甲硫氨酸的任意上述方法中，培养的氢营养型微生物是产甲烷古细菌，例如甲烷杆菌属、甲烷短杆菌、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、产甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷拟球菌属、甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷热杆菌属、甲烷热球菌属、甲烷热菌属、或甲烷炎菌属。
[0168] 在某些实施方案中，非天然的或重组的氢营养型微生物可以是嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、德氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、伊氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆、抗酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、伍氏甲烷短杆菌、沃氏甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、居烂泥甲烷胞菌、马堡甲烷热杆菌、热自养甲烷热杆菌、热弯曲甲烷热杆菌、嗜热甲烷热杆菌、沃氏甲烷热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、筑后甲烷袋状菌、海底甲烷袋状菌、低温产甲烷菌、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌、居蟑螂甲烷微球菌、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌、乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、运动甲烷微菌、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、热自养甲烷热球菌、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌、沸泉甲烷热球菌、印度洋甲烷热球菌、热液口甲烷热球菌、詹氏甲烷热球菌以及火神甲烷热球菌。
[0169] 在任意上述方法中，氢营养型微生物是嗜温的、嗜热的、嗜超热的或其组合。在任意上述方法中，氢营养型微生物是专性厌氧菌或兼性厌氧菌。在任意上述方法中，氢营养型微生物是专性氢营养体或兼性氢营养体。
[0170] 可以将氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)工程改造成在相同的培养条件(例如，血清管或生物反应器)、任选地在H2的存在下、在COx底物的存在下培养时产生与亲本微生物相比增强的水平的甲硫氨酸。在某些实施方案中，本公开的经工程改造的氢营养型微生物产生的甲硫氨酸的水平比亲本营养型微生物产生的甲硫氨酸水平高至少约10％，或者至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约
40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约500倍或约1000倍。其它实施方案中，本公开的经工程改造的氢营养型微生物在相同的培养条件下产生的甲硫氨酸水平比亲本氢营养型微生物产生的甲硫氨酸水平高至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约
30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约60％、至少约
65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。
40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约500倍或约1000倍。其它实施方案中，本公开的经工程改造的氢营养型微生物在相同的培养条件下产生的甲硫氨酸水平比亲本氢营养型微生物产生的甲硫氨酸水平高至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约
30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约60％、至少约
65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。
[0171] 在某些实施方案中，如本文所提供的用于任选地在H2的存在下将COx底物转化为甲硫氨酸的方法将以约0.001g/L培养物至约500g/L的培养物产生甲硫氨酸。在一些实施方案中，所产生的甲硫氨酸的量为约1g/L培养物至约100g/L培养物。在另一些实施方案中，所产生的甲硫氨酸的量为约0.001g/L、0.01g/L、0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2.5g/L、5g/L、
