[0002] 与本
申请相关的序列表以文本格式代替纸印本提供，并且在此通过引用并入到
说明书中。含有序列表的文本文件的名称为910215_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为3.4KB，于2015年1月2日生成，并且经由EFS-Web
电子提交。
[0003] 背景
[0004] 随着谷氨酸的
风味增强品质的发现以及
味精在日本的市场化，氨基酸在世纪之交后很快就获得商业价值。几种氨基酸，包括不能被动物或人类合成的那些(称为必需氨基酸)，被用作动物
饲料添加剂，用作人类的食物补充剂，以及用在用于维持重病患者的静脉溶液中。单美国氨基酸市场就占全球市场的20％，预期到2016年超过20亿美元，市场中超过一半用于动物饲料补充剂。
[0005] 用于商业用途的氨基酸一般以四种方式制备：从天然来源提取、化学合成、
发酵和酶催化。尽管仍用于某些氨基酸，但提取现在的重要性有限。化学合成可以以非常大的规模进行，但反应一般产生外消旋混合物并且这需要拆分以及回收所需的对映体。一个例外是必需氨基酸甲硫氨酸，其已经作为外消旋体(DL-甲硫氨酸)由起始原料丙烯
醛、氢氰酸、甲硫醇和氨合成制造，并且已经在市场上作为饲料添加剂销售了超过50年。使用甲硫氨酸外消旋体时可行的，因为动物具有将非天然的D-型甲硫氨酸转
化成有益的L-型的酶。相反，对于其他氨基酸而言则不存在用于转化D-型的这类相当的酶系统，因此甲硫氨酸以外的氨基酸必须以纯的L-型制备。尽管如此，这些方法需要苛刻的制备环境或产生环境有害的副产物。目前，用于氨基酸制备的最优选方法是发酵和酶催化。
[0006]
土壤细菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，其能够以高生产率从糖产生风味增强剂L-谷氨酸)的发现为发酵在氨基酸生产中的成功铺平了道路(Kinoshita等，J.Gen.Appl.Microbiol.3:193,1957)。在过去30年中氨基酸市场的迅速发展的原因主要归功于在发酵技术以及氨基酸生产微生物的菌株改良方面的进展，所述氨基酸生产菌株如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌，其已经能够进行许多氨基酸的工业规模生产(Ikeda M(2003)Amino acid production processes(氨基酸生产工艺).见:Scheper T,Faurie R,Thommel J(编辑)Advances in biochemical engineering/biotechnology(生物化学工程/生物技术进展),vol 79.Springer,NewYork,pp 1–35；Leuchtenberger等，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:1,2005)。但是，发酵市场大多由天然醇和合成醇产品特别是
乙醇主导。在氨基酸生产中使用的
碳水化合物原料直接用于动物饲料中以及用于
生物燃料生产中。对动物产品和
生物燃料的需求增长增加了碳水化合物原料的成本，这又增加了制备氨基酸的成本。
[0007] 鉴于原料的高价格，在本领域中存在着对以成本有效方式生物生产氨基酸的可替代改良方法的需求。本公开满足了这种需求，并且进一步提供了其他相关的优势
[0008] 简要概述
[0009] 在某些方面，本公开提供了非天然的氢营养微生物，其中所述非天然的氢营养微生物表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性,并且其中所述非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物从而产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0010] 在进一步的方面，本公开提供了一种重组氢营养微生物，其包含编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子，其中所述重组氢营养微生物能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0011] 在还进一步的方面，本公开提供了一种制备天冬氨酸途径氨基酸的方法，所述方法包括培养根据本公开的非天然的或重组的氢营养微生物达足以产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的时间，其中所述非天然的或重组的氢营养微生物：(a)表达一种或多种具有与亲代氢营养微生物相比的增加的活性的天冬氨酸途径酶；(b)过表达一种或多种天冬氨酸途径酶；或(c)包含对一种或多种天冬氨酸途径酶的改变的调控，其中所述非天然的氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸(诸如赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。
[0012] 在又进一步的方面，本公开提供了一种用于制备天冬氨酸途径氨基酸或含天冬氨酸途径氨基酸的饲料添加剂的方法，所述方法包括在存在H2/COx底物的情况下在足以允许表达编码来自用于生物合成天冬氨酸家族氨基酸的一种或多种途径的多肽的外源多核苷酸的条件下培养本公开的重组的、分泌天冬氨酸途径氨基酸的氢营养微生物达足以允许表达所述外源多核苷酸的时间，其中一种或多种天冬氨酸途径氨基酸在培养基中以比由亲代氢营养微生物产生的所述一种或多种天冬氨酸途径氨基酸更高的水平产生和积累。
[0013] 在其他的方面，本公开提供了一种用于制备天冬氨酸途径氨基酸的系统，其包括：包含H2/COx底物的气体源；
生物反应器，所述生物反应器包含本公开的任一种或多种非天然的或重组的氢营养微生物，所述非天然的或重组的氢营养微生物：(a)表达一种或多种具有与亲代氢营养微生物相比的增加的活性的天冬氨酸途径酶；(b)过表达一种或多种天冬氨酸途径酶；或(c)包含对一种或多种天冬氨酸途径酶的改变的调控；和布置在所述气体源和所述生物反应器之间以允许所述气体流入到所述生物反应器中的连接器；其中所述非天然的氢营养微生物代谢所述H2/COx底物从而与亲代氢营养微生物相比过量产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸(诸如赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。
[0015] 图1示出了海沼甲烷球菌(Methnococcus maripaludis)lysC突变体Trel10-Mut333在赖氨酸和苏氨酸存在下的去调控生长速率(在37℃孵育72小时后测量OD600)，所述海沼甲烷球菌lysC突变体Trel10-Mut333具有G333R突变(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的LysC氨基酸
位置G277)。
[0016] 图2示出了由具有突变的内源性天冬氨酸激酶的海沼甲烷球菌产生的天冬氨酸途径氨基酸的HPLC图。与亲代株相比突变体的产生谱为丙氨酸(5mg/L)、赖氨酸(8mg/L)、苏氨酸(21mg/L)和甘氨酸(78mg/L)。
[0017] 详述
[0018] 本公开提供了用于生物利用气体或将气体转化成有用的组合物，诸如高价值分子(例如，氨基酸)、
生物材料(例如，动物饲料)或其组合的组合物和方法。例如，可以将
合成气体供给氢营养微生物从而产生一种或多种不同的天冬氨酸途径氨基酸。这种方式允许使用氢营养古细菌或细菌作为新的宿主系统来利用包含氢气和碳
氧化物(例如，CO、CO2)的原料或将包含氢气和碳氧化物的原料转化成赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或其任意组合。
[0019] 作为背景，天冬氨酸途径氨基酸–诸如赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸–在它们的生物合成途径中共用几种酶，其中的一种或多种接受反馈调控、基因表达的抑制或两者。例如，天冬氨酸激酶是参与引导碳流动到这些工业上重要的氨基酸的生物合成中的第一关键酶，其在谷氨酸棒杆菌中被苏氨酸和赖氨酸别构抑制而不能磷
酸化天冬氨酸(Sano和Shiio,J.Gen.Appl.Microbiol.16:373,1970；Yoshida等,J.Mol.Biol.368:521,2007)。高丝氨酸脱氢酶是苏氨酸/甲硫氨酸生物合成途径中的第一关键酶，但该酶与赖氨酸生物合成途径的第一关键酶二氢吡啶二
羧酸合酶竞争天冬氨酰半醛。对朝向苏氨酸/甲硫氨酸或赖氨酸的碳流的控制将取决于哪个酶获得底物–例如，在棒杆菌中，高丝氨酸脱氢酶活性被苏氨酸抑制，并且表达被甲硫氨酸阻遏，但二氢吡啶二羧酸合酶不受赖氨酸水平影响。类似地，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶受甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的反馈调控(Born和Blanchard,Biochem.38:14416,1999)。
[0020] 本公开提供了用于对氢营养微生物进行代谢改造(例如，改变基因，改变基因表达，改变基因表达调控)从而将前体和代谢流重新引导朝向产生与野生型或亲代生物体相比更高水平的特定氨基酸(例如，赖氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸)的组合物和方法。在某些方面，本公开提供了用于生产氨基酸的组合物、方法和系统，其包括使用改良的氢营养微生物，其中所述改良的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0021] 在更详细地提出本公开之前，提供将用于本文中的某些术语的定义对理解本公开可能是有帮助的。其他定义在整个本公开中给出。
[0022] 在本说明书中，除非另外指明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围要理解为包括所述范围内的任何整数的值以及(当适用时)其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另外指明，本文提到的涉及任何物理特征诸如
聚合物亚基、尺寸或厚度的任何数字范围要理解为包括所提及的范围内的任何整数。除非另外指明，当用于本文中时，术语“约”意指所示范围、值或结构的±20％。术语“基本上由……组成”将
权利要求的范围限于所
指定的材料或步骤或不实质地影响所要求保护的
发明的基本的和新的特征的那些材料或步骤。应当理解术语“一个(a)”和“一种(an)”当用于本文中时是指“一个或多个”所列举的成分。可替代选择(例如，“或”)的使用应当理解为意指可替代选择中的任一个、两个或其任意组合。当用于本文中时，术语“包括”、“具有”和“包含”同义地使用，这些术语及其变体意在被解释为是非限制性的。
[0023] 当用于本文中时，“天冬氨酸途径氨基酸”或“天冬氨酸家族氨基酸”是指从天冬氨酸合成的一种或多种氨基酸，包括赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、高丝氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。当天冬氨酸家族氨基酸中的每一种的生物合成途径中的步骤可以分支或分叉时，它们全部以天冬氨酸激酶(也称作天
门冬氨酸激酶)
磷酸化天冬氨酸开始。在某些实施方案中，天冬氨酸家族氨基酸的生物合成途径中的天冬氨酸激酶受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种的反馈抑制。此外，对来自“天冬氨酸家族氨基酸的生物合成途径”的蛋白或酶的提及可以意指，例如，赖氨酸生物合成途径酶、甘氨酸生物合成途径酶、苏氨酸生物合成途径酶、甲硫氨酸生物合成途径酶或其任意组合。
[0024] 当用于本文中时，“氢营养型生物”或“氢营养的”是指能够消耗H2，氧化H2或将H2转变成另一种化合物作为其代谢的一部分的微生物。在某些实施方案中，氢营养型生物可以是专性的或兼性的氢营养型生物，专性的或兼性的厌氧微生物或其任意组合。例如，兼性的氢营养型生物可以在存在或不存在氢作为
能量来源的条件下生长，并且可以使用一种或多种各种各样的碳源，诸如碳水化合物、乙酸盐、
甲酸盐、甲醇、甲胺或碳氧化物(例如，产乙酸菌，梭菌属，可以在不存在H2的条件下生长并且使用乙酸盐作为
能源和碳源两者)。示例性的氢营养型生物包括产烷生物(Methanogen)、产乙酸菌(Acetogen)、氢氧混合气细菌等。
[0025] 当用于本文中时，“H2/COx底物”或“H2/COx原料”是指氢(H2)与二氧化碳(CO2)或
一氧化碳(CO)或两者的混合物，其也可以包含各种其他组分，诸如氨(NH3)、
烃(例如，甲烷(CH4))、CO2、CO、甲醛(CH2O)、
硫化氢(H2S)、硫化羰(COS)、
氰化氢(HCN)、水
蒸汽、惰性气体或其他气体。
[0026] 当用于本文中时，“合成气体”或“合成气”是指一氧化碳和氢的混合物，其可以例如通过
天然气或液体烃的蒸汽重整、干燥或CO2重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化，在氢合成内，在氨合成内，在甲醇合成内，通过炼
钢或通过
煤、
生物质或废物的
气化制备。在某些实施方案中，合成气可以进一步通过水-煤气变换反应来调整。合成气也可以包含相对于CO和H2较小量的甲烷、CO2、H2S或其他气体。
[0027] 当用于本文中时，术语“宿主”是指可以通过突变或利用外源核酸分子来进行遗传修饰以产生感兴趣多肽(例如，天冬氨酸激酶)的细胞或微生物(例如，古细菌、细菌)。在某些实施方案中，宿主细胞可以任选地已经具有赋予与被表达的突变的或外源的多肽相关或不相关的所需特性(例如，去调控)的其他遗传修饰。例如，宿主细胞可以具有或被改变以具有赋予额外的或增强的进入天冬氨酸途径氨基酸的碳流活性、竞争氨基酸的产生减少、高度生长、对污染物或特定培养条件的耐受性、代谢其他碳底物的能
力或合成所期望产物或中间体的能力的遗传修饰。
[0028] 当用于本文中时，术语“产烷生物”或“产甲烷古细菌”是指能够使用氢气和任意的各种各样的一种或两种碳底物(例如，二氧化碳、乙酸盐、甲酸、甲醛、一氧化碳、甲醇、甲基胺(例如，甲胺、二甲胺、三甲胺等))在缺氧条件下产生甲烷的微生物。要理解在本领域中细菌不是古细菌而古细菌不是细菌。当用于本文中时，产甲烷古细菌可以是“专性的氢营养型生物”，其需要氢气来产生甲烷。产甲烷古细菌可以是“兼性的氢营养型生物”，其能够在缺少氢气的条件下产生甲烷。此外，产甲烷古细菌可以是嗜温的、嗜热的或超嗜热的。
[0029] 当用于本文中时，“生物质”是指具有生物学起源的有机材料，其可以包括全细胞、裂解的细胞、细胞外材料、产生的产物或其部分，等等。例如，从培养的微生物(例如，细菌或古细菌培养物)
收获的材料可以被认为是生物质，其可以包括分泌的产物或可以是分泌的产物。
[0030] 当用于本文中时，“核酸分子”，也被称为多核苷酸，是指由共价连接的称作核苷酸的亚基组成的聚合化合物。核酸分子包括聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，两者可以是单链或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、半合成DNA等等。
[0031] 当用于本文中时，术语“内源的”或“天然的”是指在宿主细胞中正常存在的基因、蛋白、化合物或活性。此外，与亲代基因、蛋白或活性相比突变的、过表达的、改组的、复制的或以其他方式改变的基因、蛋白或活性仍然被认为是该特定宿主细胞内源的或天然的。例如，来自第一基因(例如，启动子、翻译衰减序列)的内源控制序列可以用来改变或调控第二天然基因或核酸分子的表达，其中第二天然基因或核酸分子的表达或调控不同于亲代细胞中的正常表达或调控。
[0032] 当用于本文中时，“异源的”或“外源的”核酸分子、构建体或序列是指不是宿主细胞天然的核酸分子或核酸分子的一部分，但是可以是与来自宿主细胞的核酸分子或核酸分子的一部分同源的。异源的或外源的核酸分子、构建体或序列的来源可以是来自不同的属或种。在某些实施方案中，异源或外源核酸分子通过例如，缀合、转化、
转染、电穿孔等加入(即，不是内源的或天然的)到宿主细胞或宿主基因组中，其中加入的分子可以整合到宿主基因组中或作为
染色体外遗传物质存在(例如，作为质粒或其他形式的自我复制载体)，并且可以以多个拷贝存在。另外，“异源的”是指由引入到宿主细胞中的外源核酸分子编码的非天然的酶、蛋白或其他活性，即使宿主细胞编码同源蛋白或活性。
[0033] 术语“同源”或“同源物”是指在宿主细胞、种或株中发现或源自宿主细胞、种或株的分子或活性。例如，异源或外源核酸分子可以与天然宿主细胞基因是同源的，并且可以任选地具有改变的表达水平、不同的序列、改变的活性或其任意组合。
[0034] 当用于本文中时，术语“非天然的”是指包含不同于野生型或亲代细胞或分子的至少一种遗传改变的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体。例如，非天然的可以是指与野生型或亲代微生物相比已经被改变使得内源核酸分子或基因的表达或基因产物的活性已经改变(例如，增加、减小、去调控、活化、去阻遏、阻遏)的微生物或细胞(例如，位点特异性突变体或随机突变体，包括自发突变体)。这样的修饰包括，例如，在非编码调控区中改变基因或操纵子的表达的那些。“非天然的”生物体、微生物或细胞可以包括重组生物体、微生物或细胞。
[0035] 当用于本文中时，术语“重组”是指已经通过引入外源核酸分子而被修饰的微生物、细胞、核酸分子或载体或指已经改变使得内源核酸分子或基因的表达是受控的、去调控的或构成性的微生物或细胞，其中这种改变或修饰可以通过基因工程来引入。遗传改变可以包括，例如，引入编码一种或多种蛋白或酶的核酸分子(其可以包含表达控制元件，诸如启动子)或其他核酸分子添加、缺失、置换的修饰或细胞遗传物质的其他功能性破坏或向细胞遗传物质添加的其他功能性破坏。示例性的修饰包括来自参照或亲代微生物的异源或同源多肽的编码区中的那些或其功能
片段。在某些实施方案中，本公开的生物体、微生物或细胞是非天然的生物体、微生物或细胞和重组生物体、微生物或细胞。例如，表达或过表达去调控的内源酶(例如，天冬氨酸激酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶)的非天然的氢营养微生物也可以含有一种或多种外源或异源核酸分子，所述外源或异源核酸分子被表达或过表达以产生参与天冬氨酸途径氨基酸的生物合成的某些酶活性(例如，天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、二氨基庚二酸脱羧酶)。
[0036] 当用于本文中时，“转化”是指将核酸分子(例如，外源或异源核酸分子)引入到宿主细胞中。被转化的宿主细胞可以在染色体外携带所述外源或异源核酸分子或将所述外源或异源核酸分子整合到染色体中。整合到宿主细胞基因组和自我复制载体中通常导致被转化的核酸分子基因上稳定的遗传。含有转化的核酸的宿主细胞被称为“重组的”或“遗传改造的”或“转化的”或“转基因的”细胞(例如，细菌、古细菌)。
[0037] 当用于本文中时，术语“去调控”是指与亲代或野生型微生物中的基因表达或活性分别相比，基因产物的减小的或增加的表达或基因产物(例如，蛋白、酶)的减小的或增加的活性。例如，对微生物可以进行遗传操作(例如，突变，遗传改造)从而与操作之前的亲代或野生型微生物相比增加或减小基因产物的表达或增加或减小基因产物的活性。在某些实施方案中，将靶基因突变使得表达的基因产物具有增加的活性。例如，靶基因的编码区可以被改变使得表达的基因产物具有增加的活性，靶基因的拷贝数可以增加以增加活性，靶基因可以被过表达以增加活性或其任意组合。在其他实施方案中，靶基因被突变使得表达的基因产物具有减小的、最小的或无法检测到的对反馈抑制的反应(例如，氨基酸生物合成酶，诸如天冬氨酸激酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶或高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶(homoserine O-transsuccinyltransferase)，在一种或多种反馈
抑制剂赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的存在下被去调控)。在进一步的实施方案中，靶基因被突变使得该基因具有减小的、最小的或无法检测到的对表达阻遏的反应(例如，氨基酸生物合成酶，诸如高丝氨酸脱氢酶，在反馈共阻遏物甲硫氨酸的存在下被去调控)。备选地，微生物可以例如，在选择压力下被鉴定具有上述基因改变中的任一种或多种(例如，自发突变体)。上述实施方案中的任一个的去调控的基因或基因产物可以是自发的、诱导的或改造的突变体或变体。
