由重组异养微生物生产的特制油
阅读：924发布：2021-01-09
专利汇可以提供由重组异养微生物生产的特制油专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于在重组 微 生物 (包括产油微生物)中生产油类、 燃料 、油脂化学品以及其它化合物的方法和组合物，以及低成本培育所述微生物的方法。含有外源性基因的微藻细胞可用于制造运输燃料(如可再生柴油、 生物柴油 以及可再生喷气燃料)以及油脂化学品(如官能 流体 、 表面活性剂 、肥皂以及 润滑剂 )，所述外源性基因编码例如脂酶、 蔗糖 转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、 酮 酰基-ACP合酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A/ 醛 还原酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白。，下面是由重组异养微生物生产的特制油专利的具体信息内容。
1.一种包含甘油三酯油类的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％；C10:0占至少约1％；C12:0占至少约1％；C14:0占至少约2％；C16:0占至少约30％；C18:0占至少约5％；C18:1占至少约60％；C18:2占少于约7％；以及饱和脂肪酸占至少约35％。
2.如权利要求1所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞包含外源性基因，并且其中所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶任选地已失活或突变而具有较小的酶活性。
3.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油类的甘油三酯油类型态。
4.如权利要求3所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类选自由可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油组成的组。
5.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的型态：C8:0与C10:0的组合总量是至少约10％；C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约
60％；以及C18:1与C18:2的组合总量少于约30％。
6.如权利要求1所述的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1；C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约7∶1；以及C14:0与C16:0的比率是至少约1∶2。
7.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ-12脂肪酸去饱和酶组成的组。
8.如权利要求7所述的产油微生物细胞，其中所述外源性基因选自由编码酰基-ACP硫酯酶的基因组成的组。
9.如权利要求8所述的产油微生物细胞，其中所述外源性基因编码酰基-ACP硫酯酶，所述酰基-ACP硫酯酶选自由以下组成的组：加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49001)；樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39473)；加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q41635)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71730)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABD83939)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD42220)；毛白杨脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABC47311)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号NP_172327)；
拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85387)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85388)；陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q9SQI3)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA54060)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC72882)；美叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABB71581)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAC19933)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAL15645)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39513)；陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD01982)；葡萄脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAN81819)；山竹脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB51525)；芥菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABI18986)；长叶马府油树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAX51637)；甘蓝型油菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABH11710)；稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY86877)；稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号NP_001068400)；稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY99617)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49269)；美国榆脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71731)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAB60830)；湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49180)；德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858)；德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858.1)；湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49179)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB717291.1)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U39834)；加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号M94159)；樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U31813)；赖特氏萼距花脂肪酰基-ACOP硫酯酶(基因库编号U56103)；以及普通种蓖麻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABS30422)。
10.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
11.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞：东方曲壳藻、阿格藻属、透明茧形藻、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线形变种、咖啡形双眉藻点纹变种、咖啡形双眉藻泰勒氏变种、咖啡形双眉藻小型变种、优美双眉藻、优美双眉藻头状变种、双眉藻属、项圈藻属、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻、波氏藻属、布朗葡萄藻、苏台德克斯葡萄藻、卡特藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、牟氏角毛藻广盐变种、角毛藻属、无硝小球藻、南极小球藻、金绿小球藻、卡氏小球藻、包囊小球藻、脱水小球藻、椭圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空腔变种、谷氏小球藻、水溪小球藻、水溪小球藻栖海岸变种、水溪小球藻增大变种、凯氏小球藻、匍扇小球藻(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻、黄绿小球藻金绿变种、黄绿小球藻淡黄变种、红藻小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、巴夫氏小球藻、嗜光小球藻、普氏小球藻、原始小球藻(包括UTEX藻株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25以及CCAP藻株211/17和
211/8d中的任一种)、原始小球藻耐酸变种、规则小球藻、规则小球藻小型变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻、嗜糖小球藻、嗜糖小球藻椭圆形变种、盐生小球藻、简单小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球形小球藻、斯蒂格小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型、普通小球藻自养变种、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种粗皮变型、普通小球藻普通变种绿色变型、黄色小球藻、左氏小球藻、他伯氏小球藻、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐藻属、隐蔽小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻、双眼杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海洋杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、比雷杜氏藻、普林莫杜氏藻、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色独球藻、独球藻属、椭圆藻属、裸藻属、伏氏藻属、克罗脆杆藻、脆杆藻属、粘球藻属、丽丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻、单针藻属、微绿球藻属、盐生微拟球藻、微拟球藻属、适意舟形藻、毕氏舟形藻、Navicula pseudotenelloides、薄膜舟形藻、嗜腐舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、普通菱形藻、分散菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、微小菱形藻椭圆变种、微小菱形藻莫纳变种、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵胞藻、极小卵胞藻、卵胞藻属、湖泊颤藻、颤藻属、亚短颤藻、嗜酸帕氏藻、巴夫藻属、扁裸藻属、席藻属、扁藻属、卡氏颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆原藻、雍滞原藻、波多黎各原藻、桑椹形原藻、饶氏原藻、塔胞藻属、桑椹藻属、囊状金藻、被甲栅藻、水绵属、钝顶螺旋藻、裂丝藻属、聚球藻属、四角藻属、四爿藻属、司西四爿藻、威氏海链藻以及Viridiella fridericiana。
12.如权利要求11所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是所述原藻属的细胞。
13.如权利要求12所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是所述桑椹形原藻属的细胞。
14.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是产油酵母细胞。
15.如权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是产油细菌细胞。
16.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是可可脂，并且其中所述外源性基因包含红花硫酯酶基因。
17.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是椰子油。
18.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是棕榈油，并且其中所述外源性基因包含油棕硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。
19.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是棕榈仁油，并且其中所述外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。
20.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是牛油树脂。
21.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是牛脂。
22.如权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是猪油，并且其中所述外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
23.一种产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％；C10:0占至少约1％；C12:0占至少约1％；C14:0占至少约2％；C16:0占至少约30％；C18:0占至少约5％；C18:1占至少约60％；C18:2占少于约7％；以及饱和脂肪酸占至少约35％。
24.如权利要求23所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞包含外源性基因，并且其中所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶任选地已失活或突变而具有较小的酶活性。
25.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油类的甘油三酯油类型态。
26.如权利要求25所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类选自由可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油组成的组。
27.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含如下的型态，在所述型态中C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约
50％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；C8:0与C10:0的组合总量少于约50％。
28.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1；
C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约7∶1；C14:0与C16:0的比率是至少约1∶2。
29.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ-12脂肪酸去饱和酶组成的组。
30.如权利要求29所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶的外源性基因。
31.如权利要求30所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶选自由以下组成的组：加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49001)；樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39473)；加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q41635)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71730)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABD83939)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD42220)；毛白杨脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABC47311)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号NP_172327)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85387)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85388)；陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q9SQI3)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA54060)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC72882)；美叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABB71581)；
披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAC19933)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAL15645)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39513)；陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD01982)；葡萄脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAN81819)；山竹脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB51525)；芥菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABI18986)；长叶马府油树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAX51637)；甘蓝型油菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABH11710)；稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY86877)；稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号NP_001068400)；稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY99617)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49269)；美国榆脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71731)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAB60830)；湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49180)；德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858)；德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858.1)；湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49179)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB717291.1)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U39834)；加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号M94159)；樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U31813)；赖特氏萼距花脂肪酰基-ACOP硫酯酶(基因库编号U56103)；以及普通种蓖麻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABS30422)。
32.如权利要求31所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
33.如权利要求32所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞：东方曲壳藻、阿格藻属、透明茧形藻、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线形变种、咖啡形双眉藻点纹变种、咖啡形双眉藻泰勒氏变种、咖啡形双眉藻小型变种、优美双眉藻、优美双眉藻头状变种、双眉藻属、项圈藻属、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻、波氏藻属、布朗葡萄藻、苏台德克斯葡萄藻、卡特藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、牟氏角毛藻广盐变种、角毛藻属、无硝小球藻、南极小球藻、金绿小球藻、卡氏小球藻、包囊小球藻、脱水小球藻、椭圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空腔变种、谷氏小球藻、水溪小球藻、水溪小球藻栖海岸变种、水溪小球藻增大变种、凯氏小球藻、匍扇小球藻(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻、黄绿小球藻金绿变种、黄绿小球藻淡黄变种、红藻小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、巴夫氏小球藻、嗜光小球藻、普氏小球藻、原始小球藻(包括UTEX藻株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25以及CCAP藻株211/17和
211/8d中的任一种)、原始小球藻耐酸变种、规则小球藻、规则小球藻小型变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻、嗜糖小球藻、嗜糖小球藻椭圆形变种、盐生小球藻、简单小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球形小球藻、斯蒂格小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型、普通小球藻自养变种、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种粗皮变型、普通小球藻普通变种绿色变型、黄色小球藻、左氏小球藻、他伯氏小球藻、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐藻属、隐蔽小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻、双眼杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海洋杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、比雷杜氏藻、普林莫杜氏藻、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色独球藻、独球藻属、椭圆藻属、裸藻属、伏氏藻属、克罗脆杆藻、脆杆藻属、粘球藻属、丽丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEXLB 2614)、微小单针藻、单针藻属、微绿球藻属、盐生微拟球藻、微拟球藻属、适意舟形藻、毕氏舟形藻、Navicula pseudotenelloides、薄膜舟形藻、嗜腐舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、普通菱形藻、分散菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、微小菱形藻椭圆变种、微小菱形藻莫纳变种、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵胞藻、极小卵胞藻、卵胞藻属、湖泊颤藻、颤藻属、亚短颤藻、嗜酸帕氏藻、巴夫藻属、扁裸藻属、席藻属、扁藻属、卡氏颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆原藻、雍滞原藻、波多黎各原藻、桑椹形原藻、饶氏原藻、塔胞藻属、桑椹藻属、囊状金藻、被甲栅藻、水绵属、钝顶螺旋藻、裂丝藻属、聚球藻属、四角藻属、四爿藻属、司西四爿藻、威氏海链藻以及Viridiella fridericiana。
34.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞是所述原藻属的细胞。
35.如权利要求34所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞是所述桑椹形原藻属的细胞。
36.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类，其中所述产油微生物细胞是产油酵母细胞。
37.如权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类，其中所述产油微生物细胞是产油细菌细胞。
38.如权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是椰子油。
39.如权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是棕榈油，并且其中所述外源性基因包含油棕硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。
40.如权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是棕榈仁油，并且其中所述外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。
41.如权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是牛油树脂。
42.如权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是牛脂。
43.如权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是猪油，并且其中所述外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
44.如权利要求23所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类组合物进一步包含选自由以下组成的组的属性：
i.少于0.3mcg/g的总类胡萝卜素；
ii.少于0.005mcg/g的番茄红素；
iii.少于0.005mcg/g的β-胡萝卜素；
iv.少于0.3mcg/g的叶绿素A；
v.少于175mcg/g的γ-生育酚；
vi.少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；
vii.少于350mcg/g的总生育三烯酚；
viii.少于0.05mcg/g的叶黄素；或
ix.少于275mcg/g的生育酚。
45.一种制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法，所述甘油三酯油类组合物具有选自由以下组成的组的脂肪酸型态：C8:0占至少约1％；C10:0占至少约1％；C12:0占至少约1％；C14:0占至少约2％；C16:0占至少约30％；C18:0占至少约5％；C18:1占至少约
60％；C18:2占少于约7％；以及饱和脂肪酸占至少约35％，所述方法包括以下步骤：
a.在培养基中培育产油微生物细胞的群体直到所述产油微生物细胞的细胞干重的至少10％是甘油三酯油类为止；以及
b.从所述产油微生物细胞中分离出所述甘油三酯油类组合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述产油微生物细胞包含外源性基因，并且其中所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶任选地已失活或突变而具有较小的酶活性。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油类的甘油三酯油类型态。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述天然存在的油类选自由可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油组成的组。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含如下型态，在所述型态中，C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；C8:0与C10:0的组合总量少于约50％。
50.如权利要求45所述的方法，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1；C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约7∶1；
以及C14:0与C16:0的比率是至少约1∶2。
51.如权利要求46所述的方法，所述内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ-12脂肪酸去饱和酶组成的组。
52.如权利要求46所述的方法，其中所述外源性基因选自由编码酰基-ACP硫酯酶的基因组成的组。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述外源性基因编码酰基-ACP硫酯酶，所述酰基-ACP硫酯酶选自由以下组成的组：加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49001)；樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39473)；加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q41635)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71730)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABD83939)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD42220)；毛白杨脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABC47311)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号NP_172327)；
拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85387)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85388)；陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q9SQI3)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA54060)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC72882)；美叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABB71581)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAC19933)；油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAL15645)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39513)；陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD01982)；葡萄脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAN81819)；山竹脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB51525)；芥菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABI18986)；长叶马府油树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAX51637)；甘蓝型油菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABH11710)；稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY86877)；稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号NP_001068400)；稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY99617)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49269)；美国榆脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71731)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAB60830)；湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49180)；德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858)；德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858.1)；湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49179)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729)；肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB717291.1)；细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U39834)；加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号M94159)；樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U31813)；赖特氏萼距花脂肪酰基-ACOP硫酯酶(基因库编号U56103)；以及普通种蓖麻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABS30422)。
54.如权利要求46所述的方法，其中所述产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
55.如权利要求46所述的方法，其中所述产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞：东方曲壳藻、阿格藻属、透明茧形藻、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线形变种、咖啡形双眉藻点纹变种、咖啡形双眉藻泰勒氏变种、咖啡形双眉藻小型变种、优美双眉藻、优美双眉藻头状变种、双眉藻属、项圈藻属、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻、波氏藻属、布朗葡萄藻、苏台德克斯葡萄藻、卡特藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、牟氏角毛藻广盐变种、角毛藻属、无硝小球藻、南极小球藻、金绿小球藻、卡氏小球藻、包囊小球藻、脱水小球藻、椭圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空腔变种、谷氏小球藻、水溪小球藻、水溪小球藻栖海岸变种、水溪小球藻增大变种、凯氏小球藻、匍扇小球藻(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻、黄绿小球藻金绿变种、黄绿小球藻淡黄变种、红藻小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、巴夫氏小球藻、嗜光小球藻、普氏小球藻、原始小球藻(包括UTEX藻株
1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25以及CCAP藻株211/17和211/8d中的任一种)、原始小球藻耐酸变种、规则小球藻、规则小球藻小型变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻、嗜糖小球藻、嗜糖小球藻椭圆形变种、盐生小球藻、简单小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球形小球藻、斯蒂格小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型、普通小球藻自养变种、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种粗皮变型、普通小球藻普通变种绿色变型、黄色小球藻、左氏小球藻、他伯氏小球藻、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐藻属、隐蔽小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻、双眼杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海洋杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、比雷杜氏藻、普林莫杜氏藻、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色独球藻、独球藻属、椭圆藻属、裸藻属、伏氏藻属、克罗脆杆藻、脆杆藻属、粘球藻属、丽丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻、单针藻属、微绿球藻属、盐生微拟球藻、微拟球藻属、适意舟形藻、毕氏舟形藻、Navicula pseudotenelloides、薄膜舟形藻、嗜腐舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、普通菱形藻、分散菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、微小菱形藻椭圆变种、微小菱形藻莫纳变种、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵胞藻、极小卵胞藻、卵胞藻属、湖泊颤藻、颤藻属、亚短颤藻、嗜酸帕氏藻、巴夫藻属、扁裸藻属、席藻属、扁藻属、卡氏颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆原藻、雍滞原藻、波多黎各原藻、桑椹形原藻、饶氏原藻、塔胞藻属、桑椹藻属、囊状金藻、被甲栅藻、水绵属、钝顶螺旋藻、裂丝藻属、聚球藻属、四角藻属、四爿藻属、司西四爿藻、威氏海链藻以及Viridiella fridericiana。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述产油微生物细胞是所述原藻属的细胞。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述产油微生物细胞是所述桑椹形原藻属的细胞。
58.如权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是椰子油。
59.如权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是棕榈油，并且其中所述外源性基因包含油棕硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。
60.如权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是棕榈仁油，并且其中所述外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。
61.如权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是牛油树脂。
62.如权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是牛脂。
63.如权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是猪油，并且其中所述外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
64.一种制造油基产品的方法，所述方法包括以下步骤：
a.对如权利要求21所述的产油微生物甘油三酯油类组合物进行选自由以下组成的组的至少一种化学反应：皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶促水解；催化水解；热压水水解；催化水解反应，其中使脂质分解成甘油和脂肪酸；产生脂肪族氮化合物的胺化反应；产生一元酸和二元酸的臭氧分解反应；甘油三酯分解反应，选自由酶促分解和压力分解组成的组；水解反应之后进行缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或同时进行脱氧反应或缩合反应；除气反应；脱氧反应，选自由氢解反应、氢化、连续氢化-氢解反应、连续氢解-氢化反应以及联合氢化-氢解反应组成的组；脱氧反应后进行缩合反应；酯化反应；酯交换反应；酯基转移反应；羟基化反应；以及羟基化反应后进行缩合反应；以及
b.分离所述反应的产物与其它组分。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述油基产品选自由肥皂、燃料、介电液体、液压液、增塑剂、润滑剂、传热流体以及金属加工液组成的组。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述油基产品是燃料产品，所述燃料产品选自由以下组成的组：
a.生物柴油；
b.可再生柴油；以及
c.喷气燃料。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述燃料产品是生物柴油，所述生物柴油具有下列一种或多种属性：
i.少于0.3mcg/g的总类胡萝卜素；
ii.少于0.005mcg/g的番茄红素；
iii.少于0.005mcg/g的β-胡萝卜素；
iv.少于0.3mcg/g的叶绿素A；
v.少于175mcg/g的γ-生育酚；
vi.少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；
vii.少于350mcg/g的总生育三烯酚；
viii.少于0.05mcg/g的叶黄素；或
ix.少于275mcg/g的生育酚。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述燃料产品是可再生柴油，所述可再生柴油的T10-T90是至少20℃、40℃或60℃。
69.如权利要求66所述的方法，其中所述燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。
由重组异养微生物生产的特制油
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求享有2010年5月28日提交的美国临时专利申请第61/349,774号、2010年8月18日提交的美国临时专利申请第
61/374,992号、2010年11月16日提交的美国临时专利申请第61/414,393号以及2010年
12月29日提交的美国临时专利申请第61/428,192号的权益。这些申请各自为了达到所有目的以引用的方式整体并入本文。
61/374,992号、2010年11月16日提交的美国临时专利申请第61/414,393号以及2010年
12月29日提交的美国临时专利申请第61/428,192号的权益。这些申请各自为了达到所有目的以引用的方式整体并入本文。
[0004] 本申请包括第1-195页所显示的序列表，在此附上所述序列表。发明领域
[0005] 本发明涉及由微生物制成的油类、燃料以及油脂化学品的生产。具体来说，本发明涉及产油微藻、对它们进行培育以生产有用的化合物(包括脂质、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇以及烷烃)的方法，以及用于对它们进行遗传学改变以提高生产效率并且改变由它们生产的油类的类型和组成的方法和试剂。
[0006] 发明背景
[0007] 化石燃料是埋藏的有机材料的可燃地质沉积物的通用术语，由腐烂的植物和动物形成，所述植物和动物通过历经数亿万年暴露于地壳中的热和压力而已经转化成原油、煤、天然气或重油。化石燃料是有限的、不可再生的资源。全球经济带来的能源需求增加还使得烃的成本压力逐渐增加。除了能源以外，很多行业，包括塑料业和化学品制造商，主要依赖于获得烃作为其制造方法的原料。对目前供给来源的具有成本效益的替代品可以帮助减轻能源和这些原材料成本的不断增加的压力。
[0008] PCT公布第2008/151149号描述了用于培育微藻以生产油类的方法和材料，并且尤其示例了由微藻原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)产生的油类生产柴油燃料。仍然需要提供在微藻中生产油类的改良型方法，特别是以较高产率和效率生产链长较短、饱和度较高并且没有色素的油类的方法。本发明满足这种需求。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供了具有独特的脂质型态的产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，并且包括表达编码如脂肪酰基-ACP硫酯酶的蛋白质的外源性基因的重组细胞。本发明还提供了由所述细胞制备脂质和油基产品(包括燃料，如生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料)的方法。
[0011] 在第一方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C8:0占至少1％或至少5％，优选地占至少3％。在一些情况下，脂质型态是C8:0占至少10％或至少15％，优选地占至少12％。在一些实施方案中，所述细胞是重组细胞。在一些情况下，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C8的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述外源性基因编码湿地萼距花(Cupheapalustris)酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，所述细胞是原藻(Prototheca)细胞。在一些情况下，所述细胞属于选自表1中所标示的微藻的微藻属或物种。
[0012] 在第二方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C10:0占至少4％。在一些情况下，脂质型态是C10:0占至少20％、至少25％或至少30％，优选地占至少24％。在一些情况下，C10:0与C12:0的比率是至少6∶1。在一些实施方案中，所述细胞是重组细胞。在一些情况下，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C10的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述外源性基因编码来自以下物种的酰基-ACP硫酯酶蛋白，所述物种选自由细叶萼距花(Cuphea hookeriana)和美国榆(Ulmus americana)组成的组。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。在一些实施方案中，所述细胞属于选自表1中所标示的微藻的微藻属或物种。
[0013] 在第三方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C12:0占至少10％或至少15％，优选地占至少13％。在一些情况下，脂质型态是C12:0占至少30％、至少35％或至少40％，优选地占至少34％。在一些情况下，C12与C14的比率是至少5∶1。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，所述重组细胞包含编码来自加州月桂(Umbellularia californica)和樟树(Cinnamomum camphora)的酰基-ACP硫酯酶蛋白的至少两种外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述细胞是原藻细胞。
[0014] 在第四方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C14:0占至少5％或至少15％，优选地占至少10％。在一些情况下，脂质型态是C14:0占至少40％、至少45％或至少50％，优选地占至少43％。在一些情况下，C14:0与C12:0的比率是至少7∶1。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白来自于选自由樟树和美国榆组成的组的物种。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。在一些实施方案中，所述细胞属于选自表1中所标示的微藻的微藻属或物种。
[0015] 在第五方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C16:0占至少10％或至少20％，优选地占至少15％。在一些情况下，脂质型态是C16:0占至少30％、至少35％或至少40％，优选地占至少37％。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码来自加州月桂和樟树的酰基-ACP硫酯酶蛋白的至少两种外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。
[0016] 在第六方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是饱和脂肪酸占至少55％或至少65％，优选地占至少60％。在一些情况下，所述细胞的脂质型态是饱和脂肪酸占至少80％、至少85％或至少90％，优选地占至少86％。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C10-C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述细胞包含编码酮酰基合酶蛋白的外源性基因。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。
[0017] 在第七方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在一些情况下，所述细胞的脂质型态是饱和脂肪酸占至少40％或至少50％，优选地占至少45％。在一些情况下，所述细胞的脂质型态是C18:0占至少15％、至少20％或至少25％，优选地占至少19％。在一些实施方案中，所述细胞包含突变型内源性去饱和酶基因，所述突变型内源性去饱和酶基因使得与野生型细胞相比C18:0脂肪酸增加到至少2倍。在一些情况下，所述微藻细胞的脂质型态是C18:2占至多1％或至多5％，优选地占至多2％。在一些实施方案中，所述微藻细胞的脂质型态是18∶1占至多5％或至多10％，优选地占至多7％。
[0018] 在本文所述的重组细胞的一些实施方案中，所述细胞包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。
[0019] 在第八方面，本发明提供了一种制备脂质的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)培育如上文所述的细胞直到所述细胞中以干重计脂质占至少15％或至少25％，优选地占至少20％为止，以及(b)将脂质与水溶性生物质组分分离。
[0020] 在第九方面，本发明提供了另一种制备脂质的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)培育产油微生物细胞，优选地培育微藻细胞，所述细胞含有编码两种不同的酰基-ACP硫酯酶的外源性基因，其中所述细胞的脂质型态不同于(i)不含所述外源性基因的细胞的型态和(ii)仅含一种外源性基因的细胞的型态，以及(b)将脂质与水溶性生物质组分分离。在一些情况下，至少一种外源性基因编码选自由表4中所标示的硫酯酶组成的组的脂肪酰基-ACP硫酯酶。
[0021] 在第十方面，本发明提供了一种制备油基产品的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)培育如上文所述的细胞直到所述细胞中以干重计脂质占至少5％或至少15％，优选地占至少10％为止，(b)将脂质与水溶性生物质组分分离，以及(c)对脂质进行选自由以下组成的组的至少一种化学反应：皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶促水解；催化水解；热压水水解；催化水解反应，其中使脂质分解成甘油和脂肪酸；产生脂肪族氮化合物的胺化反应；产生一元酸和二元酸的臭氧分解反应；甘油三酯分解反应，选自由酶促分解和压力分解组成的组；水解反应之后进行缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或同时进行脱氧反应或缩合反应；除气反应；脱氧反应，选自由氢解反应、氢化、连续氢化-氢解反应、连续氢解-氢化反应以及联合氢化-氢解反应组成的组；脱氧反应后进行缩合反应；酯化反应；酯交换反应；酯基转移反应；羟基化反应；以及羟基化反应后进行缩合反应，借以生产油基产品。
[0022] 在一些情况下，所述油基产品选自肥皂或燃料产品。在一些实施方案中，所述油基产品是选自由生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料所组成的组的燃料产品。在一些情况下，所述燃料产品是具有一种或多种下列属性的生物柴油：(i)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选0.05mcg/g-0.244mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的番茄红素；(iii)少于0.01mcg/g、少于
0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的β-胡萝卜素；(iv)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优 选0.045mcg/g-0.268mcg/g的 叶 绿 素A；(v)1mcg/g-500mcg/g、35mcg/g-175mcg/g，优选38.3mcg/g-164mcg/g的γ-生育酚；(vi)少于1％、少于0.5％，优选少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g，优选249.6mcg/g-325.3mcg/g的总生育三烯酚；(viii)0.001mcg/g-0.1mcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g，优 选0.003mcg/g-0.039mcg/g的 叶 黄 素；或 (ix)10mcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g，优选60.8mcg/g-261.7mcg/g的生育酚。在一些情况下，燃料产品是T10-T90为至少20℃、40℃或60℃的可再生柴油。在一些情况下，燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。
0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的β-胡萝卜素；(iv)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优 选0.045mcg/g-0.268mcg/g的 叶 绿 素A；(v)1mcg/g-500mcg/g、35mcg/g-175mcg/g，优选38.3mcg/g-164mcg/g的γ-生育酚；(vi)少于1％、少于0.5％，优选少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g，优选249.6mcg/g-325.3mcg/g的总生育三烯酚；(viii)0.001mcg/g-0.1mcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g，优 选0.003mcg/g-0.039mcg/g的 叶 黄 素；或 (ix)10mcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g，优选60.8mcg/g-261.7mcg/g的生育酚。在一些情况下，燃料产品是T10-T90为至少20℃、40℃或60℃的可再生柴油。在一些情况下，燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。
[0023] 在第十一方面，本发明提供了一种甘油三酯油类，所述甘油三酯油类包含(a)C8:0占至少3％、C10:0占至少4％、C12:0占至少13％、C14:0占至少10％和/或饱和脂肪酸占至少60％的脂质型态，以及(b)一种或多种下列属性：(i)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选0.05mcg/g-0.244mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的番茄红素；(iii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的β-胡萝卜素；(iv)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选0.045mcg/g-0.268mcg/g的叶绿素A；(v)1mcg/g-300mcg/g、35mcg/g-175mcg/g，优选38.3mcg/g-164mcg/g的γ-生育酚；(vi)少于1％、少于0.5％，优选少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g，优选249.6mcg/g-325.3mcg/g的总生育三烯酚；(viii)0.001mcg/g-0.1mcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g，优选0.003mcg/g-0.039mcg/g的叶黄素；或(ix)10mcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g，优选60.8mcg/g-261.7mcg/g的生育酚。
[0024] 在第十二方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自C8∶C10脂肪酸比率是至少5∶1的微藻。在一相关方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自具有至少50％至75％，优选至少60％的饱和脂肪酸的微藻。在另一相关方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自C16∶14脂肪酸比率是约2∶1的微藻。在再另一相关方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自C12∶C14脂肪酸比率是至少5∶1的微藻。在一些实施方案中，所述微藻含有至少一种外源性基因。在一些情况下，所述微藻属于原藻属。
[0025] 在第十三方面，本发明提供了一种甘油三酯油类，所述甘油三酯油类包含(a)如下的脂质型态：＜C12占少于5％或少于2％，优选地占少于1％；C14:0占1％-10％之间，优选地占2％-7％之间；C16:0占20％-35％之间，优选地占23％-30％之间；C18:0占5％-20％之间，优选地占7％-15％之间；C18:1占35％-60％之间，优选地占40％-55％之间；以及C18:2脂肪酸占1％-20％之间，优选地占2％-15％之间；以及(b)一种或多种下列属性：(i)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选0.05mcg/g-0.244mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的番茄红素；(iii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选少于0.003mcg/g的β-胡萝卜素；(iv)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选0.045mcg/g-0.268mcg/g的叶绿素A；(v)1mcg/g-300mcg/g、35mcg/g-175mcg/g，优选38.3mcg/g-164mcg/g的γ-生育酚；(vi)少于1％、少于0.5％，优选少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾 醇；(vii)100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g，优 选249.6mcg/g-325.3mcg/g 的总生育三烯酚；(viii)0.001mcg/g-0.1mcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g，优选0.003mcg/g-0.039mcg/g的叶黄素；或(ix)10mcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g，优选60.8mcg/g-261.7mcg/g的生育酚。
[0026] 在一些情况下，甘油三酯油类是从包含一种或多种外源性基因的微生物中分离的。在一些实施方案中，一种或多种外源性基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶针对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述微生物进一步包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。
[0027] 在第十四方面，本发明提供了一种制备甘油三酯油类的方法，所述甘油三酯油类包含如下的脂质型态：＜C12占少于5％或少于2％，优选地占少于1％；C14:0占1％-10％之间，优选地占2％-7％之间；C16:0占20％-35％之间，优选地占23％-30％之间；C18:0占5％-20％之间，优选地占7％-15％之间；C18:1占35％-60％之间，优选地占40％-55％之间；以及C18:2脂肪酸占1％-20％之间，优选地占2％-15％之间，其中从包含一种或多种外源性基因的微生物中分离出所述甘油三酯油类。在一些情况下，所述甘油三酯油类包含如下的脂质型态：C14:0占1％-10％，优选地占3％-5％；C16:0占20％-30％，优选地占25％-27％；C18:0占5％-20％，优选地占10％-15％；以及C18:1占35％-50％，优选地占40％-45％。在一些实施方案中，一种或多种外源性基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶针对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，所述微生物进一步包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在一些情况下，一种或多种外源性基因是蔗糖转化酶。在一些实施方案中，所述突变型内源性去饱和酶基因是硬脂酰基-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)(例如SEQ ID NO：199-200)。在一些实施方案中，所述突变型内源性去饱和酶基因是脂肪酸去饱和酶(FAD)。
[0028] 在第十五方面，本发明提供了一种产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞包含甘油三酯油类，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％；C10:0占至少约1％；C12:0占至少约1％；C14:0占至少约2％；C16:0占至少约30％；C18:0占至少约5％；C18:1占至少约60％；C18:2占少于约7％；以及饱和脂肪酸占至少约35％。在一些情况下，产油微生物细胞包含外源性基因，并且任选地包含所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶，所述内源性去饱和酶已失活或突变而具有较小的酶活性。
[0029] 在一些情况下，甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油的脂肪酸型态。在一些情况下，天然存在的油选自由以下组成的组：可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油。在一些情况下，甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的型态：C8:0与C10:0的组合总量是至少约10％；C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％；以及C18:1与C18:2的组合总量少于约30％。在一些情况下，甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1；C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约7∶1；以及C14:0与C16:0的比率是至少约1∶2。
[0030] 在一些情况下，内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ-12脂肪酸去饱和酶组成的组。在一些情况下，外源性基因选自由编码酰基-ACP硫酯酶的基因组成的组。在一些情况下，外源性基因编码选自由表4中所标示的那些酰基-ACP硫酯酶组成的组的酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
[0031] 在各种实施方案中，产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞：东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格藻属(Agmenellum)、透明茧形藻(Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻(Amphoracoffeiformis)、咖啡形双眉藻线形变种(Amphora coffeiformis linea)、咖啡形双眉藻点纹变种(Amphora coffeiformis punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(Amphora coffeiformis taylori)、咖啡形双眉藻小型变种(Amphora coffeiformis tenuis)、优美双眉藻(Amphora delicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphora delicatissima capitata)、双眉藻属(Amphora sp.)、项圈藻属(Anabaena)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、镰形纤维藻(Ankistrodesmus falcatus)、黄金色藻(Boekelovia hooglandii)、波氏藻属(Borodinella sp.)、布朗葡萄藻
(Botryococcus braunii)、苏台德克斯葡萄藻(Botryococcus sudeticus)、卡特藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟氏角毛藻广盐变种(Chaetoceros muelleri subsalsum)、角毛藻属(Chaetoceros sp.)、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极小球藻(Chlorella Antarctica)、金绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、卡氏小球藻(Chlorella candida)、包囊小球藻(Chlorella capsulate)、脱水小球藻(Chlorella desiccate)、椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、淡褐小球藻(Chlorella fusca)、淡褐小球藻空腔变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、谷氏小球藻(Chlorella
glucotropha)、水溪小球藻(Chlorellainfusionum)、水溪小球藻栖海岸变种(Chlorella infusionum var.actophila)、水溪小球藻增大变种(Chlorella infusionum var.