7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、
70g/L、80g/L、90g/L、l00g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、
300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/L或500g/L。
7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、
70g/L、80g/L、90g/L、l00g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、
300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/L或500g/L。
[0172] 在另一些实施方案中，如本文所提供的用于任选地在H2的存在下将COx底物转化为甲硫氨酸的方法将产生至少约或多至约1千克(kg)、至少约或多至约10kg、至少或多至约100kg、至少约或多至约1,000kg、至少约或多至约10,000kg、至少约或多至约50,000kg、至少约或多至约100,000kg、至少约或多至约250,000kg、至少约或多至约500,000kg，或更多的甲硫氨酸/天。在某些实施方案中，甲硫氨酸产量为约100,000公吨(MT)/年(即10亿kg/年或300,000kg/天)、约75,000MT/年(或225,000kg/天)、约50,000MT/年(或150,000kg/天)、约25,000MT(或75,000kg/天)、或约10,000MT/年(或30,000kg/天)。
[0173] 用于制造甲硫氨酸的系统
[0174] 在另一些方面，本公开提供了一种用于生产甲硫氨酸的系统，其包括含H2/COx底物的气体源；生物反应器，其含有任意一种或更多种上述非天然或重组的氢营养型微生物，所述非天然或重组的氢营养型微生物(a)表达与亲本氢营养型微生物相比具有增加的活性的一种或更多种硫同化多肽；(b)过表达一种或更多种硫同化多肽；或(c)包含一种或更多种硫同化多肽的改变的调节；以及连接器，其设置在所述气体源和所述生物反应器之间，以使得所述气体流入所述生物反应器；其中所述非天然氢营养型微生物代谢H2/COx底物以与亲本氢营养型微生物相比过量产生一种或更多种甲硫氨酸途径氨基酸。
[0175] 在任意上述系统中，将H2/COx底物转化为生物物质，例如动物饲料或肥料。在某些实施方案中，H2/COx底物被同化为富含甲硫氨酸的生物物质。在另一些实施方案中，所得甲硫氨酸被纯化并用作动物饲料、食品添加剂或营养补充剂。在其它实施方案中，富含甲硫氨酸的生物质用于动物饲料、食品添加剂或营养补充剂。
[0176] 在如本文所公开的使用非天然或重组的氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)产生甲硫氨酸的任意上述系统中，气体原料是H2/COx底物，其中原料包含H2与CO2或CO或两者以及任选地各种如本文所述的其它组分。在某些实施方案中，H2/COx底物是合成气，例如通过以下方式产生的合成气：蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化天然气或液烃(例如，乙烷、丙烷、石脑油)、通过水气变换反应调节、在氨合成中、在甲醇合成中、通过炼钢、或通过煤、石脑油、渣油、生物质或废物的气化。在某些实施方案中，H2/COx底物是如此产生的任何气流与氢、一氧化碳、二氧化碳或其任意组合的一种或更多种其它来源的掺和物，包括管道氢、管道二氧化碳、二氧化碳洗涤废气、烟气、乙烷裂解物废气、重整器废气氯合成废气或其任意组合。
[0177] 在如本文所公开的使用非天然或重组的氢营养型微生物(例如，产甲烷菌)产生甲硫氨酸的任意上述方法中，培养的氢营养型微生物是产甲烷古细菌，例如甲烷杆菌属、甲烷短杆菌、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、产甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷拟球菌属、甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷热杆菌属、甲烷热球菌属、甲烷热菌属、或甲烷炎菌属。
