用于药物输送的脂质体
阅读：525发布：2021-07-20
专利汇可以提供用于药物输送的脂质体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了含有取代的铵和/或聚阴离子、和任选地带有期望的 治疗 实体或成像实体的脂质体组合物。本发明也提供了制备本发明提供的脂质体组合物的方法。，下面是用于药物输送的脂质体专利的具体信息内容。
1.组合物，包含介质中的脂质体，所述脂质体具有通过包含一种或多种脂 类的膜与所述介质隔开的内部空间，其中所述脂质体的内部空间含有取代的铵， 所述取代的铵具有下式：
R1-(R2-)N+(-R3)-R4
其中N是铵氮原子，R1、R2、R3、R4每一个独立地是氢原子或有机基团，所 述有机基团每一个独立地具有不超过8个的碳原子，并且总数不超过18个碳原子， 包括18个碳原子，其中R1、R2、R3、R4中至少一个是有机基团；
其中所述有机基团独立地是烷基、亚烷基、杂环烷基、环烷基、芳基、链烯 基、环烯基或其羟基取代的衍生物，任选地包含S、O或N原子，形成醚、酯、 硫醚、胺或酰胺键；和
其中R1、R2、R3、R4中至少三个是有机基团；或至少其中一个所述有机基团 具有直接连接到所述铵氮原子的仲碳原子或叔碳原子；和
其中所述内部空间也包含阴离子。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述有机基团每一个独立地具有不超过6 个的碳原子。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述有机基团的碳原子总数不超过16个碳 原子。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述有机基团的碳原子总数不超过12个碳 原子。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述取代的铵在水中形成真溶液。
6.权利要求1所述的组合物，其中基本上所有所述取代的铵包含在所述脂质 体的所述内部空间内。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述取代的铵在药学上是惰性的。
8.权利要求1所述的组合物，其中所述取代的铵选自异丙基乙基铵、异丙基 甲基铵、二异丙基铵、叔丁基乙基铵、二环己基铵、吗啉鎓、吡啶鎓、哌啶鎓、 吡咯烷鎓、哌嗪鎓、叔丁基铵、2-氨-2-甲基丙醇-1，2-氨基-2-甲基-丙二醇-1，3，三-(羟 乙基)-氨基甲烷、N，N′-二乙基-乙醇铵、N，N′，N″-三-(2-羟乙基)铵、N，N′-双-(2-羟乙 基)乙铵、三甲铵、三乙铵、二乙基甲基铵、二异丙基乙铵、三异丙铵、N-甲基吗 啉鎓、1-(2-羟乙基)哌啶鎓、1-甲基吡咯烷鎓、1，4-二甲基哌嗪鎓、四甲基铵、四乙 基铵和四丁基铵。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述取代的铵在所述脂质体内部空间中的 浓度高于所述取代的铵在所述含脂质体的介质中的浓度。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述取代的铵在所述内部空间中的浓度是 至少约0.05M、0.1M、0.2M、0.5M、0.6M或0.7M的浓度。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述取代的铵在所述内部空间中的浓度是 约0.65M。
12.权利要求1所述的组合物，其中所述阴离子是二价阴离子、三价阴离子、 多价阴离子、聚合阴离子、聚阴离子化的多元醇或聚阴离子化的糖。
13.组合物，包含介质中的脂质体，所述脂质体具有通过包含一种或多种脂类 的膜与所述介质隔开的内部空间，其中所述内部空间包含选自聚阴离子化的多元 醇或聚阴离子化的糖的阴离子，以及其中所述脂质体包含有效地将实体保留在所 述脂质体内的跨膜梯度。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述跨膜梯度是离子梯度、铵离子梯度、 pH梯度、电化学势梯度、溶解性梯度或包含至少一个C-N键的取代的铵离子的梯 度。
15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述阴离子包括
(i)选自下述的多元醇部分：单糖、二糖、线性多羟基化化合物、环状多羟基 化化合物、具有一个以上羟基基团的脂肪醇、具有一个以上羟基基团的脂环醇、 或具有一个以上羟基基团的杂环醇；和
(ii)连接到所述多元醇部分的至少两个强阴离子官能团。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述强阴离子官能团的至少一个是硫酸 酯、磷酸酯、硼酸酯、磺酸基团、膦酸基团、硫代碳酸基团、二硫代碳酸基团、 其衍生物或其类似物。
17.权利要求15所述的组合物，其中所述多元醇部分选自阿拉伯糖、核糖、 木糖、葡萄糖、半乳糖、山梨糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、 prolylene glycol、丙三醇、treitol、赤藓醇、季戊四醇、核糖醇、阿糖醇、山梨醇、 甘露醇、乳糖醇、麦芽糖醇、果糖醇、葡萄糖醇、木糖醇或肌醇。
18.权利要求15所述的组合物，其中所述聚阴离子是每分子具有3至8个硫 酸盐基团的多硫酸化蔗糖。
19.权利要求15所述的组合物，其中所述多硫酸化蔗糖是八硫酸蔗糖。
20.权利要求15所述的组合物，其中所述聚阴离子是六磷酸肌醇。
21.权利要求15所述的组合物，其中所述阴离子在所述脂质体内部中的浓度 是至少约0.05、0.1、0.2、0.5、0.6、0.7或1.0克当量/L。
22.权利要求15所述的组合物，其中所述阴离子在所述脂质体内部中的浓度 是至少约0.65克当量/L或约1.0克当量/L。
23.权利要求1-22中任一项所述的组合物，除所述取代的铵和所述阴离子之 外，还包括实体。
24.权利要求23所述的组合物，其中所述实体是球形阳离子实体、治疗剂实 体或可检测标记。
25.权利要求23所述的组合物，其中所述实体以超过所述实体在所述介质中 的浓度存在于所述内部空间中。
26.权利要求23所述的组合物，其中所述介质基本上无所述实体。
27.权利要求23的组合物，其中所述实体与所述脂类总数的摩尔比是至少约 0.05、至少约0.1、至少约0.2、至少约0.3、至少约0.5、至少约0.7或至少约1.0。
28.权利要求24所述的组合物，其中所述治疗剂实体是抗菌治疗剂、抗病毒 治疗剂或抗肿瘤治疗剂。
29.权利要求24所述的组合物，其中所述治疗剂实体是氨基糖苷抗生素或氟 喹诺酮衍生物。
30.权利要求28所述的组合物，其中所述治疗剂实体选自：拓扑异构酶抑制 剂、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、 磷酸酶抑制剂、极光蛋白激酶抑制剂、微管解聚剂、微管稳定剂、烷化剂、酶、 酶抑制剂、组蛋白脱乙酰转移酶抑制剂、抗代谢物、受体结合剂、激素、激素拮 抗剂、核苷酸、多核苷酸、任何前述物质的衍生物、任何前述物质的前药和任何 前述物质的类似物。
31.权利要求28所述的组合物，其中所述抗肿瘤治疗剂选自蒽环类抗生素化 合物、喜树碱化合物、长春花碱、玫瑰树碱化合物、紫杉醇化合物、渥曼青霉素 化合物、吡唑并嘧啶化合物、任何前述物质的衍生物、任何前述物质的前药和任 何前述物质的类似物。
32.权利要求24所述的组合物，其中所述治疗剂实体选自：阿霉素、道诺霉 素、丝裂霉素C、表阿霉素、吡柔比星、柔红霉素、癌霉素、N-乙酰阿霉素、佐 柔比星、5-亚氨道诺霉素、N-乙酰道诺霉素、daunoryline、米托蒽醌、喜树碱、9- 氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、10，11-亚甲二氧基喜 树碱、9-氨基-10，11-亚甲二氧喜树碱、9-氯-10，11-亚甲二氧喜树碱、伊立替康、托 泊特坎、勒托替康、silatecan、(7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树 碱、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚甲二氧-20(S)-喜树碱、7-(2-N-异丙基氨基)乙 基)-(20S)-喜树碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春氟宁、长春西汀、长春酰 胺、玫瑰树碱、6-3-氨丙基-玫瑰树碱、2-二乙基氨基乙基-玫瑰树碱鎓及其盐、达 替铵、retelliptine、帕利它西、多烯紫杉醇、任何前述物质的衍生物、任何前述物 质的前药和任何前述物质的类似物。
33.权利要求24所述的组合物，其中所述治疗剂实体选自：抗组胺乙二胺衍 生物、bromphenifamine、苯海拉明、抗原生动物药物、喹诺酮、碘喹啉、脒化合 物、戊烷脒、抗蠕虫剂化合物、噻嘧啶、抗吸血虫药物、奥沙尼喹、抗真菌三唑 衍生物、fliconazole、埃他康唑、酮康唑、咪康唑、抗菌头孢菌素、头孢唑啉、头 孢尼西、头孢噻肟、头孢酰亚胺、头孢呋辛、抗菌β-内酰胺衍生物、氨曲南、头 孢美唑、头孢西丁、红霉素组抗菌剂、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、竹桃霉素、 青霉素化合物、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、氯唑西林、甲氧西林、萘夫西林、 苯唑西林、羧苄西林、四环素化合物、新生霉素、壮观霉素、万古霉素；抗分枝杆 菌药物、氨基水杨酸、卷曲霉素、乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利 福平、氯法齐明、抗病毒金刚烷胺化合物、金刚烷胺、金刚乙胺、奎尼丁化合物、 奎宁、奎纳克林、氯喹、羟氯喹、伯胺喹、阿莫地喹、甲氟喹宁、抗微生物qionolone、 环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺药物类； 尿道抗微生物剂、呋喃妥因、trimetoprim；硝基咪唑类衍生物、甲硝唑、胆碱季铵 化合物化合物、ambethinium、新斯的明、毒扁豆碱、抗-阿尔茨海默病、氨基吖啶、 他克林、抗帕金森药物、苯扎托品、比哌立登、普环啶、苯海索、抗毒蕈碱剂、 阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、丙胺太林、肾上腺素化合物、多巴胺、血清胺、沙 丁胺醇、多巴酚丁胺、麻黄碱、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、 metaproperenol、氟替卡松、特布他林、血清胺再吸收抑制剂、麦角胺衍生物、箭 毒系列肌肉松弛素、中枢作用肌肉松弛素、巴氯酚、环苯并环庚三烯、苯芙海因、 烟碱、烟碱受体拮抗剂、β-肾上腺素阻断剂、acebutil、胺碘酮、苯并二氮化合物、 地尔硫草、抗心律失常药、二异丙酰胺、恩卡尼、局部麻醉化合物、普鲁卡因、 普鲁卡因酰胺、利多卡因、flecaimide、奎尼丁；ACE抑制剂、卡托普利、enelaprilat、 福辛普利、喹那普利、雷米普利；鸦片剂衍生物、可待因、哌替啶、美沙酮、吗 啡、抗脂类药物、氟伐他汀、吉非贝齐、HMG-coA抑制剂、普伐他汀、降压药剂、 可乐定、胍那苄、哌唑嗪、胍乙啶、granadril、肼苯哒嗪、非冠状动脉血管扩张剂、 双嘧达莫、乙酰胆碱酯酶抑制剂、匹鲁卡品、生物碱、毒扁豆碱、新斯的明、任 何前述物质的衍生物、任何前述物质的前药和任何前述物质的类似物。
34.权利要求24所述的组合物，其中，在2-8℃下的6个月之后，至少90％ 的所述实体保持包囊在所述脂质体中。
35.权利要求24所述的组合物，其中在2-8℃下的2年之后，至少80％的所述 实体保持包囊在所述脂质体中。
36.权利要求24所述的组合物，其中所述实体以第一实体-脂类比率被包囊在 所述组合物的脂质体内，以及其中在将所述组合物施用到哺乳动物的血流中之后 24小时，所述实体以第二实体-脂类比率被保持包囊在所述脂质体内，其中所述第 二实体-脂类比率超过所述第一物质-脂类比率的50％、至少60％或至少70％。
37.权利要求36所述的组合物，其中所述实体是长春花碱、其类似物或其衍 生物。
38.权利要求36所述的组合物，其中所述实体是长春瑞滨。
39.权利要求36所述的组合物，其中所述哺乳动物是大鼠。
40.包含脂质体的组合物，所述脂质体包含一种或多种脂类和以至少约0.10 的实体-脂类摩尔比率包囊在其中的抗肿瘤治疗剂实体，
其中所述脂质体组合物的体内抗-肿瘤活性比游离非脂质体形式的实体的抗肿 瘤活性高至少四倍，和
其中施用于哺乳动物的所述脂质体组合物的毒性等于或低于以游离非脂质体 形式施用于所述哺乳动物的所述实体的毒性。
41.权利要求40所述的组合物，其中施用于哺乳动物的所述脂质体组合物的 毒性比以游离非脂质体形式施用于所述哺乳动物的所述实体的毒性低至少两倍或 低至少三倍。
42.权利要求40所述的组合物，其中施用于哺乳动物的所述脂质体组合物的 毒性比以游离非脂质体形式施用于所述哺乳动物的所述实体的毒性低至少四倍。
43.权利要求40所述的组合物，其中所述实体是前药。
44.权利要求40所述的组合物，其中所述实体是喜树碱拓扑异构酶I抑制剂、 喜树碱前药，其类似物或其衍生物。
45.权利要求44所述的组合物，其中所述喜树碱前药是伊立替康。
46.权利要求44所述的组合物，其中施用到哺乳动物血流中的所述实体从所 述脂质体释放的半释放期是至少约10小时。
47.权利要求44所述的组合物，其中施用到哺乳动物血流中的所述实体从所 述脂质体释放的半释放期是至少约24小时。
48.权利要求44所述的组合物，其中所述脂质体包含选自聚阴离子化的糖和 聚阴离子化的多元醇的聚阴离子。
49.权利要求48所述的组合物，其中所述聚阴离子是八硫酸蔗糖或六磷酸肌 醇。
50.权利要求44所述的组合物，其中所述脂质体包含生物可降解的聚阴离子 聚合物。
51.权利要求50所述的组合物，其中所述生物可降解的聚阴离子聚合物是聚 磷酸盐。
52.权利要求44所述的组合物，其中所述脂质体含有取代的铵化合物，所述 铵化合物具有下式：
R1-(R2-)N+(-R3)-R4
其中N是铵氮原子，R1、R2、R3、R4每一个独立地是氢原子或有机基团，所 述有机基团每一个独立地具有不超过8个的碳原子，并且总数不超过18个碳原子， 包括18个碳原子，其中R1、R2、R3、R4中至少一个是有机基团；
其中所述有机基团独立地是烷基、亚烷基、杂环烷基、环烷基、芳基、链烯 基、环烯基或其羟基取代的衍生物，任选地包含S、O或N原子，形成醚、酯、 硫醚、胺或酰胺键；和
其中R1、R2、R3、R4中至少三个是有机基团；或所述有机基团的至少一个具 有直接连接到所述铵氮原子的仲碳原子或叔碳原子。
53.权利要求40-52中任一项所述的组合物，其中所述拓扑异构酶抑制剂以每 摩尔脂类至少约0.30摩尔药物的浓度被包载。
54.权利要求40-53中任一项所述的组合物，其中所述拓扑异构酶抑制剂以每 摩尔脂类约0.40摩尔药物至每摩尔脂类约1.7摩尔药物之间的浓度被包载。
55.权利要求40-54所述的组合物，其中所述哺乳动物是小鼠。
56.权利要求40-55中任一项所述的组合物，其中所述抗肿瘤活性在HT-29肿 瘤模型或BT-474肿瘤模型中在体内被测定。
57.权利要求46-47所述的组合物，其中所述哺乳动物是大鼠。
58.用于施用长春花碱药物的组合物，包括介质中的脂质体，所述脂质体具有 内部空间和将所述内部与所述介质隔开的膜，所述膜包含一种或多种脂类，所述 脂质体包含以第一药物/脂类比率包载在所述脂质体中的长春花碱药物，其中在将 所述组合物投到哺乳动物的血流中之后24小时，所述长春花碱药物以第二药物/ 脂类比率保持包囊在所述脂质体内，所述第二药物/脂类比率为所述第一药物/脂类 比率的约50％以上。
59.权利要求58所述的组合物，其中所述第二药物/脂类比率为所述第一药物 /脂类比率的至少约60％。
60.权利要求58所述的组合物，其中所述第二药物/脂类比率为所述第一药物 /脂类比率的至少约70％。
61.权利要求58-60所述的组合物，其中所述第一药物/脂类摩尔比率至少 0.05、至少0.1或至少0.2。
62.权利要求61所述的组合物，其中所述第一药物/脂类质量比至少约0.05 mg/mmol、至少约0.1mg/mmol或至少约0.3mg/mmol。
63.权利要求58-62中任一项所述的组合物，其中所述脂质体包括有效地将所 述药物保留在所述脂质体内的内部/外部跨膜离子梯度。
64.权利要求58-63中任一项所述的组合物，其中所述内部空间包括选自聚合 聚阴离子、聚阴离子化的多元醇或聚阴离子化的糖的聚阴离子。
65.权利要求63或64所述的组合物，其中所述内部空间包括铵离子或取代的 铵离子。
66.权利要求65所述的组合物，其中所述取代的铵离子是伯铵、仲铵、叔铵 或季铵离子。
67.权利要求63或64所述的组合物，其中所述内部空间包含取代的铵离子， 所述取代的铵离子具有下式：
R1-(R2-)N+(-R3)-R4
其中N是铵氮原子，R1、R2、R3、R4每一个独立地是氢原子或有机基团，所 述有机基团每一个独立地具有不超过8个的碳原子，并且总数不超过18个碳原子， 包括18个碳原子，其中R1、R2、R3、R4中至少一个是有机基团；
其中所述有机基团独立地是烷基、亚烷基、杂环烷基、环烷基、芳基、链烯 基、环烯基或其羟基-取代的衍生物，任选地包含S、O或N原子，形成醚、酯、 硫醚、胺或酰胺键；和
其中R1、R2、R3、R4中至少三个是有机基团；或所述有机基团的至少一个具 有直接连接到所述铵氮原子的仲碳或叔碳原子；和
其中所述内部空间也包含阴离子。
68.权利要求65所述的组合物，其中所述聚阴离子以至少0.05克当量/L、至 少0.2克当量/L、至少0.5克当量/L、至少0.6克当量/L的浓度包含在所述内部空 间中。
69.权利要求58-68中任一项所述的组合物，其中所述长春花碱药物是长春新 碱、长春碱、长春瑞滨、长春氟宁、长春酰胺、长春西汀、其类似物或其衍生物。
70.权利要求69所述的组合物，其中所述小泡形成脂类包括磷脂酰胆碱和胆 固醇。
71.权利要求70所述的组合物，其中所述磷脂酰胆碱选自天然卵磷脂、氢化 天然卵磷脂、合成的卵磷脂、1，2-二硬脂酰-卵磷脂、1，2-二棕榈酰-卵磷脂、1，2-二 豆蔻酰-卵磷脂、1，2-二油酰-卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰-卵磷脂和1-棕榈酰-2-油酰卵 磷脂。
72.权利要求70所述的组合物，其中所述磷脂酰胆碱和所述胆固醇以约3∶2 的摩尔比被包含。
73.权利要求58-68中任一项所述的组合物，其中所述脂类包括中性PEG-脂 类衍生物或阴离子PEG-脂类衍生物。
74.权利要求73所述的组合物，其中所述中性PEG-脂类衍生物为所述脂类总 数的约0.1摩尔％至约10摩尔％。
75.权利要求73所述的组合物，其中所述中性PEG-脂类衍生物是PEG-神经 酰胺或PEG-二酰基丙三醇。
76.权利要求73所述的组合物，其中所述阴离子PEG-脂类衍生物以低于总脂 类的1摩尔％被包含。
77.权利要求76所述的组合物，其中所述阴离子PEG-脂类衍生物是N-(PEG)- 二酰基-磷脂酰乙醇胺。
78.权利要求58-77中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物是大鼠。
79.用于施用长春花碱药物的组合物，包括介质中的脂质体，所述脂质体具有 内部空间和将所述内部与所述介质隔开的膜，所述膜包括脂类，
其中所述脂类以约3∶2的摩尔比包括卵磷脂和胆固醇；和
其中所述长春花碱药物以约0.15mg/mmol卵磷脂至约0.55mg/mmol卵磷脂的 药物/脂类比包含在所述脂质体中；和
其中所述内部空间也含有生物可降解的聚阴离子聚合物、聚阴离子化的多元 醇或聚阴离子化的糖；和
其中所述聚合物或糖以约0.5克当量/L至约1.0克当量/L的浓度包含在所述脂 质体的所述内部空间中；和
其中所述长春花碱药物是长春瑞滨、长春新碱或长春碱。
80.权利要求79所述的组合物，其中所述聚阴离子化的糖是八硫酸蔗糖。
81.权利要求80所述的组合物，还包括离子化的中性聚(乙二醇)-脂类衍生物， 其量为总脂类的约0.1摩尔％至约10摩尔％。
82.权利要求81所述的组合物，其中所述聚(乙二醇)-脂类衍生物是聚(乙二 醇)-二烷基丙三醇、聚(乙二醇)-二酰基丙三醇或聚(乙二醇)-神经酰胺，其中所述聚 (乙二醇)-脂类衍生物的聚(乙二醇)部分的分子量为约250至约10,000。
83.权利要求80所述的组合物，还含有包括阴离子聚(乙二醇)-脂类衍生物， 其量为总脂类的约0.1摩尔％至约0.9摩尔％
84.权利要求83所述的组合物，所述阴离子聚(乙二醇)-脂类衍生物是PEG- 磷脂酰乙醇胺，其中所述聚(乙二醇)-脂类衍生物的聚(乙二醇)部分的分子量为约 250至约10,000。
85.权利要求79-84中任一项所述的组合物，其中在哺乳动物血液循环中所述 长春花碱药物从所述脂质体释放的半释放期超过24小时。
86.权利要求85所述的组合物，其中所述哺乳动物是大鼠。
87.组合物，包含具有内部空间的脂质体和包含紫杉醇化合物，其中所述紫杉 醇化合物基本上包含在所述脂质体的内部空间中。
88.权利要求87所述的组合物，其中所述紫杉醇是离子中性分子。
89.权利要求88所述的组合物，其中所述紫杉醇的分子结构不含亲水性聚合 物部分。
90.权利要求87-89中任一项所述的组合物，其中所述包囊的紫杉醇的数量为 每摩尔所述脂类至少0.05摩尔。
91.权利要求89所述的组合物，其中所述包囊的紫杉醇的数量为每摩尔所述 脂类至少0.1摩尔。
92.权利要求87-92中任一项所述的组合物，其中所述内部空间基本上无选自 胶束形成表面活性剂化合物和环糊精化合物的加溶助剂。
93.权利要求87-92中任一项所述的组合物，其中所述紫杉醇是帕利它西或多 烯紫杉醇。
94.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述脂类包括用亲水性聚合物 衍生化的脂类。
95.权利要求94所述的组合物，其中所述亲水性聚合物-衍生化的脂类构成所 述脂类总数的最高达20摩尔％。
96.权利要求94所述的组合物，其中所述亲水性聚合物-衍生化的脂类构成所 述脂类总数的1摩尔％以下。
97.权利要求94所述的组合物，其中，与除了缺少所述亲水性聚合物-衍生化 的脂类之外相同组成的脂质体的循环寿命相比，所述脂质体在哺乳动物中的血液 循环寿命高两倍以下。
98.权利要求97所述的组合物，其中所述哺乳动物是大鼠。
99.权利要求96所述的组合物，其中所述亲水性聚合物-衍生化的脂类构成所 述脂类总数的约0.1摩尔％至约0.9摩尔％。
100.权利要求94-99中任一项所述的组合物，其中所述亲水性聚合物是聚(乙 二醇)或其衍生物。
101.权利要求94-100中任一项所述的组合物，其中所述亲水性聚合物-衍生化 的脂类是聚(乙二醇)-衍生化的磷脂、聚(乙二醇)-衍生化的二酰基丙三醇、聚(乙二 醇)-衍生化的二烷基丙三醇、聚(乙二醇)-衍生化的神经酰胺、聚(乙二醇)-衍生化的 脂肪酸、聚(乙二醇)-衍生化脂肪醇的或聚(乙二醇)-衍生化的固醇。
102.权利要求94-101中任一项所述的组合物，其中所述亲水性聚合物是具有 至少三个乙二醇单元的聚(乙二醇)。
103.权利要求94-101中任一项所述的组合物，其中所述亲水性聚合物是分子 量约200至约10,000的聚(乙二醇)。
104.权利要求94-101中任一项所述的组合物，其中所述亲水性聚合物是分子 量约500至约5,000的聚(乙二醇)。
105.前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述脂质体包括导向部分。
106.权利要求105所述的组合物，其中所述导向部分是蛋白质、肽、多糖、 多核苷酸、天然小分子、合成小分子、其组合或其衍生物。
107.权利要求105所述的组合物，其中所述导向部分是天然的、合成的或重 组产生的蛋白质，包含抗体的抗原结合序列。
108.权利要求105所述的组合物，其中所述导向部分是抗体、其抗原结合片 段、包括抗体的抗原结合多肽序列的单链蛋白、单结构域抗体、任何前述物质的 类似物或任何前述物质的衍生物。
109.权利要求105所述的组合物，其中所述导向部分连接到所述脂质体膜并 暴露于所述介质。
110.权利要求109所述的组合物，其中所述连接的导向部分包含将所述脂质 体膜与所述部分连接起来的亲水性聚合物。
111.权利要求110所述的组合物，其中所述亲水性聚合物是聚(乙二醇)。
112.权利要求111所述的组合物，其中所述聚(乙二醇)的分子量为约250至约 30,000。
113.权利要求104-112中任一项所述的组合物，其中所述导向部分导致脂质 体内化入细胞中。
114.权利要求104-112中任一项所述的组合物，其中所述导向部分选择性地 结合到受体酪氨酸激酶、生长因子受体、血管生成因子受体、转铁蛋白受体、细 胞粘附分子或维生素受体。
115.权利要求114所述的组合物，其中所述酪氨酸激酶受体是生长因子受体。
116.权利要求115所述的组合物，其中所述酪氨酸激酶生长因子受体是 EGFR、ErbB-2(HER-2)、ErbB-3(HER3)、或ErbB-4(HER4)。
117.权利要求114所述的组合物，其中所述血管生成因子受体是bFGF受体 或VEGF受体。
118.权利要求114所述的组合物，其中所述细胞吸附分子是整联蛋白。
119.权利要求113-118中任一项所述的组合物，其中所述细胞是恶性细胞。
120.将实体包囊入脂质体中的方法，包括步骤：将权利要求1-22中任一项所 述的组合物与所述实体接触足以使所述物质包囊入所述脂质体的时间。
121.权利要求120所述的方法，其中至少一部分的所述实体进入所述脂质体 内部空间。
122.权利要求120所述的方法，其中至少90％的所述实体进入所述脂质体内 部空间。
123.权利要求120所述的方法，其中包囊入所述脂质体的所述实体的比例是 至少80％、至少90％或至少95％。
124.权利要求120所述的方法，其中所述实体是球形阳离子实体、治疗剂实 体或可检测标记。
125.权利要求120所述的方法，其中所述实体与所述脂类总数的摩尔比是至 少约0.05、约0.1、约0.2或约0.3。
126.权利要求120所述的方法，其中所述治疗剂实体是抗菌治疗剂、抗病毒 治疗剂或抗肿瘤治疗剂。
127.权利要求120所述的方法，其中所述治疗剂实体是氨基糖苷抗生素或氟 喹诺酮衍生物。
128.权利要求124所述的方法，其中所述治疗剂实体选自：拓扑异构酶抑制 剂、法兰基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、磷 酸酶抑制剂、极光蛋白激酶抑制剂、微管解聚剂、微管稳定剂、烷化剂、酶、酶 抑制剂、组蛋白脱乙酰转移酶抑制剂、抗代谢物、受体结合剂、激素、激素拮抗 剂、核苷酸、多核苷酸、任何前述物质的衍生物、任何前述物质的前药和任何前 述物质的类似物。
129.权利要求124所述的方法，其中所述治疗剂实体选自：蒽环类抗生素化 合物、喜树碱化合物、长春花碱、玫瑰树碱化合物、紫杉醇化合物、渥曼青霉素 化合物、吡唑并嘧啶化合物、任何前述物质的衍生物、任何前述物质的前药和任 何前述物质的类似物。
130.权利要求124所述的方法，其中所述治疗剂实体选自：阿霉素、道诺霉 素、丝裂霉素C、表阿霉素、吡柔比星、柔红霉素、癌霉素、N-乙酰阿霉素、佐 柔比星、5-亚氨道诺霉素、N-乙酰道诺霉素、daunoryline、米托蒽醌、喜树碱、9- 氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、10，11-亚甲二氧基喜 树碱、9-氨基-10，11-亚甲二氧喜树碱、9-氯-10，11-亚甲二氧喜树碱、伊立替康、托 泊特坎、勒托替康、silatecan、(7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树 碱、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚甲二氧-20(S)-喜树碱、7-(2-N-异丙基氨基)乙 基)-(20S)-喜树碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春氟宁、长春西汀、长春酰 胺、玫瑰树碱、6-3-氨丙基-玫瑰树碱、2-二乙基氨基乙基-玫瑰树碱鎓及其盐、达 替铵、retelliptine、帕利它西、多烯紫杉醇、任何前述物质的衍生物、任何前述物 质的前药和任何前述物质的类似物。
131.权利要求124所述的方法，其中所述治疗剂实体选自：抗组胺乙二胺衍 生物、bromphenifamine、苯海拉明、抗原生动物药物、喹诺酮、碘喹啉、脒化合 物、戊烷脒、抗蠕虫剂化合物、噻嘧啶、抗吸血虫药物、奥沙尼喹、抗真菌三唑 衍生物、fliconazole、埃他康唑、酮康唑、咪康唑、抗菌头孢菌素、头孢唑啉、头 孢尼西、头孢噻肟、头孢酰亚胺、头孢呋辛、抗菌β-内酰胺衍生物、氨曲南、头 孢美唑、头孢西丁、红霉素组抗菌剂、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、竹桃霉素、 青霉素化合物、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、氯唑西林、甲氧西林、萘夫西林、 苯唑西林、羧苄西林、四环素化合物、新生霉素、壮观霉素、万古霉素；抗分枝杆 菌药物、氨基水杨酸、卷曲霉素、乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利 福平、氯法齐明、抗病毒金刚烷胺化合物、金刚烷胺、金刚乙胺、奎尼丁化合物、 奎宁、奎纳克林、氯喹、羟氯喹、伯胺喹、阿莫地喹、甲氟喹宁甲氟喹宁、抗微 生物qionolone、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、 磺胺药物类；尿道抗微生物剂、呋喃妥因、trimetoprim；硝基咪唑类衍生物、甲硝 唑、胆碱季铵化合物化合物、ambethinium、新斯的明、毒扁豆碱、抗-阿尔茨海默 病、氨基吖啶、他克林、抗帕金森药物、苯扎托品、比哌立登、普环啶、苯海索、 抗毒蕈碱剂、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、丙胺太林、肾上腺素化合物、多巴胺、 血清胺、沙丁胺醇、多巴酚丁胺、麻黄碱、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上 腺素、metaproperenol、氟替卡松、特布他林、血清胺再吸收抑制剂、麦角胺衍生 物、箭毒系列肌肉松弛素、中枢作用肌肉松弛素、巴氯酚、环苯并环庚三烯、苯 芙海因、烟碱、烟碱受体拮抗剂、β-肾上腺素阻断剂、acebutil、胺碘酮、苯并二 氮化合物、地尔硫草、抗心律失常药、二异丙酰胺、恩卡尼、局部麻醉化合物、 普鲁卡因、普鲁卡因酰胺、利多卡因、flecaimide、奎尼丁；ACE抑制剂、卡托普 利、enelaprilat、福辛普利、喹那普利、雷米普利；鸦片剂衍生物、可待因、哌替 啶、美沙酮、吗啡、抗脂类药物、氟伐他汀、吉非贝齐、HMG-coA抑制剂、普伐 他汀、降压药剂、可乐定、胍那苄、哌唑嗪、胍乙啶、granadril、肼苯哒嗪、非冠 状动脉血管扩张剂、双嘧达莫、乙酰胆碱酯酶抑制剂、匹鲁卡品、生物碱、毒扁 豆碱、新斯的明、任何前述物质的衍生物、任何前述物质的前药和任何前述物质 的类似物。
132.权利要求120-131中任一项所述的方法，其中所述接触是在含水溶液中。
133.权利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的pH在约4至约7范围 内。
134.权利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的离子强度等于或小于50 mM氯化钠的离子强度。
135.权利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的离子强度等于或小于20 mM氯化钠的离子强度。
136.权利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的pH在约6.0至约7.0之 间，以及所述实体是长春花碱、其类似物或其衍生物。
137.权利要求136所述的方法，其中所述含水溶液的pH约6.5，以及所述实 体是长春瑞滨。
138.权利要求135所述的方法，其中所述含水溶液的pH在约5至约7之间， 所述物质是喜树碱衍生物。
139.权利要求139所述的方法，其中所述含水溶液的pH在约5.0至约6.5之 间，以及所述物质是托泊特坎或伊立替康。
140.权利要求134或135所述的方法，其中在所述接触之后，所述含水溶液 的离子强度被增加至50mM氯化钠的离子强度以上。
141.权利要求140所述的方法，其中所述离子强度值被增加至至少100mM 氯化钠的离子强度。
142.权利要求141所述的方法，其中所述离子强度值被增加至至少150mM 氯化钠的离子强度。
143.制备含有包囊的实体的脂质体的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供所述实体的实体前体；
(b)将所述实体前体包囊入具有内部空间的脂质体；和
(c)在所述脂质体内提供一条件，以在所述脂质体内部空间中将所述包囊的实 体前体转化为所述实体，获得脂质体包囊形式的所述实体；
其中所述实体是有机化合物或包含铂系元素金属的配位复合物的化合物。
144.权利要求143所述的方法，其中所述包囊步骤包括将所述实体前体与具 有跨膜梯度的所述脂质体接触，接触的时间足以将所述衍生物包囊入所述脂质体。
145.权利要求144所述的方法，其中所述跨膜梯度是离子梯度、pH梯度、电 化学势梯度或溶解性梯度。
146.权利要求144所述的方法，其中所述离子梯度选自铵离子、包含至少一 个C-N键的取代形式的铵离子的离子梯度。
147.权利要求144所述的方法，其中所述实体前体是所述实体的球形阳离子 衍生物。
148.权利要求143所述的方法，其中所述化合物是药物。
149.权利要求148所述的方法，其中所述有机化合物是紫杉醇化合物。
150.权利要求149所述的方法，其中所述紫杉醇化合物是帕利它西或多烯紫 杉醇。
151.权利要求149所述的方法，其中所述实体前体包含紫杉醇分子的位置2′ 或7′中任一位置中的羟基基团的酯，其中所述酯包括可滴定的胺。
152.权利要求151所述的方法，其中所述实体前体是2′-(2-(N，N′-二乙基氨基) 丙酰基)-帕利它西或2′-(2-(N，N′-二乙基氨基)丙酰基)-多烯紫杉醇。
153.权利要求143所述的方法，其中所述条件是pH的变化。
154.权利要求143所述的方法，其中所述条件是不稳定键的酶切割。
155.权利要求143所述的方法，其中所述条件是水解、光分解、辐解、硫解、 氨解、还原、取代、氧化或消除方法。
156.试剂盒，用于提供脂质体包囊的实体，包括权利要求1-22中任一项所述 的组合物，使用所述组合物包囊实体的说明书，和任选地在独立的容器中的所述 实体。
157.权利要求156所述的试剂盒，其中所述实体是球形阳离子物质、治疗剂 实体或可检测标记。
158.权利要求1-119中任一项所述的组合物，其中所述脂质体包括取代的铵 化合物，所述铵化合物在含水溶液中于环境温度下的pKa值是至少8.0、至少8.5、 至少9.0、至少9.5或至少10.0。
159.权利要求120-142中任一项所述的方法，其中与所述实体接触的所述组 合物包括脂质体，所述脂质体包含取代的铵化合物，所述铵化合物在含水溶液中 于环境温度下的pKa值为至少8.0、至少8.5、至少9.0、至少9.5或至少10.0。