auxenophila)、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、匍扇小球藻(Chlorellalobophora)(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻(Chlorella luteoviridis)、黄绿小球藻金绿变种
(Chlorella luteoviridis var.aureoviridis)、黄绿小球藻淡黄变 种(Chlorella luteoviridis var.lutescens)、红藻小球藻(Chlorellaminiata)、极微小球藻(Chlorella minutissima)、突变小球藻(Chlorellamutabilis)、夜间小球藻(Chlorella nocturna)、巴夫氏小球藻(Chlorellaparva)、嗜光小球藻(Chlorella photophila)、普氏小球藻(Chlorellapringsheimii)、原始小球藻(Chlorella protothecoides)(包括UTEX藻
株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25以 及CCAP藻 株211/17 和211/8d中 的任一种)、原始小球藻耐酸变种(Chlorellaprotothecoides var.acidicola)、规则
小球藻(Chlorella regularis)、规则小球藻小型变种(Chlorella regularis var.
minima)、规则小球藻伞状变种(Chlorella regularis var.umbricata)、瑞氏小球
藻(Chlorella reisiglii)、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、嗜糖小球藻
椭圆形变种(Chlorellasaccharophila var.ellipsoidea)、盐生小球藻(Chlorella salina)、简单小球藻(Chlorella simplex)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻属(Chlorella sp.)、球形小球藻(Chlorella sphaerica)、斯蒂格小球藻
(Chlorella stigmatophora)、万尼 氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小 球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型(Chlorellavulgaris f.tertia)、普通小球藻自养变种(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris)、普通小球藻普通变种粗皮变型(Chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia)、普通小球藻普通变种绿色变型(Chlorella vulgaris var.
vulgaris f.viridis)、黄色小球藻(Chlorella xanthella)、左氏小球藻(Chlorella zofingiensis)、他伯氏小球藻(Chlorella trebouxioides)、普通小球藻、水溪绿球藻(Chlorococcuminfusionum)、绿球藻属(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝 隐 藻 属 (Chroomonas sp.)、金 球 藻 属 (Chrysosphaera sp.)、球 钙 板 藻 属(Cricosphaera sp.)、隐藻属(Cryptomonas sp.)、隐蔽小环藻(Cyclotellacryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属(Cyclotellasp.)、杜氏藻属
(Dunaliella sp.)、拜尔代维勒杜氏藻(Dunaliellabardawil)、双眼杜氏藻(Dunaliella bioculata)、颗 粒 状 杜 氏 藻(Dunaliellagranulate)、海 洋 杜 氏 藻 (Dunaliella maritime)、微小杜氏藻(Dunaliellaminuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、比雷杜氏藻 (Dunaliellapeircei)、普林莫 杜氏藻(Dunaliella primolecta)、盐 生杜氏藻(Dunaliellasalina)、陆生杜氏藻(Dunaliella terricola)、特氏杜氏藻
(Dunaliellatertiolecta)、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、特氏杜氏藻、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属(Eremosphaera sp.)、椭圆藻属(Ellipsoidon sp.)、裸藻属(Euglena)、伏氏藻属(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属(Fragilaria sp.)、粘球藻属(Gleocapsa sp.)、丽丝藻属(Gloeothamnion sp.)、膜胞藻属(Hymenomonas sp.)、等鞭金藻球亲近种(Isochrysis aff.galbana)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属(Monoraphidium sp.)、微绿球藻属(Nannochloris sp.)、盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)、微拟球藻属(Nannochloropsis sp.)、适意舟形藻(Navicula acceptata)、毕氏舟形藻(Navicula biskanterae)、Navicula pseudotenelloides、薄膜 舟 形藻 (Navicula pelliculosa)、嗜腐舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属(Navicula sp.)、肾鞭藻属(Nephrochloris sp.)、肾藻属(Nephroselmis sp.)、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚 历山 大菱 形 藻(Nitzschiaalexandrina)、普 通菱 形藻 (Nitzschia communis)、分散菱形藻(Nitzschiadissipata)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschiahantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschia inconspicua)、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschia microcephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、微小菱形藻椭圆变种(Nitzschia pusilla elliptica)、微小菱形藻莫纳变种(Nitzschia pusilla monoensis)、四边形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、棕鞭藻属(Ochromonas sp.)、小卵胞藻(Oocystis parva)、极小卵胞藻(Oocystispusilla)、卵胞藻属(Oocystis sp.)、湖泊颤藻(Oscillatoria limnetica)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、亚短颤藻(Oscillatoria subbrevis)、嗜酸帕氏藻(Pascheria acidophila)、巴夫藻属(Pavlova sp.)、扁裸藻属(Phagus)、席藻属(Phormidium)、扁藻属(Platymonas sp.)、卡氏颗石藻(Pleurochrysiscarterae)、齿状颗石藻(Pleurochrysis dentate)、颗石藻属(Pleurochrysissp.)、威克海姆
原藻 (Prototheca wickerhamii)、雍 滞原 藻(Protothecastagnora)、波 多黎 各 原藻(Prototheca portoricensis)、桑椹形原藻(Prototheca moriformis)、饶氏原藻(Prototheca zopfii)、塔胞藻属(Pyramimonas sp.)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、囊状金藻(Sarcinoidchrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、裂丝藻属(Stichococcus sp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属(Tetraselmissp.)、司西四爿藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)以及Viridiella fridericiana。
(Botryococcus braunii)、苏台德克斯葡萄藻(Botryococcus sudeticus)、卡特藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟氏角毛藻广盐变种(Chaetoceros muelleri subsalsum)、角毛藻属(Chaetoceros sp.)、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极小球藻(Chlorella Antarctica)、金绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、卡氏小球藻(Chlorella candida)、包囊小球藻(Chlorella capsulate)、脱水小球藻(Chlorella desiccate)、椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、淡褐小球藻(Chlorella fusca)、淡褐小球藻空腔变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、谷氏小球藻(Chlorella
glucotropha)、水溪小球藻(Chlorellainfusionum)、水溪小球藻栖海岸变种(Chlorella infusionum var.actophila)、水溪小球藻增大变种(Chlorella infusionum var.
auxenophila)、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、匍扇小球藻(Chlorellalobophora)(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻(Chlorella luteoviridis)、黄绿小球藻金绿变种
(Chlorella luteoviridis var.aureoviridis)、黄绿小球藻淡黄变 种(Chlorella luteoviridis var.lutescens)、红藻小球藻(Chlorellaminiata)、极微小球藻(Chlorella minutissima)、突变小球藻(Chlorellamutabilis)、夜间小球藻(Chlorella nocturna)、巴夫氏小球藻(Chlorellaparva)、嗜光小球藻(Chlorella photophila)、普氏小球藻(Chlorellapringsheimii)、原始小球藻(Chlorella protothecoides)(包括UTEX藻
株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25以 及CCAP藻 株211/17 和211/8d中 的任一种)、原始小球藻耐酸变种(Chlorellaprotothecoides var.acidicola)、规则
小球藻(Chlorella regularis)、规则小球藻小型变种(Chlorella regularis var.
minima)、规则小球藻伞状变种(Chlorella regularis var.umbricata)、瑞氏小球
藻(Chlorella reisiglii)、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、嗜糖小球藻
椭圆形变种(Chlorellasaccharophila var.ellipsoidea)、盐生小球藻(Chlorella salina)、简单小球藻(Chlorella simplex)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻属(Chlorella sp.)、球形小球藻(Chlorella sphaerica)、斯蒂格小球藻
(Chlorella stigmatophora)、万尼 氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小 球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型(Chlorellavulgaris f.tertia)、普通小球藻自养变种(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris)、普通小球藻普通变种粗皮变型(Chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia)、普通小球藻普通变种绿色变型(Chlorella vulgaris var.
vulgaris f.viridis)、黄色小球藻(Chlorella xanthella)、左氏小球藻(Chlorella zofingiensis)、他伯氏小球藻(Chlorella trebouxioides)、普通小球藻、水溪绿球藻(Chlorococcuminfusionum)、绿球藻属(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝 隐 藻 属 (Chroomonas sp.)、金 球 藻 属 (Chrysosphaera sp.)、球 钙 板 藻 属(Cricosphaera sp.)、隐藻属(Cryptomonas sp.)、隐蔽小环藻(Cyclotellacryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属(Cyclotellasp.)、杜氏藻属
(Dunaliella sp.)、拜尔代维勒杜氏藻(Dunaliellabardawil)、双眼杜氏藻(Dunaliella bioculata)、颗 粒 状 杜 氏 藻(Dunaliellagranulate)、海 洋 杜 氏 藻 (Dunaliella maritime)、微小杜氏藻(Dunaliellaminuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、比雷杜氏藻 (Dunaliellapeircei)、普林莫 杜氏藻(Dunaliella primolecta)、盐 生杜氏藻(Dunaliellasalina)、陆生杜氏藻(Dunaliella terricola)、特氏杜氏藻
(Dunaliellatertiolecta)、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、特氏杜氏藻、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属(Eremosphaera sp.)、椭圆藻属(Ellipsoidon sp.)、裸藻属(Euglena)、伏氏藻属(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属(Fragilaria sp.)、粘球藻属(Gleocapsa sp.)、丽丝藻属(Gloeothamnion sp.)、膜胞藻属(Hymenomonas sp.)、等鞭金藻球亲近种(Isochrysis aff.galbana)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属(Monoraphidium sp.)、微绿球藻属(Nannochloris sp.)、盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)、微拟球藻属(Nannochloropsis sp.)、适意舟形藻(Navicula acceptata)、毕氏舟形藻(Navicula biskanterae)、Navicula pseudotenelloides、薄膜 舟 形藻 (Navicula pelliculosa)、嗜腐舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属(Navicula sp.)、肾鞭藻属(Nephrochloris sp.)、肾藻属(Nephroselmis sp.)、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚 历山 大菱 形 藻(Nitzschiaalexandrina)、普 通菱 形藻 (Nitzschia communis)、分散菱形藻(Nitzschiadissipata)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschiahantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschia inconspicua)、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschia microcephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、微小菱形藻椭圆变种(Nitzschia pusilla elliptica)、微小菱形藻莫纳变种(Nitzschia pusilla monoensis)、四边形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、棕鞭藻属(Ochromonas sp.)、小卵胞藻(Oocystis parva)、极小卵胞藻(Oocystispusilla)、卵胞藻属(Oocystis sp.)、湖泊颤藻(Oscillatoria limnetica)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、亚短颤藻(Oscillatoria subbrevis)、嗜酸帕氏藻(Pascheria acidophila)、巴夫藻属(Pavlova sp.)、扁裸藻属(Phagus)、席藻属(Phormidium)、扁藻属(Platymonas sp.)、卡氏颗石藻(Pleurochrysiscarterae)、齿状颗石藻(Pleurochrysis dentate)、颗石藻属(Pleurochrysissp.)、威克海姆
原藻 (Prototheca wickerhamii)、雍 滞原 藻(Protothecastagnora)、波 多黎 各 原藻(Prototheca portoricensis)、桑椹形原藻(Prototheca moriformis)、饶氏原藻(Prototheca zopfii)、塔胞藻属(Pyramimonas sp.)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、囊状金藻(Sarcinoidchrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、裂丝藻属(Stichococcus sp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属(Tetraselmissp.)、司西四爿藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)以及Viridiella fridericiana。
[0032] 在一些情况下，所述产油微生物细胞是原藻属的细胞。在一些情况下，所述产油微生物细胞是桑椹形原藻属的细胞。
[0033] 在一些情况下，所述产油微生物细胞是产油酵母细胞。在一些情况下，所述产油微生物细胞是产油细菌细胞。
[0034] 在一些情况下，天然存在的油是可可脂并且外源性基因包含红花(Carthamus tinctorus)硫酯酶基因。在一些情况下，天然存在的油是椰子油。在一些情况下，天然存在的油是棕榈油并且外源性基因包含油棕(Elaeis guiniensis)硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花(Cuphea wrightii)FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。在一些情况下，天然存在的油是棕榈仁油并且外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。在一些情况下，天然存在的油是牛油树脂。在一些情况下，天然存在的油是牛脂。在一些情况下，天然存在的油是猪油，并且外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹(Garcinia mangostana)硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜(Brassica napus)硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
[0035] 在第十六方面，本发明提供了一种产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％；C10:0占至少约1％；C12:0占至少约1％；C14:0占至少约2％；C16:0占至少约30％；C18:0占至少约5％；C18:1占至少约60％；C18:2占少于约7％；以及饱和脂肪酸占至少约35％。在各种实施方案中，通过在培养基中培育产油微生物细胞或重组产油微生物细胞群体来制备甘油三酯油类组合物，其中产油微生物细胞如上文所述，尤其是上文关于本发明的第十五方面所述的那些细胞。
[0036] 在一些情况下，产油微生物甘油三酯油类组合物进一步包含选自由以下组成的组的属性：(i)少于0.3mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g的番茄红素；(iii)少于0.005mcg/g的β-胡萝卜素；(iv)少于0.3mcg/g的叶绿素A；(v)少于175mcg/g的γ-生育酚；(vi)少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)少于
350mcg/g的总生育三烯酚；(viii)少于0.05mcg/g的叶黄素；或(ix)少于275mcg/g的生育酚。
350mcg/g的总生育三烯酚；(viii)少于0.05mcg/g的叶黄素；或(ix)少于275mcg/g的生育酚。
[0037] 在第十七方面，本发明提供了一种制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法，所述组合物的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％；C10:0占至少约1％；C12:0占至少约1％；C14:0占至少约2％；C16:0占至少约30％；C18:0占至少约5％；C18:1占至少约60％；C18:2占少于约7％；以及饱和脂肪酸占至少约35％，其中所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培育产油微生物细胞的群体直到所述产油微生物细胞的细胞干重的至少10％是甘油三酯油类为止；以及(b)从产油微生物细胞中分离出甘油三酯油类组合物。在各种实施方案中，经由培育如上文所述的产油微生物细胞或重组产油微生物细胞(尤其是上文关于本发明的第十五方面所述的那些细胞)群体来制备甘油三酯油类组合物。
[0038] 在第十八方面，本发明提供了一种制备油基产品的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)对如上文关于本发明的第十六方面所述的产油微生物甘油三酯油类组合物进行选自由以下组成的组的至少一种化学反应：皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶促水解；催化水解；热压水水解；催化水解反应，其中使脂质分解成甘油和脂肪酸；产生脂肪族氮化合物的胺化反应；产生一元酸和二元酸的臭氧分解反应；甘油三酯分解反应，选自由酶促分解和压力分解组成的组；水解反应之后进行缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或同时进行脱氧反应或缩合反应；除气反应；脱氧反应，选自由氢解反应、氢化、连续氢化-氢解反应、连续氢解-氢化反应以及联合氢化-氢解反应组成的组；脱氧反应后进行缩合反应；酯化反应；酯交换反应；酯基转移反应；羟基化反应；以及羟基化反应后进行缩合反应；以及(b)将反应产物与其它组分分离。
[0039] 在一些情况下，所述油基产品选自由肥皂、燃料、介电液体、液压液、增塑剂、润滑剂、传热流体以及金属加工液组成的组。在一些情况下，所述油基产品是选自由以下组成的组的燃料产品：(a)生物柴油；(b)可再生柴油；以及(c)喷气燃料。
[0040] 在一些情况下，所述燃料产品是具有一种或多种下列属性的生物柴油：(i)少于0.3mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g的番茄红素；(iii)少于0.005mcg/g的β-胡萝卜素；(iv)少于0.3mcg/g的叶绿素A；(v)少于175mcg/g的γ-生育酚；(vi)少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)少于350mcg/g的总生育三烯酚；(viii)少于0.05mcg/g的叶黄素；或(ix)少于275mcg/g的生育酚。
[0041] 在一些情况下，燃料产品是T10-T90为至少20℃、40℃或60℃的可再生柴油。
[0042] 在一些情况下，燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。
[0043] 本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。
[0044] 附图简述
[0045] 图1示出了由原藻甘油三酯油类生产的可再生柴油的色谱图。
[0046] 发明详述
[0047] 本发明因发现原藻和某些相关微生物出乎意料地具有可用于以低成本并且大量地生产油类、燃料以及其它烃类或脂质组合物的有利特性以及发现用于对这些微生物进行遗传学改变以改良这些特性的方法和试剂而产生。由这些微生物产生的油类可以被用于运输燃料、油脂化学品和/或食品和化妆品工业以及其它应用中。对脂质进行转酯基作用会产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。其它酶促和化学方法可适合于产生脂肪酸、醛、醇、烷烃以及烯烃。在一些应用中，生产可再生柴油、喷气燃料或其它烃类化合物。本发明还提供了培育微藻的方法，用以提高产量和提高脂质产率，和/或更具成本效益地生产本文所述的组合物。
[0048] 为了便于阅读，此发明详述被分为几个部分。第I部分提供了本文所用的术语的定义。第II部分描述了本发明方法中使用的培养条件。第III部分描述了遗传工程改造的方法和材料。第IV部分描述了对微生物(例如原藻)进行遗传工程改造以使其能够利用蔗糖。第V部分描述了对微生物(例如原藻)进行遗传工程改造以调节脂质生物合成。第VI部分描述了制备燃料和化学品的方法。第VII部分公开了本发明的实施例和实施方案。发明详述后面是说明本发明的各个方面和实施方案的实施例。
[0049] I.定义
[0050] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义。下列参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等，Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology(1994年第2版)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker编著，1988)；TheGlossary of Genetics，第5版，R.Rieger等(编著)，Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有说明，否则本文所用的下列术语具有归属于它们的含义。
[0051] “在微藻中具有活性”是指在微藻中具有功能的核酸。举例来说，已被用于驱动抗生素抗性基因赋予转基因微藻以抗生素抗性的启动子在微藻中具有活性。
[0052] “酰基载体蛋白”或“ACP”是一种如下的蛋白质，所述蛋白质在脂肪酸合成期间在4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的末端硫醇上与正在增长的酰基链以硫醇酯形式结合并且包含脂肪酸合酶复合物的组分。
[0053] “酰基-辅酶A分子”或“酰基-辅酶A”是一种如下的分子，所述分子包含在辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的末端硫醇上经由硫醇酯键与辅酶A共价连接的酰基部分。
[0054] “面积百分比”是指利用FAME GC/FID检测方法所观测到的峰面积，在所述检测方法中，在检测前将样品中的每个脂肪酸均转化成脂肪酸甲酯(FAME)。举例来说，与其它任何脂肪酸(如C14:1)相比，对于具有14个碳原子而无不饱和的脂肪酸(C14:0)观测到单独的峰。各类FAME的峰面积与它在混合物中所占的组成百分比是成正比的，并且是基于样品中存在的所有峰的总和来计算(即[特异峰的面积/所有测量到的峰的总面积]×100)。当提及本发明的油类和细胞的脂质型态时，“C8-C14占至少4％”意思是细胞中或所提取的甘油脂组合物中总脂肪酸的至少4％具有包括8个、10个、12个或14个碳原子的链长。
[0057] “生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可能含有细胞和/或细胞内内含物以及细胞外物质，包括但不限于由细胞分泌的化合物。
[0058] “生物反应器”是一种当中任选地以悬浮液形式培养细胞的封闭罩或局部封闭罩。
[0059] “催化剂”是一种试剂，如分子或大分子复合物，它能够促成或促进使反应物形成产物的化学反应而不会成为产物的一部分。催化剂可提高反应速率，之后催化剂可能作用于另一反应物以形成产物。催化剂一般使反应所需的总活化能降低，以使反应更快地或在更低的温度下进行。因此，可能更快速地达到反应平衡。催化剂的实例包括酶，它是生物催化剂；热，它是非生物催化剂；以及用于石油提炼过程中的金属。
[0060] “纤维素物质”是纤维素的消化产物，包括葡萄糖和木糖，以及任选地另外的化合物，如二糖、寡糖、木质素、糠醛以及其它化合物。纤维素物质的来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜废粕、玉米秸、木材碎片、锯末以及柳枝稷。