[0038] 当用于本文中时，术语“过表达的”是指当在相同的条件下生长时，在非天然的或重组的微生物中的基因表达水平或基因产物水平大于在亲代或野生型微生物中见到的基因表达水平或基因产物水平。在某些实施方案中，过表达可以在转录水平、翻译水平或两个水平上发生，其可以因改变的调控控制(例如，使用强启动子)或拷贝数的增加或两种因素而引起。
[0039] 两个或多个核酸序列之间的“百分比同一性”是由序列所共用的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置总数x 100)，考虑空位数目，以及需要被引入以优化两个或多个序列的比对的每个空位的长度。序列的比较和两个或多个序列之间百分比同一性的确定可以使用数学
算法来完成，诸如BLAST和Gapped BLAST程序，采用它们的缺省参数(例如，Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990；还参见BLASTN，在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。
[0040] “保守置换”在本领域中被公认为是一个氨基酸替代具有相似性质的另一个氨基酸。示例性的保守置换在本领域中是众所周知的(参见，例如，WO 97/09433，第10页；Lehninger,Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.NY,NY,pp.71-77,1975；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA,p.8,1990)。
[0041] “抑制”或“被抑制”，当用于本文中时，是指相对于对照、内源或参照分子，靶基因的表达或靶分子(例如，磷酸烯醇丙
酮酸合酶)的活性直接地或间接地改变、减小、下调或消除，其中所述改变、减小、下调或消除在统计学上、生物学上、工业上或在临床上是有意义的。例如，活性被抑制的、失活的或减小的生物合成酶(例如，被遗传改变的)与野生型或亲代酶相比可以具有35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的活性。
[0042] 当用于本文中时，术语“衍生物”是指通过化学或生物学手段，利用或不利用酶，对化合物的修饰，修饰的化合物在结构上类似于母体化合物并且可由该母体化合物(实际地或理论上)衍生而来。衍生物可以具有与母体化合物不同的化学、生物学或物理性质，诸如与母体化合物相比更加亲水或具有改变的
反应性。衍生化(即，修饰)可以涉及置换分子内的一个或多个结构部分(例如，官能团的改变)。例如，氢可以用卤素诸如氟或氯置换或羟基(-OH)可以用羧酸部分(-COOH)置换。其他示例性的衍生化包括糖基化、烷基化、酰基化、乙酰化、泛素化、酯化和酰胺化。
[0043] 术语“衍生物”还指母体化合物的所有
溶剂化物，例如，水合物或加合物(例如，与醇的加合物)、活性
代谢物和盐。盐的类型取决于化合物内的结构部分的性质。例如，酸性基团，诸如羧酸基团，可以形成
碱金属盐或碱土金属盐(例如，钠盐、
钾盐、镁盐、
钙盐以及具有生理学可耐受的季铵离子的盐和与氨和生理学可耐受的有机胺诸如，例如，三乙胺、乙醇胺或三-(2-羟乙基)胺形成的
酸加成盐)。碱性基团可以与例如，
无机酸诸如
盐酸、
硫酸或磷酸或与有机羧酸或磺酸诸如乙酸、
柠檬酸、乳酸、
苯甲酸、
马来酸、富马酸、
酒石酸、甲磺酸或
对甲苯磺酸形成酸加成盐。同时含有碱性基团和酸性基团的化合物，例如除了碱性氮
原子以外还含有羧基的化合物，可以作为两性离子存在。盐可以通过本领域技术人员已知的习惯方法来获得，例如，通过将化合物与无机酸或
有机酸或碱在溶剂或稀释剂中化合来获得或通过阳离子交换或阴离子交换由其他盐获得。
[0044] 氢营养微生物–宿主细胞
[0045] 本公开的亲代或起始的氢营养微生物可以是野生型(天然)株，突变的(非天然的)株(例如，增加的生长速率，去调控的或去阻遏的生物合成酶)或重组株，它们中的每一个都可以进一步被修饰以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种氨基酸(例如，赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。在某些实施方案中，氢营养型生物可以是细菌或产甲烷古细菌。
[0046] 在某些实施方案中，本公开提供了氢营养微生物，其是产甲烷古细菌，诸如甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷卵圆形菌属(Methanocalculus)、甲烷暖球菌属(Methanocaldococcus)、甲烷胞菌属(Methanocella)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷类球菌属(Methanococcoides)、甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)、甲烷泡菌属(Methanofollis)、产甲烷菌属(Methanogenium)、甲烷盐菌属(Methanohalobium)、甲烷嗜盐菌属
(Methanohalophilus)、甲烷裂叶菌属(Methanolacinia)、甲烷叶菌属(Methanolobus)、甲烷食甲基菌属(Methanomethylovorans)、甲烷微菌属(Methanomicrobium)、甲烷微球菌属(Methanomicrococcus)、甲烷盘菌属(Methanoplanus)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、Methanoregula、甲烷鬃毛菌属(Methanosaeta)、甲烷咸菌属(Methanosalsum)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、Methanospirillium、甲烷嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、甲烷嗜热球菌属(Methanothermococcus)、甲烷热菌属(Methanothermus)或甲烷炎菌属(Methanotorris)。
[0047] 在进一步的实施方案中，氢营养微生物是特定的产甲烷古细菌物种。示例性的产甲烷古细菌物种包括嗜碱甲烷杆菌(Methanobacterium alcaliphilum)、布氏甲烷杆菌(Methanobacterium bryantii)、刚果甲烷杆菌(Methanobacterium congolense)、徳氏甲烷杆菌(Methanobacterium defluvii)、埃斯帕诺拉甲烷杆菌(Methanobacterium espanolae)、甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)、依氏甲烷杆菌(Methanobacterium ivanovii)、
沼泽甲烷杆菌(Methanobacterium palustre)、热聚甲烷杆菌(Methanobacterium thermaggregans)、泥沼甲烷杆菌(Methanobacterium
uliginosum)、耐酸甲烷短杆菌(Methanobrevibacter acididurans)、嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、Methanobrevibacter gottschalkii、
Methanobrevibacter olleyae、
瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、乌兹甲烷短杆菌(Methanobrevibacter woesei)、沃丽尼甲烷短杆菌(Methanobrevibacter wolinii)、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、沼泽产甲烷胞菌(Methanocella paludicola)、
Methanothermobacter marburgensis、热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicum)、嗜热弯曲甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermoflexus)、嗜热甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermophilus)、沃氏甲烷嗜热杆菌
(Methanothermobacter wolfeii)、集结甲烷嗜热菌(Methanothermus sociabilis)、巴伐利亚甲烷粒菌(Methanocorpusculum bavaricum)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum parvum)、Methanoculleus chikuoensis、深海甲烷囊菌(Methanoculleus submarinus)、嗜冷产甲烷菌(Methanogenium frigidum)、泥游产甲烷菌(Methanogenium liminatans)、海洋产甲烷菌(Methanogenium marinum)、Methanomicrococcus blatticola、内共生甲烷盘菌(Methanoplanus endosymbiosus)、居泥甲烷盘菌(Methanoplanus limicola)、石油甲烷盘菌(Methanoplanus petrolearius)、坎氏甲烷火菌(Methanopyrus kandleri)、Methanoregula boonei、联合甲烷鬃毛菌(Methanosaeta concilii)、竹节状甲烷鬃毛菌(Methanosaeta harundinacea)、浮游甲烷鬃毛菌(Methanosaeta pelagica)、嗜热甲烷鬃毛菌(Methanosaeta thermophila)、
醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、可活动甲烷微菌
(Methanomicrobium mobile)、风产甲烷球菌(Methanococcus aeolicus)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、嗜热无机营养甲烷嗜热球菌(Methanothermococcus thermolithotrophicus)、坎氏甲烷火菌(Methanopyrus kandleri)、嗜热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermoautotroiphicus)、沸热甲烷暖球菌
(Methanocaldococcus fervens)、印度甲烷暖球菌(Methanocaldococcus indicus)、下层甲烷暖球菌(Methanocaldococcus infernus)、詹氏甲烷暖球菌(Methanocaldococcus jannaschii)和火山甲烷暖球菌(Methanocaldococcus vulcanius)。
[0048] 在某些实施方案中，产甲烷古细菌浮生细胞色素或不产生细胞色素。例如，不产生细胞色素的产甲烷古细菌包括海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)或万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)。示例性的产生细胞色素的产甲烷古细菌是巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)或马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)。
[0049] 在相关的实施方案中，产甲烷古细菌可以是嗜温的、嗜热的或超嗜热的。示例性的嗜温的产甲烷菌包括甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷卵圆形菌属、甲烷暖球菌属、甲烷球菌属、甲烷粒菌属和甲烷八叠球菌属中的一些种。示例性的嗜热的产甲烷菌包括甲烷微菌属、甲烷鬃毛菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷嗜热球菌属中的一些种。示例性的超嗜热的产甲烷菌包括甲烷暖球菌属、甲烷火菌属、甲烷热菌属和甲烷炎菌属中的一些种。
[0050] 在进一步的实施方案中，本公开提供作为细菌的氢营养微生物。在某些实施方案中，氢营养型生物可以是代谢合成气或CO的微生物，诸如梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、热球菌属(Pyrococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、产醋菌属(Acetogenium)、醋杆菌属(Acetobacterium)、
脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属(Butyribaceterium)、氧化碳嗜热菌属
(Carboxydothermus)或消化链球菌属(Peptostreptococcus)。示例性的梭菌属种包括自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)、杨氏梭菌(C.ljungdahli)、拉格利梭菌(C.ragsdalei)、食氧化碳梭菌(C.carboxydivorans)、伍氏梭菌(C.woodii)和C.neopropanologen并且示例性的丁酸杆菌属物种是食甲基丁酸杆菌(B.methylotrophicum)。在某些其他实施方案中，氢营养型生物可以是氢氧混合气(Knall-gas)细菌，诸如钩虫贪
铜菌(Cupriavidus
necator)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、海洋氢弧菌(Hydrogenovibrio marinus)或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
[0051] 在某些实施方案中，氢营养微生物是专性氢营养型或兼性氢营养型。在进一步的实施方案中，氢营养微生物是专性厌氧微生物或兼性厌氧微生物。在某些实施方案中，氢营养兼性厌氧微生物可以在H2和氧或氧化物(例如，氧化
铁、胺氧化物、膦氧化物、亚砜)的存在下生长。示例性的氢营养兼性厌氧微生物包括贪铜菌属(Cupriavidus)(例如，嗜碱贪铜菌(C.alkaliphilus)、C.basilensis、C.campinensis、C.gilardii、C.laharis、耐金属贪铜菌(C.metallidurans)、钩虫贪铜菌(C.necator)、C.numazuensis、C.oxalaticus、C.pampae、C.pauculus、C.pinatubonensis、C.respiraculi、台湾贪铜菌(C.taiwanensis))、嗜热氢杆菌、Xanthobacter autotrophicus、不透明红球菌
(Rhodococcus opacus)、Rhodopseudomnas sp.、和Alicaligenes sp.。
[0052] 氢营养微生物–非天然的和重组的
[0053] 本公开的氢营养微生物可以进行遗传操作(例如，非天然的)、重组修饰或其组合以敲除、减少、表达或过表达目标多肽，这产生可用于将H2/COx底物的多种组分转化(例如，利用、转化、同化、氧化、还原)成其他有用化合物或组合物诸如氨基酸或饲料的重组微生物。
[0054] 产生非天然的氢营养微生物的遗传操作可以包括(例如，一个或多个基因靶标的)随机诱变(例如，化学诱导的、自发的)或位点特异性诱变，与一个或多个基因靶标的表达相关的
调控序列或位点的改变(例如，通过去除强的、弱的、诱导型、阻抑型或多个启动子或通过用具有不同特性的启动子替代这些启动子)，改变一个或多个基因靶标的染色体位置，改变与一个或多个基因靶标邻接的核酸序列(诸如核糖体结合位点或转录终止子)，减少或增加一个或多个基因靶标的拷贝数，修饰参与一个或多个基因靶标的转录或一个或多个基因产物的翻译的调控蛋白、阻遏物、抑制基因、增强子、转录激活因子等或将一个或多个基因靶标的表达去调控的任何其他方法(包括使用反义核酸分子、短干扰核酸分子或敲除或阻断靶蛋白的表达的其他方法)。
[0055] 在某些实施方案中，遗传操作包括产生非天然的氢营养微生物的一个或多个自发突变。这样的自发突变体可以例如通过将微生物置于特定的选择压力(其中仅具有所需的表现型的突变体将生长)下来鉴定(例如，在生长培养基中缺少特定的氨基酸或毒素，在抗生素的存在下，缺少特定的代谢物，等)。
[0056] 已经在细菌和古细菌的不同属间观察到密码子使用偏好性的变化，其可以影响在异源宿主中的重组蛋白表达(Sharp等,Nucl.Acids Res.33:1141,2005；Emery和Sharp,Biol.Lett.7:131,2011)。在某些实施方案中，核酸分子(例如，编码天冬氨酸途径氨基酸生物合成酶的核酸)可以如本文所述在引入至宿主细胞前进行密码子优化以提高或最大化蛋白表达。密码子优化是指在核酸分子水平改变基因或编码区中的密码子序列从而反映宿主细胞的更常见的密码子使用而不用改变由该密码子所编码的氨基酸。对异源宿主中的基因表达的密码子优化方法以前已经有所描述(参见，例如，Welch等.,Methods Enzymol.498:43,2011；Henry和Sharp,Mol.Biol.Evol.24:10,2007；美国
专利公开号2011/0111413)。
[0057] 在进一步的实施方案中，编码本公开的生物合成酶的内源或外源核酸分子可以被改变，诸如具有由野生型改变的氨基酸序列。通过这些方法生成的每个变体多肽将保留至少50％活性(优选100％或更大的活性)并且具有与参考或亲代野生型酶序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的多肽序列。在某些实施方案中，变体多肽将包括在相对于参考或亲代野生型酶的一个或多个预
定位置处的至少一个氨基酸置换(例如，至少1、2、3、5、6、7、8、9或10或更多个或至多20、25或30个置换)或不超过特定数目的氨基酸置换(例如，不超过1、
2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个置换)，条件是变体保留了目标活性(例如，羧化酶，脱羧酶，脱氢酶，差向异构酶，激酶，裂解酶，还原酶，合酶)。
[0058] 如上所述，在天冬氨酸途径氨基酸的生物合成中的第一关键酶是天冬氨酸激酶,其可以受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种的反馈调控。例如，大肠杆菌具有三种天冬氨酸激酶同工酶–两种是双功能的，具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性，其被称作天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I(AK/HD-I；thrA)和天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II(AK/HD-II；metL),另一种仅具有天冬氨酸激酶活性，其被称作天冬氨酸激酶III(AK-III；lysC)。AK/HD-I受苏氨酸的反馈调控(以及苏氨酸和亮氨酸对表达的阻遏),而AK/HD-II仅受甲硫氨酸的反馈调控，AK-III仅受赖氨酸的反馈调控(参见Patte等，Biochim.Biophys.Acta 136:245,1967；Theze等，J.Bacteriol.117:133,1974)。相反，谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸两者的反馈抑制(Sano和Shiio,1970；Yoshida等,2007)。参与天冬氨酸途径氨基酸的生物合成的其他酶也受反馈抑制，诸如高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶、二氢吡啶二羧酸合酶。
