一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法
专利汇可以提供一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的 彗星 实验方法，它属于环境对鱼体遗传毒理学评价领域。方法：一、制备鱼肌肉组织的细胞悬液；二、彗星实验采用双层凝胶结构，进行裂解；三、裂解后冲洗，放入 电泳 缓冲液中电泳；四、电泳结束后 载玻片 经冲洗、晾干后移去盖玻片， 染色 后清洗，盖上盖玻片，用 荧光 显微镜 观察彗星图像，然后计算细胞受损率或分析图像，再分析结果，即完成。本 发明 优点在于具有高灵敏性，无需 放射性 示踪，并且这种技术只需要少量细胞，操作简单、直观、检测快速和具有良好经济性，相比 试剂 盒 更为廉价；还为鱼体遗传毒性进行定性、定量化评价提供支持，了解其江河 水 产 质量 、水质情况及其鱼体遗传毒理现状。，下面是一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法专利的具体信息内容。
1.一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、称取鱼肌肉组织0.8mg，放入离心管中，加入400μL 4℃预冷的PBS，用科弯剪剪成糜状，然后用匀浆器研磨，过100目筛网，再用2mL的PBS冲洗并滤去碎组织，取400μL滤液，置于离心管待用，获得细胞悬液；步骤一的操作全程于0～4℃下进行；
二、彗星实验采用双层凝胶结构，双层凝胶制备好后，将载玻片放置在4℃冰箱中
0.8～1.2h，然后放入4℃预冷的新配制细胞裂解液中，4℃下避光裂解1.5h；
三、裂解后将载玻片取出，用双蒸水冲洗，然后放入盛有4℃的新配制电泳缓冲液的水平电泳槽中静止30min，再在4℃，300mA，0.7V/cm的条件下电泳20min；
四、电泳结束后将载玻片用去离子水冲洗3次，晾干后移去盖玻片，将载玻片用50μl EB染液染色15～20min，然后用双蒸水清洗，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察彗星图像，在
100倍荧光显微镜下随机选取8～12个清晰细胞核图像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，然后计算细胞受损率或用casp软件分析图像，再使用spss统计软件分析结果，即完成鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验。
2.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤一中鱼肌肉取自鲤科鱼类胸腔背部、侧线与背鳍间肌肉。
3.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤一中的操作全程于2℃下进行。
4.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤一中PBS的浓度为0.01mol/L，pH为7.2～7。
5.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤二中细胞裂解液的配制：2.5mol/L NaCl、100mmol/L Na2EDTA、10mmol/L Tris、临用前加10％DMSO和1％Triton X-100。
6.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤二中将载玻片放置在4℃冰箱中1h。
7.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤二中双层凝胶的制备方法如下：
(1)取45mg正常熔点琼脂糖溶于6mL PBS，微波炉加热使其充分溶解，制备成0.75％正常熔点琼脂糖溶液，然后浇注到磨砂载玻片上，盖上盖玻片并于室温下贮存至琼脂糖凝固，移去盖玻片，获得第一层琼脂糖；
(2)取10mg低熔点琼脂糖溶于2mL PBS，微波炉稍加热使其充分溶解，制备成0.5％低熔点琼脂糖溶液，待温度降至35～38℃，取400μL细胞悬液与其混匀，然后将所得混合液加到第一层琼脂糖上，盖上盖玻片，即完成双层凝胶的制备。
8.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤三中电泳缓冲液的配制：1mmol/L Na2EDTA和300mmol/L NaOH。
9.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤四中EB染液的浓度为2μg/ml。
一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
100倍荧光显微镜下随机选取8～12个清晰细胞核图像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，然后用casp软件分析图像，再使用spss统计软件分析结果，即完成鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验。
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