[0178] 在某些实施方案中，非天然的或重组的氢营养型微生物可以是嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、德氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、伊氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆、抗酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、伍氏甲烷短杆菌、沃氏甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、居烂泥甲烷胞菌、马堡甲烷热杆菌、热自养甲烷热杆菌、热弯曲甲烷热杆菌、嗜热甲烷热杆菌、沃氏甲烷热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、筑后甲烷袋状菌、海底甲烷袋状菌、低温产甲烷菌、Methanogenium liminatans、海洋产甲烷菌、居蟑螂甲烷微球菌、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、竹节状甲烷鬃毛状菌、Methanosaeta pelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌、乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、运动甲烷微菌、Methanococcus aeolicus、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、热自养甲烷热球菌、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌、沸泉甲烷热球菌、印度洋甲烷热球菌、热液口甲烷热球菌、詹氏甲烷热球菌以及火神甲烷热球菌。
[0179] 在任意上述系统中，氢营养型微生物是嗜温的、嗜热的、嗜超热的或其组合。在任意上述方法中，氢营养型微生物是专性厌氧菌或兼性厌氧菌。在任意上述方法中，氢营养型微生物是专性氢营养体或兼性氢营养体。实施例
[0180] 实施例1
[0181] 海沼甲烷球菌的乙硫氨酸抗性突变体的产生
[0182] 微生物中的甲硫氨酸的产生受到高度的调节，特别是通过反馈抑制。将细菌或古细菌暴露于毒性甲硫氨酸类似物(例如，DL-乙硫氨酸)将导致细胞在甲硫氨酸反馈抑制中突变，这被鉴定为能够在有毒类似物存在下生长的那些突变体(参见例如Kumar等，Biotechnology Advances 23：41-61，2005)。表1提供了连同相对于野生型的其遗传背景得到的生物体列表，包括在本文所述的实验中使用的一些生物体。
[0183] 表1.经修饰的海沼甲烷球菌S2
[0184]
[0185]菌株 相对表型或基因型
Trel42-erl.3 Trel142乙硫氨酸抗性突变体1.3
Trel42-erl.3 Trel142乙硫氨酸抗性突变体1.3
[0186] 乙硫氨酸抗性海沼甲烷球菌突变体的分离
[0187] 为了产生乙硫氨酸抗性突变体，在37℃下在25mL不含酪蛋白氨基酸的补充有100mg/L赖氨酸至OD600为约0.50的McCas培养基中使Trel10-333UR-ΔdA(含有赖氨酸反馈抗性lysC和dapA缺失的海沼甲烷球菌S2，表1)生长(参见Sarmiento等，Methods
Enzymol.494：44，2011，涉及培养基McCV，这里在没有酪蛋白氨基酸或酵母提取物的情况下使用)，然后分配到两个厌氧Balch管(每个管中5mL培养物)中，一只管接受0.3mL甲磺酸乙酯诱变剂(EMS，1：50稀释于不含Cas的McCas中)，另一只管单独接受0.3mL不含Cas的McCas作为对照。将管用80/20的H2/CO2混合物加压至40PSIG，并在37℃下在无振动情况下孵育1小时。孵育1小时后，释放压力，从每只管中取出0.5mL培养物，并铺在McCas琼脂平板上以确定杀灭率。
Enzymol.494：44，2011，涉及培养基McCV，这里在没有酪蛋白氨基酸或酵母提取物的情况下使用)，然后分配到两个厌氧Balch管(每个管中5mL培养物)中，一只管接受0.3mL甲磺酸乙酯诱变剂(EMS，1：50稀释于不含Cas的McCas中)，另一只管单独接受0.3mL不含Cas的McCas作为对照。将管用80/20的H2/CO2混合物加压至40PSIG，并在37℃下在无振动情况下孵育1小时。孵育1小时后，释放压力，从每只管中取出0.5mL培养物，并铺在McCas琼脂平板上以确定杀灭率。
[0188] 洗涤剩余的培养物以除去EMS，然后在1000g离心机中离心15分钟，除去上清液，将沉淀的细胞重通过新悬浮于1mL不含Cas的McCas中，最后以1000g离心15分钟洗涤。重复2次洗涤以除去EMS。在最终洗涤后，将收获的细胞悬浮在500μL的不含Cas的McCas中，并将100μl转移至含有5mL不含Cas的McCas+100mg/L赖氨酸(用于EMS处理)的三个Balch管中或一个用于回收的管(对照，未处理的)中。向每只管中加入0.1mL 2.5％Na2S x 9H20，然后将每只管用80/20的H2/CO2加压至40PSIG，并使其在37℃下回收过夜。第二天早晨，通过离心将每种培养物浓缩至0.1mL，并铺在含有100mg/L赖氨酸和3g/L乙硫氨酸的不含Cas的McCas平板上。在37℃下在具有10PSIG的80/20的H2/CO2气体混合物的Oxoid厌氧罐中孵育板。乙硫氨酸选择产生仅从已经暴露于EMS的培养物生长的菌落。除非另有说明，否则所有工作均在无氧条件下进行。