[0061] “共培养”和其变体，如“共培育”和“共发酵”指的是在同一生物反应器中存在两种或更多种类型的细胞。两种或更多种类型的细胞可能均是微生物，如微藻，或可能是微藻细胞与不同的细胞类型一起培养。培养条件可以是促进两种或更多种类型的细胞生长和/或繁殖的条件，或是促成两种或更多种细胞中的一种或子集生长和/或繁殖，同时维持其余细胞生长的条件。
[0062] “辅因子”是除底物以外的为酶发挥其酶活性所需的任何分子。
[0063] “互补DNA”或“cDNA”是mRNA的DNA拷贝，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或扩增(例如经由聚合酶链式反应(“PCR”))获得。
[0064] “培育”和其变体，如“培养”和“发酵”是指通过使用所选和/或控制的条件有意地促进一种或多种细胞生长(细胞大小、细胞内含物和/或细胞活性增加)和/或繁殖(经由有丝分裂使细胞数目增加)。生长与繁殖的组合可以被称作增殖。所选和/或控制的条件的实例包括利用限定性培养基(具有已知特征，如pH值、离子浓度以及碳源)、指定温度、氧压、二氧化碳水平以及在生物反应器中生长。培育并不指微生物在自然界中或者在无人为干预的情况下的生长或繁殖；例如，有机体自然生长而最终变成化石从而产生地质原油的过程并不是培育。
[0065] “细胞溶解”是细胞在低渗环境中的溶解。细胞溶解是由过度渗透或水向细胞内侧运动(水分过多)引起。细胞不能承受内侧水的渗透压，且因此发生破裂。
[0066] “脱脂粉(Delipidated meal)”和“脱脂的微生物生物质”是当中油类(包括脂质)已被提取或分离出以后的微生物生物质，所述提取或分离是经由使用机械方式(即通过压榨机实施)或溶剂提取法或同时使用这两种方式来实现的。与从微生物生物质中提取或分离油类/脂质之前相比，脱脂粉中的油类/脂质的量减少，但含有一些残留的油类/脂质。
[0067] “表达载体”或“表达构建体”或“质粒”或“重组DNA构建体”是指经由人为干预(包括通过重组手段或直接化学合成)产生的核酸，其中一系列指定的核酸元件使得特定核酸能够在宿主细胞中转录和/或翻译。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。表达载体通常包括有待转录的核酸，它与启动子可操作地连接。
[0068] “外源性基因”是被引入(“转化”)到细胞中并且进行编码以使RNA和/或蛋白质表达的核酸。经过转化的细胞可以被称为重组细胞，其中可能引入有另外的外源性基因。相对于所转化的细胞，外源性基因可能来自于不同的物种(且因此是异源的)，或来自于相同的物种(且因此是同源的)。因此，外源性基因可以包括相对于基因的内源性拷贝占据细胞基因组中不同位置或处于不同控制下的同源基因。外源性基因在细胞中可以存在超过一个拷贝。外源性基因可以作为基因组中的插入物或作为游离型分子维持于细胞中。
[0069] “外源性提供”是指向细胞培养物的培养基中提供的分子。
[0070] “压榨”是从原材料(如大豆和油菜籽)中提取油类的一种机械方法。压榨机是一种螺旋型机器，它经由笼状桶样空腔压制材料。原材料进入压榨机的一侧，并且废滤饼从另一侧排出，而油类从罐笼的笼条之间漏出并且被收集。所述机器利用由螺杆驱动产生的摩擦力和持续压力来移动并且压缩原材料。油类通过不允许固体通过的小开口漏出。由于原材料受到压制，所以摩擦力通常使它变热。
[0071] “脂肪酰基-ACP硫酯酶”是在脂质合成期间催化脂肪酸从酰基载体蛋白(ACP)上裂解的酶。
[0072] “脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶”是催化酰基-辅酶A分子还原成伯醇的酶。
[0073] “脂肪酰基-辅酶A还原酶”是催化酰基-辅酶A分子还原成醛的酶。
[0074] “脂肪醛脱羰基酶”是催化脂肪醛转化成烷烃的酶。
[0075] “脂肪醛还原酶”是催化醛还原成伯醇的酶。
[0076] “固定碳源”是一种含碳分子，通常是有机分子，它在环境温度和压力下以固体或液体形式存在于培养基中并且可以由培养于培养基中的微生物所利用。
[0077] “匀浆”是被物理破坏的生物质。
[0078] “烃”是仅含有氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成与氢原子连接的直链、支链、环状或部分环状的主链。烃类化合物的分子结构从最简单的甲烷(CH4)(天然气的成分)形式到非常大并且非常复杂的结构(如在原油、石油以及沥青中发现的一些分子，如沥青质)不等。烃可以呈气态、液态或固态形式，或这些形式的任何组合，并且在主链中相邻的碳原子之间可具有一个或多个双键或三键。因此，所述术语包括直链、支链、环状或部分环状的烷烃、烯烃、脂质以及石蜡。实例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷以及角鲨烯。
[0079] “氢∶碳比”是分子中以各原子为基础的氢原子与碳原子的比率。所述比率可以被用于指烃分子中碳原子和氢原子的数目。举例来说，具有最高比率的烃是甲烷CH4(4∶1)。
[0080] “疏水性组分”是物质中在疏水相中的可溶性比在水相中高的部分或组分。疏水性组分大致上不溶于水并且通常具非极性。
[0081] “脂质产率增加”是指微生物培养物的产量增加，例如通过增加每升培养物的细胞干重、增加形成脂质的细胞的百分比或增加每单位时间每升培养物体积的脂质总量。
[0082] “诱导型启动子”是回应于特定的刺激物而介导可操作连接的基因进行转录的启动子。所述启动子的实例可能是在改变pH值或氮水平的条件下所诱导的启动子序列。
[0083] “可操作连接”是两个核酸序列之间的功能性连接，所述核酸序列如控制序列(通常是启动子)和所连接序列(通常是编码蛋白质的序列，也被称为编码序列)。如果启动子可以介导外源性基因转录，那么所述启动子与所述外源性基因是可操作连接的。
[0084] “原位”意思是“在适当位置上”或“在其原始位置上”。
[0085] “营养素的限制性浓度”是培养物中的化合物限制所培养的有机体繁殖的浓度。“营养素的非限制性浓度”是在给定的培养时间内支持最大程度繁殖的浓度。因此，在限制性浓度的营养素存在下在给定的培养时间内产生的细胞数低于在所述营养素不具限制性时的细胞数。当存在的营养素的浓度大于支持最大程度繁殖的浓度时，所述营养素被称为在培养物中“过量”。
[0086] “脂酶”是一种水溶性酶，它催化不溶于水的脂质底物的酯键水解。脂酶催化脂质水解成甘油和脂肪酸。
[0087] “脂质修饰酶”是指一种改变脂质共价结构的酶。脂质修饰酶的实例包括脂酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、去饱和酶(包括硬脂酰基酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)和脂肪酰基去饱和酶(FAD))以及脂肪醛脱羰基酶。
[0088] “脂质通路酶”是在脂质代谢(即脂质合成、修饰或降解)中发挥作用的任何酶，以及对脂质进行化学修饰的任何蛋白质以及载体蛋白。
[0089] “脂质”是可溶于非极性溶剂(如乙醚和氯仿)中并且相对或完全不溶于水的一类分子。脂质分子因它们大部分由在性质上具疏水性的长烃尾组成而具有这些特性。脂质的实例包括脂肪酸(饱和和不饱和)；甘油酯或甘油脂(如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或中性脂肪，以及磷酸甘油酯或甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂类、甾醇脂质(包括胆甾醇和甾类激素)、异戊烯醇脂质(包括萜类)、脂肪醇、蜡以及聚酮化合物)；以及复合脂质衍生物(连接糖的脂质，或糖脂，以及连接蛋白的脂质)。“脂肪”是脂质的亚群，被称为“三酰基甘油酯”。
[0090] “溶胞物”是含有溶解的细胞的内含物的溶液。
[0091] “溶解”是生物有机体的质膜以及任选地细胞壁发生破裂而足以释放至少某些细胞内内含物，这常通过机械、病毒或渗透机制损伤其完整性来实现。
[0092] “溶解”是生物有机体或细胞的细胞膜以及任选地细胞壁遭到破坏而足以释放至少某些细胞内内含物。
[0093] “微藻”是含有叶绿体或质体并且任选地能够进行光合作用的真核微生物有机体，或是能够进行光合作用的原核微生物有机体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物以及完全依靠固定碳源生存的异养生物。微藻包括细胞分裂后即刻与姐妹细胞分离的单细胞有机体(如衣藻属(Chlamydomonas))，以及如团藻属(Volvox，其是两种不同细胞类型的简单多细胞光合微生物)的微生物。微藻包括如小球藻、杜氏藻以及原藻的细胞。微藻还包括展现细胞间粘附作用的其它微生物光合有机体，如阿格藻属、项圈藻属以及桑椹藻属。微藻还包括丧失进行光合作用的能力的专性异养微生物，如某些双鞭甲藻藻类物种以及原藻属的物种。
[0094] “微生物(microorganism)”和“微生物(microbe)”是微观的单细胞有机体。
[0095] 关于两种蛋白质或基因的“天然共表达”意思是例如因为编码这两种蛋白质的基因处于共同调节序列的控制下或因为它们回应于相同刺激物而表达，所以所述蛋白质或它们的基因天然共表达于产生它们的组织或有机体中。
[0096] “渗透压休克”是渗透压突然降低后溶液中的细胞破裂。有时会诱导渗透压休克以使所述细胞的细胞组分释放到溶液中。
[0097] “多糖降解酶”是能够催化任何多糖水解或糖化的任何酶。举例来说，纤维素酶催化纤维素水解。
[0098] “多糖”或“聚糖”是由通过糖苷键连接到一起的单糖组成的碳水化合物。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖。可以通过酶使纤维素解聚，产生单糖(如木糖和葡萄糖)以及较大的二糖和寡糖。
[0099] “启动子”是引导核酸转录的核酸控制序列。本文所用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，如在II型聚合酶启动子的情况下，是TATA元件。启动子还任选地包括末端增强子或阻遏子元件，它们可以位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对的位置上。
[0100] “重组”是细胞、核酸、蛋白质或载体因引入有外源性核酸或原生核酸发生改变而得到修饰。因此，例如重组细胞表达细胞原生(非重组)形式中不存在的基因或表达与由非重组细胞表达的那些基因不同的原生基因。“重组核酸”是一般通过对核酸进行操作(例如使用聚合酶和核酸内切酶)而最初于体外形成的核酸，或以其它方式呈自然界中通常不存在的形式的核酸。可以产生重组核酸，例如以使两个或更多个核酸可操作连接。因此，为了实现本发明的目的，通过接合在自然界中通常不会连接的DNA分子而在体外形成的分离的核酸或表达载体均被认为是重组的。在重组核酸被制备并且引入到宿主细胞或有机体中后，它可以使用宿主细胞的体内细胞机构进行复制；然而，所述核酸在重组产生后虽然随后在细胞内进行复制，但为了实现本发明的目的仍然被认为是重组的。同样，“重组蛋白”是使用重组技术，即通过使重组核酸表达而制备的蛋白质。
[0101] “可再生柴油”是经由使脂质进行氢化和脱氧而产生的烷烃(如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0以及C18:0)的混合物。
[0102] “糖化”是使生物质(通常是纤维素或木质纤维生物质)转化成单体糖(如葡萄糖和木糖)的过程。“经过糖化的”或“经过解聚的”纤维素物质或生物质是指已经由糖化作用而转化成单体糖的纤维素物质或生物质。
[0103] 术语“相似”在被用于与天然存在的油类进行比较而没有进一步限定的情况下时意指与天然存在的油类相比较的油类所含的最高两种甘油三酯与天然存在的油类相差约+/-15％或+/-10％。举例来说，牛油树脂(牛油树(B.Parkii)的油类)含有41.2％-56.8％的C18:0和34.0％-46.9％的C18:1作为两种最常见的甘油三酯组分(参见表5)。在相差+/-10％以内“相似的”油类应含有约37％至约62％的C18:0和31％至约52％的C18:1作为两种最常见的甘油三酯组分。当被用于这种情况下时，术语“相似”包括相差+/-9％、+/-8％、+/-7％、+/-6％、+/-5％、+/-4％、+/-3％、+/-2％或十/-1％，并且可以进一步表示与天然存在的油类的最高三种或最高四种甘油三酯，或最高三种甘油三酯中的两种，或最高四种甘油三酯中的三种进行比较。
[0105] “糠醛物质”是保持相同的基本结构特征的2-呋喃甲醛或衍生物。
[0106] “秸杆”是收获谷物后残留的作物的干燥茎和叶。
[0107] “蔗糖利用基因”是当表达时帮助细胞能够利用蔗糖作为能量来源的基因。本文由蔗糖利用基因编码的蛋白质被称为“蔗糖利用酶”，并且包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶以及己糖激酶(如葡萄糖激酶和果糖激酶)。
[0108] II.培育
[0109] 本发明大体涉及培育微生物(例如微藻、产油酵母、真菌以及细菌)，尤其是重组微藻藻株，包括原藻属藻株以生产脂质。为了方便阅读，本部分再分成几个小部分。第1小部分描述了原藻属物种和藻株以及如何通过基因组DNA比较来鉴定新型原藻属物种和藻株以及相关微藻以及其它微生物。第2小部分描述了适用于进行培育的生物反应器。第3小部分描述了用于培育的培养基。第4小部分描述了根据本发明的说明性培育法生产油类。这些描述内容也一般适用于其它微生物。
[0110] 1.原藻属物种和藻株以及其它微生物
[0111] 原藻是用于生产脂质的引人注目的微生物，这是因为它可以产生高水平的脂质，特别是适用于生产燃料的脂质。与由其它微藻产生的脂质相比，由原藻产生的脂质具有链长较短并且饱和度较高的烃链。此外，原藻脂质一般不含色素(叶绿素和某些类胡萝卜素的水平低到不可检测出)，而且在任何情况下，所含的色素比来自其它微藻的脂质少得多。此外，相对于从其它微生物生产脂质，由本发明提供的重组原藻细胞可被用于以较高产率和效率并且以降低的成本生产脂质。用于本发明方法中的说明性原藻属藻株包括另外，这种微藻以异养方式生长并且可以经过遗传工程改造成威克海姆原藻、雍滞原藻(包括UTEX
327)、波多黎各原藻、桑椹形原藻(包括UTEX藻株1441、1435)以及饶氏原藻。原藻属的物种是专性异养生物。
327)、波多黎各原藻、桑椹形原藻(包括UTEX藻株1441、1435)以及饶氏原藻。原藻属的物种是专性异养生物。
[0112] 可以通过扩增基因组的某些目标区来鉴定用于本发明中的原藻属物种。举例来说，可以经由使用引物以及使用基因组任何区域的方法(例如使用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42：115-121中描述的方法)对核和/或叶绿体DNA进行扩增和测序来鉴定特定的原藻属物种或藻株。使用核糖体DNA序列来鉴定小球藻属的分离株。本领域技术人员可使用公认的种系发生学分析方法，如对核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23S rRNA、18S rRNA以及其它保守的基因组区域进行扩增和测序，从而不仅可以鉴定原藻属的物种，还可以鉴定具有相似脂质型态和生产能力的其它烃和脂质产生有机体。关于对藻类进行鉴定和分类的方法的实例还参见例如Genetics，2005年8月；170(4)：1601-10和RNA，2005年4月；11(4)：361-4。
[0113] 因此，可以利用基因组DNA比较来鉴定用于本发明中的合适的微藻物种。可以从微藻物种扩增保守的基因组DNA区域(诸如但不限于编码23S rRNA的DNA)，并且与共有序列相比较，以筛选与用于本发明中的优选微藻在分类学上相关的微藻物种。对于原藻属内的物种进行的所述DNA序列比较的实例展示于下文中。基因组DNA比较还可以用于鉴定藻株保藏中心错误鉴定的微藻物种。藻株保藏中心常常基于表型特征和形态特征鉴定微藻物种。使用这些特征可能会导致对微藻物种或微藻属进行错误分类。使用基因组DNA比较是基于种系发生学关系对微藻物种进行分类的较好方法。
[0114] 用于本发明中的微藻通常具有编码23S rRNA并且与SEQ ID NO：11-19中所列的至少一个序列具有至少99％、至少95％、至少90％或至少85％核苷酸一致性的基因组DNA序列。
[0115] 对于进行序列比较来测定核苷酸或氨基酸一致性百分比，通常一个序列用作参照序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法的程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。
[0116] 可以例如通过局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981))、同源性比对算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970))、相似性搜索方法(Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988))、计算机实现这些算法(WisconsinGenetics软件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)或通过目测检查(一般参见Ausubel等(同上))来对序列进行最佳比对以进行比较。
[0117] 适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的另一种实例算法是BLAST算法，描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可以经由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(网址是www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某个正值临限分数T。T被称为相邻字分数临限值(Altschul等(同上))。这些初始相邻字命中用作种子启动搜索，以寻找含有它们的较长HSP。所述字命中然后沿着各序列在两个方向上延伸，直到能够增加累积比对分数为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终＞0)和N(错配残基的罚分；始终＜0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用计分矩阵计算累积分数。各个方向上字命中的延伸在下列情况时停止：累积比对分数相对于其所达到的最大值减少了量X；由于一个或多个残基比对负值的累积而使累积分数降至0或以下；或到达任一序列的末端。对于鉴定核酸或多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的预设参数是合适的。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的预设值是字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的预设值是字长(W)为3，期望值(E)为10以及BLOSUM62计分矩阵。TBLATN程序(对于核苷酸序列，使用蛋白质序列)使用的预设值是字长(W)为3，期望值(E)为10以及BLOSUM 62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
[0118] 除了计算序列一致性百分比以外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统 计分 析(参见例 如Karlin和Altschul，Proc.Nat′ l.Acad.Sci.USA 90：
5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小概率总和(P(N))，指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然存在匹配的概率。举例来说，如果将测试核酸与参照核酸比较时最小概率总和小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，那么所述核酸被认为与参照序列相似。
5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小概率总和(P(N))，指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然存在匹配的概率。举例来说，如果将测试核酸与参照核酸比较时最小概率总和小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，那么所述核酸被认为与参照序列相似。
[0119] 除了生产合适的脂质或烃以生产油类、燃料以及油脂化学品之外，影响对用于本发明中的微生物进行选择的其它考虑因素还包括：(1)脂质含量高(占细胞重量的百分比)；(2)易于生长；(3)易于进行遗传工程改造；以及(4)易于对生物质进行加工。在具体实施方案中，野生型或经过遗传工程改造的微生物产生具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％或更多的脂质的细胞。优选的有机体以异养方式生长(利用糖在避光条件下生长)。
[0120] 可用于实行本发明的藻类的实例包括但不限于表1中所列的下列藻类。
[0121] 表1.藻类的实例。
[0122]
[0123]
[0124]
[0125] 可用于实行本发明的产油酵母的实例包括但不限于表26中所列的下列产油酵母。
[0126] 表26.产油酵母的实例。
[0127] 弯 曲 隐 球 酵 母 (Cryptococcus curvatus)、 陆 生 隐 球 酵 母(Cryptococcusterricolus)、假丝酵母属(Candida sp.)、斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、产油 油脂 酵母(Lipomyces lipofer)、产脂拟 内孢霉 (Endomycopsis vernalis)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
[0128] 可用于实行本发明的其它真菌的实例包括但不限于表27中所列的下列真菌。
[0129] 表27.真菌的实例。
[0130] 被孢 霉 属(Mortierella)、葡 酒 色被 孢 霉(Mortierrla vinacea)、高 山被 孢 霉(Mortierella alpine)、德 巴 利 腐 霉(Pythium debaryanum)、卷 枝 毛 霉(Mucorcircinelloides)、棕 曲 霉(Aspergillus ochraceus)、土 曲 霉 (Aspergillus terreus)、薄青霉(Pennicillium iilacinum)、汉逊酵母属(Hensenulo)、毛壳菌属(Chaetomium)、芽枝霉属(Cladosporium)、畸枝霉属(Malbranchea)、根霉菌属(Rhizopus)以及腐霉属(Pythium)
[0131] 在本发明的一些实施方案中，微生物是细菌。在细菌(如大肠杆菌(E.coli))中表达外源性基因的实例是熟知的；参见例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，Sambrook等(第3版，2001，Cold SpringHarbor Press)。
[0132] 2.生物反应器
[0133] 培养微生物以实现进行遗传操作和生产烃(例如脂质、脂肪酸、醛、醇以及烷烃)的目的。前一种类型的培养以小规模并且最初至少在起始微生物可以生长的条件下进行。以生产烃为目的的培养通常在生物反应器中大规模(例如10,000L、40,000L、100,000L或更大的生物反应器)进行。通常在本发明的方法中在生物反应器内于液体培养基中对微藻(包括原藻属物种)进行培养。生物反应器通常不允许光进入。
[0134] 使用生物反应器或发酵罐来培养产油微生物细胞，优选地培养微藻细胞，经历它们的生理周期的各个阶段。生物反应器提供很多优势以用于异养生长和繁殖方法中。为了生产用于食品中的生物质，优选地在液体培养物中(诸如在悬浮培养物中)使微藻大量发酵。生物反应器(如钢发酵罐)可以容纳非常大的培养物体积(本发明的各种实施方案中使用40,000升以及更大容量的生物反应器)。生物反应器通常还允许控制培养条件，如温度、pH值、氧压以及二氧化碳水平。举例来说，生物反应器通常是可配置的，例如使用与管道连接的端口，以允许气体组分(如氧气或氮气)鼓泡通过液体培养物。利用生物反应器还可以更容易地对其它培养参数(如培养基的pH值、微量元素的身份和浓度以及其它培养基成分)进行操控。
[0135] 生物反应器可以经过配置以使培养基在微藻复制和数目增加期间流过生物反应器。在一些实施方案中，例如可以在接种后但在细胞达到所需密度之前将培养基注入生物反应器中。在其它情况下，在培养开始时将生物反应器用培养基填充，并且在接种培养物后不再注入培养基。换句话说，在水性培养基中培养微藻生物质一段时间，期间微藻复制并且数目增加；然而，在整个这段时间内没有大量的水性培养基流过生物反应器。因此在一些实施方案中，在接种后没有水性培养基流过生物反应器。
[0136] 可以使用装备有如旋转刀和旋桨、摇动机构、搅拌棒、用于加压气体注入的部件等装置的生物反应器对微藻培养物进行混合。混合可以是连续性的或间歇性的。举例来说，在一些实施方案中，并不维持气体进入和培养基进入的紊流状态以使微藻复制，直至实现所述微藻的所需数目增加为止。
[0137] 可以使用生物反应器端口将气体、固体、半固体以及液体引入或提取到容纳微藻的生物反应器腔室中。虽然很多生物反应器具有超过一个端口(例如一个端口用于培养基进入，以及另一个端口用于取样)，但没有必要让一个端口仅用于一种物质进入或排出。举例来说，一个端口可以用于使培养基流入生物反应器中并且随后用于取样、气体进入、气体排出或者其它目的。优选地可以在不改变或危害培养物的无菌性质的情况下重复使用取样口。取样口可以经过配置而具有阀门或允许样品停止和开始流动或提供连续取样部件的其它装置。生物反应器通常具有允许接种培养物的至少一个端口，并且所述端口还可以用于其它目的，如培养基或气体进入。
[0138] 生物反应器端口允许对微藻培养物的气体含量进行操控。举例来说，生物反应器的一部分容积可以是气体而非液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵入生物反应器中。可以被有利地泵入生物反应器中的气体包括空气、空气/CO2混合物、隋性气体(如氩气)以及其它气体。生物反应器通常经过装备以使得使用者能够控制气体进入生物反应器的速率。如上所述，可以通过增加进入生物反应器中的气体流动来促进培养物混合。
[0139] 气体流动增加还会影响培养物的浊度。可以通过在水性培养基液面以下安置一个进气口以使进入生物反应器的气体鼓泡至培养物表面，从而实现紊流。一个或多个出气口使气体逸散，从而防止生物反应器中压力蓄积。出气口优选地通向防止污染性微生物进入生物反应器中的“单向”阀门。
[0140] 3.培养基
[0141] 微藻培养基通常含有如固定氮源、固定碳源、微量元素、任选地用于维持pH值的缓冲液以及磷酸类物质(通常以磷酸盐形式提供)的组分。其它组分可以包括盐(如氯化钠)，尤其对于海水微藻来说。氮源包括有机和无机氮源，包括例如但不限于分子氮、硝酸类物质、硝酸盐、氨(纯氨或盐形式，如(NH4)2SO4和NH4OH)、蛋白质、大豆粉、玉米浸渍液以及酵母提取物。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰以及钼，例如分别呈ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O以及(NH4)6Mo7O24·4H2O的形式。
[0142] 根据本发明的方法使用的微生物存在于全世界各个地方和环境中。由于它们与其它物种的分离以及它们发生的进化趋异，所以难以预测用于提供最佳生长以及产生脂质和/或烃成分的特定生长培养基。在一些情况下，某些微生物株可能不能生长于特定的生长培养基中，这是因为存在某种抑制性组分或不存在所述特定微生物株所需要的某种基本的营养需求。
[0143] 固体和液体生长培养基一般可以从多种来源获得，而且适用于多种微生物株的特定培养基的制备方法的说明可以例如在线见于http://www.utex.org/(由奥斯汀(Austin)的德克萨斯大学(University ofTexas)，1 University Station A6700，Austin，Texas，78712-0183对于其藻类培养物保藏中心(UTEX)所维持的网站)上。举例来说，各种淡水和盐水培养基包括描述于PCT公布号2008/151149中的培养基，所述公布以引用的方式并入本文。
[0144] 在一个具体的实施例中，朊间质培养基适用于无菌培养，并且可以通过将1g朊间质蛋白胨加入到1升布氏培养基(Bristol Medium)中来制备1L体积的培养基(pH约6.8)。布氏培养基在水溶液中包含2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、
1.29mM KH2PO4以及1.43mM NaCl。对于1.5％的琼脂培养基，可以将15g琼脂加入到1L溶液中。将溶液盖上并且进行高压灭菌，然后在使用前储存于冷藏温度下。另一个实例是原藻分离培养基(PIM)，其包含10g/L邻苯二甲酸氢钾(KHP)、0.9g/L氢氧化钠、0.1g/L硫酸镁、
0.2g/L磷酸氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.001g/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L
5-氟胞嘧啶，pH值范围是5.0至5.2(参见Pore，1973，App.Microbiology，26：648-649)。
可以通过咨询上文所标示的URL或者通过咨询维持微生物培养物的其它组织(如SAG、CCAP或CCALA)容易地鉴定适用于本发明方法的其它培养基。SAG是指哥廷根大学(University of )( Germany)的藻类培养物保藏中心，CCAP是指由苏格兰海洋科
学协会(ScottishAssociation for Marine Science)(Scotland，United Kingdom)管理的藻类和原生动物培养物保藏中心，并且CCALA是指植物学研究所(Institute of Botany)( Czech Republic)的藻类培养物保藏实验室。另外，美国专利第5,900,370号描
述了适于原藻属物种异养发酵的培养基制剂和条件。
1.29mM KH2PO4以及1.43mM NaCl。对于1.5％的琼脂培养基，可以将15g琼脂加入到1L溶液中。将溶液盖上并且进行高压灭菌，然后在使用前储存于冷藏温度下。另一个实例是原藻分离培养基(PIM)，其包含10g/L邻苯二甲酸氢钾(KHP)、0.9g/L氢氧化钠、0.1g/L硫酸镁、
0.2g/L磷酸氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.001g/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L
5-氟胞嘧啶，pH值范围是5.0至5.2(参见Pore，1973，App.Microbiology，26：648-649)。
可以通过咨询上文所标示的URL或者通过咨询维持微生物培养物的其它组织(如SAG、CCAP或CCALA)容易地鉴定适用于本发明方法的其它培养基。SAG是指哥廷根大学(University of )( Germany)的藻类培养物保藏中心，CCAP是指由苏格兰海洋科
学协会(ScottishAssociation for Marine Science)(Scotland，United Kingdom)管理的藻类和原生动物培养物保藏中心，并且CCALA是指植物学研究所(Institute of Botany)( Czech Republic)的藻类培养物保藏实验室。另外，美国专利第5,900,370号描
述了适于原藻属物种异养发酵的培养基制剂和条件。
