一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗及其制备方法
阅读：311发布：2023-01-22
专利汇可以提供一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽 疫苗 及其制备方法，涉及一种多肽疫苗，提供一种能同时有效 预防 多种亚型禽流感病毒、且安全可靠的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗及制备方法。多肽疫苗是以病毒样颗粒形式存在，禽流感病毒M2e表位被有效呈递在病毒样颗粒表面，构成病毒样颗粒亚基的 氨 基酸序列和编码该氨基酸序列的DNA序列。设计相应的引物，得DNA序列；再插入到载体pMAL-c2x的多克隆位点区，形成多肽疫苗的表达载体质粒pMALc2x-M2eHBc+，重组质粒转化大肠杆菌得重组基因工程菌；接种培养，加入IPTG，诱导目的基因表达，离心收集菌 体细胞 ，冻融，加入PBS缓冲液重悬菌体，离心取上清液，过滤纯化。，下面是一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗，其特征在于抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的结构是以病毒样颗粒形式存在，禽流感病毒M2e表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，构成病毒样颗粒亚基的氨基酸序列为序列1：
MSLLTEVETPTRNEWECKCSDSSDPDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASLLTEVETPTRNGWECRCSDSSDSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC；
编码该氨基酸序列的DNA序列为序列2：
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAAATGCAGCGATTCAAGTGATCCTGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAAGCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCAACCCGTAACGGTTGGGAATGCCGTTGCAGCGATAGCAGCGATTCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG。
2.如权利要求1所述的一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗，其特征在于所述的DNA序列其1-75位核苷酸为H5N1亚型禽流感病毒的M2e基因片段，该片段插入到乙肝核心抗原基因的5′端，其313-382位核苷酸为通用的禽流感病毒的M2e基因片段，该片段插入到乙肝核心抗原基因的MIR区。
3.如权利要求1所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)设计相应的引物，利用重叠延伸PCR技术，将禽流感病毒的M2e基因片段拼接于HBcAg的5′端和MIR区，得到如序列2所述的DNA序列；
2)将序列2所述的DNA序列通过酶切连接的方法，插入到市售的载体pMAL-c2x的多克隆位点区，通过测序确认连接成功，读码框正确，形成抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的表达载体质粒pMALc2x-M2eHBc+，该载体质粒含有上述序列2所述DNA序列；
3)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组基因工程菌；
4)将重组基因工程菌接种于加有氨苄青霉素的pMAL载体培养基中，振荡培养，加入IPTG，诱导目的基因表达，诱导结束后离心收集菌体细胞，冻融，加入PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，离心，取上清液，过滤，纯化，纯化所得到蛋白即为呈现病毒样颗粒状的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗，将得到的蛋白透析，进行抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的浓缩。
4.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于所述的序列2插入到多种类型的表达载体并在相应的宿主细胞中表达。
5.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于所述的序列2构建原核表达载体在原核生物如大肠杆菌中表达，或构建酵母表达载体在酵母中表达，或构建真核表达载体在哺乳动物细胞中表达。
6.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于所述的序列2构建原核表达载体pMALc2x-M2eHBc+，并在大肠杆菌中表达。