[0059] 因此，本公开提供了具有去调控的参与天冬氨酸途径氨基酸的生物合成的酶诸如天冬氨酸激酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶或二氢吡啶二羧酸合酶的氢营养微生物，其活性可以是内源的、外源的或两者。在某些实施方案中，天冬氨酸激酶可以任选地具有缀合的高丝氨酸脱氢酶活性。鉴定抗反馈抑制突变体的方法在本领域中是已知的–例如，能够在毒性氨基酸类似物诸如赖氨酸类似物S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)或甲硫氨酸类似物DL-乙硫氨酸的存在下生长的微生物被认为抗与毒性类似物对应的氨基酸的反馈抑制(参见，例如，Shiio等,Agric.Bioi.Chem.54:3275,1990；Kumar和Gomes,Biotechnology Advances 23:41-61,2005)。
[0060] 在某些方面，本公开提供了非天然的氢营养微生物，其中所述非天然的氢营养微生物表达或过表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性,并且其中所述非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，去调控的内源性天冬氨酸激酶活性是抗赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种的反馈抑制的天冬氨酸激酶突变体。在其他实施方案中，去调控的内源性天冬氨酸激酶活性由包含自发突变,随机突变,位点特异性突变或其任意组合的突变lysC基因编码。
[0061] 在进一步的实施方案中，去调控的内源性天冬氨酸激酶活性由包含在苏氨酸结合位点、赖氨酸结合位点、赖氨酸和苏氨酸结合位点、不同于赖氨酸或苏氨酸结合位点的位点或其任意组合处的突变的突变体lysC基因编码。在某些实施方案中，去调控的内源性天冬氨酸激酶活性由包含在苏氨酸结合位点处的突变的突变体thrA基因编码。在其他实施方案中，去调控的内源性天冬氨酸激酶活性由包含在甲硫氨酸结合位点处的突变的突变体metL基因编码。
[0062] 当提到本公开的lysC抗反馈突变体时，参考对应于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032LysC蛋白(GenBank登录号CAF18822.1)的氨基酸位置的残基编号。示例性的苏氨酸结合位点突变包括残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合。示例性的赖氨酸结合位点突变包括残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合。示例性的赖氨酸和苏氨酸结合位点突变位于残基D294处。示例性的在不同于赖氨酸和苏氨酸结合位点的位点处突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述突变中的任一种或多种可以包含在本公开的天冬氨酸激酶中，条件是所述天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
[0063] 为了有效地发生天冬氨酸途径氨基酸的生物合成，特定量的碳流必须通过该途径流动。促进或增强天冬氨酸途径氨基酸的产生的一种方式是使进入此途径的碳流最大化，如本公开所提供的那样。
[0064] 在其他方面，本公开提供了非天然的氢营养微生物，其中所述非天然的氢营养微生物具有减小的磷酸烯醇
丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性、增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的天冬氨酸氨基转移酶活性或其任意组合，并且其中所述非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，非天然的氢营养微生物具有减小的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或具有两者。在某些其他实施方案中，非天然的氢营养微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶活性、增加的乙酰CoA合酶活性、增加的天冬氨酸氨基转移酶活性或其任意组合。
[0065] 在进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还具有减小的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或具有两者。在又进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰CoA合酶、增加的天冬氨酸氨基转移酶活性或其任意组合。在这些实施方案中的每一个中，非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0066] 如本文所述，几种产生天冬氨酸途径氨基酸的生物合成酶受反馈调控(例如，天冬氨酸激酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶、二氢吡啶二羧酸合酶)，编码这些酶的基因受阻遏(例如，高丝氨酸脱氢酶)或两者(例如，二氢吡啶二羧酸合酶)。因此，天冬氨酸途径氨基酸的产生可以通过减少调控、阻遏或两者来提高，如本公开所提供的那样。
[0067] 在进一步的方面，本公开提供了非天然的氢营养微生物，其中所述非天然的氢营养微生物包含一种或多种去调控和/或去阻遏的来自天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的一种或多种途径的多肽，并且其中所述非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸(例如，更高水平的赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。在某些实施方案中，非天然的氢营养微生物具有被去阻遏、去调控或去阻遏和去调控两者的天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶(例如，metB)或其任意组合。
[0068] 在进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还具有一种或多种其他去调控和/或去阻遏的来自天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的一种或多种途径的多肽。在又进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还具有被去阻遏、去调控或去阻遏和去调控两者的高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶(例如，metB)或其任意组合，其中所述去阻遏或去调控或两者是由一种或多种自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合引起的。
[0069] 除了过量产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸以外，避免提取或分离所产生的氨基酸将是有利的。因此，本公开提供了增强在培养基中产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的方法，在所述方法中分离或纯化方法得到简化。
[0070] 在又进一步的方面中，本公开提供了非天然的氢营养微生物，其中所述非天然的氢营养微生物表达或过表达一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的输出蛋白(exporter)，并且其中所述非天然的或重组的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，非天然的氢营养微生物表达或过表达与强表达控制序列(例如，nif或tet启动子)可操作相连的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的输出蛋白诸如rhtA或lysE输出蛋白。在其他实施方案中，一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的非天然的氢营养微生物转运蛋白/输入蛋白被敲除或抑制。
[0071] 确保到天冬氨酸家族氨基酸的特定生物合成途径的碳流的另一方式是去除其他竞争氨基酸的产生。如本公开中所提供的，氢营养微生物可以是一种或多种氨基酸的营养
缺陷型。
[0072] 在还进一步的方面，本公开提供了非天然的氢营养微生物，其中所述非天然的氢营养微生物是一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的营养缺陷型，并且其中所述非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，非天然的氢营养微生物是高丝氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型或其任意组合。在某些其他实施方案中，非天然的氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、异亮氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。在一些实施方案中，非天然的氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型或两者。
[0073] 在进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物也是一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的营养缺陷型。在又进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物也是高丝氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型或其任意组合。在还进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还是赖氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、异亮氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。在甚至进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还是赖氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型或两者。
[0074] 有时，简单过表达产生天冬氨酸家族氨基酸的一种或多种生物合成酶在本公开的氢营养微生物中将是有用的。
[0075] 在甚至进一步的方面，本公开提供了过表达来自天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的一个或多个途径的多肽的非天然的氢营养微生物，并且其中所述非天然的氢营养微生物代谢H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，二氢吡啶二羧酸合酶被过表达或高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者被过表达或高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者被过表达或高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者被过表达或具有天冬氨酸激酶活性的多肽被过表达。
[0076] 在进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还过表达来自天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的一个或多个途径的多肽。在某些进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物还过表达天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶(还被称为二氢吡啶羧酸还原酶)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合；或天冬氨酸半醛脱氢酶(例如，被nasd或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(例如，由dapA或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(例如，由dapB或其变体编码)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(例如，由dapL或其变体编码)和任选地二氨基庚二酸脱羧酶(例如，由lysA或其变体编码)；或过表达高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者；或过表达高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者；或过表达高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者；或过表达具有天冬氨酸激酶活性的多肽。
[0077] 在微生物生物体中的表达外源或异源核酸的重组方法在本领域中是众所周知的。这样的方法可以发现描述于，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南),第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学规程),John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。示例性的被表达的外源蛋白或酶包括参与以下的那些：赖氨酸生物合成(例如，天冬氨酸激酶、天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶[还被称为二氢吡啶羧酸还原酶]、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、四氢吡啶二羧酸乙酰转移酶、N-琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、乙酰基-二氨基庚二酸氨基转移酶、N-琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、N-乙酰基二氨基庚二酸乙酰基转移酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合)，苏氨酸生物合成(例如，天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶或其任意组合)，甲硫氨酸生物合成(例如，天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶、O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合)或影响进入天冬氨酸家族氨基酸生物合成途径的碳流的酶(例如，丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸合酶、乙酰CoA合酶、天冬氨酸氨基转移酶或其任意组合)。对编码酶或其功能片段的核酸分子的遗传修饰可以赋予重组细胞以从其天然存在状态发生改变的生物化学或
代谢能力。
[0078] 可以使用本领域中已知的多种方法中的任一种将本公开的任一氢营养微生物转化以包含至少一种外源核酸从而为宿主提供新的或增强的活性(例如，酶活性)或可以遗传修饰以去除或实质上减小内源基因功能。用于在氢营养微生物诸如产甲烷古细菌中转移和表达异源核酸分子的遗传工具在本领域中是已知的(参见，例如，Rother等，Curr.Opin.Microbiol.8:745,2005；Leigh等,FEMS Microbiol.Rev.35:577,2011)。例如，可获得用于DNA递送(Dodsworth等,Appl.Environ.Microb.76:5644,2010；Metcalf等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:2626,1997)，用于穿梭载体(Gardner和Whitman,Genetics
152:1439,1999；Metcalf等,1997)、用于异源基因的调控表达(Lie和Leigh,
J.Bacteriol.184:5301,2002；Chaban等,Mol.Microbiol.66:596,2007；Guss等,Archaea
2:193,2008)和用于敲进或敲除基因交换(Moore和Leigh,J.Bacteriol.187:972,2005；
Pritchett等,Appl.Environ.Microb.70:1425,2004)的工具。因此，可以使用在氢营养微生物中失活、敲除或删除内源基因功能的多种方法。
[0079] 在某些实施方案中，启动子、密码子优化或两者可以用于在宿主氢营养微生物中高度构成性表达编码氨基酸生物合成途径酶的外源核酸分子。还可以利用在宿主氢营养微生物(例如，产甲烷古细菌)中调控表达外源核酸分子。在某些实施方案中，编码氨基酸生物合成酶的外源核酸分子的调控表达可以合乎需要地优化非天然的或重组的氢营养微生物的生长速率。响应于H2/COx底物的存在的编码氨基酸生物合成酶的核酸分子的受控表达可以改善基于各种不同来源或比率的可用H2/COx底物的生长。
[0080] 如本文所述，超过一种异源或外源核酸分子可以作为独立的核酸分子、作为多个可个别控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单一核酸分子或其任意组合被引入到宿主细胞中。例如，如本文所公开的那样，代谢H2/COx的微生物可以被修饰以表达两种以上编码所需的天冬氨酸家族氨基酸的生物合成酶(例如，天冬氨酸激酶、天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、高丝氨酸合酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶、O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶)的异源或外源核酸分子。当两种或多种外源核酸分子被引入到宿主代谢H2/COx的微生物中时，要理解两种以上的外源核酸分子可以作为单一核酸分子(例如，在单一载体上)、在分开的载体上、在单一位点或多个位点处被整合到宿主染色体中而引入。参考异源核酸分子或蛋白活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白活性的数目，而不是被引入到宿主细胞中的单独核酸分子的数目。
[0081] 例如，氢营养微生物(诸如产烷生物)可以被重组转化以产生能够以比亲代微生物更高的水平利用、转化或代谢H2/COx底物(例如，H2与CO2、CO或两者)成天冬氨酸途径氨基酸诸如赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸的多肽。
[0082] 作为背景，至少四种不同的赖氨酸生物合成途径存在于古细菌和细菌中，并且存在超过一种途径并不是不常见的，尽管所有四种途径一般不同时存在。途径中的不同步骤通过不同的酶催化，并且因此，这些中的每一种可以被过表达以增加酶的量从而驱动赖氨酸的产生。编码这些赖氨酸生物合成途径所需的酶的核酸分子也可以被重组地加入到缺少这些酶的氢营养微生物。最后，(a)可能与导致赖氨酸产生的途径竞争的步骤可以被弱化、阻断或敲除，(b)可能增强赖氨酸产生的步骤(例如，将碳流转换到赖氨酸生物合成)可以被改变或(c)两者可以被改变，以便使产生的赖氨酸量最大化。
[0083] 赖氨酸生物合成的第一途径包括下列的酶：天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、二氨基庚二酸表异构酶和二氨基庚二酸脱羧酶。赖氨酸生物合成的第二途径包括下列的酶：天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶和二氨基庚二酸脱羧酶。赖氨酸生物合成的第三途径包括下列的酶：天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、N-琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、N-琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸表异构酶和二氨基庚二酸脱羧酶。赖氨酸生物合成的第四途径包括下列的酶：天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸乙酰转移酶、乙酰基-二氨基庚二酸氨基转移酶、N-乙酰基二氨基庚二酸乙酰基转移酶、二氨基庚二酸表异构酶和二氨基庚二酸脱羧酶。