[0145] 对于油类生产，选择固定碳源十分重要，这是因为固定碳源的成本必须足够低而可以低成本生产油类。因此，当合适的碳源包括例如乙酸酯、弗罗里多苷(floridoside)、果糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、蔗糖和/或木糖时，选择含有这些化合物的原料是本发明方法的一个重要方面。根据本发明方法使用的合适的原料包括例如黑液、玉米淀粉、经过解聚的纤维素物质、乳清、糖蜜、马铃薯、高粱、蔗糖、甜菜、甘蔗、稻米以及小麦。碳源还可以混合物形式提供，如蔗糖与经过解聚的甜菜废粕的混合物。一种或多种碳源可以至少约50μM、至少约100μM、至少约500μM、至少约5mM、至少约50mM以及至少约500mM浓度的一种或多种外源性提供的固定碳源形式提供。出于本发明的目的特别相关的碳源包括纤维素(呈解聚形式)、甘油、蔗糖以及高粱，各自更详细地论述于下文中。
[0146] 根据本发明，可以利用经过解聚的纤维素生物质作为原料来培养微生物。纤维素生物质(例如秸杆，如玉米秸)是廉价并且易于获得的；然而，试图使用这种物质作为用于酵母的原料以失败告终。具体来说，已经发现所述原料会抑制酵母生长，而且酵母不能利用由纤维素物质产生的5-碳糖(例如来自半纤维素的木糖)。相反，微藻可以依靠经过加工的纤维素物质生长。纤维素物质一般包括约40％-60％的纤维素、约20％-40％的半纤维素以及10％-30％的木质素。
[0147] 合适的纤维素物质包括来自于草本和木本能源作物的残余物，以及农作物(并非从主要食物或纤维产品的田间摘下)，即植物部分，主要是茎和叶。实例包括农业废物，如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括茎、叶、壳以及棒)、小麦秸、稻草、甜菜废粕、柑桔渣、柑桔皮；林业废物，如硬木和软木间伐材，以及来自木材操作的硬木和软木残余物；木材废弃物，如锯木厂废弃物(木材碎片、锯末)以及纸浆厂废物；城市废物，如城市固体废物的纸质部分、城市木材废弃物以及城市绿色废物(如城市剪草)；以及木材建筑废物。另外的纤维素物质包括专门的纤维素作物，如柳枝稷、杂交白杨木以及芒属、纤维甘蔗以及纤维高粱。由这些物质产生的五碳糖包括木糖。
[0148] 对纤维素物质进行处理以提高微生物利用这些物质中所含的糖的效率。本发明提供了用于在酸爆裂后对纤维素物质进行处理，以使所述物质适用于对微生物(例如微藻和产油酵母)进行异养培养的新型方法。如上文所述的木质纤维生物质包含各种组分，包括纤维素，即β-1，4连接的葡萄糖(一种六碳糖)的结晶聚合物；半纤维素，即较松散连接的聚合物，主要包含木糖(一种五碳糖)并且包含少量的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖；木质素，即一种复杂的芳香族聚合物，包含芥子醇和其衍生物以及果胶(α-1，4连接的多聚半乳糖醛酸的直链)。由于纤维素和半纤维素具有聚合结构，所以它们当中的糖(例如单体葡萄糖和木糖)呈不能被很多微生物高效利用(代谢)的形式。对于这些微生物，对纤维素生物质进行进一步加工以产生构成聚合物的单体糖可以非常有助于确保纤维素物质被高效地用作原料(碳源)。
[0149] 对纤维素或纤维素生物质进行称为“爆裂”的过程，其中在高温和高压下用稀硫酸(或其它酸)处理生物质。这个过程调整生物质以使其中的纤维素和半纤维素组分能够被高效地酶促水解成葡萄糖和木糖单体。所得到的单体糖被称为纤维素糖。随后纤维素糖可以被微生物利用，产生多种代谢物(例如脂质)。酸爆裂步骤使得半纤维素组分部分地水解成构成性单糖。这些糖可以在进一步处理的情况下完全从生物质中释放出来。在一些实施方案中，进一步处理是热液处理，包括用热水对经过爆裂的物质进行洗涤，除去污染物(如盐)。纤维素乙醇发酵不需要这个步骤，这是因为所述方法中使用较稀的糖浓度。在其它实施方案中，进一步处理是另外的酸处理。在再其它实施方案中，进一步处理是对经过爆裂的物质进行酶促水解。这些处理还可以任何组合形式使用。处理的类型可影响所释放的糖的类型(例如五碳糖相比六碳糖)以及在过程中它们被释放的阶段。因此，可以产生主要是五碳糖或是六碳糖的不同的糖流。这些经过富集的五碳糖或六碳糖流因此可以针对具有不同碳利用能力的特定微生物。
[0150] 本发明的方法通常包括发酵以产生高于乙醇发酵中达到的细胞密度的细胞密度。由于用于异养纤维素油类生产的培养物的密度较高，所以固定碳源(例如纤维素衍生的糖流)优选地呈浓缩形式。在培育步骤前经过解聚的纤维素物质中的葡萄糖水平优选地是至少300克/升、至少400克/升、至少500克/升或至少600克/升，所述的培育步骤任选
地是分批补料式培育，其中在细胞生长并且积聚脂质时随时间推移将物质送到细胞中。在生产纤维素乙醇中不使用等于或接近这一浓度范围的纤维素糖流。因此，为了在生产木质纤维油类期间产生并且持续非常高的细胞密度，必须将碳原料以高度浓缩形式递送至异养培养物中。然而，进料流中不是产油微生物的底物或不能被产油微生物代谢的任何组分会在生物反应器中积聚，如果所述组分具有毒性或会抑制所需最终产物产生，那么将会引起问题。而在乙醇发酵中，木质素和木质素衍生的副产物、碳水化合物衍生的副产物(如糠醛和羟甲基糠醛)以及源自于纤维素物质产生(爆裂过程中以及后续的中和过程中)的盐以及甚至未代谢的戊糖/己糖都会引起问题，这些影响会在这些物质在初始原料中的浓度较高的方法中被显著放大。为了使可用于大规模生产本发明中所述的木质纤维油类的六碳糖达到300g/L范围(或更高)内的糖浓度，这些毒性物质的浓度可以是在纤维素生物质的乙醇发酵中通常所存在的浓度的20倍。
地是分批补料式培育，其中在细胞生长并且积聚脂质时随时间推移将物质送到细胞中。在生产纤维素乙醇中不使用等于或接近这一浓度范围的纤维素糖流。因此，为了在生产木质纤维油类期间产生并且持续非常高的细胞密度，必须将碳原料以高度浓缩形式递送至异养培养物中。然而，进料流中不是产油微生物的底物或不能被产油微生物代谢的任何组分会在生物反应器中积聚，如果所述组分具有毒性或会抑制所需最终产物产生，那么将会引起问题。而在乙醇发酵中，木质素和木质素衍生的副产物、碳水化合物衍生的副产物(如糠醛和羟甲基糠醛)以及源自于纤维素物质产生(爆裂过程中以及后续的中和过程中)的盐以及甚至未代谢的戊糖/己糖都会引起问题，这些影响会在这些物质在初始原料中的浓度较高的方法中被显著放大。为了使可用于大规模生产本发明中所述的木质纤维油类的六碳糖达到300g/L范围(或更高)内的糖浓度，这些毒性物质的浓度可以是在纤维素生物质的乙醇发酵中通常所存在的浓度的20倍。
[0151] 对纤维素物质进行爆裂法处理会利用大量的硫酸、热以及压力，从而释放碳水化合物的副产物，即糠醛和羟甲基糠醛。糠醛和羟甲基糠醛在半纤维素水解期间经由使木糖脱水成糠醛和水而产生。在本发明的一些实施方案中，在将经过糖化的木质纤维物质引入生物反应器之前，从其中除去这些副产物(例如糠醛和羟甲基糠醛)。在本发明的某些实施方案中，除去碳水化合物的副产物的方法是对经过爆裂的纤维素物质进行热液处理。另外，本发明提供了使用能够耐受如糠醛或羟甲基糠醛的化合物的藻株来生产木质纤维油类的方法。在另一个实施方案中，本发明还提供了不仅能够耐受发酵培养基中的糠醛，而且还实际上能够代谢在木质纤维油类生产期间的这些副产物的方法和微生物。
[0152] 爆裂过程还产生显著性水平的盐。举例来说，当使经过爆裂的纤维素生物质以10∶1的水∶固体比率(干重)重悬时，用于爆裂的典型条件可以产生超过5mS/cm的电导率。在本发明的某些实施方案中，对稀释过的经过爆裂的生物质进行酶促糖化，并且将得到的上清液多达25倍浓缩以用于生物反应器中。经过浓缩的糖流中的盐水平(如通过电导+
率所测量)出乎意料地高(高达1.5M Na 等同物)。在对经过爆裂的物质进行中和以进行后续的酶促糖化方法时同样会再产生盐。本发明提供了除去这些盐以使所得的经过浓缩的纤维素糖流可以被用于生产木质纤维油类的异养方法中的方法。在一些实施方案中，除去这些盐的方法是用树脂(诸如但不限于DOWEX Marathon MR3)进行去离子化。在某些实施方案中，在浓缩糖或调节pH值以及糖化前对生物质进行热液处理或前述的任何组合之前进行用树脂去离子化的步骤；在其它实施方案中，在这些过程中的一个或多个之后进行所述步骤。在其它实施方案中，爆裂过程本身发生变化，以避免产生出乎意料地高水平的盐。
举例来说，对纤维素生物质进行硫酸(或其它酸)爆裂的合适替代方案是使纤维素生物质能够进行酶促水解(糖化)的机械制浆。在再其它实施方案中，使用能够抵抗高水平盐的原生微生物株或能够抵抗高水平盐的经过遗传工程改造的藻株。
率所测量)出乎意料地高(高达1.5M Na 等同物)。在对经过爆裂的物质进行中和以进行后续的酶促糖化方法时同样会再产生盐。本发明提供了除去这些盐以使所得的经过浓缩的纤维素糖流可以被用于生产木质纤维油类的异养方法中的方法。在一些实施方案中，除去这些盐的方法是用树脂(诸如但不限于DOWEX Marathon MR3)进行去离子化。在某些实施方案中，在浓缩糖或调节pH值以及糖化前对生物质进行热液处理或前述的任何组合之前进行用树脂去离子化的步骤；在其它实施方案中，在这些过程中的一个或多个之后进行所述步骤。在其它实施方案中，爆裂过程本身发生变化，以避免产生出乎意料地高水平的盐。
举例来说，对纤维素生物质进行硫酸(或其它酸)爆裂的合适替代方案是使纤维素生物质能够进行酶促水解(糖化)的机械制浆。在再其它实施方案中，使用能够抵抗高水平盐的原生微生物株或能够抵抗高水平盐的经过遗传工程改造的藻株。
[0153] 制备用于利用产油微生物进行异养木质纤维油类生产的经过爆裂的纤维素生物质的方法的一个优选实施方案。第一步骤包括将重悬的经过爆裂的纤维素生物质的pH值调节至5.0-5.3范围内，随后洗涤纤维素生物质三次。可以通过多种手段完成这个洗涤步骤，所述手段包括利用脱盐树脂和离子交换树脂、反渗透、热液处理(如上文所述)或仅仅在去离子水中重复进行重悬和离心。这个洗涤步骤产生电导率在100μS/cm-300μS/cm之间的纤维素流，并且除去大量的糠醛和羟甲基糠醛。可以保留来自这个洗涤步骤的倾析物，以对从半纤维素组分中释放的五碳糖进行浓缩。第二步骤包括对经过洗涤的纤维素生物质进行酶促糖化。在一个优选实施方案中，使用Accellerase(Genencor)。第三步骤包括通过离心或倾析以及对经过糖化的生物质进行冲洗来回收糖。所得到的生物质(固体)是高能量富含木质素的组分，可被用作燃料或丢弃。收集在离心/倾析以及冲洗过程中回收到的糖流。第四步骤包括进行微量过滤，以除去污染固体并回收渗透物。第五步骤包括浓缩步骤，所述步骤可以利用真空蒸发器来完成。这个步骤任选地可以包括加入消泡剂，诸如P′2000(Sigma/Fluka)，这有时因所得的糖原料中含有蛋白质而为必需的。
[0154] 在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是甘油，包括由生物柴油进行酯基转移产生的经过酸化和未经过酸化的甘油副产物。在一个实施方案中，碳源包括甘油和至少一种其它碳源。在一些情况下，在发酵开始时将所有的甘油和至少一种其它固定碳源提供给微生物。在一些情况下，将甘油和至少一种其它固定碳源以预定比率同时提供给微生物。在一些情况下，在发酵过程中将甘油和至少一种其它固定碳源以预定比率送到微生物中。
[0155] 某些微藻在甘油存在下进行细胞分裂的速度快于在葡萄糖存在下的速度(参见PCT公布号2008/151149)。在这些情况下，两阶段生长过程(其中首先将甘油送至细胞以使细胞密度快速增加，然后送入葡萄糖以积聚脂质)可以提高生产脂质的效率。利用酯基转移过程的甘油副产物在使其回到生产过程中时会提供显著的经济优势。还提供了其它进料方法，诸如甘油与葡萄糖的混合物。馈送所述混合物也具有相同的经济益处。另外，本发明提供了将替代糖(如蔗糖)以各种组合形式与甘油一起馈送给微藻的方法。
[0156] 在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是转化糖。转化糖是通过使蔗糖分解成其单糖组分(果糖和葡萄糖)而产生。可以经由本领域中已知的多种方法来生产转化糖。所述的一种方法是加热蔗糖水溶液。常使用催化剂来加速蔗糖向转化糖的转化。这些催化剂可以是生物催化剂，例如酶，诸如可以将转化酶和蔗糖酶加入蔗糖中来加速产生转化糖的水解反应。酸是非生物催化剂的一个实例，其在与热配合时可以加速水解反应。在制成转化糖后，所述转化糖的结晶倾向性小于蔗糖，而且因此对于储存和分批补料式发酵提供了优势，在分批补料式发酵中在异养培育微生物(包括微藻)的情况下需要浓缩的碳源。在一个实施方案中，碳源是转化糖，优选地在培育步骤(任选地是分批补料式培育)之前呈浓缩的形式，优选地至少800克/升、至少900克/升、至少1000克/升或至少1100克/升。
在细胞生长并且积聚脂质时随时间推移将优选地呈浓缩的形式的转化糖送到细胞中。
在细胞生长并且积聚脂质时随时间推移将优选地呈浓缩的形式的转化糖送到细胞中。
[0157] 在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是蔗糖，包括含有蔗糖的复合原料，诸如甘蔗加工产生的浓甘蔗汁。因为用于异养油类生产的培养物的密度较高，所以固定碳源(例如蔗糖、葡萄糖等)在培育步骤之前优选地呈浓缩的形式，优选地至少500克/升、至少600克/升、至少700克/升或至少800克/升的固定碳源，所述培育步骤任选地是分批补料式培育，其中在细胞生长并且积聚脂质时随时间推移将所述物质送到细胞中。在一些情况下，碳源是蔗糖，所述蔗糖呈浓甘蔗汁形式，优选地在培育步骤之前呈浓缩的形式，优选地含至少60％固体或约770克/升糖、至少70％固体或约925克/升糖，或至少80％固体或约1125克/升糖，所述培育步骤任选地是分批补料式培育。在细胞生长并且积聚脂质时随时间推移将浓缩的浓甘蔗汁送到细胞中。
[0158] 在一个实施方案中，培养基进一步包括至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，培养基包括蔗糖转化酶。在一个实施方案中，蔗糖转化酶是可分泌的蔗糖转化酶，其由外源性蔗糖转化酶基因编码(由微生物群体表达)。因此，在一些情况下，如下文第IV部分中更详细描述，微藻已经经过遗传工程改造以表达蔗糖利用酶，诸如蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡萄糖激酶或果糖激酶。
[0159] 含有蔗糖的复合原料包括甘蔗加工产生的废糖蜜；利用甘蔗加工的这种低价废产品可以显著节省烃和其它油类生产的成本。用于本发明方法中的另一种含有蔗糖的复合原料是高粱，包括高粱糖浆和纯高粱。高粱糖浆由甜高粱的汁液产生。它的糖型态主要由葡萄糖(右旋糖)、果糖以及蔗糖组成。
[0160] 4.油类生产
[0161] 为了根据本发明的方法生产油类，优选在暗处培养细胞，正如例如在使用不允许光照射培养物的极大(40,000升以及更高)的发酵罐时。原藻属物种在含有固定碳源的培养基中并且在避光情况下生长和繁殖以生产油类；所述生长被称为异养生长。
[0162] 举例来说，将脂质产生产油微生物细胞(优选地是微藻细胞)的接种物引入培养基中；细胞开始繁殖前存在停滞期(停滞阶段)。在停滞期后，繁殖速率平稳增加并且进入对数生长期或指数生长期。指数生长期后，由于营养素(如氮)减少、毒性物质增加以及群体感应机制而使繁殖减慢。此减慢后，繁殖停止，并且取决于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或平稳生长状态。为了获得富含脂质的生物质，通常在指数生长期结束之后收集培养物，可以通过使氮或另一种关键的营养素(除了碳以外)被耗尽从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成脂质而使指数生长期较早终止。可以操控培养条件参数，以使总体油类生产、所产生的脂质物质的组合和/或特定油类的生产达到最佳。
[0163] 如上文所述，使用生物反应器或发酵罐以使细胞进入其生长周期的各个阶段。举例来说，可以将脂质产生细胞的接种物引入培养基中，随后进入停滞期(停滞阶段)，之后细胞开始生长。在停滞期后，生长速率平稳增加并且进入对数生长期或指数生长期。指数生长期后，由于营养素减少和/或毒性物质增加而使生长减慢。此减慢后，生长停止，并且取决于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或稳定状态。本文公开的细胞的脂质生产可以发生于对数生长期期间或之后，包括静止期，在静止期中提供或仍然可获得营养素以使细胞在不分裂的情况下能够继续产生脂质。
[0164] 优选的是，使用本文所述以及本领域已知的条件培养的微生物包含至少约20重量％的脂质，优选地至少约40重量％，更优选地至少约50重量％，并且最优选地至少约60重量％的脂质。工艺条件可以经过调整以增加适用于特定用途的脂质的产率和/或减少生产成本。举例来说，在某些实施方案中，在限制性浓度的一种或多种营养素(如氮、磷或硫)存在下培养微藻，同时提供过量的固定碳能(如葡萄糖)。与在提供过量氮的培养物中微生物的脂质产率相比，限制氮倾向于使微生物的脂质产率增加。在具体实施方案中，脂质产率增加至少约：10％、50％、100％、200％或500％。可以在总培养期的一部分或整个培养期内在限制量的营养素存在下培养微生物。在具体实施方案中，在总培养期期间，使营养素的浓度在限制性浓度与非限制性浓度之间循环至少2次。可以通过在延长的时间内继续培养同时提供过量的碳，但限制氮或不提供氮来使细胞的脂质含量增加。
[0165] 在另一个实施方案中，通过在脂质通路酶(例如脂肪酸合成酶)的一种或多种辅因子存在下培养脂质产生微生物(例如微藻)来使脂质产率增加。一般来讲，辅因子的浓度足以使微生物脂质(例如脂肪酸)产率与不存在辅因子的情况下的微生物脂质产率相比有所增加。在具体实施方案中，通过将含有编码辅因子的外源性基因的微生物(例如微藻)纳入培养物中来向培养物提供辅因子。或者，可以通过纳入含有编码参与辅因子合成的蛋白质的外源性基因的微生物(例如微藻)来向培养物提供辅因子。在某些实施方案中，合适的辅因子包括脂质通路酶所需的任何维生素，如：生物素、泛酸盐。编码适用于本发明中的辅因子的基因或参与这些辅因子合成的基因是熟知的，并且可以利用构建体和技术(如上述构建体和技术)引入到微生物(例如微藻)中。
[0166] 本文所述的生物反应器、培养条件以及异养生长和繁殖方法的特定实例可以任何合适的方式进行组合以改良微生物生长以及脂质和/或蛋白质生产的效率。
[0167] 已经利用不同的培养方法产生了具有高百分比的油类/脂质累积(以干重计)的微藻生物质，所述培养方法是本领域已知的(参见PCT公布号2008/151149)。通过本文所述的培养方法产生并且根据本发明使用的微藻生物质包含以干重计至少10％的微藻油类。在一些实施方案中，微藻生物质包含以干重计至少25％、至少50％、至少55％或至少60％的微藻油类。在一些实施方案中，微藻生物质含有以干重计10％-90％的微藻油类、
25％-75％的微藻油类、40％-75％的微藻油类或50％-70％的微藻油类。
25％-75％的微藻油类、40％-75％的微藻油类或50％-70％的微藻油类。
[0168] 用于本发明的方法和组合物中的本文所述的生物质的微藻油类或从生物质中提取的微藻油类可以包含具有一个或多个不同脂肪酸酯侧链的甘油脂。甘油脂包含与一个、两个或三个脂肪酸分子发生酯化的甘油分子，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度并且具有不同的饱和度。如以下第IV部分所更详细描述，可以经由培养条件或脂质通路工程改造来操控脂肪酸分子(和微藻油类)的长度和饱和度特征以对本发明微藻油类中的脂肪酸分子的特性或比例进行调节。因此，可以在单个藻类物种内通过将来源于两种或更多种微藻物种的生物质或藻类油类混合于一起，或通过将本发明的藻类油类与来自其它来源的油类共混来制备特定的藻类油类共混物，所述其它来源诸如大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、废植物、乌桕油、橄榄、向日葵、棉籽、鸡脂肪、牛脂、猪油脂、微藻、大型藻类、微生物、萼距花、亚麻、花生、精选白色动物油脂、猪油、亚麻荠、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡豆、亚麻仁(亚麻籽)、榛子、大戟、南瓜籽、胡荽、山茶、芝麻、红花、稻米、油桐树、可可、干椰子肉、罂粟花、蓖麻籽、美洲山核桃、希蒙德木、夏威夷果、巴西坚果、鳄梨、石油或前述油类中任一种的馏分。
[0169] 还可以通过将来源于至少两种不同的微藻物种的生物质或油类组合来操控油类组成，即甘油脂的脂肪酸成分的特性和比例。在一些实施方案中，至少两种不同的微藻物种具有不同的甘油脂型态。可以如本文所述，优选地在异养条件下对不同的微藻物种进行共同培养或单独培养，以产生各自的油类。不同微藻物种在细胞的甘油脂中可以含有不同百分比的不同脂肪酸成分。
[0170] 一般来讲，原藻属藻株几乎没有或没有链长是C8-C14的脂肪酸。举例来说，桑椹形原藻(UTEX 1435)、克鲁格尼原藻(Protothecakrugani)(UTEX 329)、雍滞原藻(UTEX1442)以及饶氏原藻(UTEX1438)不含(或不可检测量的)C8脂肪酸，含有0％-0.01％之间的C10脂肪酸、0.03％-2.1％之间的C12脂肪酸以及1.0％-1.7％之间的C14脂肪酸。
[0171] 在一些情况下，含有编码对链长是C8或C8-10的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少12％或至少15％或更多的链长是C8的脂肪酸。
在其它情况下，含有编码对链长是C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少
24％或至少25％或更多的链长是C10的脂肪酸。在其它情况下，含有编码对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少34％、至少35％或至少40％或更多的链长是C12的脂肪酸。在其它情况下，含有编码对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少
2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少10％、至少15％、至少30％、至少43％或至少45％或更多的链长是C14的脂肪酸。
在其它情况下，含有编码对链长是C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少
24％或至少25％或更多的链长是C10的脂肪酸。在其它情况下，含有编码对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少34％、至少35％或至少40％或更多的链长是C12的脂肪酸。在其它情况下，含有编码对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少1％、至少
2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少10％、至少15％、至少30％、至少43％或至少45％或更多的链长是C14的脂肪酸。
[0172] [0001]在非限制性实施例中，含有编码对链长是C8的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有1％-25％之间，或1％-15％之间，优选地1.8％-12.29％的链长是C8的脂肪酸。在其它非限制性实施例中，含有编码对链长是C10的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有1％-50％之间，或1％-25％之间，优选地1.91％-23.97％的链长是C10的脂肪酸。在其它非限制性实施例中，含有编码对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有5％-50％之间，或10％-40％之间，优选地
13.55％-34.01％的链长是C12的脂肪酸。在其它非限制性实施例中，含有编码对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有
1％-60％之间，或2％-45％之间，优选地2.59％-43.27％的链长是C14的脂肪酸。在其它非限制性实施例中，含有编码对具有不同碳链长度的脂肪酰基-ACP底物具有广泛特异性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有多达30％、多达35％或优选地多达
39.45％的链长是C16的脂肪酸。在一些情况下，含有编码对链长在C8与C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有1％-75％之间，或2％-60％之间，优选地2.69％-57.98％的中链(C8-C14)脂肪酸。在一些情况下，含有编码对链长在C12与C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少30％、至少40％或至少49％的C12-C14脂肪酸。在某些情况下，将转基因原藻属藻株保持在恒定且较高的选择压力下以保留外源性基因会因具有特定链长的所需脂肪酸增加而是有利的。还可以通过利用本文公开的同源重组载体和方法将外源性基因插入到细胞的核染色体中来使外源性基因保持高水平。含有整合到核染色体中的外源性基因的重组细胞是本发明的一个目的。
13.55％-34.01％的链长是C12的脂肪酸。在其它非限制性实施例中，含有编码对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有
1％-60％之间，或2％-45％之间，优选地2.59％-43.27％的链长是C14的脂肪酸。在其它非限制性实施例中，含有编码对具有不同碳链长度的脂肪酰基-ACP底物具有广泛特异性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有多达30％、多达35％或优选地多达
39.45％的链长是C16的脂肪酸。在一些情况下，含有编码对链长在C8与C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有1％-75％之间，或2％-60％之间，优选地2.69％-57.98％的中链(C8-C14)脂肪酸。在一些情况下，含有编码对链长在C12与C14之间的脂肪酰基-ACP底物具有活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶的转基因的原藻属藻株具有至少30％、至少40％或至少49％的C12-C14脂肪酸。在某些情况下，将转基因原藻属藻株保持在恒定且较高的选择压力下以保留外源性基因会因具有特定链长的所需脂肪酸增加而是有利的。还可以通过利用本文公开的同源重组载体和方法将外源性基因插入到细胞的核染色体中来使外源性基因保持高水平。含有整合到核染色体中的外源性基因的重组细胞是本发明的一个目的。
[0173] [0002]微藻油类还可以包括由微藻产生的或从培养基掺入微藻油类中的其它成分。这些其它成分可以不同量存在，这取决于用于培养微藻的培养条件、微藻物种、用于从生物质中回收微藻油类的提取方法以及可能影响微藻油类组成的其它因素。所述成分的非限制性实例包括类胡萝卜素，存在量是0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选地0.05微克至0.244微克/每克油类；叶绿素A，存在量为0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选地0.045微克至0.268微克/每克油类；总叶绿素，量为少于0.1mcg/g、少于0.05mcg/g，优选地少于0.025微克/每克油类；γ-生育酚，存在量为1mcg/g-300mcg/g、35mcg/g-175mcg/g，优选地38.3微克-164微克/每克油类；总生育酚，存在量为10mcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g，优选地60.8微克至261.7微克/每克油类；少于1％、少于0.5％，优选地少于0.25％的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；少于400mcg/g，优选地少于300微克的总生育三烯酚/每克油类；或总生育三烯酚，存在量为100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g，优选地249.6微克至325.3微克/每克油类。
[0174] 其它成分可以包括但不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素(例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等)、叶黄质(例如叶黄素、玉米黄质、α-隐黄质以及β-隐黄质)以及各种有机或无机化合物。在一些情况下，从原藻属物种中提取的油类包含0.001mcg/g-0.01mcg/g之间、0.0025mcg/g-0.05mcg/g之间，优选地0.003微克至0.039微克的叶黄素/每克油类；少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选地少于0.003微克的番茄红素/每克油类；以及少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g，优选地少于0.003微克的β-胡萝卜素/每克油类。
[0175] 在一些实施方案中，本发明提供了一种包含甘油三酯油类的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％或至少约15％；C10:0占至少约1％、至少约5％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或至少约30％；C12:0占至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％；C14:0占至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C16:0占至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:0占至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C18:1占至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:2占少于约7％、少于约5％、少于约3％、少于约1％或约0％；以及饱和脂肪酸占至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
[0176] [0003]在一些实施方案中，产油微生物细胞包含甘油三酯油类，所述甘油三酯油类包含选自由以下组成的组的脂肪酸型态：C8:0与C10:0的组合总量是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；以及C18:1与C18:2的组合总量少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约
10％、少于约5％或是约0％。
10％、少于约5％或是约0％。
[0177] 在一些实施方案中，产油微生物细胞包含甘油三酯油类，所述甘油三酯油类具有包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率的脂肪酸型态：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1、至少6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；C10:0与C12:0的
比率是至少约6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；C12:0与C14:0
的比率是至少约5∶1、至少6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；
C14:0与C12:0的比率是至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；以及C14:0与
C16:0的比率是至少1∶2、至少1∶3、至少1∶4、至少1∶5、至少1∶6、至少1∶7、至少1∶8、至少1∶9或至少1∶10。