7.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于在将重组基因工程菌接种于加有氨苄青霉素的pMAL载体培养基中，振荡培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，诱导目的基因表达。
8.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于诱导条件为：温度37℃，转速为160r/min，诱导4h。
9.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于诱导结束后离心收集菌体细胞，反复冻融3次，加入1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤。
10.如权利要求3所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法，其特征在于所述纯化采用NEB公司的Amylose纯化树脂E8021V纯化，按照操作手册进行，纯化所得到蛋白即为呈现病毒样颗粒状的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗，将得到的蛋白用1×PBS充分透析，利用冷冻干燥技术进行抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的浓缩。
一种抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多肽疫苗，尤其是涉及一种体外表达的呈现病毒样颗粒状的抗多亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备，构成该病毒样颗粒的蛋白分子氨基酸序列和对应的基因序列，及该病毒样颗粒的制备方法和用途。
背景技术
[0002] 禽流行性感冒病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，A型流感病毒。禽流感(Avian Influenza，AI)是由该病毒引起的禽类感染和疾病综合症(卡尔克BW.禽病学[M].北京：北京农业大学出版社，1991)。国际兽医局动物流行病组织(IOE)和我国《家畜家禽防疫条例》均将该病列为A类烈性传染病。目前在世界上许多国家和地区都有该病发生的报道，高致病性禽流感(HPAI)以突然的发病和高死亡率为主要特征，常常导致饲养鸡群的全部死亡。近年来，在我国局部地区也发生了HPAI的流行，给禽类养殖业带来很大的经济损失。1997年在香港从几个有流感症状的病人体内分离到了原来只在禽类中流行的高致病性禽流感H5N1亚型毒株，后来造成多人死亡，流行病学调查确认病毒是从禽类直接传染给人(Kanta Subbarao，Alexander Klimov，Jacqueline Katz，et al.Characterization ofan avian influenza A(H5N1)virus isolated from a child with a fatal respiratory illness[J].Science，1998，279(16)：393-396)，此后东南亚和欧洲一些国家陆续有H5N1感染人的报道，国际卫生组织和世界各国卫生部门加强了对该病毒流行的监测和研究，目前在禽流感病毒相关领域的研究均取得了很大进展。疫苗接种是预防和控制AIV流行的主要措施之一，一直以来禽流感病毒疫苗研究的焦点都聚集在病毒囊膜外壳的两个糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)上，基于这两个蛋白开发的疫苗也在控制禽流感的爆发中发挥了很大作用，但是这两个基因不断发生的基因漂移(drift)和基因转换(shift)也使得人们不断置疑禽流感病毒疫苗的保护效果，疫苗主要抗原HA和NA如果与正在发生的病毒流行株同源性降低则意味着疫苗保护力的下降，甚至完全丧失。为维持疫苗的保护效果，需要及时分离、鉴定当前流行株的基因结构，预测可能发生的毒株突变，这些都需要耗费大量的人力和财力，且基于HA和NA开发的疫苗一般不具有亚型间交叉保护能力。上述不利因素使研究人员将目光投向了病毒囊膜上存在的第三个蛋白-M2蛋白，与HA和NA基因相比，M2基因是高度保守的(Lamb RA，Lai C J.Conservation of the influenza virus membrane protein(M1)amino acid sequence and anopen reading frame of RNA segment 7encoding a second protein(M2)in H1N1 and H3N2strains[J].Virology，1981，112(2)：746-751)。Ito 等 (Ito T，Gorman O T，Kawaoka Y，Bean W J，WebsterR G.Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2proteins[J].Journal of Virology，1991，65：5491-5498)对几十年间分离到的M2基因进行了进化分析，发现M2相对比较保守，且M2基因在不同亚型之间同源性也相当高。