[0084] 在某些实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物进一步包含编码来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第一外源核酸分子，并且所述非天然的氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的赖氨酸，如本文所述。在进一步的实施方案中，来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽是天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合。在其他实施方案中，来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽是天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合。
[0085] 在特殊的实施方案中，第一外源核酸分子编码二氢吡啶二羧酸合酶，其中二氢吡啶二羧酸合酶任选地被过表达。在进一步的实施方案中，第一外源核酸分子编码天冬氨酸半醛脱氢酶(例如，由asd或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(例如，由adapA或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(例如，由adapB或其变体编码)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(例如，由adapL或其变体编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(例如，由lysA或其变体编码)。
[0086] 在一些实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物进一步包含编码来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第一外源核酸分子，并且进一步具有(a)被敲除或具有减小的活性的一种或多种苏氨酸生物合成途径多肽，(b)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甲硫氨酸生物合成途径多肽，(c)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甘氨酸生物合成途径多肽，(d)被敲除或具有减小的活性的一种或多种赖氨酸降解途径多肽(例如，cadA)或(e)其组合。在某些实施方案中，高丝氨酸脱氢酶基因被敲除或编码活性减小的高丝氨酸脱氢酶突变体。
[0087] 在上述任一非天然的氢营养微生物中，外源核酸分子被整合到基因组中或外源核酸分子处于自我复制载体中。另外，在上述任一非天然的氢营养微生物中，非天然的氢营养微生物是高丝氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0088] 在又进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物进一步包含编码来自苏氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第一外源核酸分子，并且所述非天然的氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的苏氨酸。在进一步的实施方案中，一种或多种来自苏氨酸生物合成途径的多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶或其任意组合。在特殊的实施方案中，第一外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者，其中高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者任选地被过表达、去调控或两者均有。
[0089] 在一些实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物进一步包含编码来自苏氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第一外源核酸分子，并且进一步具有(a)被敲除或具有减小的活性的一种或多种赖氨酸生物合成途径多肽，(b)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甲硫氨酸生物合成途径多肽，(c)被敲除或具有减小的活性的一种或多种异亮氨酸生物合成途径多肽，(d)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甘氨酸生物合成途径多肽，(e)被敲除或具有减小的活性的一种或多种苏氨酸降解途径多肽(例如，tdh)或(f)其任意组合。在某些实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶、二氢吡啶二羧酸合酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的赖氨酸或异亮氨酸生物合成途径核酸分子被敲除或编码活性减小的高丝氨酸O-乙酰转移酶突变体、二氢吡啶二羧酸合酶突变体、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。
[0090] 在前述任一非天然的氢营养微生物中，外源核酸分子被整合到基因组中或外源核酸分子处于自我复制载体中。另外地，在前述任一非天然的氢营养微生物中，非天然的氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、异亮氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0091] 在甚至进一步的实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物进一步包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第一外源核酸分子，并且所述非天然的氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的甲硫氨酸，如本文所述。在进一步的实施方案中，来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或多种多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶(例如，metB)、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。在特殊的实施方案中，第一外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者，其中高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者被任选地过表达、去调控或两者均有。
[0092] 在某些其他实施方案中，第一外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者，其中高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者被任选地过表达、去调控或两者都被过表达。在其他实施方案中，第一外源核酸分子编码大肠杆菌ThrA(AK/HD-I)、大肠杆菌MetL(AK/HD-II)、高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其组合，其中AK/HD-I、AK/HD-II、高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其组合被任选地过表达、去调控或两者都被过表达。在特殊的实施方案中，大肠杆菌ThrA(AK/HD-I)是去调控的突变体，其中AK/HD-I在氨基酸位置G330、S345、S352和G433中的任一个或多个处被突变。
[0093] 在一些实施方案中，表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性的非天然的氢营养微生物进一步包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第一外源核酸分子，并且进一步具有(a)被敲除或具有减小的活性的一种或多种赖氨酸生物合成途径多肽，(b)被敲除或具有减小的活性的一种或多种苏氨酸生物合成途径多肽，(c)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甘氨酸生物合成途径多肽，(d)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甲硫氨酸降解途径多肽(例如，metK)或(e)其任意组合。在某些实施方案中，编码二氢吡啶二羧酸合酶、苏氨酸脱水酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码减小的活性。
[0094] 在任一上述非天然的氢营养微生物中，外源核酸分子被整合到基因组中或外源核酸分子处于自我复制载体中。另外，在任一上述非天然的氢营养微生物中，非天然的氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0095] 在某些方面，本公开提供了重组氢营养微生物，其包含编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子，其中所述重组氢营养微生物能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，氢营养微生物表达去调控的内源性天冬氨酸激酶活性，诸如抗赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种的反馈抑制的内源性天冬氨酸激酶突变体。在进一步的实施方案中，第一外源核酸分子过表达具有天冬氨酸激酶活性的多肽或第一外源核酸分子编码去调控的外源性天冬氨酸激酶活性，诸如抗赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种的反馈抑制的外源性天冬氨酸激酶突变体。在一些实施方案中，去调控的外源性天冬氨酸激酶活性由突变的大肠杆菌天冬氨酸激酶基因编码，诸如突变的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I蛋白(GenBank登录号BAB96579.2)、突变的天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II蛋白(GenBank登录号BAE77370.1)或突变的天冬氨酸激酶III蛋白(GenBank登录号BAE78026.1)。在特殊的实施方案中，去调控的外源性天冬氨酸激酶活性由在氨基酸位置G330、S345、S352和G433中的任一个或多个处突变的大肠杆菌天冬氨酸激酶ThrA蛋白(GenBank登录号BAB96579.2)提供或由在氨基酸位置T342处突变的突变大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC蛋白(GenBank登录号BAE78026.1)提供。在其他实施方案中，去调控的外源、内源或两种天冬氨酸激酶活性分别由各自包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合的突变体thrA基因、metL基因、lysC基因或其组合编码。
[0096] 在进一步的实施方案中，去调控的外源、内源或两种天冬氨酸激酶活性分别由包含在苏氨酸结合位点、赖氨酸结合位点、赖氨酸和苏氨酸结合位点、不同于赖氨酸或苏氨酸结合位点的位点或其任意组合处的突变的突变体lysC基因编码。当提到本公开的lysC突变体时，参考对应于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032LysC蛋白(GenBank登录号CAF18822.1)的氨基酸位置的残基编号。示例性的苏氨酸结合位点突变包括残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合。示例性的赖氨酸结合位点突变包括残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合。示例性的赖氨酸和苏氨酸结合位点突变位于残基D294处。示例性的在不同于赖氨酸和苏氨酸结合位点的位点处的突变包括残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合。上述任一种或多种突变可以包含在本公开的天冬氨酸激酶中，条件是该天冬氨酸激酶多肽保留其激酶活性。
[0097] 在其他方面，本公开提供了重组氢营养微生物，其包含编码具有丙酮酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子，编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的第二外源核酸分子，编码具有天冬氨酸氨基转移酶活性的多肽的第三外源核酸分子或其任意组合，其任选地具有减小的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性，其中所述重组氢营养微生物能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，重组氢营养微生物具有减小的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性，增加的丙酮酸激酶活性或具有两者。在某些其他实施方案中，重组氢营养微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰CoA合酶、增加的天冬氨酸氨基转移酶活性或其任意组合。
[0098] 在进一步的方面，本公开提供了重组氢营养微生物，其包含一种或多种编码改变的来自天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的一个或多个途径的多肽的外源核酸分子，其中所述一种或多种编码的多肽被去调控和/或去阻遏，其中所述重组氢营养微生物能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，重组氢营养微生物具有被去阻遏、去调控或去阻遏和去调控两者的高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶或其任意组合。
[0099] 在又进一步的方面，本公开提供了重组氢营养微生物，其包含编码一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的输出蛋白的第一外源核酸分子，其中所述重组氢营养微生物能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，重组氢营养微生物进一步包含编码一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的输出蛋白诸如rhtA或lysE输出蛋白的外源核酸分子。在其他实施方案中，一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的非天然的氢营养微生物转运蛋白/输入蛋白被敲除或抑制。
[0100] 在还进一步的方面，本公开提供了重组氢营养微生物，其包含用于敲除一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的生物合成的遗传修饰，其中所述重组氢营养微生物是一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的营养缺陷型，并且能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。在某些实施方案中，重组氢营养微生物是高丝氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。在某些其他实施方案中，重组氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、异亮氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。在一些实施方案中，重组氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0101] 在某些进一步的方面，本公开提供了重组氢营养微生物，其包含一种或多种编码来自天冬氨酸家族氨基酸的生物合成的一个或多个途径的多肽的外源核酸分子，其中所述一种或多种编码的多肽被过表达，并且重组氢营养微生物能够同化H2/COx底物以产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0102] 在某些实施方案中，天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶(还被称为二氢吡啶羧酸还原酶)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合被过表达；或天冬氨酸半醛脱氢酶(例如，由asd或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(例如，由dapA或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(例如，由dapB或其变体编码)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(例如，由dapL或其变体编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(例如，由lysA或其变体编码)被过表达；或高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者被过表达；或高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者被过表达；或高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者被过表达；或具有天冬氨酸激酶活性的多肽被过表达。
[0103] 在某些实施方案中，具有编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子的重组氢营养微生物进一步包含编码来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第二外源核酸分子，并且所述重组氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的赖氨酸，如本文所述。在进一步的实施方案中，编码的来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽是天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合。在其他实施方案中，编码的来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽是天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶或其任意组合。在特殊的实施方案中，第二外源核酸分子编码二氢吡啶二羧酸合酶，其中二氢吡啶二羧酸合酶任选地被过表达，可操作地连接至核酸表达控制序列或两者均有。在一些实施方案中，第二外源核酸分子编码天冬氨酸半醛脱氢酶(例如，由asd或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(例如，由dapA或其变体编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(例如，由dapB或其变体编码)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(例如，由dapL或其变体编码)和任选地二氨基庚二酸脱羧酶(例如，由lysA或其变体编码)，其中一种或多种或所有单个的核酸分子编码序列任选地被过表达，可操作地连接至核酸表达控制序列或两者均有。