[0189] 选择来自各个板的5个菌落用于HPLC分析以测量甲硫氨酸的产生。简言之，使海沼甲烷球菌重组体在37℃下在补充有嘌呤霉素(2.5mg/L)、用H2:CO2(4:1)充气至40psi的Balch管中的5mLMcCAS培养基中在振动下生长过夜。次日，使用100μl的过夜培养物作为种子培养物，接种用H2:CO2(4:1)分别充气至40和20psi的压力的Balch管或100ml血清培养基中的5ml最小量的培养基(MM)。将培养物置于37℃下振动72小时；在培养开始时，将H2：CO2(4：1)气体再填充至全压力。发酵后，将1.8ml培养物转移至Eppendorf管中，以12,000xg除去细胞，并将得到的上清液通过0.2μm过滤器。通过HPLC分析滤液的氨基酸含量。根据需要，种子和发酵培养基可补充有嘌呤霉素(2.5mg/L)。
[0190] 表2.血清管中突变海沼甲烷球菌的氨基酸产生
[0191]
[0192] 在通过乙硫氨酸选择鉴定的五个菌落中，当通过HPLC分析时，三个菌落示出增加的甲硫氨酸滴度。具有增加的甲硫氨酸滴度的三个菌落被指定为乙硫氨酸抗性突变体1.1、3.1和3.3(分别为Trel10-333UR-ΔdA-er 1.1、Trel10-333UR-ΔdA-er 3.1和Trel10-
333UR-ΔdA-er 3.3)。
333UR-ΔdA-er 3.3)。
[0193] 乙硫氨酸抗性甲烷八叠球菌属突变体的分离
[0194] 为了选择乙硫氨酸抗性甲烷八叠球菌属突变体，对Trel 42(乙酸甲烷八叠球菌C2A，DSM 2834)或Trel 9(马氏甲烷八叠球菌GO1，DSM 3647)进行诱变。简言之，使菌株生长在25mL不含Casamino的加入5G/L甲醇的McCas培养基中(培养基配方请参见Sarmiento等，Methods Enzymol.494：44，2011；其是指培养基McCV，并且这里在没有酪蛋白氨基酸或酵母提取物的情况下使用)或不含酪胨和酵母的在37℃加入5G/L甲醇至约0.50的OD600的DSM 120培养基中。将5mL培养物分配到两个厌氧的Balch管中。向一只管中加入0.3mL甲磺酸乙酯(EMS，在不含Cas的McCas中以1:50稀释)，并向第二管中加入0.3mL培养基(对照)。在37℃将管与80/20的N2/CO2混合物在20PSIG下在无振动情况下孵育1小时。孵育1小时后，释放压力，并从每只管中取出0.5mL并铺在琼脂平板上以确定杀灭率。
[0195] 通过以1000xg离心15分钟洗涤剩余的培养物，除去上清液并通过重悬于5mL培养基中洗涤收获的细胞。这些收获和洗涤步骤再重复两次以除去所有痕量的EMS。最终洗涤后，将收获的细胞悬浮在5mL培养基中，并将1mL转移到含有5mL培养基的三个Balch管中以进行回收。向每只管中加入0.1mL 2.5％Na2S x 9H20，然后将每只管用80:20N2/CO2加压至20PSIG，并在37℃下回收至少48小时。次日，通过离心将每种培养物浓缩至1.0mL，并将其铺在含有1.25mg/mL的乙硫氨酸和5g/L的三乙胺合适的培养基的琼脂平板上或以浓度为
0.4mg/mL至1.6mg/mL的乙硫氨酸富集在液体培养基中。对于在铺板之前富集的培养物，在含有相同浓度的乙硫氨酸的琼脂平板上铺板之前，将富集进行两次。在37℃下在具有
10PSIG的80:20N2/CO2气体混合物的Oxoid厌氧罐中孵育板。选择使得菌落只在用经EMS处理的细胞接种的板上生长。除非另有说明，否则所有的工作都是在厌氧条件下进行的。
0.4mg/mL至1.6mg/mL的乙硫氨酸富集在液体培养基中。对于在铺板之前富集的培养物，在含有相同浓度的乙硫氨酸的琼脂平板上铺板之前，将富集进行两次。在37℃下在具有
10PSIG的80:20N2/CO2气体混合物的Oxoid厌氧罐中孵育板。选择使得菌落只在用经EMS处理的细胞接种的板上生长。除非另有说明，否则所有的工作都是在厌氧条件下进行的。
[0196] 诱变的乙酸甲烷八叠球菌Trel42的三个菌落在乙硫氨酸上生长，这些菌落在血清瓶发酵中进行测试(如实施例1中所述)。结果总结在下表3中。
[0197] 表3.血清管中突变甲烷八叠球菌属的氨基酸产生
[0198]
[0199] 实施例2
[0200] 海沼甲烷球菌和乙酸甲烷八叠球菌的乙硫氨酸抗性突变体
[0201] 海沼甲烷球菌：使用Qiagen DNAeasy血液&组织试剂盒根据革兰氏阴性细菌的方案从过量产生甲硫氨酸的海沼甲烷球菌突变体以及从亲本菌株S2(Trel10)分离基因组DNA。使用以下引物进行MMP1359-MMP1358操纵子的硫同化ORF的聚合酶链反应(PCR)扩增：