Wanli等(WanliL，Peng Z，Jian D，Yun L，Yinghua C.Sequence comparison between the extracellular domain ofM2protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenzavaccine design[J].Microbes and Infection，2005，7：171-177)的研究也与此相一致。尽管M2蛋白只是流感病毒粒子中的一个小蛋白，病毒颗粒上的数量也较少，但人们仍然能够在感染A型流感病毒的人和雪貂的血清中检测到M2蛋白特异性抗体(Black R A，Rota P A，GorodkovaN，Klenk H D，Kendal A P.Antibody response of M2protein of influenza A virus expressed ininsect cells[J].Journal of General Virology，
1993b，74：1673-1677)，进一步研究发现针对M2蛋白的抗体可以抑制流感病毒在培养细胞和小鼠体内的复制(Zebedee S L，Lamb R A.Influenza A virus M2protein：monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2in virions[J].Journal of Virology，1988，62：2762-2772；Treanor J J，Tierney E L，Zebedee S L，Lamb R A，Murphy B R.Passively transferred monoclonal antibody to the M2protein inhibitsinfluenza A virus replication in mice[J].Journal of Virology，1990，64：
1375-1377)。这些研究结果使人们认识到M2蛋白也是流感病毒的保护性抗原之一，是具有交叉保护能力的“通用”流感疫苗研究的候选抗原，多个研究小组的结果证明无论是原核表达的修饰的M2蛋白(MichaelFrace A，Alexander I Klimov，Thomas Rowe，Renee A Black，Jacqueline M Katz.Modified M2proteins produce heterotypic immunity against influenza A virus[J].Vaccine，1999，17：2237-2244)，还是M2e与大分子载体连接后表达出的融合蛋白(Neirynck S，Deroo T，SaelensX，Vanlandschoot P，Jou W M，Fiers W.A universal influenza A vaccine based on the extracellulardomain of the M2protein[J].Nat Med，1999，5(10)：1157-1163)都具有亚型间交叉免疫保护作用，免疫动物后能同时对同源或异源病毒的攻击提供一定甚至完全的保护。因此，M2蛋白及其M2e表位是具有交叉保护能力的流感疫苗的候选抗原。
1993b，74：1673-1677)，进一步研究发现针对M2蛋白的抗体可以抑制流感病毒在培养细胞和小鼠体内的复制(Zebedee S L，Lamb R A.Influenza A virus M2protein：monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2in virions[J].Journal of Virology，1988，62：2762-2772；Treanor J J，Tierney E L，Zebedee S L，Lamb R A，Murphy B R.Passively transferred monoclonal antibody to the M2protein inhibitsinfluenza A virus replication in mice[J].Journal of Virology，1990，64：
1375-1377)。这些研究结果使人们认识到M2蛋白也是流感病毒的保护性抗原之一，是具有交叉保护能力的“通用”流感疫苗研究的候选抗原，多个研究小组的结果证明无论是原核表达的修饰的M2蛋白(MichaelFrace A，Alexander I Klimov，Thomas Rowe，Renee A Black，Jacqueline M Katz.Modified M2proteins produce heterotypic immunity against influenza A virus[J].Vaccine，1999，17：2237-2244)，还是M2e与大分子载体连接后表达出的融合蛋白(Neirynck S，Deroo T，SaelensX，Vanlandschoot P，Jou W M，Fiers W.A universal influenza A vaccine based on the extracellulardomain of the M2protein[J].Nat Med，1999，5(10)：1157-1163)都具有亚型间交叉免疫保护作用，免疫动物后能同时对同源或异源病毒的攻击提供一定甚至完全的保护。因此，M2蛋白及其M2e表位是具有交叉保护能力的流感疫苗的候选抗原。