比率是至少约6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；C12:0与C14:0
的比率是至少约5∶1、至少6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；
C14:0与C12:0的比率是至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1；以及C14:0与
C16:0的比率是至少1∶2、至少1∶3、至少1∶4、至少1∶5、至少1∶6、至少1∶7、至少1∶8、至少1∶9或至少1∶10。
[0178] 在一些实施方案中，本发明提供了一种产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组：C8:0占至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％或至少约15％；C10:0占至少约1％、至少约5％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或至少约30％；C12:0占至少约1％、至少约5％、至少约
10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％；C14:0占至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C16:0占至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:0占至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C18:1占至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:2占少于约7％、少于约5％、少于约3％、少于约1％或约0％；以及饱和脂肪酸占至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％；C14:0占至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C16:0占至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:0占至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C18:1占至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:2占少于约7％、少于约5％、少于约3％、少于约1％或约0％；以及饱和脂肪酸占至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
[0179] 在一些实施方案中，产油微生物甘油三酯油类组合物包含甘油三酯油类，所述甘油三酯油类包含如下的脂肪酸型态：C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C8:0与C10:0的组合总量少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％或是约0％。
[0180] 在一些实施方案中，产油微生物甘油三酯油类组合物包含甘油三酯油类，所述甘油三酯油类具有包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率的脂肪酸型态：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约7∶1、至少约
8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C14:0与C16:0的比率是至少约1∶2、至少约1∶3、至少约1∶4、至少约1∶5、至少约1∶6、至少约1∶7、至少约1∶8、至少约1∶9或至少约1∶10。
8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C14:0与C16:0的比率是至少约1∶2、至少约1∶3、至少约1∶4、至少约1∶5、至少约1∶6、至少约1∶7、至少约1∶8、至少约1∶9或至少约1∶10。
[0181] 在一些实施方案中，本发明提供了一种制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法，所述组合物具有选自由以下组成的组的脂肪酸型态：C8:0占至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％或至少约15％；C10:0占至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或至少约30％；C12:0占至少约1％、至少约
5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％；C14:0占至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；
C16:0占至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；
C18:0占至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C18:1占至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:2占少于约7％、少于约5％、少于约3％、少于约1％或约0％；以及饱和脂肪酸占至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％，其中所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培育产油微生物细胞的群体直到所述产油微生物细胞的细胞干重的至少10％是甘油三酯油类为止；以及(b)从产油微生物细胞中分离甘油三酯油类组合物。
5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％；C14:0占至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；
C16:0占至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；
C18:0占至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％；C18:1占至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％；C18:2占少于约7％、少于约5％、少于约3％、少于约1％或约0％；以及饱和脂肪酸占至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％，其中所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培育产油微生物细胞的群体直到所述产油微生物细胞的细胞干重的至少10％是甘油三酯油类为止；以及(b)从产油微生物细胞中分离甘油三酯油类组合物。
[0182] 在一些实施方案中，制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法产生包含如下脂肪酸型态的甘油三酯油类：C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C14:0、C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C8:0与C10:0的组合总量少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％或是约0％。
[0183] 在一些实施方案中，制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法产生甘油三酯油类，所述甘油三酯油类具有包含选自由以下组成的组的甘油三酯油类比率的脂肪酸型态：C8:0与C10:0的比率是至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约
9∶1或至少约10∶1；C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约
7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；以及C14:0与C16:0的比率是至少
约1∶2、至少约1∶3、至少约1∶4、至少约1∶5、至少约1∶6、至少约1∶7、至少约
1∶8、至少约1∶9或至少约1∶10。
9∶1或至少约10∶1；C10:0与C12:0的比率是至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C12:0与C14:0的比率是至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；C14:0与C12:0的比率是至少约
7∶1、至少约8∶1、至少约9∶1或至少约10∶1；以及C14:0与C16:0的比率是至少
约1∶2、至少约1∶3、至少约1∶4、至少约1∶5、至少约1∶6、至少约1∶7、至少约
1∶8、至少约1∶9或至少约1∶10。
[0184] III.遗传工程改造的方法和材料
[0185] 本发明提供了对本发明方法中使用的微生物(包括原藻细胞和重组宿主细胞)进行遗传修饰的方法和材料，所述微生物包括但不限于重组桑椹形原藻、饶氏原藻、克鲁格尼原藻以及雍滞原藻宿主细胞。为了便于阅读，对这些方法和材料的描述被分成几个小部分。在第1小部分中描述了转化方法。在第2小部分中描述了利用同源重组的遗传工程改造方法。在第3小部分中描述了表达载体和组分。
[0186] 在本发明的某些实施方案中，需要对微生物进行遗传修饰以增强脂质产生、调节由微生物产生的组分的特性或比例，或改良或提供基于多种原料物质的重新生长特征。小球藻，尤其是原始小球藻、极微小球藻、耐热性小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属以及浮水小球藻是优选用于本文所述的遗传工程改造方法中的微生物，但也可以使用其它小球藻物种以及其它品种的微生物。
[0187] 启动子、cDNA和3′UTR以及载体的其它元件可以经由克隆技术，使用从原生来源分离的片段来产生(参见例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Sambrook等(第3版，2001，Cold Spring HarborPress)；和美国专利4,683,202)。或者，可以使用已知方法以合成方式产生元件(参见例如Gene.1995年10月16日；164(1)：49-53)。
[0188] 1.工程改造方法-转化
[0189] 可以通过任何合适的技术转化细胞，所述技术包括例如基因枪法、电穿孔(参见Maruyama等，(2004)，Biotechnology Techniques8：821-826)、玻璃珠转化法以及碳化硅晶须转化法。可以使用的另一种方法包括形成原生质体以及利用CaCl2和聚乙二醇(PEG)将重组DNA引入微藻细胞中(参见Kim等，(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73，报道了利用这种方法转化椭圆形小球藻)。可以利用将微藻共转化以将两种不同的载体分子同时引入细胞中(参见例如Protist 2004年12月；155(4)：381-93)。
[0190] 还可以使用基因枪法(参见例如Sanford，Trends In Biotech.(1988)6：299302；美国专利第4,945,050号)；电穿孔(Fromm等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)(1985)82：
5824 5828)；使用激光束、显微注射或能够将DNA引入微藻中的任何其它方法来转化原藻细胞。
5824 5828)；使用激光束、显微注射或能够将DNA引入微藻中的任何其它方法来转化原藻细胞。
[0191] 在本发明中可以使用用于将转基因引入到微生物(诸如小球藻)中的任何适当的技术。Dawson等(1997)(同上)描述了使用微弹轰击将硝酸还原酶(NR)基因从普通小球藻引入到NR缺陷型耐热性小球藻突变体中，从而产生稳定的转化体。简言之，将0.4微米7
的钨珠用质粒涂布；使3×10 个耐热性小球藻细胞涂于非选择性琼脂板的中间三分之一区域并且用PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery 系统(Bio-Rad)轰击。
的钨珠用质粒涂布；使3×10 个耐热性小球藻细胞涂于非选择性琼脂板的中间三分之一区域并且用PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery 系统(Bio-Rad)轰击。
[0192] 用于将转基因引入到微生物(诸如小球藻)中的优选方法是由Kim等，(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73描述的方法。Kim报道了使用CaCl2和聚乙二醇(PEG)来转化椭8
圆形小球藻原生质体。具体来说，通过使椭圆形小球藻细胞生长到1-2X10 个/毫升的密度来制备原生质体。通过以1600g离心5分钟来回收并且洗涤细胞，并且将细胞重悬于5毫升含有0.6M山梨糖醇、0.6M甘露醇、4％(重量/体积)纤维素(Calbiochem)、2％(重量/体积)离析酶(Calbiochem)以及50单位果胶酶(Sigma)的磷酸盐缓冲液(Ph 6.0)中。在暗处在平缓振荡下在25℃下孵育细胞悬浮液16小时。通过以400g离心5分钟来回收所得到的原生质体。将沉淀物平缓地重悬于5毫升含有0.6M山梨糖醇和0.6M甘露醇的f/2培养基中并且以400g离心5分钟。将这个沉淀物重悬于1毫升含有50mM CaCl2的0.6M山梨糖醇/甘露醇溶液中。然后，将5mg转基因DNA以及25μg小牛胸腺DNA(Sigma)加入0.4
7 8
毫升的10-10 个原生质体中。在室温下15分钟后，加入200μL PNC(40％聚乙二醇4000、
0.8M NaCl、50Mm CaCl2)并且在室温下平缓地混合30分钟。此后，加入补充有0.6M山梨糖醇/甘露醇溶液、1％酵母提取物以及1％葡萄糖的0.6毫升f/2培养基，并且在25℃下在暗处孵育经过转化的细胞12小时以使细胞壁再生。Huang等(2007)(同上)使用一种类似的方法将编码汞还原酶的转基因引入到小球藻属DT种中。
圆形小球藻原生质体。具体来说，通过使椭圆形小球藻细胞生长到1-2X10 个/毫升的密度来制备原生质体。通过以1600g离心5分钟来回收并且洗涤细胞，并且将细胞重悬于5毫升含有0.6M山梨糖醇、0.6M甘露醇、4％(重量/体积)纤维素(Calbiochem)、2％(重量/体积)离析酶(Calbiochem)以及50单位果胶酶(Sigma)的磷酸盐缓冲液(Ph 6.0)中。在暗处在平缓振荡下在25℃下孵育细胞悬浮液16小时。通过以400g离心5分钟来回收所得到的原生质体。将沉淀物平缓地重悬于5毫升含有0.6M山梨糖醇和0.6M甘露醇的f/2培养基中并且以400g离心5分钟。将这个沉淀物重悬于1毫升含有50mM CaCl2的0.6M山梨糖醇/甘露醇溶液中。然后，将5mg转基因DNA以及25μg小牛胸腺DNA(Sigma)加入0.4
7 8
毫升的10-10 个原生质体中。在室温下15分钟后，加入200μL PNC(40％聚乙二醇4000、
0.8M NaCl、50Mm CaCl2)并且在室温下平缓地混合30分钟。此后，加入补充有0.6M山梨糖醇/甘露醇溶液、1％酵母提取物以及1％葡萄糖的0.6毫升f/2培养基，并且在25℃下在暗处孵育经过转化的细胞12小时以使细胞壁再生。Huang等(2007)(同上)使用一种类似的方法将编码汞还原酶的转基因引入到小球藻属DT种中。
[0193] 也已使用电穿孔来转化微生物，诸如小球藻。如由Maruyama等(2004)，Biotechnology Techniques 8：821-826(以引用的方式整体并入本文)所报道，使用这种技术将转基因引入嗜糖小球藻c-211-1a的原生质体中，所述原生质体是由处于静止期的细胞来制备。在600V/cm与900V/cm之间的场强以及约400ms的脉冲持续时间下观测到所引入质粒的暂时表达，其中确定对70-kDa FITC-葡聚糖的高膜通透性。
[0194] 在微生物(如小球藻)中表达转基因的实例可以见于文献(参见例如Current Microbiology，第35卷(1997)，第356-362页；Sheng WuGong Cheng Xue Bao.2000年7月；16(4)：443-6；Current Microbiology，第38卷(1999)，第335-341页；Appl Microbiol Biotechnol(2006)72：197-205；Marine Biotechnology 4，63-73，2002；Current Genetics39：5，365-370(2001)；Plant Cell Reports 18：9，778-780，(1999)；BiologiaPlantarium
42(2)：209-216，(1999)；Plant Pathol.J 21(1)：13-20，(2005))中。同样参见本文实例。
42(2)：209-216，(1999)；Plant Pathol.J 21(1)：13-20，(2005))中。同样参见本文实例。
[0195] 在产油酵母(例如解脂耶氏酵母)中表达转基因的实例可以见于文献(参见例如Bordes等，J Microbiol Methods，6月27日(2007))中。在真菌(例如高山被孢霉、卷枝毛霉以及棕曲霉)中表达转基因的实例也可以见于文献(参见例如Microbiology，7月；153(第7部分)：2013-25(2007)；Mol Genet Genomics，6月；271(5)：595-602(2004)；Curr Genet，3 月；21(3)：215-23(1992)；Current Microbiology，30(2)：83-86(1995)；
Sakuradani，NISR Research Grant，“Studies of Metabolic Engineering ofUseful Lipid-producing Microorganisms”(2004)；以及PCT/JP2004/012021)中。在细菌(诸如大肠杆菌)中表达外源性基因的实例是熟知的；参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等(第3版，2001，Cold Spring Harbor Press。
Sakuradani，NISR Research Grant，“Studies of Metabolic Engineering ofUseful Lipid-producing Microorganisms”(2004)；以及PCT/JP2004/012021)中。在细菌(诸如大肠杆菌)中表达外源性基因的实例是熟知的；参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等(第3版，2001，Cold Spring Harbor Press。
[0196] 根据本发明转化微生物的载体可以通过为本领域技术人员所熟悉的已知技术来制备。用于转化多种小球藻属物种的构建体的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：8。在一个实施方案中，设计用于在微生物(如微藻)中表达脂酶基因的示例性载体含有编码脂酶的基因，所述基因与在微藻中具有活性的启动子可操作地连接。或者，如果载体不含与目标基因可操作连接的启动子，那么所述基因可以被转化到细胞中以使它在载体整合时与内源性启动子可操作地连接。已经证明可以在微藻中实施这种无启动子的转化方法(参见例如Plant Journal 14：4，(1998)，第441-447页)。载体还可以含有第二基因，所述第二基因编码例如赋予针对抗生素或除草剂的抗性的蛋白质，即选择标记。一种或两种基因后面任选地是含有多聚腺苷酸化信号的3′端非翻译序列。编码两种基因的表达盒可以物理方式连接于载体中或单独的载体上。还可以利用微藻的共转化，其中同时使用不同载体分子来转化细胞(参见例如Protist 2004年12月；155(4)：381-93)。可以任选地基于在抗生素存在下生长的能力或其它选择标记在使缺少抗性盒的细胞不能生长的条件下来选择经过转化的细胞。
[0197] 2.工程改造方法-同源重组
[0198] 同源重组是互补DNA序列匹配并且交换同源区域的能力。将转基因DNA(“供体”)引入有机体中，所述DNA含有与所靶向的基因组序列同源的序列(“模板”)，然后在相应的基因组同源序列位点处重组到基因组中。在大多数情况下，该过程的机械步骤包括：(1)使同源DNA片段配对；(2)使供体DNA分子发生双链断裂；(3)使供体DNA的游离末端插入到模板DNA分子中，随后进行DNA合成；以及(4)发生双链断裂修复事件，产生最终的重组产物。
[0199] 在宿主有机体中进行同源重组的能力具有许多实际意义，这是因为其可以在分子遗传学层面上进行并且可以用于制备能够生产特制油的产油微生物。同源重组本质上是精确的基因靶向事件，因此，由相同的靶向序列制备的大多数转基因株系在表型上是基本一致的，需要筛选极少的转化事件。同源重组还将基因插入到宿主染色体中，产生极好的遗传稳定性，甚至在不存在遗传选择的情况下。由于不同的染色体基因座可能会影响基因表达，甚至是异源启动子/UTR介导的基因表达，所以同源重组可以是在未知基因组环境中查找基因座以及评估这些环境对基因表达的影响的方法。
[0200] 利用同源重组的特别有用的遗传工程改造应用是选择特异性宿主调节元件(如启动子/UTR)而以高度特异性方式驱动异源性基因表达。举例来说，用编码选择性标记的异源性基因去除或敲除去饱和酶基因/基因家族可能预期会提高宿主细胞中产生的饱和脂肪酸的总百分比。实施例11描述了同源重组靶向构建体以及在桑椹形原藻中将所述去饱和酶基因去除或敲除的工作实施例。
[0201] 由于同源重组是精确的基因靶向事件，所以它可以被用于对目标基因或目标区域内的任何核苷酸进行精确修饰，只要已经鉴定出足够的侧翼区域既可。因此，可以利用同源重组作为对影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调节序列进行修饰的手段。它还可以被用于修饰蛋白质编码区以试图调节酶活性(如底物特异性、亲和力以及Km)，并且因而使宿主细胞的代谢发生所需的变化。同源重组提供了操控宿主基因组，从而实现基因靶向、基因转换、基因缺失、基因复制、基因倒置以及交换基因表达调节元件(如启动子、增强子以及3′UTR)的有效手段。
[0202] 可以通过利用含有内源性序列片段的靶向构建体来“靶向”宿主细胞内源性基因组内的目标基因或目标区域来实现同源重组。所述靶向序列可以位于目标基因或目标区域的5′端上、目标基因/区域的3′端上或甚至侧接目标基因/区域。所述靶向构建体可以具有另外的载体骨架的超螺旋质粒DNA形式、无载体骨架的PCR产物形式或线性化分子形式转化到宿主细胞中。在一些情况下，首先利用限制酶使转基因DNA(供体DNA)内的同源序列暴露是有利的。这个步骤可以增加重组效率并且减少不期望有的事件发生。增加重组效率的其它方法包括利用PCR产生转化转基因DNA，所述DNA含有与所靶向的基因组序列同源的线性末端。
[0203] 为了进行非限制性说明，供体DNA序列中用于同源重组的区域包括桑椹形原藻的KE858DNA区域。KE858是一个1.3kb基因组片段，它包含与蛋白质的转移RNA(tRNA)家族共有同源性的蛋白质编码区的一部分。DNA印迹法已展示KE858序列在桑椹形原藻(UTEX1435)基因组中以单个拷贝形式存在。这个区域以及使用这个区域进行同源重组靶向的实例已描述于PCT申请第PCT/US2009/66142号中。供体DNA中使用的另一个区域是6S rRNA基因组序列中的部分。在对桑椹形原藻进行同源重组中使用这个序列已描述于以下实施例中。
[0204] 3.载体与载体组分
[0205] 鉴于本文的公开内容，可以通过为本领域技术人员所熟悉的已知技术来制备根据本发明转化微生物的载体。载体通常含有一个或多个基因，其中各基因进行编码以使所需产物(基因产物)表达，并且与调节基因表达或使基因产物靶向重组细胞内的特定位置的一个或多个控制序列可操作地连接。为了辅助阅读，这个小部分被分成几个小部分。A小部分描述了载体中通常含有的控制序列以及本发明提供的新型控制序列。B小部分描述了载体中通常含有的基因以及本发明提供的新型密码子优化方法和利用它们制备的基因。
[0206] A.控制序列
[0207] 控制序列是调节编码序列的表达或将基因产物引导至细胞内或细胞外的特定位置的核酸。调节表达的控制序列包括例如调节编码序列转录的启动子和使编码序列转录终止的终止子。另一个控制序列是位于编码多聚腺苷酸化信号的编码序列末端上的3′端非翻译序列。将基因产物引导至特定位置的控制序列包括编码信号肽的序列，所述序列将它们所连接的蛋白质引导至细胞内或细胞外的特定位置。
[0208] 因此，设计用于在微藻中表达外源性基因的示例性载体含有所需基因产物(例如选择标记、脂质通路修饰酶或蔗糖利用酶)的编码序列，所述编码序列与在微藻中具有活性的启动子可操作地连接。或者，如果载体不含与目标编码序列可操作连接的启动子，那么可以将编码序列转化到细胞中，以使其在载体整合时与内源性启动子可操作地连接。已经证明可以在微藻中实施这种无启动子的转化方法(参见例如Plant Journal 14：4，(1998)，第441-447页)。
[0209] 许多启动子在微藻中具有活性，包括所转化的微藻的内源性启动子以及所转化的藻类的外源性启动子(即来自其它藻类的启动子、来自高等植物的启动子以及来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。在微藻中具有活性的说明性外源性和/或内源性启动子(以及在微藻中具有功能的抗生素抗性基因)描述于PCT公布号2008/151149和其中引用的参考文献中。
[0210] 用于表达外源性基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或可以是异源性基因。一些启动子在超过一种微藻物种中具有活性。其它启动子具有物种特异性。说明性启动子包括已经表明在多个微藻物种中具有活性的启动子，诸如下面实施例中使用的来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的β-微管蛋白，以及病毒启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CMV)启动子和小球藻病毒启动子(参见例如PlantCell Rep.2005年3月；23(10-11)：727-35；J Microbiol.2005年8月；43(4)：361-5；Mar Biotechnol(NY).2002年1月；4(1)：63-73)。适用于在原藻中表达外源性基因的另一个启动子是耐热性小球藻谷氨酸脱氢酶启动子/5′UTR。任选地使用这些序列中含有启动子的至少10个、20个、30个、40个、50个或60个或更多个核苷酸。用于在原藻中表达外源性基因的说明性启动子列于本申请的序列表中，诸如小球藻HUPl基因的启动子(SEQ ID NO：1)和椭圆形小球藻硝酸还原酶启动子(SEQ ID NO：2)。还可以利用小球藻病毒启动子在原藻中表达基因，诸如美国专利6,395,965中的SEQ ID NO：1-7。在原藻中具有活性的另外的启动子可以见于例如Biochem Biophys Res Commun.1994年10月14日；204(1)：187-94；Plant Mol Biol.1994年10月；26(1)：85-93；Virology.2004年8月15日；326(1)：150-9；以及Virology.2004年1月5日；318(1)：214-23中。其它有用的启动子详细描述于以下实施例中。
[0211] 启动子一般可以表征为组成型或诱导型。组成型启动子一般在所有时间(或在细胞生命周期中的某些时间)均具有相同水平的驱动表达的活性或功能。相反，诱导型启动子仅回应于刺激物而具有活性(或使其无活性)，或被显著上调或下调。这两种类型的启动子均可以用于本发明的方法中。用于本发明中的诱导型启动子包括回应于刺激物而介导可操作连接的基因转录的启动子，所述刺激物诸如外源性提供的小分子(例如葡萄糖，对于SEQ ID NO：1的启动子来说)、温度(热或冷)、培养基中缺少氮等。合适的启动子可以激活基本上沉默的基因转录，或优选地明显上调低水平转录的可操作连接基因的转录。以下实施例描述了用于原藻细胞中的另外的诱导型启动子。
[0212] 任选纳入终止区控制序列，并且如果使用所述序列，那么主要选择适当的序列，因为终止区是相对可互换的。终止区可以相对于转录起始区(启动子)是原生的，可以相对于目标DNA序列是原生的或可以从其它来源获得。参见例如Chen和Orozco，Nucleic Acids Res.(1988)16：8411。
[0213] 本发明还提供了使目标基因分室化表达的控制序列和重组基因以及含有它们的载体。所靶向的细胞器是叶绿体、质体、线粒体以及内质网。此外，本发明提供了使蛋白质分泌到细胞外的控制序列和重组基因以及含有它们的载体。
[0214] 可以利用质体靶向信号使在原藻核基因组中表达的蛋白质靶向质体。小球藻内源性质体靶向序列是已知的，诸如小球藻核基因组中编码靶向质体的蛋白质的基因；参见例如基因库登录号AY646197和AF499684，并且在一个实施方案中，本发明的载体中使用所述控制序列以使蛋白质的表达靶向原藻质体。
[0215] 以下实施例描述了使用藻类质体靶向序列使异源蛋白质靶向宿主细胞中的正确的区室。利用桑椹形原藻和原始小球藻细胞制备cDNA文库，并且所述cDNA文库描述于PCT申请第PCT/US2009/066142号中。
[0216] 在本发明的另一个实施方案中，使多肽在原藻中的表达靶向内质网。在表达载体中纳入适当的滞留或分选信号以确保蛋白质滞留于内质网(ER)中而不进入下游的高尔基体中。举例来说，来自WageningenUR-Plant Research International的载体IMPACTVECTOR1.3包括熟知的KDEL滞留或分选信号。利用这种载体实现ER滞留具有实际优势，这是因为已报道这可以使表达水平提高5倍或更多倍。主要原因似乎是与细胞质相比，ER含有较低浓度和/或不同的负责使已表达蛋白发生翻译后降解的蛋白酶。在绿微藻中具有功能的ER滞留信号是已知的。举例来说，参见Proc Natl Acad Sci U S A.2005年4月26日；
102(17)：6225-30。
102(17)：6225-30。
[0217] 在本发明的另一个实施方案中，目标在于使多肽分泌到细胞外进入培养基中。关于可以根据本发明的方法用于原藻中的在小球藻中具有活性的分泌信号的实例，参见Hawkins等，Current Microbiology第38卷(1999)，第335-341页。
[0218] 许多启动子在微藻中具有活性，包括所转化的藻类的内源性启动子以及所转化的藻类的外源性启动子(即来自其它藻类的启动子、来自高等植物的启动子以及来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。在微藻中具有活性的外源性和/或内源性启动子以及在微藻中具有功能的抗生素抗性基因由例如以下文献所描述：Curr Microbiol.1997年12月；35(6)：356-62(普通小球藻)；Mar Biotechnol(NY).2002年1月；4(1)：63-73(椭圆形小球藻)；Mol Gen Genet.1996年10月16日；252(5)：572-9(三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum))；Plant MolBiol.1996年4月；31(1)：1-12(强壮团藻(Volvox carteri))；
Proc Natl AcadSci U S A.1994年11月22日；91(24)：11562-6(强壮团藻)；Falciatore A，Casotti R，Leblanc C，Abrescia C，Bowler C，PMID：10383998，1999年 5月；1(3)：