[0202] 1359seqF1(5'-CTATAGAACTAACCCAATG-3'；SEQ ID NO：9)
[0203] 1359seqR1(5'-GGTGTTGCAGATACTAT-3'；SEQ ID NO：10)
[0204] 1359SeqF3(5'-AGACTTGAACCTTTA-3'；SEQ ID NO：11)
[0205] 1359seqR3(5'-CGCCAAAATCTTCCCTGC-3'；SEQ ID NO：12)。
[0206] 将这些相同的引物用作MMP1359-MMP1358操纵子的正向和反向测序引物以获得这些ORF的完整的重叠序列覆盖。
[0207] 突变序列与亲本菌株以及先前公开的序列的Blast比较显示在甲硫氨酸生产者的MMP1359-MMP1358操纵子中的两个不同的突变。Trel10-333UR-ΔdA-er1.1和Trel10-333UR-ΔdA-er3.1在MMP1358 ORF的第341位核苷酸处具有G-A转换，导致氨基酸序列中的G114E取代突变。Trel10-333UR-ΔdA-er3.3在ORF MMP1359的第1315位具有G-A转换，导致在氨基酸序列中的D439N取代突变。在MMP1359和MMP1358 ORF中鉴定的突变表明这些基因与甲硫氨酸的生物合成相关，并且可能受到甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。
[0208] 乙酸甲烷八叠球菌：使用Epicentre Masture Pure DNA纯化试剂盒从每个突变体(包括亲本菌株C2A(Trel42))分离基因组DNA，并且通过PCR扩增含有推定的高半胱氨酸合酶基因(Trel 42中的ORF1821(SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30的氨基酸序列)和1822和Trel 9中的相关ORF)的区域。用于Trel 42中的区域的扩增和测序的引物如下：
[0209] C2A1821F(5'-GTATTGAATTGGCAAACT-3'；SEQ ID NO：22)
[0210] C2A1821R(5'-ACCGGCTCAGACCCGGTG-3'；SEQ ID NO：23)
[0211] C2A1821SEQ1(5'-GGAAAGAACTCGACGTGC-3'；SEQ ID NO：24)
[0212] C2A1821SEQ2(5'-ACTGACATTCTTGATTATG-3'；SEQ ID NO：25)
[0213] C2A1821SEQ3(5'-CTTGCAGCGCGCAGGCT-3'；SEQ ID NO：26)
[0214] 在ORF1821(SEQ ID NO.31)的第1466位核苷酸处的Trel42mut3中发现G/C至A/T转换。该突变导致ORF1821(SEQ ID NO：32)第489位处的S至N氨基酸变化。
[0215] 实施例3
[0216] 氢营养型微生物的LYSC突变体
[0217] 之前已经描述过海沼甲烷球菌的反馈抗性lysC(天冬氨酸激酶)突变体的分离。简言之，在37℃使野生型海沼甲烷球菌Trel10生长在25mL不含酪蛋白氨基酸的McCas培养基中(培养基配方请参见Sarmiento等，Methods Enzymol.494：44，2011；其是指培养基McCV，并且这里在没有酪蛋白氨基酸或酵母提取物的情况下使用)至约0.20的OD600。将5mL培养物分配到两个厌氧的Balch管中。向一只管中加入0.3mL甲磺酸乙酯(EMS，在不含Cas的McCas中以1:50稀释)，并向第二管中加入0.3mL不含cas的McCas(对照)。将管用80/20的N2/CO2混合物加压至40PSIG并在37℃在无振动的情况下孵育1小时。孵育1小时后，释放压力，从每只管中取出0.5mL并铺在McCas琼脂平板上以确定杀灭率。
[0218] 将剩余的培养物分配到5(经EMS处理)或2(对照)、1.5无菌厌氧离心管并以1000g离心15分钟。除去上清液，并通过重悬于1mLMcCas，并在1000g再次离心15分钟洗涤细胞沉淀。该洗涤重复两次以除去所有痕量的EMS。最终洗涤后，将收获的细胞悬浮在200μL不含Cas的McCas中，并转移到5mL不含Cas的McCas中以进行回收。向每只管中加入1mL 2.5％Na2S x 9H20，然后将每只管用80/20H2/CO2加压至40PSIG，并在37℃下回收过夜。第二天早晨，通过离心将每种培养物浓缩至0.1mL，并将其铺在含有0.1M苏氨酸和0.02M AEC的不含Cas的McCas板上。在37℃下在具有10PSIG的80/20H2/CO2气体混合物的Oxoid厌氧罐中孵育板。选择使得菌落只在用经EMS处理的细胞接种的板上生长。除非另有说明，否则所有的工作都是在厌氧条件下进行的。