发明领域
[0002]本发明总体上涉及脂质体领域，更具体地涉及用于输送治疗实体或诊断实 体的脂质体组合物。
发明背景
[0003]脂质体或脂双层小泡已经用于或被提议用于各种研究、工业和医疗的应用 中，特别是体内用作诊断化合物或治疗化合物的载体。参见例如：Lasic，D. Liposomes：from physics to applications.Elsevier，Amsterdam，1993；Lasic，D和 Papahadjopoulos，D.，eds.Medical Applications of Liposomes.Elsevier，Amsterdam， 1998。脂质体的通常特征是具有通过一个或多个双层组成的膜与外部介质隔开的 内部空间，形成显微囊或小泡。脂质体的双层膜典型地由包含空间上隔开的亲水 性区域和疏性区域的脂质，即合成的或天然来源的两亲性分子形成，参见Lasic D.， 1993，见上文。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂 (polymerosomes、niosomes(非离子表面活性剂囊泡))形成。脂质体通常充当能 够拥有有用特性或发挥有用活性的各种实体的载体，这些实体不受限制地，例如 是化学化合物、化合物的组合、合成或天然来源的超分子复合体、遗传物质、活 生物体、其部分、或其衍生物。为了实现这一目的，制备脂质体，以便以掺入脂 质体的形式(liposome-incorporated form)包含期望的实体。将期望的实体掺入脂质体 的过程常常称为“装载”。掺入脂质体的实体可以完全或部分地位于脂质体的内部空 间，在脂质体的双层膜内，或与脂质体膜的外表面结合。实体掺入脂质体的过程 也称为包囊或包载。
[0004]这三个术语在本文中可替换使用，具有相同的意思。用脂质体包囊实体的 目的常常是为了保护实体免遭环境破坏，同时使包囊的实体主要在实体活性有利 的位置或环境中发挥其活性，而在这种活性可能无用或不利的其他位置不大发挥 其活性。该现象称为输送(delivery)。例如，脂质体内的药物物质可免遭体内酶的 破坏，但在疾病位置由脂质体释放出来并进行治疗。
[0005]理想地，这样的脂质体可以被制备用于包含期望的化合物，具有下述特性：(i)高装载效率，即与被带入包囊过程的量相比，具有高百分比的包囊的实体；(ii) 每单位脂质体双层物质具有大量包囊的实体；(iii)高浓度的包囊实体，和(iv)稳 定的形式，即当储存或通常在脂质体出现在期盼脂质体包埋的实体发挥其预期活 性的位置或环境之前仅仅少量的包囊实体释放(渗漏)。
[0006]因此，本领域要求提供可用于输送各种化合物，尤其是治疗实体、诊断实 体或成像实体的各种脂质体组合物。发明概述
[0007]本发明基于这样的发现，取代的铵和聚阴离子可用于将实体装入并保持在 脂质体中。因此，本发明提供了用于输送各种实体的方法和脂质体组合物，尤其 是治疗实体，即在活生物体如人、植物或动物中诊断、预后、测试、筛选、治疗 或预防不利状态如疾病中有用的实体。
[0008]在一种实施方案中，本发明提供了含有处于介质中的脂质体的组合物，其 中脂质体里面含有取代的铵，
其中R1、R2、R3和R4中的每一个独立地是氢或有机基团，具有总计达18个的碳 原子，包括18个在内，其中R1、R2、R3和R4中的至少一个是有机基团，其中该 有机基团独立地是具有可达8个碳原子的烃基，并且是烷基、亚烷基、杂环烷基、 环烷基、芳基、烯基或环烯基基团或其羟基-取代的衍生物，任选地，在它的烃链 中包括S、O或N原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺键，其中R1、R2、R3和R4 中的至少三个是有机基团，或取代的铵是位阻铵(sterically hindered ammonium)， 如，例如，其中有机基团中的至少一个具有直接连接到铵氮原子的仲碳原子或叔 碳原子。优选地，包囊入脂质体的取代的铵化合物的酸性(去质子化)解离常数的负 对数(pKa)，至少约8.0、至少约8.5、至少约9.0、至少约9.5或至少约10.0，这是 在环境温度下于含水溶液中测定的。
其中R1、R2、R3和R4中的每一个独立地是氢或有机基团，具有总计达18个的碳 原子，包括18个在内，其中R1、R2、R3和R4中的至少一个是有机基团，其中该 有机基团独立地是具有可达8个碳原子的烃基，并且是烷基、亚烷基、杂环烷基、 环烷基、芳基、烯基或环烯基基团或其羟基-取代的衍生物，任选地，在它的烃链 中包括S、O或N原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺键，其中R1、R2、R3和R4 中的至少三个是有机基团，或取代的铵是位阻铵(sterically hindered ammonium)， 如，例如，其中有机基团中的至少一个具有直接连接到铵氮原子的仲碳原子或叔 碳原子。优选地，包囊入脂质体的取代的铵化合物的酸性(去质子化)解离常数的负 对数(pKa)，至少约8.0、至少约8.5、至少约9.0、至少约9.5或至少约10.0，这是 在环境温度下于含水溶液中测定的。
[0009]在另一实施方案中，本发明提供了含有处于介质中的脂质体的组合物，其 中脂质体的内部空间含有聚阴离子，其中聚阴离子是聚阴离子化的多元醇或聚阴 离子化的糖。脂质体优选地含有能够将实体装载入脂质体的跨膜梯度。在一种实 施方案中，跨膜梯度是由铵、季铵、或取代的伯铵、仲铵或叔铵化合物构成的梯 度，所述取代的伯铵、仲铵或叔铵化合物在环境温度下在稀释的含水溶液中的酸 性(去质子化)解离常数(pKa)的负对数至少约8.0、至少约8.5、至少约9.0、至少约 9.5或至少约10.0。脂质体任选地含有包埋的实体，例如治疗剂、可检测标记、或 球形阳离子有机分子。[00010]在还有另一实施方案中，本发明提供的组合物还包含包囊入本发明脂质体 的实体。优选地，实体包囊入脂质体的内部空间内。例如，脂质体的内部空间还 包含抗肿瘤治疗剂，其中组合物对对象的毒性水平至少等于或小于在不用组合物 的情况下给予对象的抗肿瘤治疗剂的毒性水平。
[0010]在还有另一实施方案中，本发明提供的组合物是包含喜树碱化合物的脂质 体组合物。该组合物的抗癌活性比在组合物不存在下同样给药的喜树碱化合物的 抗癌活性高至少2倍、4倍、或10倍，同时组合物的毒性不超过在组合物不存在 下同样给药的喜树碱化合物的毒性，要低至少2倍、或低至少4倍。在一种实施 方案中，喜树碱化合物是药物前体，并以每1mg脂质体膜物质例如脂类，至少0.1 mg、至少0.2mg、至少0.3mg、0.5mg或至少1mg的量包含在脂质体中。喜树碱 化合物优选包囊在脂质体中，实质上包囊在脂质体的内部空间。在一个例子中， 喜树碱化合物是伊立替康(irinotecan(CPT-11))。
[0011]在还有另一实施方案中，本发明提供的组合物是长春花碱(vinca alkaliod) 或其衍生物的脂质体组合物。在体内暴露于哺乳动物血液24小时后，该组合物在 脂质体内24-小时时的药物保持量为原始药物装载量的至少50％、至少60％或至少 70％。长春花碱或其衍生物优选包囊在脂质体中，实质上包囊在脂质体的内部空间。 哺乳动物的例子是大鼠。示例性长春花碱及其衍生物是长春新碱(vincristine)、长春 碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)。
[0012]在还有另一实施方案中，本发明提供了将实体包囊入脂质体的方法。该方 法包括将本发明的脂质体与实体，例如治疗实体或可检测实体接触。优选地，在 本发明取代的铵或聚阴离子在介质中的浓度低于在脂质体内部空间中的浓度的条 件下进行接触。在一种实施方案中，脂质体组合物与实体在含水介质中接触。
[0013]在还有另一实施方案中，本发明提供了将实体包囊入脂质体的方法。该方 法包括将本发明含脂质体的组合物与实体前体(pre-entity)接触，其中实体前体能够 在一定条件下转化为实体，并在脂质体内部提供将实体前体在脂质体内转化为实 体的条件。在一种情况下，实体是有机化合物，实体前体是其碱性衍生物。
[0015]图1显示了在将装载CPT-11的脂质体经静脉丸剂注射(i.v.bolus)给药大 鼠之后，脂质体脂类(圆圈)和药物(三角形)的血液药物动力学。脂质体使用TEA-Pn 方法装载(参见实施例9)。
[0016]图2显示了经静脉丸剂注射施用用TEA-Pn方法装载CPT-11的脂质体后， 在大鼠血液内的体内药物-脂质体脂类比率的动态学(参见实施例9)。
[0017]图3显示了在裸鼠内游离CPT-11和脂质体CPT-11对BT-474人乳腺癌异种 移植物的抗肿瘤功效。“对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实 施例10)。
[0018]图4显示了在用游离CPT-11或脂质体CPT-11对携带BT-474肿瘤的裸鼠进 行治疗期间的动物体重动态学。“对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠 (参见实施例10)。
[0019]图5显示了经静脉丸剂注射施用用TEA-SOS方法装载CPT-11的脂质体后， 在大鼠血液内的体内药物-脂质体脂类比率的动态学(参见实施例14)。
[0020]图6显示了在裸鼠中游离CPT-11和脂质体CPT-11对HT-29人结肠癌异种 移植物的抗肿瘤功效。图上的文字说明表示药物装载方法和每次注射的给药剂量。 “盐水对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例15)。
[0021]图7显示了在用游离CPT-11或脂质体CPT-11制剂对携带HT-29肿瘤的裸 鼠进行治疗期间的动物体重动态学。误差条(error bars)代表了数据的标准偏差。 “盐水对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例15)。
[0022]图8A显示了经静脉丸剂注射对大鼠施用装载托泊特坎的脂质体后，脂质体 脂类的血液药物动力学。图上说明文字表示药物装载方法和脂质体的药物含量(参 见实施例24)。
[0023]图8B显示了经静脉丸剂注射施用装载托泊特坎的脂质体后，在大鼠血液内 的体内药物-脂质体脂类比率的动态学。图上说明文字表示药物装载方法和脂质体 的药物含量(参见实施例24)。
[0024]图9显示了游离托泊特坎、脂质体托泊特坎或HER2-定向免疫脂质体托泊 特坎(TEA-Pn方法)对SKBr-3乳腺癌细胞的体外细胞毒性(参见实施例27)。
[0025]图10显示了游离托泊特坎、脂质体托泊特坎或HER2-定向免疫脂质体托泊 特坎(TEA-SOS方法)对SKBr-3乳腺癌细胞的体外细胞毒性(参见实施例32)。
[0026]图11显示了不同托泊特坎(TPT)制剂在裸鼠中对BT-474人乳腺癌异种移 植物的抗肿瘤功效。“盐水对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见 实施例29)。
[0027]图12显示了用游离托泊特坎(TPT)、脂质体托泊特坎(Ls-TPT)或抗-HER2 免疫脂质体托泊特坎(F5 ILs-TPT)对含BT-474肿瘤的裸鼠进行治疗期间动物体重 的动态学。“对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例29)。
[0028]图13A显示了在裸鼠中托泊特坎制剂对BT-474人乳腺癌异种移植物的抗肿 瘤功效。游离托泊特坎(游离TPT)或脂质体托泊特坎(Ls-TPT)以它们最大耐受剂量 的八分之一给药。误差棒代表数据的标准偏差。“对照”指仅用无药物和无脂质体的 载体治疗的小鼠(参见实施例31)。
[0029]图13B显示了在裸鼠中托泊特坎制剂对BT-474人乳腺癌异种移植物的抗肿 瘤功效。游离托泊特坎(游离TPT)或脂质体托泊特坎(Ls-TPT)以它们最大耐受剂量 的四分之一给药。误差棒代表数据的标准偏差。“对照”指仅用无药物和无脂质体的 载体治疗的小鼠(参见实施例31)。
[0030]图13C显示了在裸鼠中托泊特坎制剂对BT-474人乳腺癌异种移植物的抗肿 瘤功效。游离托泊特坎(游离TPT)或脂质体托泊特坎(Ls-TPT)以它们最大耐受剂量 的二分之一给予。误差棒代表数据的标准偏差。“对照”指仅用无药物和脂质体的载 体治疗的小鼠(参见实施例31)。
[0031]图13D显示了在裸鼠中托泊特坎制剂对BT-474人乳腺癌异种移植物的抗肿 瘤功效。游离托泊特坎(游离TPT)或脂质体托泊特坎(Ls-TPT)以它们的最大耐受剂 量给药。误差棒代表数据的标准偏差。“对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗 的小鼠(参见实施例31)。
[0032]图14显示了用以它们的最大耐受剂量给药的游离托泊特坎(游离TPT)或脂 质体托泊特坎(Ls-TPT)对携带BT-474肿瘤的裸鼠治疗期间的平均体重动力学。“对 照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例31)。
[0033]图15显示了游离6-(3-氨丙基)-玫瑰树碱(游离APE)、脂质体6-(3-氨丙基)- 玫瑰树碱HER2-定向免疫脂质体6-(3-氨丙基)-玫瑰树碱(F5 ILs-AE))对BT-474乳 腺癌细胞的体内细胞毒性(参见实施例35)。
[0034]图16显示了游离6-(3-氨丙基)-玫瑰树碱(游离APE)、脂质体6-(3-氨丙基)- 玫瑰树碱或EGFR-定向免疫脂质体6-(3-氨丙基)-玫瑰树碱(C225-ILs-APE)对具有 低(MCF-7)或高(MDA-MB468)EGF受体表达水平的乳腺癌细胞的体外细胞毒性 (参见实施例36)。
[0035]图17显示了在经静脉丸剂注射将APE脂质体给予大鼠后，脂质体配制的 6-(3-氨丙基)玫瑰树碱(APE)的血液药物动力学特性：脂质体脂类(图A，空圆圈)、 药物(图A，实心圆圈)的血液药物动力学，和药物-脂质体比率的动态学(图B)(参 见实施例37)。
[0036]图18显示了在经静脉丸剂注射将长春瑞滨脂质体给予大鼠后，长春瑞滨配 制的脂质体(Ls-VRB)和抗-HER2脂质体(F5-ILs-VRB)的血液药物动力学特性：脂质 体脂类(图A)、药物(图B)的血液药物动力学，和药物-脂质体比率的动态学(图C)(参 见实施例43)。
[0037]图19显示了在经静脉丸剂注射将装载长春瑞滨的脂质体给予大鼠后的脂质 体脂类的血液药物动力学特性。脂质体使用预先包载的糖酐酯三乙铵(DS-TEA)、 糖酐酯铵(DS-A)或硫酸铵(S-A)装载(参见实施例44)。
[0038]图20显示了在经静脉丸剂注射施用使用预先包载的糖酐酯三乙铵 (DS-TEA)、糖酐酯铵(DS-A)或硫酸铵(S-A)装载长春瑞滨的脂质体后，在体内大鼠 血液中的药物-脂质体脂类比率的动态学(参见实施例44)。
[0039]图21显示了在经静脉丸剂注射将装载长春瑞滨的脂质体给予大鼠之后脂质 体脂类的血液药物动力学。脂质体使用预先包载的蔗糖八硫酸铵(蔗糖八硫酸三乙 铵(triethylammonium sucroseoctasulfate))(TEA-SOS)装载，并具有如在图上说明文字 中所表示的平均大小(参见实施例45)。
[0040]图22显示了在经静脉丸剂注射施用装载长春瑞滨的脂质体之后，大鼠血液 内的体内药物-脂质体脂类比率动态学。脂质体使用预先包载的蔗糖八硫酸铵 (TEA-SOS)装载，并具有在如图上说明文字中所表示的平均大小(参见实施例45)。
[0041]图23显示了在经静脉丸剂注射施用使用TEA-SOS方法配制入脂质体 (Ls-VRB)或抗-HER2免疫脂质体(F5-ILs-VRB)的长春瑞滨后，大鼠内脂质体脂类的 血液药物动力学(参见实施例46)。
[0042]图24显示了在经静脉丸剂注射施用使用TEA-SOS方法配制入脂质体 (Ls-VRB)或抗-HER2免疫脂质体(F5-ILs-VRB)的长春瑞滨后，大鼠血液内的体内药 物-脂质体脂类比率的动力学(参见实施例46)。
[0043]图25显示了游离长春瑞滨(游离VRB)、脂质体长春瑞滨(Ls-VRB)或HER2- 定向免疫脂质体长春瑞滨(F5-Ils-VRB)对HER2-过量表达的人乳腺癌细胞 MDA-MB-453的体外细胞毒性(参见实施例48)。
[0044]图26显示了游离长春瑞滨(游离VRB)、脂质体长春瑞滨(Ls-VRB)或HER2- 定向免疫脂质体长春瑞滨(F5-Ils-VRB)对HER2-过量表达的CaLu-3人非小细胞性 肺癌细胞的体外细胞毒性(参见实施例49)。
[0045]图27显示了游离长春瑞滨(游离VRB)、脂质体长春瑞滨(Ls VRB/SOS-TEA) 或HER2-定向免疫脂质体长春瑞滨(F5-ILs VRB/SOS-TEA)对HER2-过量表达的人 乳腺癌细胞SKBr-3的体外细胞毒性(参见实施例50)。
[0046]图28显示了在裸鼠中游离长春瑞滨(游离VRB)或脂质体长春瑞滨(Ls VRB) 对HT-29人结肠癌异种移植物的抗肿瘤功效。“盐水对照”指仅用无药物和无脂质 体的载体治疗的小鼠。误差棒代表数据的标准偏差(参见实施例51)。
[0047]图29显示了在用游离长春瑞滨(游离VRB)、脂质体长春瑞滨(Ls VRB)或用 载体(盐水)对携带HT-29肿瘤的裸鼠治疗期间的平均体重动力学。误差棒代表数据 的标准偏差(参见实施例51)。
[0048]图30显示了游离长春瑞滨(游离VRB)或脂质体长春瑞滨(Ls VRB)在同源 C-26鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效。每次注射的药物的剂量在图上说明文字上示 出。误差棒代表数据的标准偏差。“盐水对照”指仅用无药物和无脂质体的载体治疗 的小鼠(参见实施例52)。
[0049]图31显示了在用不同剂量的游离长春瑞滨(游离VRB)、脂质体长春瑞滨 (Ls VRB)或仅用载体(盐水)对携带同源C-26鼠结肠癌肿瘤的小鼠进行治疗期间的 平均体重的动态学。每次注射的药物的剂量在图上说明文字上示出(参见实施例 52)。
[0050]图32显示了在裸鼠中，游离长春瑞滨(游离药物)或利用TEA-SOS方法制 备的scFv F5-连接的抗-HER2免疫脂质体长春瑞滨(F5-ILs-VRB TEA-SOS)、通过 TEA-Pn方法制备的抗-HER2免疫脂质体长春瑞滨(F5-ILs-VRB TEA-Pn)对HER2- 过量表达的人乳腺癌(BT-474)异种移植物的抗肿瘤功效。“盐水对照”指仅用无药物 和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例53)。
[0051]图33显示了在用游离长春瑞滨、使用TEA-SOS方法制备的scFv F5-连接 的抗-HER2免疫脂质体长春瑞滨、通过TEA-Pn方法制备的抗-HER2免疫脂质体 长春瑞滨或仅用载体对携带HER2-过量表达的人乳腺癌(BT-474)异种移植物的小 鼠进行治疗期间的平均体重的动力学。对符号的解释，参见图32的文字说明(也请 参见实施例53)。
[0052]图34显示了在裸鼠中，游离长春瑞滨(游离药物)或使用不同数量的PEG- 脂类制备的scFv F5-连接的抗-HER2免疫脂质体长春瑞滨对过量表达HER2的人乳 腺癌(BT-474)异种移植物的抗肿瘤功效。误差棒代表数据的标准偏差。“载体对照” 指仅用无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例54)。
[0053]图35显示了在裸鼠中，游离长春瑞滨(游离NAV)、脂质体长春瑞滨(NAV Lip) 或FC225Fab′-连接的抗-EGFR-免疫脂质体长春瑞滨(C225-NAV Lip)对过量表达 EGFR的人成胶质细胞瘤(U87)异种移植物的抗肿瘤功效。“盐水”指仅用无药物和 无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例55)。
[0054]图36显示了在经静脉丸剂注射施用使用硫酸三乙铵方法配制入脂质体的阿 霉素后，在大鼠血液内的脂质体脂类的血液药物动力学和药物／脂质体脂类比率的 动态学(参见实施例56)。
[0055]图37显示了在裸鼠中，脂质体阿霉素(Ls-Dox)或使用不同数量的PEG-脂类 制备的scFv F5-连接的抗-HER2免疫脂质体阿霉素(F5 ILs-Dox)对HER2-过量表达 的人乳腺癌(BT-474)异种移植物的抗肿瘤功效。图上面的文字说明显示了用摩尔％ 的脂质体磷脂表达的PEG-脂类的数量。“盐水对照”指仅用无药物和无脂质体的载 体治疗的小鼠(参见实施例57)。
[0056]图38显示了脂质体长春碱在大鼠中的血液药物动力学(参见实施例58)。
[0057]图39显示了经静脉丸剂注射施用脂质体长春碱后，大鼠血液内药物/脂质 体脂类比率的变化(参见实施例58)。
[0058]图40显示了游离长春新碱(游离VCR)、脂质体长春新碱(Ls-VCR)或HER2- 定向免疫脂质体长春新碱(F5-ILs-VCR)对HER2-过量表达的人乳腺癌细胞SKBr-3 的体外细胞毒性(参见实施例61)。
[0059]图41显示了经静脉丸剂注射施用配制入不同平均大小(在图上面的文字说 明中示出)的脂质体的长春新碱后，大鼠中脂质体脂类的血液药物动力学(参见实施 例62)。
[0060]图42显示了经静脉丸剂注射施用配制入不同平均大小(在图上面的文字说 明中示出)的脂质体的长春新碱后，大鼠血液中药物/脂质体脂类比率的动态学(参 见实施例62)。
[0061]图43显示了在裸鼠中，游离长春新碱(游离VCR)、通过柠檬酸三乙铵方法 制备的脂质体长春新碱(Ls-VCR柠檬酸)、通过蔗糖八硫酸三乙铵(三乙铵 sucrooctasulfate)方法制备的脂质体长春新碱(Ls-VCR SOS)、或通过蔗糖八硫酸三 乙铵方法制备的scFv F5-连接的抗-HER2免疫脂质体长春新碱(F5 ILs-VCR SOS)对 HER2-过量表达的人乳腺癌(BT-474)异种移植物的抗肿瘤功效。“盐水对照”指仅用 无药物和无脂质体的载体治疗的小鼠(参见实施例64)。
[0062]图44显示了在用游离长春新碱(游离VCR)、通过柠檬酸三乙铵方法制备的 脂质体长春新碱(Ls-VCR柠檬酸)、通过蔗糖八硫酸三乙铵方法制备的脂质体长春 新碱(Ls-VCR SOS)、通过蔗糖八硫酸三乙铵方法制备的scFv F5-连接的抗-HER2 免疫脂质体长春新碱(F5 ILs-VCR SOS)或仅用载体(盐水对照)对携带HER2-过量表 达的人乳腺癌(BT-474)异种移植物的小鼠进行治疗期间的平均体重动态学(参见实 施例64)。
[0063]图45显示了游离长春新碱(长春新碱)、脂质体长春新碱(nt-vcr)或C225 Fab′- 连接的抗-EGFR免疫脂质体长春新碱(C225-vcr)对裸鼠中的EGFRvlII-过量表达的 人脑癌(U87)异种移植物的抗肿瘤功效。“盐水”指仅用无药物和无脂质体的载体治 疗的小鼠(参见实施例65)。
[0064]图46显示了在经静脉丸剂注射施用脂质体CPT-11后，大鼠血液中CPT-11 的血液药物动力学和以活性(内酯)形式存在的CPT-11的百分比的动态学(参见实施 例69)。
[0065]图47显示了在经静脉丸剂注射施用CPT-11溶液(游离CPT-11)后，大鼠血 液中CPT-11的血液药物动力学和以活性(内酯)形式存在的CPT-11的百分比的动态 学(参见实施例69)。优选实施方案详述
[0066]本发明总体上涉及用于输送各种实体，特别是治疗剂和成像剂的方法和脂 质体组合物。本发明发现取代的铵和聚阴离子可用于将实体例如化合物装载并保 留在脂质体内。因此，本发明提供了含有取代的铵和/或聚阴离子的脂质体组合物 和试剂盒以及制备这些脂质体组合物的方法。
[0067]根据本发明的一个特征，提供了在内部空间含有至少一个或多个取代的铵 化合物的脂质体组合物，该取代的铵化合物具有下式：
其中，R1、R2、R3和R4中每一个独立地是氢或有机基团，其中，R1、R2、R3和 R4中至少一个是有机基团，例如烷基、亚烷基、杂环烷基、环烷基、芳基、链烯 基或环烯基基团，其羟基-取代的衍生物，任选地在它的烃链中包括S、O或N原 子，例如在其上形成醚(包括乙缩醛或酮缩醛)、酯、硫化物(硫醚)、胺或酰胺键。 如果R1、R2、R3和R4中三个以下是有机基因，那么根据本发明，至少一个，优选 两个有机基团具有直接连接到铵的氮上的仲碳或叔碳原子(即碳原子分别具有2 或3个碳碳键)，即取代的铵是位阻铵。一般而言，已经知道，在本发明脂质体内 部空间中存在的可滴定铵如未取代的铵离子(NH4+)、以及伯和仲直链烷基铵离子， 例如通过“活性”、“远距离”或“跨膜梯度驱动”装载的机理，赋予其对弱的两亲性碱 增强的包囊能力。(Haran，et a1.，Biochim.Biophys.Acia，1993，v.1152，p.253-258； Maurer-Spurej，et a1.，Biochim.Biophys.Acta，1999，v.1416，p.1-10)。然而，这些氨化 合物具有氢原子，氢原子容易发生亲核取代反应，此外还与脂质体-包载的实体发 生化学反应，并因此能够在脂质体装载(包载)期间或之后削弱实体的化学完整 性。因此，所包载的取代的铵化合物在化学上更具惰性，缺少不稳定的或容易与 脂质体成分发生反应的化学功能是期望的，其中所述脂质体成分可以包括包囊的 实体。意想不到地是，我们发现了这样的脂质体组合物不但显示出突出的实体-装 载容量，也提高了脂质体-包载的实体的稳定性，例如在活体中药物不会过早从脂 质体释放，该脂质体组合物在它们的内部空间包含没有取代氢的取代的叔铵和季 铵，或位阻伯铵或仲铵，其中，通往铵氢原子的通道在空间上受阻于附近大的有 机基团，如具有连接到铵氮的一个或两个仲碳原子或叔碳原子的有机基团。
其中，R1、R2、R3和R4中每一个独立地是氢或有机基团，其中，R1、R2、R3和 R4中至少一个是有机基团，例如烷基、亚烷基、杂环烷基、环烷基、芳基、链烯 基或环烯基基团，其羟基-取代的衍生物，任选地在它的烃链中包括S、O或N原 子，例如在其上形成醚(包括乙缩醛或酮缩醛)、酯、硫化物(硫醚)、胺或酰胺键。 如果R1、R2、R3和R4中三个以下是有机基因，那么根据本发明，至少一个，优选 两个有机基团具有直接连接到铵的氮上的仲碳或叔碳原子(即碳原子分别具有2 或3个碳碳键)，即取代的铵是位阻铵。一般而言，已经知道，在本发明脂质体内 部空间中存在的可滴定铵如未取代的铵离子(NH4+)、以及伯和仲直链烷基铵离子， 例如通过“活性”、“远距离”或“跨膜梯度驱动”装载的机理，赋予其对弱的两亲性碱 增强的包囊能力。(Haran，et a1.，Biochim.Biophys.Acia，1993，v.1152，p.253-258； Maurer-Spurej，et a1.，Biochim.Biophys.Acta，1999，v.1416，p.1-10)。然而，这些氨化 合物具有氢原子，氢原子容易发生亲核取代反应，此外还与脂质体-包载的实体发 生化学反应，并因此能够在脂质体装载(包载)期间或之后削弱实体的化学完整 性。因此，所包载的取代的铵化合物在化学上更具惰性，缺少不稳定的或容易与 脂质体成分发生反应的化学功能是期望的，其中所述脂质体成分可以包括包囊的 实体。意想不到地是，我们发现了这样的脂质体组合物不但显示出突出的实体-装 载容量，也提高了脂质体-包载的实体的稳定性，例如在活体中药物不会过早从脂 质体释放，该脂质体组合物在它们的内部空间包含没有取代氢的取代的叔铵和季 铵，或位阻伯铵或仲铵，其中，通往铵氢原子的通道在空间上受阻于附近大的有 机基团，如具有连接到铵氮的一个或两个仲碳原子或叔碳原子的有机基团。
[0068]在一个实施方案中，脂质体-包载的取代的铵化合物在药学上是惰性的，也 就是说，当给予活对象如人或动物时，并不带来不利的生理应答，其量在脂质体 膜物质足以输送有效剂量的脂质体包载的实体的量的范围内。在另一实施方案中， 本发明取代的铵对于对象具有可接受的毒性水平。通常可接受的毒性水平指本发 明取代的铵的毒性剂量，例如最大耐受剂量(MTD)，或导致50％死亡的剂量(LD50) 比装载在本发明脂质体内的脂质体-包载的实体如药物的毒性剂量高至少两倍、至 少四倍、至少八倍或至少十倍。例如，硫酸三乙铵具有根据本发明可接受的毒性 水平，因为它的LD50比阿霉素——一种抗癌药物的LD50高约40倍。如果还不 清楚的话，取代的铵以及感兴趣的化学实体的毒性水平或生理应答可容易地用生 物医学领域技术人员熟知的常规技术确定。参见例如S.C.Gad.Drug Safety Evaluation，Wiley，New York，2002。本文实施例16描述了对游离的药物和/或脂质 体化配制药物的毒性进行定量的一种方法。
[0069]在一个优选的实施方案中，R1、R2、R3或R4中取代的有机基团的大小和物 化特性足以确保取代的铵在含水环境中基本上形成真(分子)溶液，而不是胶束、 双层或类似的自组装结构。因此，本发明取代的铵优选很少或基本上不分布入脂 质体的双层部分中，因而使包载取代铵的脂质体不稳定、溶解或渗透的风险最小。
[0070]取代的铵的有机基团一般是烃，含有高达8个碳原子(包括8个碳原子)、 高达6个碳原子(包括6个碳原子)或高达4个碳原子(包括4个碳原子)，并且 取代基团总共包含性地含有高达18、高达16、高达12、或高达9个碳原子。这些 取代性烃基团包括相互连接的伯碳、仲碳或叔碳原子的任何组合，以及末端直接 连接到铵氮形成杂环的环烷基基团，或末端直接连接到铵氢-取代基团的碳原子上 的环烷基基团。这些取代的烷基基团在它们的碳链中也可以包括杂原子，例如氧、 氮或硫，形成功能基团，例如醚、乙缩醛、胺或硫化物基团，以及形成官能团， 例如连接到烷基碳链的羟基。本发明有机基团的例子包括但是不限于烷基、亚烷 基、杂环烷基、环烷基、芳基、链烯基、环烯基或其羟基-取代的衍生物，例如羟 基-取代的亚烷基，形成包括取代的铵中的N的环。
[0071]在另一实施方案中，取代的铵是：杂环铵，即其中R1、R2，R3或R4中的至 少两个形成环的铵；位阻伯铵；或位阻仲铵。一般而言，位阻伯铵或位阻仲铵包 括R1、R2、R3和R4中的一个或两个被空间上使分子拥挤的烷基基团取代的任何取 代的铵，例如R1、R2、R3和R4中的一个或两个被一个或两个环烷基基团或烷基 基团取代的任何取代的铵，其中环烷基基团或烷基基团具有至少一个连接到取代 的铵的氮的仲烷基碳原子或叔烷基碳原子。这种杂环的位阻伯铵和位阻仲铵不受 限制地包括异丙基乙基铵、异丙基甲基铵、二异丙基铵、叔丁基乙基铵、二环己 基铵、质子化形式的吗啉、嘧啶、哌啶、吡咯烷、哌嗪、叔丁胺、2-氨基-2-甲基 丙醇-1，2-氨基-2-甲基-丙二醇-1，3和三-(羟乙基)-氨基甲烷。这些取代的铵化合物 通常在商业上可以以各种盐的形式获得，或通过用酸中和由它们相应的胺制备而 得。
[0072]在还有另一实施方案中，取代的铵是叔铵或季铵，包括但是不限于三甲铵、 三乙铵、三丁铵、二乙基甲基铵、二异丙基乙基铵、三异丙铵、N-甲基吗啉鎓 (N-methylmorpholinium)、N-羟乙基哌啶鎓(N-hydroxyethylpiperidinium)、N-甲基吡 咯烷鎓(N-methylpyrrolidinium)和N，N′-二甲基哌嗪鎓(N，N′-dimethylpiperazinium)、 四甲基铵、四乙基铵和四丁基铵。这些取代的铵化合物通常在商业上可以以各种 盐的形式获得，或通过用酸中和由它们相应的胺制备而得。
[0073]在还有另一实施方案中，本发明取代的铵化合物是球形阳离子化合物，也 就是说，在实体包囊条件下，一般是在pH为约pH2和约pH8之间的含水溶液中， 带有净正电荷，例如这是对氮原子离子化(质子化)的结果。
[0074]在还有另一实施方案中，包囊入脂质体的取代的伯铵、仲铵或叔铵化合物 的酸性(去质子化)解离常数的负对数(pKa)至少约8.0、至少约8.5、至少约9.0、 至少约9.5、至少约10.0，这是在环境温度中(典型地25℃)稀释的水溶液中测定的。 参数pKa是铵化合物众所周知的特征，通常表征它们的碱性强度，并且测定pKa 的方法是本领域传统的且常规的方法。许多胺和它们质子化形式(铵)的pKa值 在化学和药理学参考书中以表格的形式列出。参见例如IUPAC Handbook of Pharmaceutical Salts，ed.by P.H.Stahl和C.G Wermuth，Wiley-VCH，2002；CRC Handbook of Chemistry and Physics，82nd Edition，ed.by D.R.Lide，CRC Press， Florida，2001，p.8-44至8-56。一般而言，较高的pKa表征较强的碱。示范性取代 的铵化合物以及未取代的铵(作为它们共轭的胺碱列出)具有如下pKa值：吡咯 烷，11.31；哌啶，11.12；二异丙胺，11.05；二乙胺，10.93；三乙胺，10.75；三 甲胺，10.73；叔丁胺，10.68；环己胺，10.66；甲胺，10.66；乙胺，10.65；丙胺， 10.54；异丙胺，10.53；N-乙基哌啶，10.45；二环己胺，10.4；N-甲基哌啶，10.38； 二乙基甲胺，10.35；二甲基丙胺，10.15；三甲胺，9.8；哌嗪，9.73(I)，5.33(II)； 2-氨基-2-甲基丙醇，9.69；N，N′-二甲基哌嗪，9.66(I)，5.2(II)；二乙基-(2-羟乙基) 胺，9.58；乙醇胺，9.5；N-羟乙基吡咯烷，9.44；二乙醇胺，9.28；氨(ammonia)， 9.27；二甲基-(2-羟乙基)胺，8.83；2-氨基-2-甲基丙二醇-1，3，8.8；吗啉，8.5；三-(羟 甲基)-氨基甲烷，8.3；N-甲基葡糖胺，8.03；三乙醇胺，7.76；N-乙基吗啉，7.67； N-羟乙基吗啉，7.39；咪唑，7.03；嘧啶，5.23。通常，烷基或环烷基基团取代铵 化合物中的氢会增加pKa值。明显地，与不含羟基或醚官能的类似的取代的氨相 比，取代的烷基基团中的多羟基或醚官能，或在含氮杂环基团中存在的芳香性会 减少pKa值。具有一个以上铵基团的化合物通常第二个或随后的铵基团的pKa比 第一个铵基团的pKa低得多。我们意想不到地发现，具有较高pKa值——即由较 强的碱性胺形成的取代的铵在稳定脂质体中的药物上比那些由弱胺形成的取代的 铵更有效。例如，三乙铵(pKa＝10.75)的IHP和SOS盐在体内稳定脂质体中的伊立 替康上比起三乙醇铵(pKa＝7.76)相应的盐明显更为有效(实施例73)。
[0075]包含在本发明的脂质体组合物中的取代的铵可以是任何合适的形式，例如 盐。合适的盐包括药学上可接受的盐。参见例如，P.H.Stahl，C.G.Wermuth(eds)， Handbook of Pharmaceutical Salts，Wiley-VCH，Weinheim，2002。在一个实施方案中， 取代的铵是含有一个或多个本发明的聚阴离子的盐。理想地，本发明取代的铵盐 中的相反离子(阴离子)赋予盐以水溶性，在药学上是惰性的，当与治疗剂或可检测 实体接触时能够形成沉淀或凝胶，和/或渗透通过脂质体膜的能力小于取代的铵或 它的非解离的胺形式。一般而言，本发明取代的铵盐在脂质体内，例如在含水空 间中形成真溶液，并不形成显著量的凝聚相，如胶束、双层、凝胶或晶体相。取 代的铵和盐-形成阴离子例如聚阴离子的相对量在化学当量点(point of stiochiometric equivalency)或附近，通常pH在3-9范围内，更通常在pH4-8范围， 这例如取决于取代的铵离子的共轭碱的解离常数。
[0076]一般而言，取代的铵包含在内部，也就是本发明脂质体的内部(inner)(内部 (interior))空间。在一个实施方案中，取代的铵部分地或基本上完全从脂质体周 围的外部介质中去除。用本领域技术人员熟知的任何合适的方法可以去除取代的 铵，例如稀释、离子交换层析、尺寸排阻层析、透析、超滤、沉淀等。