239-251(Laboratory of Molecular Plant Biology，StazioneZoologica，Villa
Comunale，I-80121 Naples，Italy)(三角褐指藻和威氏海链藻)；Plant Physiol.2002年5月；129(1)：7-12(紫球藻属(Porphyridiumsp.))；Proc Natl Acad Sci U S A.2003年1月21日；100(2)：438-42(莱茵衣藻)；Proc Natl Acad Sci U S A.1990年2月；
87(3)：1228-32(莱茵衣藻)；Nucleic Acids Res.1992年6月25日；20(12)：2959-65；
MarBiotechnol(NY).2002年1月；4(1)：63-73(小球藻属)；Biochem Mol BiolInt.1995年
8月；36(5)：1025-35(莱茵衣藻)；J Microbiol.2005年8月；43(4)：361-5(杜氏藻属)；
Yi Chuan Xue Bao.2005年4月；32(4)：424-33(杜氏藻属)；Mar Biotechnol(NY).1999年5月；1(3)：239-251(海链藻 属(Thalassiosira)和褐指藻 属(Phaedactylum))；
Koksharova，Appl Microbiol Biotechnol 2002年2月；58(2)：123-37(各种物 种)；
Mol Genet Genomics.2004年2月；271(1)：50-9(嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongates))；J.Bacteriol.(2000)，182，211-215；FEMS Microbiol Lett.2003年4月25日；221(2)：155-9；Plant Physiol.1994年6月；105(2)：635-41；Plant Mol Biol.1995年
12月；29(5)：897-907(聚球藻属PCC 7942)；Mar Pollut Bull.2002；45(1-12)：163-7(项圈藻属PCC 7120)；Proc Natl Acad Sci U S A.1984年3月；81(5)：1561-5(项圈藻属(各种藻株))；Proc Natl Acad Sci US A.2001年3月27日；98(7)：4243-8(集胞藻属(Synechocystis))；Wirth，Mol Gen Genet 1989年3月；216(1)：175-7(各种物种)；Mol Microbiol，2002年6月；44(6)：1517-31；以及Plasmid，1993年9月；30(2)：90-105(双管弗氏藻(Fremyella diplosiphon))；Hall等(1993)Gene 124：75-81(莱茵衣藻)；Gruber等(1991).Current Micro.22：15-20；Jarvis等(1991)Current Genet.19：317-322(小球藻属)；关于另外的启动子，还参见美国专利6,027,900中的表1。
Proc Natl AcadSci U S A.1994年11月22日；91(24)：11562-6(强壮团藻)；Falciatore A，Casotti R，Leblanc C，Abrescia C，Bowler C，PMID：10383998，1999年 5月；1(3)：
239-251(Laboratory of Molecular Plant Biology，StazioneZoologica，Villa
Comunale，I-80121 Naples，Italy)(三角褐指藻和威氏海链藻)；Plant Physiol.2002年5月；129(1)：7-12(紫球藻属(Porphyridiumsp.))；Proc Natl Acad Sci U S A.2003年1月21日；100(2)：438-42(莱茵衣藻)；Proc Natl Acad Sci U S A.1990年2月；
87(3)：1228-32(莱茵衣藻)；Nucleic Acids Res.1992年6月25日；20(12)：2959-65；
MarBiotechnol(NY).2002年1月；4(1)：63-73(小球藻属)；Biochem Mol BiolInt.1995年
8月；36(5)：1025-35(莱茵衣藻)；J Microbiol.2005年8月；43(4)：361-5(杜氏藻属)；
Yi Chuan Xue Bao.2005年4月；32(4)：424-33(杜氏藻属)；Mar Biotechnol(NY).1999年5月；1(3)：239-251(海链藻 属(Thalassiosira)和褐指藻 属(Phaedactylum))；
Koksharova，Appl Microbiol Biotechnol 2002年2月；58(2)：123-37(各种物 种)；
Mol Genet Genomics.2004年2月；271(1)：50-9(嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongates))；J.Bacteriol.(2000)，182，211-215；FEMS Microbiol Lett.2003年4月25日；221(2)：155-9；Plant Physiol.1994年6月；105(2)：635-41；Plant Mol Biol.1995年
12月；29(5)：897-907(聚球藻属PCC 7942)；Mar Pollut Bull.2002；45(1-12)：163-7(项圈藻属PCC 7120)；Proc Natl Acad Sci U S A.1984年3月；81(5)：1561-5(项圈藻属(各种藻株))；Proc Natl Acad Sci US A.2001年3月27日；98(7)：4243-8(集胞藻属(Synechocystis))；Wirth，Mol Gen Genet 1989年3月；216(1)：175-7(各种物种)；Mol Microbiol，2002年6月；44(6)：1517-31；以及Plasmid，1993年9月；30(2)：90-105(双管弗氏藻(Fremyella diplosiphon))；Hall等(1993)Gene 124：75-81(莱茵衣藻)；Gruber等(1991).Current Micro.22：15-20；Jarvis等(1991)Current Genet.19：317-322(小球藻属)；关于另外的启动子，还参见美国专利6,027,900中的表1。
[0219] 用于表达外源性基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或可以是异源性基因。一些启动子在超过一种微藻物种中具有活性。其它启动子具有物种特异性。优选的启动子包括已经表明在多个微藻物种中具有活性的启动子，诸如来自莱茵衣藻的RBCS2以及病毒启动子(如花椰菜花叶病毒(CMV)启动子和小球藻病毒)的启动子(参见例如Plant Cell Rep.2005年3月；23(10-11)：727-35；J Microbiol.2005年8月；43(4)：
361-5；Mar Biotechnol(NY).2002年1月；4(1)：63-73)。在其它实施方案中，可以使用葡萄藻属(Botryococcus)苹果酸脱氢酶启动子(如包含SEQ ID NO：150的任一部分的核酸)或莱茵衣藻RBCS2启动子(SEQ ID NO：151)。任选地使用这些序列中含有启动子的至少10个、20个、30个、40个、50个或60个或更多个核苷酸。优选的小球藻属物种内源性启动子是SEQ ID NO：1和SEQID NO：2。
361-5；Mar Biotechnol(NY).2002年1月；4(1)：63-73)。在其它实施方案中，可以使用葡萄藻属(Botryococcus)苹果酸脱氢酶启动子(如包含SEQ ID NO：150的任一部分的核酸)或莱茵衣藻RBCS2启动子(SEQ ID NO：151)。任选地使用这些序列中含有启动子的至少10个、20个、30个、40个、50个或60个或更多个核苷酸。优选的小球藻属物种内源性启动子是SEQ ID NO：1和SEQID NO：2。
[0220] [0004]优选用于在小球藻中表达外源性基因的启动子列于本申请的序列表中，诸如小球藻HUP1基因的启动子(SEQ ID NO：1)和椭圆形小球藻硝酸还原酶启动子(SEQ ID NO：2)。还可以利用小球藻病毒启动子在小球藻中表达基因，诸如美国专利6,395,965中的SEQID NO：1-7。在小球藻中具有活性的另外的启动子可以见于例如Biochem Biophys Res Commun.1994年10月14日；204(1)：187-94；PlantMol Biol.1994年10月；26(1)：85-93；Virology.2004年8月15日；326(1)：150-9；以及Virology.2004年1月5日；318(1)：
214-23。
214-23。
[0221] B.基因和密码子优化
[0222] 基因通常包括启动子、编码序列以及终止控制序列。当通过重组DNA技术进行组装时，基因可以被称为表达盒，并且可以由限制性位点侧接以便于插入到用于将重组基因引入宿主细胞中的载体中。表达盒可以由基因组DNA序列或其它核酸侧接，目的在于促成表达盒通过同源重组稳定整合到基因组中。或者，载体与其表达盒可以保持未整合，在这种情况下，载体通常包括能够使异源性载体DNA进行复制的复制起点。
[0223] 载体中存在的常见基因是编码一种蛋白质的基因，所述蛋白质的表达使得能够将含有所述蛋白质的重组细胞与不表达所述蛋白质的细胞区分开来。所述基因和其相应的基因产物被称作选择标记。用于转化原藻的转基因构建体中可以使用多种选择标记中的任一种。合适的选择标记的实例包括G418抗性基因、硝酸还原酶基因(参见Dawson等(1997)，Current Microbiology 35：356-362)、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT；参见Kim等(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73)、新霉素磷酸转移酶基因ble基因(它赋予脉霉素抗性)(Huang等(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.72：197-205)，以及氨基糖苷-3′-O-磷酸转移酶(SEQ ID NO：194)(其赋予卡那霉素(kanamycin)抗性)。测定微藻对抗生素的敏感性的方法是熟知的。举例来说，Mol Gen Genet.1996年10月16日；252(5)：572-9。
[0224] 在一般用于转化微藻(包括原藻属物种)的转基因构建体中还可以使用不基于抗生素的其它选择标记。赋予可以利用先前不能由微藻利用的某些碳源的能力的基因也可以被用作选择标记。举例来说，桑椹形原藻藻株通常不能很好地依赖蔗糖生长(如果有生长的话)。使用含有蔗糖转化酶基因的构建体可以赋予阳性转化体以蔗糖作为碳底物生长的能力。关于使用蔗糖利用作为选择标记以及其它选择标记的另外的细节论述于以下部分IV中。
[0225] 出于本发明的目的，用于制备本发明的重组宿主细胞的表达载体包括至少2种，并且通常包括3种基因，其中一种基因是选择标记。举例来说，可以通过用本发明载体进行转化来制备本发明的经过遗传工程改造的原藻，所述载体除了选择标记外还包含一种或多种外源性基因，诸如蔗糖转化酶基因或酰基ACP-硫酯酶基因。可以利用诱导型启动子使一种或两种基因表达，所述启动子使得能够控制这些基因表达的相对时机以增强脂质产率以及向脂肪酸酯的转化。两种或更多种外源性基因的表达可以处于相同诱导型启动子的控制下，或处于不同诱导型(或组成型)启动子的控制下。在后一种情况下，可以诱导第一外源性基因表达第一时间段(期间可以诱导或不诱导第二外源性基因表达)并且可以诱导第二外源性基因表达第二时间段(期间可以诱导或不诱导第一外源性基因表达)。
[0226] 在其它实施方案中，两种或更多种外源性基因(除了任何选择标记外)是：脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶，两者组合作用能够产生醇产物。进一步提供了外源性基因的其它组合，包括但不限于脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-辅酶A还原酶，以产生醛。在一个实施方案中，载体提供脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶与脂肪醛脱羰基酶的组合，以产生烷烃。在这些实施方案中的各实施方案中，可以利用诱导型启动子表达一种或多种外源性基因。
[0227] 表达两种或更多种外源性基因的其它说明性本发明载体包括编码蔗糖转运蛋白与蔗糖转化酶的载体以及编码选择标记与分泌型蔗糖转化酶的载体。经过任一种类型的载体转化的重组原藻由于经过工程改造而能够利用甘蔗(和甘蔗衍生糖)作为碳源，所以能够以较低的生产成本生产脂质。插入上述两种外源性基因可以与经由定向和/或随机诱变破坏多糖生物合成相组合，从而使得甚至更多碳流进入脂质生产。单个地和组合利用营养转换、改变脂质生产的工程改造与用外源性酶进行处理来使得由微生物生产的脂质组合物发生变化。所述变化可以是所生产的脂质量、所生产的一种或多种烃物质相对于其它脂质的量和/或微生物中产生的脂质物质类型方面的变化。举例来说，可以对微藻进行工程改造以产生较高量和/或百分比的TAG。
[0228] [0005]为了使重组蛋白最佳表达，使用具有由所转化宿主细胞优先使用的密码子的产生mRNA的编码序列是有益的。因此，转基因的适当表达需要转基因的密码子使用与表达转基因的有机体的特定密码子偏倚性相匹配。这种作用精确的根本机制有许多，包括可用的氨基酰化tRNA池与细胞中合成的蛋白质之间的适当平衡，以及当满足这个需要时使转基因信使RNA(mRNA)更加有效地翻译。当转基因中的密码子使用没有经过优化时，可用的tRNA池不足以使异源性mRNA有效翻译，导致核糖体中止和终止以及转基因mRNA可能不稳定。
[0229] 本发明提供了经过密码子优化的核酸，其可用于使得重组蛋白在原藻中成功表达。通过研究从桑椹形原藻分离的cDNA序列来对原藻属物种中的密码子使用进行分析。这个分析对超过24,000个密码子进行查询，且分析结果示于下表2中。
[0230] 表2.原藻属藻株中的优选密码子使用。
[0231]
[0232] 在其它实施方案中，对于除原藻属藻株以外的微藻藻株，对重组载体中的基因进行密码子优化。举例来说，使基因重编码以在微藻中表达的方法描述于美国专利7,135,290中。可以在例如基因库的密码子使用数据库中获得关于密码子优化的另外的信息。
[0233] 粉核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、盐生杜氏藻以及原始小球藻中的密码子使用的其它非限制性实例分别示出于表28、29以及30中。
[0234] 表28.粉核小球藻中的密码子使用。
[0235]
[0236]
[0237] 表29.盐生杜氏藻中的优选密码子使用。
[0238]
[0239] 表30.原始小球藻中的优选密码子使用。
[0240]
[0241] C.诱导型表达
[0242] [0006]本发明还提供了使用诱导型启动子来表达目标基因。具体来说，使用诱导型启动子来表达脂酶基因允许在微生物生长后在必要时对条件进行调整时产生脂酶以例如在细胞破裂后增强酯基转移、降低反应混合物的水含量和/或加入足够的醇以驱动TAG向脂肪酸酯转化。
[0243] 用于本发明中的诱导型启动子包括回应于刺激物而介导可操作连接的基因转录的启动子，所述刺激物诸如外源性提供的小分子(例如葡萄糖，对于SEQ ID NO：1的启动子而言)、温度(热或冷)、光等。合适的启动子可以激活基本上沉默的基因转录，或优选地明显上调低水平转录的可操作连接基因的转录。在后一种情况下，脂酶转录的水平优选地不会显著干扰表达所述脂酶的微生物的生长。
[0244] 转基因在小球藻中的表达可以经由启动子以诱导性方式进行，所述启动子诸如驱动小球藻己糖转运蛋白基因的启动子(SEQ ID NO：1)。这种启动子在培养基中存在葡萄糖的情况下可以被强烈活化。
[0245] D.两种或更多种外源性基因的表达
[0246] 此外，经过遗传工程改造的微生物(如微藻)可包含并且表达两种或更多种外源性基因，如脂酶基因和溶解基因(例如编码多糖降解酶的基因)。可以利用诱导型启动子使一种或两种基因表达，所述启动子使得能够控制这些基因表达的相对时机以增强脂质产率以及向脂肪酸酯的转化。两种或更多种外源性基因的表达可以处于相同诱导型启动子的控制下，或处于不同诱导型启动子的控制下。在后一种情况下，可以诱导第一外源性基因表达第一时间段(期间可以诱导或不诱导第二外源性基因表达)并且可以诱导第二外源性基因表达第二时间段(期间可以诱导或不诱导第一外源性基因表达)。本文提供了用于对脂质产生微生物进行工程改造以使所述微生物可以代谢蔗糖的载体和方法，可以代谢蔗糖是一种有利的性状，这是因为这会使得经过工程改造的细胞能够将甘蔗原料转化成脂质。
[0247] 本文还提供了表达两种或更多种外源性基因的经过遗传工程改造的微生物株(例如微藻、产油酵母、细菌或真菌)，所述外源性基因例如脂肪酰基-ACP硫酯酶与脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶，这些外源性基因组合作用可产生醇产物。进一步提供了外源性基因的其它组合，包括但不限于脂肪酰基-ACP硫酯酶与脂肪酰基-辅酶A还原酶，以产生醛。另外，本申请提供了脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶与脂肪醛脱羰基酶的组合，以产生烷烃。可以利用诱导型启动子表达一种或多种外源性基因。
[0248] 适用于本发明中的另外的修饰的实例包括对微藻藻株进行遗传工程改造以表达两种或更多种外源性基因，一种外源性基因编码固定碳源(诸如蔗糖)的转运蛋白而第二种外源性基因编码蔗糖转化酶。所得到的可发酵的有机体生产烃的生产成本低于可以由先前已知的生物学烃生产方法所获得的有机体。插入上述两种外源性基因可以与经由定向和/或随机诱变破坏多糖生物合成相组合，从而使得甚至更多碳流进入烃生产。单个地和组合利用营养转换、改变烃生产的工程改造与用外源性酶进行处理来使得由微生物生产的烃组合物发生变化。所述变化可以是所生产的烃量、所生产的一种或多种烃物质相对于其它烃的量和/或微生物中产生的烃物质类型方面的变化。举例来说，可以对微藻进行工程改造以产生较高量和/或百分比的TAG。
[0249] E.分室化表达
[0250] 本发明还提供了目标基因的分室化表达。具体来说，在具体实施方案中，使脂酶的表达靶向一个或多个细胞区室是有利的，其中将脂酶与大部分细胞脂质相隔离直到酯基转移反应开始为止。所靶向的优选细胞器是叶绿体、线粒体以及内质网。
[0251] (1)表达于叶绿体中
[0252] 在本发明的一个实施方案中，使多肽在微生物中的表达靶向叶绿体。用于使异源性基因的表达靶向叶绿体的方法是已知的并且可以被用于本发明中。使外源基因产物靶向于叶绿体中的方法描述于Shrier等，EMBO J.(1985)4：25 32中。关于使核基因产物移位至叶绿体中的转运肽的使用，还参见Tomai等，Gen.Biol.Chem.(1988)263：1510415109和美国专利第4,940,835号。用于引导蛋白质向叶绿体转运的方法还综述于KenaufTIBTECH(1987)5：40 47中。小球藻内源性叶绿体靶向序列是已知的，如小球藻核基因组中编码靶向叶绿体的蛋白质的基因；参见例如基因库登录号AY646197和AF499684。
[0253] Wageningen UR-Plant Research International出售IMPACTVECTOR1.4载体，它使用菊花(Chrysanthemum morifolium)小亚单位蛋白质的分泌信号将异源蛋白质递送至叶绿体基质(细胞质)环境中，跨越双层膜系统进行穿梭。使所述蛋白质与成熟核酮糖二磷酸羧化酶蛋白质的前11个氨基酸融合以允许对信号肽进行适当加工(Wong等，Plant Molecular Biology 20：81-93(1992))。信号肽含有来自RbcS基因的天然内含子。
[0254] 在另一个途径中，对叶绿体基因组进行遗传工程改造以使其表达异源蛋白质。已描述了通过用涂有外源DNA的高速钨微弹轰击受体细胞来使莱茵衣藻(一种绿藻)的叶绿体进行稳定转化。参见例如Boynton等，Science(1988)240：1534 1538；Blowers等，Plant Cell(1989)1：123 132；以及Debuchy等，EMBO J.(1989)8：28032809。使用钨微弹的转化技术由Klein等，Nature(London)(1987)7：70 73描述。对植物和微藻进行叶绿体转化的其它方法是已知的。参见例如美国专利5,693,507；6,680,426；以及Plant Physiol.2002年5月；129(1)：7-12；以及Plant Biotechnol J.2007年5月；5(3)：402-12。
[0255] 如美国专利第6,320,101号(2001年11月20日颁予Kaplan等；其以引用的方式并入本文)中所述，可以对细胞进行化学处理以使每个细胞的叶绿体数目减少到约1个。然后，可以经由粒子轰击将异源性核酸引入细胞中以将至少一种异源性核酸分子引入到叶绿体中。异源性核酸经过选择以使其可以经由同源重组整合到叶绿体基因组中，所述同源重组可以通过叶绿体固有的酶而容易地实现。为了这个目的，异源性核酸除目标基因之外还包括源自于叶绿体基因组的至少一个核酸序列。另外，异源性核酸通常包括选择标记。关于这种技术的另外的细节见于美国专利第4,945,050号和第5,693,507号中，所述专利以引用的方式并入本文。多肽因此可以由叶绿体的蛋白质表达系统产生。
[0256] 美国专利第7,135,620号(2006年11月14日颁予Daniell等；以引用的方式并入本文)描述了叶绿体表达载体和相关方法。表达盒是包括编码序列以及使编码序列可以在叶绿体中适当表达的适当控制序列的DNA构建体。典型表达盒包括下列组分：来自微生物基因或叶绿体基因的5′端非翻译区，如psbA，它使编码目标多肽的DNA序列能够在叶绿体中转录和翻译；编码目标多肽的DNA序列；以及翻译和转录终止区，如叶绿体基因的3′端反向重复区，它可以使所引入基因的RNA稳定，从而增强外源基因表达。所述盒可以任选地包括抗生素抗性基因。
[0257] 通常，表达盒由适当的限制性位点侧接以可以插入到适当基因组中。表达盒可以由来自叶绿体DNA的DNA序列侧接以促成表达盒尤其通过同源重组稳定整合到叶绿体基因组中。或者，表达盒可以保持未整合，在这种情况下，表达盒通常包括能够使异源性DNA在叶绿体中进行复制的叶绿体复制起点。
[0258] 表达盒一般包括能够在叶绿体中表达的基因中的启动子区。启动子区可能包括可获自叶绿体基因的启动子，如来自菠菜或豌豆的psbA基因，或来自玉米的rbcL和atpB启动子区以及Rrna启动子。启动子的实例描述于Hanley-Bowdoin和Chua，TIBS(1987)12：6770；Mullet 等，Plant Molec Biol.(1985)4：3954；Hanley-Bowdoin(1986)PhD.Dissertation，the Rockefeller University；Krebbers等，NucleicAcids Res.(1982)10：
4985 5002；Zurawaki等，Nucleic Acids Res.(1981)9：3251 3270；以及Zurawski等，Proc.Nat′l Acad Sci.U.S.A.(1982)79：7699 7703中。可以鉴定其它启动子并且通过将目标启动子置于无启动子标记基因的5′端并且相对于由例如来自psbA基因的启动子(相对较强的叶绿体启动子)获得的转录观测所述目标启动子的效率来评价如此所鉴定的启动子的相对强度。异源性基因表达的效率另外可以通过多种技术中的任一种来增强。这些技术包括使用多个启动子以串联方式插入于异源性基因的5′端(例如双重psbA启动子)、加入增强子序列等。
4985 5002；Zurawaki等，Nucleic Acids Res.(1981)9：3251 3270；以及Zurawski等，Proc.Nat′l Acad Sci.U.S.A.(1982)79：7699 7703中。可以鉴定其它启动子并且通过将目标启动子置于无启动子标记基因的5′端并且相对于由例如来自psbA基因的启动子(相对较强的叶绿体启动子)获得的转录观测所述目标启动子的效率来评价如此所鉴定的启动子的相对强度。异源性基因表达的效率另外可以通过多种技术中的任一种来增强。这些技术包括使用多个启动子以串联方式插入于异源性基因的5′端(例如双重psbA启动子)、加入增强子序列等。
[0259] 可以使用在小球藻叶绿体中具有活性的多种启动子以使外源性基因在小球藻叶绿体中表达，如在基因库登录号NC_001865(普通小球藻叶绿体，完整基因组)中存在的启动子。
[0260] 在需要使异源性基因进行诱导型表达的情况下，在表达盒中可以包括诱导型启动子和/或含有在转录和/或翻译水平上提供调节作用(在3′端上)的序列的5′端非翻译区。举例来说，5′端非翻译区可以来自于表达可以受光调节的基因。同样，可使用3′端反向重复区使异源性基因的RNA稳定。可以根据表达会回应于特定目标刺激物而有所增强而在不存在所述刺激物的情况下低表达或不表达来鉴定诱导型基因。举例来说，可以根据在光照射期间表达出现增强，而在弱光或无光的情况下表达出现明显减少或不表达来鉴定光诱导型基因。来自绿微藻的光调节型启动子是已知的(参见例如Mol Genet Genomics.2005年12月；274(6)：625-36)。
[0261] 所使用的终止区主要是适当的终止区，这是因为终止区在叶绿体和细菌间似乎是相对可互换的。终止区可以相对于转录起始区是原生的，可以相对于目标DNA序列是原生的或可以从其它来源获得。参见例如Chen和Orozco，Nucleic Acids Res.(1988)16：8411。
[0262] 可以通过许多方法中的任一种将表达盒转化到目标植物细胞中。这些方法包括例如基因枪法(参见例如Sanford，Trends In Biotech.(1988)6：299302；美国专利第4,945,050号)；电穿孔(Fromm等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)(1985)82：5824 5828)；
使用激光束、显微注射或能够将DNA引入叶绿体中的任何其它方法。
使用激光束、显微注射或能够将DNA引入叶绿体中的任何其它方法。
[0263] 对适用于微生物(如微藻)中的叶绿体表达载体的另外的描述见于美国专利第7,081,567号(2006年7月25日颁予Xue等)；第6,680,426号(2004年1月20日颁予
Daniell等)；以及第5,693,507号(1997年12月2日颁予Daniell等)中。
Daniell等)；以及第5,693,507号(1997年12月2日颁予Daniell等)中。
[0264] 可以利用叶绿体靶向信号使在小球藻核基因组中表达的蛋白质靶向叶绿体。小球藻内源性叶绿体靶向序列是已知的，如小球藻核基因组中编码靶向叶绿体的蛋白质的基因；参见例如基因库登录号AY646197和AF499684。蛋白质还可以通过将基因直接插入于叶绿体基因组中以表达于小球藻叶绿体中。通常经由同源重组来进行叶绿体转化，并且叶绿体转化可以在已知叶绿体基因组序列以能够建立靶向载体的情况下进行(参见例如小球藻叶绿体的完整基因组序列；基因库登录号NC_001865)。关于叶绿体转化的细节，参见本文前几部分。
[0265] (2)表达于线粒体中
[0266] 在本发明的另一个实施方案中，使多肽在微生物中的表达靶向线粒体。用于使外源基因产物靶向于线粒体中的方法(Boutry等，Nature(London)(1987)328：340 342)已有所描述，包括在绿微藻中的方法(参见例如Mol Gen Genet.1993年1月；236(2-3)：235-44)。
[0267] 举例来说，编码合适的分泌信号的表达载体可以使异源性蛋白质靶向线粒体。来自Wageningen UR-Plant Research International的IMPACTVECTOR1.5载体使用酵母CoxIV分泌信号，已展示所述分泌信号可以在线粒体基质中递送蛋白质。使所述蛋白质与酵母CoxIV蛋白的前4个氨基酸融合以允许对信号肽进行适当加工(Kohler等，Plant J 11：613-621(1997))。其它线粒体靶向序列是已知的，包括在绿微藻中具有功能的靶向序列。举例来说，参见FEBS Lett.1990年1月29日；260(2)：165-8；和J Biol Chem.2002年2月
22日；277(8)：6051-8。
22日；277(8)：6051-8。
[0268] 可以利用线粒体靶向信号使在小球藻核基因组中表达的蛋白质靶向线粒体。关于线粒体蛋白质靶向和转化的细节，参见本文前几部分。
[0269] (3)表达于内质网中
[0270] 在本发明的另一个实施方案中，使多肽在微生物中的表达靶向内质网。在表达载体中纳入适当的滞留或分选信号以确保蛋白质滞留于内质网(ER)中而不进入下游的高尔基体中。举例来说，来自Wageningen UR-Plant Research International的IMPACTVECTOR1.3载体包括熟知的KDEL滞留或分选信号。利用这种载体实现ER滞留具有实际优势，这是因为已报道这可以使表达水平提高5倍或更多倍。主要原因似乎是与细胞质相比，ER含有较低浓度和/或不同的负责使已表达蛋白发生翻译后降解的蛋白酶。在绿微藻中具有功能的ER滞留信号是已知的。举例来说，参见Proc Natl Acad Sci U S A.2005年4月26日；
102(17)：6225-30。
102(17)：6225-30。
[0271] 虽然本发明的方法和材料使得可以将任何外源性基因引入到微生物(例如原藻)中，但是如以下几个部分中所论述，尤其关注与蔗糖利用和脂质通路修饰相关的基因。
[0272] IV.选择标记
[0273] 1.蔗糖利用
[0274] 在实施方案中，本发明的重组原藻细胞进一步含有一种或多种外源性的蔗糖利用基因。在各种实施方案中，所述一种或多种基因编码一种或多种蛋白，所述蛋白选自由果糖激酶、葡萄糖激酶、己糖激酶、蔗糖转化酶、蔗糖转运蛋白组成的组。举例来说，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达使得原藻将蔗糖从培养基转运到细胞中并且将蔗糖水解，以产生葡萄糖和果糖。任选地，在内源性己糖激酶的活性不足以最大程度地使果糖磷酸化的情况下，还可以表达果糖激酶。合适的蔗糖转运蛋白的实例是基因库登录号CAD91334、CAB92307以及CAA53390。合适的果糖激酶的实例是基因库登录号P26984、P26420以及CAA43322。
[0275] 在一个实施方案中，本发明提供了分泌蔗糖转化酶的原藻宿主细胞。蔗糖转化酶的分泌使得不需要表达能够将蔗糖转运到细胞中的转运蛋白。这是因为分泌的转化酶催化蔗糖分子转化成葡萄糖分子和果糖分子，后两者均可以由本发明提供的微生物转运和利用。举例来说，具有分泌信号(如SEQ ID NO：4(来自酵母)、SEQ ID NO：5(来自高等植物)、SEQ ID NO：6(真核细胞共有分泌信号)以及SEQ ID NO：7(来自高等植物的信号序列与真核细胞共有信号序列的组合))的蔗糖转化酶(如SEQ ID NO：3)的表达使得在细胞外产生转化酶活性。所述蛋白质的表达(能够通过本文中公开的遗传工程改造方法使其表达)使得细胞已经能够利用细胞外的葡萄糖作为能量来源以利用蔗糖作为细胞外的能量来源。
[0276] 在含有蔗糖的培养基中表达转化酶的原藻属物种是生产油类的优选微藻物种。这种具有完全活性的蛋白质的表达以及细胞外靶向使得所得到的宿主细胞能够利用蔗糖生长，而它们的未经过转化的对应物则不能。因此，本发明提供了具有经过密码子优化的转化酶基因的原藻重组细胞，所述转化酶基因包括但不限于酵母转化酶基因，它被整合到细胞基因组中以使转化酶基因表达(如通过转化酶活性和蔗糖水解所评估)。本发明还提供了在原藻重组细胞中用作选择标记的转化酶基因(这是因为这些细胞能够利用蔗糖生长，而它们的未经过转化的对应物则不能)；以及利用转化酶作为藻类分子遗传学的有效选择标记对重组宿主细胞进行选择的方法。