[0003] 病毒样颗粒(VLP)是一种能够自主包装成病毒外壳结构，但不具有病毒复制能力的假病毒，可以将抗原与VLP基因嵌合表达，表达产物能够将外源基因片段有效展示到病毒颗粒表面。VLP能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式(Ulrich R，Nassal M，Meisel H，Kruger D H.Core particles of hepatitis Bvirus as carrier for foreign epitopes[J].Adv Virus Res，1998，50：141-152)。HBcAg是乙肝病毒的重要结构蛋白，其免疫原性强，是机体CTL识别的主要靶抗原之一，也是目前公认的作为疫苗载体的大分子蛋白之一。目前研究证明HBcAg无论在原核和真核细胞内均能高效表达，自主装配成球形的VLP颗粒，其N端和主要免疫优势区(Major immunodominant region，MIR)及C端都能忍受一定长度外源片段的插入或替换而不影响其自主装配，且对外源片段遗传背景没有限制(Pumpens P，Grens E.HBV core particles as a carrier for B cell/T cell epitopes[J].Intervirology，2001，44：
98-114)。之前有几个研究小组相继对M2e与HBcAg的融合基因表达及其免疫原性做了研究，免疫动物后均取得了较好的免疫保护效果(Marina De Filette，WillyMin Jou，Ashley Birkett，Katie Lyons，Brian Schultz，Anne Tonkyro，Stephanie Resch，WalterFiers.Universal influenza A vaccine：Optimization of M2-based constructs[J].Virology，
2005，337：149-161)，将禽流感病毒的M2e基因片段同时融合入HBcAg基因的5′端和MIR区的研究未见有文献报道。
98-114)。之前有几个研究小组相继对M2e与HBcAg的融合基因表达及其免疫原性做了研究，免疫动物后均取得了较好的免疫保护效果(Marina De Filette，WillyMin Jou，Ashley Birkett，Katie Lyons，Brian Schultz，Anne Tonkyro，Stephanie Resch，WalterFiers.Universal influenza A vaccine：Optimization of M2-based constructs[J].Virology，
2005，337：149-161)，将禽流感病毒的M2e基因片段同时融合入HBcAg基因的5′端和MIR区的研究未见有文献报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种能同时有效地预防多种亚型禽流感病毒的、且安全可靠的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗及其制备方法。
[0005] 本发明所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的结构是以病毒样颗粒形式存在，禽流感病毒M2e表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，构成病毒样颗粒亚基的氨基酸序列为序列1(SEQ ID NO.1)：
[0006] MSLLTEVETPTRNEWECKCSDSSDPDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASLLTEVETPTRNGWECRCSDSSDSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(230个aa)。
[0007] 编码该氨基酸序列的DNA序列为序列2(SEQ ID NO.2)：
[0008] ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAAATGCAGCGATTCAAGTGATCCTGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAAGCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCAACCCGTAACGGTTGGGAATGCCGTTGCAGCGATAGCAGCGATTCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG(693个dNTP)。
[0009] 本发明所述的DNA序列其1-75位核苷酸为H5N1亚型禽流感病毒的M2e基因片段，该片段插入到乙肝核心抗原基因的5′端，其313-382位核苷酸为通用的禽流感病毒的M2e基因片段，该片段插入到乙肝核心抗原基因的MIR区。
[0010] 本发明所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的制备方法包括以下步骤：