[0077]根据本发明的另一特征，提供了包含聚阴离子的脂质体组合物。本发明的 聚阴离子可以是任何适宜的化学实体，该化学实体具有一个以上带负电荷的基团， 从而导致在脂质体内部例如含水空间中产生两个以上单位的净负离子电荷。本发 明的聚阴离子可以是二价阴离子、三价阴离子、多价阴离子、聚合的多价阴离子、 聚阴离子化的多元醇或聚阴离子化的糖。毫无限制地，硫酸盐、磷酸盐、焦磷酸 盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、硼酸盐和柠檬酸盐是这种二价和三价阴离 子的例子。在一个优选实施方案中，本发明的聚阴离子是聚阴离子聚合物，具有 有机(碳)或无机骨架，和许多阴离子官能团，即在中性含水溶液中可离子化成 负电荷，并整合或附着到骨架的官能团。聚合物是天然或合成的化合物，通常具 有高分子量，由重复的连接单元组成，每一个重复的连接单元是相对轻和简单的 分子。示范性的聚阴离子化的聚合物是聚磷酸盐、聚乙烯基硫酸盐、聚乙烯基磺 酸盐、阴离子化的聚丙烯酸聚合物、阴离子化的，例如多磺化聚胺(polysulfonated polyamines)，例如多磺化聚(乙烯亚胺)；多硫酸化、多羧化或多磷酸化多糖；酸性 多氨基酸；多核苷酸；其他多磷酸化、多硫酸化、多磺化、多硼酸化、多羧化聚 合物。这种多价阴离子和聚合物是本领域熟知的，许多可以通过商业渠道获得。 本发明的聚合物阴离子优选是生物可降解的，也就是说，能够在活的生物体内降 解成无毒的单位。示范性的生物可降解聚合物阴离子是聚磷酸盐。
[0078]在另一优选的实施方案，聚阴离子是聚阴离子化的多元醇或聚阴离子化的 糖。多元醇是具有许多连接到例如线性、支链或环状碳骨架上的羟基基团的有机 分子。因此，多元醇可以用其他术语表征为多羟基化化合物。优选地，多元醇上 的多数碳原子是羟基化的。多元醇(多原子醇)是本领域熟知的分子。直链(线 性或支链)和环状多元醇都可以被使用。不受限制地，本发明示范性的多元醇是： 乙二醇；丙三醇、treitol、赤藓醇、季戊四醇、甘露醇、葡萄糖醇、山梨醇、山梨 聚糖、木糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、果糖醇(fructitol)和肌醇。在一组互连的多 数羟基化的碳原子内，糖通常包括环乙缩醛、环酮缩醛、酮或醛基团，或其加合 物。糖常常是天然存在的化合物。糖在水介质中水解产生称为单糖的单元。典型 地，在含水溶液中，五个或六个碳原子的单糖分子形成环状半缩醛——环状结构。 优选地，本发明的糖是单糖或二糖，也就是由一个或两个单糖单元组成，每一个 单糖具有三到七个，优选三到六个碳原子。不受限制地，本发明示例性的糖是单 糖己糖，如葡萄糖(右旋糖)、半乳糖、甘露糖、果糖；单糖戊糖，如木糖、核糖、 阿拉伯糖和二糖，如乳糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖和纤维二糖。由若干个互连的 糖单元构成而形成环(环糊精)的化合物和它们的衍生物也可以使用。使糖还原是获 得多元醇的一种方法。优选使用更稳定的“非还原”和非可代谢二糖如蔗糖或海藻 糖。各种多元醇、单糖和二糖可以通过商业渠道获得。
[0079]聚阴离子化的多元醇或糖是羟基基团被完全或部分修饰或被阴离子基团取 代(阴离子化的)的多元醇或糖。因此，聚阴离子化的多元醇或聚阴离子化的糖 包含多元醇部分或糖部分以及连接到其上的阴离子基团。不受限制地，示例性阴 离子基团包括羧酸盐、碳酸盐、硫代碳酸盐、二硫代碳酸盐、磷酸盐、膦酸盐、 硫酸盐、磺酸盐、硝酸盐和硼酸盐。优选地，聚阴离子化的糖或多元醇的至少一 个阴离子基团是强阴离子基团，也就是说，当在含水介质中，在宽pH范围内，例 如pH3-12，优选pH2-12，50％以上被离子化，或作为选择，解离常数的对数(pKa) 为3或更小，优选2或更小。可以用本领域已知的各种化学方法对多元醇或糖进 行聚阴离子化。例如，多元醇和/或糖与三氧化硫或氯磺酸在嘧啶或2-甲基吡啶中 的反应导致一些或所有羟基基团被硫酸残基酯化(硫酸化)，得到多硫酸化糖或多元 醇。本发明示例性的硫酸化糖是硫酸化的蔗糖，不受限制地包括六硫酸蔗糖、五 硫酸蔗糖和八硫酸蔗糖(参见Ochi.K.，et al.，1980，Chem.Pharm.Bull.，v.28，p. 638-641)。类似地，在碱性催化剂存在下，与氯化氧磷或二乙基磷酰氯的反应产生 多磷酸化多元醇或糖。多磷酸化多元醇也可分离自天然来源。例如，肌醇多磷酸 盐如六磷酸肌醇(植酸)分离自玉米。适于实践本发明的各种硫酸化、磺酸化和磷 酸化的糖和多元醇公开于例如美国专利5,783,568和美国专利5,281,237中，这些 专利并入本文作为参考。意想不到地发现，仅具有强酸解离步骤——例如pKa小 于约3.0优选小于约2.0的基团如硫酸盐单酯(pKa1.0或更小)的聚阴离子化的多羟 基化化合物，，比起还具有弱酸解离步骤如磷酸盐单酯(步骤1，pKa约1.5；步骤 2，pKa约6.7；参见Stahl and Wermuth，Op.cit.，2002)的聚阴离子化的多羟基化的化 合物，提供了具有更好的药物保留性的脂质体包囊效果。下面的实施例73举例说 明了该发现。多元醇和/或糖与一个以上的硼酸分子的配位作用也产生聚阴离子化 (多硼酸化)产物。多元醇和/或糖与二硫化碳在碱存在下的反应产生聚阴离子化 的(多二硫代碳酸化、多黄原酸盐)衍生物。聚阴离子化的多元醇或糖衍生物可以 以游离酸的形式分离，或用合适的碱，例如用碱金属氢氧化物、氢氧化铵、或优 选用取代的胺中和，取代的胺例如是对应于本发明取代的铵的胺，以纯的形式或 以取代的氢氧化铵的形式，从而提供本发明取代的铵的聚阴离子化盐。作为选择， 用任何已知的方法，例如用离子交换方法，聚阴离子化的多元醇/糖的钠盐、钾盐、 钙盐、钡盐或锰盐可以分离并转化为适宜的形式，例如取代的铵盐形式。
[0080]本发明的聚阴离子的电荷密度通常为每单元例如在碳链中每碳原子或环、 或在糖中每单糖单元具有至少两、三或四个带负电荷的基团。本发明聚阴离子化 的糖或环状多元醇优选至少75％可获得的羟基基团被聚阴离子化的，更优选100％ 可获得的羟基基团被聚阴离子化。此外，在本发明脂质体内部的聚阴离子化作用 通常在这样的水平，与在目的作用位置输送并释放包载在脂质体内的实体相容或 者帮助在目的作用位置输送并释放包载在脂质体内的实体，但是减少在脂质体到 达它的目的作用位置之前过早释放包载的实体。
[0081]根据本发明，脂质体内的聚阴离子化程度可以用于调控释放特征，例如包 载在脂质体内的实体的释放速度和动力学。一般地，聚阴离子化程度可以基于阴 离子化的糖或多元醇相对于阴离子总量量评估，或在聚阴离子是单一种类的阴离 子的情况下，基于相对于本发明脂质体内的聚阴离子如聚阴离子化的糖或多元醇 或其混合物的总聚阴离子化容量的聚阴离子化百分比进行评估。在一种实施方案 中，聚阴离子化的糖或多元醇与一种或多种其他阴离子混合，并且聚阴离子化的 糖或多元醇相对于其他阴离子的数量越少，实体从脂质体释放的速度越快。
[0082]通常如果包载的实体在目的活性位置从脂质体释放的速度太慢，通过使用 聚阴离子化的糖或多元醇与一种或多种其他单价或多价阴离子，例如氯化物、硫 酸盐、磷酸盐等的混合物，可以取得理想的实体释放速度。作为选择，可以使用 具有各种聚阴离子化程度的聚阴离子化的糖或多元醇的混合物。在一个实施方案 中，本发明脂质体内的聚阴离子化程度，在脂质体内例如具有包载的实体的脂质 体内，为总阴离子的0.1％至99％、10％至90％或20％至80％之间。
[0083]一般而言，本发明的脂质体组合物可以含有任何适宜形式的一种或多种本 发明的聚阴离子，例如包含聚阴离子和阳离子的酸或盐形式。聚阴离子，例如聚 阴离子化的糖或多元醇的数量可以在化学计量学上与阳离子的数量相同或不同。 在一种实施方案中，本发明的脂质体组合物含有一种或多种阳离子的聚阴离子盐， 其中横跨脂质体膜具有阳离子浓度梯度或pH梯度。在另一实施方案中，本发明的 脂质体组合物含有一种或多种本发明的取代的铵聚阴离子盐。在还有另一实施方 案中，本发明的脂质体组合物在脂质体中含有聚阴离子，而在含有脂质体的介质 中的聚阴离子通过本领域技术人员已知的任何适宜的方法部分去除或基本上去 除，例如稀释、离子交换层析、尺寸排阻层析、透析、超滤、吸附、沉淀等方法。 在还有另一实施方案中，具有包载的聚阴离子例如聚阴离子化的多元醇或聚阴离 子化的糖的脂质体也具有有效地将物质保留在脂质体中的跨膜梯度。这种跨膜梯 度的例子是pH梯度、电化学势梯度、铵离子梯度、取代的铵离子梯度或溶解性梯 度。取代的铵梯度通常包括含有至少一个C-N键的取代形式的铵离子，如伯铵、 仲铵、叔铵、季铵。产生跨膜梯度的方法是脂质体领域常规的方法。
[0084]根据本发明的还有另一特征，本发明的脂质体组合物含有一种或多种本发 明取代的铵和/或聚阴离子和化学实体或生物实体，例如治疗剂或可检测实体。例 如，包含在本发明的脂质体组合物中的实体可以是治疗剂、墨、染料、磁性化合 物、肥料、诱饵、生物催化剂、风味剂或气味改性物质、漂白剂、或用本领域已 知的任何适宜的方法可以检测的任何实体，适宜的方法例如磁共振成像(MRI)、光 成像、荧光/发光成像或核成像技术。便利地，包含在或可装载在本发明的脂质体 组合物中的实体是弱碱性的并可以渗透膜的(亲脂性的)实体，例如含胺实体或 氮碱实体。
[0085]在另一实施方案中，包含在本发明脂质体组合物中的实体是治疗剂。
[0086]在另一实施方案中，包含在本发明脂质体组合物中的实体是抗癌实体。一 些公知的商业上批准的(或在积极开发中的)抗肿瘤剂的部分清单分类如下。
[0087]根据结构进行分类：氟嘧啶类——5-FU、氟脱氧尿苷、喷噻溴铵、5′-脱氧 氟尿苷、UFT、S-1 Capecitabine；嘧啶核苷类——脱氧胞苷、阿糖胞苷、5-氮杂胞 嘧啶、吉西他汀、5-氮杂胞嘧啶-阿拉伯糖苷；嘌呤类——6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、 硫唑嘌啉、别嘌呤醇、克拉屈滨、氟达拉宾、喷司他丁、2-氯腺苷；铂类似物—— 顺铂、卡铂、奥沙利铂、依络铂(Tetraplatin)、铂-DACH、奥马铂、CI-973、JM-216； 葸环类抗生素/蒽酮——阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、米托蒽醌；表 鬼臼毒素——依托泊苷、替尼泊苷；喜树碱——依立替康、托泊特坎、勒托替康 (Lurtotecan)、Silatecan、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲二氧喜树碱、9-硝基喜树碱、 TAS 103、7-(4-甲基-哌嗪-亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱、7-(2-N-异丙基 氨基)乙基)-20(S)-喜树碱；激素和激素类似物——己烯雌酚、它莫西芬、托瑞米芬、 Tolmudex、Thymitaq、氟他胺、比卡鲁胺、非那雄胺、雌二醇、曲西立滨、多洛昔 芬、醋酸甲羟孕酮、甲地孕酮醋酸酯、氨鲁米特、睾内酯和其他物质；酶、蛋白 质和抗生素——天冬酰胺酶、白细胞介素、干扰素、亮丙瑞林、培门冬酶和其他 物质；长春花碱——长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春酰胺；紫杉醇类——帕 利它西、多烯紫杉醇(Docetaxel)。
[0088]根据机制进行分类：抗激素——参见classification for Hormones and Hormonal Analogues，Anastrozole抗叶酸类——甲氨喋呤、氨基喋呤、三甲曲沙、 甲氧苄啶、Pyritrexim、乙胺嘧啶、依达曲沙、MDAM；抗微管剂——紫杉醇和长 春花碱；烷化剂(经典和非经典)——氮芥类(双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、美法仑、 尿嘧啶氮芥)、氧氮磷环类(Oxazaphosphorines)(异磷酰胺(Ifosfamide)、环磷酰胺、 过磷酰胺、氯乙环磷酰胺(Trophosphamide))、烷基磺酸酯类(马利兰)、亚硝基脲类 (卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素)、塞替派、达卡巴嗪和其他物质；抗代谢物类—— 嘌呤、嘧啶和核苷，如上所列；抗生素类——蒽环类抗生素/葸醌、博来霉素、放 线菌素、丝裂霉素、普卡霉素、喷司他丁、链脲菌素；拓扑异构酶抑制剂——喜 树碱(Topo I)、表鬼臼毒素、m-AMSA、玫瑰树碱(Topo II)；抗病毒类——AZT、扎 西他滨、吉西他汀、地丹诺幸和其他物质；各种细胞毒性剂——羟基脲、米托坦、 融合毒素、PZA、草苔毒素、视黄素、丁酸和衍生物、戊聚糖、烟曲霉素和其他物 质。
[0089]除了上述物质之外，抗癌实体不受限制地包括任何拓扑异构酶抑制剂；长 春花碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春氟宁和长春西汀；微管解聚剂 或微管去稳定剂；微管稳定剂，例如紫杉醇；帕利它西或多烯紫杉醇的氨烷基或 氨酰基类似物，例如2′-[3-(N，N-二乙基氨基)丙酰基]帕利它西、7-(N，N-二甲基甘氨 酰)帕利它西和7-L-丙氨酰帕利它西；烷化剂；受体结合剂；酪氨酸激酶抑制剂； 磷酸酶抑制剂；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；酶抑制剂；极光蛋白激酶抑制 剂；核苷酸、多核苷酸和法兰基转移酶抑制剂。
[0090]在另一实施方案中，包含在本发明脂质体组合物中的实体是下述物质治疗 剂：蒽环类抗生索化合物或衍生物、喜树碱化合物或衍生物、玫瑰树碱化合物或 衍生物、长春花碱或衍生物、渥曼青霉素及其类似物和衍生物、或具有极光蛋白 激酶抑制特性的吡唑并嘧啶。
[0091]在还有另一实施方案中，包含在本发明脂质体组合物中的实体是葸环类抗 生素药物，阿霉素、道诺霉素、丝裂霉素C、表阿霉素、吡柔比星、柔红霉素、癌 霉素、N-乙酰阿霉素、佐柔比星、5-亚氨道诺霉素、N-乙酰道诺霉素、daunoryline、 米托葸醌；喜树碱化合物，喜树碱、9-氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、10-羟基喜树 碱、9-硝基喜树碱、10，11-亚甲二氧喜树碱、9-氨基-10，11-亚甲二氧喜树碱、9-氯-10， 11-亚甲二氧喜树碱、伊立替康、托泊特坎、勒托替康、silatecan、(7-(4-甲基哌嗪 亚甲基)(methylpiperazinomethylene)-10，11-亚乙二氧-20(S)-喜树碱、7-(4-甲基哌嗪亚 甲基)-10，11-亚甲二氧-20(S)-喜树碱、7-(2-N-异丙基氨基)乙基)-(20S)-喜树碱；玫 瑰树碱化合物，玫瑰树碱、6-3-氨丙基-玫瑰树碱、2-二乙基氨基乙基-玫瑰树碱鎓 (ellipticinium)及其盐、达替铵(datelliptium)、retelliptine。
[0092]在还有另一实施方案中，包含在本发明脂质体组合物中的实体是药物实体， 不受限制地包括下述任何物质：抗组胺乙二胺衍生物(bromphenifamine、苯海拉明)； 抗原生动物剂：喹诺酮(双碘喹啉)；脒(戊烷脒)；抗蠕虫剂(噻嘧啶)；抗吸血虫药 物(奥沙尼喹)；抗真菌三唑衍生物(fliconazole、埃他康唑、酮康唑、咪康唑)；抗菌 头孢菌素(头孢唑啉、头孢尼西、头孢噻肟、头孢酰亚胺、头孢呋辛)；抗菌β-内酰 胺衍生物(氨曲南、头孢美唑、头孢西丁)；红霉素组抗菌剂(红霉素、阿奇霉素、 克拉霉素、竹桃霉素)；青霉菌类(苄青霉素、苯氧甲基青霉素、氯唑西林、甲氧西 林、萘夫西林、苯唑西林、羧苄西林)；四环素类；其他抗菌抗生素、新生霉素、 壮观霉素、万古霉素；抗分枝杆菌药物：氨基水杨酸(aminosalicyclc acid)、卷曲霉 素、乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、氯法齐明；抗病毒金刚 烷胺类：金刚烷胺、金刚乙胺；奎尼丁衍生物类：氯喹、羟氯喹、伯胺喹、qionone； 抗菌qionolones：环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星； 磺胺药物类；尿道抗菌剂：六亚甲基四胺、呋哺妥因、trimetoprim；硝基咪唑类： 甲硝唑；胆碱季铵化合物(ambethinium、新斯的明、毒扁豆碱)；抗-阿尔茨海默病 氨基吖啶类(他克林)；抗帕金森药物(苯扎托品、比哌立登、普环啶、苯海索)； 抗毒蕈碱剂(可托品、莨菪碱、东莨菪碱、丙胺太林)；肾上腺素多巴胺(沙丁胺醇、 多巴酚丁胺、麻黄碱、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、metaproperenol、 氟替卡松、特布他林)；麦角胺衍生物类；肌肉松弛素(myorelaxant)或curane系列； 中枢作用肌肉松弛素；巴氯酚、环苯并环庚三烯、苯芙海因；烟碱；β-肾上腺素阻 断剂(beta-adrenoblocker)(acebutil、胺碘酮)；地尔硫草(ditiazem)；抗心律失常药 (diisopyramide、恩卡尼)、局部麻醉剂序列——普鲁卡因、普鲁卡因酰胺、利多卡 因、flecaimide)、奎尼丁；ACE抑制剂：卡托普利、enelaprilat、福辛普利、喹那 普利、雷米普利；抗脂类药物(antilipidemics)：氟伐他汀、吉非贝齐(gemfibrosil)、 HMG-coA抑制剂(普伐他汀)；降压药剂：可乐定、胍那苄、哌唑嗪(prazocin)、胍 乙啶、granadril、肼苯哒嗪；和非冠状血管扩张剂：双嘧达莫。
[0093]根据本发明，包含在本发明脂质体组合物中的实体可以是实体前体 (pre-entity)，例如前药或能够在如pH变化或酶切割不稳定的键的条件下经一步或 多步转化步骤转化为期望的实体的药剂。这种转化可以在前药从脂质体内部释放 在药物/脂质体作用的目的位置处后发生。然而，前药可以在应用脂质体作为输送 载体，例如给予患者之前，在本发明脂质体内部被转化成期望的活性实体。例如， 实体可以被修饰成前药，以便于它更容易地被装载入脂质体中，然后一旦到达本 发明的脂质体内时它可以被转化回到期望的实体。用这种方式，根据本发明，通 常不适于“活性”、“远距离”或其他基于梯度的装载方法的实体，可以以它们天然地、 未修饰的形式，有效地被装载入脂质体，例如装载入脂质体内部空间。
[0094]已知，球形阳离子化合物，即能够在脂质体装载条件下获得净正离子电荷 的化合物，特别是含有可滴定胺的化合物，有效地装载入展示出跨膜离子梯度的 脂质体中。如果感兴趣的实体是有机化合物，并且不是具有可滴定胺的球形阳离 子化合物，那么其具有必要的离子特性的衍生物可以用合适的修饰方法制备而得， 例如根据Woodle等在WO 96/25147中描述的方法。例如，通过用氨基酸酯化实体 的羟基基团可以引入胺基团。作为选择，疏水基团可以被引入水溶性化合物以帮 助它分配入脂质体膜以及随后横穿脂质体膜进入脂质体内室，即进入脂质体里面。 产生脂质体-可装载的实体前体的另一有用的修饰是形成羰基加合物，例如腙、肟、 乙缩醛或酮缩醛。在将修饰的化合物装载入本发明的脂质体后，修饰的含氨基基 团可以从修饰的化合物水解或者用其他化学方法分裂出来。在脂质体内由实体前 体重新产生实体的典型方法是水解、光分解、辐解、硫解、氨解、还原、取代、 氧化或消除。这些方法可以不受限制地通过pH变化或酶作用实现。例如，非离子 实体——帕利它西或多烯紫杉醇被转化成它们的2′-(二乙基氨基丙酰基)-7′-(二乙 基氨基丙酰基)酯，其是弱碱(实体前体)。在用任何已知的方法装载入脂质体后， 通过将pH增加至pH7.0以上来刺激它的水解，使脂质体内的2′-(二乙基氨基丙酰 基)-帕利它西转化成原始的帕利它西，所述装载方法不受限制地包括“活性”、“远 距离”、“基于跨膜-梯度的”或“基于溶解性梯度的”方法，和/或本发明的方法。因此， 将中性紫杉醇分子包囊在它内部空间的脂质体以每摩尔脂质体脂类超过0.05摩尔 的药物/脂类比率获得，无需紫杉醇分子的亲水性共价修饰(例如通过附着PEG)、 环糊精紫杉醇复合体或紫杉醇-增溶、胶束-形成表面活性剂的帮助。
[0095]根据本发明，包含在脂质体组合物中的脂质体可以是任何本领域已知或以 后发现的脂质体。一般而言，本发明的脂质体可以具有任何脂质体结构，例如具 有通过一个或多个脂双层与外部介质隔开的内部空间的结构，或具有携带亲脂性 中心部分的半透性膜的任何微胶囊，在亲脂性中心部分中膜将内部隔离开来。脂 双层可以是具有亲水部分(part)(亲水部分(moiety))和疏水部分(疏水部分)的两 亲性分子的任何排列。通常，双层中的两亲性分子被排列成二维的片，其中疏水 部分朝向片的里面，而亲水部分朝向片的外面。形成本发明脂质体的两亲性分子 可以是本领域已知的或以后发现的任何两亲性分子，例如合成的或天然来源的脂 类或生物相容性脂类。本发明的脂质体也可以由两亲性聚合物和表面活性剂，例 如polymerosomes和niosomes形成。对于本公开的目的而言，不受限制地，这些 形成脂质体的物质也称为“脂类”。
[0096]根据本发明，包含在本发明脂质体组合物中的脂质体也可以是导向脂质体 (targeting liposomes)，例如在脂质体的表面上含有一个或多个导向部分或生物分布 修饰剂的脂质体。导向部分可以是能够与期望的靶标特异性结合或相互作用的任 何介质。在一种实施方案中，导向部分是配体。根据本发明，配体优选与细胞结 合和/或内化入细胞，在细胞中脂质体包载的实体发挥其期望的效应(靶细胞)。配 体通常是结合对的成员，其中第二成员存在于靶细胞上或靶细胞中，或存在于包 含靶细胞的组织中。适宜用于本发明的配体的例子是：叶酸、蛋白质例如转铁蛋 白、生长因子、酶、肽、受体、抗体或抗体片段如Fab′、Fv、单链Fv、单结构域 抗体，或包含抗体分子的抗原结合序列(CDRs)的任何其他多肽。其中导向部分是 抗体或其靶抗原结合片段的配体定向脂质体称为免疫脂质体。在优选的实施方案 中，携带导向部分例如配体的脂质体被内化入靶细胞。在还有另一实施方案中， 导向部分是与酪氨酸激酶受体特异性相互作用的配体，例如，如EGFR、HER2、 HER3、HER4、PD-GFR、VEGFR、bFGFR或IGFR受体。在还有另一实施方案中， 导向部分与生长因子受体、血管生成因子受体、转铁蛋白受体、细胞粘附分子或 维生素受体特异性相互作用。
[0097]根据本发明的另一实施方案，包含在本发明脂质体组合物内的脂质体具有 本发明取代的铵和/或聚阴离子的跨膜浓度梯度。优选地，脂质体内部(内部)空 间中的浓度较高。此外，除了本发明取代的铵和/或聚阴离子产生的梯度之外，本 发明的脂质体组合物可以包括一个或多个跨膜梯度。例如，包含在本发明脂质体 组合物中的脂质体可以额外地包括跨膜pH梯度、离子梯度、电化学势梯度和/或 溶解性梯度。
[0098]根据本发明的还有另一实施方案，本发明的脂质体组合物可以以试剂盒提 供，该试剂盒包含具有脂质体的容器，任选地，具有实体和说明书的容器，例如 关于在一种或多种应用中使用脂质体组合物的程序或信息的说明书。这种说明书 可以通过任何介质提供，例如纸件复印件、电子介质或含有说明书的数据库或网 址端口。
[0099]本发明的脂质体膜组合物可以通过本领域技术人员已知的或以后发现的任 何适宜的方法制备。一般而言，各种脂类组分可以被用于制备本发明的脂质体。 脂质体组分通常包括，但是不限于：(1)不带电荷的脂组分，例如胆固醇、神经酰 胺、二酰基丙三醇、酰基(聚醚)或烷基聚(醚)；(2)中性磷脂，例如二酰基磷脂酰 胆碱、鞘磷脂和二酰基磷脂酰乙醇胺，(3)阴离子脂类，例如二酰基磷脂酰丝氨酸、 二酰基磷脂酰丙三醇、二酰基磷酸酯、心磷脂、二酰基磷脂酰肌醇、二酰基丙三 醇半琥珀酸酯、二酰基丙三醇半戊二酸酯、胆甾醇半琥珀酸酯、胆甾醇半戊二酸 酯和类似物；(4)聚合物-共轭脂类，例如N-[甲氧基-(聚(乙二醇)二酰基磷脂酰乙 醇胺、聚(乙二醇)-二酰基丙三醇、聚(乙二醇)-神经酰胺；和(5)阳离子脂类，例如 1，2，-二酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)、二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)和1，2-二酰 基-sn-丙三醇-3-乙基磷酸胆碱。也可以利用这些脂类的单酰基-取代的衍生物，以 及二-和单烷基-类似物。
[0100]可以选择各种脂类成分以满足、修改或赋予一种或多种期望的功能。例如， 磷脂可以被用作主要的小泡-形成脂类。包含胆固醇以用于维持膜的刚性并减少药 物渗漏。聚合物-共轭的脂类可用于脂质体配方中，以通过减少脂质体被肝脏和脾 脏清除来增加循环寿命，或在缺少循环扩展效应的情况下提高存储期间脂质体针 对聚集作用的稳定性。尽管以脂质体脂类的1摩尔％或更高的量包含PEG-脂类被 认为具有延长若干倍的脂质体血液循环时间(参见例如美国专利5,013,556)，但是我 们惊奇地发现本发明的脂质体具有相当长的循环时间，而将PEG-脂类加入到脂质 体组合物仅仅将循环寿命延长不到两倍，如果有的话。此外，电荷-调控(可滴定) 脂类可以被用于通过帮助一些类型的实体规避内体途经的包围，来帮助输送脂质 体包囊的实体至细胞靶标或核靶标。
[0101]在一种实施方案中，本发明的脂质体包括卵磷脂、胆固醇和两亲性聚合物。 包含在本发明的脂质体中的卵磷脂可以是天然卵磷脂、氢化的天然卵磷脂、合成 的卵磷脂、1，2-二硬脂酰-卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二豆蔻酰卵磷脂、二油酰卵磷 脂、1-硬脂酰-2-油酰卵磷脂或1-棕榈酰-2-油酰卵磷脂，而两亲性聚合物可以是聚 乙二醇-脂类衍生物例如聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二酰基丙三醇、或聚乙 二醇-神经酰胺衍生物，其中聚(乙二醇)部分的分子量约250至约20,000，最常见 的约500至约5,000。在另一实施方案中，在本发明脂质体中的卵磷脂和胆固醇的 摩尔比约3∶2。在还有另一实施方案中，两亲性聚合物占本发明脂质体中的脂质体 形成脂类的至少0.1摩尔％。在还有另一实施方案中，两亲性聚合物的量在本发明 脂质体中的脂质体形成脂类的0.1摩尔％至1摩尔％之间。优选地，两亲性聚合物 是中性聚合物，即在药物装载条件下具有零净离子电荷，例如PEG-二酰基丙三醇、 PEG-二烷基丙三醇或PEG-神经酰胺。出人意料地发现，包含PEG-脂类含量可达 总脂的约5.7摩尔％(摩尔百分比)的离子中性两亲性脂类使脂质体高效率装载例 如长春花碱如长春瑞滨，而在阴离子带电荷PEG-DSPE的情况下，在PEG-脂类含 量为1.6摩尔％(摩尔百分比)或更高时，装载效率显著下降(实施例72)。
[0102]在还有另一实施方案中，本发明的脂质体含有喜树碱衍生物，例如喜树碱 前药如伊立替康，并且该脂质体以例如约3∶2的摩尔比包含卵磷脂和胆固醇，和 例如以脂质体形成脂类的至少0.1摩尔％或1％以下的量包含两亲性聚合物。
[0103]本发明的脂质体可以通过本领域已知或将会知道的任何方法制备。参见例 如G.Gregoriadis(编者)，Liposome Technology，vo1.1-3，第1版，1983；第2版，1993， CRC Press，Boca Raton，FL。适宜制备本发明脂质体组合物的方法的例子包括挤出、 反相蒸发、超声波、溶剂(例如乙醇)注射、微流化作用、洗涤剂透析、醚注射和脱 水/再水合。通过控制用于低压挤出的膜孔大小或用于微流化作用的压力或通过次 数或任何其他适宜的方法可以控制脂质体的大小。在一种实施方案中，期望的脂 类首先通过薄膜水合作用或通过乙醇注射进行水合，随后利用通过确定孔大小的 膜进行挤出形成一定的尺寸，最常见的为0.05μm、0.08μm或0.1μm。
[0104]在脂质体内部含有本发明取代的铵和/或聚阴离子的脂质体组合物可以用 任何适宜的方法制备，例如，在例如以盐形式的本发明取代的铵和/或聚阴离子存 在下形成脂质体。或者在脂质体形成之后，或者在装载或包载期望的实体之前， 可以将脂质体外的取代的铵和/或聚阴离子去除或稀释。可选择地，含有本发明取 代的铵和/或聚阴离子的脂质体组合物可以直接通过离子交换方法制备，或通过中 间游离酸步骤制备，该中间游离酸步骤具有本发明取代的铵的梯度，例如取代的 聚阴离子化的糖或多元醇的铵盐。这种脂质体可以用具有挥发酸的胺或它的盐， 例如碳酸盐中和。所得的脂质体溶液可以直接使用，或者作为选择，如果需要， 包含在其中的盐可以被去除，例如通过蒸发和结晶去除，然后溶解在含水介质中。
[0105]优选地，本发明的脂质体组合物具有取代的铵和/或聚阴离子跨膜浓度梯 度，例如脂质体内的取代的铵和/或聚阴离子盐的浓度通常比脂质体外介质中的取 代的铵和/或聚阴离子的浓度高至少100倍。
[0106]在一种实施方案中，脂质体内的取代的铵和/或聚阴离子盐的浓度比脂质体 外介质中的取代的铵和/或聚阴离子盐的浓度高至少100倍，并且浓度至少约 10mM、50mM、0.1M、0.2M、0.5M、0.6M、0.7M或1.0M，其中摩尔浓度根据取 代的胺进行计算。在另一实施方案中，脂质体内的取代的铵和/或聚阴离子盐的浓 度比脂质体外介质中的取代的铵和/或聚阴离子盐的浓度高至少100倍，并且浓度 约0.65M或约1.0M。
[0107]此外，本发明的脂质体组合物外部通常具有这样的pH，该pH适宜于或有 助于在装载过程中维持期望实体的稳定性，以及高装载效率，例如90％以上的包 载水平。例如，优选pH在pH4-7或pH4.5-6.5范围内。特别地，根据本发明，对 喜树碱化合物例如托泊特坎或伊立替康的装载，最好在外部介质的pH在约4.0至 约7.0范围内，更优选地在约pH5.0至pH6.5范围内完成。装载长春花碱衍生物， 例如长春新碱、长春瑞滨或长春碱，最好在pH约5.0-7.0，更优选在pH约6.5下 完成。
[0108]根据本发明，通过将期望的实体与本发明的脂质体在含水介质中于合适的 温度温育，可以将期望的实体装载或包载入脂质体中，温度例如在装载期间高于 脂类成分的相转变温度，在装载实体之后低于相转变温度。温育时间通常基于脂 类成分的特性、装载入脂质体的实体和温育温度。典型地，温育时间从几分钟至 几小时足够。因为获得85％以上的高包载效率，通常为90％以上，通常没有必要 去除未包载的实体。然而，如果有必要去除未包载的实体，未包载的实体可以用 各种方法从组合物去除，方法如尺寸排阻层析、透析、超滤、吸附或沉淀。出人 意料地发现，在将实体如特别是喜树碱衍生物或长春花碱衍生物与本发明的脂质 体温育期间，维持低离子强度，然后在温育结束时增加离子强度，产生较高的装 载效率、更好地去除未包载的药物以及脂质体对聚集具有更好的稳定性。典型地， 在例如含水溶液中，在离子强度小于相当于50mM NaCl的离子强度，或更优选地 小于相当于30mM NaCl的离子强度下，进行温育。温育之后，可以加入浓盐溶液， 例如浓NaCl溶液，将离子强度提高到高于相当于50mM NaCl的离子强度，或更 优选地，高于100mM NaCl的离子强度。不受理论限制地，我们假设，离子强度 的增加有助于实体从脂质体膜的解离，使得基本上所有实体包囊在脂质体内部空 间中。
[0109]一般而言，实体-脂类比率，例如在装载实体时获得的药物装载比率，取决 于包载在脂质体内的实体量、包载的取代的铵和/或聚阴离子例如盐的浓度、包载 的实体的物化特性以及使用的相反离子(阴离子)例如聚阴离子的类型。因为在组 合物中和/或通过本发明的方法获得了高装载效率，对于包载在脂质体中的实体而 言，实体-脂类比率为基于装载过程中所用的实体和脂质体脂类的量而计算出的实 体-脂类比率的80％以上、90％以上，以及通常为95％以上(输入比率)。事实上， 实践上100％(定量)的包囊水平是常见的。脂质体中实体-脂类比率可以根据重量比 (每重量或摩尔单位的脂质体脂类的实体重量)或摩尔比(每重量或摩尔单位的 脂质体脂类的实体摩尔数)表征。通过常规的计算方法，例如示例于下的常规的 计算方法，一个单位的实体-脂类比率可以被转化成其他单位。在本发明脂质体中 的实体的重量比典型为每mg脂类至少0.05、0.1、0.2、0.35、0.5或至少0.65mg 实体。根据摩尔比，本发明的实体-脂类比率为每摩尔脂质体脂类至少约0.02至约 5、优选至少0.1至约2、更优选地约0.15至约1.5摩尔药物。在一种实施方案中， 实体-脂类比率，例如喜树碱衍生物的药物装载比率为每一摩尔脂质体脂类至少0.1 摩尔例如0.1摩尔喜树碱衍生物，优选至少0.2摩尔。在另一实施方案中，实体- 脂类比率，例如药物装载量，为每mg脂质体形成脂类至少约300mg实体(例如 长春花碱其衍生物)。在还有另一实施方案中，实体-脂类比率，例如药物装载量， 为每mg脂质体形成脂类至少约500mg实体(例如喜树碱衍生物或喜树碱前药)。 令人惊奇地，本发明提供稳定和接近于定量的喜树碱衍生药物例如伊立替康的脂 质体包囊，，其中药物-脂类比率为每1克脂质体脂类超过0.8mmol实体，每1克 脂质体脂类超过1.3mmol实体，甚至为每1克脂质体脂类超过1.7mmol实体(参 见实施例74)。
[0110]如果脂质体包含磷脂，方便地用每摩尔单位的脂质体磷脂所具有的药物重 量(质量)单位数来表示实体含量，例如mg药物/mmol磷脂。然而，本领域技术 人员将认识到药物含量同样可以以不依赖于脂质体中磷脂的存在的方式来表示， 此外，同样可以根据每单位(质量或摩尔)脂质体脂类含量所具有的药物的摩尔 数来表示。例如，含有3摩尔份二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，分子量790)、2摩尔 份胆固醇(分子量387)和0.015摩尔份聚(乙二醇)-衍生化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (PEG-DSPE，分子量2750)，和含有药物/脂类比率为150mg/mmol磷脂的药物阿 霉素(分子量543.5)的脂质体，相同的药物含量可以等同地用mg药物/mg总脂类 表示如下：(a)通过组分的摩尔数量除以脂质体磷脂总的摩尔数量，计算脂质体脂类组分的摩 尔数量，其被标准化为脂质体磷脂(在该例子中是DSPC和PEG-DSPE)的摩尔单位：
DSPC 3/(3+0.015)＝0.99502
胆固醇2/(3+0.015)＝0.66335
PG-DSPE 0.015/(3+0.015)＝0.00498
(b)计算与脂质体磷脂的单位摩尔数量和组分分子量相对应的总脂类的质量数量 总脂类，mg/mmol磷脂＝0.99502×790+0.66335×387+0.00498×2750＝1056.48
(c)通过以每摩尔单位磷脂的质量单位表示的药物含量除以步骤(b)中获得的数，计 算每质量单位总脂类的药物质量数量：
阿霉素，mg/mg总脂类＝150/1056.48＝0.14198。
(d)通过步骤(c)中获得的数除以药物分子量(在该例子中为543.5)，计算每单位总 脂类质量所具有的药物摩尔数。
阿霉素，mmol/g总脂类＝0.14198/543.5×1000＝0.261.
(e)计算磷脂在脂质体脂类基质中所占的摩尔份数：
磷脂摩尔份数＝(磷脂总摩尔数)/(脂类总摩尔数)＝(3+0.015)/(3+2+0.015)＝ 0.6012。
(f)计算阿霉素与总脂类的摩尔比。
DSPC 3/(3+0.015)＝0.99502
胆固醇2/(3+0.015)＝0.66335
PG-DSPE 0.015/(3+0.015)＝0.00498
(b)计算与脂质体磷脂的单位摩尔数量和组分分子量相对应的总脂类的质量数量 总脂类，mg/mmol磷脂＝0.99502×790+0.66335×387+0.00498×2750＝1056.48
(c)通过以每摩尔单位磷脂的质量单位表示的药物含量除以步骤(b)中获得的数，计 算每质量单位总脂类的药物质量数量：
阿霉素，mg/mg总脂类＝150/1056.48＝0.14198。
(d)通过步骤(c)中获得的数除以药物分子量(在该例子中为543.5)，计算每单位总 脂类质量所具有的药物摩尔数。
阿霉素，mmol/g总脂类＝0.14198/543.5×1000＝0.261.