[0104] 在一些实施方案中，具有编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子的重组氢营养微生物进一步包含编码来自赖氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第二外源核酸分子，并且进一步具有(a)被敲除或具有减小的活性的一种或多种苏氨酸生物合成途径多肽，(b)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甲硫氨酸生物合成途径多肽，(c)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甘氨酸生物合成途径多肽，(d)被敲除或具有减小的活性的一种或多种赖氨酸降解途径多肽(例如，cadA)或(e)其组合。在某些实施方案中，高丝氨酸脱氢酶基因被敲除或编码减小活性的高丝氨酸脱氢酶突变体。
[0105] 在任一上述重组氢营养微生物中，第一外源核酸分子被整合到基因组中或第一外源核酸分子被包含在自我复制载体上。另外，在任一上述重组氢营养微生物中，重组氢营养微生物是高丝氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0106] 在还进一步的实施方案中，具有编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子的重组氢营养微生物进一步包含编码来自苏氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第二外源核酸分子，并且重组氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的苏氨酸，如本文所述。在进一步的实施方案中，编码的来自苏氨酸生物合成途径的一种或多种多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶或其任意组合。在特殊的实施方案中，第二外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者，其中高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶或两者任选地被过表达，可操作地连接至核酸表达控制序列，去调控或其任意组合。
[0107] 在一些实施方案中，具有编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子的重组氢营养微生物进一步包含编码来自苏氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第二外源核酸分子，并且进一步具有(a)被敲除或具有减小的活性的一种或多种赖氨酸生物合成途径多肽，(b)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甲硫氨酸生物合成途径多肽，(c)被敲除或具有减小的活性的一种或多种异亮氨酸生物合成途径多肽，(d)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甘氨酸生物合成途径多肽，(e)被敲除或具有减小的活性的一种或多种苏氨酸降解途径多肽(例如，tdh)或(f)其任意组合。在某些实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶、二氢吡啶二羧酸合酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的赖氨酸或异亮氨酸生物合成途径核酸分子被敲除或编码活性减小的高丝氨酸O-乙酰转移酶突变体、二氢吡啶二羧酸合酶突变体、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。
[0108] 在任一上述重组氢营养微生物中，第一外源核酸分子被整合到基因组中或第一外源核酸分子处于自我复制载体中。另外，在任一上述重组氢营养微生物中，重组氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、甲硫氨酸营养缺陷型、异亮氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0109] 在甚至进一步的实施方案中，具有编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶或高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶的多肽的第一外源核酸分子的重组氢营养微生物进一步包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第二外源核酸分子，并且所述重组氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的甲硫氨酸，如本文所述。在进一步的实施方案中，编码的来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或多种多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、高丝氨酸O-转琥珀酰转移酶(例如，metA)、O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶(例如，metB)、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。在特殊的实施方案中，第二外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者，其中高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰转移酶或两者任选地被过表达，可操作地连接至核酸表达控制序列、去调控或其任意组合。在某些其他实施方案中，第二外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者，其中高丝氨酸O-乙酰转移酶,O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或两者任选地被过表达，可操作地连接至核酸控制序列，去调控或其任意组合。
[0110] 在一些实施方案中，具有编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的第一外源核酸分子的重组氢营养微生物进一步包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或多种多肽的第二外源核酸分子，并且进一步具有(a)被敲除或具有减小的活性的一种或多种赖氨酸生物合成途径多肽，(b)被敲除或具有减小的活性的一种或多种苏氨酸生物合成途径多肽，(c)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甘氨酸生物合成途径多肽，(d)被敲除或具有减小的活性的一种或多种甲硫氨酸降解途径多肽(例如，metK)或(e)其任意组合。在某些实施方案中，编码二氢吡啶二羧酸合酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码活性减小的二氢吡啶二羧酸合酶突变体、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。
[0111] 在任一上述重组氢营养微生物中，第一外源核酸分子被整合到基因组中或第一外源核酸分子处于自我复制载体中。另外，在任一上述重组氢营养微生物中，重组氢营养微生物是赖氨酸营养缺陷型、苏氨酸营养缺陷型、甘氨酸营养缺陷型或其任意组合。
[0112] 在某些实施方案中，如本文所述的氢营养微生物可以被改造以表达或过量产生天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)或二氢吡啶二羧酸合酶(EC 4.3.3.7)，并且任选地被改造成还表达或过量产生LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(EC 2.6.1.83)、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4.1.16)或两者。在某些实施方案中，氢营养微生物被改造以表达或过量产生二氢吡啶二羧酸合酶(EC 4.3.3.7)、二氢吡啶二羧酸还原酶(EC 1.3.1.26)和LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(EC 2.6.1.83)。在进一步的实施方案中，氢营养微生物被改造以表达或过量产生天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)、二氢吡啶二羧酸合酶(EC 4.3.3.7)、二氢吡啶二羧酸还原酶(EC 1.3.1.26)、LL-二氨基庚二酸氨基转移酶(EC 2.6.1.83)和任选地二氨基庚二酸脱羧酶(EC 4.1.1.20)。在这些实施方案中的任一个中，氢营养微生物可以进一步任选地表达或过量产生天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)以便产生，例如，可检测到的或过量的赖氨酸。在这些实施方案中的任一个中，氢营养微生物可以编码抗赖氨酸的反馈抑制的突变的LysC(EC 2.7.2.4)或突变的AK/HD-I(EC 2.7.2.4/EC 1.1.1.3)(例如，核酸位置G1297A，其对应于氨基酸改变G433R)。
[0113] 例如，为了表达或过量产生天冬氨酸激酶，来自大肠杆菌(thrA)、大肠杆菌(metL)、大肠杆菌(lysC)、谷氨酸棒杆菌(lysC)或海沼甲烷球菌(lysC)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源性天冬氨酸激酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的天冬氨酸激酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAF18822.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号CAF30573.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00291.1)、瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47522.1)、大肠杆菌K-12亚株W3110 thrA(GenBank登录号BAB96579.2)；大肠杆菌K-12亚株W3110metL(GenBank登录号BAE77370.1)；大肠杆菌K-12亚株W3110 lysC(GenBank登录号BAE78026.1)。
[0114] 在一些实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列或其功能片段基于来自大肠杆菌K-12亚株W3110的thrA、metL或lysC氨基酸序列并且分别与Genbank登录号BAB96579.2、BAE77370.1或BAE78026.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少
95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的天冬氨酸激酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号BAB96579.2、BAE77370.1或BAE78026.1中给出的序列相同或包含这些天冬氨酸激酶的共有序列或包含多种已知天冬氨酸激酶多肽的共有序列。在特殊的实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列是在氨基酸位置G330、S345、S352和G433中的任一个或多个处突变(成，例如，天冬氨酸、苯丙氨酸或精氨酸)的大肠杆菌ThrA蛋白(GenBank登录号BAB96579.2)或是在氨基酸位置T342处突变(成，例如，异亮氨酸)的大肠杆菌LysC蛋白(GenBank登录号
BAE78026.1)。
[0115] 在某些实施方案中，天冬氨酸激酶氨基酸序列或其功能片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号CAF18822.1或CAF30573.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的天冬氨酸激酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号CAF18822.1、CAF30573.1、AFD00291.1或ADC47522.1中给出的序列相同或包含这些天冬氨酸激酶的共有序列或包含多种已知天冬氨酸激酶多肽的共有序列。
[0116] 例如，为了表达或过量产生二氢吡啶二羧酸合酶，来自谷氨酸棒杆菌(DapA)或海沼甲烷球菌(DapA)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源二氢吡啶二羧酸合酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的二氢吡啶二羧酸合酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAF20312.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号CAF30132.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFC99231.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47521.1)。
[0117] 在某些实施方案中，二氢吡啶二羧酸合酶氨基酸序列或其功能片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号CAF20312.1或CAF30132.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的二氢吡啶二羧酸合酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号CAF20312.1、CAF30132.1、AFC99231.1或ADC47521.1中给出的序列相同或包含这些二氢吡啶二羧酸合酶的共有序列或包含多种已知二氢吡啶二羧酸合酶多肽的共有序列。
[0118] 例如，为了表达或过量产生LL-二氨基庚二酸氨基转移酶，来自海沼甲烷球菌或瘤胃甲烷短杆菌(DapL)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源LL-二氨基庚二酸氨基转移酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的LL-二氨基庚二酸氨基转移酶多肽来自海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号Q6LX26.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC46792.1)。
[0119] 在某些实施方案中，LL-二氨基庚二酸氨基转移酶氨基酸序列或其功能片段基于海沼甲烷球菌S2或瘤胃甲烷短杆菌M1的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号Q6LX26.1或ADC46792.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的LL-二氨基庚二酸氨基转移酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号Q6LX26.1或ADC46792.1中给出的序列相同或包含这些LL-二氨基庚二酸氨基转移酶的共有序列或包含多种已知LL-二氨基庚二酸氨基转移酶多肽的共有序列。
[0120] 例如，为了表达或过量产生内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶，来自谷氨酸棒杆菌(lysC)或海沼甲烷球菌(lysC)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAF21279.1)或破伤风梭菌(Clostridium tetani)E88(Genbank登录号AAO36992.1)。
[0121] 在某些实施方案中，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶氨基酸序列或其功能片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或破伤风梭菌E88的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号CAF21279.1或AAO36992.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号CAF21279.1或AAO36992.1中给出的序列相同或包含这些内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的共有序列或包含多种已知内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶多肽的共有序列。
[0122] 在某些实施方案中，如本文所述的氢营养微生物可以被改造以表达或过量产生高丝氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.3)、高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)或苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)。在进一步的实施方案中，如本文所述的氢营养微生物可以被改造以表达或过量产生AK/HD-I(EC 2.7.2.4/EC 1.1.1.3)和高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)以便产生，例如，可检测到的或过量的苏氨酸。在又进一步的实施方案中，如本文所述的氢营养微生物可以被改造以表达或过量产生AK/HD-I(EC 2.7.2.4/EC 1.1.1.3)、高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)和苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)以便产生，例如，可检测到的或过量的苏氨酸。在这些实施方案中的任一个中，氢营养微生物可以进一步任选地表达或过量产生天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)。在这些实施方案中的任一个中，氢营养微生物可以编码抗苏氨酸的反馈抑制的突变的AK/HD-I(EC 2.7.2.4/EC 1.1.1.3)(例如，G1297A)。
[0123] 例如，为了表达或过量产生高丝氨酸脱氢酶，来自谷氨酸棒杆菌(hom)或海沼甲烷球菌(hom)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源高丝氨酸脱氢酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的高丝氨酸脱氢酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号BAB98576.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号CAF31258.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00624.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC46990.1)。