[0011] 1)设计相应的引物，利用重叠延伸PCR技术，将禽流感病毒的M2e基因片段拼接于HBcAg的5′端和MIR区，得到如序列2所述的DNA序列；
[0012] 2)将序列2所述的DNA序列通过酶切连接的方法，插入到市售的载体pMAL-c2x的多克隆位点区，通过测序确认连接成功，读码框正确，形成抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的表达载体质粒pMALc2x-M2eHBc+，该载体质粒含有上述序列2所述DNA序列；
[0013] 3)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组基因工程菌；
[0014] 4)将重组基因工程菌接种于加有氨苄青霉素的pMAL载体培养基中，振荡培养，加入IPTG，诱导目的基因表达，诱导结束后离心收集菌体细胞，冻融，加入PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，离心，取上清液，过滤，纯化，纯化所得到蛋白即为呈现病毒样颗粒状的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗，将得到的蛋白透稀，进行抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的浓缩。
[0015] 所述的序列2能插入到多种类型的表达载体并在相应的宿主细胞中表达，可以构建原核表达载体在原核生物如大肠杆菌中表达，也可以构建酵母表达载体在酵母中表达，还可以构建真核表达载体在哺乳动物细胞中表达，较佳的，该基因序列构建原核表达载体pMALc2x-M2eHBc+，并在大肠杆菌中表达。
[0016] 在将重组基因工程菌接种于加有氨苄青霉素的pMAL载体培养基中，最好振荡培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG最好至终浓度为0.8mmol/L，诱导目的基因表达；诱导条件为：温度37℃，转速为160r/min，诱导4h；诱导结束后离心收集菌体细胞，最好反复冻融3次，加入约1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，最好15000r/min离心15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，然后采用NEB公司的Amylose纯化树脂(产品编号：E8021V)纯化，按照操作手册进行，纯化所得到蛋白即为呈现病毒样颗粒状的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗，将得到的蛋白用1×PBS充分透稀，利用冷冻干燥技术进行抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗的浓缩。
[0017] 病毒样颗粒的电镜观察可采用以下方法：分别取10μL纯化的M2eHBc+融合蛋白样品加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，自然干燥2h，用JEM2100透射电子显微镜观察原核表达的重组蛋白自主包装成的VLP颗粒。磷钨酸染色是负染，背景为黑色，病毒样颗粒的蛋白为白色。
[0018] 本发明所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗应用时，可以单独以每小鼠50μg剂量滴鼻免疫小鼠或以每小鼠50μg剂量与弗氏佐剂混合免疫小鼠，能够诱导小鼠产生M2特异性抗体。
[0019] 本发明具有以下突出优点：
[0020] 1、本发明所述的抗多种亚型禽流感病毒的多肽疫苗是一种可抗多亚型禽流感病毒的多肽疫苗，免疫动物后可诱导动物产生抗多种亚型禽流感病毒的抗体；
[0022] 3、该多肽疫苗为病毒样颗粒结构，M2e表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，能够诱导机体产生全面的免疫应答，且通过滴鼻免疫小鼠能诱导小鼠IgA的产生；
[0023] 4、病毒样颗粒结构的多肽疫苗稳定性好，有效期长，疫苗运输储存方便，有利于推广使用；
[0025] 图1为M2eHBc+构建示意图。在图1中，①指HbcAg第2位aa位点；②指HbcAg第80位aa位点；③指HbcAg第81位aa位点；A为融合基因M2eHBc的构建过程，B为融合基因M2eHBc+的构建过程；C为以M2eF和M2eR，M2eHF和M2eHR两对引物扩增的片段为模板，用M2eF和M2eHR引物进行第二轮PCR扩增，得到M2eHBc；D为以M2eF和M2eHR，M2eH2F和M2eHR两对引物扩增的片段为模板，用M2eF和M2eHR引物进行第二轮PCR扩增，得到M2eHBc+。
[0026] 图2为pMALc2x-M2eHBc+表达和纯化图。在图2中，1、pMALc2x-M2eHBc+载体(已转化BL21(DE3)菌株)未加入IPTG诱导，2、加入IPTG诱导4h的全菌体总蛋白，3、IPTG诱导4h的菌体经超声波处理后离心上清电泳结果，4、超声波处理沉淀电泳结果，5、纯化蛋白电泳结果，M、低分子量蛋白Marker。