[0277] 蔗糖转化酶在原藻中成功表达还说明了本发明的另一个方面，因为这表明异源(重组)蛋白质可以在藻类细胞中表达，并且以具有完全活性和功能的形式被成功转运到细胞外并且进入培养基中。因此，本发明提供了用于在微藻中表达多种不同的异源蛋白质并且将它们分泌到宿主细胞外的方法和试剂。所述蛋白质包括例如工业酶(如脂酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶(例如SEQ ID NO：190-191)、酯酶、氧化还原酶、转移酶、乳糖酶、异构酶以及转化酶)以及治疗性蛋白(如生长因子、细胞因子、包含两条轻链和两条重链的全长抗体、Fab、scFv(单链可变片段)、骆驼型抗体、抗体片段、抗体片段融合蛋白、抗体受体融合蛋白、胰岛素、干扰素以及胰岛素样生长因子)。
[0278] 蔗糖转化酶在原藻中的成功表达还说明了本发明的另一个方面，因为这提供了利用真菌转运肽在藻类中引导原藻中蛋白质分泌的方法和试剂；以及确定肽是否能够在原藻细胞中充当转运肽以及其充当转运肽的能力的方法和试剂。本发明的方法和试剂可以被用作鉴定在这些方法中能够成功将蛋白运送到细胞外并且使得酵母转化酶得到极大利用的其它转运肽的工具和平台。如本实施例中所表明，除去内源性酵母转化酶转运肽并且将其替换为其它转运肽(宿主藻类内源性的或是来自其它来源的(真核细胞、原核细胞以及病毒))可以鉴定任何目标肽是否可以充当引导蛋白质从细胞中排出的转运肽。
[0279] 合适的蔗糖转化酶的实例包括由基因库登录号CAB95010、NP_012104以及CAA06839标示的蔗糖转化酶。合适的转化酶的非限制性实例列于下表3中。以下序列表中包括各个所列转化酶的氨基酸序列。在一些情况下，适用于本发明的方法和载体中的外源性蔗糖利用基因编码与选自表3的蔗糖转化酶具有至少40％、50％、60％、75％或90％或更高氨基酸一致性的蔗糖转化酶。
[0280] 表3.蔗糖转化酶。
[0281]
[0282]
[0283] 由原藻将转化酶分泌到培养基中使得细胞同样能够利用甘蔗加工产生的废糖蜜生长，如同其利用纯试剂级葡萄糖生长一般；利用甘蔗加工的这种低价废产品可以显著节省脂质和其它油类生产的成本。因此，本发明提供了一种微生物培养物，所述培养物含有原藻微生物群体以及包含(i)蔗糖和(ii)蔗糖转化酶的培养基。在各种实施方案中，培养物中的蔗糖来源于高粱、糖用甜菜、甘蔗、糖蜜或经过解聚的纤维素物质(其可能任选地含有木质素)。在另一个方面，本发明的方法和试剂可以显著增加可以被重组原藻利用的原料的数目和类型。虽然本文示例的微生物经过改变以使它们可以利用蔗糖，但可以利用本发明的方法和试剂以使原料(如纤维素)可以由能够分泌纤维素酶、果胶酶、异构酶等的本发明经过工程改造的宿主微生物利用，从而使酶促反应的分解产物不再仅仅单纯地由宿主耐受，而是可以作为碳源由宿主利用。这方面的实例描述于下文以及实施例中，在所述实施例中，微生物经过工程改造以表达可分泌的α-半乳糖苷酶，从而赋予水解寡糖中的α-半乳糖苷键的能力，所述α-半乳糖苷键诸如棉子糖和水苏糖(为存在于农业废物流中的两种寡糖)中所含的α-半乳糖苷键。
[0284] 2.α-半乳糖苷酶表达
[0285] 虽然如上文所述的蔗糖转化酶的表达会赋予原藻细胞可以更高效地利用蔗糖作为碳源的能力(经由使二糖蔗糖中果糖分子与葡萄糖分子之间的α-键进行酶水解)，但水解寡糖中的其它类型的α-键的其它酶的表达也能够赋予原藻细胞利用其它碳源的能力。这些酶的表达(以及所产生的可以利用原藻和其它微藻细胞通常不能够利用的碳源的能力)可以通过使得能够选择能够利用这些碳源生长的阳性克隆而用作针对这些转基因原藻细胞的选择标记。
[0286] 在一个实施方案中，本发明的重组原藻细胞进一步含有一种或多种编码多糖降解酶的外源性基因。在各种实施方案中，一种或多种编码多糖降解酶的基因是编码分泌型α-半乳糖苷酶的基因。外源性分泌型α-半乳糖苷酶在原藻细胞中的表达赋予所述经过转化的藻株利用含有D-半乳糖苷键(如半乳糖单糖单位与葡萄糖单糖单位之间的α-键)的糖(碳源)生长的能力。表达外源性分泌型α-半乳糖苷酶的原藻属藻株将能利用二糖，如蜜二糖(由α-D-半乳糖-葡萄糖构成的二糖)。
[0287] 糖，如棉子糖(包含α-连接型半乳糖-葡萄糖-果糖的三糖)和水苏糖(由两个α-连接型D-半乳糖单位，后面有α-连接型葡萄糖以及果糖构成的四糖)以相当大的比例存在于农业废物流中，所述农业废物流如甜菜浆(棉子糖)和大豆粉(水苏糖)。所述农业残余物代表了可以由能够利用它们的微生物(包括原藻)转化成油类的重要的未开发的碳源。
[0288] 原藻属藻株不能利用任何显著量的寡糖，或根本不能利用寡糖，所述寡糖如棉子糖和水苏糖。在棉子糖和水苏糖的情况下，虽然表达蔗糖转化酶的转基因藻株(如上文所述)已经能够水解蔗糖的α-半乳糖苷衍生物中果糖与葡萄糖之间的α-键，但仍然不能利用其余寡糖，因为蔗糖转化酶不能裂解所述糖中其余的α-键而所得的二糖不可被利用。在另一个实施方案中，本发明的重组原藻细胞包含编码蔗糖转化酶的外源性基因和编码α-半乳糖苷酶的外源性基因。因此，表达蔗糖转化酶和α-半乳糖苷酶的藻株将能够完全水解寡糖，如棉子糖和水苏糖，从而能够消耗组分单体。另外，α-半乳糖苷酶编码基因可以被用作转化的选择标记。含有外源性α-半乳糖苷酶基因的克隆将具有利用蜜二糖生长的能力。适用于原藻属藻株中的α-半乳糖苷酶基因的实例包括来自卡尔酵母(Saccharomyces carlbergensis)的MEL1基因、来自黑曲霉(Aspergilus niger)的AglC基因。有趣的是，即使根据原藻属藻株中的优选密码子使用对基因进行优化，也不是所有的α-半乳糖苷酶基因均在原藻属物种中具有功能。以下实施例表明转基因原藻细胞在使用经过密码子优化的来自卡尔酵母的MEL1基因和来自黑曲霉的AglC基因而非来自高等植物瓜尔豆(Cyamopsis tetragonobola/Guarbean)的α-半乳糖苷酶编码基因进行转化时能够利用蜜二糖生长。
[0289] 3.硫胺素营养缺陷补充
[0290] 已知包括桑椹形原藻的原藻属藻株是硫胺素营养缺陷性藻株(参见例如Ciferri，O.(1956)Nature，第178卷，第1475-1476页)，意思是这些藻株需要营养培养基中的硫胺素来生长。硫胺素营养缺陷是由硫胺素生物合成通路中的酶突变或表达不足所致。经过补充的表达硫胺素生物合成通路中缺少的酶的转基因藻株则能够在不加入硫胺素的情况下生长，因此降低营养培养基的成本并且使得所得到的微藻生物质从动物营养学观点来看更合乎需要。用硫胺素生物合成通路酶补充也可以用作选择标记，这是因为转基因赋予能够利用不含硫胺素的培养板/培养基生长的能力。
[0291] 在一个实施方案中，本发明的重组原藻细胞进一步含有一种或多种编码硫胺素生物合成通路酶的外源性基因。在另一个实施方案中，本发明的重组原藻细胞包含编码来自藻类、植物或蓝藻细菌来源的羟甲基嘧啶磷酸合酶(例如SEQ ID NO：192)的外源性基因。在再其它实施方案中，羟甲基嘧啶磷酸合酶由THIC基因编码。在再其它实施方案中，THIC基因是胶球藻(Coccomyxa)C-169THIC、拟南芥(Arabidopsis thaliana)THIC、集胞藻属PCC 6803 THIC或肠道沙门氏菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimuriumstr.)THIC(SEQ ID NO：193)。以下实施例详述对桑椹形原藻UTEX1435进行工程改造而使其具有经过恢复的硫胺素原养性。
[0292] 4.其它选择标记
[0293] 用于转化微生物(如小球藻)的转基因构建体中可以使用多种选择标记中的任一种。合适的选择标记的实例包括硝酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)、新霉素磷酸转移酶基因以及ble基因(赋予脉霉素抗性)。测定微藻对抗生素的敏感性的方法是熟知的。举例来说，Mol Gen Genet.1996年10月16日；252(5)：572-9。
[0294] 更特定来说，Dawson等(1997)，Current Microbiology35：356-362(以引用的方式整体并入本文)描述了针对NR缺陷型耐热性小球藻突变体使用来自普通小球藻的硝酸还原酶(NR)基因作为选择标记。Kim等(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73(以引用的方式整体并入本文)公开了使用HPT基因作为选择标记用于使椭圆形小球藻转化。Huang等(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.72：197-205(以引用的方式整体并入本文)报道了针对小球藻属DT种使用Sh ble作为选择标记。
[0295] V.脂质通路工程改造
[0296] 除了改变微生物(例如微藻、产油酵母、真菌或细菌，如原藻)利用原料(如含有蔗糖的原料)的能力以外，本发明还提供了经过修饰以使所生产的脂质的特性和/或比例发生改变的重组微生物(例如原藻)。可以进一步或可选地对该通路进行修饰，以改变经由对脂肪酸通路中的脂质和中间体进行酶促加工而产生的各种脂质分子的特性和/或比例。在各种实施方案中，本发明的重组微生物(例如原藻细胞)相对于其未经过转化的对应物来说能够优化每单位体积和/或每单位时间的脂质产率、碳链长度(例如对于可再生柴油生产或需要脂质原料的工业化学品应用)、使双键或三键数目减少(任选地减少至零)，以及增加特定脂质物质或不同脂质群体的氢∶碳比。另外，产生合乎需要的烃的微生物可以经过工程改造以产生较高量的所述组分或以较大的特异性产生所述组分。
[0297] 在微藻的情况下，一些野生型细胞已具有优良的生长特征，但不产生所需类型或量的脂质。实例包括但不限于桑椹藻属、席藻属、阿格藻属、卡特藻属、鳞孔藻属、桑椹藻属、菱形藻属、鳞孔藻属、项圈藻属、裸藻属、水绵属、绿球藻属、四角藻属、颤藻属、扁裸藻属以及绿梭藻属，它们具有能够在城市污水或废水中生长的合乎需要的生长特征。所述细胞以及小球藻属、原藻属以及其它微生物的物种可以经过工程改造而具有得到改良的脂质生产特征。所需的特征包括优化每单位体积和/或每单位时间的脂质产率、碳链长度(例如对于生物柴油生产或需要烃原料的工业应用)、使双键或三键数目减少(任选地减少至零)、除去或消除环和环状结构，以及增加特定脂质物质或不同脂质群体的氢∶碳比。另外，产生适当烃的微藻还可以经过工程改造而具有甚至更合乎需要的烃输出量。所述微藻的实例包括小球藻属和原藻属的物种。
[0298] 在具体实施方案中，控制代谢中的分支点向脂肪酸合成进行的一种或多种关键酶被上调或下调，以促进脂质生产。可以例如通过用表达构建体转化细胞来实现上调，在所述表达构建体中例如利用强启动子和/或使转录增加的增强子元件使编码目标酶的基因表达。所述构建体可以包括选择标记，以能够对转化体进行选择，使得构建体扩增和所编码的酶的表达水平增加。适于根据本发明的方法上调的酶的实例包括丙酮酸脱氢酶，其在丙酮酸向乙酰辅酶A转化中发挥作用(来源于微藻的一些酶的实例包括基因库登录号NP_415392；AAA53047；Q1XDM1；以及CAF05587)。丙酮酸脱氢酶的上调可以增加乙酰辅酶A的产生，并且从而增加脂肪酸合成。乙酰辅酶A羧化酶催化脂肪酸合成的起始步骤。因此，可以使这种酶上调，以增加脂肪酸的产生(来源于微藻的一些酶的实例包括基因库登录号BAA94752；AAA75528；AAA81471；YP_537052；YP_536879；NP_045833；以及BAA57908)。还可以通过上调酰基载体蛋白(ACP)增加脂肪酸的产生，所述ACP在脂肪酸合成期间运载正在增长的酰基链(来源于微藻的一些ACP的实例包括基因库登录号A0T0F8；P51280；
NP_849041；YP_874433)。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。使这种酶上调可以增加脂肪酸的产生(来源于微藻的一些酶的实例包括基因库登录号AAA74319；
AAA33122；AAA37647；P44857；以及ABO94442)。
NP_849041；YP_874433)。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。使这种酶上调可以增加脂肪酸的产生(来源于微藻的一些酶的实例包括基因库登录号AAA74319；
AAA33122；AAA37647；P44857；以及ABO94442)。
[0299] 基因的上调和/或下调可以被应用于控制脂肪酸生物合成通路的基因表达的全局调控因子。因此，脂肪酸合成中的一种或多种全局调控因子可以在适当时被上调或下调，以分别抑制或增强多种脂肪酸合成基因的表达并最终增加脂质的产生。实例包括甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)，如SREBP-1a和SREBP-1c(例如参见基因库登录号NP_035610和Q9WTN3)。
[0300] 本发明还提供了重组微生物(例如原藻细胞)，所述微生物已经过修饰而含有一种或多种编码脂质修饰酶的外源性基因，所述脂质修饰酶如脂肪酰基-ACP硫酯酶(例如美叶桉(C.callophylla)(SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：146；还参见表4))、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶(参见表6)、脂肪酰基-辅酶A还原酶(参见表7)、脂肪醛脱羰基酶(参见表8)、脂肪醛还原酶、去饱和酶(如硬脂酰基-ACP去饱和酶(例如经过密码子优化的普通种蓖麻(R.communis)SAD、SEQ ID NO：147以及SEQ ID NO：148)以及脂肪酰基去饱和酶和角鲨烯合酶(参见基因库登录号AF205791)。在一些实施方案中，将编码脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白的基因任选地连同编码其它脂质修饰酶的一种或多种基因一起转化到原藻细胞中。在其它实施方案中，ACP与脂肪酰基-ACP硫酯酶相互具有亲和力，这在两者一起用于本发明的微生物和方法中时赋予优势，与它们在特定组织或有机体中是否天然共表达无关。因此，本发明涵盖了这些酶的天然共表达对，以及具有亲和力而彼此相互作用以促成从ACP裂解长度特异性碳链的那些酶。
[0301] 在再其它实施方案中，将编码去饱和酶的外源性基因连同编码对脂质饱和度进行修饰的其它脂质修饰酶的一种或多种基因一起转化到微生物(例如原藻细胞)中。在其它实施方案中，使内源性去饱和酶基因在微生物(例如原藻细胞)中过表达(例如经由引入所述基因的另外的拷贝)。例如硬脂酰基-ACP去饱和酶(参见例如基因库登录号AAF15308；ABM45911；以及AAY86086)催化硬脂酰基-ACP转化成油酰基-ACP。使这种基因上调可以增加细胞产生的单不饱和脂肪酸的比例；而下调可以减少单不饱和物质的比例。出于说明的目的，硬脂酰基-ACP去饱和酶(SAD)负责由C18:0前体合成C18:1脂肪酸。另一个去饱和酶家族是脂肪酰基去饱和酶(FAD)，包括δ-12脂肪酸去饱和酶(Δ12FAD)。
这些去饱和酶也对脂质饱和度进行修饰。出于说明的目的，δ-12脂肪酸去饱和酶负责由C18:1前体合成C18:2脂肪酸。同样，可以控制一种或多种甘油脂去饱和酶的表达以改变不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率，所述去饱和酶诸如ω-6-脂肪酸去饱和酶、ω-3-脂肪酸去饱和酶或ω-6-油酸去饱和酶。在一些实施方案中，可以针对所需的碳链长度选择去饱和酶，以使去饱和酶能够在指定碳链长度的底物中或具有指定范围内的碳链长度的底物中进行位置特异性修饰。在另一个实施方案中，如果所需的脂肪酸型态是单不饱和油脂(如C16:1和/或C18:1)增加，那么可以使SAD过表达或异源性SAD表达联合使脂肪酰基去饱和酶(FAD)沉默或失活(例如经由突变、RNAi、敲除内源性去饱和酶基因等)。
这些去饱和酶也对脂质饱和度进行修饰。出于说明的目的，δ-12脂肪酸去饱和酶负责由C18:1前体合成C18:2脂肪酸。同样，可以控制一种或多种甘油脂去饱和酶的表达以改变不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率，所述去饱和酶诸如ω-6-脂肪酸去饱和酶、ω-3-脂肪酸去饱和酶或ω-6-油酸去饱和酶。在一些实施方案中，可以针对所需的碳链长度选择去饱和酶，以使去饱和酶能够在指定碳链长度的底物中或具有指定范围内的碳链长度的底物中进行位置特异性修饰。在另一个实施方案中，如果所需的脂肪酸型态是单不饱和油脂(如C16:1和/或C18:1)增加，那么可以使SAD过表达或异源性SAD表达联合使脂肪酰基去饱和酶(FAD)沉默或失活(例如经由突变、RNAi、敲除内源性去饱和酶基因等)。
[0302] 在其它实施方案中，微生物(例如原藻细胞)已经过修饰而具有突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在一些情况下，所述突变型内源性去饱和酶基因是脂肪酸去饱和酶(FAD)。在其它情况下，所述突变型内源性去饱和酶基因是硬脂酰基酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)。以下实施例11描述了靶向去除或敲除硬脂酰基-ACP去饱和酶和δ-12脂肪酸去饱和酶。
[0303] 在一些情况下，一种或多种遗传工程改造技术配合用以获得产生所需脂质型态的转基因细胞是有利的。在一个实施方案中，微生物(例如原藻细胞)包含突变型内源性去饱和酶基因和一种或多种外源性基因。在非限制性实施例中，具有突变型内源性去饱和酶基因的原藻细胞还可以表达外源性脂肪酰基-ACP硫酯酶基因和/或蔗糖转化酶基因。以下实施例11描述了内源性SAD已经过靶向去除或敲除并且还表达樟树C14优先型硫酯酶和蔗糖转化酶的转基因原藻细胞。在这种情况下，所述转基因原藻细胞产生的脂质型态与在动物脂中所见到的脂质型态极为接近。动物脂通常源自于炼好的牛脂肪或羊脂肪，在室温下是固体并且被用于食品、化妆品以及化学工业方面的多种应用中。动物脂的脂肪酸型态是：C14:0占4％；C16:0占26％；C16:1占3％；C18:0占14％；C18:1占41％；C18:2占3％；以及C18:3占1％。如以下实施例11中所示，内源性SAD已经过靶向去除或敲除并且表达樟树C14优先型硫酯酶的转基因原藻细胞的克隆具有如下的脂质型态：C12和碳链长度更短的脂肪酸占少于1％；C14:0占2.74％至6.13％；C16:0占23.07％至25.69％；
C18:0占7.02％至11.08％；C18:1占42.03％至51.21％；以及C18:2占9.37％至13.45％(以面积百分比形式表示)。在一些情况下，转基因原藻细胞具有如下的脂质型态：C14:0占
3％-5％；C16:0占25％-27％；C18:0占10％-15％；以及C18:1占40％-45％。
C18:0占7.02％至11.08％；C18:1占42.03％至51.21％；以及C18:2占9.37％至13.45％(以面积百分比形式表示)。在一些情况下，转基因原藻细胞具有如下的脂质型态：C14:0占
3％-5％；C16:0占25％-27％；C18:0占10％-15％；以及C18:1占40％-45％。
[0304] 因此，在具体实施方案中，对本发明的微生物进行遗传工程改造以使其表达一种或多种外源性基因，所述外源性基因选自酰基-ACP硫酯酶、酰基-辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶或天然共表达的酰基载体蛋白。合适的表达方法已关于脂酶基因的表达描述于上文中，所述方法尤其包括诱导型表达和分室化表达。脂肪酰基-ACP硫酯酶在脂质合成期间从酰基载体蛋白(ACP)上裂解脂肪酸。通过进一步的酶促加工，所裂解的脂肪酸然后与辅酶组合，以产生酰基-辅酶A分子。该酰基-辅酶A是脂肪酰基-辅酶A还原酶的酶活性的底物(产生醛)以及脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶的底物(产生醇)。上文鉴定的脂肪酰基-辅酶A还原酶作用产生的醛进一步是脂肪醛还原酶的酶活性的底物(产生醇)或是脂肪醛脱羰基酶的酶活性的底物(产生烷烃或烯烃)。
[0305] 在一些实施方案中，由本文所述的方法产生的脂肪酸、甘油脂或相应的伯醇、醛、烷烃或烯烃含有8个、10个、12个或14个碳原子。优选用于生产柴油、生物柴油、可再生柴油或喷气燃料的脂肪酸或应用于工业中的相应伯醇、醛、烷烃以及烯烃含有8个至14个碳原子。在某些实施方案中，上述脂肪酸以及其它相应的烃分子是饱和的(没有碳-碳双键或三键)；单不饱和的(单个双键)；多不饱和的(两个或更多个双键)；是直链(不是环状)或支链的。对于燃料生产，优选较大的饱和度。
[0306] 上文所述的酶具有优先水解含有特定数目的碳原子的底物的特异性。举例来说，脂肪酰基-ACP硫酯酶能够从ACP优先裂解下具有12个碳原子的脂肪酸。在一些实施方案中，ACP与长度特异性硫酯酶相互具有亲和力，使得它们特别适于以组合形式使用(例如外源性ACP和硫酯酶基因可以在产生它们的特定组织或有机体中天然共表达)。因此，在各种实施方案中，本发明的重组原藻细胞可以含有外源性基因，所述外源性基因编码具有针对底物中所含碳原子数目催化酶活性(例如从ACP裂解下脂肪酸、将酰基-辅酶A还原成醛或醇，或将醛转化成烷烃)的特异性的蛋白质。在各种实施方案中，酶特异性可以是针对具有8个至34个碳原子，优选地8个至18个碳原子，并且更优选地8个至14个碳原子的底物。优选特异性是针对具有更少个(即12个)而不是更多个(即18个)碳原子的底物。
[0307] 适用于本发明的微生物和方法中的其它脂肪酰基-ACP硫酯酶包括但不限于列于表4中的硫酯酶。
[0308] 表4.脂肪酰基-ACP硫酯酶和基因库登录号。
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313] 以下实施例描述了来自细叶萼距花、加州月桂、樟树、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻以及美国榆的异源脂肪酰基-ACP硫酯酶在原藻属物种中的成功靶向和表达。此外，证实表达这些异源脂肪酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞中脂肪酸型态发生改变。由于一般来说藻类硫酯酶与高等植物硫酯酶之间以及桑椹形原藻脂肪酰基-ACP硫酯酶与上面所列的异源脂肪酰基-ACP硫酯酶之间缺乏序列一致性，所以这些结果非常出乎意料。
如实施例中所示，这些异源性硫酯酶在原藻中的表达可以产生能够产生油类/脂质的转基因微藻，所产生的油类/脂质具有事实上独特的脂肪酸型态，所述脂肪酸型态目前未能由可商购的种子作物，甚至经由共混多种种子作物油类而获得。表5展示了常见的可商购的种子油类的脂肪酸型态。以下所有的可商购的种子油类的数据均汇编自美国药典食品与化学法典(USPharmacopeias Food and Chemicals Codes，2010年-2011年第7版)。动物脂数据来自于美国国家研究委员会：动物产品的脂肪含量和组成(National Research Council：Fat Content and Composition of AnimalProducts)(1976年)。
如实施例中所示，这些异源性硫酯酶在原藻中的表达可以产生能够产生油类/脂质的转基因微藻，所产生的油类/脂质具有事实上独特的脂肪酸型态，所述脂肪酸型态目前未能由可商购的种子作物，甚至经由共混多种种子作物油类而获得。表5展示了常见的可商购的种子油类的脂肪酸型态。以下所有的可商购的种子油类的数据均汇编自美国药典食品与化学法典(USPharmacopeias Food and Chemicals Codes，2010年-2011年第7版)。动物脂数据来自于美国国家研究委员会：动物产品的脂肪含量和组成(National Research Council：Fat Content and Composition of AnimalProducts)(1976年)。
[0314] 表5.可商购的种子油类的脂质型态(百分比)。
[0315]
[0316]
[0317] 举例来说，这些常见的种子油类当中没有一种含有较高量的C8或C10脂肪酸，其中椰子油和棕榈仁油是最大的来源，但两者所具有的比率是1∶1(C8∶C10脂肪酸)。如实施例中所示，经过湿地萼距花C:8优先型硫酯酶转化的原藻不仅能够达到超过12％的C8脂肪酸水平，而且还能达到约5∶1的C8∶C10脂肪酸比率。脂肪酸水平方面的改变可以用于生产含有特制脂肪酸型态的用于多种商业应用的油类。另外，不同脂肪酸链长之间的比率的改变不能在没有经过进一步高成本化学加工(如酯化、蒸馏、分馏以及再酯化)的油类中在商业上获得。作为另一实例，棕榈油是含有最高含量的C16:0脂肪酸(32％至47％)的油类，但棕榈油几乎不含C14:0脂肪酸。含有美国榆硫酯酶的原藻达到约33％至38％的C16:0脂肪酸和约10％至16％的C14:0脂肪酸(C16:0与C14:0的比率为约2∶1)。这种脂肪酸型态是不能经由在商业水平上共混现有的油类所达到的，这是因为富含16:0脂肪酸的种子油类通常含有较少的14:0脂肪酸。
[0318] 以下实施例还首次描述了至少两种脂肪酰基-ACP硫酯酶在一个克隆中的成功靶向和表达。确定这些克隆中脂肪酸型态的变化并且取决于哪两种硫酯酶共表达于一个克隆中，以不同的方式影响脂肪酸型态。举例来说，从上表5中看到，椰子油和棕榈仁油的C12∶C14比率约为3∶1。如以下实施例中所述，含有两种异源性硫酯酶基因的原藻转化体能够产生比率约为5∶1的C12∶C14脂肪酸水平。这种C12∶C14脂肪酸比率到目前为止不能在商业水平上(即经由共混种子油类)达到。
[0319] 由转基因微藻产生的油类的另一个新型方面是脂肪酸的饱和度。棕榈油目前是饱和油的最大来源，其中总饱和物质∶不饱和物质是52％∶48％。如以下实施例中所示，具有来自美国榆和樟树的异源性硫酯酶的原藻在其所产生的油类中达到超过60％的总饱和度。同样如以下实施例中所示，具有来自美国榆的异源性硫酯酶的原藻在其所产生的油类中达到超过86％的总饱和度。
[0320] 适用于本发明的微生物和方法的脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶包括但不限于列于表6中的酶。
[0321] 表6.以基因库登录号列出的脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶。
[0322]
[0323] 适用于本发明的微生物和方法的脂肪酰基-辅酶A还原酶包括但不限于列于表7中的酶。
[0324] 表7.以基因库登录号列出的脂肪酰基-辅酶A还原酶。
[0325]
[0326] 适用于本发明的微生物和方法的脂肪醛脱羰基酶包括但不限于列于表8中的酶。
[0327] 表8.以基因库登录号列出的脂肪醛脱羰基酶。
[0328]
[0329] 天然共表达的脂肪酰基-ACP硫酯酶与酰基载体蛋白的组合适用于本发明的微生物和方法。
[0330] 烃或脂质修饰酶的另外的实例包括下列任何美国专利中所含的氨基酸序列、所引用的氨基酸序列，或由下列任何美国专利中所含或引用的核酸序列编码的氨基酸序列：6,610,527；6,451,576；6,429,014；6,342,380；6,265,639；6,194,185；6,114,160；6,083,731；6,043,072；5,994,114；5,891,697；5,871,988；6,265,639，并且进一步描述于以下基因库登录号中：AAO18435；ZP_00513891；Q38710；AAK60613；AAK60610；AAK60611；
NP_113747；CAB75874；AAK60612；AAF20201；BAA11024；AF205791；以及CAA03710。
NP_113747；CAB75874；AAK60612；AAF20201；BAA11024；AF205791；以及CAA03710。
[0331] 脂质生物合成通路中的其它酶也适用于本发明的微生物和方法。举例来说，酮酰基-ACP合酶(Kas)连同一些上文所列的酶一起在脂质生物合成通路中起作用。存在不同类别的Kas酶：Kas I参与不断增长的酰基ACP链与丙二酰基-ACP之间的连续缩合步骤。Kas II通常参与由C16:0-ACP产生并入丙二酰基-ACP的C18:0-ACP的最终缩合步骤。因而，在主要合成C16-C18:0脂肪酸(以及它们的不饱和衍生物)的高等植物和一些微藻物种/藻株中，Kas II酶与FatA基因产物(酰基-ACP硫酯酶)相互作用。
[0332] 酰基-ACP硫酯酶是高等植物(以及一些微藻物种)脂肪酸生物合成的终止物，并且在大部分植物物种中，这是由FatA基因家族的成员进行的，所述成员的作用在于使延长终止于C16:0向C18:0转化的阶段。在合成短链脂肪酸的物种(如萼距花属(Cuphea)、油棕属(Elaeis)、肉豆蔻属(Myristica)或加州月桂属(Umbellularia))中，由FatB基因编码的一组不同的酰基-ACP硫酯酶进行这一终止步骤(参见例如椰子树(Cocos nucifera)FatB3-B的经过密码子优化的编码区，SEQID NO：189)。Kas II酶与酰基-Acp硫酯酶之间的相互作用对于正确终止脂肪酸链延长来说是重要的。因此，在FatB基因已经过进化而能够进行短链脂质生物合成的高等植物物种(以及微藻物种)中，另一类称作Kas IV基因的Kas基因出现相应的共进化。Kas IV基因负责使脂肪酸的链长在特定大小范围内延长(4-14个碳的长度)。
[0333] 适用于本发明的微生物和方法的其它酶包括与表4、6-8中所列的一种蛋白质具有至少70％氨基酸一致性并且展现相应的所需酶活性(例如从酰基载体蛋白裂解下脂肪酸、将酰基-辅酶A还原成醛或醇或将醛转化成烷烃)的酶。在另外的实施方案中，与上述一个序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％一致性的序列存在酶活性，所有这些序列在此以引用的方式并入本文，如同它们被充分阐述一般。
[0334] 通过选择有待表达的外源性基因的所需组合，可以特制由微生物产生的产物，所述产物然后可以从水性生物质中被提取出。举例来说，所述微生物可以含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源性基因；并且任选地含有(ii)天然共表达的酰基载体蛋白或以其它方式针对脂肪酰基-ACP硫酯酶具有亲和力的酰基载体蛋白(或相反)；并且任选地含有(iii)编码脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶或脂肪酰基-辅酶A还原酶的外源性基因；并且任选地含有(iv)编码脂肪醛还原酶或脂肪醛脱羰基酶的外源性基因。在本文所述的培养条件下，所述微生物合成与ACP连接的脂肪酸，并且脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP裂解下脂肪酸，以通过进一步酶促加工产生脂肪酰基-辅酶A分子。脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶在存在时催化酰基-辅酶A还原成醇。同样，脂肪酰基-辅酶A还原酶在存在时催化酰基-辅酶A还原成醛。在存在编码脂肪酰基-辅酶A还原酶的外源性基因并且使其表达以产生醛产物的那些实施方案中，由第三外源性基因编码的脂肪醛还原酶催化醛还原成醇。同样，脂肪醛脱羰基酶在存在时催化醛转化成烷烃或烯烃。
[0335] 在另一个实施方案中，微生物可以含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源性基因；(ii)任选地含有天然共表达的酰基载体蛋白或针对脂肪酸酰基-ACP硫酯酶具有亲和力的酰基载体蛋白；(iii)突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使去饱和酶基因或去饱和酶蛋白无活性，如去饱和酶敲除；(iv)内源性硬脂酰基酰基载体蛋白去饱和酶过表达或异源性SAD表达；以及(v)上述任何组合。
[0336] 可以从已知能够大量产生脂质的细胞(如原始小球藻)中获得编码这些酶(如脂肪酰基-ACP硫酯酶)的基因。可以将已知在脂质产生中发挥作用的基因(例如编码使双键饱和的酶的基因)单个地转化到受体细胞中。然而，为了实行本发明，不需要对所需要的基因进行预先假设。用于鉴定能够改变(改良)微藻中脂质产生的基因的方法描述于PCT公布号2008/151149中。