(e)计算磷脂在脂质体脂类基质中所占的摩尔份数：
磷脂摩尔份数＝(磷脂总摩尔数)/(脂类总摩尔数)＝(3+0.015)/(3+2+0.015)＝ 0.6012。
(f)计算阿霉素与总脂类的摩尔比。
[0111]阿霉素，mol/mol总脂类＝(磷脂摩尔份数)×(阿霉素，g/mole磷脂)/(阿霉素 分子量)＝0.6012×150/543.5＝0.166
[0112]因此，用各种单位表示的药物-脂类和药物-磷脂比率之间的关系容易建立。 本文所使用的“脂类”不受限制地包括脂质体膜中的任何膜形成成分，如聚合物和/ 或洗涤剂。
[0113]本发明脂质体包载的取代的铵和/或聚阴离子盐溶液通常具有这样的渗透强 度(同渗重摩)，该渗透强度帮助脂质体对渗透破坏(膨胀和/或破裂)保持稳定，而不 牺牲脂质体的装载容量。在一种实施方案中，本发明脂质体组合物的同渗重摩在 0.1至1.5mol/kg范围内，优选在0.2至1.0mol/kg范围内。令人惊奇地，我们发现 本发明的脂质体对于高脂质体内渗透强度对药物装载的不利影响是稳定的。高达 0.727mol/kg的脂质体内同渗重摩被充分耐受，这导致药物的实际定量装载达到脂 质体内取代的铵离子交换药物分子的化学计量的最大理论值(在伊立替康的情况 下，每一取代的铵离子为一个药物单位)，即使对于药物和脂质体共温育期间脂质 体外含水介质的同渗重摩接近约0.3mol/kg的生理值也如此(实施例74)。
[0114]一般而言，本发明的脂质体组合物在保藏期间相当稳定，这是例如从本发 明脂质体中的实体的初始装载起的一段时间阶段之后，由释放在脂质体外的包载 的实体或依然保持在脂质体内的实体的百分比所测定的。例如，本发明的脂质体 组合物在4℃中稳定至少6个月，例如在最初装载实体之后6个月，10％以下包载 的实体释放出来。在一种实施方案中，本发明的脂质体组合物在4℃中稳定至少2 年，例如在最初装载实体之后2年，20％以下包载的实体释放出来。
[0115]直到脂质体到达它的目的作用位置之前，例如在对并人施用脂质体抗肿瘤 药物情况下，脂质体到达肿瘤之前，脂质体包载的实体一直保持包囊在脂质体中 是有利的。在体内条件下，例如在哺乳动物血液中，本发明的脂质体对于包载的 实体的释放(渗漏)显示出惊人的稳定性。在大鼠体内血液中，50％包载的实体例 如药物从脂质体释放出来所需要的暴露时间(半释放期)超过24小时。特别地， 装载有长春花碱药物例如长春碱、长春新碱和长春瑞滨的脂质体对体内药物渗漏 显示显著的稳定性，半释放期至少24小时，或体内血液中24小时之后保持包囊 在脂质体内的实体的数量为给药前值的至少约50％。典型地，观察到半释放期超 过33小时，或体内血液中24小时之后保持包囊在脂质体内的包囊的实体的数量 至少约60％；甚至半释放期超过46小时，或体内血液中24小时之后保持包囊在 脂质体内的包囊的实体的数量为给药前值的至少约70％也是常见的。有时，包囊 的药物在体内血液中的半释放期超过93小时，甚至超过120小时。装载喜树碱衍 生物如托泊特坎和伊立替康的脂质体在体内血液中也显示出优越的稳定性，24小 时之后79-85％的原始药物装载保持包囊在脂质体中。引人注目地，尽管在血液循 环中具有如此低的体内药物释放速度，本发明的脂质体显示出超过游离药物(即作 为溶液施用的药物)的重大的体内抗肿瘤活性。
[0116]本发明的脂质体意想不到地既提供了的包载治疗剂的高功效，也提供了低 毒性。一般而言，本发明包囊入脂质体的治疗剂实体在哺乳动物中的活性，例如 喜树碱衍生物的抗肿瘤活性，与以相同的数量通过其常规非脂质体制剂，例如不 使用本发明的脂质体组合物的方式给药的治疗剂的活性相比，至少相等、高至少 两倍和高至少四倍，而包囊在脂质体中的实体的毒性不超过以相同剂量和时间安 排但是以游离的非包囊的形式给药的相同的治疗剂实体的毒性、低至少两倍、至 少三倍或低至少四倍。例如，一般地已知，通过其他公开的方法用脂质体包囊抗 癌症喜树碱衍生物导致毒性相比起未包囊的药物有所增加(较低的最大耐受剂量， 较低的50％致死剂量)。参见美国专利6,355,268；美国专利6,465,008；Colbern，et al. Clinical Cancer Res.1998，v.4，p.3077-3082；Tardi，et al.Cancer Res.，2000，v.60， p.3389-3393；Emerson，et al.Clinical Cancer Res.2000，v.6，p.2903-2912。经体内肿 瘤模型评价，脂质体包囊的喜树碱前药，如水溶性的伊立替康(CPT-11)、阳离子喜 树碱前药衍生物，比缺少脂质体制剂时的药物例如游离(溶液)形式的药物，具 有高得多的抗肿瘤活性，例如高至少4倍、甚至10倍。因为治疗剂化合物例如喜 树碱前药需要酶作用，例如需要内源性非特异性羧酸酯酶作用，但是根据本发明 该酶被基本上包囊在脂质体内部空间内，所以这甚至更为显著。另一方面，令人 惊奇地，本发明脂质体形式的喜树碱前药如CPT-11(药物/脂类质量比率超过0.1， 例如0.2-0.6或更多)的毒性，比游离的(未包囊的)前药CPT-11的毒性低2倍以 上、3倍以上和甚至4倍以上。此外，药物体内从CPT-11脂质体释放出的时间延 长，在投入血流之后24小时，50％以上、甚至70％以上(79-86％)的原始药物含量 依然保留在脂质体中，半释放期超过24小时，典型地超过48小时。在体内药物 保留在脂质体内的时间延长与较高的抗肿瘤效应相关。令人惊奇地，在含有低分 子量的聚阴离子化的糖衍生物(八硫酸蔗糖)而不是聚合物阴离子(聚磷酸盐)的脂质 体中观察到最低的体内CPT-11释放和最高的抗肿瘤活性(实施例15)。
[0117]根据本发明的另一实施方案，本发明的脂质体组合物可以作为药物组合物 提供，该药物组合物含有本发明的脂质体组合物，和载体例如药学上可接受的载 体。药学上可接受的载体的例子是生理盐水、等渗葡萄糖、等渗蔗糖、林格氏溶 液和Hanks′溶液。可以加入缓冲物质以提供获得保藏稳定性的最优pH。例如，约 6.0至约7.5之间的pH，更优选地约6.5的pH对于脂质体膜脂类的稳定性是最佳 的，并提供对包载的实体优异的保持力。典型地，2-20mM浓度的组氨酸、羟乙 基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)、吗啉代(morpholipo)-乙基磺酸盐(MES)、琥珀酸盐、 酒石酸盐和柠檬酸盐是示范性缓冲物质。其他适宜的载体包括例如水、缓冲水溶 液、0.4％NaCl、0.3％甘氨酸和类似物。可以加入蛋白质、碳水化合物或聚合物稳 定剂和张力调节剂，例如凝胶、清蛋白、葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮。组合物的张 力可以用葡萄糖或更惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露醇或糊精调节至0.25-0.35 mol/kg的生理水平。这些组合物可以通过传统的、熟知的灭菌技术如通过过滤灭 菌。所得的含水溶液可以包装起来以便使用，或在无菌条件下过滤并冻干，冻干 的制剂在给药之前与无菌含水介质混合。
[0118]如需要，药物脂质体组合物也可以含有其他药学上可接受的辅助物质，以 接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂和类似物，例如醋酸钠、乳 酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，脂质体悬浮液可以包括脂类保护剂， 其保护脂类在保存时免遭自由基和脂类过氧化物破坏。亲脂性自由基淬火剂，如α- 生育酚和水溶性离子特异性如醯胺铁(ferrioxamine)是适宜的。
[0119]在流体药物制剂中本发明脂质体的浓度可以在宽范围内变化，即按重量计 算从通常约0.05％以下或至少约2-10％到多达30至50％，并主要通过流体体积、 粘度等根据所选择的特定的给药方式进行选择。例如，可以增加浓度以减少与治 疗相关的流体装载。这在患有动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压 的患者中可能特别有利。可选择地，由刺激性脂类组成的脂质体药物组合物可以 被稀释到低浓度，以减少在给药位置出现炎症。
[0120]投药的脂质体药物组合物的数量将取决于包载在脂质体中的特定治疗剂实 体的数量、正被治疗的疾病状态、正被使用的脂质体的类型以及医师的判断。一 般而言，投药的脂质体药物组合物的数量将足以输送治疗上有效剂量的特定的治 疗剂实体。
[0121]输送治疗上有效的剂量所必需的脂质体药物组合物的量可以通过药物测试 领域常见的常规的体外和体内方法测定。参见例如D.B.Budman，A.H.Calvert，E.K. Rowinsky(编者).Handbook of Anticancer Drug′Development，LWW，2003。各种治疗 剂实体的治疗上有效的剂量是本领域熟知的；根据本发明，通过本发明的药物脂 质体组合物输送的治疗剂实体给出了与用其常规非脂质体制剂给予相同数量的治 疗剂实体所获得的活性至少相同或高2倍、4倍或10倍的活性。典型地，本发明 脂质体药物组合物的剂量在每千克体重约0.005至约500mg治疗剂实体之间的范 围内，最经常地，在每千克体重约0.1至约100mg治疗剂实体之间的范围内。
[0122]典型地，本发明的脂质体药物组合作为局部物质或可注射物质制备，或者 是液体溶液或者悬浮液。然而，也可以制备适于在注射之前溶于或悬浮于液体载 体中的固体形式。组合物也可以根据本领域已知的方法配制成肠包覆的片剂或凝 胶胶囊。
[0123]本发明的脂质体组合物可以用医学上可接收的任何方式给药，这取决于所 治疗的病症和损伤。可能的给药途经包括注射，通过肠胃外途经，如肌内、皮下、 静脉内、动脉内、腹膜内、关节内、脑膜内、鞘内，或其他途经；以及经口、鼻、 眼、直肠、阴道、局部或肺部，例如通过吸入的方法。对于将根据本发明配制的 脂质体药物输送至中央神经系统的肿瘤，缓慢而持续地将脂质体直接颅内输注入 肿瘤(对流加强传送(convection enhanced delivery)或CED)是特别有利的。参见 Saito，et al.，Cancer Research，voi.64，p.2572-2579，2004；Mamot，et al.，J. Neuro-Oncology，vol.68，p.1-9，2004。组合物也可以直接施用于组织的表面。持续 释放给药、pH依赖性释放给药或其他特异性化学或环境条件介导的释放给药也明 确包含在本发明中，例如通过诸如缓释注射(depot injection)或可蚀性移植(erodible implant)这样方法给药。实施例
[0124]下面的实施例旨在举例说明本发明但不是以任何方式、形状或形式或者明 确地或者含蓄地限制本发明。尽管这些实施例是可能使用的实施例中的典型，本 领域技术人员知道的其他步骤、方法或技术也可以选择使用。实施例1.取代的铵盐溶液的制备
[0125]通过用水将硫酸稀释至0.25M浓度，然后用众多胺中的其中一种胺滴定硫 酸溶液，制备用于将药物(例如阿霉素)装载入脂质体的三烷基铵和二烷基铵硫酸盐 溶液。用于该实施例的取代的胺是三乙胺、三甲胺、二甲胺、二乙胺或二乙醇胺。 加入胺之后，将所得溶液稀释至0.2M的取代的铵盐终浓度。使用露点渗透压机 (dew point osmometer)测定同渗重摩。所得的取代的烷基铵硫酸盐溶液的特性在下 表1中示出。表1.各种二烷基铵和三烷基铵硫酸盐溶液的特性
盐 同渗重摩，mmol/kg pH 硫酸二甲铵 硫酸二甲乙醇铵 硫酸二乙铵 硫酸三甲铵 硫酸三乙铵 472 509 519 497 559 5.65 5.72 5.85 5.81 5.33
实施例2.含有包载的二烷基铵盐和三烷基铵盐的脂质体的制备，和将物质装载入 这些脂质体
盐 同渗重摩，mmol/kg pH 硫酸二甲铵 硫酸二甲乙醇铵 硫酸二乙铵 硫酸三甲铵 硫酸三乙铵 472 509 519 497 559 5.65 5.72 5.85 5.81 5.33
实施例2.含有包载的二烷基铵盐和三烷基铵盐的脂质体的制备，和将物质装载入 这些脂质体
[0126]将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(Chol)和N-(甲氧基-聚(乙二醇)-氧羰 基)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)(由聚(乙二醇)制备，分子量2,000)以3∶2∶ 0.015摩尔比共溶于氯仿，并在55-60℃通过旋转蒸发去除氯仿。干燥的脂膜然后 在60℃于实施例1中列出的二烷基铵硫酸盐或三烷基铵硫酸盐的其中一种的溶液 中水合30分钟。脂悬浮液在压力下被挤出通过孔径为0.1μm的二叠层聚碳酸酯径 迹蚀刻膜过滤器(two stacked polycarbonate track-etched membrane filter)(Corning Nuclepore)。通过准弹性光散射方法(quasielastic light scattering method)测定的脂质 体大小近似为110-120nm。通过凝胶过滤，使用交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-75， Amersham Pharmacia Biotechnology)柱，用pH7.2-7.4的HEPES-缓冲盐水洗脱该柱， 将未包囊的三烷基铵或二烷基铵盐从脂质体的外部介质中去除，脂质体收集在柱 的孔隙体积部分。以150μg药物/pmol脂质体磷脂的浓度，将盐酸阿霉素USP(冻 干粉末，每1份阿霉素含有2重量份乳糖)加入到脂质体中。混合物在55℃温育45 分钟，冰上冷冻10分钟，通过凝胶过滤层析，使用Sephadex G-75柱，用pH7.4 的HEPES-缓冲盐水洗脱，去除未包囊的药物。游离阿霉素的存在(特征为出现较 慢移动的红色带)无法通过视觉观察到。分别根据实施例70和71(分光光度法)， 分析纯化的装载阿霉素的脂质体的磷脂和阿霉素。所得的药物装载效率在表2中 示出。表2.阿霉素装载入含有包载的二烷基铵盐溶液和三烷基铵盐溶液的脂质体。输入 药物/磷脂比率150μg/μmol。
脂质体-包载的盐 脂质体中的药物/磷脂比率 (μg/μmol) 包载效率(％) 硫酸三甲铵 硫酸三乙铵 硫酸二乙铵 硫酸二甲基乙醇铵 140.74±10.35 163.81±16.41 158.16±18.34 155.08±8.51 93.8±5.7 109.2±11.6 105.4±7.8 103.4±11.6
实施例3.含有各种二烷基-、三烷基-和杂环-取代铵硫酸盐的脂质体的制备，和阿 霉素装载入这些脂质体。
脂质体-包载的盐 脂质体中的药物/磷脂比率 (μg/μmol) 包载效率(％) 硫酸三甲铵 硫酸三乙铵 硫酸二乙铵 硫酸二甲基乙醇铵 140.74±10.35 163.81±16.41 158.16±18.34 155.08±8.51 93.8±5.7 109.2±11.6 105.4±7.8 103.4±11.6
实施例3.含有各种二烷基-、三烷基-和杂环-取代铵硫酸盐的脂质体的制备，和阿 霉素装载入这些脂质体。
[0127]如实施例1，使用商业上可获得的烷基-取代的、羟烷基-取代的和杂环胺制 备取代的铵的硫酸盐溶液。如实施例1，形成脂质体，除了替换脂膜水合步骤，将 纯脂类溶解在乙醇中(每50μmol磷脂，近似100μl乙醇)，并在60-65℃与取代的 铵盐溶液混合，以便得到的脂类分散液含有约10vol.％的乙醇。
[0128]通过将阿霉素溶液(2mg/ml，于pH6.5的HEPES-缓冲盐水中)以155μg药 物/μmol脂质体磷脂(PL)的比率加入到脂质体，并在热水浴中58℃加热45分钟， 以装载阿霉素。将所得的脂质体与任何残留的未包囊的阿霉素分离开来，并分析 药物和脂类含量，如实施例1所述。结果在表3中示出。表3.阿霉素装载入含有包载的空间受阻的取代的烷基、二烷基-、三烷基-和杂环 铵盐溶液的脂质体中。
用于制备取代的 铵盐的胺 同渗重摩， mmol/kg 药物装载， mg/mmol磷脂 装载效率，％ 三甲胺 三乙胺 二甲基乙醇胺 二甲胺 二乙胺 二异丙胺 三(羟甲基)-氨基 甲烷 1-哌啶乙醇 4-甲基吗啉 哌啶 497 559 509 472 519 533 423 506 465 479 149.4±7.9 149.6±6.9 163.1±6.6 158.6±7.4 156.7±13.0 159.9±6.2 179.9±15.3 153.5±7.1 152.4±9.8 158.5±12.5 96.4±4.9 96.5±4.3 105.3±4.5 102.3±4.9 101.1±8.5 103.2±4.1 116.1±11.5 99.9±4.5 98.3±6.2 102.3±8.2
1-甲基吡咯烷 二甲基哌嗪 492 378 153.6±12.3 158.0±6.5 99.1±7.8 101.9±4.3
实施例4.三乙铵多磷酸盐(TEA-Pn)溶液的制备
用于制备取代的 铵盐的胺 同渗重摩， mmol/kg 药物装载， mg/mmol磷脂 装载效率，％ 三甲胺 三乙胺 二甲基乙醇胺 二甲胺 二乙胺 二异丙胺 三(羟甲基)-氨基 甲烷 1-哌啶乙醇 4-甲基吗啉 哌啶 497 559 509 472 519 533 423 506 465 479 149.4±7.9 149.6±6.9 163.1±6.6 158.6±7.4 156.7±13.0 159.9±6.2 179.9±15.3 153.5±7.1 152.4±9.8 158.5±12.5 96.4±4.9 96.5±4.3 105.3±4.5 102.3±4.9 101.1±8.5 103.2±4.1 116.1±11.5 99.9±4.5 98.3±6.2 102.3±8.2
1-甲基吡咯烷 二甲基哌嗪 492 378 153.6±12.3 158.0±6.5 99.1±7.8 101.9±4.3
实施例4.三乙铵多磷酸盐(TEA-Pn)溶液的制备
[0129]将每分子含有13-18磷酸盐单元的线性多(磷酸)钠(Phosphate glass； CALGON，得自Sigma Chemical Company)溶解入水中，获得约1.3M磷酸盐的 浓度。将溶液通过填充有120mL氢形式的磺酸化聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物阳 离子交换树脂珠(Dowex 50W×8-200，Dow Chemical Co.)的柱。该柱用含水的3-3.6 M HCl预先平衡使得树脂为氢形式，并用去离子水洗涤至中性pH。将15ml多磷 酸钠溶液应用到柱上，并用去离子水洗脱。使用传导率检测仪监测柱洗脱剂。传 导率在峰值时的柱流出物用纯三乙胺滴定至pH5.5-6.0。使用钠-敏感性玻璃电极通 过电势分析法分析溶液中残留的钠，使用无机磷酸盐分析法分析磷酸盐含量，如 实施例1所述。将残留钠含量在1％以下的溶液稀释至最终磷酸盐浓度为0.55M。 典型地，溶液的TEA浓度为0.52-0.55M、pH为5.5-6.0和同渗重摩为430-480 mmol/kg。实施例5.从脂质体制剂去除未包囊的聚磷酸盐
[0130]根据Kirpotin，et al.，Biochemistry 36：66-75，1997，制备含有包载的荧光标记 8-羟基芘三磺酸盐的脂质体(大小为120nm)，并与多磷酸钠溶液混合。将混合物装 载在含有全部获自Amersham Pharmacia的交联葡聚糖珠(Sephadex G-75)、6％琼脂 糖珠(Sepharose 6B-CL)或4％琼脂糖珠(Sepharose 4B-CL)的尺寸排阻柱上，并用 MES-葡萄糖缓冲液(pH5.5)洗脱。使用Bartlett(1959)的磷酸盐测定法分析流出物 的磷酸盐含量，通过荧光光谱法测定脂质体含量。在研究的凝胶-层析载体中， Sepharose CL-6B能在样品/柱床体积比为13时将聚磷酸盐与脂质体完全分开。实施例6.制备三乙铵蔗糖八硫酸盐(TEA-SOS)溶液
[0131]蔗糖八硫酸钠(当量，144.8)是蔗糖衍生物的钠盐，其中所有羟基基团已经 形成硫酸酯。蔗糖八硫酸(SOS)钠盐购自Toronto Research Chemicals，Toronto， Canada，p/n S699020。将6克蔗糖八硫酸钠溶解在16.57ml的去离子水中，得到约 2.5N的硫酸盐基团终浓度。溶液通过离子交换处理，如实施例4所述。然后用纯 三乙胺滴定作为离子交换柱流出物获得的蔗糖八硫酸溶液，至pH5.7(中和点)，并 测定溶液的pH和同渗重摩。所得溶液计算得到的三乙铵浓度为0.643M，pH5.7， 同渗重摩为530mmol/kg。残留钠的存在用电势分析法无法检测到(0.1％以下)。实施例7.用取代的铵盐装载有伊立替康(CPT-11)的脂质体：制备和在血浆存在下 体外药物释放。
[0132]在本实施例中，硫酸盐、柠檬酸盐、焦磷酸盐、三磷酸盐和线性聚磷酸盐 (13-18mer)作为阴离子在脂质体-包载的取代的铵盐溶液中被研究。因为磷酸盐聚 合物具有生物可降解性和因为聚磷酸盐在细胞中天然发现的缘故，选择磷酸盐聚 合物，作为其他合成的聚合物阴离子(聚丙烯酸盐、葡聚糖硫酸盐和类似物)的对照。 还有，低分子量的聚磷酸盐溶液的粘性比其他聚合物的粘性低，这使得聚磷酸盐 更容易处理。
[0133]下面的物质被用于制备盐溶液：1.多磷酸钠，NaO-[PO3Na]n-Na，n＝13-18，购自Sigma(产品编号P-8510，“磷酸盐 级(phosphate Glass)，实践级(practical grade)”，也称为六偏磷酸钠或商标名 CALGON)；
2.三多磷酸五钠，Na5P3O10，购自Sigma(产品编号T-5883)；
3.十水焦磷酸四钠，Na4P2O7·10H2O，购自Sigma(产品编号P-9146)。
4.购自Sigma的离子交换树脂Dowex 50Wx4(4％交联的磺酸化聚苯乙烯树脂， 100-200网孔)(产品编号50×4-200)，或购自Sigma的Dowex HCR-W2(8％交联的 磺酸化聚苯乙烯树脂50-100网孔)(产品编号I-8880)可交换使用。按下面的倾析顺 序来洗涤树脂：用去离子水倾析三次，用1N HCl(体积超过树脂3倍)倾析两次， 用水倾析三次，用1N NaOH倾析两次，用水倾析三次，用1N HCl倾析三次，用 水倾析三次。倾析之后，树脂是H+形式。
5.三甲胺(TMA)，水溶液40％，购自Aldrich Chemical Co.(产品编号43,326-8)。通 过酸滴定建立约5.9N的浓度。
6.三乙胺(TEA)，99％，HPLC级，来自Fisher(产品编号04884)。酸滴定浓度是6.9-7.1 N。
2.三多磷酸五钠，Na5P3O10，购自Sigma(产品编号T-5883)；
3.十水焦磷酸四钠，Na4P2O7·10H2O，购自Sigma(产品编号P-9146)。
4.购自Sigma的离子交换树脂Dowex 50Wx4(4％交联的磺酸化聚苯乙烯树脂， 100-200网孔)(产品编号50×4-200)，或购自Sigma的Dowex HCR-W2(8％交联的 磺酸化聚苯乙烯树脂50-100网孔)(产品编号I-8880)可交换使用。按下面的倾析顺 序来洗涤树脂：用去离子水倾析三次，用1N HCl(体积超过树脂3倍)倾析两次， 用水倾析三次，用1N NaOH倾析两次，用水倾析三次，用1N HCl倾析三次，用 水倾析三次。倾析之后，树脂是H+形式。
5.三甲胺(TMA)，水溶液40％，购自Aldrich Chemical Co.(产品编号43,326-8)。通 过酸滴定建立约5.9N的浓度。
6.三乙胺(TEA)，99％，HPLC级，来自Fisher(产品编号04884)。酸滴定浓度是6.9-7.1 N。
[0134]通过反渗透、离子交换和有机去除法来纯化水，获得无有机“16-18MOhm” 质量(organic free“16-18MOhm”quality)。
[0135]通过离子交换方法制备焦磷酸盐、三磷酸盐和聚磷酸盐的含水溶液。将多 磷酸钠(3g，于25mL水中)、焦磷酸盐(4g，于27mL水中)或聚磷酸盐(6.7g， 30mL水中)装载到含有100mL(床体积)如上制备的离子交换树脂的柱上。用水洗 脱柱，并收集级分。收集显示酸性pH(pH＜3)的级分。用20mL水稀释三份0.5mL 等分含有磷酸的收集级分，并用0.100N NaOH滴定至pH4.5-5.0的终点(Fisher分 析溶液)，来测定当量浓度。离子交换之后富集的级分用三甲胺滴定(以便获得三 甲铵盐)至pH5.4-5.5。滴定之后，如果必要，稀释溶液以便三甲铵的最终浓度接 近0.5N。
[0136]通过用80mL水稀释1.39mL浓硫酸(17.9M)，并用纯三乙胺或含水三甲胺 在pH计控制下将稀释的溶液滴定至等当点(pH5.1-5.5)，制备三甲铵和三乙铵硫酸 盐。用水将体积调整到100mL。
[0137]通过将获自Sigma的1.572g一水柠檬酸ACS(产品编号C-1909)溶解在20 mL水中，并用含水三甲胺将溶液滴定至等当点，制备三甲铵柠檬酸盐溶液。用水 将体积调整到25mL。
[0138]利用正压，通过0.2-μm醋酸纤维素过滤器过滤该溶液。使用蒸汽压渗透压 计和玻璃-甘汞电极pH计分别测量溶液的同渗重摩和pH。酸水解(5min，100℃， 3N H2SO4)之后，通过磷钼酸盐分光光度分析法(参见实施例70)测定磷酸盐溶液中 阴离子的当量浓度。阴离子当量浓度仅仅考虑在pH5.5充分离子化的酸性官能团。 根据加入的三烷基铵基本组分(base)测定阳离子当量浓度。获得的溶液具有下述 特性(表4)：表4.用于将CPT-11装载入脂质体的取代的铵盐溶液的特性
盐 阳离子当量 浓度 阴离子当量 浓度 pH 同渗重摩(mmol/kg) TMA柠檬酸 盐 TMA硫酸盐 TMA焦磷酸 盐 TMA三磷酸 盐 TMA多磷酸 盐 TEA硫酸盐 0.58 0.50 0.44 0.57 0.49 0.54 0.60 0.50 0.54 0.68 0.58 0.50 5.1 5.4 5.4 5.4 5.5 5.35 791 625 651 695 336 719
盐 阳离子当量 浓度 阴离子当量 浓度 pH 同渗重摩(mmol/kg) TMA柠檬酸 盐 TMA硫酸盐 TMA焦磷酸 盐 TMA三磷酸 盐 TMA多磷酸 盐 TEA硫酸盐 0.58 0.50 0.44 0.57 0.49 0.54 0.60 0.50 0.54 0.68 0.58 0.50 5.1 5.4 5.4 5.4 5.5 5.35 791 625 651 695 336 719
[0139]胆固醇和DSPC购自Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama，USA。 PEG-DSPE(PEG分子量2,000)购自Shearwater Polymers，Huntsville，AL，USA。将 重量比为3∶1∶0.1(摩尔比约3∶2∶0.03)的DSPC、胆固醇和PEG-DSPE溶解在 氯仿(Fisher；Optima grade，用戊烯稳定)中，DSPC的浓度为60mg/mL。以每管 30mg DSPC(0.5mL)将溶液分配到Pyrex管中，并使用旋转蒸发器在60℃在减压 下缓慢蒸发。室温下，真空中(100微米水银，油泵)将脂膜干燥30-60分钟。
[0140]通过在60℃在上面的含水盐溶液中温和摇动，将干燥的脂膜水合15-20分 钟。脂类形成乳白色的悬浮液(多层小泡)。该乳白色悬浮液进行下述5次循环： 在干冰和异丙醇(-80℃，3分钟)的混合物中冷冻，在60℃水浴中解冻3分钟。然 后，使用在60℃加热的手工操作的往复式挤出机(Avanti Polar Lipids)，将脂类悬 浮液挤压通过二叠层聚碳酸酯膜过滤器(Nucleopore，Whatman，孔径0.1μm)10次 (双程)。
[0141]挤出的脂质体保持在60℃中5分钟，并在冰水(0-4℃)中淬火5分钟。然后 通过在Sephadex G-75上进行凝胶层析，将脂质体从形成梯度的盐溶液分离入装载 缓冲MES-葡萄糖(50g/L葡萄糖ACS、0.975g/L 2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸(MES)和足 够数量的5M NaOH，使pH至6.4)。脂质体出现在孔隙体积部分(柱床体积的30％)。
[0142]将每1mg固体含有0.860mg CPT-11基本成分(base)的CPT-11(盐酸伊立 替康)制剂溶解于0.001N HCl，制备16.5mg/mLCPT-11基本成分的贮存液。将该 溶液与MES-葡萄糖缓冲液中的脂质体混合，获得每1μmol脂质体磷脂含150μg CPT-11的比率。混合物在55℃水浴中温育30分钟，偶尔温和摇动一下(大约每分 钟一次)，然后在冰水(0-4℃)中迅速冷冻。使用MES-葡萄糖作为洗脱剂，通过在 Sephadex G-75上进行凝胶层析，将脂质体与未包囊的药物分离开。包囊的药物通 过分光光度分析法测定(实施例71)，磷脂用抽取分析法(extraction assay)测定(实施 例70)。
[0143]在50％人血浆存在下，在体外按照如下方法研究药物从如此获得的装载 CPT-11的脂质体的释放。冷冻的人供体血浆在37℃解冻，14,500g下离心10分钟， 并过滤通过0.45-μm醋酸纤维素注射过滤器。使装载有CPT-11的脂质体制剂通过 0.2-μm无表面活性剂的醋酸纤维素(SFCA)无菌注射过滤器进行过滤。将0.5-mL的 脂质体与0.5mL血浆在无菌1.5-mL共聚物Eppendorf管中混合，密封，并在摇摆 平台上37℃中温育24小时。空白样品含有0.5mL无菌MES-葡萄糖以替代脂质体。 使用144mM NaCl，5mM HEPES-Na，pH7.4缓冲液(HBS-5)，在珠状交联的2％ 琼脂糖凝胶(Sepharose CL-2B，Pharmacia；10mL床体积)上，通过凝胶层析分离脂 质体。脂质体出现在孔隙体积部分中，而血浆蛋白和释放的药物(如果有)则保 留在凝胶中。分析脂质体馏分中的CPT-11和磷脂，并测定药物/磷脂比率(输出比)。 含脂质体样品的读数减去空白样品(仅血浆)的读数。通过输出药物/脂类比率除以 输入药物/脂类比率(与血浆温育之前的药物/脂类比率)，测定温育之后保留在脂质 体中的药物百分比。表5概括了装载和释放的数据。表5.CPT-11装载入含有叔烷基铵盐的脂质体中，并在人血浆存在下的药物体外释 放情况
包载的盐溶液 与血浆温育之 与血浆温育之后 药物/脂类比 率 包囊效率(％) 药物/脂类比 率 保持包囊的药 物(％) TMA硫酸盐 TMA焦磷酸 盐 TMA三磷酸 盐 TMA-Pn 127.2±5.6 136.2±9.0 132.9 134.4±9.3 84.8±3.8 90.8±6.0 88.6 89.6±6.2 132.1±6.9 132.3±5.0 129.2 135.0±7.4 103.8±10.0 97.1±10.1 97.3 100.4±12.4
TEA硫酸盐 131.1±6.5 87.4±4.4 125±5.0 95.5±8.6
实施例8.使用焦磷酸盐、三磷酸盐、聚磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐三烷基铵盐装 载CPT-11的脂质体的体内稳定性
包载的盐溶液 与血浆温育之 与血浆温育之后 药物/脂类比 率 包囊效率(％) 药物/脂类比 率 保持包囊的药 物(％) TMA硫酸盐 TMA焦磷酸 盐 TMA三磷酸 盐 TMA-Pn 127.2±5.6 136.2±9.0 132.9 134.4±9.3 84.8±3.8 90.8±6.0 88.6 89.6±6.2 132.1±6.9 132.3±5.0 129.2 135.0±7.4 103.8±10.0 97.1±10.1 97.3 100.4±12.4
TEA硫酸盐 131.1±6.5 87.4±4.4 125±5.0 95.5±8.6
实施例8.使用焦磷酸盐、三磷酸盐、聚磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐三烷基铵盐装 载CPT-11的脂质体的体内稳定性
[0144]尽管喜树碱脂质体可以在体外血浆中显示出可接收的药物渗漏现象，在体 内血液循环中药物可能更快地渗漏出来。因此，在小鼠中使用单时间点分析方法， 筛选一组CPT-11脂质体制剂，分析体内血液循环中的药物稳定性。
[0145]如实施例6所描述地，制备脂质体并装载CPT-11，有如下改动。代替使 用Shearwater Polymers的PEG-DSPE，我们使用Avanti Polar Lipids的相似的 PEG-DSPE。为了能对血液/组织样品中的脂质体脂类基质进行定量，以0.25 mCi/mmol磷脂的数量，将非可交换的放射性标记[3H]-胆甾醇十六烷基醚 ([3H]-CHE；(Amersham，USA))加入到脂类的氯仿溶液中。以12mg DSPC/管将脂 溶液分配入Pyrex管，通过旋转蒸发/真空干燥形成脂膜。脂膜在0.7mL形成梯度 的取代的铵盐溶液中水合。含有包载的含磷酸盐的盐的脂质体中脂浓度通过放射 性闪烁计数法测定。也测定无包载的含磷酸盐的盐的制剂中的磷脂，不进行萃取， 如实施例70所述，并用作脂放射性标准。将制备用于装载的脂质体-药物混合物部 分收集起来并进行分析，以在装载之前确定加入的CPT-11与脂质体脂类的装载前 比率(“输入比率”)。使用高斯模型，通过准弹性光散射法(QELS)测定体积平均值和 脂质体大小分布的标准偏差。表6概括了这些脂质体的特性。表6.用于体内稳定性研究的装载CPT-11的[3H]-CHE标记的脂质体的特征
包载的盐溶液 装之前的药 物/脂类比率 装载之后的药 物/脂类比率 装载效率(％) 脂质体大小 (平均值±SD) nm TMA柠檬酸 盐 TMA硫酸盐 TMA焦磷酸 盐 TMA三磷酸 盐 TMA多磷酸 盐 TEA硫酸盐 159.2±3.5 156.1±2.5 164.6±5.8 163.6±5.7 170.5±8.0 153.±3.3 156.7±3.6 156.±3.1 156.6±4.3 156.0±3.2 162.4±4.0 154.9±4.9 98.5±4.4 100.0±3.6 95.2±6.0 95.3±5.3 95.3±6.8 101.0±5.3 122.1±25.3 122.2±28.4 121.1±19.9 122.4±12.9 123.0±12.7 121.1±18.0
包载的盐溶液 装之前的药 物/脂类比率 装载之后的药 物/脂类比率 装载效率(％) 脂质体大小 (平均值±SD) nm TMA柠檬酸 盐 TMA硫酸盐 TMA焦磷酸 盐 TMA三磷酸 盐 TMA多磷酸 盐 TEA硫酸盐 159.2±3.5 156.1±2.5 164.6±5.8 163.6±5.7 170.5±8.0 153.±3.3 156.7±3.6 156.±3.1 156.6±4.3 156.0±3.2 162.4±4.0 154.9±4.9 98.5±4.4 100.0±3.6 95.2±6.0 95.3±5.3 95.3±6.8 101.0±5.3 122.1±25.3 122.2±28.4 121.1±19.9 122.4±12.9 123.0±12.7 121.1±18.0
[0146]六周龄的雌性CD-1小鼠(Charles River)以10mg/kg(0.2mg CPT-11/小鼠)的 剂量通过尾静脉注射这些脂质体CPT-11制剂两次。八小时之后，麻醉小鼠并通过 开放性心脏穿刺放血。将血液收集到肝素化的注射器中(10-20μl，1000U/ml肝素 USP)，并转移入称重的管中，并放置在冰中，其中该管含有0.4ml磷酸盐缓冲液 生理盐水溶液(PBS)，该溶液中含有0.04％EDTA(Gibco BRL)。对管称重以测定血 液样品的重量，通过在9,000g离心5分钟分离血细胞，收集含有PBS-稀释的血浆 的上清液，用于药物和脂质体脂类分析。通过荧光分析法对CPT-11定量(实施例 71)。通过淬火-校正放射性闪烁计数法对脂质体脂类定量。与血浆样品平行，对脂 质体和磷脂-放射性标准进行计数。通过血浆样品中药物/放射性比率除以注射的脂 质体的药物/放射性比率，来计算保持包囊的药物的百分比。由于游离CPT-11快速 从血液中消除(参见实施例69)以及已知的[3H]-CHE对脂交换的稳定性，试验的读 数被认为指示了脂质体CPT-11和脂类的血液含量。假设100％注射的药丸进入循 环；血液体积为小鼠体重的6.3％；血细胞比容45％，计算保持在循环中的注射的 脂类剂量的百分比(％I.D.)。表7概述了这些结果。表7.注射后单点时刻(8小时)小鼠中CPT-11包囊的体内稳定性和装载CPT-11 的脂质体的循环寿命。％I.D.，注射剂量的％。
脂质体-包载的盐 药物/脂类比， 注射前值的％ 脂质体脂类， ％I.D.，于血液中 TMA柠檬酸盐 TMA硫酸盐 TMA焦磷酸盐 TMA三磷酸盐 TMA多磷酸盐 TEA硫酸盐 80.2±7.8 70.1±4.8 67.3±9.2 70.6±6.0 107.5±8.9 76.6±13.1 18.8±3.4 23.6±1.8 23.2±3.1 24.9±8.2 24.3±3.4 23.6±0.1
脂质体-包载的盐 药物/脂类比， 注射前值的％ 脂质体脂类， ％I.D.，于血液中 TMA柠檬酸盐 TMA硫酸盐 TMA焦磷酸盐 TMA三磷酸盐 TMA多磷酸盐 TEA硫酸盐 80.2±7.8 70.1±4.8 67.3±9.2 70.6±6.0 107.5±8.9 76.6±13.1 18.8±3.4 23.6±1.8 23.2±3.1 24.9±8.2 24.3±3.4 23.6±0.1
[0147]所有制剂显示8小时后体内血液中药物包囊水平为注射前水平的70-80％， 而含有聚磷酸盐的脂质体最稳定(药物包囊保持在约100％)。实施例9.用三乙铵多磷酸盐制备的CPT-11脂质体的血液药物动力学。
[0148]按照实施例3描述的方法制备使用三乙铵多磷酸盐的脂质体CPT-11制剂。 脂类——DSPC、胆固醇和N-(甲氧基-聚(乙二醇)(分子量2000)-氧羰基)-DSPE (PEG-DSPE)(都来自Avanti Polar Lipids，Inc.)——作为干粉末以3∶2∶0.015摩尔 比混合，并于62-65℃溶解在100％乙醇(USP级，大约0.15mL/100mg脂类)中。 为了进行药物动力学研究，以0.5mCi/mmol磷脂的数量，将3H-胆甾醇十六烷基 醚([3H]-CHE，获自Amersham Pharmacia)作为非可交换的放射性标记加入到脂类 中。按照实施例4中的方法制备TEA-Pn(0.5M三乙铵，pH5.7-6.2)的含水溶液。 将TEA-Pn溶液(10倍于加入的乙醇的体积)与脂类溶液在60-65℃混合，并在该温 度进行搅拌，直到形成均质的乳白色多层囊。使用氩压力挤出机(Lipex Biomembranes)在60-65℃下，使悬浮液挤压通过100nm孔径的2叠层聚碳酸酯径 迹蚀刻过滤器(Coming Nuclepore)15次，所得的单层脂质体迅速在冰上冷冻，然后 放置在环境温度下。通过在Sepharose CL-4B柱上进行凝胶层析，用MES-葡萄糖 缓冲液(5mM MES、50g/L葡萄糖，pH用NaOH调节到6.5)洗脱，去除乙醇和未 掺入的聚磷酸盐。
[0149]将含有于水中的20mg/mL伊立替康基本成分的CPT-11(盐酸伊立替康)贮 存液以150-200mg/mmol磷脂的药物/脂类比加入到脂质体，混合物在60-62℃温育 45-60分钟，偶尔搅拌一下。迅速冷却温育混合物，并在0℃温育10分钟，然后可 以达到环境温度。加入1/20体积的2.88M NaCl以调整生理离子强度，并提高膜- 结合的CPT-11(相对于包囊在脂质体内部的药物)的去除结果。通过在Sephadex G-25或G-75柱(Amersham Pharmacia)进行凝胶层析，用HBS-6.5缓冲液(5mM 2-(4-(2-羟乙基)-哌嗪)-乙基磺酸(HEPES)，144mM NaCl，pH6.5)洗脱，去除未包 囊的药物。合并在孔隙体积中洗脱的脂质体级分，通过0.2微米过滤进行灭菌，并 保存在4-6℃，直到使用。用脂类浓度、药物浓度和颗粒大小对脂质体表征，如实 施例7所述。脂质体的平均大小为108nm，CPT-11含量为每mmol磷脂139±18mg CPT-11基本成分。
[0150]体内脂质体脂类和脂质体药物在血液中的寿命以及药物从脂质体释放的特 征，在具有留置的中心静脉插管的雌性Sprague-Dawley大鼠(190-210g)中进行研 究。大鼠注射以0.2-0.3mL 3H-CHE-标记的伊立替康脂质体(0.05mmol磷脂，或每 kg体重为7-8mg CPT-11)丸剂。注射后使用经肝素处理的注射器在各时间点获取 血样(0.2-0.3mL)。提取的血液体积补充以磷酸盐缓冲生理盐水。血液样品用0.3ml 含有0.04％EDTA的冰冷PBS稀释，称重，通过离心分离血细胞。收集上清流体， 用实施例71的荧光测定程序分析CPT-11，用常规方法通过闪烁放射性计数法分析 脂质体脂类标记。具有已知的药物和3H-CHE-脂类浓度的脂质体制剂用作标准。 放射性标准含有相等数量的稀释的大鼠血浆，以说明淬火效果。假设以ml计的血 液体积是以克计的体重的6.5％，血细胞比容为40％，计算血液中CPT-11和脂质 体脂类的数量。血液中脂类和药物的总数用注射剂量的％(％I.D.，％ID)表示，并 针对注射后时间作图。通过血液样品中的药物/脂类比率除以注射脂质体的药物/脂 类比率(取100％)，计算保留在脂质体中药物的百分比。因为这些图总体上显示与 单指数动力学(在半对数比例尺上是线性的)具有良好的一致性，使用Microsoft EXCEL计算机程序(Microsoft Corp.，USA)的TREND选项，药物、脂类的血液半衰 期和药物从脂质体释放的半衰期由数据与单指数衰变方程最佳拟合计算而得。结 果显示在图1中。由最拟合参数得知，脂类和药物的血液半衰期分别是16.4小时 和6.61小时。这些条件下，游离的CPT-11迅速从循环中清除掉(参见实施例69)。