[0027] 图3为M2eHBc+蛋白Western杂交。在图3中，1、阴性对照(pMALc2x-M2eHBc+表达菌株未加入IPTG诱导菌体总蛋白)，2、pMALc2x-M2eHBc+表达菌株IPTG诱导表达4h菌体总蛋白杂交信号，M、预染蛋白Marker。
[0028] 图4为M2eHBc+病毒样颗粒电镜图片。
[0029] 图5为肌肉途径不同免疫组血清抗禽流感病毒M2蛋白抗体效价。在图5中，横坐标为Different Immune Sera(不同免疫组血清)，纵坐标为Anti-M2Titer Log2(抗M2抗体滴度)；左区域为BSA免疫组，右区域为M2eHBC+免疫组。
[0030] 图6为滴鼻免疫途径不同抗原免疫组血清IgG-M2抗体效价，在图6中，横坐标为不同免疫组血清，纵坐标为IgG-M2Titer(Log2)(抗M2抗体滴度)；两区域分别PBS(i.n.)免疫组，M2eHBc+(i.n.)免疫组。
具体实施方式
[0031] 以下实施例将对本发明作进一步的说明。
[0032] 实施例1：M2e片段与HBcAg融合基因的获得
[0033] 采用OE-PCR(overlap extension PCR)方法进行融合基因的构建，合成以下引物：
[0034] M2eF：5′-GGCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAGG-3′
[0035] M2eR：5′-GTCAATGTCAGGATCACTTGAATCGCTG-3′
[0036] M2eHF：5′-AGTGATCCTGACATTGACCCGTATAAAG-3′
[0037] M2eH 1R：5′-CCAACCGTTACGGGTTGGGGTTTCCACTTCGGTCAGCAGGCTTGCTGGGTCTTCCAAATTAC-3′
[0038] M2eH2F：5′-ACCCGTAACGGTTGGGAATGCCGTTGCAGCGATAGCAGCGATTCCAGGGAATTAGTAGTCAG-3′
[0039] M2eHR：5′-GGCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3′
[0040] 引物中M2eR与M2eHF有18个碱基互补，M2eH1R与M2eH2F有15碱基互补。引物M2eF带有酶切位点Sal I，M2eHR设计有酶切位点HindIII，以便酶切片段连接入原核表达载体pMALc2x。
[0041] M2e片段连接于HBcAg 5′端的融合基因构建：以M2eF与M2eR为引物，以pMD18T-M2为模板，扩增出M2e核苷酸序列，预计扩增片段长度为87bp；以M2eHF与M2eHR为引物，以本实验室保存的pBI1301-HBcAg载体为模板，扩增出HBcAg基因的全长，预计扩增片段长度约为558bp。扩增出的特异性片段，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，分别挖胶回收。上述回收纯化片段50倍稀释后，等量稀释产物混合均匀，以混合物为模板以M2eF和M2eHR为引物进行第二轮扩增，预计扩增出的长度约为621bp的片段，即是HBcAg 5′端连接有禽流感病毒M2e核酸序列的融合基因，命名为M2eHBc。
[0042] 以M2eF与M2eH1R为引物，以上文扩增的M2eHBc为模板扩增出M2eHBc的前半段，预计扩增长度约为365bp；以M2eH2F与M2eHR为引物，M2eHBc为模板扩增出M2eHBc的后半段，预计扩增长度约为368bp。扩增出的特异性片段，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，挖胶回收，适当稀释后，作为第二轮PCR的模板，引物仍然采用M2eF和M2eHR，第二轮PCR预计扩增长度约为693bp，该片段即为HBcAg 5′端及MIR区均连接有禽流感病毒M2e片段的融合基因M2eHBc+，且MIR区连接的是密码子经过优化的通用M2e(M2e的第14位氨基酸由E突变为G)，以上的PCR扩增均采用高保真酶进行，具体构建过程见图1。
[0043] 实施例2：M2eHBc+融合基因的原核表达载体构建
[0044] M2eHBc+融合基因片段，经过Sal I和HindIII双酶切后，与同样酶切纯化的原核表达载体pMALc2x连接，连接产物转化DH5α，从抗性平板上挑取的白色克隆经过酶切、测序鉴定后，正确的克隆分别命名为pMALc2x-M2eHBc+。
[0045] 实施例3：M2eHBc+融合蛋白表达、鉴定及纯化
[0046] 将测序正确的原核表达载体pMALc2x-M2eHBc+转化表达菌株BL21(DE3)，鉴定为阳性的克隆接种于加有氨苄青霉素和抗性的pMAL专用培养基中，振荡培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，诱导融合基因表达。诱导条件为：温度37℃，转速为160r/min，诱导4h。诱导结束后离心收集菌体细胞，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况(蛋白表达结果见图2)。将经过IPTG诱导表达菌体蛋白和未诱导菌对照进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白电转移至尼龙膜，分别以兔抗H5N1M2蛋白抗体为第一抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG为第二抗体，进行Westernblotting分析，确认表达蛋白具有M2蛋白抗原性(Western blotting结果见图3)。有正确蛋白表达的工程菌株，大量培养，IPTG诱导蛋白表达，条件如上所述，诱导结束后离心收集菌体细胞，反复冻融3次，加入约1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌后，采用NEB公司Amylose纯化树脂(产品编号：E8021V)纯化，按照操作手册进行。树脂纯化的蛋白均用PBS 4℃下充分透析处理，蛋白浓缩采用冻干机冷冻抽干方法进行。蛋白浓度测定采用Bradford法，用购自上海生物公司的试剂盒进行，具体步骤参照试剂盒说明书。