[0124] 在某些实施方案中，高丝氨酸脱氢酶氨基酸序列或其功能片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号BAB98576.1或CAF31258.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的高丝氨酸脱氢酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号
BAB98576.1、CAF31258.1、AFD00624.1或ADC46990.1中给出的序列相同或包含这些高丝氨酸脱氢酶的共有序列或包含多种已知高丝氨酸脱氢酶多肽的共有序列。
[0125] 例如，为了表达或过量产生高丝氨酸激酶，来自大肠杆菌(thrB)、谷氨酸棒杆菌(thrB)或海沼甲烷球菌(thrB)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源高丝氨酸激酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的高丝氨酸激酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号BAB98577.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号CAF29851.1)、大肠杆菌K-12亚株W3110thrB(GenBank登录号BAB96580.2)或Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFC99758.1)。
[0126] 在某些实施方案中，高丝氨酸激酶氨基酸序列或其功能片段基于大肠杆菌K-12亚株W3110、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号BAB96580.2、BAB98577.1或CAF29851.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。
在其他实施方案中，重组编码的高丝氨酸激酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号BAB96580.2、BAB98577.1、CAF29851.1或AFC99758.1中给出的序列相同或包含这些高丝氨酸激酶的共有序列或包含多种已知高丝氨酸激酶多肽的共有序列。
[0127] 例如，为了表达或过量产生苏氨酸合酶，来自大肠杆菌(thrC)、谷氨酸棒杆菌(thrC)或海沼甲烷球菌(thrC)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源苏氨酸合酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的苏氨酸合酶多肽来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号BAB99613.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号CAF29691.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00584.1)、大肠杆菌K-12亚株W3110thrC(GenBank登录号BAB96581.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47342.1)。
[0128] 在某些实施方案中，苏氨酸合酶氨基酸序列或其功能片段基于大肠杆菌K-12亚株W3110、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032或海沼甲烷球菌S2的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号BAB96581.1、BAB99613.1或CAF29691.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的苏氨酸合酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号BAB96581.1、BAB99613.1、CAF29691.1、AFD00584.1或ADC47342.1中给出的序列相同或包含这些苏氨酸合酶的共有序列或包含多种已知苏氨酸合酶多肽的共有序列。
[0129] 在某些实施方案中，氢营养微生物可以直接将硫源诸如H2S直接结合至甲硫氨酸生物合成途径中。产生的或存在的用于被氢营养微生物使用的任何硫化物都可以进入高半胱氨酸生物合成途径，其中O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶将H2S结合到O-乙酰高丝氨酸中以产生高半胱氨酸，其可以进一步被甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)转化成甲硫氨酸。
[0130] 例如，如本文所述的氢营养微生物可以被改造以表达或过量产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(EC 2.5.1.49)，其可以将H2S结合到O-乙酰基-高丝氨酸中以产生高半胱氨酸，并且任选地被改造以表达或过量产生钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶(EC 2.1.1.13)或钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶(也被称为高半胱氨酸甲基转移酶)(EC 2.1.1.14)从而将高半胱氨酸转变成甲硫氨酸。
[0131] 为了表达或过量产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，来自Methanocella conradii或瘤胃甲烷短杆菌的一种或多种基因可以被引入到本公开的氢营养微生物(例如，非天然的或重组产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，非天然的或重组产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽来自Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00350.1)、瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47419.1或ADC46998.1)、艰难梭菌(Clostridium difficile)T19(Genbank登录号ERM48664.1)、肉毒梭菌A亚株(Clostridium botulinum A str.)ATCC 3502(Genbank登录号CAL83417.1)、Leptospira meyeri(Genbank登录号P94890.1)或类球红细菌
(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1(Genbank登录号YP_351901.2)。
[0132] 在某些实施方案中，O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶氨基酸序列或其功能片段基于Methanocella conradii HZ254或瘤胃甲烷短杆菌M1的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号AFD00350.1或ADC47419.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号AFD00350.1,ADC47419.1、ADC46998.1、CCL83415.1或CAL83417.1中给出的序列相同或包含这些O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的共有序列或包含多种已知O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的共有序列。
[0133] 在任一上述O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶中，非天然的或重组的氢营养微生物进一步被改造以表达、过表达或过量产生高丝氨酸O-乙酰转移酶，如本文所述。
[0134] 在进一步的实施方案中，如本文所述的氢营养微生物可以被改造以表达或过量产生钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶(EC 2.1.1.13)或钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶(还被称为高半胱氨酸甲基转移酶)(EC 2.1.1.14)，并且任选地被改造成还表达或过量产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
[0135] 例如，为了表达或过量产生钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶，来自大肠杆菌(metH)、谷氨酸棒杆菌(metH)或艰难梭菌的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，非天然的甲烷氧化菌)中并且在氢营养微生物(例如，非天然的甲烷氧化菌)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶多肽来自大肠杆菌K-12亚株MG1655(Genbank登录号AAC76832.1)、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号BAB98900.1)、艰难梭菌F665(Genbank登录号ERM51559.1)或Psuedomonas putida GB-1(Genbank登录号ABY97885.1)。
[0136] 在某些实施方案中，钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶氨基酸序列或其功能片段基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的氨基酸序列并且与Genbank登录号BAB98900.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号AAC76832.1、BAB98900.1、ERM51559.1或ABY97885.1中给出的序列相同或包含这些钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的共有序列或包含多种已知钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶多肽的共有序列。
[0137] 在其他实施方案中，例如，为了表达或过量产生甲硫氨酸合酶，来自大肠杆菌(metE或metB12)、谷氨酸棒杆菌(metE)或海沼甲烷球菌(metE)的一种或多种基因可以被引入到氢营养微生物(例如，非天然的或重组产烷生物)中并且在氢营养微生物(例如，非天然的或重组产烷生物)中表达或过表达，由此产生或过量产生外源钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶多肽来自大肠杆菌K-12亚株MG1655(Genbank登录号AAC76832.1)、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Genbank登录号CAF19845.1)、海沼甲烷球菌S2(Genbank登录号NP_987521.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbank登录号AFD00421.1)或瘤胃甲烷短杆菌M1(Genbank登录号ADC47470.1)。
[0138] 在某些实施方案中，钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶氨基酸序列或其功能片段基于海沼甲烷球菌S2或瘤胃甲烷短杆菌M1的氨基酸序列并且分别与Genbank登录号NP_987521.1或ADC47470.1中给出的序列或其功能片段至少75％、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在其他实施方案中，重组编码的钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶具有对宿主细胞密码子优化的氨基酸序列或与Genbank登录号AAC76832.1、CAF19845.1、NP_987521.1、AFD00421.1或ADC47470.1中给出的序列相同或包含这些钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶的共有序列或包含多种已知钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶多肽的共有序列。
[0139] 在任一上述甲基转移酶实施方案中，非天然的或重组氢营养微生物进一步被改造以表达、过表达或过量产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，如本文中所述。
[0140] 在任一上述非天然的或重组氢营养微生物实施方案中，本公开提供了作为产甲烷古细菌的氢营养微生物，诸如甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷卵圆形菌属、甲烷暖球菌属、甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷类球菌属、甲烷粒菌属、甲烷囊菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷嗜热杆菌属、甲烷嗜热球菌属、甲烷热菌属或甲烷炎菌属。
[0141] 在任一上述非天然的或重组氢营养微生物实施方案中，本公开提供了作为特定产甲烷古细菌物种的氢营养微生物。示例性的产甲烷古细菌物种，诸如嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、徳氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、依氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆菌、耐酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、乌兹甲烷短杆菌、沃丽尼甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、沼泽产甲烷胞菌、Methanothermobacter marburgensis、热自养甲烷嗜热杆菌、嗜热弯曲甲烷嗜热杆菌、嗜热甲烷嗜热杆菌、沃氏甲烷嗜热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、Methanoculleus chikuoensis、深海甲烷囊菌、嗜冷产甲烷菌、泥游产甲烷菌、海洋产甲烷菌、Methanomicrococcus blatticola、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、联合甲烷鬃毛菌、竹节状甲烷鬃毛菌、浮游甲烷鬃毛菌、嗜热甲烷鬃毛菌、醋酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、可活动甲烷微菌、风产甲烷球菌、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、嗜热无机营养甲烷嗜热球菌、坎氏甲烷火菌、嗜热自养甲烷嗜热杆菌、沸热甲烷暖球菌、印度甲烷暖球菌、下层甲烷暖球菌、詹氏甲烷暖球菌和火山甲烷暖球菌。
[0142] 在任一上述非天然的或重组氢营养微生物实施方案中，本公开提供了氢营养微生物，其包含产生细胞色素或不产生细胞色素的产甲烷古细菌。示例性的不产生细胞色素的产甲烷古细菌包括海沼甲烷球菌或万氏甲烷球菌。示例性的产生细胞色素的产甲烷古细菌是巴氏甲烷八叠球菌或马氏甲烷八叠球菌。
[0143] 在任一上述非天然的或重组氢营养微生物实施方案中，本公开提供了作为细菌的氢营养微生物。在某些实施方案中，氢营养型生物可以是代谢合成气或CO的微生物，诸如梭菌属、穆尔氏菌属、热球菌属、真杆菌属、产醋菌属、醋杆菌属、脱硫杆菌属、厌氧醋菌属、丁酸杆菌属、氧化碳嗜热菌属或消化链球菌属。示例性的梭菌属物种包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉格利梭菌、食氧化碳梭菌、伍氏梭菌和C.neopropanologen并且示例性的丁酸杆菌属物种是食甲基丁酸杆菌。在某些其他实施方案中，氢营养型生物可以是氢氧混合气细菌，诸如钩虫贪铜菌、嗜热氢杆菌、海洋氢弧菌或幽门螺杆菌。
[0144] H2/COx底物
[0145] 氢制备涉及一系列重整、调整和分离步骤，其中那些步骤中的几个(例如，蒸汽重整、自热重整、高温变换、低温变换、CO2涤气和变压
吸附)可以提供原料，所述原料本身或与一种或多种其他气体流组合可以提供可用作本公开的氢营养微生物和方法的原料的H2/COx底物。
[0146] 作为背景，氢制备可以涉及单步骤或多步骤重整，部分氧化或气化从而产生H2/COx底物诸如合成气，结合高温
水煤气变换(HTS)反应、低温水煤气变换(LTS)反应或两者。在一些方法中，通过使用变压吸附(PSA)与分子筛移除碳氧化物，其将基本上纯的氢(H2)气体流从包含一些残余H2气以及各种量的二氧化碳(CO2)、一氧化碳(CO)和甲烷(CH4)的尾气中分离。在某些实施方案中，二氧化碳可以任选地在将气体(例如，合成气)接受PSA之前进行涤气。取决于所使用的合成气制备工艺和是否对二氧化碳进行涤气，尾气将包含不同比率的H2、CO2、CO和CH4。在一些实施方案中，用于本公开的方法中的H2/COx底物是包含PSA尾气和H2气的混合物的气体流混合物。
[0147] 例如，结合HTS的甲烷蒸汽重整产生的气体流具有占大多数的H2(约75％)和CO2(约20％)，以及一些CH4(约5％)和非常少的CO或不含CO。在另一个
实施例中，甲烷蒸汽重整结合LTS产生的气体流具有占大多数的H2(约75％)和CO(约10％)，以及一些CO2(约5％)和CH4(约1％)。在又另一实施例中，甲烷蒸汽重整结合HTS和PSA产生的尾气具有占大多数的H2(约30％)和CO2(约45％)，以及相当量的CO(约10％)和CH4(约15％)。在此最后一个实施方案中，如果包括CO2涤气步骤，则尾气将包含占大多数的H2(约50％)、CH4(约30％)和CO(约
20％)，以及少量的CO2(约1％)。在某些实施方案中，PSA尾气与从PSA产生的管道H2混合从而产生目标H2/COx底物，诸如H2:CO2比率为约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的H2/COx底物。
[0148] 甲烷的蒸汽重整可以提供分别为约1:7至约1:15的CO2与H2的原料比率，其中其他组分可以包括CO、CH4和H2O。备选地，甲烷可以用CO2重整，这称为干重整。甲烷的干重整可以提供分别为约1:5至约1:15的CO2与H2的原料比率，其中其他组分可以包括CO、CH4和H2O。
[0149] 部分氧化(催化的或非催化的)和自热重整使用氧而不是水作为与天然气的共反应物。部分氧化和自热重整可以提供的CO2与H2的原料比率为约1:20，其中其他组分可以包括CO、CH4和H2O。
[0150] 气化(用空气或氧部分氧化含碳物质(例如，
液化天然气、石脑油、
沥青、煤、生物质等))可以提供被本公开的氢营养微生物和方法所利用的H2/COx原料。例如，煤的气化提供的CO2与H2的原料比率分别为约1:1.1至约1:11，其中其他组分可以包括CO、CH4、N2和H2O。
[0151] 氨合成涉及一系列重整和调整步骤，其中那些步骤中的4个(蒸汽重整、自热重整、高温变换、低温变换)可以提供被本公开的氢营养微生物和方法所利用的H2/COx原料。对于这些不同方法中的每一个，提供的CO2与H2的原料比率分别为约1:3至约1:10，其中其他组分可以包括CO、CH4、N2和H2O。
[0152] 甲醇合成涉及低温重整、蒸汽重整和自热重整的步骤，所有这些步骤可以提供被本公开的氢营养微生物和方法所利用的H2/COx原料。对于这三个方法中的每一个，产生的CO2与H2的原料比率分别为约1:7至约1:12，其中其他组分可以包括CO、CH4和H2O。
[0153] 综合钢厂组合了多种工艺，包括炼
焦炉(用来由煤制备
焦炭)、