[0151]血液药物/脂类比率显示了CPT-11从脂质体释放的两阶段特征(图2)。在第 一个24小时，药物释放与时间是线性关系(R＝0.992)，这证明是零阶释放动力学。 在24小时的时间点，约75％的药物被释放出来，进一步的释放变为非线性的。在 24小时里，脂质体以每小时约起始载量的3.6％的恒定速率释放药物。因此，在近 似14个小时的阶段里，50％的药物被释放出来。在缓释制剂中，药物的零阶释放 是吸引人的特性，这是因为药物释放速度随时间保持恒定。实施例10.在裸鼠中，用三乙铵多磷酸盐制备的CPT-11脂质体对乳腺癌异种移植 物的抗肿瘤功效
[0152]CPT-11脂质体的抗肿瘤功效在人乳腺癌BT-474模型中进行研究，人乳腺 癌BT-474是过量表达C-ErbB2(HER2)受体的雌激素-依赖性导管腺癌。BT-474细 胞获自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。具有较高肿瘤生长速度 的BT-474亚系由按下面描述的方法培养的快速生长异种移植物肿瘤节构建而得。 在T-150瓶中，细胞在含有10％胎牛血清、0.1mg/mL硫酸链霉素和100U/ml青 霉素G的RPMI-1460培养基中体外增殖，每周以1∶3分裂。NCR nu/nu雌性小鼠 (4-6周龄，Taconic Farms)皮下植入60天持续释放的0.72-mg 17β-雌二醇小药丸 (Innovative Research of America，Inc.)，两天后在上背区域皮下接种0.1mL含有于细 胞生长培养基中的2×107 BT-474细胞的悬浮液。每周2次，通过触诊和测径器测 量肿瘤的最大(长度)和最小(宽度)轴来监控肿瘤进展。使用下面的公式，通 过测径器测量数据，每周确定肿瘤大小两次(Geran，R.I.，et al.，1972 Cancer Chemother.Rep.3：1-88)：肿瘤体积＝[(长)×(宽)2]/2
[0153]在接种后第13天，肿瘤达到200mm3的平均大小，并将动物随机分配入三 个组，每组13-15只动物。
[0154]如实施例8制备脂质体CPT-11(药物/磷脂比率192mg/mmol；平均脂质体 大小86.8nm)。用MES-葡萄糖载体将游离CPT-11和脂质体CPT-11稀释至5mg/ml 的CPT-11基本成分。在肿瘤接种后第14、18、21和25天，动物通过尾静脉注射 游离CPT-11、脂质体CPT-11或仅仅注射载体。含药物的制剂以每次注射50mg CPT-11/kg的剂量给予，这是有关啮齿动物肿瘤模型中进行CPT-11研究的文献中 报道的剂量的平均值。
[0155]为了评价与治疗相关的毒性，也对动物每周两次称重。进行观察直到接种 后60天结束，在这时雌激素补充小药丸被耗尽。将各个组的平均肿瘤体积对时间 一起作图并进行比较。如图3所示，尽管游离CPT-11减慢肿瘤生长速度，但在接 受脂质体治疗的组中肿瘤显著消退。当在第36天对照组中肿瘤达到所允许的最大 尺寸——平均3,500mm3，以及在第46天，在用游离药物治疗的组中，肿瘤平均 约1,000mm3，而在同一时刻，在脂质体治疗的组中没有动物具有可触诊的肿瘤。
[0156]用动物体重动力学来评价与治疗相关的毒性(图4)。没有哪个组显示出任何 明显的毒性。对照组动物的重量始终在增加。在最后治疗日，接受脂质体CPT-11 的动物的平均体重微微减少约3.3％。然而该肿瘤减轻得到逆转，并且所述动物达 到它们期望的重量。与治疗前重量相比，通过Student′s t-试验，该平均体重的减少 在统计学上并不显著(p＝0.274)。因此，所有治疗是可以忍受的，没有显著毒性。
[0157]因此，通过预先包载聚阴离子的生物可降解聚合物(聚磷酸盐)的位阻取代铵 盐(三乙铵)的药物装载而获得的CPT-11脂质体制剂，在研究的肿瘤模型中显示出 延长的血液寿命期、缓释特征和增加的抗肿瘤活性，而毒性上并无可测量的增加。实施例11.对用预先包载的三乙铵盐制备的装载CPT-11的脂质体的比较性评价： 脂质体大小的影响、药物/脂类比率、预先包载的阴离子的特性。
[0158]制备两种装载CPT-11的脂质体的原型制剂，一种用具有预先包载的TEA-Pn 的脂质体，另一种用具有预先包载的TEA-SOS的脂质体。这些脂质体的制备包括 下述生产步骤：
[0159]1)通过在乙醇中共溶混合脂类。脂类基质组合物由下述物质组成：1，2-二硬 脂酰-SN-磷脂酰胆碱(DSPC)(分子量790)，3摩尔份(59.8摩尔％)；胆固醇(Chol)(分 子量387)，2摩尔份(39.9摩尔％)；和N-(ω-甲氧基-聚(乙二醇)-氧羰基)-1，2-二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺(分子量2787)(PEG-DSPE)，0.015摩尔份(约0.3摩尔％)。DSPC 和PEG-DSPE购自Avanti Polar Lipids，Birmingham，Alabama。胆固醇(最高纯度级) 购自Calbiochem。在硼硅酸盐玻璃容器中以±0.1mg的精度称量干脂类，并以适合 于下面的脂类分散步骤的比率与无水乙醇混合。因为DSPC具有高转变稳定(55℃)， 通常在55-60℃下进行溶解，直到获得澄清溶液。
[0160]2)制备TEA-Pn和TEA-SOS溶液。多磷酸钠(n＝13-18)来自Sigma Chemical Co.，p/n P8510。蔗糖八硫酸钠购自Toronto Research Chemicals，Toronto，Canada，p/n S699020。称取盐，并溶解在水中，得到1.2-2.5N溶液。使用H+-形式的阴离子交 换剂Dowex 50Wx8-200或Dowex HCR-W2(获自Sigma)，将钠盐转化为游离酸。 在首次使用之前，树脂如下洗涤：用3体积的下述溶液搅拌，然后进行倾析：(1) 1.0-1.2M含水HCl2次；(2)水2次；(3)1.0-1.2M含水NaOH2次；(4)水2次； (5)1.0-1.2M含水HCL2次。将于水中的洗涤过的树脂的悬浮液在重力流的作用下 填充在合适的尺寸层析柱中，使每mL钠盐溶液至少具有8mL填充的树脂。通过 2柱体积的3.0-3.6M含水HCL，之后5柱体积的水或直到洗出液的传导率低于1 μS，进一步平衡树脂。使用之后，通过顺序通过下述物质使柱再生，1.-1.2M HCl——3柱体积；3.0-3.6M HCl——2柱体积；水——至少5柱体积，或直到洗 出液的传导率低于1μS，并于室温中保存在0.2μm过滤的水中。将Pn和SOS钠 盐溶液施用于柱沥干的表面上(每4ml填充的树脂体积约1ml)，并在重力作用下 以约1-2ml/min的速度流动，这是对于75-150mL的树脂床尺寸而言。柱用水洗 脱。测试洗出液的传导率。收集具有10mS或更高传导率的级分。如果需要更高 浓度的多酸溶液，可以在20-50mS时开始收集，其代价是形成梯度的盐丧失稍微 较多。在多磷酸的情况下，收集的溶液保持冷冻(0-4℃)直到胺滴定步骤，这是 因为在低pH时磷酸二酯键具有水解不稳定性。收集的洗出液的pH将小于0.7(典 型地约0.4)，传导率约120-200mS。任选地，因为在低pH下聚磷酸盐稳定性的缘 故，无延迟地进行胺滴定步骤。将来自Fisher，p/n 04884的HPLC-级三乙胺(99.5+％ 的纯度)用于滴定由离子交换获得的酸溶液。通过电位滴定分析测定纯TEA的当量 浓度。将0.100-mL等分TEA(0.100ml)加入20ml水中，三次。用0.1N HCl标准 溶液滴定这些等分试样，至5.5-6.0的pH终点(玻璃电极)。计算得到的当量浓度 (7.07N)接近于理论值7.17N。测量的多磷酸(Pn)或蔗糖八硫酸(SOS)溶液的体积用 纯TEA在pH(玻璃)电极的控制下滴定。需要充分搅拌来分散胺。滴定终点是pH 5.6-6.2。准确记录加入的TEA的体积。测量滴定的溶液的体积，根据加入的TEA 的体积和当量浓度计算TEA的浓度。如果必要，加入水来调节TEA浓度至所需的 0.55±0.05N或0.65±0.03N，如下所示。使用钠选择性玻璃电极(Coming)，通过 电势分析法测定在所得到的TEA-Pn或TEA-SOS溶液中残留钠的量。用19mL水 稀释1mL溶液，并根据电极制造商的使用手册，使用增量法测定钠浓度。残留钠 的量为1mM以下，典型地在0.5mM以下。使用正压进料，使获得的TEA-Pn或 TEA-SOS溶液通过0.2μm醋酸纤维素无菌过滤器。测量并记录溶液的最终pH和 同渗重摩。我们使用pH甘汞微组合全玻璃电极测量pH，使用蒸汽压/露点渗压机 测量同渗重摩。溶液被冷冻保存直到使用。
[0161]3).通过将脂类的乙醇溶液与梯度形成缓冲液混合，在梯度形成缓冲液中制 备脂类分散液。用乙醇混合方法将脂类分散在形成梯度的盐溶液中。所有步骤在 60-65℃中进行。在耐化学性玻璃梨形瓶或管中，在约0.5-0.6M DSPC的浓度下， 将脂类溶解在100％乙醇USP中。将形成梯度的盐溶液(TEA-Pn或TEA-SOS)预加 温到60-65℃，并立即加入到乙醇脂溶液中，并通过旋转和/或漩涡充分混合各成分。 乙醇的最终量为约10体积％。对于磷脂超过0.1mmol级别的制剂，将所得的悬浮 液于60-65℃置于旋转蒸发器中，通过旋转抽真空，直到乙醇停止产生，这以泡沫 形成终止而示出。对于磷脂为0.1mmol或0.1mmol以下级别的制剂，在该步骤乙 醇不从脂类分散液去除。所得脂类分散液保持在60-65℃，并立即用于挤出步骤。
[0162]4).脂类分散液连续挤压通过孔径确定的膜。对于体积达1mL的脂类悬浮 液，我们使用手工操作的反复式挤出机，其由Avanti Polar Lipids提供。该挤出机 安装19mm径迹蚀刻过滤膜，并根据金属加热模块恒温调节温度。对于1至10mL 的体积，我们使用恒温的、气压操作的、单向流动挤出机，该挤出机来自Lipex Biomembranes。该挤出机安装25mm过滤膜。如果合适，使用手工进料或氩气压 力，在60-65℃反复挤压脂类悬浮液通过一系列2叠层聚碳酸酯膜过滤器(来自 Corning-Nuclepore and Osmonics Corp.的过滤器同样适合)，该膜过滤器具有100 nm、80nm或50nm的公称孔径。当对脂质体大小的效应感兴趣时，挤压在100nm、 80nm或50nm步骤停止。对于每次试验，所使用的过滤器的准确类型和挤压次数 表示如下。所挤出的脂质体保持在60-65℃约15分钟，并在冰浴中迅速冷却到 2-4℃。冰浴中约15分钟之后，脂质体允许达到室温。
[0163]5).脂质体外的梯度形成缓冲液的去除以及脂质体向药物装载缓冲液的转 移。去除未包囊的梯度形成盐，并使用尺寸排阻层析(SEC)将脂质体转移入药物装 载缓冲液。其他可放大步骤的切线流过滤(Tangential flow filtration)、中空纤维透析 (hollow fiber dialysis)可以用于放大生产(scale-up manufacture)。通过用阴离子交换 树脂(例如Dowex-1或Dowex-2季铵交联聚苯乙烯珠)处理脂质体以确保完全去除 脂质体外的聚阴离子是有利的。药物装载缓冲液含有50g/L无水葡萄糖USP和5 mM水中的组织培养级(tissue culture certified)HEPES，并用NaOH将该缓冲液 调节至pH6.5。该缓冲液被真空过滤通过0.2微米尼龙过滤器(Whatman)。挤出的 脂质体在Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱上层析，并用该药物装载缓冲液洗脱。脂 质体出现在孔隙体积部分，并根据洗出液浊度以约2倍的所施用体积收集。根据 实施例70，测定洗脱的脂质体的磷脂浓度，通过QELS测定颗粒大小，并保存在 4-6℃。
[0164]6)脂质体与药物温育。在与脂质体混合之前一刻，通过将盐酸伊立替康溶 解在水中以获得20mg/mL药物基本成分的浓度而制备CPT-11(盐酸伊立替康)贮 存液。溶液的pH在4.0至5.0之间。使用正压使药物溶液过滤通过0.2微米聚醚 砜(PES)无菌过滤器。将上面步骤5中产生的药物装载缓冲液中的等分脂质体在室 温中与贮存的伊立替康溶液混合，获得每摩尔脂质体磷脂0.15-0.55g药物范围内的 药物/脂类输入比。如果合适，将特定的输入药物/脂类比率表示于下。用1M NaOH 将混合物的pH调节到6.5，玻璃瓶中的混合物在58-62℃恒温水浴中温育30-45 min，同时缓慢搅拌，在冰浴(0-2℃)中迅速冷却，并在该温度放置15分钟。然后 将脂质体加温到室温，用于下一步骤(去除未包囊的药物并转移入保存缓冲液)。在 所研究的药物/脂类比率的全部范围内，该步骤产生95％以上、典型地98-100％的 包囊效率。
[0165]7).去除未包囊的CPT-11，将脂质体转移到保存缓冲液，最终过滤并保存。 去除未包囊的药物，利用尺寸排阻层析将脂质体转移入保存缓冲液。保存缓冲液 含有于水中的20mM HEPES、135mM NaCl，pH6.5(用NaOH调节)，在使用之 前0.2-微米真空过滤。基本上按照上面步骤2中描述的方法在Sephadex G-75 (Amersham Pharmacia Biotech)上进行凝胶层析。测定从柱(孔隙体积部分)洗脱得到 的CPT-11脂质体的脂质体磷脂和CPT-11(通过分光光度法，参见实施例70和71)， 并通过QELS测定体积加权平均颗粒尺寸。如果必要，将药物浓度调整到2.0-4.0 mg/mL范围内。将脂质体过滤通过0.2微米聚醚砜无菌过滤器，并在无菌条件下 分配入无菌聚苯乙烯瓶(Corning Cryo-Vials)或PTFE衬里的螺纹帽(PTFE-lined screw-cap)硼硅酸盐4-mL玻璃瓶中，至瓶体积的大约70-80％。无菌条件下封闭瓶 (空气中)，作标记，并保存在4-6℃。实施例12.药物/脂类比率对药物装载效率和含TEA-Pn的脂质体的体外药物保持 效果的影响。
[0166]根据实施例11的程序，制备含有包载的0.65N含水TEA-Pn溶液，pH6.1， 同渗重摩531mmol/kg的脂质体。脂质体分散液被10次挤压通过二叠层100nm孔 径聚碳酸酯过滤器。脂质体脂类基质液还包含0.5mCi/mmol磷脂的[3H]-CHE。装 载药物之前的脂质体大小为98.5±34.3nm。脂质体以200、300、400和500mg CPT-11/mmol磷脂的初始药物-磷脂比率装载。分别根据实施例71的分光光度法和 根据实施例72的磷脂挤压-消化-蓝色(extraction-digestion-blue)磷钼酸盐分析方法 测定脂质体中药物和磷脂的量。
[0167]为了评体内药物释放速度，进行实施例8的方法。以5mg CPT-11/kg的剂 量，将脂质体通过尾静脉注射入6周龄雌性Swiss Webster小鼠(体重18-22g)。在 注射后8小时和24小时，麻醉3组小鼠，并通过开口心脏穿刺放血。将血液与0.4 mL于PBS中的冰冷的0.04％EDTA混合，通过离心分离血细胞，通过实施例71 中描述的荧光光度法测量CPT-11的血浆浓度。通过使用淬火-校正液体闪烁计数法 测量[3H]-CHE的数量来测定脂类，并通过将测定的药物/脂类比率除以注射的脂质 体中的药物/脂类比率，计算保留在脂质体中的药物的量。因为游离CPT-11具有快 速的血液清除特性，导致低血液水平，我们假设所有被测定的药物是脂质体形式 的药物。
[0168]结果呈现在表8中。各组药物保留之间的差异在统计学上并不显著。作为 这些研究的结果，我们得出的结论是，将药物装载增加至500mg/mmol将不会不 利地影响药物装载或体内稳定性。该比率被用于进一步的研究。表8.药物/脂类比率对伊立替康TEA-Pn脂质体中药物装载和体内药物保留的影响 (平均值±标准偏差)。
药物/脂类比率，mg/mmol磷脂 保留在脂质体中的药物，注射 前值的％ 输入 输出 ％装载 8小时后 24小时后 200 208.4 104.2 54.6±9.9 9.72±2.23 300 286.3 95.4 85.2±14.3 14.52±2.51 400 348.8 87.2 81.5±18.3 17.31±6.14 500 518.9 103.8 66.8±19.6 13.47±1.44
实施例13.CPT-11装载入含TEA-SOS的脂质体的药物装载效率：脂质体大小的影 响和小鼠体内药物保留
药物/脂类比率，mg/mmol磷脂 保留在脂质体中的药物，注射 前值的％ 输入 输出 ％装载 8小时后 24小时后 200 208.4 104.2 54.6±9.9 9.72±2.23 300 286.3 95.4 85.2±14.3 14.52±2.51 400 348.8 87.2 81.5±18.3 17.31±6.14 500 518.9 103.8 66.8±19.6 13.47±1.44
实施例13.CPT-11装载入含TEA-SOS的脂质体的药物装载效率：脂质体大小的影 响和小鼠体内药物保留
[0169]如实施例11所述，使用具有0.643N TEA-SOS、pH5.7和530mmol/kg的 同渗重摩的梯度形成溶液制备含有包载的溶液的脂质体。使脂类分散液10次挤压 通过孔径为50nm、80nm或100nm的二叠层聚碳酸酯过滤器。脂质体脂类基质 液以1.5mCi/mmol脂质体磷脂的浓度包括[3H]-CHE。通过动态光分散(dynamic light scattering)测定脂质体大小。脂质体以大约550mg伊立替康/mmol磷脂的初 始药物-磷脂比率装载CPT-11。通过QELS测定装载药物的脂质体的大小，并如实 施例70和71中描述地进行测定。
[0170]雌性Swiss Webster小鼠(8-10周，平均27-30克)通过尾静脉以10mg/kg的 药物剂量注射这些CPT-11脂质体制剂。24小时之后处死小鼠，收集血液，并分析 CPT-11和脂质体脂类，如实施例11所述。这些结果概述于表9中。表9.TEA-SOS脂质体中的伊立替康装载和体内药物保留
挤出膜孔径，nm 脂质体大小，nm， 平均值SD 药物装载， mg伊立替康 /mmol磷脂 小鼠中24小时后 保留在脂质体中 的药物，注射前值 的％ 50 87.6±28.1 57.9±24.2 79.2±3.8 80 98.5±15.1 571.1±69.7 82.6±2.1 100 110.8±25.2 567.7±37.7 86.2±2.7
挤出膜孔径，nm 脂质体大小，nm， 平均值SD 药物装载， mg伊立替康 /mmol磷脂 小鼠中24小时后 保留在脂质体中 的药物，注射前值 的％ 50 87.6±28.1 57.9±24.2 79.2±3.8 80 98.5±15.1 571.1±69.7 82.6±2.1 100 110.8±25.2 567.7±37.7 86.2±2.7
[0171]令人惊奇地，与具有聚阴离子聚合物(聚磷酸盐)的相似的脂质体相比，具有 八硫酸蔗糖的三乙铵盐——非聚合的聚阴离子化的有机羟基化的有机化合物(糖) ——的脂质体，提供了明显更好的(4-5倍)药物在脂质体中的体内药物保留效果。实施例14.装载CPT-11的SOS-TEA脂质体在大鼠内的血液药物动力学
[0172]如实施例12中所述的方法制备脂质体(100nm挤出膜孔径)。以10mg CPT-11/kg(17.6μmol磷脂/kg)的剂量，将脂质体经静脉内给予两只9周龄的具有留 置的中心静脉插管的雌性Sprague Dawley大鼠(Harlan)(体重约200g)。在规定的 时间点获取血液样品，并分析药物和脂质体脂类的含量，如实施例9所述。数据 用％注射的脂类剂量/ml血浆以及在每一时间点时保留在脂质体中的药物的％来表 示，对注射后的时间作图，并通过与单指数动态模型的最佳拟合计算脂质体的半 衰期以及药物从脂质体释放的药物释放半衰期(图5)。由装载CPT-11的TEA-SOS 脂质体释放的药物释放半衰期是56.8小时，大大长于相似的TEA-Pn脂质体的半 衰期。实施例15.游离CPT-11、包囊入含TEA-Pn和TEA-SOS的脂质体的CPT-11在具 有人结肠癌(HT-29)皮下异种移植物的无胸腺裸鼠中的抗肿瘤活性。
[0173]如实施例11所述，使用TEA-Pn溶液或TEA-SOS溶液制备脂质体，其中 TEA-Pn溶液含有0.65M TEA，pH6.1和同渗重摩53lmmol/kg，TEA-SOS溶液含 有0.643M TEA，pH5.7和同渗重摩530mmol/kg。挤出步骤包括10次通过孔径为 100nm的二叠层聚碳酸酯膜。所得的TEA-Pn和TEA-SOS 1脂质体的大小分别为 112.3±15.5nm和120.5+42.5(平均值±大小分布的SD)。脂质体以500mg/mmol的 输入药物/磷脂比率装载CPT-11。对于TEA-Pn和TEA-SOS制剂，所得的脂质体 的药物含量分别为465.6±26.5(93％装载效率)CPT-11/mmol磷脂和499.9±22.5 mg(100％装载效率)CPT-11/mmol磷脂。
[0174]HT-29细胞获自American Type Culture Collection，Rockville，MD，并根据供 应者的建议，在37℃、5％CO2中，在补充有10％胎牛血清、50U/ml青霉素G和 50μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基中增殖。NCR nu/nu同型无胸腺雄性裸鼠(6 周龄，体重至少16g)获自Charles River。小鼠右腹皮下接种0.1mL含有悬浮于无 抗生素生长培养基中的5×106细胞的悬浮液。11天后，根据下述方法将肿瘤大小 在150mm3至350mm3之间的动物分配入治疗组中。根据肿瘤大小对动物进行排 列，并依据递减的肿瘤大小分成6类别。通过从每一大小类别中随机选择一只动 物，组成每组11只动物的6个治疗组，这样在每一治疗组中相同地代表了所有的 肿瘤大小。从第13天开始，每隔4天动物4次通过尾静脉注射下述制剂：1)对照 (HEPES-缓冲盐水pH6.5)；2)游离CPT-1150mg/kg，以非缓冲生理盐水中的新 鲜制备的5mg/mL溶液给药；3)TEA-Pn脂质体CPT-11，每次注射25mg/kg；4) TEA-Pn脂质体CPT-11，每次注射50mg/kg；5)TEA-SOS脂质体CPT-11，每次注 射25mg/kg；6)TEA-SOS脂质体CPT-11，每次注射50mg/kg。如实施例10所述， 每周两次监控动物体重和肿瘤大小。动物称得的重量减去肿瘤重量得到动物体重。 肿瘤接种之后对动物观察60天。当某组中肿瘤达到小鼠体重的20％时，对该组中 的动物实施安乐死。在一些组中，肿瘤完全消退，并在研究结束时并无肿瘤再生 长的迹象。收集这些动物中肿瘤接种位置处的组织，并进行保存以用于对残留的 肿瘤细胞进行病理学分析。
[0175]该研究的结果显示在图6和7中。游离CPT-11对肿瘤生长仅具有微小的效 应。所有脂质体都具有导致肿瘤消退的显著的效应，之后在大部分动物中重新生 长。在TEA-Pn和TEA-SOS CPT-11脂质体中，50mg/kg的剂量都比25mg/kg剂 量更有效。由肿瘤大小数据(图7)计算得到的平均肿瘤大小加倍时间是：对照 ——4.2天；游离药物，50mg/kg——4.8天；TEA-Pn脂质体药物，25mg/mg——43.6 天；TEA-Pn脂质体药物，50mg/kg——47.5天；TEA-SOS脂质体药物，25 mg/kg——48.2天；和TEA-SOS脂质体药物，50mg/kg——超过56天(在第56天 时肿瘤大小未加倍时间)。因此，在相同剂量和时间表下，根据本发明制备的脂质 体CPT-11比游离药物的活性高至少10倍。出乎意料地，以相同剂量给药时， TEA-SOS CPT-11脂质体在减少肿瘤生长上比TEA-Pn CPT-11脂质体明显更为有 效。而在用游离药物和TES-Pn脂质体药物以每注射50mg/kg治疗的组中，所有 动物都出现肿瘤再生长现象；在接受25mg/kg每一脂质体的组中，在研究结束时 有一只动物(9.1％)无肿瘤；以及在接受50mg/kgTEA-SOS脂质体CPT-11制剂的 组中，在研究结束时有4只动物(36.4％)无肿瘤，也无再生长的迹象。
[0176]药物出现某些毒性。接受游离CPT-11，但不接受脂质体CPT-11的动物在 药物注射之后经历短暂的病态约1小时(丧失机敏性、驼背、皮肤起皱、活动能力 减弱)。接受游离CPT-11的动物在治疗期间经受永久性的体重减轻，减轻约6％， 并且没有恢复。接受两种脂质体CPT-11制剂的动物在第二和第三次注射之间的期 间经历短暂的重量减轻，平均重量减轻为治疗前值的约5％(25mg/kg下)或约9％ (50mg/kg下)，并最终获得正常的重量。因此，脂质体药物的毒性不超过游离(非 脂质体)药物的毒性，而脂质体药物的功效则高许多。当药物治疗结束时，重量 减轻得到逆转，并且所有动物恢复了它们的重量，未出现最终病态或毒性死亡现 象。之后，随同肿瘤消退，动物重量增加。在盐水对照组中，发展有较大肿瘤的 动物由于肿瘤-相关病态的缘故重量明显减轻。总的来说，药物被装载入具有预先 包载的聚阴离子化糖(八硫酸蔗糖)的脂质体的脂质体药物组合物，证明是最有效 的，而毒性低于非脂质体药物。实施例16.小鼠中游离和脂质体CPT-11的毒性
[0177]通过在对正常(具免疫活性)小鼠单次静脉注射后测定最大耐受剂量(MTD)， 比较游离CPT-11和根据本发明制备的脂质体包囊的CPT-11的急性毒性。
[0178]使用下述物质：
[0179]1)CPT-11(盐酸伊立替康)制剂，经HPLC分析具有98.9％盐酸伊立替康，水 分为7.6％。在该研究中，根据“原态”基础(“as is”basis)，制备药物制剂，不修正水 分含量或伊立替康基本成分的含量。
[0180]2)根据实施例11制备脂质体CPT-11(Ls-CPT-11)，使用如下物质：由DSPC 200摩尔份、胆固醇133摩尔份、PEG-DSPE 1摩尔份组成的脂类基质；含有0.65 M TEA，pH6.4的包载的溶液TEA-SOS；装载入脂质体中的药物，于5mM HEPES 缓冲液，5％葡萄糖，pH6.5中，药物以500mg药物/mmol磷脂的输入药物/脂类比 率，在60℃装载30分钟。装载效率＞99％。脂质体大小(体积平均值±标准偏差， 由QELS测量)：101±37nm。脂质体在载体中配制，20mM HEPES-Na，135mM NaCI；pH6.5。注射的制剂中的药物浓度在下表中描述。
[0181]3)游离CPT-11溶液。通过以22mg/mL的浓度将盐酸伊立替康溶解在5％ 含水葡萄糖中，制备游离的药物贮存液，并经0.2μm过滤除菌。在注射之前该贮 存液用无菌5％葡萄糖稀释。
[0182]4)动物。雌性Swiss Webster小鼠，6-8周龄，来自Harlan，USA。
[0183]MTD测定一般遵照United States National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program采用的方案。该方案包括下述三个步骤：
[0184]步骤1)：范围探索(Range-seeking)步骤，剂量递增因子为1.8。由两只动 物组成的组在尾静脉注射入剂量递增的游离或脂质体伊立替康，以剂量60mg/kg 起始，以1.8的递增因子持续进行，直到在所有动物中观察到急性死亡或最终发病 (terminal morbidity)(注射后＞1天内)。记录死亡/最终发病剂量之下的一步的剂量。
[0185]步骤2)：范围探索(Range-seeking)步骤，剂量递增因子为1.15。由两只 动物组成的组在尾静脉注射入剂量递增的游离或脂质体伊立替康，以步骤1记录 的剂量起始，以1.15的递增因子持续进行，直到在所有动物中观察到急性死亡或 最终发病(注射后＞1天内)。在试验性MTD，记录死亡/最终发病剂量之下的一步的 剂量。
[0186]步骤3)：确认步骤。由5只动物组成的组以步骤2中测定的试验性MTD 静脉(尾静脉)注射游离或脂质体伊立替康。对动物追踪7天，每周两次记录动物的 体重，并与注射前重量比较。观察一般健康状况(机敏性、外表、喂食、排泄物、 皮肤、毛发和粘膜状况、移动、呼吸、体态)。如果在观察期间，没有死亡、进行 性发病或重量减轻超过注射前体重的15％这样的现象，则该剂量被认为作为急性 单次注射MTD得到确认。如果出现这些结果中的任何结果，那么以1.15的因子 的下一较低剂量重复试验。
[0187]为了获得用于确认步骤的额外的统计学数据，追踪存活动物的体重动态学 至注射后11天。因为浓度和注射体积的限制，324mg/kg以上的脂质体伊立替康 这样的剂量不可能给予。结果呈现在表10中。表10.小鼠中对CPT-11制剂的MTD探索研究。
结果
步骤1：以因子1.8增加剂量
药物 注射剂 量 (mg/kg) 药物浓度 (mg/ml) 注射 体积 (μl) 小 鼠 编 号 动物体重，注射后的天数 0 (g) 1 (g) 2 (g) 4 (g) 5 (g) 6 (g) 7 (g) 11 (g) Ls- CPT -11 60 8 150 1 2 19.2 19.7 18.0 19.3 nd nd 20.3 20.6 20.6 20.4 20.6 19.6 20.2 19.7 19.7 20.7 100 12 165 1 2 19.5 20.1 18.6 18.9 nd nd 19.6 20.2 20.0 21.5 20.1 22.2 19.4 21.8 19.9 22.5 180 22 165 1 2 19.4 20.0 18.4 19.3 nd nd 18.9 19.6 19.7 20.6 20.5 21.4 19.5 21.6 20.5 21.7
324 30.6 210 1 2 21.8 21.6 21.2 20.4 21.2 21.3 nd nd 20.2 20.8 nd nd 20.2 21.4 nd Nd 游离 CPT -11 60 8 150 1 2 20.6 19.5 20.4 19.1 nd nd 22.1 20.2 22.1 20.3 22.2 20.4 22.0 20.5 22.5 21.1 100 12 165 1 2 3 19.3 20.1 19.9 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡
注射之后，所有用游离CPT-11治疗的小鼠患病，呼气不足约1小时，然后恢复；
注射之后，所有用Ls-CPT-11治疗的小鼠正常。
nd：未测定
步骤2：以因子1.15增加剂量
药物 注射 剂量 (mg/kg) 药物 浓度 (mg/ml) 注 射 体 积 (μl) 小鼠 编号 动物体重，注射后的天数 0 (g) 1 (g) 2 (g) 5 (g) 7 (g) 游离 CPT-11 60 70 80 90 8 8 8 12 8 150 175 200 150 225 3 4 5 6 7 8 9 10 11 19.9 19.5 20.9 22.3 20.6 20.6 22.3 22.4 20.6 20.0 18.7 20.0 21.8 19.9 20.8 20.9 19.4 20.6 22.4 20.1 21.1 19.9 18.8 19.3 22.4 19.9 20.7 21.3 18.9 20.4 22.8 20.9 21.4 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡
步骤3：确认
药物 注射 剂量 (mg/kg) 药物 浓度 (mg/ml) 注射体 积(μl) 小鼠 编号 动物体重，注射后的天数 0 (g) 3 (g) 5 (g) 7 (g) 游离 CPT-11 80 8 200 1 2 3 4 5 20.2 20.5 20.7 20.8 21.9 19.3 20.6 20.6 21.4 21.9 20.0 20.5 20.8 22.1 21.6 21.7 21.2 21.9 23.0 21.5 Ls- CPT-11 324 365 180 6 7 8 21.0 20.4 20.4 20.0 20.4 19.8 20.1 20.2 20.3 20.2 19.2 20.7
9 10 29.9 20.7 19.9 19.5 20.5 19.8 21.5 20.2
结果
步骤1：以因子1.8增加剂量
药物 注射剂 量 (mg/kg) 药物浓度 (mg/ml) 注射 体积 (μl) 小 鼠 编 号 动物体重，注射后的天数 0 (g) 1 (g) 2 (g) 4 (g) 5 (g) 6 (g) 7 (g) 11 (g) Ls- CPT -11 60 8 150 1 2 19.2 19.7 18.0 19.3 nd nd 20.3 20.6 20.6 20.4 20.6 19.6 20.2 19.7 19.7 20.7 100 12 165 1 2 19.5 20.1 18.6 18.9 nd nd 19.6 20.2 20.0 21.5 20.1 22.2 19.4 21.8 19.9 22.5 180 22 165 1 2 19.4 20.0 18.4 19.3 nd nd 18.9 19.6 19.7 20.6 20.5 21.4 19.5 21.6 20.5 21.7
324 30.6 210 1 2 21.8 21.6 21.2 20.4 21.2 21.3 nd nd 20.2 20.8 nd nd 20.2 21.4 nd Nd 游离 CPT -11 60 8 150 1 2 20.6 19.5 20.4 19.1 nd nd 22.1 20.2 22.1 20.3 22.2 20.4 22.0 20.5 22.5 21.1 100 12 165 1 2 3 19.3 20.1 19.9 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡
注射之后，所有用游离CPT-11治疗的小鼠患病，呼气不足约1小时，然后恢复；
注射之后，所有用Ls-CPT-11治疗的小鼠正常。
nd：未测定
步骤2：以因子1.15增加剂量
药物 注射 剂量 (mg/kg) 药物 浓度 (mg/ml) 注 射 体 积 (μl) 小鼠 编号 动物体重，注射后的天数 0 (g) 1 (g) 2 (g) 5 (g) 7 (g) 游离 CPT-11 60 70 80 90 8 8 8 12 8 150 175 200 150 225 3 4 5 6 7 8 9 10 11 19.9 19.5 20.9 22.3 20.6 20.6 22.3 22.4 20.6 20.0 18.7 20.0 21.8 19.9 20.8 20.9 19.4 20.6 22.4 20.1 21.1 19.9 18.8 19.3 22.4 19.9 20.7 21.3 18.9 20.4 22.8 20.9 21.4 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡 注射后1-2分钟死亡
步骤3：确认
药物 注射 剂量 (mg/kg) 药物 浓度 (mg/ml) 注射体 积(μl) 小鼠 编号 动物体重，注射后的天数 0 (g) 3 (g) 5 (g) 7 (g) 游离 CPT-11 80 8 200 1 2 3 4 5 20.2 20.5 20.7 20.8 21.9 19.3 20.6 20.6 21.4 21.9 20.0 20.5 20.8 22.1 21.6 21.7 21.2 21.9 23.0 21.5 Ls- CPT-11 324 365 180 6 7 8 21.0 20.4 20.4 20.0 20.4 19.8 20.1 20.2 20.3 20.2 19.2 20.7
9 10 29.9 20.7 19.9 19.5 20.5 19.8 21.5 20.2
[0188]因此，当游离CPT-11的MTD为80mg/kg，脂质体CPT-11的MTD令人惊 奇地甚至最高给药剂量324mg/kg时也未获得。因此，根据本发明对CPT-11进行 脂质体包囊药物毒性减少至少4倍。实施例17.装载CPT-11的TEA-SOS脂质体药物对渗漏的保存稳定性
[0189]使用TEA-SOS方法(实施例11)，以500-550mg/mmol磷脂的药物/脂类输入 比率制备5批脂质体CPT-11。利用膜挤压通过孔径为80nm或100nm的聚碳酸酯 膜，制备脂质体，如下表所示。脂质体经0.2-μm过滤器除菌，并在4-8℃，以3.4-14.5 mg/mL CPT-11的浓度保存在135mM NaCl，20mM HEPES-Na，pH6.5(保存缓冲 液)中。指定的保存时间之后，通过使用保存缓冲液作为洗脱剂，在Sephadex G-75 上进行凝胶层析，去除渗漏的药物。如实施例70和71所述，分别使用分光光度 法和酸消化蓝磷钼酸盐方法，分析凝胶层析之前和之后脂质体中药物和磷脂的浓 度。根据本发明制备的CPT-11脂质体非常稳定。在保存期间，在6个月时间中， CPT-11从这些脂质体的渗漏低于5％(表10)。表11.CPT-11脂质体在保存期间的包囊稳定性(数据为平均值±SE)
脂质体批号 挤压孔径，nm CPT-11浓度， mg/ml 保存时间， 月 保持包囊的药 物的％ 1 2 3 4 5 80 80 100 100 80 3.44±0.06 7.88±0.19 4.57±0.06 4.62±0.11 14.52±0.42 6 6 6 6 3 99.02±3.77 102.3 8±4.78 96.38±4.69 95.72±4.36 103.4±5.92
实施例18.装载托泊特坎的脂质体
脂质体批号 挤压孔径，nm CPT-11浓度， mg/ml 保存时间， 月 保持包囊的药 物的％ 1 2 3 4 5 80 80 100 100 80 3.44±0.06 7.88±0.19 4.57±0.06 4.62±0.11 14.52±0.42 6 6 6 6 3 99.02±3.77 102.3 8±4.78 96.38±4.69 95.72±4.36 103.4±5.92
实施例18.装载托泊特坎的脂质体
[0190]如实施例11制备含有包载的TEA-Pn溶液和TEA-SOS溶液的脂质体。在 与脂质体混合之前一刻，通过将盐酸托泊特坎以15-20mg/ml溶解在水中，制备盐 酸托泊特坎(GlaxoSmithKline，PA，USA)贮存液，并计算实际盐酸托泊特坎含量。用 1N HCl将pH调节到3.0。利用正压，使药物溶液过滤通过0.2微米聚醚砜(PES) 无菌过滤器。将药物装载缓冲液中的含TEA-Pn或TEA-SOS脂质体的等分试样在 室温中与托泊特坎HCl贮存液混合，获得0.15-0.45g/mmol脂质体磷脂范围内的药 物/脂类输入比。优选比率是每mmol脂质体磷脂含0.35g托泊特坎HCl。玻璃容 器中的混合物在55-62℃恒温水浴中温育，并伴随缓慢的搅拌，进行30-60min， 在冰浴(0-2℃)中迅速冷却，并放置在该温度5-15min。这步骤产生89-90％(TEA-Pn 梯度)或97-100％(TEA-SOS梯度)的包囊效率。使用尺寸排阻柱层析，去除未包囊 的托泊特坎，并将脂质体转移入保存缓冲液。在施用到柱上之前，通过与1/20体 积的2.88M含水氯化钠混合，增加脂质体制剂的离子强度，并将混合物温育15 分钟。出乎意料地我们发现将脂质体介质的离子强度由装载期间的低值(通常相当 于20mM NaCl以下)调整到高于20mM NaCl的值，优选地调整到50mM NaCl和 更高值，提高未包囊药物的去除效果，增加装载托泊特坎的脂质体对聚集的稳定 性，这可能通过帮助去除膜结合的托泊特坎而实现，其相对于包囊在脂质体内部 的药物而言。剩余的步骤遵照实施例11的步骤7进行。对于结果，参见下表12。实施例19.托泊特坎的抗-HER2-免疫脂质体制剂的制备
[0191]通过将托泊特坎脂质体连接到选自嗜菌体展示文库的抗-HER2单链人Fv抗 体片段F5以用于将其高水平地内化入表达HER2的细胞，制备可特异性地内化入 过量表达HER2(C-ErbB-2)表面受体酪氨酸激酶癌蛋白的癌细胞的托泊特坎免疫 脂质体(Poul，et al.，2000，J.Molecular Biology，v.301，p.1149-1161)。F5是以约150 nM的亲和力与HER2受体的胞外结构域结合，引起快速内化作用的27-KDa蛋白 质(Neve，et al.，2001，Biophys.Biochim.Res.Commun.v.280，p.274-279)。对于脂 质体连接，一般遵照美国专利6,210,707方法和Nielsen，et al.(2002)，Biochim. Biophys.Acta，v.1591，p.109-118的方法。首先制备F5亲水性脂聚合物连接物。F5 氨基酸链的C-末端具有加入的末端半胱氨酸基团(F5Cys)。F5Cys构建物表达在大 肠杆菌(E.coli)中，并通过蛋白质A柱层析从细菌裂解物分离出来。将蛋白A 洗脱的级分吸附到阴离子交换树脂上以去除热原质和宿主DNA，并用硫醇还原剂 处理以释放末端半胱氨酸的硫醇基团。还原的F5Cys用SP Sepharose Fast Flow (Amersham Phannacia)通过离子交换层析进一步纯化。将纯化的蛋白连接到硫醇- 反应性脂类-聚(乙二醇)接头，N-(3-(N-酰亚胺)propyonylamido)-聚(氧乙烯)-氧羰 基)-1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE)，其是分子量2,000的PEG的衍生 物(图4.1)，商业上由Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabama，USA生产。将蛋白与接头 在含水缓冲液中以1∶4摩尔比温育，用1mM半胱氨酸淬火未反应的接头。在反 应期间，F5Cys的末端半胱氨酸与接头的酰亚胺基团共价连接。所得的 F5-PEG-DSPE偶联物是水溶性的胶束形式，具有高表观分子量(500-850 KDa)，并 通过尺寸排阻层析与未反应的蛋白(约25％)分离开来。纯化的偶联物中蛋白的数量 通过UV分光光度法在280nm处测定，接头的数量利用与用于磷脂定量的方法(参 见实施例70)相同的分光光度方法分析。纯化的F5-PEG-DSPE偶联物在水中是稳 定的，具有完全的免疫反应性，并在65℃至少1小时和37℃至少3月的时间里对 变性和反应性丧失具有稳定性。