[0047] 实施例4：电镜观察原核表达的融合蛋白
[0048] 分别取10μL纯化的M2eHBc+融合蛋白样品加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，自然干燥2h。用JEM2100透射电子显微镜观察原核表达重组蛋白自主包装成的VLP颗粒，电镜观察结果见图4，透射电子显微镜下观察到表达的M2eHBc+蛋白能够自主包装成VLP颗粒形状，大小25nm左右。
[0049] 实施例5：动物免疫及抗体效价测定
[0050] 肌肉注射免疫：首次免疫将纯化的病毒样颗粒状融合蛋白M2eHBc+和BSA对照蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，采用皮下多点注射法免疫5-6周龄雌性Balb/c，8只小鼠随机分为4组，每只免疫纯化蛋白量为50μg。每隔2周加强一次，连续加强2次，加强免疫时纯化蛋白50μg与不完全弗氏佐剂混合均匀。
[0051] 鼻腔内滴入免疫方案：小鼠经乙醚麻醉后，分两次将病毒样颗粒状融合蛋白M2eHBc+或对照PBS滴入鼻腔内，使其自然流入体内，共免疫3次，每次间隔2周，每只免疫纯化蛋白量为50μg。
[0052] 所有免疫组均在末次免疫后1周眼眶采血处死小鼠，分离血清。
[0054] M2特异性抗体检测采用Dot-ELISA法，抗体效价定为能发生阳性颜色反应的血清2
最大稀释倍数。将尼龙膜用铅笔划出约1cm 的方块，取M2标准蛋白约4μL点于划在尼龙膜上的方块正中央，自然晾干；
最大稀释倍数。将尼龙膜用铅笔划出约1cm 的方块，取M2标准蛋白约4μL点于划在尼龙膜上的方块正中央，自然晾干；
[0055] 将尼龙膜装于塑料袋中，按每平方厘米膜约0.5mL加入适量封闭液，37℃摇床慢速振荡2h，弃封闭液，用TBST洗膜三次，取一大的带盖平皿，在平皿上放置5-6张滤纸，滤纸用封闭液浸透，将尼龙膜平铺在滤纸上；
[0056] 1)将待测血清用封闭液以2的倍数倍比稀释，依次取连续稀释的血清约3μL分别点在加有抗原的方块正中央，盖上平皿盖子，置于37℃孵育2h。将膜用TBST洗3次，10min/次；
[0057] 2)将膜放于一新塑料袋中，加入稀释的二抗，封闭塑料袋，平放入37℃摇床中慢摇1h；
[0058] 3)将膜从二抗血清中取出，用TBST洗3次，10min/次，同时回收二抗，可反复用3～5次；
[0059] 4)配制TMB显色液，洗好的膜放入显色液中室温显色，显色至一定的深度时，立即用扫描仪扫描图片记录实验结果，因为TMB显色后又会慢慢褪去颜色，所以要及时扫描图片。
[0060] M2eHBc+和BSA对照蛋白肌肉注射免疫小鼠后分离血清，应用Dot-ELISA进行M2特异性IgG抗体效价检测，结果表明(见图5)，M2eHBc+免疫小鼠后产生的抗M2蛋白抗体几何平均效价为1∶82551，与对照BSA蛋白免疫组(平均效价1∶406)相比差异显著。
[0061] 将经过滴鼻途径，M2eHBc+和PBS对照抗原免疫后小鼠分离的血清以2的倍数进行倍比稀释，Dot-ELISA法测定抗体效价结果见6。从图中可以看出两种抗原免疫小鼠后，小鼠体内产生的M2特异性抗体效价差异极显著，采用M2eHBc+滴鼻组M2特异性抗体平均效价为1∶1024，而阴性对照几乎不能产生M2特异性抗体。
[0063] 序列1：氨基酸序列
[0064] MSLLTEVETPTRNEWECKCSDSSDPDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASLLTEVETPTRNGWECRCSDSSDSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(230个aa)
[0065] 序列2：DNA序列
[0066] ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAAATGCAGCGATTCAAGTGATCCTGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAAGCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCAACCCGTAACGGTTGGGAATGCCGTTGCAGCGATAGCAGCGATTCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG(693个dNTP)
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