[0219] 在赖氨酸和苏氨酸存在下生长时，EMS产生的lysC突变体Trel10-Mut333的生长速率不受影响，Trel10-Mut333具有G333R突变(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的LysC氨基酸位置G277)(在37℃孵育72小时后测量OD600；数据未示出)－换句话说，Trel10-Mut333的突变的天冬氨酸激酶不受赖赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制。通过HPLC鉴定由Trel10-Mut333突变体产生的天冬氨酸途径氨基酸(数据未示出)。
[0220] 衍生剂邻苯二甲醛(OPA)用于自动进样器的自动化衍生反应，并进行预柱。将反应混合物在pH 10.2(经硼酸盐缓冲液)下缓冲，这使得直接衍生化酸水解的蛋白/肽样品。首先使用3-巯基丙酸(3-MPA)使目标氨基酸与OPA反应。将3-MPA整合入吲哚中降低了它们的疏水性，结果，色谱法洗脱OPA衍生物。与亲本菌株相比，Trel10-Mut333突变体的产生情况如下(在所有鉴定的突变体中通常相似，数据未示出)：丙氨酸(5mg/L)、赖氨酸(8mg/L)、苏氨酸(21mg/L)和甘氨酸(78mg/L)。
[0221] 通过使用Qiagen DNAeasy血液&组织试剂盒按照革兰氏阴性细菌的方案提取基因组DNA来验证海沼甲烷球菌lysC中的突变。用正向引物(LysCforl-5'GGGAC GGCGC A AC AA ATGG3'；SEQ ID NO：13)和反向引物(LysCrev1-5'GGAGATAGTGAGACCCCTGGAGT3'；SEQ ID NO：14)使用Easy-A高保真度聚合酶扩增LysC靶标。将扩增的DNA与LysCfor1或LysCrev1混合并测序(Operon)。鉴定出一个自发突变体和8个化学诱导突变体。除了先前在棒杆菌属鉴定的第G277位处的突变(本例中为G277R)之外，还发现了以前未在棒杆菌属中鉴定出来的新的突变位置，包括S302P和G359E(根据谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的LysC的氨基酸位置编号)。
[0222] 实施例4
[0223] 氢营养型微生物中尿嘧啶磷酸核糖转移酶缺失和REPA插入
[0224] 为了提高质粒转化效率，通过用编码复制蛋白的基因A(repA，具有其自身启动子)取代尿嘧啶磷酸核糖转移酶(upp)基因(基因座MMP0680)在基因组水平修饰lysC突变体海沼甲烷球菌Trel10-Mut333(被称为Trel10-333UR)。RepA使得具有repA的任何质粒进行有效的转化，所述质粒例如衍生自或基于含repA的pURB500质粒的质粒(参见Tumbula等，J.Bacteriol.179：2976,1997)。尿嘧啶磷酸转移酶活性的丧失给予经修饰的海沼甲烷球菌6-氮尿嘧啶(6-azaurcil)抗性表型。
[0225] 简言之，使用引物TKH_038(5'aaattatgaggcgcgcctccctgaagaagaagagag3'；SEQ ID NO：27)和TKH_039(5'tgcttattcggcgcgccagttccattttaccacc3'；SEQ ID NO：28)从海沼甲烷球菌S001(Walters等，App.Environ.Microbiol.77：2549,2011)的基因组DNA扩增(连同其启动子)repA基因。使用 HD克隆试剂盒(Clontech)将扩增的repA片段克隆到用AscI线性化的 载体中。将最终的质粒命名为pKH11。将来自
pKH11的XbaI-BamHI片段克隆到用限制酶NheI和BglII线性化的pMEV1中(Gardner WL
(2000)Expression vectors for the methane-producing archaeon Methanoc occus maripaludis.Dissertation,University of Georgia)。将携带嘌呤霉素抗性基因的所得自杀载体命名为pKH20。
pKH11的XbaI-BamHI片段克隆到用限制酶NheI和BglII线性化的pMEV1中(Gardner WL
(2000)Expression vectors for the methane-producing archaeon Methanoc occus maripaludis.Dissertation,University of Georgia)。将携带嘌呤霉素抗性基因的所得自杀载体命名为pKH20。
[0226] 基本上如Sarmiento等(2011)所述，将质粒pKH20转化到Trel10-Mut333中，并且在含有嘌呤霉素(2.5mg/L)的McCAS平板上选择转化体。将在嘌呤霉素存在下生长的转化体菌落转移到补充有6-氮尿嘧啶(0.25mg/ml)的McCAS液体培养基中并生长过夜。将一部分过夜培养物转移到补充有0.5mg/ml 6-氮尿嘧啶的新鲜McCAS培养基中，并再次生长过夜。将培养物稀释，然后铺展至含有0.25mg/ml 6-氮尿嘧啶的McCAS平板上。5天后，将单个菌落重复铺到含有或不含嘌呤霉素的McCAS平板上。将在嘌呤霉素存在下不能生长的菌落转移到补充有6-氮尿嘧啶(0.25mg/ml)的McCAS液体培养基中以确认抗性。使用以下引物通过PCR验证在Trel10-Mut333基因组上用repA基因替换upp基因：uptdelconf1(5'-caattactgaacccaaagaccat-3'；SEQ ID NO：14)和uptdelconf2(5'-