[0192]为了制备抗-HER2免疫脂质体托泊特坎，将实施例18中的装载托泊特坎的 脂质体与F5-PEG-DSPE在含水盐水缓冲液中以每1微摩尔磷脂为15微克蛋白的 比率(每一脂质体约45个F5拷贝)混合。在60℃将混合物温育40分钟，在冰上冷 冻，在具有Sepharose CL-4B(交联的4％琼脂糖珠，Amersham Phannacia)的柱上 层析，以去除残留的胶束偶联物、未偶联的蛋白和在温育期间可能释放的任何微 量的脂质体外的药物。具有膜-整合的F5-PEG-DSPE的脂质体用5mM HEPES-144 mM NaCl缓冲液pH7.4洗脱，收集在柱的孔隙体积中，过滤除菌，并进行分配以 用于储存(4-6℃)。脂质体-整合的F5的数量通常大于加入的偶联物的80％。通过 SDS-PAGE测定脂质体，通过密度测定法对Coomassie-染色的F5带进行定量。经 测定，免疫脂质体中的药物和脂类浓度与非-靶向脂质体相似。托泊特坎脂质体和 F5-免疫脂质体(实施例18-19)的特性概述于表12中。表12.托泊特坎脂质体和免疫脂质体的特征
脂质体-包 载的盐 F5 scfv 附着 药物/脂类比率，g/mol磷 脂 ％包囊 脂质体大小，平均 值±SD，nm 输入 输出 TEA-Pn TEA-Pn TEA-SOS 否 是 否 173.6 173.6 347.2 155.2±5.9 156.2±5.2 340.8±14.7 89.4±3.4％ 90.0±3.0％ 98.2±4.2％ 96.4±38.7 96.2±33.8 99.1±32.6
实施例20.装载缓冲液的pH和药物/脂类比率对托泊特坎装载入脂质体的影响
脂质体-包 载的盐 F5 scfv 附着 药物/脂类比率，g/mol磷 脂 ％包囊 脂质体大小，平均 值±SD，nm 输入 输出 TEA-Pn TEA-Pn TEA-SOS 否 是 否 173.6 173.6 347.2 155.2±5.9 156.2±5.2 340.8±14.7 89.4±3.4％ 90.0±3.0％ 98.2±4.2％ 96.4±38.7 96.2±33.8 99.1±32.6
实施例20.装载缓冲液的pH和药物/脂类比率对托泊特坎装载入脂质体的影响
[0193]使用乙醇注射方法(实施例18)制备含有包载的0.5N TEA-Pn(pH6.2，同渗 重摩413mmol/kg)的脂质体(DSPC/Chol/PEG-DSPE，3∶2∶0.015摩尔比)，5次 挤压通过孔径100nm的二叠层聚碳酸酯过滤器和10次挤压通过孔径50nm的二 叠层聚碳酸酯过滤器。装载缓冲液是5mM MES，50g/L葡萄糖，将各pH值调节 到5.0-6.5的范围内。经QELS测定脂质体大小为73.1±21.3nm。通过下述方法装 载脂质体：将托泊特坎贮存液(20mg/ml)与脂质体在装载缓冲液中以100mg/mmol 的输入药物-磷脂比率混合，在60℃温育混合物45分钟，冰上淬火15分钟，并使 用Sephadex G-75柱用20mM HEPES，135mM NaCl，pH6.5洗脱，去除未包囊的 药物。通过分光光度法(实施例70和71)对托泊特坎和磷脂进行定量。结果(表13) 表明，在pH5.5-6.5范围内，托泊特坎装载几乎是定量的。表13.装载缓冲液的pH对托泊特坎包囊入含有包载的TEA-Pn的脂质体的百分比 的影响
装载缓冲液pH ％包囊 5.0 5.5 6.0 50.1±2.1 97.2±8.1 115.5±15.0
6.5 102.1±8.1
装载缓冲液pH ％包囊 5.0 5.5 6.0 50.1±2.1 97.2±8.1 115.5±15.0
6.5 102.1±8.1
[0194]也研究了药物与脂类的比率(0.15-0.45mg/mmol磷脂)对装载效率的影响。 按照上述方法，制备含有包载的TEA-Pn(0.5M TEA，pH5.8，同渗重摩480mmol/kg) 的脂质体，除了最终挤压步骤是10次通过二叠层0.08μm聚碳酸酯过滤器外。装 载在pH6.5进行。经QELS测定脂质体大小为93.1±15.1nm。结果(表14)表明 对于整个研究的药物/脂类比率范围，装载效率85％。表14.药物/脂类比率对托泊特坎包囊入含TEA-Pn的脂质体的包囊效率的影响
托泊特坎/磷脂比率，mg/mmol ％包囊(平均值±SE) 输入比率 输出比率(装载后) 168.2 224.4 280.3 336.4 392.5 448.5 166.9±11.1 232.5±47.6 253.5+19.8 298.3±18.0 361.2±36.8 394.9±29.5 99.2±6.6 103.7±21.2 90.4±7.0 88.7±5.3 92.0±9.4 88.0±6.6
实施例21.在体外，在血浆存在下托泊特坎脂质体的稳定性
托泊特坎/磷脂比率，mg/mmol ％包囊(平均值±SE) 输入比率 输出比率(装载后) 168.2 224.4 280.3 336.4 392.5 448.5 166.9±11.1 232.5±47.6 253.5+19.8 298.3±18.0 361.2±36.8 394.9±29.5 99.2±6.6 103.7±21.2 90.4±7.0 88.7±5.3 92.0±9.4 88.0±6.6
实施例21.在体外，在血浆存在下托泊特坎脂质体的稳定性
[0195]如实施例18所述，制备脂质体(DSPC/Chol/PEG-DSPE，摩尔比3∶2∶0.015)， 该脂质体含有包载的0.5N TEA-Pn，pH6.2，同渗重摩413mmol/kg。通过10次挤 压通过二叠层100nm孔径聚碳酸酯过滤器，产生大小为96.4±29.3nm的脂质体。 为了定量血浆中的脂质体脂类，将[3H]-CHE以0.5Ci/mol DSPC包含在脂类溶液 中。托泊特坎在pH6.0，于58℃，以150mg/mmol的药物/磷脂比率装载45分钟。 装载效率为148.48±10.26g托泊特坎/mol磷脂(99.0±6.8％)。
[0196]脂质体用50％人血浆在多孔微透析装置(Spectra-Por Micro透析器10-孔， Spectrum，USA)中温育。人供体血浆用等体积的含有0.02％叠氮钠的HEPES-缓冲 盐水(20mM HEPES，135mMNaCI)，pH6.5稀释，并装载入透析器(32mL)的下部 容器(lower reservoir)中。通过孔径为30nm的聚碳酸酯膜，将孔(0.4mL)与容器分 开，使得血浆蛋白和小分子能自由通过，但脂质体不能通过。将脂质体与计算出 来的量的血浆和HEPES-缓冲盐水混合，获得的浓度为2.5mM磷脂和血浆的 50vol.％。将装置在37℃温育，缓慢搅拌容器中的内含物。温育8小时之后，下部 容器中的内含物更换新鲜的50％血浆。在给定时间点后(参见下文)，从孔中获取 50-μL等分样品，在含有2.2-2.4mL Sepharose CL-2B，洗脱剂HEPES-缓冲盐水的 柱上层析，以将脂质体与血浆蛋白和游离药物分离开。将脂质体收集在孔隙体积 部分中。在将血浆样品溶解在90％含水异丙醇-0.1N HCl中后，利用384nm激发 光和524nm发射光通过荧光测定法对托泊特坎定量，通过对[3H]-CHE(淬火校正) 进行闪烁计数来定量脂类。将在每一时间点测得的药物-与-脂类比率与温育之前的 起始比率进行比较，获得在每一时间点保持包囊的托泊特坎的百分比。温育8小 时之后，保留在脂质体中的药物的数量是它起始值的大约55％(表15)。表15.于37℃，在50％人血浆中，托泊特坎由装载有TEA-Pn梯度的脂质体的体 外释放
温育时间，小时 ％保持包囊的药物 1 4 8 24 95.5±5.4 76.8±7.3 55.9±4.1 55.4±16.8
实施例22.在各种药物/脂类比率，具有包载的TEA-Pn梯度的托泊特坎脂质体：
在小鼠中的体内药物保留和循环寿命
温育时间，小时 ％保持包囊的药物 1 4 8 24 95.5±5.4 76.8±7.3 55.9±4.1 55.4±16.8
实施例22.在各种药物/脂类比率，具有包载的TEA-Pn梯度的托泊特坎脂质体：
在小鼠中的体内药物保留和循环寿命
[0197]如实施例18所述，使利挤压通过二叠层100nm孔径聚碳酸酯过滤器12次， 制备含有包囊的形成梯度的盐溶液(0.5N TEA-Pn，pH6.2，同渗重摩413mmol/kg) 的脂质体(DSPC/Chol/PEG-DSPE，3∶2∶0.015摩尔比，以0.5mCi/mmol DSPC含 有[3H]-CHE)。经QELS测量，脂质体的大小为107.7±19.1。在5mM HEPES，50g/L 葡萄糖，pH6.5中，将脂质体与托泊特坎的含水贮存液(20mg/ml)，以130-360g/mol 范围内的药物/磷脂比率混合，然后在58℃温育混合物45min，放置在冰上15min， 通过Sephadex G-75层析去除未包囊的药物。12周龄的雌性FvB小鼠以每kg体重 5mg托泊特坎的剂量(大约0.2mg托泊特坎/动物)，通过尾静脉注射以脂质体， 注射三次。在指定时间，典型地在注射后8小时或24小时，将小鼠麻醉，放血， 并分析血液样品中的药物和脂类，如实施例8所述。结果在表16中示出。24小时 之后，初始药物载量的大约6-32％保持包囊状态。较高的药物载量(＞200mg/mmol 磷脂)导致较长的药物保留时间。表16.使用TEA-Pn梯度方法装载不同药物/脂类比率的原型托泊特坎脂质体的体 内药物保留和循环寿命
包囊的药物/ 磷脂比率， mg/mmol 保留在循环中的脂类，％注射 的剂量 保持包囊状态的托泊特坎，％ 初始载量 8小时后 24小时后 8小时后 24小时后 127.2±10.9 207.2±21.6 301.3±24.5 360.3±35.6 36.1±2.0 32.1±5.2 34.4±3.2 33.6±2.4 18.7±8.1 9.84±1.88 8.04±4.25 8.68±4.96 51.7±7.1 75.6±13.0 79.2±4.2 73.5±7.0 6.72±2.5 13.8±3.5 25.6±4.4 32.3±9.8
实施例23.使用不同的包载的铵盐和三乙铵盐装载的托泊特坎脂质体的体内药物 保留和循环寿命
包囊的药物/ 磷脂比率， mg/mmol 保留在循环中的脂类，％注射 的剂量 保持包囊状态的托泊特坎，％ 初始载量 8小时后 24小时后 8小时后 24小时后 127.2±10.9 207.2±21.6 301.3±24.5 360.3±35.6 36.1±2.0 32.1±5.2 34.4±3.2 33.6±2.4 18.7±8.1 9.84±1.88 8.04±4.25 8.68±4.96 51.7±7.1 75.6±13.0 79.2±4.2 73.5±7.0 6.72±2.5 13.8±3.5 25.6±4.4 32.3±9.8
实施例23.使用不同的包载的铵盐和三乙铵盐装载的托泊特坎脂质体的体内药物 保留和循环寿命
[0198]如实施例18所述，制备由DSPE、胆固醇和PEG-DSPE(按重量比3∶1∶ 0.1)组成的脂质体，该脂质体也含有0.22mCi/mmol DSPE的[3H]-CHE，与实施例 18不同的是，挤压步骤包括：10次通过2叠层200-nm孔过滤器，10次通过2叠 层100-nm孔过滤器和20次通过2叠层50-nm孔过滤器。脂质体包含下述盐溶液：
[0199]由购自Sigma的葡萄糖硫酸钠(分子量5000)制备0.5N葡萄糖硫酸铵 (ammonium dextran sulfate)溶液(A-DS)，并通过与实施例4的程序相似的离子交换 程序转化为铵盐。葡萄糖硫酸溶液立即用12.4M含水氨水滴定。A-DS溶液的pH 为5.66，同渗重摩为208mmol/kg。
[0200]类似于实施例6，制备0.48N蔗糖八硫酸铵(A-SOS)，但是用氢氧化铵滴 定。溶液的pH为6.27，同渗重摩为58mmol/kg。
[0201]如实施例6所述制备0.47M蔗糖八硫酸三乙铵(TEA-SOS)。溶液pH为6.6， 同渗重摩为297mmol/kg。
[0202]通过在61-62℃、以346±1mg/mmol的药物/磷脂比率用药物温育脂质体40 min，然后在冰上温育10min，在10mM MES-Na，50g/L葡萄糖，pH6.5含水溶 液中将托泊特坎装载入脂质体。通过在Sephadex G-25上进行层析，将脂质体从未 包囊的药物纯化出来，洗脱剂为含水2mM组胺，144mM NaCl，pH6.6(HCl)。
[0203]7到9周龄的雌性Swiss Webster小鼠经尾静脉注射这些脂质体托泊特坎制 剂，剂量为每kg体重为5mg托泊特坎(大约0.2mg托泊特坎/动物)，注射3次。 在注射后8小时或24小时，收集血液，并分析托泊特坎和脂类，如实施例22所 述。
[0204]结果呈现在下表17中。尽管所有三种脂质体制剂表现出非常接近的脂质体 循环寿命，在注射后24天，大约23-28％的注射剂量保留在血液中，但是出乎意料 地是，无论在数量(药物保留提高大约2倍)还是在统计学显著性上(在95％置信度 水平由2-尾非配对Student′s t-试验获得的统计学显著性分别是p＝0.0257和 p＝0.00995；由Mann′s U-试验获得的结果差异明显[α]＝0.01)，TEA-SOS脂质体和 A-SOS脂质体中的药物保留效果都好于A-DS脂质体。含有托泊特坎脂质体的 TEA-SOS的药物保留效果优于含有托泊特坎脂质体的A-SOS的药物保留效果。表17.使用TEA-SOS、铵-SOS(A-SOS)和葡萄糖硫酸铵(A-DS)制备的托泊特坎脂质体的体内药物保留和循环持续时间
梯度 药物/磷脂比率， mg/mmol 装载效率，％ 脂质体大小，nm 保留在循环中的脂类，％注射 剂量 保持包囊的托泊特坎，％起始 载量 8小时后 24小时后 8小时后 24小时后 A-DS A-SOS TEA-S0S 288.1±20.6 346.2±14.3 340.8±14.7 83.3±6.0 100.0±4.1 98.5±4.2 76.9±22.7 99.7±28.9 99.1±32.6 43.7±1.2 42.3±2.2 42.1±2.3 27.7±1.5 23.4±2.0 23.0±2.9 43.6±6.8 53.3±0.8 57.0±5.6 18.7±1.5 31.3±3.2 38.1±6.1
实施例24.大鼠中托泊特坎脂质体的药物和脂类血浆动力学
梯度 药物/磷脂比率， mg/mmol 装载效率，％ 脂质体大小，nm 保留在循环中的脂类，％注射 剂量 保持包囊的托泊特坎，％起始 载量 8小时后 24小时后 8小时后 24小时后 A-DS A-SOS TEA-S0S 288.1±20.6 346.2±14.3 340.8±14.7 83.3±6.0 100.0±4.1 98.5±4.2 76.9±22.7 99.7±28.9 99.1±32.6 43.7±1.2 42.3±2.2 42.1±2.3 27.7±1.5 23.4±2.0 23.0±2.9 43.6±6.8 53.3±0.8 57.0±5.6 18.7±1.5 31.3±3.2 38.1±6.1
实施例24.大鼠中托泊特坎脂质体的药物和脂类血浆动力学
[0205]在大鼠中评价循环寿命和托泊特坎释放参数。如实施例18所述，通过乙醇 混合/挤压方法制备脂质体(DSPC/胆固醇/PEG-DSPE，摩尔比3∶2∶0.015)，并使 用TEA-Pn梯度或TEA-八硫酸蔗糖(TEA-SOS)梯度以不同的药物/脂类比率(15-450 mg/mmol磷脂)装载托泊特坎。为了定量脂类基质，脂质体包含0.5-1.5mCi/mmol DSPC的[3H]-CHE。以4-5mg/kg体重的剂量，具有留置的中心静脉插管的雌性 Sprague Dawley大鼠(6-8周龄，体重200g)通过静脉注射(通过导管)托泊特坎脂质 体。导管用盐水冲洗。在选定的时间(最高达注射后48小时)通过导管将血液样 品(0.2-0.3mL)收集入肝素化的注射器中，与0.4mL含有0.04％EDTA的冷硫酸盐 缓冲盐水混合，通过离心分离血细胞，通过H-CHE放射性计数(淬火校正)评价上 清液(PBS-稀释的血浆)中的脂类，通过荧光测定法评价托泊特坎(实施例71)。对于 血浆稀释液校正分析结果，由获得的血液样品的重量计算，并假设血细胞 (hematocryt)为40％。由经计算为体重的6.5％的血液体积估计药物和脂类的总血液 剂量。将给定时间点的药物/脂类比率与注射的脂质体的药物/脂类比率比较，计算 保留在脂质体中托泊特坎的百分比。下表18概括了脂类、药物的血液半衰期，药 物释放半衰期以及脂质体的其他特性。药物动力学(PK)曲线显示在图8A(脂类)和 8B(药物/脂类比率)中。总体上说，药物和脂类的血液PK曲线与单指数模型(R2 0.984-0.999)充分拟合。尽管它们大小为90-100nm以及非常少量的PEG化的脂类 (0.3mol.％)，脂质体令人意想不到地显示出良好的循环寿命(脂类组分的血浆半衰期 在11-16小时范围内)。对于使用TEA-SOS装载的脂质体观察到最小水平的托泊特 坎释放(半衰期22.9小时)。表18.大鼠中脂类和药物的循环半衰期(t1/2)，药物从原型托泊特坎脂质体释放出 来的半衰期
包载的盐 和浓度 托泊特坎 载量，mg/ mmol磷脂 脂质体大 小，nm(平 均值±SD) 注射的 剂量， mg/kg t1/2脂 类，小 时 t1/2药 物，小 时 药物释 放的 t1/2，小 时 每组 动物 数量 TEA-Pn 0.5N TEA-Pn 0.5N TEA-SOS 0.643N 124.3±9.7 360.3±35.6 439.2±15.9 92.3±23.3 107.7±19.1 108.8±13.4 4 5 5 15.8 12.8 10.8 4.13 6.06 7.36 5.34 9.97 22.87 3 2 2
实施例25.在托泊特坎脂质体储存期间药物对渗漏的稳定性
包载的盐 和浓度 托泊特坎 载量，mg/ mmol磷脂 脂质体大 小，nm(平 均值±SD) 注射的 剂量， mg/kg t1/2脂 类，小 时 t1/2药 物，小 时 药物释 放的 t1/2，小 时 每组 动物 数量 TEA-Pn 0.5N TEA-Pn 0.5N TEA-SOS 0.643N 124.3±9.7 360.3±35.6 439.2±15.9 92.3±23.3 107.7±19.1 108.8±13.4 4 5 5 15.8 12.8 10.8 4.13 6.06 7.36 5.34 9.97 22.87 3 2 2
实施例25.在托泊特坎脂质体储存期间药物对渗漏的稳定性
[0206]将制备用于上述研究的几种原型制剂的样品，在4-6℃储存不同的时间，以 评价包囊的托泊特坎对药物从脂质体渗漏的保存稳定性。使脂质体样品通过 Sephadex G-75柱，用20mM HEPES，135mMNaCl，pH6.5洗脱，除去脂质体外 的药物，并通过分光光度法分析药物含量，通过[3H]-CHE放射性计数法分析脂类。 结果(表19)表明在储存期间脂质体中的托泊特坎具有良好的保留性。表19.储存期间原型托泊特坎脂质体中的药物保留
形成脂质体梯 度的盐 脂质体大小， 平均值±SD， nm 初始药物载 量，mg药物/ mmol磷脂 保存时间，月 储存后的药物 载量，％初始 载量 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-SOS 0.643N pH5.6 96.4±29.3 107.7±19.1 107.7±19.1 107.7±19.1 108.8±13.4 148.5±10.3 127.2±10.9 207.2±21.6 301.3±24.5 439.2±15.9 8 6 6 6 2 101.6±5.5 94.6±6.2 113.9±9.4 112.9±9.3 97.8±9.4
实施例26.HER2-过量表达的癌细胞对脂质体和免疫脂质体托泊特坎的体外吸收
形成脂质体梯 度的盐 脂质体大小， 平均值±SD， nm 初始药物载 量，mg药物/ mmol磷脂 保存时间，月 储存后的药物 载量，％初始 载量 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-Pn 0.500 N pH6.2 TEA-SOS 0.643N pH5.6 96.4±29.3 107.7±19.1 107.7±19.1 107.7±19.1 108.8±13.4 148.5±10.3 127.2±10.9 207.2±21.6 301.3±24.5 439.2±15.9 8 6 6 6 2 101.6±5.5 94.6±6.2 113.9±9.4 112.9±9.3 97.8±9.4
实施例26.HER2-过量表达的癌细胞对脂质体和免疫脂质体托泊特坎的体外吸收
[0207]该研究揭示了在细胞培养物中根据本发明制备的装载托泊特坎的抗-HER2- 免疫脂质体将托泊特坎特异性地输送到HER2-过量表达的细胞的能力。制备(免 疫)脂质体并使用实施例19的TEA-Pn方法装载托泊特坎。在T-75瓶中，于37℃， 5％CO2中，将HER-2过量表达的人乳腺癌细胞(SKBr-3，ATCC)培养在改良的 McCoy 5A培养基(无曲辛)中，培养直至汇合，该培养基补充以10％胎牛血清、50 g/mL硫酸链霉素和50U/ml青霉素G(完全生长培养基)。通过胰蛋白酶消化收获细 胞，以150,000细胞/孔，于0.5mL完全生长培养基中，将收获的细胞温育在24- 孔细胞培养板上，并允许驯化过夜。培养基用0.5mL完全生长培养基替换，该完 全生长培养基含有在0.01-0.1mM磷脂范围内选定浓度的托泊特坎制剂。孔一式三 份用于每一条件。对照孔在缺少药物和/或脂质体的情况下温育(以获得用于药物 分析的背景读数)。板在37C，5％ CO2中，伴随缓慢搅拌温育4-8小时。对培养 基吸气，细胞用1mL份含有Ca和Mg盐的冷Hanks′平衡盐溶液冲洗4次。通过 加入0.1mL于水中的1％Triton X-100溶解细胞，细胞裂解物中药物数量经荧光测 定法测定(实施例71)。在10-2500ng托泊特坎/孔范围内获得标准曲线，并在减去 细胞自身荧光背景后与二价多项(说明了在较高药物浓度自淬火)相符。当使用微量 板荧光计时，过滤器选择为激光光400/30nm，发射光530/25nm。无论比色皿还 是微量板荧光计都给出的相同的结果。
[0208]两个试验的结果概述在下表20中。对HER2定向脂质体药物具有显著的细 胞吸收水平(比非-定向脂质体托泊特坎高50-300倍)。令人感兴趣的是，对游离托 泊特坎的吸收也明显低于HER2-定向免疫脂质体托泊特坎。这可以这样解释，在 存在血清的细胞生长培养基中，托泊特坎分子中的喜树碱内酯环快速水解，产生 具有较低细胞渗透性和较低细胞毒性的羧基形式的药物。总之，定向细胞的、可 内化的、连接配体的免疫脂质体在胞内输送托泊特坎的能力得到确认。表20.含有TEA-Pn的托泊特坎脂质体和抗-HER2免疫脂质体的体外细胞吸收(nd， 未测定)。脂质体特征请参见表12。
脂质体浓 度，mM， 磷脂 托泊特坎浓 度，μg/mL 暴露时间， 小时 SK-Br-3细胞对托泊特坎的吸收， ng/100,000细胞 非-定向脂 质体 F5-免疫脂 质体 游离药物 0.1 15.5 4 1.45±0.09 163±5.7 nd 0.01 1.55 4 0.185±0.03 60.2±2.0 nd 0.033 5.0 8 3.62±2.03 169.6±13.7 5.56±0.91
实施例27.在体外脂质体和免疫脂质体托泊特坎对HER2-过量表达的癌细胞的细 胞毒性
脂质体浓 度，mM， 磷脂 托泊特坎浓 度，μg/mL 暴露时间， 小时 SK-Br-3细胞对托泊特坎的吸收， ng/100,000细胞 非-定向脂 质体 F5-免疫脂 质体 游离药物 0.1 15.5 4 1.45±0.09 163±5.7 nd 0.01 1.55 4 0.185±0.03 60.2±2.0 nd 0.033 5.0 8 3.62±2.03 169.6±13.7 5.56±0.91
实施例27.在体外脂质体和免疫脂质体托泊特坎对HER2-过量表达的癌细胞的细 胞毒性
[0209]一旦抗-HER2托泊特坎免疫脂质体将药物胞内输送入HER2-过量表达的癌 细胞的能力被确立(实施例26)，对于确保内化的脂质体能够以其活性形式释放药物 是重要的。为了这个目的，对游离托泊特坎(即托泊特坎被配制成溶液)、脂质体托 泊特坎和抗-HER2-免疫脂质体托泊特坎的体外细胞毒性进行了研究。制备脂质体 托泊特坎制剂，培养并收获SKBr-3细胞，如实施例26所述。以含5,000个细胞的 0.1mL完全生长培养基，将细胞接种到96孔细胞培养板，一式三份，并驯化。培 养板最边上的排和列空着。将托泊特坎脂质体、免疫脂质体或游离药物(通过将托 泊特坎20mg/mL贮存液，pH3稀释入未缓冲的盐水至2mg/mL新鲜制备游离药物) 的无菌制剂用完全药物培养基稀释，获得起始浓度90、30或10g/mL，并以因子3 用培养基连续稀释。孔中的培养基用0.2mL药物/脂质体稀释液替换，并在37℃， 5％CO2中温育规定的时间(4-6小时)。每排一个孔用无药物的培养基温育以充当未 处理的对照。从孔中吸取含药物的培养基，用0.2mL无药物培养基冲洗细胞，将 0.2mL新鲜的无药物培养基加入到所有孔中。将板在37℃，5％CO2中温育4天。 不改变培养基，将在无血清培养基中的0.03mL的2mg/mL四唑染料(噻唑蓝， MTT)(Sigma Chemical Co.)溶液加入到每一孔中。在37℃，5％CO2，将板再温育 2-3小时。吸取培养基，使孔充满0.2mL 70vol.％的含水异丙醇，0.075N HCl， 并温和搅拌直到formazan染料溶解(15-30min)。在540nm处使用微量板光度计测 定formazan溶液的光密度。以试验孔中的光密度与含未处理细胞的孔中的光密度 的比率，计算细胞存活，用％未处理对照表示，用背景校正。将数据对药物浓度作 图，通过图中由存活-浓度曲线与50％存活线的交点估计IC50剂量。
[0210]结果示出在图9中。导致50％生长抑制(IC50)的药物剂量对于游离托泊特坎 或非定向脂质体托泊特坎超过30μg/mL；对于F5-免疫脂质体托泊特坎为15μg/mL。 这些结果与定向药物吸收数据一致。实施例28.小鼠中脂质体和F5-免疫脂质体托泊特坎的比较稳定性和血浆药物动力 学
[0211]根据实施例11和19，使用乙醇脂类溶液混合-挤压程序下述条件下，制备 以1.5mCi/mmol磷脂含有放射性脂类标记[3H]-CHE的托泊特坎脂质体：形成梯度 的盐溶液：0.643N八硫酸蔗糖三乙铵；聚碳酸酯膜挤压；15次通过2叠层PCTE 过滤器，80nm孔径；托泊特坎装载：药物/磷脂输入比率350mg/mmol(对托泊特 坎游离基本成分计算)；F5 scFv连接如实施例19所描述地进行。脂质体具有下述 特征：
[0212]经QELS测定大小为：加权平均值101.2nm；标准偏差，20.1nm。
[0213]药物包囊：托泊特坎脂质体(Topo-Ls)359.3±27.4mg/mmol磷脂；托泊特坎 F5scFv-免疫脂质体(Topo-F5-ILs)326.3±15.9mg/mmol磷脂。
[0214]该研究总体上按照实施例22进行。由9只雄性Swiss Webster小鼠(8-10周 龄，24-27g)组成的组经尾静脉注射Topo-Ls、Topo-F5ILs或新鲜制备的托泊特坎1 mg/mL，于无缓冲盐水中，剂量为每kg体重5mg托泊特坎基本成分(相当于脂类 剂量：14-16mol磷脂/kg体重)。在注射后1小时、8小时或24小时，在每一时间 点对3只动物在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下经开口心脏穿刺放血，将血液收集入含有 PBS-EDTA的管中，并分析托泊特坎(荧光测定法)和脂质体(通过放射性闪烁计数 法)。投入的剂量取100％，计算在给定时间点保留在血液中的药物和脂类剂量的数 量，假设每只动物的血量为体重的6.3％，充满血细胞的部分45％。单独将血浆样 品的药物/脂类放射性比率与注射脂质体的药物/脂类放射性比率比较，对每一动物 计算每一时间点保持包囊在脂质体中的药物的数量。在注射后1小时时收集的血 浆样品中游离托泊特坎的数量低于注射剂量的1％(事实上，它们在我们分析方法 的检测极限之下)；因此，没有对游离托泊特坎组在进一步的时间点进行研究。因 为游离托泊特坎具有快速血液清除和低血液水平，我们认为在所有时间点血液中 发现的基本上所有托泊特坎都是脂质体包囊的托泊特坎。
[0215]结果概述在下表21中。引人注目地，根据本发明制备的脂质体甚至在注射 入动物血流24小时后仍然保持原始药物载量的79-85％。脂质体和免疫脂质体组的 脂类或药物的平均血浆值之间的差异在1.8-13.6％范围内，这接近于分析误差或在 分析误差的范围内。使用Student′s t-试验计算的与每一时间点的药物或脂类值相关 的脂质体和免疫脂质体之间的零假设(null hypothesis)的概率，在0.543-0.938范围 内。我们的结论是两种制剂之间的药物或脂类的残留血液水平可以忽略不计且在 统计学上是不可区别的。表21.在注射后各时间点，脂质体脂类、托泊特坎和保持包囊在脂质体中的托泊 特坎在小鼠血浆中的数量
注射后时间 脂类，％注射剂量 药物，％注射剂量 药物/脂类，％注射 前值 F5-连接的脂质体托泊特坎(Topo-F5ILs) 1小时 57.58±4.95 55.45±7.23 96.14±7.32 8小时 35.37±3.84 34.18±5.87 96.31±11.92 24小时 15.51±11.84 12.30±9.02 79.36±8.03 脂质体托泊特坎(未连接的)(Topo-Ls) 1小时 58.88±9.51 57.63±9.45 97.90±5.29 8小时 39.61±1.99 38.82±1.49 98.06±4.44 24小时 15.84±3.85 13.45±2.64 85.25±7.03
实施例29.脂质体的和抗-HER2-免疫脂质体的托泊特坎在BT-474异种移植物模 型中的抗肿瘤功效
注射后时间 脂类，％注射剂量 药物，％注射剂量 药物/脂类，％注射 前值 F5-连接的脂质体托泊特坎(Topo-F5ILs) 1小时 57.58±4.95 55.45±7.23 96.14±7.32 8小时 35.37±3.84 34.18±5.87 96.31±11.92 24小时 15.51±11.84 12.30±9.02 79.36±8.03 脂质体托泊特坎(未连接的)(Topo-Ls) 1小时 58.88±9.51 57.63±9.45 97.90±5.29 8小时 39.61±1.99 38.82±1.49 98.06±4.44 24小时 15.84±3.85 13.45±2.64 85.25±7.03
实施例29.脂质体的和抗-HER2-免疫脂质体的托泊特坎在BT-474异种移植物模 型中的抗肿瘤功效
[0216]在该研究中，我们使用了利用三乙铵-聚磷酸盐梯度包载药物的第一原型托 泊特坎免疫脂质体。基本上按照实施例11和19的方法制备脂质体。在60℃，将 脂类基质组分——DSPC(Avanti Polar Lipids；3摩尔份)、胆固醇(Calbiochem， 98.3％；2摩尔份)和甲氧基-PEG(2000)-DSPE(Avanti Polar Lipids，0.015摩尔 份)——与100％乙醇USP混合，得到含有0.5mM磷脂的溶液。在60℃，用含水 三乙铵磷酸盐溶液(0.608M三乙胺，0.65N磷酸盐，pH6.1，重量克摩尔渗透浓 度为531mmol/kg)稀释乙醇脂溶液，充分混合，并在60℃使用热稳定的气压挤压 机(Lipex Biomembranes)10次挤压通过孔径为100nm的2叠层聚碳酸酯膜 (Nuclepore，Corning)。挤出的脂质体在冰上冷却，通过在Sepharose CL-4B上，使 用5％葡萄糖-5mM HEPES-Na缓冲液，pH6.5作为洗脱剂进行凝胶层析，去除未 包囊的三乙铵多磷酸盐。经QELS测定，脂质体大小为103.8±35.1nm。以每μmol 磷脂0.35mg托泊特坎基本成分的比率，将该缓冲液中的脂质体与盐酸托泊特坎在 60℃温育30min。温育结束时，将脂质体在冰上冷却，在Sephadex G-75上以20mM HEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5作为洗脱剂进行层析，去除任何未包囊的药物。 如前面所报告地，通过荧光测定法测定药物含量，通过磷酸盐分析方法测定脂类 含量。如此获得的脂质体托泊特坎每mmol磷脂具有365.4±23.1mg托泊特坎基本 成分。为了制备HER2-定向托泊特坎免疫脂质体，将该脂质体托泊特坎制剂的一 部分与如实施例所述的纯化的抗-HER2 scFv F5和酰亚胺-PEG-DSPE接头的偶联 物温育。简而言之，将于含水10％蔗糖-10mM柠檬酸钠溶液，pH6.5中的 F5-PEG-DSPE偶联物与托泊特坎脂质体以每mmol脂质体磷脂15mg蛋白的比率 混合，并60℃温育30min。在冰上冷却温育混合物，并在Sepharose CL-4B上， 以20mM HEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5作为洗脱剂进行层析，去除任何未包 囊的scFv偶联物。在该附加的温育之后，药物与脂类的比率降低14％。
[0217]将含有1-2mg/mL托泊特坎的托泊特坎脂质体和免疫脂质体制剂通过0.2 微米无菌注射过滤器，并在无菌条件下分配入聚丙烯瓶中，4-6℃储存达1个月直 至使用。
[0218]通过将将盐酸托泊特坎粉末以2mg/mL溶解于5％葡萄糖中制备新鲜的游 离托泊特坎，通过0.2微米注射过滤器除菌。
[0219]如实施例10描述，建立HER2-过量表达的BT-474人乳腺癌异种移植物模 型。在肿瘤注射之后第13天，选择具有120-350立方毫米范围内的肿瘤的动物， 并随机分配入3个治疗组和1个对照组，每组有12只动物。在肿瘤接种之后第14、 18和21天，小鼠经静脉(尾静脉)注射托泊特坎制剂进行治疗，每次注射剂量为5 mg/kg体重，或注射相等体积的生理盐水。每日监控动物的总体健康状况。每周两 次监控肿瘤大小和体重，时间最长至肿瘤接种后第53天。对肿瘤达到体重的20％ 的动物，或进行性重量减少达20％或更多的动物实施安乐死。
[0220]图11和12分别显示了肿瘤生长和动物体重数据。脂质体托泊特坎(拓扑 替康(topotecan))制剂在肿瘤生长抑制中的活性要高于游离药物，F5-靶向脂质体 制剂(F5-定向脂质体制剂(F5-targeted liposomal formulation))的活性高于非靶向脂 质体制剂(非定向脂质体制剂(non-targeted one)。在观察阶段结束时，各治疗组 中平均肿瘤大小差异明显(经非配对2-尾Student′s t-试验获得的p值(p values)对于 游离v.免疫脂质体药物为1.2×10-6；游离v.脂质体药为0.000114；脂质体v.免疫脂 质体药物为0.00718)。因此，脂质体包囊的托泊特坎比游离药物更具活性，抗-HER2 免疫脂质体托泊特坎比非定向脂质体药物更具活性。在脂质体和免疫脂质体组中， 在最初的肿瘤消退之后，在最后一次治疗的10天内出现肿瘤再生长的现象。在游 离药物组中并无肿瘤消退现象。被注意到，给定剂量的托泊特坎的脂质体制剂比 游离药物毒性更大。具有肠胃毒性。接受脂质体托泊特坎的动物出现腹泻，经受 体重减轻；在体重减轻的最高峰时，体重减轻平均约14％。在非定向脂质体组中， 动物体重恢复，除了一只动物(12.5％)在研究结束时体重减轻始终为15％；在F5- 定向组中，5只动物(41.6％)发展为晚期病态并断气，还有两只(16.7％)体重减轻始 终为约15％。在对照组和游离药物组中，无体重减轻或治疗相关的病态。实施例30.在一周3次给予静脉注射的小鼠中，游离托泊特坎和脂质体托泊特坎 的最大耐受剂量(Maximum tolerated dose(MTD))
[0221]除了三乙铵多磷酸盐溶液用具有0.65M三乙铵，pH6.2的三乙铵蔗糖八硫 酸盐溶液替换；并使用80-nm聚碳酸酯膜过滤器替换100-nm聚碳酸酯膜过滤器进 行挤压外，该研究使用如实施例29制备的脂质体托泊特坎制剂。通过准弹性光散 射法以高斯近似(Gaussian approximation)(QELS)测定的体积加权脂质体大小为 95.1±19.6nm(平均值±SD)；药物/脂类比率为369.1±18.3mg/mmol磷脂。在2组中 的5只六周龄雌性Swiss-Webster小鼠(18-20g)经三次静脉(尾静脉)注射游离托泊 特坎或脂质体托泊特坎，一周一次，以每次注射2mg/kg托泊特坎基本成分的剂 量起始，并对每一随后的组以1.8的因子增加，直至剂量为37.8mg/kg。免疫脂质 体托泊特坎不包括在该研究中。每日监控动物的体重和总体健康。在从治疗开始 起10天的时间里，组中两只动物中任何一只在任何时间点进行性体重减轻超过 20％或自然死亡时，被认为指示出了毒性剂量。根据动物死亡率和重量数据，经测 定对于游离托泊特坎，MTD落入11.7-21mg/kg范围，对于脂质体(原型2)托泊特 坎落入2.0-3.6mg/kg范围。在第二个研究中，用游离托泊特坎、脂质体托泊特坎 或F5-免疫脂质体托泊特坎(由该实施例的脂质体托泊特坎制备，如实施例29所述) 注射小鼠，剂量由2.0mg/kg(脂质体/免疫脂质体托泊特坎)或12mg/kg(游离托泊 特坎)起始，并对每一随后的组以1.15的因子增加，直至获得接近建立的MTD间 隔的上限范围的剂量。在所有动物中并不导致死亡或最终发病的最高剂量被认作 MTD，并发现对于游离托泊特坎为18.4mg/kg，对照脂质体托泊特坎为3.0mg/kg， 对于免疫脂质体托泊特坎为3.0mg/kg。因此，脂质体托泊特坎比起游离药物显示 出更大的毒性。实施例31.BT-474异种移植物模型中，在0.125-1.0×MTD范围内，脂质体托泊特 坎的抗肿瘤功效
[0222]实施例30中的托泊特坎脂质体和F5-免疫脂质体被用于该研究。如实施例 29所述，在裸鼠中培养BT-474皮下异种移植物。在肿瘤细胞接种18天后，将具 有肿瘤(105-345立方毫米，平均约200立方毫米)的动物随机分入每组6只动物 组成的治疗组和每组8只动物组成的对照组。在肿瘤接种后第19、23和27天， 通过三次静脉(尾静脉)注射，动物接受1×MTD、0.5×MTD、0.25×MTD或 0.125×MTD的游离或脂质体托泊特坎。对照组接受生理盐水。如实施例29所述， 监控肿瘤大小和动物体重。为了获得动物体重测量值，由动物体重总测量值减去 肿瘤重量(假设肿瘤密度为1.0，由肿瘤大小计算肿瘤重量)获得该值。在MTD 时所有药物显示出抗肿瘤活性(图13A-13D)。以它们各自的MTD或以其相等分数 (1/2、1/4或1/8)给予的游离药物和脂质体药物之间的效率没有明显的差异。因此， 使用TEA-SOS梯度对药物进行脂质体包囊导致抗肿瘤活性增加大约6倍，而且药 物毒性也有类似的增加。动物体重动态学表明，除了用游离托泊特坎以MTD进行 的治疗外，所有的治疗都是无毒性的，用游离托泊特坎以MTD进行的治疗显示出 短暂的体重减轻(体重减轻约为治疗前值的15％)，之后体重减轻症状消退(图14)。实施例32.使用八硫酸蔗糖三乙铵包载方法制备的托泊特坎脂质体的制备和定向 的体外细胞毒性
[0223]遵照实施例18的程序，使用含有643mM TEA，pH5.7，同渗重摩530 mmol/kg的包载的TEA-SOS溶液，以170mg/mmol的药物/磷脂比率制备脂质体托 泊特坎。脂质体具有55mg药物/mmol磷脂；190％的装载效率和105nm的颗粒大 小。总体上如实施例19所述，这些脂质体与F5-PEG-DSPE偶联物的胶束溶液， 以每脂质体大约30 scFv(15mg抗体/mmol磷脂)在60℃温育大约1小时。使用 Sepharose CL-4B通过SEC分离连接抗体的脂质体，并配制入HBS-6.5 HEPES-缓 冲盐水中。在连接抗-HER2 scfv(F5)期间，药物/脂类比率没有可检测的变化。
[0224]如下测定癌细胞对托泊特坎制剂的吸收。将HER2-过量表达的人乳腺癌细 胞(SK-Br-3，ATCC HTB-30)以150,000细胞/孔铺到24孔细胞培养板，并驯化过夜。 在37℃，以0.1mM和0.01mM的脂质体浓度，将细胞与F5-定向脂质体托泊特坎 和非定向脂质体托泊特坎在完全生长培养基中温育4小时(一式三份)。用Hanks′ 平衡盐溶液冲洗细胞4次，溶解在0.1％Triton X-100-70％酸化的异丙醇混合物1： 10中，通过荧光测定法测定每孔中与细胞连接的托泊特坎的数量。将结果(平均值 ±标准误差)概述于表22中。定向脂质体输送比非定向脂质体多100-300倍的药物 进入定向的细胞。表22.SK-Br-3乳腺癌细胞对脂质体托泊特坎的吸收
制剂 在0.1mM磷脂时的托泊 特坎吸收，ng/孔 在0.01mM磷脂时的托泊 特坎吸收，ng/孔 非定向脂质体 4.76±0.24 0.607±0.088 HER2-定向脂质体 533.8±13.7 197.0±4.6 比率：定向的/非定向的 112.1±8.6 324±55
制剂 在0.1mM磷脂时的托泊 特坎吸收，ng/孔 在0.01mM磷脂时的托泊 特坎吸收，ng/孔 非定向脂质体 4.76±0.24 0.607±0.088 HER2-定向脂质体 533.8±13.7 197.0±4.6 比率：定向的/非定向的 112.1±8.6 324±55