高炉(用来制备
生铁)和氧气转炉(用于炼钢)。在某些实施方案中，在综合钢厂中的
直接还原利用重整天然气作为还原剂(代替焦炭)来制备生铁。这些炉的每一个，以及直接还原重整(其产生炉顶气)，可以产生的CO2与H2的原料比率分别为约8:1(来自高炉或氧气转炉)至约1:32(来自
炼焦炉)，其中其他组分可以包括CO、CH4、C2H6、C3H8、N2和H2O。
[0154] 在H2/COx底物的任一上述来源中，如此产生的H2/COx原料可以混合任何其他产生的H2/COx原料或与H2、CO2、CO或其任意组合混合以产生目标H2/COx底物，诸如H2:CO2比率为约4:1或3:1的底物。在某些实施方案中，用于例如被产烷生物利用的H2/COx底物包含的H2:CO2比率为约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1，并且任选地CO的总量不超过约0.1％、0.2％、0.3％、
0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、
7.0％、8.0％、9.0％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或20％。在其他实施方案中，用于例如被梭菌属利用的H2/COx底物包含的H2:(CO2+CO)比率为约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1，并且任选地CO的总量为至少约1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在这些实施方案中的任一个中，H2/COx底物可以包含PSA尾气与H2气的共混物。
[0155] 在任一上述非天然的或重组氢营养微生物实施方案中，本公开提供了氢营养微生物，其利用、代谢、氧化或转化由H2与CO2或CO或两者以及任选地如本文所述的各种其他组分组成的H2/COx底物。在某些实施方案中，H2/COx底物是H2、CO2和CO，其中存在的CO多于CO2，任选地具有如本文所述的各种其他组分。在进一步的实施方案中，H2/COx底物是H2、CO2和CO，其中存在的CO2多于CO，任选地具有如本文所述的各种其他组分。在还进一步的实施方案中，H2/COx底物是H2、CO2和CO，其中存在的CO多于CO2和H2两者，任选地具有如本文所述的各种其他组分。在某些情况下，代谢H2/COx的微生物可以利用H2作为能源，其中x是1或2的COx作为碳源或利用H2和COx作为能源，并且COx作为碳源。
[0156] 在任一上述非天然的或重组氢营养微生物实施方案中，本公开提供了H2/COx底物，其可以例如通过天然气或液体烃(例如，乙烷、丙烷、石油脑)的蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化，在氢制备内，在氨合成内，在甲醇合成内，通过炼钢或通过煤、石油脑、渣油、生物质或废物的气化来制备。在某些实施方案中，通过上述任一重整方法产生的H2/COx底物可以进一步通过水-煤气变换反应来调整。另外，通过上述任一方法产生的一个或多个气体流可以与氢、一氧化碳或二氧化碳的其他来源掺混以产生或制备H2/COx底物，包括管道氢、管道二氧化碳、二氧化碳洗涤器尾气、
烟道气、乙烷
裂解炉尾气、重整装置尾气或氯合成尾气。在一些实施方案中，CO2与H2的原料比率分别为约1:50至约10:1。在进一步的实施方案中，CO2与H2的原料比率分别为约1:3至约1:5。
[0157] 培养方法
[0158] 多种培养方法可以用于本文所述的非天然的或重组的氢营养微生物(例如，细菌、产甲烷古细菌)。例如，氢营养微生物可以通过分批培养或连续培养方法生长。在某些实施方案中，培养物生长在受控培养装置中，诸如
发酵罐、生物反应器、中空
纤维膜生物反应器、泡罩塔(bubble column)生物反应器、滴流床(trickle bed)生物反应器等。
[0159] 经典的分批培养方法是封闭的系统，其中培养基的组成在培养开始时设定，并且在培养过程期间不通过外部进行变更。因此，在培养过程开始时，向培养基中接种所需的氢营养微生物(例如，产烷生物)并且允许出现生长或代谢活性，而不向系统中添加任何物质。通常，“分批”培养是关于添加碳源、气体原料和培养基组分的分批法，其中允许废气离开，并且经常试图控制其他因素，诸如pH。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组合物不断地更换直至培养结束的时候。在分批培养内，细胞缓慢地通过静态停滞期至高速生长对数期并且最终达到其中生长速率消失或停止的静止期。如果没有处理，处于静止期的细胞将最终死亡。处于对数生长期的细胞在一些系统中经常担负着终产物或中间体的大量生产。在其他系统中可以获得静止期或指数期后生产。
[0160] 分批补料系统是对标准分批系统的变化形式。分批补料培养方法包括这样的分批系统，其改良在于随着培养的进展增量地添加底物和潜在的培养基组分。当分解代谢阻遏易于抑制细胞的代谢并且需要在培养基中具有有限量的底物时分批补料系统是有用的。在气体底物发酵中，系统关于气体底物来说是连续的(因为废气可以被移除)并且关于液体(培养基)是分批补料培养。分批和分批补料培养方法在本领域中是常见的和已知的(参见，例如，Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology(生物技术：工业微生物学手册)，第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.36:227,1992)。
[0161] 连续培养是“开放式”系统，其中向生物反应器连续添加已知成分培养基并且同
时移除等量的条件培养基(具有或不具有生物质或细胞保留)用于加工。连续培养通常将细胞保持在恒定的高液相
密度，其中细胞主要处于对数期生长。备选地，连续培养可以涉及生物质、细胞保留或细胞固定，其中原料和营养素连续添加并且有价值的产物、副产物和废产物可以连续地从细胞团移除。可以通过多种方法，诸如通过过滤、离心或沉降来进行细胞保留。细胞固定可以使用大范围的由天然和/或合成材料构成的固相载体进行。
[0162] 连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任意数目的因素。例如，一种方法可以以固定的速率保持有限的营养素(例如，碳源、氮水平、氢水平、磷水平)并且允许调节所有其他参数。在其他系统中，可以连续地改变影响生长的许多因素，而通过培养基
浊度测量的细胞浓度则保持恒定。在某些实施方案中，限制氢营养型生物质生长以增加产物与生物质之比。对于连续培养方法调节营养素和生长因素的方法以及使产物形成速率最大化的技术在本领域中是众所周知的(参见Brock，1989)。
[0163] 液相生物反应器(例如，搅拌槽、填充床、一液相、两液相、中空纤维膜)在本领域中是众所周知的并且可以用于氢营养微生物的生长。
[0164] 多相生物反应器可以用在本公开的方法中(例如，鼓泡反应器、滴流床反应器(固定床或填充床)、
流化床反应器)。泡罩塔是其中以气泡形式的气体与液体
接触的装置。滴流床反应器使用气体和液体的并流或逆流流动来使培养物生长。流化床反应器包括使
流体(气体或液体)以足以使固体悬浮并且使其如同是流体那样表现的高速度通过颗粒状固体材料。多相生物反应器的一个目的是
混合液相和气相，其中气体被氢营养微生物或高或低程度地消耗，这取决于
质量转移和化学反应的强度。各种类型的多相生物反应器在本领域中是众所周知的并且可以用于在本公开的方法中培养氢营养微生物。
[0165] 在本公开中描述的氢营养微生物可以作为分离的纯培养物与可以辅助生长的一种或多种异源非氢营养微生物一起生长或与氢营养微生物的一个或多个不同的菌株或菌种组合以产生混合培养物。
[0166] 在其他方面，本公开提供了制备天冬氨酸途径氨基酸或含天冬氨酸途径氨基酸的饲料添加剂的方法，所述方法包括培养上述任一种非天然的或重组的氢营养微生物达足以产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸的时间，其中所述非天然的或重组的氢营养微生物：(a)表达一种或多种具有与亲代氢营养微生物相比的增加的活性的天冬氨酸途径酶；(b)过表达一种或多种天冬氨酸途径酶；或(c)包含对一种或多种天冬氨酸途径酶的改变的调控，其中所述非天然的氢营养微生物产生比亲代氢营养微生物更高水平的一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0167] 在某些实施方案中，本公开提供了制备天冬氨酸途径氨基酸或含天冬氨酸途径氨基酸的饲料添加剂的方法，所述方法包括在存在H2/COx底物的条件下在足以允许表达编码来自用于生物合成天冬氨酸家族氨基酸的一个或多个途径的多肽的外源多核苷酸的条件下培养本公开的重组的、分泌天冬氨酸途径氨基酸的氢营养微生物达足以允许表达所述外源多核苷酸的时间，其中一种或多种天冬氨酸途径氨基酸在培养基中以比由亲代氢营养微生物产生的所述一种或多种天冬氨酸途径氨基酸更高的水平产生和积累。
[0168] 在任一上述方法中，氢营养微生物可以在发酵罐或生物反应器诸如液相、泡罩塔或滴流床生物反应器中培养。
[0169] 在如本文公开的任一上述使用非天然的或重组的氢营养微生物(例如，产烷生物)产生天冬氨酸途径氨基酸的方法中，气体原料是H2/COx底物，其中所述原料包含H2与CO2或CO或CO2和CO两者以及任选地如本文所述的各种其他组分。在某些实施方案中，H2/COx底物是合成气，诸如通过天然气或液体烃的蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化，通过水-煤气变换反应调整，通过氨合成，通过甲醇合成，通过炼钢或通过煤、生物质或废物的气化所产生的合成气。
[0170] 在如本文公开的任一上述使用非天然的或重组的氢营养微生物(例如，产烷生物)产生天冬氨酸途径氨基酸的方法中，气体底物是H2/COx底物，其可以例如通过天然气或液体烃(例如，乙烷、丙烷、石油脑)的蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化，通过水-煤气变换反应调整，在氢制备内，在氨合成内，在甲醇合成内，通过炼钢或通过煤、石油脑、渣油、生物质或废物的气化来制备。在某些实施方案中，H2/COx底物是如此制备的任意气体流与氢、一氧化碳、二氧化碳或其任意组合的一种或多种其他来源的共混物，所述其他来源包括管道氢、管道二氧化碳、二氧化碳洗涤器尾气、烟道气、乙烷裂解炉尾气、重整装置尾气、氯合成尾气或其任意组合。
[0171] 在如本文公开的任一上述使用非天然的或重组的氢营养微生物(例如，产烷生物)产生天冬氨酸途径氨基酸的方法中，被培养的氢营养微生物是产甲烷古细菌，诸如甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷卵圆形菌属、甲烷暖球菌属、甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷类球菌属、甲烷粒菌属、甲烷囊菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷嗜热杆菌属、甲烷嗜热球菌属、甲烷热菌属或甲烷炎菌属。
[0172] 在某些实施方案中，非天然的或重组的氢营养微生物可以是嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、徳氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、依氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆菌、耐酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、乌兹甲烷短杆菌、沃丽尼甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、沼泽产甲烷胞菌、Methanothermobacter marburgensis、热自养甲烷嗜热杆菌、嗜热弯曲甲烷嗜热杆菌、嗜热甲烷嗜热杆菌、沃氏甲烷嗜热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、Methanoculleus chikuoensis、深海甲烷囊菌、嗜冷产甲烷菌、泥游产甲烷菌、海洋产甲烷菌、Methanomicrococcus blatticola、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、联合甲烷鬃毛菌、竹节状甲烷鬃毛菌、浮游甲烷鬃毛菌、嗜热甲烷鬃毛菌、醋酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、可活动甲烷微菌、风产甲烷球菌、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、嗜热无机营养甲烷嗜热球菌、坎氏甲烷火菌、嗜热自养甲烷嗜热杆菌、沸热甲烷暖球菌、印度甲烷暖球菌、下层甲烷暖球菌、詹氏甲烷暖球菌和火山甲烷暖球菌。
[0173] 在进一步的实施方案中，氢营养微生物是可以代谢合成气的细菌。在某些实施方案中，代谢合成气的细菌是自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉格利梭菌、食氧化碳梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌、Clostridium neopropanologen或其任意组合。
[0174] 在任一上述方法中，氢营养微生物是嗜温的、嗜热的、超嗜热的或其组合。在任一上述方法中，氢营养微生物是专性厌氧微生物或兼性厌氧微生物。在任一上述方法中，氢营养微生物是专性氢营养型或兼性氢营养型。
[0175] 在某些实施方案中，如本文所提供的将H2/COx底物转化成目的天冬氨酸途径氨基酸的方法将产生至少约或多至1千克(kg)，至少约或多至10kg、至少约或多至100kg、至少约或多至1,000kg、至少约或多至10,000kg、至少约或多至50,000kg、至少约或多至100,000kg、至少约或多至250,000kg、至少约或多至500,000kg或更多的目的氨基酸/天。在某些实施方案中，以约100,000公吨(MT)/年(即，1亿千克/年或300,000千克/天)、约75,000MT/年(或225,000千克/天)、约50,000MT/年(或150,000千克/天)、约25,000MT(或75,000千克/天)或约10,000MT/年(或30,000千克/天)产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0176] 制备氨基酸的系统
[0177] 在其他的方面，本公开提供了用于制备天冬氨酸途径氨基酸的系统，其包括包含H2/COx底物的气体源；生物反应器，所述生物反应器包含上述任一种或多种非天然的或重组的氢营养微生物，所述非天然的或重组的氢营养微生物(a)表达一种或多种具有与亲代氢营养微生物相比的增加的活性的天冬氨酸途径酶；(b)过表达一种或多种天冬氨酸途径酶；或(c)包含对一种或多种天冬氨酸途径酶的改变的调控；和布置在所述气体来源和所述生物反应器之间以允许所述气体流入到所述生物反应器中的连接器；其中所述非天然的氢营养微生物代谢所述H2/COx底物从而与亲代氢营养微生物相比过量产生一种或多种天冬氨酸途径氨基酸。
[0178] 在任一上述系统中，H2/COx底物被转变成生物材料，诸如动物饲料或
肥料。在某些实施方案中，H2/COx底物被同化成富含一种或多种天冬氨酸家族氨基酸诸如赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或其任意组合的生物材料。在进一步的实施方案中，所得的一种或多种天冬氨酸家族氨基酸被纯化并用作动物饲料、
食品添加剂或
营养补充剂。在又其他实施方案中，富含一种或多种天冬氨酸家族氨基酸的生物质被用于动物饲料、食品添加剂或营养补充剂。
[0179] 在如本文公开的任一上述使用非天然的或重组的氢营养微生物(例如，产烷生物)产生天冬氨酸途径氨基酸的系统中，气体原料是H2/COx底物，其中所述原料包含H2与CO2或CO或CO2和CO两者以及任选地如本文所述的各种其他组分。在某些实施方案中，H2/COx底物是合成气，诸如通过天然气或液体烃(例如，乙烷、丙烷、石油脑)的蒸汽重整、干重整、自热重整、催化部分氧化或部分氧化，通过水-煤气变换反应调整，在氨合成内，在甲醇合成内，通过炼钢或通过煤、石油脑、渣油、生物质或废物的气化所产生的合成气。在某些实施方案中，H2/COx底物是如此制备的任意气体流与氢、一氧化碳、二氧化碳或其任意组合的一种或多种其他来源的共混物，所述其他来源包括管道氢、管道二氧化碳、二氧化碳洗涤器尾气、烟道气、乙烷裂解炉尾气、重整装置尾气、氯合成尾气或其任意组合。
[0180] 在如本文公开的任一上述使用非天然的或重组的氢营养微生物(例如，产烷生物)产生天冬氨酸途径氨基酸的系统中，被培养的氢营养微生物是产甲烷古细菌，诸如甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷卵圆形菌属、甲烷暖球菌属、甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷类球菌属、甲烷粒菌属、甲烷囊菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷嗜热杆菌属、甲烷嗜热球菌属、甲烷热菌属或甲烷炎菌属。
[0181] 在某些实施方案中，非天然的或重组的氢营养微生物可以是嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、徳氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、依氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆菌、耐酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、乌兹甲烷短杆菌、沃丽尼甲烷短杆菌、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、沼泽产甲烷胞菌、Methanothermobacter marburgensis、热自养甲烷嗜热杆菌、嗜热弯曲甲烷嗜热杆菌、嗜热甲烷嗜热杆菌、沃氏甲烷嗜热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、Methanoculleus chikuoensis、深海甲烷囊菌、嗜冷产甲烷菌、泥游产甲烷菌、海洋产甲烷菌、Methanomicrococcus blatticola、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregula boonei、联合甲烷鬃毛菌、竹节状甲烷鬃毛菌、浮游甲烷鬃毛菌、嗜热甲烷鬃毛菌、醋酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、可活动甲烷微菌、风产甲烷球菌、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、嗜热无机营养甲烷嗜热球菌、坎氏甲烷火菌、嗜热自养甲烷嗜热杆菌、沸热甲烷暖球菌、印度甲烷暖球菌、下层甲烷暖球菌、詹氏甲烷暖球菌和火山甲烷暖球菌。
[0182] 在任一上述系统中，氢营养微生物是嗜温的、嗜热的、超嗜热的或其组合。在任一上述方法中，氢营养微生物是专性厌氧微生物或兼性厌氧微生物。在任一上述方法中，氢营养微生物是专性氢营养型或兼性氢营养型。实施例
[0183] 实施例1
[0184] 氢营养微生物的LYSC突变体
[0185] 第一步骤是分离海沼甲烷球菌(M.maripaludis)的抗反馈抑制lysC(天冬氨酸激酶)突变体。例如，一种或多种特定突变被改造进海沼甲烷球菌的天冬氨酸激酶基因中或通过将野生型或亲代海沼甲烷球菌暴露于毒性赖氨酸类似物，诸如S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)来鉴定自发天冬氨酸激酶突变体，并且鉴定能够在(耐受)AEC的存在下生长的海沼甲烷球菌。对毒性类似物的抗性可以是自发的或可以使用诱变剂诸如EMS诱导。毒性类似物可以与其他氨基酸类似物诸如甲硫氨酸或苏氨酸组合或可以单独使用，以选择耐受毒性类似物的海沼甲烷球菌突变体。另外，通过鉴定在调控剂诸如苏氨酸、赖氨酸或两者的组合的存在下不再对生长抑制易感的突变体来选择具有反馈抗性(去调控)的天冬氨酸激酶。此外，此反馈抗性可以是自发的，通过化学诱变剂诱导的或位点特异引入的。
[0186] 简言之，野生型海沼甲烷球菌Trel10在37℃在不含