aatagttaccggcgttacaatca-3'；SEQ ID NO：15)。将具有经验证的用repA基因替换upp基因的6-氮尿嘧啶抗性/嘌呤霉素敏感菌落命名为Trel10-333UR。
aatagttaccggcgttacaatca-3'；SEQ ID NO：15)。将具有经验证的用repA基因替换upp基因的6-氮尿嘧啶抗性/嘌呤霉素敏感菌落命名为Trel10-333UR。
[0227] 实施例5
[0228] 氢营养型微生物中的DAPA缺失
[0229] 使用与Sarmiento等(2011)描述的基本相同的无标记诱变方法产生用于增加的甲硫氨酸产生的Trel10-333UR-ΔdA-dapA缺失的构建。通过使用引物DapAfor2(5'-tccctgatcgatagaaagtgtagt-3'；SEQ ID NO：16)和DapArev2(5 '-
ttgccgatgaaattaaagtgaaa-3'；SEQ ID NO：17)的PCR合成来自海沼甲烷球菌S2(Trel10)基因组的含有dapA基因以及上游和下游区域的的约2.4kb片段，并将其克隆到质粒pT OPO中以产生pJB012。使用引物DapAdelfor2(5'-gcgggcgcgccgcataattacaccttatgcgttc-3'；SEQ ID NO.：18)和DapAdelrev2(5'-gcgggcgcgcctaatcacggttcgtgatactat-3'；SEQ ID NO.：
19)通过采用向外PCR(out ward PCR)产生dapA基因的框内缺失片段，这两个引物都包含5'AscI位点。纯化PCR产物，用AscI消化并连接到pTOPO中以产生pJB013。最后，使用引物uppneoF(5'-attacgccaagcttggtaccactctcttcttcttcaggga-3'；SEQ ID NO：20)和uppneoR(5'-gtggatccgagctcggtacctgagatccccgcgctggagg-3'；SEQ ID NO：21)从pKH14PCR扩增含有upp：：neo基因的片段，并将其克隆到pJB013的KpnI位点以产生pJB015。
ttgccgatgaaattaaagtgaaa-3'；SEQ ID NO：17)的PCR合成来自海沼甲烷球菌S2(Trel10)基因组的含有dapA基因以及上游和下游区域的的约2.4kb片段，并将其克隆到质粒pT OPO中以产生pJB012。使用引物DapAdelfor2(5'-gcgggcgcgccgcataattacaccttatgcgttc-3'；SEQ ID NO.：18)和DapAdelrev2(5'-gcgggcgcgcctaatcacggttcgtgatactat-3'；SEQ ID NO.：
19)通过采用向外PCR(out ward PCR)产生dapA基因的框内缺失片段，这两个引物都包含5'AscI位点。纯化PCR产物，用AscI消化并连接到pTOPO中以产生pJB013。最后，使用引物uppneoF(5'-attacgccaagcttggtaccactctcttcttcttcaggga-3'；SEQ ID NO：20)和uppneoR(5'-gtggatccgagctcggtacctgagatccccgcgctggagg-3'；SEQ ID NO：21)从pKH14PCR扩增含有upp：：neo基因的片段，并将其克隆到pJB013的KpnI位点以产生pJB015。
[0230] 将pJB015转化到Trel10-333UR中(如前所述)，在琼脂平板上选择新霉素(500ug mg/ml)抗性菌落。通过PCR证实染色体dapA基因处的单个交叉事件。使具有单个交叉的菌落在非选择性培养基中生长24小时以允许双交换事件，然后铺在含有100mg/L赖氨酸和0.25ug/ml 6-氮尿嘧啶的McCAS培养基上。将菌落铺到含或不含赖氨酸的McCAS平板。对需要赖氨酸进行生长的菌落进行dapA缺失的PCR确认。将一个这样的菌落命名为Trel10-
333UR-ΔdA。
333UR-ΔdA。
[0231] 实施例6
[0232] 甲硫氨酸生物合成基因的过表达
[0233] 可以通过去除天然启动子或用强组成型启动子代替天然启动子来使海沼甲烷球菌Trel10甲硫氨酸生物合成途径的任何基因过表达，所述基因包括lysC、失调的lysC、asd、MMP1358 ORF、MMP1359 ORF、失调的MMP1358 ORF、失调的MMP1359ORF或甲硫氨酸合酶。在一种情况下，分别具有和不具有甲硫氨酸合酶(MetE)的失调的MMP1358 ORF或失调的MMP1359 ORF被可操作地连接至复制型质粒上的组成型组蛋白基因hmv启动子并且被引入海沼甲烷球菌Trel10中。在另一种情况下，失调的ORF1358和Orf1359可操作地连接至hmv启动子并被引入Trel10-Mut333中。测量血清瓶(如实施例1所述)和发酵罐(如实施例9所述)中的氨基酸产生，结果总结在表4和表5中。