[0225]如实施例27所述描述地，测定这些托泊特坎制剂对SKBr-3乳腺癌细胞的 细胞毒性。将SKBr-3细胞以5,000细胞/孔接种入96-孔板，驯化过夜，用于细胞 生长培养基中的增加浓度的(0.004-30g/mL)游离托泊特坎、脂质体托泊特坎或F5- 免疫脂质体托泊特坎37℃温育4小时。去除含药物的培养基，将细胞生长在无药 物培养基中72小时。利用噻唑蓝(MTT)分析方法测定每孔中存活细胞的数量，用 与对照(未处理)细胞的百分比表示。结果呈现在图10中。托泊特坎免疫脂质体的 毒性(IC50≥0.15-0.5μg/mL)大于非定向托泊特坎脂质体(IC50≥3.1μg mL)和游离托泊 特坎(IC50≥2.3μg/mL)。实施例33.不同大小的托泊特坎脂质体的体内稳定性
[0226]如实施例22所述，通过12次挤压通过100nm孔径聚碳酸酯膜或另外再 12次通过50nm孔径聚碳酸酯膜制备含有TEA-Pn的脂质体。以150g/mo1磷脂 的比率加入托泊特坎(TPT)。装载在58℃热水浴中45min完成，然后在冰上淬火。 50-nm-和100-nm-挤出的脂质体的装载效率分别为126.80±19.24μg TPT/μmol PL (84.5±12.8％)和148.48±10.26μg TPT/μmol PL(99.0±6.8％)。三组中的雌性Swiss Webster小鼠以5mg TPT/kg的剂量静脉内注射两种Ls-TPT制剂中的其中一种。6 小时后杀死小鼠，并收集血液。如实施例22所述，分析血浆中的TPT和脂质体脂 类。结果呈现在表23中。表23.使用TEA-Pn包载方法装载的不同大小的Ls-TPT的体内稳定性
脂质体大小，nm 血浆中的药物，％ 注射剂量 血浆中的脂质体 脂类，％注射剂量 药物/脂类比率，％ 注射前值 74.2±21.6 32.93±1.97 45.7±2.2 72.06±5.51 96.4±29.3 33.26±3.56 37.6±5.3 88.41±15.68
实施例34.6-(3-氨丙基)玫瑰树碱(6-APE)的合成和脂质体包囊
脂质体大小，nm 血浆中的药物，％ 注射剂量 血浆中的脂质体 脂类，％注射剂量 药物/脂类比率，％ 注射前值 74.2±21.6 32.93±1.97 45.7±2.2 72.06±5.51 96.4±29.3 33.26±3.56 37.6±5.3 88.41±15.68
实施例34.6-(3-氨丙基)玫瑰树碱(6-APE)的合成和脂质体包囊
[0227]根据Werbel et al.，J. Med.Chem.1986，v.29，p.1321-1322的程序，在两步法 中由玫瑰树碱制备6-(3-氨丙基)玫瑰树碱。室温中，将501.4mg玫瑰树碱基本成 分(NSC71795)(Aldrich Chemical Co.)与大约100mg氢化钠(Sigma；用无水石油醚 洗涤)在5ml干二甲基甲酰胺(DMF)中搅拌30min。在2mL干DMF中，向该混合 物逐滴加入678mg的N-溴丙基酞酰亚胺(bromopropylphtalimide)(Aldrich)溶液。 氩中搅拌紫色的反应混合物过夜，用1mL水处理，并倾倒入60ml水中。混合物 用25mL二氯甲烷提取两次，提取液经无水硫酸钠干燥，并通过中性氧化铝层。 氧化铝层用10mL二氯甲烷冲洗两次，合并的过滤物和冲洗物在真空中干燥。产 物用20ml无水乙醇和2ml无水肼在室温中搅拌过夜。将获得的浆在真空下过滤， 黄色的过滤物用50mL 0.2N NaOH稀释，并用两份(75ml和50ml)氯仿提取。氯 仿提取物经Na2SO4干燥，并在真空中干燥。粗产物(产量408mg)在硅60柱上层 析，用氯仿-甲醇混合物(体积比7∶3)等度洗脱，用干三甲胺饱和。在未反应的玫 瑰树碱之后，洗脱在第二黄色带中的馏分，显示出含有大约30％产量的期望的化 合物。结果由1H-NMR.TLC确定：Rf0.29-0.31(硅60；CHCl3-MeOH体积比7∶3， 用三甲胺饱和)。玫瑰树碱，Rf 0.81-0.83。通过溶解在无水乙醇中并在干异丙醇中 用6 N HCl溶液滴定，将获得的化合物转化为二盐酸盐。过滤出橙色晶体6-APE 二盐酸盐(NSC 176328)，用醚冲洗，真空中干燥。二盐酸盐的产量为86％。
[0228]如下制备脂质体：在0.5M TMA的三甲铵多磷酸盐(TMA-Pn)溶液，pH5.6 中，60℃对DSPC、胆固醇和PEG(分子量2000)-DSPE(3∶2∶0.015摩尔比)组成 的纯脂膜进行水合，然后经六个循环的快速冷冻(-78℃)和解冻(60℃)，并10次挤 压通过二叠层50-nm孔径聚碳酸酯过滤器。使用Sepharose CL-4B柱，用HEPES- 葡萄糖(5mM HEPES，5％葡萄糖，pH5.5)洗脱，去除未包囊的TMA-Pn。脂质体 大小为85.7±32.1nm。
[0229]以100g APE/mol磷脂的药物与磷脂比率，将浓的6-APE溶液(10mg/ml) 加入到含TMA-Pn的脂质体，将混合物在58℃温育45分钟，并在冰上快速冷却 15分钟。通过用HEPES-葡萄糖缓冲液(5mM HEPES-Na，5％葡萄糖，pH6.5)洗脱， 在Sephadex G-75柱上凝胶层析去除未包囊的药物。然后如实施例71所述地，通 过分光光度法对脂质体包载的APE进行定量，使用实施例70的提取分析法测定脂 质体磷脂。药物包囊定量实施。实施例35.HER2-定向免疫脂质体6-APE的制备，以及体外6-APE制剂对HER2- 过量表达的BT-474乳腺癌细胞的细胞毒性
[0230]如上面实施例34所述，制备含有包囊的6-APE的脂质体(Ls-APE)。遵照实 施例19的方法，由Ls-APE制备含有包囊的6-APE的抗-HER2免疫脂质体 (F5-ILs-APE)。实施例27的MTT-基细胞存活分析方法被用于测定作为溶液、作为 Ls-APE和作为HER2-定向F5-ILs-APE输送的6-APE对HER2-过量表达的人乳腺 癌细胞(BT-474)的细胞毒性。将细胞暴露于含药物的培养基6小时，之后在无药物 培养基中温育3小时。结果显示在图15中。游离APE的IC50是0.26μg APE/ml， F5-ILs-APE的IC50是0.756μg APE/ml，而非定向Ls-APE的IC50是51.0μg APE/ml。 定向和非定向脂质体之间的活性差异有67.5倍，这表明具有相当大的定向输送效 应。实施例36.6-APE的EGFR-定向免疫脂质体制剂和在体外对癌细胞的细胞毒性
[0231]如实施例34所述，制备装载6-APE的脂质体。通过与EGFR-特异性Fab′ 抗体片段连接，制备EGFR-定向免疫脂质体，如下描述。EGFR-特异性IgG MAb C225(cetuximab，ERBITUXTM，Imclone Systems)用胃蛋白酶消化产生(Fab′)2片段。 通过在37℃用10-20mM 2-巯基乙胺处理15min，还原纯化的(Fab′)2片段，通过使 用Sephadex G-25进行凝胶过滤来纯化Fab′片段。反应性硫醇基团典型地以每蛋白 分子约0.9硫醇基团存在(使用Ellmann′s试剂定量)。在pH6.2-6.5的含水溶液中， 以蛋白-接头摩尔比1∶4，将C225Fab′共价连接到两亲性接头Mal-PEG-DSPE(Avanti Polar Lipids，AL)，在室温中进行2-4小时，或在4-6℃中过夜，产生C225 Fab′-PEG-DSPE偶联物，产量为蛋白质的30-50％。在3％琼脂糖-4％聚丙酰胺珠状 凝胶(Ultrogel AcA34，获自Sigma Chemical Co.)进行尺寸排阻柱层析，用HBS-6.5 缓冲液洗脱，将形成胶束的偶联物与未反应的蛋白分离开来。在孔隙体积部分中 回收偶联物。按照如下方法形成免疫脂质体6-APE：将C225 Fab′-PEG-DSPE与装 载药物的脂质体一起以30mg C225蛋白/mmol脂质体的比率在60℃温育30min， 在冰上淬火15min，Sepharose CL-4B柱上层析，用HBS-6.5缓冲液洗涤纯化免疫 脂质体(脂质体出现在柱的孔隙体积中或附近)。
[0232]将MDA-MB-468 EGFR-过量表达的人乳腺癌细胞和EGFR表达水平低的 MCF-7人乳腺癌细胞(ATCC，Rockville，MD)培养在供应方建议的生长培养基中，并 根据实施例27的方法研究游离6-APE、脂质体6-APE和抗-EGFR-免疫脂质体 6-APE对这些细胞的细胞毒性。将这些与含药物的培养基培养6小时，然后温育 后置于无药物培养基中3天。结果显示在图16中。在MDA-MB-468细胞中，对 于游离6-APE，IC50为约0.1μg/ml，对于C225-ILs-APE，IC50为约0.9μg/ml。在 MCF-7细胞中，对于游离6-APE，IC50为约0.5μg/ml，对于C225-ILs-APE，IC50 为约14μg/ml。在两种细胞系中，Ls-APE的IC50大于＞30μg/ml。因此，装载EGFR- 定向6-APE的免疫脂质体在EGFR-过量表达的MDA-MB-468乳腺癌细胞中表现出 抗原-特异性细胞毒性活性，但是在不过量表达EGFR的MCF-7乳腺癌细胞中并没 有表现出这种细胞毒性活性。在MCF-7细胞中，定向和非定向6-APE脂质体活性 相等。实施例37.脂质体6-APE在大鼠中的药物动力学
[0233]如上面实施例11所述，制备含有包载的TEA-Pn溶液(557mM磷酸盐基团， 500mM TEA，pH5.8，同渗重摩480mmol/kg)的脂质体以及DSPC、胆固醇和 PEG-DSPE(摩尔比3∶2∶0.015)的脂类组合物。将脂类的乙醇溶液在60℃与10 体积的含水TEA-Pn溶液混合，并10次挤压通过二叠层80nm孔径聚碳酸酯膜。 使用Sepharose CL-4B柱，用MES-葡萄糖(5mM MES-Na，5％葡萄糖，pH5.5)洗 脱，去除未包囊的TEA-Pn。经QELS测定脂质体大小为92.3±23.3nm。以0.5 mCi/mmol磷脂，将非-可交换的放射性脂类标记[3H]-CHE包括在脂类基质中。如 实施例34所述，脂质体用6-APE装载。
[0234]遵照实施9的方案研究药物动力学。雌性Sim Albino大鼠(9周龄，200g) 经静脉注射10mg 6-APE/kg。在规定的时间点获取血液，通过荧光测定法分析血 浆中的6-APE。将血浆等分试样(0.05-0.2ml)与1-2mL 90％含水异丙醇-0.1N HCl 混合，利用荧光对6-APE定量，如实施例71。脂类通过[3H]-CHE放射性闪烁计数 法定量。
[0235]结果显示在图17中。药物的血液半衰期(t1/2)为13.7小时，脂质体脂类为 16.6小时(图17A)。药物由脂质体释放的半衰期是77.9，证明具有非凡的包囊稳定 性(图17B)。实施例38.2-(2-(N，N-二乙基氨基)乙基)玫瑰树碱(2-DAE)的合成和脂质体包囊
[0236]2-(2-(N，N-二乙基氨基)乙基-玫瑰树碱鎓氯化物(NSC 359449)是抗肿瘤玫瑰 树碱衍生物，其通过在甲醇中，在三乙胺存在下用2-(N，N-二乙基氨基)乙基氯对玫 瑰树碱进行烷基化作用制备而得(参见Werbel，L.M.，Angelo，M.，Fry，D.M.，和 Worth，D.F.J.Med.Chem.1986，29：1321-1322)。如实施例37所述的方法制备含有 包载的TEA-Pn的脂质体。在5mM HEPES-Na，5％葡萄糖，pH7.4中，以2-DAE- 与-磷脂比率为100μg/μmol，将2-DAE.2HCl与TEA-Pn脂质体温育。装载的药物 的数量是88.2μgAPE/μmol PL(效率88.2％)。实施例39.脂质体2-DAE在大鼠中的药物动力学
[0237]如实施例37所述研究脂质体2-DAE(实施例38)在大鼠中的血液药物动力 学。2-DAE的t1/2是17.8h，脂质体脂类基质的t1/2是18.2h(A)。在血液中药物从 脂质体释放出来的半衰期是t1/2＝677h(B)。因此，那些脂质体在血流中对药物渗 漏特别稳定。实施例40.使用TEA-Pn方法将长春瑞滨装载入脂质体。pH的影响
[0238]利用实施例11的乙醇注射方法制备脂质体，该方法使用0.608M TEA，0.65 M磷酸盐基团的TEA-Pn溶液，pH6.1，同渗重摩为531mmol/kg；将脂类悬浮液 15次挤压通过二叠层100nm孔径聚碳酸酯膜。经QELS测定，所得的脂质体大小 为108.3±17.1nm。以药物-与-磷脂比率为350μg/μmol，将长春瑞滨酒石酸盐贮存 液10mg/mL USP形式的长春瑞滨(VRB)加入到于含水5mM HEPES-Na，5％葡萄 糖，pH6.5中的脂质体，用1-5N NaOH将pH调整到理想值，将混合物在58±2℃ 温育30min。然后将混合物在冰上冷却15min，通过Sephadex G-75凝胶过滤层析， 用HBS-6.5缓冲液(20mM HEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5)洗脱去除未包囊的药 物。然后将纯化的脂质体的等分试样溶解在酸性异丙醇中，使用分光光度法在270 nm处分析长春瑞滨。在甲醇-氯仿提取之后，利用Bartlett的磷酸盐分析方法(1959) 定量脂质体磷脂。[0239]计算的装载后药物-对-脂类比率是如同表24中显示。长 春瑞滨装载是定量的(即几乎100％)，并在研究范围内独立于pH。表24.在各种pH值的外部缓冲液中，长春瑞滨装载入含包载的TEA-Pn的脂质体 中
pH 药物-与-磷脂比率(μg/μmol) 装载效率(％) 4.5 5.0 5.75 6.25 7.0 351.2±52.88 347.6±6.35 355.2±11.2 377.0±21.5 374.3±29.58 100.4±15.2 99.3±1.8 101.5±3.2 107.7±6.6 106.9±9.0
实施例41.以各种不同的药物/脂类比率：包封率、利用TEA-Pn方法制备的脂质 体长春瑞滨和小鼠体内稳定性
pH 药物-与-磷脂比率(μg/μmol) 装载效率(％) 4.5 5.0 5.75 6.25 7.0 351.2±52.88 347.6±6.35 355.2±11.2 377.0±21.5 374.3±29.58 100.4±15.2 99.3±1.8 101.5±3.2 107.7±6.6 106.9±9.0
实施例41.以各种不同的药物/脂类比率：包封率、利用TEA-Pn方法制备的脂质 体长春瑞滨和小鼠体内稳定性
[0240]根据实施例40制备带有截留的TEA-Pn溶液的脂质体；除了以1.5 mCi/mmol磷脂，将[3H]-CHE引入到脂类基质中。经QELS测定，脂质体大小为 98.5±34.3nm。以药物-与-磷脂比率150-450mg VRB/mmol，将脂质体与处于5mM HEPES-Na，5％葡萄糖，pH6.5的含水缓冲液中的酒石酸长春瑞滨USP(美国药典) 混合，在58±2℃下温育30分钟(min)。加入药物之后，不调节pH。分离装载了 长春瑞滨的脂质体(vinorelbine-loaded liposames(Ls-VRB))，并如实施例40所述分 析药物和磷脂。
[0241]以5mg VRB/kg的剂量，给处于三个组中的雌性5-6周龄的Swiss Webster 小鼠(Harlan Bioresearch)，静脉注射Ls-VRB-Pn。脂类剂量根据装载程度变化，并 可以由上面计算出的药物-与-脂类比率确定。在注射后8小时或24小时，麻醉动 物，放血，并在冰上将血液收集入称重过的管中，管中含有已知量的含0.04％EDTA 的PBS。离心收集血细胞；并如下所述，通过[3H]-CHE放射性闪烁计数法分析上 清液中的脂质体脂类，利用HPLC分析长春瑞滨。样品掺有长春碱(内标)，用乙醚 提取，蒸发，将残留物溶解在移动相中，移动相由含水的50mM三乙钱醋酸盐 (pH5.5)和乙腈(体积比58∶42)组成。在C-18保护柱之前，将样品加载在C18反相 硅柱(Supelco C-18柱，250mm×4mmi.d.(内径)，颗粒大小5μm)上。用上面的移 动相，以1.0ml/min的流速，等度洗脱该柱。吸光率检测仪在280nm处检测VRB。 VRB和长春碱(内标)的典型保留时间，分别为9.1min和7.8min。
[0242]结果显示在表25中。装载效率随着药物/脂类比率的增加而减小，从150 mg/mmol下的几乎100％减小至450mg/mmol下的约66％。注意到，以每mmol 磷脂超过250mg长春瑞滨的比率加入酒石酸长春瑞滨，引起脂质体悬浮液发生实 质上的酸化(pH＜4.0)，从而导致装载效率降低。因此，确立了：在药物装载步骤期 间，需要控制pH。8小时之后，在血液中检测到的脂质体基质的数量是在被注射 剂量(iniected dosed(％id))的30.4±6.6％至38.6±5.2％id的范围内，与被注射脂类的 绝对数量无明显的关系。在24小时之后，血液中依然可以检测到脂类基质的6.4 ％ID至14.8％ID。8小时后，保持被包囊态的药物的数量在37％至63％之间变化。 然而，在注射后24小时，药物水平下降到所应用的分析方法的检测极限之下。表25.使用TEA-Pn方法(不调节装载缓冲液pH)、在不同药物/脂类比率下所制备 的脂质体长春瑞滨的包封率和体内药物保留。药物保留数据是平均值±SD(N＝3)。
长春瑞滨/磷脂比率 注射后8小时保持 在包封态的药物的 百分比 输入，mg/mmol， 计算的 输出，mg/mmol， 测量的 包封率，％ 150 156 104.0 36.6±4.2
250 350 450 238 260 299 95.2 74.3 66.4 56.3±1.3 65.9±2.3 63.0±4.1
实施例42.以不同药物/脂类比率，使用TEA-SOS方法，将长春瑞滨装载入脂质体
长春瑞滨/磷脂比率 注射后8小时保持 在包封态的药物的 百分比 输入，mg/mmol， 计算的 输出，mg/mmol， 测量的 包封率，％ 150 156 104.0 36.6±4.2
250 350 450 238 260 299 95.2 74.3 66.4 56.3±1.3 65.9±2.3 63.0±4.1
实施例42.以不同药物/脂类比率，使用TEA-SOS方法，将长春瑞滨装载入脂质体
[0243]除了用TEA-SOS溶液(0.65M TEA，pH5.4，同渗重摩521mmol/kg)替 换TEA-Pn溶液外，如实施例40所述制备用于药物装载的TEA-SOS脂质体，并 使脂质体挤压通过80nm孔径的聚碳酸酯膜。经QELS测定，脂质体大小为86.6± 12.9nm。以不同的药物-与-磷脂比率，将VRB加入到处于含水5mM HEPES-Na、 5％葡萄糖、pH6.5中的脂质体，随后将混合物在60℃下温育30分钟。然后分离 装载了VRB的脂质体，并如实施例40中所述进行分析。
[0244]在VRB脂质体中，计算的药物-与-脂类比率示出于表26中。令人注目地， 与聚合阴离子辅助的装载不同，在使用聚阴离子化的糖(蔗糖八硫酸酯(sucrose octasulfate))的脂质体中的长春瑞滨装载几乎是定量的，独立于药物/脂类比率， 最高可达450mg VRB/mmol磷脂的；仅仅在550mg VRB/mmol磷脂时，稍微低些 (88％)。表26.长春瑞滨装载入脂质体对药物-与-脂类比率的依赖性
长春瑞滨/磷脂比率，mg/mmol 装载效率(％) 总数 包封入脂质体 150 250 350 450 550 159.9±11.5 255.±12.4 381.8±16.3 456.1±29.5 486.2±26.0 106.6±8.1 102.2±5.1 109.1±5.1 101.4±6.6 88.4±4.2
实施例43.通过TEA-Pn方法装载有长春瑞滨的HER2-定向免疫脂质体的制备， HER2-定向和非定向长春瑞滨脂质体在大鼠中的比较血液药物动力学
长春瑞滨/磷脂比率，mg/mmol 装载效率(％) 总数 包封入脂质体 150 250 350 450 550 159.9±11.5 255.±12.4 381.8±16.3 456.1±29.5 486.2±26.0 106.6±8.1 102.2±5.1 109.1±5.1 101.4±6.6 88.4±4.2
实施例43.通过TEA-Pn方法装载有长春瑞滨的HER2-定向免疫脂质体的制备， HER2-定向和非定向长春瑞滨脂质体在大鼠中的比较血液药物动力学
[0245]如实施例19制备抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶联物。将非定向长春瑞滨 脂质体(实施例41，以350mg/mmol的药物/磷脂比率装载)与F5-PEG-DSPE偶联物 (实施例19)，在含水20mM HEPES-Na、135mM NaCl、pH6.5缓冲液中，以15 mg/mmol蛋白质/磷脂比率、在60℃下温育30分钟，制备HER2-定向长春瑞滨免 疫脂质体。通过在Sepharose 4B柱上、用相同的缓冲液洗脱而进行凝胶层析，去 除未掺入的F5偶联物。将非定向的脂质体(Ls-Pn-VRB)和HER2-靶向脂质体 (F5-ILs-Pn-VRB)，以5mg VRB/kg剂量，静脉内给予雌性Albino大鼠(8-9周龄； 200g)。在不同时间点，如实施例9所述收集血液，并如实施例41中那样地分析 VRB和脂质体脂类。通过使用MICROSOFT EXCEL(Microsoft Corp.)电子数据表 格动向功能(spreadsheetTREND function)，以便找到单指数动力学的最佳拟合； 从而分别由脂类浓度-时间图或由药物/脂类比率-时间图，计算出脂质体脂类的血 液半衰期和50％药物释放时间。结果(图18)表明：定向的和非定向的长春瑞滨脂 质体具有相同的药物和脂类的药物动力学，其中脂类半衰期为约12.1小时，并且 50％药物释放时间是约4.3小时。实施例44.使用铵和取代的铵盐制备的长春瑞滨脂质体的制剂和比较体内稳定性
[0246]葡聚糖硫酸酯铵(ammonium dextran sulfate(DS-A))溶液(pH5.8，0.65M NH4+，同渗重摩390mmol/kg)和葡聚糖硫酸酯三乙基铵溶液(triethylammonium dextran sulfate(DS-TEA))(pH6.0，0.65M NH4+，同渗重摩465mmol/kg)，是根据 实施例4的方法，由分子量为10,000的葡聚糖硫酸酯(dextran sulfate)(Sigma Chemical Co.)，分别采用12.4M含水的铵或纯三乙胺进行滴定制备而来。由分析 级硫酸铵制备硫酸铵(ammonium sulfate(S-A))含水溶液，325mM，pH5.1，同 渗重摩703mmol/kg。所有三种溶液含有的Na+是总阳离子含量的1％以下。使用 实施例41的乙醇混合-挤出方法(DSPC/胆固醇/PEG-DSPE 3∶2∶0.015摩尔比)， 制备包载有这些溶液的脂质体。以1.5mCi/mmol磷脂，将放射性脂类标记[3H]-CHE 引入到脂类基质中。挤压步骤由10次通过二叠层的0.1um聚碳酸酯膜组成。以 350mg/mmol的药物-与-磷脂比率，将VRB加入到处于5mM HEPES-Na、5％葡 萄糖、pH6.5中的脂质体中，用lN NaOH将pH调节到6.5；并且将混合物在58-60℃ 下温育30分钟。然后，反应物质在冰上被冷却15min；并使用Sephadex G-75凝 胶过滤层析去除未包封的药物，采用含水的20mM HEPES-Na、135mM NaCl、pH 6.5进行洗脱。通过分光光度技术，分析纯化的、装载长春瑞滨的脂质体中的VRB； 并使用Bartlett(1959)的磷酸盐分析方法分析磷脂(参见实施例70、71)。如实施例 43所述，在大鼠中研究脂质体的脂类和药物的血液药物动力学。
[0247]结果显示于图19-20以及表27中。将用葡聚糖硫酸酯三乙基铵装载的脂质 体与那些用葡聚糖硫酸酯的铵盐装载的脂质体进行比较。出乎意料地，相当程度 上，那些用三乙基铵盐装载的脂质体比那些用铵盐装载的脂质体稳定更多。对于 三种不同的制剂，脂质体载体本身的药物动力学相似；因此，主要取决于所利用 的脂类组成成分。从用葡聚糖硫酸酯三乙基铵装载的Ls-VRB渗漏长春瑞滨，比起 那些用葡聚糖硫酸酯铵装载的脂质体，慢大约三倍。使用硫酸铵装载的脂质体具 有最快的药物渗漏速度。表27.药物包封进使用包载有铵和取代的铵盐的脂质体中的比较体内稳定性
制剂，脂质体-包载 的盐 脂质体大小，nm， 平均值±SD (经QELS) 脂类基质的血液 半衰期，小时 达到血液内50％药 物释放的时间，小 时
DS-TEA DS-A S-A 120.8±28.5 107.8±15.4 114.5.±15.6 9.5±3.3 11.2±0.6 10.7±0.2 66.3±13.4 22.9±1.7 1.77±0.16
实施例45.不同大小的装载长春瑞滨的脂质体的制备和体内稳定性
制剂，脂质体-包载 的盐 脂质体大小，nm， 平均值±SD (经QELS) 脂类基质的血液 半衰期，小时 达到血液内50％药 物释放的时间，小 时
DS-TEA DS-A S-A 120.8±28.5 107.8±15.4 114.5.±15.6 9.5±3.3 11.2±0.6 10.7±0.2 66.3±13.4 22.9±1.7 1.77±0.16
实施例45.不同大小的装载长春瑞滨的脂质体的制备和体内稳定性
[0248]利用实施例11的乙醇混合-挤压方法，制备带有包载的蔗糖八硫酸酯三乙 基铵(triethylammonium sucrose octasulfate)溶液(0.65M TEA，pH6.4，同渗重摩 502mmol/kg)的[3H]-CHE-标记脂质体(1.5mCi/mmol磷脂)。挤出步骤包含：15次 通过孔径为0.05μm、0.08μm或0.1μum的二叠层聚碳酸酯膜。遵照实施例40的 方法，进行长春瑞滨装载、长春瑞滨脂质体分离、以及脂质体表征。雌性Albino 大鼠(8-9周龄；200g)被用于研究脂质体体内稳定性。如实施例43所述，在大鼠 中研究脂质体脂类和药物的药物动力学。
[0249]结果显示在图21、22以及下面的表28中。将挤压通过0.05、0.08和0.1μm 聚碳酸酯过滤器的脂质体进行比较，并显示出具有相似的药物和脂质体载体药物 动力学，以及相似程度的内含物渗漏。药物在血液中从脂质体的释放是用50％释 放时间表征，是在大约40-80小时的范围内；令人满意地，高于24小时。表28.长春瑞滨脂质体的表征
脂质体大小， nm，平均值 ±SD(经 QELS) 药物载量， mg/mmol磷脂 装载效率，％ 脂类基质的血 液半衰期，小 时 达到血液内 50％药物释放 的时间，小时 87.6±28.1 98.5±15.1 109.6±24.6 352.4±13.9 322.6±22.7 357.0±10.5 100.7±4.0 92.2±6.5 102.0±3.0 14.6 ±0.7 13.0±0.2 14.3±0.3 39.7±3.1 47.9±3.8 78.0±1.4
实施例46.使用TEA-SOS包载方法制备HER2-定向长春瑞滨脂质体，以及大鼠 中HER2 scFv-定向和非定向免疫脂质体长春瑞滨的药物动力学
脂质体大小， nm，平均值 ±SD(经 QELS) 药物载量， mg/mmol磷脂 装载效率，％ 脂类基质的血 液半衰期，小 时 达到血液内 50％药物释放 的时间，小时 87.6±28.1 98.5±15.1 109.6±24.6 352.4±13.9 322.6±22.7 357.0±10.5 100.7±4.0 92.2±6.5 102.0±3.0 14.6 ±0.7 13.0±0.2 14.3±0.3 39.7±3.1 47.9±3.8 78.0±1.4
实施例46.使用TEA-SOS包载方法制备HER2-定向长春瑞滨脂质体，以及大鼠 中HER2 scFv-定向和非定向免疫脂质体长春瑞滨的药物动力学
[0250]如实施例30所述，制备脂质体，以350mg/mmol的药物-磷脂比率装载长 春瑞滨，并进行分析；除了实施例45的TEA-SOS(蔗糖八硫酸酯三乙基钱)溶液 被替换为TEA-Pn溶液。挤出步骤包括15次通过0.08μm孔径的聚碳酸酯过滤器。 经QELS测定，脂质体大小为95.0±26.0nm。由这些长春瑞滨脂质体制备F5scFv- 连接的抗-HER2长春瑞滨免疫脂质体，并且在大鼠中研究HER2-定向和非定向脂 质体长春瑞滨的脂质体脂类和药物的血液药物动力学，如实施例43中所述。对于 F5-ILs-VRB和Ls-VRB，脂质体脂类的循环半衰期分别是11.4小时和10.3小时； 50％药物释放时间分别是30.9小时和30.3小时。因此，Ls-VRB和F5-ILs-VRB的 脂类和药物的药物动力学是非常接近的，这表明scFv-PEG-DSPE偶联物的引入在 循环时既不影响对载体本身的清除，也不导致药物从载体渗漏的增加(图23、24)。实施例47.包含聚(乙二醇)的非离子型脂类衍生物的长春瑞滨脂质体之制备和药 物动力学特性
[0251]合成的C20-神经酰胺之甲氧基-PEG(分子量2,000)-衍生物(PEG-神经酰 胺)，是得自Northern Lipids，Inc.，Canada。甲氧基-PEG(分子量2,000)-二硬脂酰丙 三醇(PEG-DSG)(SUNBRIGHT GS20)是获自NOF Corp.，Japan。
[0252]具有摩尔比为3∶2∶0.3的DSPC、胆固醇和PEG-脂类(PEG-神经酰胺或 PEG-DSG)的脂类组成的并且包载有TEA-SOS溶液(0.65M TEA，pH6.4，同渗重 摩502mmol/kg)的脂质体，是通过实施例11的乙醇混合/挤压方法制备的。挤压步 骤包括两次通过两个层叠式聚碳酸酯膜过滤器，其中层叠式聚碳酸酯膜过滤器使 用孔径为0.2μm的两次以及使用孔径为0.08μm的10次。脂质体以350mg/mmol 的药物/磷脂比率装载长春瑞滨，用大小、药物和脂类浓度表征；并且，如实施例 46所述，在大鼠中研究它们的药物动力学。两种制剂显示出延长的脂类基质循环 时间，以及缓慢的药物体内释放；其中，在24小时后，体内血液中至少50％的药 物保持在包封状态，如下面的表29中所示。表29含有不同PEG-脂类的长春瑞滨脂质体的表征
PEG-脂类 脂质体大 小，nm，平 均值±SD (经QELS) 药物装载， mg/mmol 磷脂 装载效率， ％ 脂类基质的 血液半衰 期，小时 血液内达到 50％药物释 放的时间， 小时 PEG-神经 酰胺 PEG-DSG 103.3±30.9 101.3±20.1 291.4±18.0 359.3±7.2 83.26±5.14 102.7±2.1 14.0 15.1 102.7 24.6
PEG-脂类 脂质体大 小，nm，平 均值±SD (经QELS) 药物装载， mg/mmol 磷脂 装载效率， ％ 脂类基质的 血液半衰 期，小时 血液内达到 50％药物释 放的时间， 小时 PEG-神经 酰胺 PEG-DSG 103.3±30.9 101.3±20.1 291.4±18.0 359.3±7.2 83.26±5.14 102.7±2.1 14.0 15.1 102.7 24.6
[0253]引人注目地，与具有低PEG化(总脂类的约0.3mol.％)之相似的、大小 相配的脂质体(实施例45，109.6nm，t1/2＝14.3小时；98.5nm，t1/2＝13.0小时)相比， 增加这些脂质体的PEG化(PEG脂类含量为总脂类的约5.7mol.％)几乎没有影响 脂质体血液循环寿命。实施例48.HER2-定向脂质体长春瑞滨的制备；以及游离、HER2-定向、和非定向 脂质体长春瑞滨对体外MDA-MB-453细胞的细胞毒性
[0254]如实施例42那样(无[3H]-CHE)，在pH6.0和350μg长春瑞滨/μmol磷脂下， 通过药物装载，制备装载有长春瑞滨的脂质体(Ls-VRB)。通过将这些脂质体与 F5-PEG-DSPE偶联物温育，形成抗-HER2免疫脂质体长春瑞滨(F5-ILs-VRB)，如 上面实施例19和42中所述；除了不加入[3H]-CHE之外。通过将酒石酸长春瑞滨 的10mg/ml溶液USP(美国药典)稀释入细胞培养基，制备“游离型”长春瑞滨。 个
[0255]MDA-MB-453是适度过量表达HER2受体(约3×104个至1×105个拷贝/细胞) 的人乳腺腺癌细胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD)。作为游离药 物、作为非定向脂质体长春瑞滨或作为HER2-定向(F5)-免疫脂质体长春瑞滨所递 送的VRB对MDA-MB-453细胞的细胞毒性，是如实施例27所述那样而确定的。 不同之处在于：在供应方所推荐的生长条件下(Leibowitz L-15，含有10％的胎牛血 清，不补充CO2)，将细胞以10,000个细胞/孔的密度铺在96孔微量滴定板上；并 且以0.03-0.1mg/ml起始，将药物制剂以1∶3逐步稀释的系列加入。将细胞存活 力数据对药物浓度作图(图25)，并将细胞存活力减少到50％(IC50)所需的药物浓度 从图上估计得到。F5-定向长春瑞滨脂质体的IC50(0.06μg/ml)与游离药物的IC50 (0.07μg/ml)接近，大大低于非定向脂质体的IC50(2.2μg/ml)。这体现出活性增加37 倍，是药物的癌细胞特异性定向递送的一个结果。实施例49.游离的、HER2-定向的和非定向的脂质体长春瑞滨对体外CaLu-3细胞 的细胞毒性
[0256]前面实施例(实施例48)的脂质体和方法，被用于研究：游离长春瑞滨、 Ls-VRB和F5-ILs-VRB在HER2-过量表达的人非小细胞肺癌细胞CaLu-3(American Type Culture Collection，Rockville，MD)中的细胞毒性。在5％CO2存在下，将细胞 培养在含10％胎牛血清的RPMI-1460培养基中。结果显示在图26中。游离VRB 的IC50为1.2μg/ml，F5-ILs-VRB的IC50为10μg/ml，非定向Ls-VRB的IC50为50 μg/ml。这表明：作为定向输送到细胞的效用，在脂质体包囊的药物的活性上，存 在5倍的增加。实施例50.游离长春瑞滨、HER2-定向和非定向脂质体长春瑞滨对体外SKBr-3细 胞的细胞毒性
[0257]实施例48的脂质体和方法，被用于研究：游离长春瑞滨、Ls-VRB和 F5-ILs-VRB在HER2-过量表达的乳腺癌细胞SKBr-3(American Type Culture Collection，Rockville，MD)中的细胞毒性；除了，在5％CO2存在下，将细胞培养在 含有10％胎牛血清的改良型McCoy 5A培养基中，以5,000个细胞/孔的密度铺板， 并且将药物与细胞温育6小时。
[0258]结果显示在图27中。游离VRB的IC50为0.28μg/ml，F5-ILs-VRB的IC50 为0.17μg/ml，且非定向Ls-VRB的IC50为0.8μg/ml。这表明：作为定向输送到细 胞的一个作用，药物活性增加4.7倍。实施例51.在小鼠的HT29人结肠癌异种移植物中，脂质体长春瑞滨的体内抗肿 瘤功效
[0259]小的单层囊脂质体(经QELS测定为93.2±26.4nm)是从二硬脂酰磷脂酰胆 碱、胆固醇和PEG-DSPE(3∶2∶0.045摩尔比)制备的，是通过在蔗糖八硫酸酯三 乙基铵的含水溶液(0.6M三乙铵，pH5.7-6.2)中，由浓乙醇溶液水合；然后反复挤 压通过聚碳酸酯膜(100nm孔尺寸)；去除脂质体外的聚阴离子盐；并且在等渗缓 冲液中，pH6.5，以325mg VRB/mmol磷脂的药物/脂类比率，在60℃下，通过与 脂质体进行温育，从而装载长春瑞滨，如实施例42中所述。
[0260]在雌性BALB/c纯合体裸鼠(6-8周，称重为17-20g)的胁区皮下注射1×106个 HT-29人结肠癌细胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD)。从肿瘤接种 后的第16天起，当平均肿瘤直径达到5-8mm，将小鼠随机分成三个组，每组6 只动物；并且，以5mg/kg的剂量，每三天一次，通过尾静脉用游离型或脂质体型 长春瑞滨进行治疗，总共注射4次。对于对照组，小鼠用等体积盐水治疗。使用 游标卡尺测量每只小鼠的肿瘤大小，并且使用下述公式计算肿瘤体积：(肿瘤长 度)×(肿瘤宽度)2/2。为了评价与治疗相关的毒性，对动物也每周两次进行称重。 脂质体型长春瑞滨在抑制HT-29肿瘤生长上显示出比游离型长春瑞滨切实更大的 有效性，导致肿瘤消退；而在游离药物组中，肿瘤不断持续生长(图28)。在治疗过 程中动物体重鲜有变化，这表明治疗是充分耐受的，也表明脂质体化 (liposomalization)并不增加药物毒性(图29)。实施例52.脂质体型长春瑞滨对抗C-26同系鼠结肠癌肿瘤的体内抗肿瘤功效
[0261]如实施例48制备脂质体型长春瑞滨和游离型长春瑞滨。雄性BALB/c小鼠 (6-8周，称重17-20g)皮下接种2×105个C-26鼠结肠癌细胞。接种后第17天，当 平均肿瘤直径达到5-8mm时，将小鼠随机分成六个处理组，每组5只动物。对荷 瘤小鼠，通过尾静脉，以6mg/kg、8mg/kg或12mg/kg注射游离长春瑞滨，以及 以4mg/kg或6mg/kg的剂量注射脂质体型长春瑞滨，每三天一次，总共注射4次。 对于对照组，小鼠注射等体积的生理盐水。肿瘤体积和动物体重遵照实施例51测 定。甚至4mg/kg的脂质体型长春瑞滨，在减少肿瘤生长上也比12mg/kg的游离 药物效率更加相当有效(图30)。在治疗过程中动物体重几无变化(＜10％减轻)，这 表明：与游离药物的毒性相比，脂质体型长春瑞滨的毒性并不增加(图31)。实施例53.HER2-定向脂质体长春瑞滨对小鼠的BT-474人乳腺癌异种移植物肿瘤 的体内抗肿瘤功效：装载反离子的影响
[0262]除了不加入[3H]-CHE之外，分别通过实施例41的TEA-Pn方法和实施例 42的TEA-SOS方法，制备大小为99.5±10.2nm的装载有VRB的脂质体。以350 mg/mmol的药物/磷脂比率装载VRB。通过将这些脂质体与F5-PEG-DSPE偶联物 (参见实施例19)温育，形成HER2-定向脂质体型长春瑞滨，如实施例43所述。 BT-474 HER2-过量表达的人乳腺癌异种移植物，是在纯合型裸鼠中培育，如实施 例10中那样进行。肿瘤细胞接种后第25天，当肿瘤大小达到约200mm(范围 144-309mm)时，将小鼠随机分入四个组，每组8只动物，通过静脉注射接受如下 治疗：5mg/kg的游离VRB；F5-ILs-VRB，以Pn作为反离子；或F5-ILs-VRB，以 SOS作为反离子，剂量为5mg/kg，每周一次，总共三次注射。对照组接受等体积 的生理盐水。如实施例10中那样，监控肿瘤和动物体重。当以5mg VRB/kg的剂 量给予时，使用蔗糖八硫酸酯装载的HER2-定向脂质体型长春瑞滨，在减小肿瘤 生长上，效率明显高于使用多(磷酸盐)装载的同样的定向构建物；而这两种免疫脂 质体制剂的效率比游离长春瑞滨高许多(图32)。经药物治疗的小鼠表现出很小的重 量变化，这表明治疗是充分耐受的(图33)。实施例54.HER2-定向脂质体型长春瑞滨对小鼠的BT-474人乳腺癌异种移植物肿 瘤的体内抗肿瘤功效：PEG化的影响。
[0263]在含水蔗糖八硫酸酯三乙基铵中，经乙醇溶液方法，通过水合摩尔比为3∶ 2∶0.015(″0.5％PEG″)或3∶2∶0.3(″10％PEG″)的DSPC、胆固醇和PEG分子量 2,000的PEG-二硬脂酰丙三醇(GS-20，NOF Corp.，Japan)组成的脂类基质，根据实 施例48制备摩尔比为3∶2的DSPC和胆固醇的脂质体，然后根据实施例48进行 膜挤出。以350mg/mmol的药物/磷脂比率，将VRB装载入脂质体。如实施例43 中所述，通过将这些脂质体与F5-PEG-DSPE偶联物(实施例19)温育，形成F5免 疫脂质体型长春瑞滨。培养具有BT-474异种移植物的裸鼠，如实施例53那样， 经静脉，以5mg/kg，用游离VRB、F5-ILs-VRB-“0.5％PEG”或 F5-ILs-VRB-“10％PEG”治疗。如图34所示，采用非离子型PEG脂类衍生物 PEG-DSG提供的具有较高PEG化作用的F5-ILs-VRB，在减少肿瘤生长上，比具 有较低数量PEG-DSG的F5-ILs-VRB效率明显更高；而两种制剂都比游离药物更 具活性。实施例55.在小鼠中，EGFR-定向脂质体型长春瑞滨对U87人脑癌异种移植物肿 瘤的体内抗肿瘤功效
[0264]根据实施例42，制备带有包封的0.65M TEA-SOS溶液的脂质体(经QELS 大小为86.6±12.9nm)，并装载上VRB。如实施例36中所述，通过将VRB脂质体 与抗-EGFR抗体Fab’片段的PEG-DSPE偶联物温育，制备抗-EGFR-免疫脂质体型 VRB(C225Fab’-ILs-VRB)。
[0265]对雄性NCR nu/nu小鼠(5-6周，称重17-20g)，在胁区皮下注射悬浮在生长 培养基中的1×107个U87人成胶质细胞瘤细胞(ATCC)，总体积150μl。当肿瘤平 均大小达到250mm时，将小鼠随机分入具有10-12只动物的四个组中。小鼠，每 周三次、以5mg VRB/kg的剂量，被静脉注射“游离”VRB、非定向Ls-VRB或 C225Fab′-ILs-VRB进行治疗。对照组接受等体积的盐水。如实施例10监控肿瘤大 小和动物体重。在相等剂量下，C225-Fab′-ILs-VRB，在抑制EGFR-过量表达的人 脑癌异种移植物肿瘤的生长上，明显比非定向脂质体型长春瑞滨或游离型长春瑞 滨更有效(图35)。实施例56.使用硫酸三乙铵方法包封在脂质体中的阿霉素的制备和药物动力学
[0266]如实施例2所述，形成含有不同的脂类基质组成成分(如下面的表所示)的脂 质体。N-戊二酰-DSPE(Glu-DSPE)获自Avanti Polar Lipids，AL，USA。利用旋转蒸 发，在氯仿中由脂溶液形成纯脂膜；真空下(90μm Hg，2小时)去除痕迹挥发物； 脂膜在硫酸三乙铵(TEA-8O4)溶液(0.65N TEA)中水合，经历六个循环的快速冷冻 和融化；并挤压通过二叠层0.1μm孔径聚碳酸酯过滤器10次，和挤压通过二叠 层0.05μm孔径聚碳酸酯过滤器10次。为了在血液样品中对脂类基质定量，将 [3H]-CHE以0.5-1.5mCi/mmol磷脂引入到脂类基质中。根据实施例2，使含有包 载的TEA-SO4溶液的脂质体装载上阿霉素。在60℃下，将HEPES-缓冲盐水(20mM HEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5)中的脂质体与盐酸阿霉素(药物/磷脂比率为 140-170mg/mmol)温育45min，然后在冰上中止，通过凝胶层析去除未包封的阿霉 素。通过分光光度法(实施例71)分析阿霉素，并且通过Bartlett方法(实施例70)分 析磷脂。所得的脂质体的特性，概述在下表30中。表30.不同脂类组成时的脂质体型阿霉素的特性