酪蛋白氨基酸的25mL McCas培养基中(对于培养基配方，参见Sarmiento等.,Methods Enzymol.494:44,2011；其提到培养基McCV，并且此处使用的不含酪蛋白氨基酸或
酵母提取物)生长至大约0.20的OD600。将5mL培养物分配到两个厌氧Balch管中。向1个管中加入0.3mL甲磺酸乙酯(EMS，1:50稀释在不含Cas的McCas中)，并且向第二管加入0.3mL不含cas的McCas(对照)。将管用H2/CO2的80/20混合物加压至40PSIG并且在不振荡的条件下在37℃孵育1小时。1小时孵育后，释放压力并且从每个管移出0.5mL并接种在McCas琼脂板上以确定杀伤率。
[0187] 将剩余培养物分配至5个(经EMS处理的)或2个(对照)1.5无菌厌氧微量离心管中并且在1000g离心15分钟。去除上清液，通过重悬在1mL不含Cas的McCas中洗涤细胞沉淀物，并且再次在1000g离心15分钟。这样的洗涤重复2次以去除所有痕量的EMS。在最后一次洗涤后，将收获的细胞悬浮在200μL不含Cas的McCas中并转移至5mL不含Cas的McCas中用于复苏。将1mL 2.5％Na2S x 9H20加入至每个管中，并且用80/20H2/CO2将每个管加压至40PSIG并使其在37℃复苏过夜。第二天早上，通过离心将每种培养物浓缩至0.1mL并接种在含有0.1M苏氨酸和0.02M AEC的不含Cas的McCas平板上。将平板在具有10PSIG的80/20H2/CO2气体混合物的Oxoid厌氧罐中在37℃孵育。进行选择使得菌落仅在接种了经EMS处理的细胞的平板上生长。除非另外说明，所有工作在厌氧条件下进行。
[0188] 图1示出了当在赖氨酸和苏氨酸的存在下生长时EMS产生的lysC突变体Trel10-Mut333(其具有G333R突变(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的LysC氨基酸位置G277))的生长速率不受影响(在37℃孵育72小时后测量OD600)–换句话说，Trel10-Mut333的突变的天冬氨酸激酶不受赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制。图2示出了由Trel10-Mut333突变体产生的并通过HPLC鉴定的天冬氨酸途径氨基酸。在自动取样器上在自动化衍生反应中使用衍生
试剂邻苯二醛(OPA)并且柱前完成。将反应混合物在pH 10.2(经由
硼酸盐缓冲液)缓冲，其允许直接衍生化酸
水解蛋白/肽样品。使用3-巯基丙酸(3-MPA)将目的氨基酸首先与OPA反应。3-MPA结合到吲哚中降低了它们的疏水性，并且因此OPA-衍生物通过色谱洗脱。与亲代菌株相比，Trel10-Mut333突变体的产生谱如下(并且通常在鉴定的所有突变体中均相似，数据未示出)：丙氨酸(5mg/L)、赖氨酸(8mg/L)、苏氨酸(21mg/L)和甘氨酸(78mg/L)。
[0189] 海沼甲烷球菌lysC中的突变通过使用Qiagen DNAeasy Blood&Tissue Kit遵循用于革兰氏阴性细菌的规程提取基因组DNA来验证。使用Easy-A高保真聚合酶，利用正向引物(LysCfor1–5'GGGACGGCGCAACAAATGG3'；SEQ ID NO.:1)和反向引物(LysCrev1–5'GGAGATAGTGAGACCCCTGGAGT3'；SEQ ID NO.:2)扩增LysC靶标。将扩增的DNA与LysCfor1或LysCrev1混合并测序(Operon)。鉴定到一个自发突变体和8个化学诱导的突变体。除了以前在棒杆菌中鉴定到的位置G277处的突变(在此例中，G277R)以外，还发现了之前未在棒杆菌中鉴定的新的突变位置，包括S302P和G359E(根据来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的LysC的氨基酸位置的编号)。
[0190] 利用万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielli)进行类似的方法，其中使用万氏甲烷球菌SB(DSMZ 1224)的集落分离株并将其称为Trel15。万氏甲烷球菌的程序类似于海沼甲烷球菌所采用的程序，不同之处在于选择使用0.02M AEC而没有苏氨酸。液相色谱(LC)结果显示在AEC抗性突变体中赖氨酸产生增加。测序显示两个Trel15突变体在推定的LysC蛋白中具有突变。具体地，在位置F339G和K380Q(对应于万氏甲烷球菌的氨基酸位置)处。
[0191] Trel15LC数据显示氨基酸谱为0(未检测到)mg/L赖氨酸、50mg/L甘氨酸、2.5mg/L苏氨酸，而Trel15-Mut 339的氨基酸谱为8.6mg/L赖氨酸、37.5mg/L甘氨酸和6.1mg/L苏氨酸，Trel15-Mut380的氨基酸谱为4.3mg/L赖氨酸、41.5mg/L甘氨酸和6.0mg/L苏氨酸。
[0192] 实施例2
[0193] 过量产生氨基酸的氢营养微生物
[0194] 初始步骤是鉴定如实施例1中所述的lysC突变体。过量产生赖氨酸的第二步骤是使赖氨酸分支的下游途径失活。例如，高丝氨酸脱氢酶或高丝氨酸脱氢酶下游的任何基因被失活，其可包括用于苏氨酸生物合成和/或甲硫氨酸生物合成的基因。失活或减小的活性通过基因删除或通过选择通过自发突变或化学诱导突变的高丝氨酸、苏氨酸和/或甲硫氨酸营养缺陷型来完成，如本文所述。
[0195] 任选地，赖氨酸生物合成途径的任意基因被过表达，包括lysC、去调控的lysC、asd、dapA、dapB、dapL、lysA或其任意组合。例如，天然启动子被一种或多种更强的启动子替换或通过供应额外拷贝的由其天然启动子表达的基因或两者均有。例如，来自沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)的组蛋白样启动子(hmv)被可操作地连接至多种目的基因，包括dapA、dapAB或dapABL基因，从而形成如本文所述的用来转化海沼甲烷球菌株的多拷贝质粒。一种这样的菌株，Trel10-Mut333，在染色体上具有突变的lysC基因，该基因编码抗反馈的天冬氨酸激酶。表2示出了由过表达DapA、DapAB或DapABL的lysC突变体产生的天冬氨酸氨基酸。示例性的修饰的海沼甲烷球菌在表1中提供。
[0196] 表1.修饰的海沼甲烷球菌S2
[0197]
[0198] 另外，编码用于交替的赖氨酸生物合成途径的酶的外源基因被引入至氢营养微生物(例如，海沼甲烷球菌)中。例如，用于赖氨酸生物合成的ddh途径被插入到通常不具有或使用该途径的氢营养微生物中。海沼甲烷球菌的转化如Sarmiento等,2011所述进行。质粒DNA使用Qiagen质粒DNA提取
试剂盒如生产厂商所述进行纯化。
[0199] 实施例3
[0200] 在氢营养微生物中删除尿嘧啶磷酸核糖基转移酶和插入repA
[0201] 为了提高质粒转化效率，将lysC突变体海沼甲烷球菌Trel10-Mut333通过用编码复制蛋白A(repA，带有其自身的启动子)的基因替换尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(upp)基因(基因座MMP0680)而在基因组水平上修饰，称作Trel10-333UR。repA允许有效的转化任何具有repA的质粒，诸如来源于或基于含repA的pURB500质粒的质粒(参见Tumbula等,J.Bacteriol.179:2976,1997)。尿嘧啶磷酸核糖基转移酶活性的丧失赋予修饰的海沼甲烷球菌以6-氮杂尿嘧啶抗性表型。
[0202] 简言之，利用引物TKH_038(5'aaattatgaggcgcgcctccctgaagaagaagagag3',SEQ ID NO.:3)和TKH_039(5'tgcttattcggcgcgccagttccattttaccacc3',SEQ ID NO.:4)从海沼甲烷球菌S001的基因组DNA扩增repA基因(以及其启动子)(Walters等,App.Environ.Microbiol.77:2549,2011)。使用 HD克隆试剂盒(Clontech)将经
扩增的repA片段克隆进用AscI线性化的 TA载体中。最终的质粒命名为
pKH11。来自pKH11的XbaI-BamHI片段被克隆进用限制性酶NheI和BglII线性化的pMEV1中(Gardner WL(2000)Expression vectors for the methane-producing archaeon Methanococcus maripaludis(用于产甲烷古细菌海沼甲烷球菌的表达载体).专题，佐治亚大学)。得到的携带嘌呤霉素抗性基因的自杀载体被命名为pKH20。
[0203] 基本上如Sarmiento等(2011)所述将质粒pKH20转化到Trel10-Mut333中，并且在含有嘌呤霉素(2.5mg/L)的McCAS平板上选择转化体。将在嘌呤霉素存在下生长的转化体集落转移到补充了6-氮杂尿嘧啶(0.25mg/ml)的McCAS液体培养基中并生长过夜。将一部分过夜培养物转移到新鲜的补充了0.5mg/ml 6-氮杂尿嘧啶的McCAS培养基中并再次生长过夜。稀释培养物，然后将其铺在含有0.25mg/ml 6-氮杂尿嘧啶的McCAS平板上。5天后，将各个集落重复铺板在具有或不具有嘌呤霉素的McCAS平板上。不能在嘌呤霉素存在下生长的集落被转移到补充了6-氮杂尿嘧啶(0.25mg/ml)的McCAS液体培养基中以确认抗性。通过使用下列引物的PCR来验证在Trel10-Mut333基因组上repA基因对upp基因的替换：uptdelconf1(5'-caattactgaacccaaagaccat-3',SEQ ID NO.:5)和uptdelconf2(5'-
aatagttaccggcgttacaatca-3',SEQ ID NO.:6)。经验证upp基因被repA基因替换的6-氮杂尿嘧啶抗性/嘌呤霉素敏感性集落被命名为Trel10-333UR。
[0204] 实施例4
[0205] 氢营养微生物中的dapA缺失
[0206] 使用Sarmiento等(2011)中所述的基本上相同的无标记诱变法生成用于增加甲硫氨酸和苏氨酸产量的Trel10-333UR-ΔdA–dapA缺失的构建体。来自含有dapA基因的海沼甲烷球菌S2(Trel10)基因组的大约2.4kb片段以及上游和下游区使用引物DapAfor2(5'-tccctgatcgatagaaagtgtagt-3')(SEQ ID NO:12)和DapArev2(5'-ttgccgatgaaattaaagtgaaa-3')(SEQ ID NO:13)通过PCR合成，并克隆至质粒pTOPO中以形成pJB012。dapA基因的框内缺失片段通过使用利用引物DapAdelfor2(5'-
gcgggcgcgccgcataattacaccttatgcgttc-3',SEQ ID NO.:14)和DapAdelrev2(5'-
gcgggcgcgcctaatcacggttcgtgatactat-3',SEQ ID NO.:15)的外向PCR形成，所述两个引物均含有5'AscI位点。将PCR产物纯化、用AscI消化并连接到pTOPO中以形成pJB013。最后，使用引物uppneoF(5’-attacgccaagcttggtaccactctcttcttcttcaggga-3',SEQ ID NO.:16)和uppneoR(5'-gtggatccgagctcggtacctgagatccccgcgctggagg-3',SEQ ID NO.:17)从pKH14PCR扩增含有upp::neo基因的片段并将其克隆进pJB013的KpnI位点以形成pJB015。
[0207] 将pJB015转化进Trel10-333UR(如前所述)，在琼脂板上选择新霉素(500ug mg/ml)抗性集落。通过PCR确认在染色体dapA基因处的单交换事件。将具有单交换的集落在非选择性培养基中培养24小时以允许双交换事件出现，然后铺板在含有100mg/L赖氨酸和0.25ug/ml 6-氮杂尿嘧啶的McC培养基上。将集落贴在含有赖氨酸或不含有赖氨酸的McC板上。在需要赖氨酸进行生长的集落上进行对dapA缺失的PCR确认。将一个这样的集落标注为Trel10-333UR-ΔdA。
[0208] 实施例5
[0209] 增强氢营养微生物中的甘氨酸和苏氨酸产生
[0210] 通过增加从OAA至苏氨酸的流量实现甘氨酸和苏氨酸产生的增强。质粒pAW42(由Walters等.,2011描述)用作用于海沼甲烷球菌(从University of York,Wentworth,York YO10 5DD,United Kingdom的Professor Chong获得)的复制质粒。
[0211] pKH24(pAW42-thrA*)构建
[0212] 利用引物TKH_094(5'aactaataggtgaaacgcgtacaggaaacacagaaaaaagcc3',SEQ ID NO.:7)和TKH_095(5'gatctcctaggcgcgcctcagactcctaacttccatgagagggtac3',SEQ ID NO.:8)从大肠杆菌ATCC 21277基因组扩增对苏氨酸的反馈有抗性(氨基酸突变G433R)的编码双功能酶天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thrA*基因，并将其克隆进用AscI和NsiI线性化的pAW42中。所得的质粒被命名为pKH24。
[0213] pKH27(pAW42-thrA*BC)构建
[0214] 利 用 引 物 TK H _ 0 9 4( S E Q I D N O .: 7 )和T K H _ 1 0 3( 5 'gatctcctaggcgcgccttactgatgattcatcatcaatttacgcaacgca3',SEQ ID NO.:9)从大肠杆菌ATCC 21277基因组DNA扩增编码抗苏氨酸反馈的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(ThrA*)、高丝氨酸激酶(ThrB)和苏氨酸合酶(ThrC)的基因簇。将PCR产物克隆进用NsiI和AseI线性化的pAW42中。所得的质粒被命名为pKH27。
[0215] pKH32(pAW42-thrA*BC-asd)构建
[0216] 海沼甲烷球菌的asd基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶。利用引物TKH115(5'gatctcctaggcgcgccttaaaggtatttttgaacgaataattcagc3',SEQ ID NO.:10)和TKH116(5'catcagtaaggcgcg tttttatccaaaggtgaaagaatgaa3',SEQ ID NO.:11)从宿主基因组扩增该基因及其上游序列(包括RBS)。将所得PCR产物克隆进用AscI线性化的pKH27中以产生pKH32。
[0217] 氨基酸分析的发酵规程
[0218] 使海沼甲烷球菌重组体生长在balch管中的5ml McCAS培养基中，补充以嘌呤霉素(2.5mg/L)，用H2:CO2(4:1)加气至40psi，在37℃震荡过夜。在第二天，使用100μl过夜培养物作为
种子培养物从而接种在balch管中的5ml最小培养基(MM)或100ml血清培养基，用H2:CO2(4:1)分别加气至40psi和20psi的压力。将培养物置于37℃震荡72小时；在开始培养时再注满H2:CO2(4:1)气体至全压力。在发酵后，将1.8ml培养物转移到Eppendorf管，以12000xg移除细胞，并将所得的上清液通过0.2μm滤器。通过HPLC分析滤液的氨基酸含量。如果需要，种子和发酵培养基均补充以嘌呤霉素(2.5mg/L)。
[0219] 表2.血清管中的氨基酸产生
[0220]
[0221] 另外，将非天然的和重组的海沼甲烷球菌在生物反应器中培养，如实施例9中所述，但不添加CO。发酵96小时后，将1.8ml培养物转移至Eppendorf管，以12000xg移除细胞，并将所得的上清液通过0.2μm滤器。通过HPLC分析滤液的氨基酸含量。如果需要，种子和发酵培养基均补充以嘌呤霉素(2.5mg/L)。
[0222] 表3.生物反应器中的氨基酸产生
[0223]
[0224] 如从表3中很显然，添加外源ThrABC活性有助于产生高于野生型海沼甲烷球菌中存在的水平的苏氨酸和甘氨酸。
[0225] 实施例6
[0226] 来自氢营养微生物的氨基酸输出
[0227] 分离来自海沼甲烷球菌的候选的rhtA(苏氨酸)或lysE(赖氨酸)输出蛋白基因并检查功能性。任选地引入进一步的突变以增加功能或通过可操作地连接至更强的启动子而过表达输出蛋白基因，或将功能性外源rhtA或lysE基因引入至海沼甲烷球菌中。过量产生的天冬氨酸途径氨基酸可以容易地从培养基中回收和/或分离。
[0228] 实施例7
[0229] 改变氢营养微生物中至氨基酸生产的碳流
[0230] 氢营养微生物(例如，海沼甲烷球菌)的主要碳流量可以以多种方式转变从而为天冬氨酸氨基酸生物合成途径提供更多的碳。例如，限制碳从丙酮酸至磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的流动可以通过失活或下调PEP合酶基因来实现。另外，异亮氨酸途径(如果存在)被任选地敲除，其保留了被此途径利用的丙酮酸和乙酰CoA。特定酶活性的失活或减小可以通过基因工程(例如，基因或基因部分缺失)或通过选择由突变引起的失活(例如，自发的或诱导的)来引入。备选地，丙酮酸羧化酶基因被任选地过表达从而将更多的碳从丙酮酸汇集至草酰乙酸(OAA)。另外，天冬氨酸氨基转移酶基因任选地被过表达从而将更多的OAA转变成天冬氨酸。过表达可以例如通过提供多拷贝的基因或通过改变启动子区以提供更强的表达来实现。
[0231] 实施例8
[0232] 培养非天然的和重组的氢营养微生物
[0233] 将海沼甲烷球菌在泡罩塔生物反应器中在厌氧条件下培养约72小时至120小时直至培养达到稳态条件，其在一系列体积递增的连续容器中完成(例如，以50ml开始，使用此培养物接种10L，然后使用此培养物接种300L或更大体积)使得达到非常大体积的高浓度培养。在此时间期间，系统将以分批补料模式运转，其中合成气被连续供给至发酵液。发酵液本身不更换。一旦达到适宜的OD600(如通过分光光度计测量的)，则将启动连续培养过程，其中开始培养基/发酵液的更换。更换速率将根据发酵罐内培养物的OD600来确定。例如，每天更换约1.5至约3.0完全体积的发酵液。
[0234] 将培养物保持在约37℃的
温度，但可以在约35℃至约40℃范围内
波动，保持在约7.0-7.2的pH(根据需要用HCl和/或NaOH调整pH)，并且保持在约1.5至约2.0的OD600。合成气由比率为约4:1至约3:1的H2:CO2构成，其可以包含约0％至约5％(最佳是至多1％)的一氧化碳，并且可以包含其他微量的污染物。合成气流速通过在方法中使用的泡罩塔或滴流塔的具体设计来指定。
[0235] 实施例9
[0236] 利用CO培养非天然的和重组的氢营养微生物
[0237] 将Trel10-333UR在3.0L连续搅拌罐生物反应器中在厌氧条件下培养直至培养物达到稳态条件。培养从甘油储备试样开始，将所述甘油储备试样用于接种容纳在100ml密封和厌氧的血清瓶中的25mL培养基，其用作反应器的种子培养物。使用4:1比率的H2/CO2气体将血清瓶加压至20psi。使用两个这样的瓶子来接种1.5L培养基，所述培养基保持在约37℃和pH7.0-7.2。使种子培养物生长约16小时，然后用来接种主反应器。在此时间期间，将4:1比率的H2/CO2喷射到主容器中。另外，使用Rushton和scoping桨(scoping blade)的组合保持600rpm的持续搅拌。在接种主容器之前大约8小时，将200ppm H2S气排出物喷射到主容器中。另外，在接种时，还将1％(按体积计)CO排出物喷射到主容器中。培养物在48-56小时内达到最大OD，其大约与在没有CO的条件下发酵达到相同OD所需的时间量相同。
[0238] 在56小时时在没有CO的条件下Trel10-333UR的天冬氨酸氨基酸的发酵效价为120mg/L甘氨酸和25.4mg/L苏氨酸，并且在有CO的条件下在56小时时为83mg/L甘氨酸和
50mg/L苏氨酸。
[0239] 上述的各种实施方案可以组合以提供更多的实施方案。本说明书中提到的或在申请数据表中列举的所有专利和非专利出版物的全部内容通过引用并入本文。实施方案的多个方面可以被
修改，如果需要的话，从而利用各个专利、申请和出版物的概念以提供更多的实施方案。
[0240] 可以根据上面的详述对实施方案作出这些和其他改变。通常，在下面的权利要求中，使用的术语不应当解释为将权利要求限制于在说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而是应当解释为包括所有可能的实施方案连同这样的权利要求有资格保护的等效形式的全部范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