[0234] 表4.血清管中经工程改造的海沼甲烷球菌的氨基酸产生
[0235]
[0236] 表5.通过发酵经工程改造的海沼甲烷球菌的氨基酸产生
[0237]
[0238] 组成型表达失调的MMP1358和MMP1359 ORF的海沼甲烷球菌Trel10(Trel10-er3.1+er3.3)产生了显著量的甲硫氨酸(107mg/L，表4)。加入失调的LysC(Trel10-Mut333+er3.1+er3.3)没有改善甲硫氨酸产生，而是产生更多的甘氨酸、苏氨酸和赖氨酸。这些数据表明，由于甲硫氨酸的过量产生导致赖氨酸和苏氨酸水平下降，野生型Trel10可能是天然地“失调的”，因此，这些氨基酸不以引发对LysC的反馈抑制的足够高的量存在。此外，这些数据表明，失调的MMP1358和MMP1359 ORF的过表达导致甲硫氨酸的非常特异性的过量产生。
[0239] 实施例7
[0240] 氢营养型微生物解微生物的甲硫氨酸输出
[0241] 从谷氨酸棒杆菌分离候选brnFE或metT甲硫氨酸输出者基因并检查其功能。任选地引入其它突变以增加功能，或者通过可操作地连接到更强的启动子过表达输出基因，或将功能性外源brnFE或metT基因引入海沼甲烷球菌中。可以容易地从培养基中回收和/或分离过量产生的甲硫氨酸。
[0242] 实施例8
[0243] 改变氢营养型微生物中到甲硫氨酸产生的碳通量
[0244] 氢营养型微生物(例如，海沼甲烷球菌)的主要碳流可以以各种方式变换以提供更多的碳到甲硫氨酸生物合成。例如，通过使PEP合酶基因失活或下调来实现限制碳从丙酮酸流到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。此外，任选地敲除异亮氨酸途径(如果存在的话)，其保留该途径使用的丙酮酸和乙酰辅酶A。通过基因工程改造(例如，基因或基因部分缺失)或选择通过突变(例如，自发的或诱导的)导致的失活来引入特定酶活性的失活或降低。可替代地，丙酮酸羧化酶基因任选地过表达以将更多的碳从丙酮酸导入氧草乙酸酯(OAA)。此外，任选地过表达天冬氨酸转氨酶基因以将更多的OAA转化为天冬氨酸。可以例如通过提供基因的多个拷贝或通过改变启动子区域以提供更强的表达来实现过表达。
[0245] 实施例9
[0246] 在生物反应器中培养非天然和重组的氢营养型微生物
[0247] 在厌氧条件下在鼓泡塔生物反应器中培养海沼甲烷球菌约72小时至120小时，直到培养物达到稳态状态情况，这可以在一系列增加体积的连续容器中进行(例如，从50ml开始，使用这样的培养物接种10L，然后使用这样的培养物接种300L或更多)，使得达到非常大量的密集培养。在此期间，系统将以补料分批模式运行，其中将合成气连续供给到发酵肉汤中。肉汤本身不交换。一旦达到适当的OD600(如通过分光光度计测量的)，则将开始连续培养过程，其中培养基/肉汤的交换开始。鉴于发酵罐中培养物的OD600，交换速率将被确定。例如，每天交换约1.5至约3.0个完整体积的肉汤。
[0248] 将培养物保持在约37℃的温度下，但可能在约35℃至约40℃的范围内波动，保持在约7.0-7.2的pH(根据需要用HC1和/或NaOH调节pH)下，并且保持在约1.5至约2.0的OD 600。合成气由H2:CO2构成，H2:CO2比例范围为约4:1至约3:1，其可包括约0％至约5％范围的一氧化碳(最佳为至多1％)，并且可以包括其它微量污染物。合成气流量由该工艺中使用的鼓泡或滴流塔的具体设计决定。
[0249] 可以组合上述各个实施方案以提供其它实施方案。本说明书中引用或申请数据表中列举的所有专利和非专利出版物的全部内容通过引用并入本文。如果需要使用各种专利、申请和出版物的概念来提供其它实施方案的话，则可以对实施方案的一些方面进行修改。
[0250] 可以根据上述详细描述对这些实施方案进行这些和其它改变。通常，在所附权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制在说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及这样的权利要求所具备的等同形式的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
[0251] 本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容，包括2015年5月6日提交的美国临时专利申请系列No.62/157,797，均以与本公开相一致的程度通过引用并入本文。
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