脂类组成(摩尔比) 脂质体大小，nm(平均值±药物/磷脂(mg/mmol) SD，由QELS) DSPC/Chol/PEG-DSPE (3∶2∶0.015) DSPC/Chol(3∶2) DSPC/Chol/Glu-DSPE (2.85∶2∶0.15) DSPC/Chol/PEG-DSPE (2.7∶2∶0.3) 81.8±27.3 79.1±27.9 83.6±27.2 83.7±23.1 163.6±4.4 137.0±17.5 141.7±10.4 175.0±6.8
脂类组成(摩尔比) 脂质体大小，nm(平均值±药物/磷脂(mg/mmol) SD，由QELS) DSPC/Chol/PEG-DSPE (3∶2∶0.015) DSPC/Chol(3∶2) DSPC/Chol/Glu-DSPE (2.85∶2∶0.15) DSPC/Chol/PEG-DSPE (2.7∶2∶0.3) 81.8±27.3 79.1±27.9 83.6±27.2 83.7±23.1 163.6±4.4 137.0±17.5 141.7±10.4 175.0±6.8
[0267]如实施例9中所述，在大鼠中，以5mg阿霉素/kg的单次静脉剂量，研究 这些具有DSPC/Chol/PEG-DSPE 2.7∶2∶0.3的脂类组成的含阿霉素脂质体的血液 药物动力学。脂质体具有长的循环时间(半衰期约28小时)(图36)。稳定的阿霉素- 与-类脂比率表明：该制剂在循环中对药物渗漏而言是非常稳定的，在48小时的时 间期间里损失为25％以下的药物。实施例57.通过TEA-硫酸盐方法而制备的装载阿霉素的脂质体和抗-HER2免疫脂 质体：制备和对抗HER2-过量表达的人乳腺癌异种移植物的体内抗肿瘤功效。
[0268]具有不同脂类组成和特性(在下表中列出)的装载阿霉素的脂质体，如实施例 56所述进行制备。通过与抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶联物(大约30scFv/脂质体) 共温育，由装载阿霉素的脂质体制备装载阿霉素的抗-HER2免疫脂质体，如实施 例19中所述。培养携带皮下人乳腺癌异种移植物(BT-474)的NCR nu/nu小鼠；一 旦肿瘤平均大小达到200mm3，以5mg/kg剂量用脂质体型阿霉素或抗-HER2免疫 脂质体型阿霉素治疗(在10-12只动物组成的组别中)，每周一次，总共三周；并且 如实施例29中描述地那样，监控肿瘤进展和动物体重。对于非定向阿霉素脂质体 制剂，研究不含PEG-DSPE、含0.5mol.％PEG-DSPE或含10mol.％PEG-DSPE 的脂类组成情况；对于F5-免疫脂质体型阿霉素，研究携带有0.5mol.％PEG-DSPE 和10mol.％PEG-DSPE的制剂(在这里PEG-DSPE的量，用脂质体磷脂的mol.％ (摩尔百分数)表示)。结果(图37，表31)证明：所有阿霉素治疗对延缓肿瘤生长 是有效的。根据接种后第53天的肿瘤大小，在所有三个非定向脂质体组中的肿瘤 生长抑制上的差异，并没有产生统计学上的显著性(ANOVA p＝0.081)；但是免疫脂 质体型阿霉素比非定向脂质体型阿霉素明显更有效(ANOVA p＝5.5×10-10)， “10％PEG-DSPE”制剂比“0.5％PEG-DSPE”制剂更有效(学生t-试验，p＝0.027)。在 “10％PEG-DSPE”F5-ILs组中，在67％的动物中，肿瘤退化到1mm3或更小；而在 “0.5％PEG-DSPE”组中，仅9％。在对照组(盐水治疗)中，在第38-43天，肿瘤 超过可接受大小的极限：体重的15％。表31.脂质体型阿霉素体内抗肿瘤功效研究：脂质体特征和治疗结果。
脂类组成 脂质体大小，nm (平均值±SD) 药物/磷脂比率， mg/mmol，(平均值 ±SD) 在第58天时的平 均肿瘤大小， mm3，(平均值 ±SEM DSPC/Chol/PEG-DSPE (3∶2∶0.015) 83.4±23.3 136.7±6.7 490±74 DSPC/Chol(3∶2) 80.5±26.6 151.2±1.9 587±61 DSPC/Chol/PEG-DSPE 81.0±24.7 140.1±4.2 365±60
(2.7∶2∶0.3) DSPC/Chol/PEG-DSPE (3∶2∶0.015) +F5 scFv-PEG-DSPE 未测量 140.7±2.8 119±39 DSPC/Chol/PEG-DSPE (2.7∶2∶0.3) +F5 scFv-PEG-DSPE 未测量 132.9±2.2 15.5±7.6
实施例58.脂质体型长春碱的制备和脂质体型长春碱在大鼠中的血液药物动力学
脂类组成 脂质体大小，nm (平均值±SD) 药物/磷脂比率， mg/mmol，(平均值 ±SD) 在第58天时的平 均肿瘤大小， mm3，(平均值 ±SEM DSPC/Chol/PEG-DSPE (3∶2∶0.015) 83.4±23.3 136.7±6.7 490±74 DSPC/Chol(3∶2) 80.5±26.6 151.2±1.9 587±61 DSPC/Chol/PEG-DSPE 81.0±24.7 140.1±4.2 365±60
(2.7∶2∶0.3) DSPC/Chol/PEG-DSPE (3∶2∶0.015) +F5 scFv-PEG-DSPE 未测量 140.7±2.8 119±39 DSPC/Chol/PEG-DSPE (2.7∶2∶0.3) +F5 scFv-PEG-DSPE 未测量 132.9±2.2 15.5±7.6
实施例58.脂质体型长春碱的制备和脂质体型长春碱在大鼠中的血液药物动力学
[0269]利用2次挤压通过二叠层0.2μm聚碳酸酯膜和10次挤压通过二叠层0.08 μm聚碳酸酯膜，通过实施例11的方法，制备含有包载有TEA-SOS水溶液(0.65M TEA，pH6.4，同渗重摩502mmol/kg)和大小99.5±10.2nm(平均值±SD，经QELS 测定)的脂质体。以150mg/mmol的药物-与-磷脂比率，加入硫酸长春碱USP(美 国药典)形式的长春碱(vinblastine(VBL))。使用1N NaOH，将药物-脂质体混合物 的pH调节到6.5，随后将混合物在60℃下温育30分钟。然后，反应在冰上冷却 15分钟；使用Sephadex G-75凝胶过滤层析，用5mM HEPES-Na、135mM NaCl、 pH6.5洗脱，去除未包封药物。然后如实施例70和实施例71那样，通过分光光 度法分析纯化的脂质体中的VBL，通过Bartlett方法分析磷脂。以1.5mCi/mmol 磷脂的比率，将[3H]-CHE引入到制剂中。脂质体型长春碱具有152.4±12.0mg VBL/mmol磷脂(定量包封)。
[0270]如实施例9所述，以5mg VBL/kg剂量，研究脂质体型长春碱在雌性Albino 大鼠(8-9周龄；200g)中的血液药物动力学。如实施例41中所述，在血浆样品中， 对长春碱定量(使用长春瑞滨作为内标)。长春碱型脂质体显示出良好的循环寿命 (脂类组分的血浆半衰期为12.8±0.04小时)(图38)以及对抗药物从脂质体渗漏的 良好稳定性，在24小时后，超过70％的初始长春碱加载量保持在被包囊状态中(图 39)。发现：注射后达到包封药物之50％释放的时间为40.6±1.2小时。实施例59.使用TEA-SOS方法制备采用长春新碱进行装载的脂质体，以及pH对 装载效率的影响。
[0271]利用15次通过二叠层0.08μm孔径聚碳酸酯膜的挤出步骤，通过实施例11 的方法，制备大小为86.6±12.9nm(经QELS)、含有摩尔比3∶2∶0.015的 DSPC/Chol/PEG-DSPE脂类组成的、以及含有包载的含水TEA-SOS溶液(0.65M TEA，pH5.4，同渗重摩521mmol/kg)的脂质体。向处于5mM HEPES-Na、5％葡 萄糖含水缓冲液、pH6.5中的脂质体中，以350μg长春新碱/μmol磷脂的药物-对 -磷脂比率，将长春新碱(VCR)以硫酸长春新碱加入；用1N NaOH将pH调节到 指示比率；混合物在60℃下温育30分钟，冰上冷却15分钟；并且使用Sephadex G-75凝胶过滤层析，用HBS-6.5(20mM HEPES，135mM NaCl，pH6.5)洗脱，将 脂质体与未包封药物分离开来。然后，分析纯化的脂质体，其中在溶解在酸性异 丙醇之后，通过分光光度法使用265nm处的吸光率分析长春新碱；并使用Bartlett 的磷酸盐测试(1959)分析磷脂含量。
[0272]结果显示在表32中。在pH4.5-7.5范围内，药物装载超过90％；并且在pH 5.0-7.5，几乎是定量的。在pH3.5下——该pH值是加入药物后、在脂质体混合物 中所观察到的pH，但不进行pH调整，装载水平相当低。表32.长春新碱装载入携带有包载的TEA-SOS的脂质体中的pH-依赖性
pH 药物/磷脂比率，μg/μmol 装载效率(％) 3.5 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 39.7±4.9 327.2±20.6 360.6±5.8 371.2±30.2 347.7±20.4 347.7±20.9 377.3±22.2 371.5±24.9 11.3±0.2 93.5±5.4 103.0±1.7 106.1±9.1 99.3±5.8 99.4±5.9 107.8±6.8 106.1±7.6
实施例60.使用TEA-SOS方法制备装载有长春新碱的脂质体：药物/脂类比率对装 载效率的影响。
pH 药物/磷脂比率，μg/μmol 装载效率(％) 3.5 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 39.7±4.9 327.2±20.6 360.6±5.8 371.2±30.2 347.7±20.4 347.7±20.9 377.3±22.2 371.5±24.9 11.3±0.2 93.5±5.4 103.0±1.7 106.1±9.1 99.3±5.8 99.4±5.9 107.8±6.8 106.1±7.6
实施例60.使用TEA-SOS方法制备装载有长春新碱的脂质体：药物/脂类比率对装 载效率的影响。
[0273]根据实施例59，制备含SOS-TEA的脂质体；根据实施例59的程序，在pH 6.5下，以150-550μg长春新碱/μmol磷脂的药物-与-磷脂比率，装载硫酸长春新碱。 然后，分析从未包封药物纯化而来的脂质体，其中通过分光光度法分析VCR；并 使用Bartlett的分析方法(1959)分析脂质体磷脂。在整个被研究的药物/脂类比率的 范围内，药物装载效率是超过90％的；并且在150-450μg长春新碱/μgmol磷脂之 间，几乎是定量的(表33)。表33.以不同的药物-与-脂类比率，将长春新碱装载入含TEA-SOS的脂质体
输入的药物-比-磷脂 (μg/μmol) 包封的药物-比-磷脂 (μg/μmol) 装载效率(％) 150 250 350 450 550 163.6±6.6 251.1±17.0 347.7±20.9 452.0±18.8 521.6±24.9 109.0±4.8 100.5±6.8 99.4±5.9 100.4±4.2 94.8±4.3
实施例61.制备免疫脂质体型长春新碱以及脂质体型长春新碱和免疫脂质体型长 春新碱对体外癌细胞的细胞毒性
输入的药物-比-磷脂 (μg/μmol) 包封的药物-比-磷脂 (μg/μmol) 装载效率(％) 150 250 350 450 550 163.6±6.6 251.1±17.0 347.7±20.9 452.0±18.8 521.6±24.9 109.0±4.8 100.5±6.8 99.4±5.9 100.4±4.2 94.8±4.3
实施例61.制备免疫脂质体型长春新碱以及脂质体型长春新碱和免疫脂质体型长 春新碱对体外癌细胞的细胞毒性
[0274]采用350mg/mmol的药物/磷脂比率，如实施例59所述地那样，制备脂质 体型长春新碱(liposomal vincristine(Ls-VCR))。如实施例19所述，通过与抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶联物共温育，由脂质体型长春新碱制备HER2-特异性的F5- 免疫脂质体型长春新碱(F5-immunolipsomal vincristine(F5-ILs-VCR))。通过将硫酸 长春新碱USP(美国药典)溶解在水中，制备“游离的”长春新碱(VCR)溶液；然后 无菌过滤。通过使用实施例27的程序，进行MTT-基的细胞存活力分析，测定VCR、 Ls-VCR和F5-ILs-VCR对HER2-过量表达的人乳腺癌细胞SKBr-3(ATCC)的细胞 毒性，其中细胞以5,000个细胞/孔被接种到96-孔微量滴定板中，驯化过夜；并与 含药物的培养基温育4小时；然后，在温育后，在无药物培养基中，放置3天。 结果显示在图40中。游离VCR的IC50是75ng/ml，F5-ILs-VCR的IC50是11ng/ml， Ls-VCR的IC50是3μg/ml。根据本发明制备的定向脂质体长春新碱活性比游离药 物高6.8倍，并且比非定向脂质体药物活性高273倍；这表明：作为细胞特异性药 物输送的一个作用，在抗癌活性上存在实质性增加。实施例62.Ls-VCR在大鼠中的血液药物动力学
[0275]使用10次通过孔径80nm或100nm的二叠层聚碳酸酯膜的挤压步骤，通 过实施例11的方法，制备脂质体；该脂质体含有包载的SOS-TEA溶液(0.65M TEA，pH5.8，同渗重摩530mmol/kg)，并且脂类组成为DSPC/Chol/PEG-DSPE(摩 尔比3∶2∶0.015)，也以1.5mCi/mmol磷脂含有[3H]-CHE。如实施例59所述， 脂质体在H6.5下、以350mg/mmol的药物/磷脂比率装载VCR。装载有VCR的 脂质体，以5mg VCR/kg的剂量，经静脉给予雌性albino大鼠(180-220g)；并且， 如实施例9中所述地，研究药物和脂质体脂类的血液药物动力学。除了移动相中 的含水的醋酸三乙铵(pH5.5)和乙腈的体积比为65∶35之外，如实施例41所述通 过HPLC对血液样品中的VCR量进行定量。VCR典型的保留时间为8.8min(分 钟)。结果显示在图41和表34中。两种制剂都具有延长的循环寿命(血液半衰期 12-17小时)。在两种制剂中，就药物渗漏而言，脂质体型长春新碱是非常稳定的(半 释放期超过120小时)(图42)。表34.使用TEA-SOS方法，以350mg/mmol磷脂装载了长春新碱的脂质体的特征
挤压孔径， nm 脂质体大 小，nm(平 均值±SD) 药物装载， mg/mmol磷 脂 t1/2β脂类， 小时 t1/2βVCR， 小时 t1/βVCR释 放，小时 80 100 101.2±20.2 125.6±32.0 347.7±20.93 366.8±18.11 17.5±1.5 12.1±0.7 16.0±2.0 12.0±0.8 ＞120 不可检测到
实施例63.不同药物/脂类比率的Ls-VCR在大鼠中的血液药物动力学
挤压孔径， nm 脂质体大 小，nm(平 均值±SD) 药物装载， mg/mmol磷 脂 t1/2β脂类， 小时 t1/2βVCR， 小时 t1/βVCR释 放，小时 80 100 101.2±20.2 125.6±32.0 347.7±20.93 366.8±18.11 17.5±1.5 12.1±0.7 16.0±2.0 12.0±0.8 ＞120 不可检测到
实施例63.不同药物/脂类比率的Ls-VCR在大鼠中的血液药物动力学
[0276]使用10次通过孔径50nm或80nm的二叠层聚碳酸酯膜的挤压步骤，通过 实施例11的方法，制备脂质体；该脂质体含有包载的SOS-TEA溶液(0.65M TEA， pH6.4，同渗重摩485mmol/kg)，脂类组成为DSPC/Chol/PEG-DSPE(摩尔比3∶2∶ 0.015)，也以1.5mCi/mmol磷脂含有[3H]-CHE。通过以计算出的药物/脂类比率 100mg/mmol、200mg/mmol或350mg/mmol磷脂，加入含水硫酸VCR溶液的20 mg/mL储液，从而如实施例59所述在pH6.5下使脂质体装载上VCR。对于所有 制备方法，药物装载效率超过96％。以5mg VCR/kg的剂量，经静脉，将装载了 VCR的脂质体给予雌性albino大鼠(8-9周龄，180-220g)；并且如实施例62中所 述地那样，研究药物和脂质体脂类的血液药物动力学。结果显示在表35中。脂质 体型长春新碱具有良好的循环寿命(药物的血液半衰期为20-30小时)；并且，在所 有被研究的尺寸和药物-与-脂类比率下，是异常稳定的(药物释放半衰期超过93小 时)。表35.使用TEA-SOS方法，以不同药物/脂类比率装载长春新碱的脂质体的特征
挤压孔 径，nm 脂质体大 小，nm(平 均值±SD) VCR，mg/mmol磷 脂 t1/2脂类， 小时 t1/2VCR， 小时 t1/2药物 释放，小 时 加入的 包封的 50 80 76.8±27.2 101.6±25.3 100 96.1±3.0 35.6±2.7 30.3±4.0 227±96 200 193.3±3.9 20.8±2.2 18.4±0.7 244±130 350 375.2±10.0 24.8 ±0.9 19.6±0.9 93.2±6.7 100 104.5±2.1 33.0±7.6 26.8±4.8 153±10
实施例64.HER2-定向脂质体型长春新碱的制备，以及非定向型和HER2-定向型脂 质体长春新碱在小鼠中对过量表达HER2的人乳腺癌异种移植物的抗肿瘤功效。
挤压孔 径，nm 脂质体大 小，nm(平 均值±SD) VCR，mg/mmol磷 脂 t1/2脂类， 小时 t1/2VCR， 小时 t1/2药物 释放，小 时 加入的 包封的 50 80 76.8±27.2 101.6±25.3 100 96.1±3.0 35.6±2.7 30.3±4.0 227±96 200 193.3±3.9 20.8±2.2 18.4±0.7 244±130 350 375.2±10.0 24.8 ±0.9 19.6±0.9 93.2±6.7 100 104.5±2.1 33.0±7.6 26.8±4.8 153±10
实施例64.HER2-定向脂质体型长春新碱的制备，以及非定向型和HER2-定向型脂 质体长春新碱在小鼠中对过量表达HER2的人乳腺癌异种移植物的抗肿瘤功效。
[0277]使用50nm孔径的膜挤压和以100mg/mmol的药物/磷脂比率装载药物，根 据实施例63(省去[3H]-CHE组分)，通过TEA-SOS方法制备装载有长春新碱的脂质 体(vincristine-loaded liposomes(Ls-VCR-SOS))。如实施例43所述，通过将 Ls-VCR-SOS与抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶联物(实施例19)温育，形成F5免疫 脂质体长春新碱(F5-ILs-VCR)。利用TEA-柠檬酸的装载有长春新碱的脂质体 (Ls-VCR-Cit)，是按与Ls-VCR-SOS脂质体相似的方法制备的；除了用柠檬酸三乙 铵溶液(通过用纯三乙胺将含水柠檬酸滴定至pH5.1，并将浓度调整到0.65M三 乙胺制备而得)替代TEA-SOS溶液之外。治疗研究设计遵照实施例10的方法。在 裸鼠上培养BT-474人乳腺癌的皮下异种移植物肿瘤，且当肿瘤大小达到250mm3 (144-309mm3范围)时，将由8到9只小鼠组成的组别中的小鼠，经静脉、以2mg VCR/kg的剂量，用游离VCR、Ls-VCR或F5-ILs-VCR治疗，每周一次，总共三 周，是在肿瘤接种后第19天开始进行。如实施例10所述，对肿瘤大小和动物体 重进行监控。对于对照组，小鼠用等体积的盐水处理。在肿瘤接种后第63天，利 用Mann-Whitney试验，用统计学方法评价处理组之间、在肿瘤大小上的差异。各 组中平均肿瘤大小的动态变化，显示在图43中。当与Ls-VCR或游离VCR相比 时，F5-ILs-VCR表现出最大的效率，导致：在第63天时，8只动物中的6只(75％) 的肿瘤完全消退。Ls-VCR-Cit也是具有效力的，导致：在63天时，也观察到9只 动物中的2只(22％)的肿瘤完全消退；然而其比F5-ILs-VCR效力低(p＜0.005)。 Ls-VCR-SOS和游离VCR具有相同的功效(p＞0.2)，但效力比F5-ILs-VCR或 Ls-VCR-Cit低。因此，令人惊讶的是，借助细胞-定向输送，使用本发明的多价阴 离子所包封的脂质体型药物，被证明比通过非结合性阴离子所包封的脂质体药物 功效更大。动物体重动力学显示：所有脂质体型VCR制剂的毒性低于游离型CVR 的毒性，导致治疗期间体重减轻较少(图44)。实施例65.EGFR-定向脂质体型长春新碱的制备，非定向和EGFR-定向脂质体型长 春新碱在小鼠中对EGFR-过量表达的人脑癌异种移植物的抗肿瘤功效。
[0278]如实施例64，使用TEA-SOS方法制备装载长春新碱的脂质体(Ls-VCR)。 如实施例36所述，通过将脂质体与抗-HER2 Fab′C225Fab-PEG-DSPE偶联物共温 育，制备EGFR-定向免疫脂质体长春新碱。
[0279]在雄性NCR nu/nu小鼠(5-6周龄，称重17-20g)的胁区，皮下注射0.15ml 的细胞生长培养基，该培养基中含有1±107个的稳定表达表皮生长因子受体(HER1) 突变体EGFRvIII的U87人成胶质细胞瘤细胞。在第11天，当平均肿瘤大小达到 300-400mm3时，将小鼠随机分成10-12动物/组的四个组。在肿瘤接种后第11、 18和25天，以1.5mg/kg的剂量，静脉内给予游离VCR(硫酸长春新碱1mg/mL， 于盐水中)、Ls-VCR或C225Fab-ILs-VCR，进行治疗。对照组中的小鼠类似地注 射等体积的生理盐水。如实施例10所述，监控肿瘤大小和小鼠体重。结果显示在 图45中。与对照动物相比，所有用VCR制剂治疗的动物显示出肿瘤生长的延迟。 在用游离VCR和Ls-VCR治疗的组之间，没有显著性差异。EGFR-定向型 C225Fab-ILs-VCR，比游离型或非定向型脂质体VCR效率高。实施例66.含有包载的三乙铵肌醇六磷酸(triethylammonium inositol hexaphosphate(TEA-IHP))溶液的脂质体的制备。
[0280]聚阴离子化的多元醇、肌醇六磷酸(IHP)十二烷基钠盐，获自Sigma(St. Louis，MO)。根据实施例4的程序，通过在Dowex 50Wx8-200交联磺化聚苯乙烯 树脂上进行离子交换制备水溶液，该溶液含有0.65M三乙铵和0.681M磷酸基团， pH6.5，且同渗重摩为718mmol/kg；然后用纯TEA滴定，并用水稀释。残留的钠 含量，是在阳离子数量的1％以下。在60℃下，将干的脂类(150μmol DSPC、100μmol Chol、0.75μmol PEG-DSPE)溶解在0.5ml的100％乙醇USP(美国药典)中，与 4.5ml的、预加热到相同温度的三乙铵肌醇六磷酸溶液混合。在30-40mm Hg以及 40-45℃下，通过旋转蒸发，部分地除去乙醇，直到混合物显示出不起泡。然后， 在60-65℃下，将脂类悬浮液15次挤压通过二叠层0.1μm孔径聚碳酸酯膜。经QELS 测定，所得的脂质体大小为104.3±39.0nm。通过在Sepharose 4B柱上进行凝胶层 析，用5mM HEPES-Na、5％葡萄糖，pH6.5缓冲液洗脱，去除未包封的三乙铵IHP。 根据实施例70提取，使用Bartlett方法，由磷脂浓度定量脂质体。实施例67.将药物装载入含包载的TEA-IHP溶液的脂质体中
[0281]用CPT11或长春瑞滨装载实施例67的脂质体。长春瑞滨以175或350g/mol 的药物-与-磷脂比率装载，CPT11以250或500g/mol的比率装载。以下面示出的 输入药物/磷脂比率(参见表36)，将药物施加给处于HEPES-葡萄糖缓冲液(实施例 67)中的脂质体。如果需要，使用1N NaOH将pH调整到6.5-6.8。混合物在60℃ 下温育30分钟，冰上冷却15分钟，并且在Sephadex G-25凝胶过滤柱上层析，用 5mM HEPES-Na、145mM NaCl，pH6.5洗脱。将纯化的脂质体之等分试样增溶 在酸化甲醇中，并通过分光光度法分析(实施例71)。通过(实施例70)提取，使用 Bartlett方法(1959)，对磷脂定量。如下面的表36所示，两种药物定量(即，几乎 100％)装载入脂质体中。表36.被装载入含包载的肌醇六磷酸的脂质体中的药物的特性
药物 输入的药物/脂类 比率，g/mol磷脂 包封的药物/脂类 比率，g/mol磷脂 装载效率，％ 长春瑞滨 长春瑞滨 CPT-11 CPT-11 175 350 250 500 175.3±8.0 352.3±11.8 265.1±11.2 518.7±27.8 100.2±4.5 100.6±3.3 106.1±4.7 103.7±5.8
实施例68.在体外的小鼠血浆存在下，游离型CPT-11或脂质体型CPT-11的化学 稳定性
药物 输入的药物/脂类 比率，g/mol磷脂 包封的药物/脂类 比率，g/mol磷脂 装载效率，％ 长春瑞滨 长春瑞滨 CPT-11 CPT-11 175 350 250 500 175.3±8.0 352.3±11.8 265.1±11.2 518.7±27.8 100.2±4.5 100.6±3.3 106.1±4.7 103.7±5.8
实施例68.在体外的小鼠血浆存在下，游离型CPT-11或脂质体型CPT-11的化学 稳定性
[0282]在体内，前药CPT-11进行化学转化，形成活性药物代谢物，称为SN-38。 SN-38和CPT-11都从它们的活性内酯形式转化为无活性的前药，称为SN-38或 CPT-11羧酸盐。在该实施例中，研究了根据本发明的CPT-11脂质体化作用，对 在血浆存在下CPT-11化学转化为这些前药的影响。利用10次挤压通过二叠层0.08 μm聚碳酸酯过滤器，根据实施例11制备脂质体；该脂质体含有包载的蔗糖八硫 酸酯三乙基铵(triethylammonium sucroseoctasulfate)(0.65M TEA，pH6.4，同渗 重摩485mmol/kg)，和摩尔比为3∶2∶0.015的DSPC、胆固醇和PEG-DSPE的脂 类组成。经QELS测定，脂质体的大小为87.4±19.2nm。通过以约500mg CPT-11 基本成分/mmol脂质体磷脂的比率；在含水的5mM HEPES-Na、5％葡萄糖，pH6.5 中，在60℃下，温育30分钟；然后在冰上维持15分钟终止，从而装载CPT-11。 然后在Sephadex G-75柱上纯化装载了CPT-11的脂质体，采用HEPES缓冲盐水(5 mM HEPES，145mM NaCl，pH6.5)洗脱。所得的CPT-11脂质体具有536.5±20.1mg CPT-11/mmol磷脂的比率。通过以1mg/ml，将盐酸伊立替康USP(美国药典)溶 解在144mM的水溶液NaCl中，新鲜制备游离型CPT-11溶液，用稀HCl酸化到 pH3。将10μl脂质体型CPT-11或游离型CPT-11的等分式样，与90μl的肝素-稳 定的小鼠血浆(Harlan Bioproducts，USA)混合，并于37℃、在振荡水浴中温育。在 给定时间点时，一式三份将脂质体样品在Sepharose CL-4B尺寸排阻柱(2ml床体 积)上进行层析，用HBS-6.5洗脱；并且经荧光检测含药物的级分。收集第一(空体 积)和第二(拖尾(trailing))含药物峰，并认为是脂质体包封的和释放的药物级分。通 过旋涡10秒钟，然后在14,100×g离心5分钟，用400μl冰冷的甲醇提取样品。分 析上清液中的CPT-11，并利用对Warner and Burke，J Chromatogr.，Ser.B Biomed.Sci. Appl.1997，vol.691，p.161-71方法予以修改的方法，通过HPLC分析其转化产物。 由3％醋酸三乙铵pH5.5(溶液A)和乙腈(溶液B)组成的移动相，以1.0ml/min的速 度，在20vol％B至50vol.％B的线性梯度中，输送14min。以375nm的激发光和 500nm的发射光，通过荧光检测洗脱的产物。保留时间为5.3min(CPT-11羧酸酯)、 6.8min(SN-38羧酸酯)、9.3min(CPT-11)和11.0min(SN-38)。结果表明：当游离 CPT-11和从脂质体释放的CPT-11经历转化时，脂质体内的CPT-11是相当稳定的。表37.在小鼠血浆中，游离型CPT-11和脂质体型CPT-11体外转化为SN-38和羧 酸酯形式。
样品 时间，小时 CPT-11，％ SN-38，％ 内酯 羧酸酯 内酯 羧酸酯 游离CPT-11 2 12 24 1.9±0.4 ＜0.1 ＜0.1 35.2±1.9 11.5±0.9 ＜0.1 4.4±0.1 9.9±0.8 22.5±9.8 58.4±2.1 78.6±1.3 77.5±9.8 Ls-CPT-11 (包封的) 12 24 97.7±0.1 97.7±0.1 ＜0.1 ＜0.1 2.3±0.1 2.3±0.1 ＜0.1 ＜0.1 Ls-CPT-11 (释放的) 12 24 60.5±10.4 78.3±6.7 25.0±7.1 14.0±5.2 5.0±0.3 6.5±0.5 9.5±3.0 1.2±1.7
实施例69.游离型CPT-11或脂质体型CPT-11在大鼠中的体内化学稳定性
样品 时间，小时 CPT-11，％ SN-38，％ 内酯 羧酸酯 内酯 羧酸酯 游离CPT-11 2 12 24 1.9±0.4 ＜0.1 ＜0.1 35.2±1.9 11.5±0.9 ＜0.1 4.4±0.1 9.9±0.8 22.5±9.8 58.4±2.1 78.6±1.3 77.5±9.8 Ls-CPT-11 (包封的) 12 24 97.7±0.1 97.7±0.1 ＜0.1 ＜0.1 2.3±0.1 2.3±0.1 ＜0.1 ＜0.1 Ls-CPT-11 (释放的) 12 24 60.5±10.4 78.3±6.7 25.0±7.1 14.0±5.2 5.0±0.3 6.5±0.5 9.5±3.0 1.2±1.7
实施例69.游离型CPT-11或脂质体型CPT-11在大鼠中的体内化学稳定性
[0283]如实施例68所述，使用三乙基铵蔗糖八硫酸酯制备脂质体CPT-11，该三 乙基铵蔗糖八硫酸酯具有0.65M TEA，pH6.4，同渗重摩502mmol/kg。脂质体大 小为98.5±18.4nm，CPT-11封装为510.1±16.5mg CPT-11/mmol磷脂。脂质体型 CPT-11和游离型CPT-11，以25mg/kg的剂量，通过静脉内，给予具有留置的中心 静脉插管的雌性Albino大鼠(180-220g)；并且，在48小时的时间里，间隔地抽 取血液样品。将血液样品与含有0.04％EDTA的冰冷PBS混合，并迅速离心去除 血细胞。如上面实施例68所述，通过HPLC分析上清液流体的等分试样中的 CPT-11、SN-38和它们羧酸酯形式。结果显示在图46和47中。尽管游离CPT-11 被迅速清除，在30分钟之后不可检测到，然而脂质体CPT-11仍然保留在循环中 (t1/215.2小时)，在24小时时有37.8％的药物保留在循环中，在48小时后有近似 10％的药物依然保留在循环中。没有检测到脂质体形式的CPT-11转化为SN-38或 羧酸盐形式的CPT-11。游离CPT-11，即作为溶液给予的CPT-11，相当快地从循环 中去除(半衰期约16min)，且可以测量到转化为羧酸盐形式的药物。实施例70.脂质体磷脂的定量
[0284]改良型酸消化——蓝色磷钼酸盐方法I。该方法是从Bartlett(1959)修改 而来。将10-20ml脂质体等分试样置于耐热的玻璃杯，用0.5ml 10N硫酸在 110-130℃下加热2小时进行消化，通过加入50ml的9％过氧化氢进行矿化；再 加热30min，直到用指示纸条不能检测到过氧化氢。在环境温度中，将消化的样 品用1ml 0.2％含水钼酸铵稀释；与0.1ml 5％含水抗坏血酸混合；并且，在沸水 浴中温育10min。在800nm下，测量还原的磷钼酸盐复合物的吸光率，并与使用 无机磷酸盐标准溶液所同时产生的标准曲线比较。
[0285]改良型酸消化——蓝色磷钼酸盐方法II。该方法是Morrison(1964)的方 法的改良型。将5μl含1-10mM磷脂的脂质体等分试样与60μl浓硫酸和10μl 30 ％过氧化氢，在耐热玻璃管中混合。将混合物在200-220℃下加热10min，用0.7μl 去离子水稀释，与10μl 10％含水亚硫酸钠混合，在沸水浴中温育5分钟，并冷却 至环境温度。加入200μl 2％含水钼酸铵和10μl 10％含水抗坏血酸，并将样品在沸 水浴中10min。将样品迅速冷却至环境温育；针对空样品，在825nm下，测量还 原的磷钼酸盐复合物的吸光率。由使用具有2、4、6、8和10nM磷酸二氢钾的标 准溶液在同一操作中获得的标准曲线，确定磷脂的数量。
[0286]提取方法。用200μl份额的甲醇-氯仿混合物(体积比1∶2)，对脂质体的25-100 μl等分试样提取3次。将有机相合并在耐热玻璃管中，真空中去除溶剂。残留物 用10N硫酸处理，根据上面的方法I进一步分析磷。
[0287]除非另外指出，分析数据用平均值±三次操作的标准误差表示。实施例71.脂质体中药物的定量
[0288]光分光光度法定量。将脂质体等分试样(10-50μl)与1mL 70vol.％含 0.075-0.1N HCL的含水异丙醇混合；并且针对空白样品，在下列波长处测量吸光 率：阿霉素，485nm；CPT-11和托泊特坎，372nm；玫瑰树碱，306nm；长春瑞 滨，270nm；长春新碱和长春碱，265nm。通过与同时操作的标准曲线比较，测定 药物的数量。
[0289]荧光定量。将含脂质体的样品(例如血浆)的等分试样稀释，稀释用酸化的异 丙醇(0.02-0.1等分试样：1mL70％异丙醇-0.075N HCl；＞0.1ml等分试样：90％ 异丙醇-0.1N HCI至1mL)。如果出现蛋白质沉淀，将样品在冰上温育1-2小时， 并通过在12,100×g离心10分钟澄清。在下列波长下，测量上清液的荧光：CPT-11， 激发光370nm，发射光423-425nm；托泊特坎，激发光380-385nm，激发光520-525 nm；玫瑰树碱，激发光306nm，发射光520nm。在减去空白荧光之后，由同时 操作的标准曲线计算药物数量。实施例72.脂聚合物对长春瑞滨包囊入脂质体的包囊效率的影响。
[0290]利用80nm孔径膜的挤压步骤，根据实施例11的方法，制备含有包囊的0.65 M TEA-SOS溶液、由DSPC 200摩尔份、胆固醇133摩尔份和聚(乙二醇)(分子量 2,000)衍生脂类PEG-DSPE(1-20摩尔份或PEG-DSG(20摩尔份)组成的脂质体。脂 质体以350mg/mmol的药物/磷脂比率装载长春瑞滨，并根据实施例40的方法从未 包囊的药物纯化出来。如实施例70所述，分析脂质体中的药物和脂类含量，并使 用体积重量高斯近似方法(volume-weighted Gaussian approximation)经QELS分析脂 质体大小。结果(表38)表明：当数量为脂质体磷脂的1摩尔％以上(总脂类的0.3 摩尔％)的阴离子PEG衍生物PEG-DSPE对药物装载效率具有负影响时，中性衍 生物PEG-DSG却令人惊奇地并不影响包囊效率，甚至在脂质体磷脂的9.1摩尔％ (总脂类的5.7摩尔％)时也不影响。表38.以不同的PEG-脂类衍生物数量通过TEA-SOS方法制备的长春瑞滨脂质体 的特性
PEG-脂类 PEG-脂类数 量，总脂类的 mol.％ 脂质体大小， nm(平均SD) 药物装载， mg/mmol磷脂 装载效率，％ 包囊 PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSG 0.3 0.6 1.8 2.9 4.0 5.7 5.7 108±32 110±18 104±35 94±33 100±36 103±31 97±36 359.5±17.8 346.6±14.5 332.0±14.0 259.8±9.5 155.4±7.0 61.2±5.2 362.7±14.2 102.7±5.2 99.0±4.1 94.9±3.8 74.2±2.0 44.4±0.9 17.5±0.3 103.6±4.2
实施例73.脂质体内药物包载剂对CPT-11在小鼠中血液寿命的影响
PEG-脂类 PEG-脂类数 量，总脂类的 mol.％ 脂质体大小， nm(平均SD) 药物装载， mg/mmol磷脂 装载效率，％ 包囊 PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSPE PEG-DSG 0.3 0.6 1.8 2.9 4.0 5.7 5.7 108±32 110±18 104±35 94±33 100±36 103±31 97±36 359.5±17.8 346.6±14.5 332.0±14.0 259.8±9.5 155.4±7.0 61.2±5.2 362.7±14.2 102.7±5.2 99.0±4.1 94.9±3.8 74.2±2.0 44.4±0.9 17.5±0.3 103.6±4.2
实施例73.脂质体内药物包载剂对CPT-11在小鼠中血液寿命的影响
[0291]遵照实施例66的一般程序，制备含有0.65N的六磷酸肌醇(IHP，植酸)或 八硫酸蔗糖的三乙铵(TEA)或三乙醇铵(TEOA)盐溶液的脂质体，并以500g/mol磷 脂装载CPT-11。以5mg CPT-11/kg体重的剂量，将脂质体静脉内给予Swiss-Webster 小鼠。24小时之后，麻醉小鼠，经开口心脏穿刺放血。收集血液，如实施例68所 述通过HPLC分析血液血浆中的CPT-11含量，药物数量用保留在血液中的注射剂 量的百分比表示(％ID)。TEOA-IHP在改进药物血液寿命中的有效性比TEA-IHP、 TEOA-SOAS和TEA-SOS低(表39)。表39.在小鼠静脉内给予CPT-11脂质体后24小时CPT-11在血液中的保留水平
脂质体内药物包载剂 保留在血液中的％ID TEOA-IHP TEA-IHP TEOA-SOS TEA-SOS 2.74±0.54 5.86±0.20 7.03±0.17 11.32±0.46
实施例74.药物装载入含有1.05N二乙铵八硫酸蔗糖的脂质体
脂质体内药物包载剂 保留在血液中的％ID TEOA-IHP TEA-IHP TEOA-SOS TEA-SOS 2.74±0.54 5.86±0.20 7.03±0.17 11.32±0.46
实施例74.药物装载入含有1.05N二乙铵八硫酸蔗糖的脂质体
[0292]使用纯二乙胺(99.5％纯度)，利用实施例6的离子-交换/滴定方法，制备1.05 N二乙钱八硫酸蔗糖(DEA-SOS)的含水溶液，pH6.0，同渗重摩727mmo1/kg。使 用实施例11的方法，将3摩尔份DSPC、2摩尔份胆固醇和0.015摩尔份 PEG2000-DSPE的脂类基质在DEA-SOS溶液存在下配制入脂质体(体积权重平均 大小92.4nm)，并将CPT-11以不同的药物/脂类输入比率装载在脂质体中。通过凝 胶层析去除未包囊的药物，测定每单位脂类包囊的药物的数量(药物/脂类输入比)。 以药物/脂类输入比与输入比的百分比计算包囊效率。结果显示在表40中。该装载 获得其最大的水平：每摩尔磷脂约1.76摩尔药物(1.67-1.70mol药物/g总脂类)，其 与基于脂质体中的二乙铵含量的量(1.78mol二乙铵/mol磷脂)非常一致，假设对于 药物分子发生脂质体内二乙铵离子的化学计量交换，以及估算的脂质体内包载的 体积约1.71/mol磷脂。表40.CPT-11装载在含有1.05N DEA-SOS的DSPC/Chol/PEG-DSPE脂质体中。
药物/脂类输入比率， mol/g 药物/脂类输出比率， mol/g 包囊效率，％ 1.25 1.50 1.80 2.06 2.20 2.42 1.247±0.038 1.534±0.052 1.669±0.043 1.690±0.054 1.704±0.062 1.685±0.103 99.8±3.0 102.3±3.5 92.7±2.4 82.0±2.6 77.5±2.8 69.6±4.3
药物/脂类输入比率， mol/g 药物/脂类输出比率， mol/g 包囊效率，％ 1.25 1.50 1.80 2.06 2.20 2.42 1.247±0.038 1.534±0.052 1.669±0.043 1.690±0.054 1.704±0.062 1.685±0.103 99.8±3.0 102.3±3.5 92.7±2.4 82.0±2.6 77.5±2.8 69.6±4.3
[0293]除非另外指出，分析数据以三次运算的平均值±标准误差表示。大鼠血浆药 物动力学数据以两次运算的平均值±标准误差表示。
[0294]尽管本发明已参考目前优选的实施方案进行描述，应该理解可以在不脱离 本发明精神的情况下进行各种修改。因此，本发明的范围由随附的权利要求书决 定，并包括这些权利要求有权获得的等同的全部范围。所有引用的文章和参考文 献，包括专利申请和公布的公开内容通过参考并入本文，用于所有目的。优先权声明
[0001]本申请要求2004年5月3日提交的美国临时专利申请第60/567,921号的优 先权，该临时申请以参考方式整体并入本文，用于所有目的。
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