[0337] 因此，本发明提供了已经过遗传工程改造而表达脂质通路酶的微生物(例如原藻细胞)，所述脂质通路酶的表达水平与相同物种的野生型细胞相比发生改变。在一些情况下，当两种细胞在相同条件下生长时，所述细胞与野生型细胞相比会产生更多的脂质。在一些情况下，对细胞进行遗传工程改造和/或选择以使其以高于野生型细胞的水平表达脂质通路酶。在一些情况下，脂质通路酶选自由丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基载体蛋白以及甘油-3-磷酸酰基转移酶组成的组。在一些情况下，对细胞进行遗传工程改造和/或选择以使其以低于野生型细胞的水平表达脂质通路酶。在细胞以较低水平表达脂质通路酶的至少一个实施方案中，所述脂质通路酶包含柠檬酸合酶。
[0338] 在一些实施方案中，对细胞进行遗传工程改造和/或选择以使其表达脂肪酸合成中的全局调控因子，所述全局调控因子的表达水平与野生型细胞相比发生改变，借此多种脂肪酸合成基因的表达水平与野生型细胞相比发生改变。在一些情况下，脂质通路酶包含对脂肪酸进行修饰的酶。在一些情况下，脂质通路酶选自硬脂酰基-ACP去饱和酶和甘油脂去饱和酶。在一些情况下，对细胞进行遗传工程改造和/或选择以使其表达较低水平的脂质通路酶或完全不表达特定脂质通路酶(即其中脂质通路酶已被敲除或由外源性基因替换)。
[0339] 一些微藻产生大量的非脂质代谢物，如多糖。由于多糖生物合成会利用可由细胞获得的总代谢能量中显著比例的能量，所以对脂质产生细胞进行诱变，然后针对多糖产生减少或消除来进行筛选，从而产生能够产生更高脂质产率的新型藻株。
[0340] 在其它实施方案中，本发明涉及含有一种或多种外源性基因的产油微生物，其中所述外源性基因编码选自由脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶、去饱和酶以及酰基载体蛋白所组成的组中的蛋白质。在另一个实施方案中，内源性去饱和酶基因过表达于含有上述外源性基因中的一种或多种的微生物中。在一个实施方案中，外源性基因与回应于刺激物而可被诱导或可被阻遏的启动子可操作连接。在一些情况下，所述刺激物选自由外源性提供的小分子、热、冷以及培养基中限制氮或不含氮组成的组。在一些情况下，外源性基因在细胞区室中表达。在一些实施方案中，细胞区室选自由叶绿体、质体以及线粒体组成的组。在一些实施方案中，所述微生物是桑椹形原藻、克鲁格尼原藻、雍滞原藻或饶氏原藻。
[0341] 在一个实施方案中，外源性基因编码脂肪酸酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，由外源性基因编码的硫酯酶催化从酰基载体蛋白(ACP)裂解下具有8个至18个碳的脂肪酸。在一些情况下，由外源性基因编码的硫酯酶催化从ACP裂解下具有10个至14个碳的脂肪酸。在一个实施方案中，由外源性基因编码的硫酯酶催化从ACP裂解下具有12个碳的脂肪酸。
[0342] 在一个实施方案中，外源性基因编码脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶。在一些情况下，由外源性基因编码的还原酶催化具有8个至18个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成相应的伯醇。在一些情况下，由外源性基因编码的还原酶催化具有10个至14个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成相应的伯醇。在一个实施方案中，由外源性基因编码的还原酶催化具有12个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成十二醇。
[0343] 本发明还提供了含有两种外源性基因的重组原藻细胞，其中第一外源性基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶，且第二外源性基因编码选自由脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶以及酰基载体蛋白组成的组中的蛋白质。在一些情况下，两种外源性基因各自均与回应于刺激物而可被诱导的启动子可操作连接。在一些情况下，各启动子均回应于相同的刺激物而可被诱导，所述刺激物诸如培养基中限制氮或不含氮。培养基中限制氮或完全缺少氮会刺激一些微生物(诸如原藻属物种)产生油类，而且可被用作引发物以诱导高水平的油类生产。当与本文公开的遗传工程改造方法组合使用时，可以促使脂质(以占细胞干重的百分比计)达到高水平，诸如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％以及至少75％；本文公开的方法使细胞中的脂质达到这些水平，其中所述脂质是至少1％-5％，优选至少4％的C8-C14；至少0.25％-1％，优选至少0.3％的C8；至少1％-5％，优选至少2％的C10；至少1％-5％，优选至少2％的C12；以及至少1％-5％，优选至少2％的C14。在一些实施方案中，细胞含有以细胞干重计超过10％、超过15％、超过20％或超过25％的脂质并且所含的脂质是至少5％、至少10％或至少15％的C8-C14；
至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％的C8-C14；至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％的C8-C14；5％-40％，优选10％-30％的C8-C14；以及
10％-40％，优选20％-30％的C8-C14。
至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％的C8-C14；至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％的C8-C14；5％-40％，优选10％-30％的C8-C14；以及
10％-40％，优选20％-30％的C8-C14。
[0344] 本文公开的新型油类与其它富含中链脂肪酸的天然存在的油类(诸如棕榈油、棕榈仁油以及椰子油)不同。举例来说，棕榈油和棕榈仁油中污染物(诸如类胡萝卜素)的水平远远高于本发明的油类。棕榈油和棕榈仁油所含的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素以及番茄红素的量尤其远远高于本发明的油类。此外，在棕榈油和棕榈仁油中发现了超过20种不同的类胡萝卜素，而实施例表明本发明的油类含有的类胡萝卜素种类极少并且水平很低。此外，棕榈油、棕榈仁油以及椰子油中维生素E化合物(诸如生育三烯酚)的水平远远高于本发明的油类。
[0345] 在一个实施方案中，由第一外源性基因编码的硫酯酶催化从ACP裂解下具有8个至18个碳的脂肪酸。在一些实施方案中，第二外源性基因编码脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶，其催化具有8个至18个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成相应的伯醇。在一些情况下，由第一外源性基因编码的硫酯酶催化从ACP裂解下具有10个至14个碳的脂肪酸，并且由第二外源性基因编码的还原酶催化具有10个至14个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成相应的伯醇，其中硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一个实施方案中，由第一外源性基因编码的硫酯酶催化从ACP裂解下具有12个碳的脂肪酸，并且由第二外源性基因编码的还原酶催化具有12个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成十二醇。在一些实施方案中，第二外源性基因编码脂肪酰基-辅酶A还原酶，其催化具有8个至18个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成相应的醛。在一些实施方案中，第二外源性基因编码与脂肪酰基-ACP硫酯酶天然共表达的酰基载体蛋白。
[0346] 在一些实施方案中，第二外源性基因编码脂肪酰基-辅酶A还原酶，并且微生物进一步含有编码脂肪醛脱羰基酶的第三外源性基因。在一些情况下，由第一外源性基因编码的硫酯酶催化从ACP裂解下具有8个至18个碳的脂肪酸，由第二外源性基因编码的还原酶催化具有8个至18个碳的脂肪酰基-辅酶A还原成相应的脂肪醛，并且由第三外源性基因编码的脱羰基酶催化具有8个至18个碳的脂肪醛转化成相应的烷烃，其中硫酯酶、还原酶以及脱羰基酶作用于相同的碳链长度。
[0347] 在一些实施方案中，第二外源性基因编码酰基载体蛋白，并且微生物进一步含有第三外源性基因，其编码选自由脂肪酰基-辅酶A还原酶和脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶组成的组中的蛋白质。在一些情况下，第三外源性基因编码脂肪酰基-辅酶A还原酶，并且微生物进一步含有编码脂肪醛脱羰基酶的第四外源性基因。
[0348] 本发明还提供了生产醇的方法，其包括在培养基中培养重组微生物(例如原藻细胞)群体，其中所述细胞含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源性基因和(ii)编码脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶的第二外源性基因，并且所述细胞合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP裂解下脂肪酸，以通过进一步加工产生脂肪酰基-辅酶A，并且脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶催化酰基-辅酶A还原成醇。
[0349] 本发明还提供了在微生物(例如原藻细胞)中生产脂质分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养原藻细胞群体，其中所述细胞含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源性基因和(ii)编码脂肪酰基-辅酶A还原酶的第二外源性基因，并且其中所述微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP裂解下脂肪酸，以通过进一步加工产生脂肪酰基-辅酶A，并且脂肪酰基-辅酶A还原酶催化酰基-辅酶A还原成醛。
[0350] 本发明还提供了在微生物(例如原藻细胞)中生产具有指定碳链长度的脂肪酸分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养脂质产生原藻细胞群体，其中所述微生物含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源性基因，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶特异性或优先地对某一碳链长度(诸如8个、10个、12个或14个碳原子)具有活性，并且其中所述微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，并且当脂肪酸被合成为具有特定碳链长度时，硫酯酶催化从ACP裂解下脂肪酸。
[0351] 在上述各种实施方案中，微生物(例如原藻细胞)可以含有编码脂质通路酶的至少一种外源性基因。在一些情况下，脂质通路酶选自由硬脂酰基-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基载体蛋白以及甘油-3-磷酸酰基转移酶组成的组。在其它情况下，微生物(例如原藻细胞)含有脂质修饰酶，其选自由脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白组成的组。
[0352] 用于表达本文所论述的多种脂质通路酶和脂质修饰酶的许多示例性转化盒或构建体呈现于实施例中。其它有用的构建体列于但不限于下表37中。
[0353] 表37.示例性转化构建体、经过密码子优化的编码区以及酶。
[0354]
[0355]
[0356]
[0357] VI.燃料和化学品生产
[0358] 对于根据本发明方法进行燃料生产，通过任何适当的手段获得或以其它方式收集由本发明的细胞产生的脂质。可以通过全细胞提取分离脂质。首先使细胞破裂，然后可以诸如通过利用如上文所述的离心从细胞物质中分离出细胞内和细胞膜/细胞壁相连的脂质以及细胞外烃。在一些实施方案中，使微生物的细胞溶解后提取微生物中产生的细胞内脂质。在提取后，对脂质进行进一步提炼，以产生油类、燃料或油脂化学品。
[0359] 完成培养后，可以从发酵液中分离微生物。任选地通过离心实现分离，产生浓缩的糊状物。离心不能从微生物中除去大量的细胞内水分，而且不是干燥步骤。然后任选地用洗涤溶液(例如去离子水)对生物质进行洗涤，以除去发酵液和碎片。任选地还可以在细胞破裂前使经过洗涤的微生物生物质干燥(烘干、冻干等)。或者，当发酵完成时，细胞无需从一些或所有发酵液中分离就可以进行溶解。举例来说，当溶解细胞时，细胞与细胞外液体的v∶v比率可以小于1∶1。
[0360] 可以使含有脂质的微生物溶解，产生溶胞物。如本文所详细描述，可以通过任何适当的手段来完成溶解微生物的步骤(也称为细胞溶解)，包括热诱导的溶解、加入碱、加入酸、利用酶(如蛋白酶和多糖降解酶(如淀粉酶))、使用超声波、机械溶解、利用渗透压休克、用溶解性病毒感染和/或表达一种或多种溶解基因。进行溶解以释放由微生物产生的细胞内分子。用于溶解微生物的这些方法中的每一种可以作为单个方法使用，或同时或依次组合使用。可以通过显微镜分析来观察细胞破裂的程度。利用本文所述的一种或多种方法，通常可以观察到超过70％的细胞破裂。细胞破裂优选超过80％，更优选超过90％并且最优选约100％。
[0361] 在具体实施方案中，使微生物在生长后溶解，例如以增加细胞脂质和/或烃的暴露以进行提取或进一步加工。可以调整脂酶表达(例如通过诱导型启动子)或细胞溶解的时机以优化脂质和/或烃的产率。下面描述了多种溶解技术。这些技术可以单个地使用或组合使用。
[0362] 在本发明的一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括对含有微生物的细胞悬浮液进行加热。在这个实施方案中，对含有微生物的发酵液(或从发酵液中分离出的微生物悬浮液)进行加热直至微生物(即微生物的细胞壁和细胞膜)降解或分解为止。所使用的温度通常是至少50℃。使用较高温度以使细胞溶解更高效，诸如至少30℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃、至少120℃、至少130℃或更高温度。
可以通过煮沸微生物以通过热处理使细胞进行溶解。或者，可以在高压灭菌器中进行热处理(不煮沸)。可以将经过热处理的溶胞物冷却，以用于进一步处理。还可以通过蒸汽处理(即通过加入加压蒸汽)使细胞破裂。使微藻细胞破裂的蒸汽处理描述于例如美国专利第
6,750,048号中。在一些实施方案中，可以通过向发酵罐中喷射蒸汽并且使发酵液在所需温度下保持约90分钟以内，优选约60分钟以内，并且更优选约30分钟以内来进行蒸汽处理。
可以通过煮沸微生物以通过热处理使细胞进行溶解。或者，可以在高压灭菌器中进行热处理(不煮沸)。可以将经过热处理的溶胞物冷却，以用于进一步处理。还可以通过蒸汽处理(即通过加入加压蒸汽)使细胞破裂。使微藻细胞破裂的蒸汽处理描述于例如美国专利第
6,750,048号中。在一些实施方案中，可以通过向发酵罐中喷射蒸汽并且使发酵液在所需温度下保持约90分钟以内，优选约60分钟以内，并且更优选约30分钟以内来进行蒸汽处理。
[0363] 在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬浮液中加入碱。所述碱应该足够强，以使所用微生物的至少一部分蛋白质化合物水解。适用于溶解蛋白的碱在化学领域中是已知的。用于本发明方法中的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐以及碳酸氢盐以及其混合物。优选的碱是KOH。使微藻细胞破裂的碱处理描述于例如美国专利第6,750,048号中。
[0364] 在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬浮液中加入酸。可以利用浓度为10mN-500mN或优选40nM-160nM的酸实现酸溶解。优选地在高于室温的温度下(例如40℃-160℃，并且优选50℃-130℃的温度)进行酸溶解。对于中等温度(例如室温至100℃，并且尤其是室温至65℃)，酸处理可以与声波处理或其它细胞破裂方法组合使用。
[0365] 在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括利用酶使微生物溶解。优选用于溶解微生物的酶是蛋白酶和多糖降解酶，诸如半纤维素酶(例如来自黑曲霉的半纤维素酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；编号H2125)、果胶酶(例如来自于根霉属(Rhizopus sp.)的果胶酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；编号P2401)、魔威酶(Mannaway)4.0L(Novozymes)、纤维素酶(例如来自于绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；编号C9422)以及崩溃酶(例如来自于担子菌属(Basidiomycetes sp.)的崩溃酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；编号D9515)。
[0366] 在本发明的其它实施方案中，利用酶来完成溶解，所述酶诸如纤维素酶(诸如任选地来自于小球藻或小球藻病毒的多糖降解酶)，或蛋白酶(诸如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、列于Degradation of Polylactide by Commercial Proteases，Oda Y等，Journal of Polymers and the Environment，第8卷，第1期，2000年1月，第29-32页(4)中的蛋白酶、碱性酶2.4FG(Novozymes)以及风味蛋白酶(Flavourzyme)100L(Novozymes))。还可以使用蛋白酶与多糖降解酶的任何组合，包括上述蛋白酶与多糖降解酶的任何组合。
[0367] 在另一个实施方案中，可以利用压榨机进行溶解。在这种方法中，在高压下迫使生物质通过一种螺旋型装置，以使细胞溶解并使细胞内脂质释放并与细胞中的蛋白和纤维(以及其它组分)分离。
[0368] 在本发明的另一个实施方案中，通过利用超声波(即声波处理)进行溶解微生物的步骤。因此，还可以利用高频率声波溶解细胞。声波可以电子学方式产生，并通过金属尖传递至经过适当浓缩的细胞悬浮液中。这种声波处理(或超声处理)基于在细胞悬浮液中产生气泡而破坏细胞的完整性。
[0369] 在本发明的另一个实施方案中，通过机械溶解进行溶解微生物的步骤。可以机械方式溶解细胞，并且任选地进行均质化，以促成烃(例如脂质)收集。举例来说，可以使用压力破碎器将含有细胞的浆料抽汲通过限制性阻尼阀。施加高压(高达1500巴)，继而立即扩散通过排出喷嘴。通过三种不同的机制完成细胞破裂：对阀门的冲击、阻尼孔的高液体剪切力以及排出时压力突然下降，这使得细胞爆裂。所述方法使细胞内分子释放。或者，可以使用球磨机。在球磨机中，用小研磨颗粒(诸如珠粒)在悬浮液中搅动细胞。细胞因剪切力、珠粒之间的研磨以及与珠粒碰撞而破裂。珠粒使细胞破裂以释放细胞内容物。还可以通过剪切力使细胞破裂，诸如借助于共混(诸如用高速度或韦林氏共混器(Waring blender))、弗氏压碎器(french press)，或甚至当细胞壁脆弱时使用离心使细胞破裂。
[0370] 在本发明的另一个实施方案中，通过使用渗透压休克进行溶解微生物的步骤。
[0371] 在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括用溶解性病毒感染微生物。已知多种病毒可用于溶解适用于本发明中的微生物，并且对于特定的微生物，选择和利用特定的溶解性病毒在本领域的技术水平以内。举例来说，绿草履虫(paramecium bursaria)小球藻病毒(PBCV-1)是大型二十面体成斑双链DNA病毒类(藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)，绿藻病毒属(Chlorovirus))的原型，这些病毒可以在某些单细胞真核小球藻样绿藻中复制并使所述绿藻溶解。因此，可以通过用合适的小球藻病毒感染培养物来溶解任何易感的微藻。用小球藻病毒感染小球藻属物种的方法是已知的。参见例如Adv.Virus Res.2006；66：293-336；Virology，1999年4月25日；257(1)：15-23；
Virology，2004年1月5日；318(1)：214-23；Nucleic Acids Symp.Ser.2000；(44)：161-2；
J.Virol.2006年3月；80(5)：2437-44；以及Annu.Rev.Microbiol.1999；53：447-94。
Virology，2004年1月5日；318(1)：214-23；Nucleic Acids Symp.Ser.2000；(44)：161-2；
J.Virol.2006年3月；80(5)：2437-44；以及Annu.Rev.Microbiol.1999；53：447-94。
[0372] 在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括自溶。在这个实施方案中，根据本发明的微生物经过遗传工程改造，以产生溶解微生物的溶解蛋白。可以利用诱导型启动子使溶解基因表达，以使细胞可以首先在发酵罐中生长至合乎需要的密度，随后诱导启动子以使溶解基因表达而溶解细胞。在一个实施方案中，溶解基因编码多糖降解酶。在某些其它的实施方案中，溶解基因是来源于溶解性病毒的基因。因此，例如可以使来源于小球藻病毒的溶解基因在藻类细胞中表达，参见Virology 260，308-315(1999)；FEMS Microbiology Letters180(1999)45-53；Virology 263，376-387(1999)；以及 Virology230，361-368(1997)。优选利用诱导型启动子使溶解基因表达，所述诱导型启动子诸如在微藻中具有活性并且可由刺激物(诸如小分子的存在、光、热以及其它刺激物)诱导的启动子。
[0373] 可以使用各种方法将脂质从由上述方法产生的细胞溶胞物中分离出来。举例来说，可以用疏水性溶剂(诸如己烷)提取脂质和脂质衍生物，诸如脂肪醛、脂肪醇以及烃(诸如烷烃)(参见Frenz等，1989，Enzyme Microb.Technol.，11：717)。还可以利用液化(参见例如Sawayama等，1999，Biomass and Bioenergy 17：33-39和Inoue等，1993，Biomass Bioenergy 6(4)：269-274)；油类液化(参见例如Minowa等，1995，Fuel
74(12)：1735-1738)；以及超临界CO2提取法(参见例如Mendes等，2003，Inorganica Chimica Acta 356：328-334)提取脂质和脂质衍生物。Miao和Wu描述了从原始小球藻培养物中回收微藻脂质的方案，其中通过离心收集细胞，用蒸馏水洗涤并通过冷冻干燥使其干燥。在研钵中磨碎所得到的细胞粉末，然后用正己烷进行提取。Miao和Wu，Biosource Technology(2006)97：841-846。
74(12)：1735-1738)；以及超临界CO2提取法(参见例如Mendes等，2003，Inorganica Chimica Acta 356：328-334)提取脂质和脂质衍生物。Miao和Wu描述了从原始小球藻培养物中回收微藻脂质的方案，其中通过离心收集细胞，用蒸馏水洗涤并通过冷冻干燥使其干燥。在研钵中磨碎所得到的细胞粉末，然后用正己烷进行提取。Miao和Wu，Biosource Technology(2006)97：841-846。
[0374] 因此，可以通过用有机溶剂进行提取来回收由本发明的微生物产生的脂质、脂质衍生物以及烃。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。通常将有机溶剂直接加入到溶胞物中而不需要提前分离溶胞物组分。在一个实施方案中，使由上述一种或多种方法产生的溶胞物与有机溶剂接触一段时间而足以使脂质和/或烃组分与有机溶剂形成溶液。在一些情况下，然后可以进一步提炼溶液，以回收特定的所需脂质或烃组分。己烷提取法在本领域中是熟知的。
[0375] 可以利用一种或多种如上文所述的酶(包括脂酶)对由本文所述的细胞产生的脂质和脂质衍生物(诸如脂肪醛、脂肪醇以及烃(诸如烷烃))进行修饰。当烃处于细胞的细胞外环境中时，可以在一定条件下将一种或多种酶加入到该环境中，在所述一定条件中，酶可以对烃进行修饰，或由烃前体完成其合成。或者，在加入一种或多种催化剂(诸如酶)之前，可以将烃部分地或完全地从细胞物质中分离出。所述催化剂是外源性加入的，而且它们的活性存在于细胞外或体外。
[0376] 因此，可以任选地通过常规手段对本文所述的由细胞在体内产生的或经过体外酶促修饰的脂质和烃进行进一步加工。所述加工可以包括“裂化”以缩减大小，因而增加烃分子的氢∶碳比。烃和甘油三酯油类加工中常规使用催化和热裂化方法。催化方法包括利用催化剂，如固体酸催化剂。催化剂可以是硅石-氧化铝或沸石，其导致碳-碳键发生异裂或不对称断裂，产生碳阳离子和氢阴离子。这些反应性中间体然后进行重排或与另一种烃发生氢负离子转移。所述反应因此使中间体再生，产生自行增长链机制。还可以对烃进行加工以使其中碳-碳双键或三键的数目减少，任选地减少至零。还可以对烃进行加工，以除去或消除其中的环或环状结构。还可以对烃进行加工，以增加氢∶碳比。这包括加入氢(“氢化”)和/或使烃“裂化”成较小的烃。
[0377] 热学方法包括利用高温和高压，以缩减烃的大小。可以使用约800℃的高温和约700kPa的高压。这些条件产生“轻”烃，该术语有时用于指富含氢的烃分子(与光子通量不同)，而这些条件还可以通过缩合产生氢含量相对减少的较大烃分子。所述方法提供均裂或对称断裂并且产生烯烃，所述烯烃任选地可以如上文所述经过酶促饱和。
[0378] 催化方法和热学方法是在植物中进行烃加工和油类提炼的标准方法。因此，可以通过常规手段对由本文所述的细胞产生的烃进行收集和加工或提炼。关于对微藻产生的烃进行加氢裂化的报道，参见Hillen等(Biotechnology and Bioengineering，第XXIV卷：193-205(1982))。在替代实施方案中，用另一种催化剂处理组分，所述催化剂如有机化合物、热和/或无机化合物。对于将脂质加工成生物柴油，如本部分下文所描述使用酯基转移方法。
[0379] 通过本发明的方法产生的烃可以用于多种工业应用中。举例来说，直链烷基苯磺酸盐(LAS)(一种用于几乎所有类型的清洁剂和清洁制备物中的阴离子表面活性剂)的生产利用一般包含具有10个-14个碳原子的链的烃。参见例如美国专利第6,946,430号、第5,506,201号、第6,692,730号、第6,268,517号、第6,020,509号、第6,140,302号、第5,080,848号以及第5,567,359号。表面活性剂(如LAS)可以用于生产个人护理组合物和清洁剂，如以下美国专利中所述的组合物和清洁剂：第5,942,479号、第6,086,903号、第
5,833,999号、第6,468,955号以及第6,407,044号。
5,833,999号、第6,468,955号以及第6,407,044号。
[0380] 由于可以获得可以取代源自化石燃料的起始物质的可再生生物起始物质并且其用途是合乎需要的，所以日益关注对生物来源的烃组分在燃料(如生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料)中的用途。迫切需要由生物材料生产烃组分的方法。本发明满足了这种需要，它是通过提供利用由本文所述的方法产生的脂质作为生物材料来生产生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料以生产生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料的方法来实现的。
[0381] 传统的柴油燃料是富含石蜡烃的石油馏出物。它们具有370℉至780℉的宽沸点范围，适用于在压燃式发动机(如柴油发动机车辆)中燃烧。美国测试与材料学会(American Society of Testing and Materials，ASTM)根据沸点范围以及其它燃料特性(如十六烷值、浊点、燃点、粘度、苯胺点、硫含量、水含量、灰含量、铜带腐蚀度以及炭渣)的容许范围建立了柴油级别。符合适当的ASTM规范并且来源于生物质或其它物质的任何烃馏出物物质在学术上可以被定义为柴油燃料(ASTM D975)、喷气燃料(ASTM D1655)，或生物柴油(ASTMD6751)(如果它是脂肪酸甲酯的话)。
[0382] 在提取后，可以对从本文所述的微生物生物质中回收的脂质和/或烃组分进行化学处理，以生产用于柴油车和喷气式发动机的燃料。
[0383] 生物柴油是一种颜色在金色与深棕色之间变化的液体，这取决于生产原料。它实际上与水不混溶，具有高沸点和低蒸气压。生物柴油是指与柴油等同的加工燃料，可以用于柴油发动机车辆中。生物柴油是生物可降解的并且无毒。生物柴油优于常规柴油燃料的另外的益处是发动机磨损较低。生物柴油通常包含C14-C18烷基酯。各种方法使如本文所述产生并分离的生物质或脂质转化成柴油燃料。生产生物柴油的优选方法是通过对本文所述的脂质进行酯基转移。用作生物柴油的优选烷基酯是甲酯或乙酯。
[0384] 由本文所述的方法生产的生物柴油可以在大多数现代柴油发动机车辆中以任何浓度单独使用或与常规柴油燃料共混使用。当与常规柴油燃料(石化柴油)共混时，生物柴油可以存在有约0.1％至约99.9％。世界上大多数地方使用称为“B”因数的系统来表示生物柴油在任何燃料混合物中的量。举例来说，将含有20％生物柴油的燃料标记为B20。纯生物柴油被称为B100。
[0385] 生物柴油还可以在家用和商用锅炉中用作加热燃料。现有的燃油锅炉可能含有橡胶部件，并且可能需要进行转换以使其利用生物柴油运转。该转换过程通常相对简单，包括将橡胶部件换成合成部件，因为生物柴油是强溶剂。由于生物柴油的强溶剂作用，所以燃烧生物柴油将会增加锅炉的效率。生物柴油可以被用作柴油制剂的添加剂，以增加纯超低硫柴油(ULSD)燃料的润滑性，这是有利的，因为生物柴油几乎不含硫。与石化柴油相比，生物柴油是较好的溶剂，并且可以被用于分解先前利用石化柴油运转的车辆燃料管中的残余物沉积物。
[0386] 可以通过富含油类的生物质中含有的甘油三酯的酯基转移生产生物柴油。因此，在本发明的另一个方面，提供了生产生物柴油的方法。在一个优选的实施方案中，生产生物柴油的方法包括以下步骤：(a)利用本文中公开的方法培育含有脂质的微生物；(b)使含有脂质的微生物溶解，以产生溶胞物；(c)从已溶解的微生物中分离脂质；以及(d)使脂质组合物进行酯交换，从而产生生物柴油。上文已经描述了使微生物生长的方法、使微生物溶解以产生溶胞物的方法、在包含有机溶剂的介质中处理溶胞物以形成异质混合物的方法以及使经过处理的溶胞物分离成脂质组合物的方法，并且这些方法也可以用于生产生物柴油的方法中。
[0387] 生物柴油的脂质型态通常与原料油类的脂质型态高度类似。可以对由本发明的方法和组合物提供的其它油类进行酯基转移，以产生生物柴油，所述生物柴油的脂质型态包括：(a)C8-C14占至少1％-5％，优选地占至少4％；(b)C8占至少0.25％-1％，优选地占至少0.3％；(c)C10占至少1％-5％，优选地占至少2％；(d)C12占至少1％-5％，优选地占至少2％；以及(3)C8-C14占至少20％-40％，优选地占至少30％。
[0388] 可以对脂质组合物进行酯基转移，以产生用作生物柴油的长链脂肪酸酯。优选的酯基转移反应概述于下文，并且包括碱催化的酯基转移和利用重组脂酶进行的酯基转移。在碱催化的酯基转移方法中，在碱性催化剂(通常是氢氧化钾)存在下，使三酰基甘油酯与醇(如甲醇或乙醇)反应。该反应形成甲酯或乙酯，以及作为副产物的丙三醇(甘油)。
[0390]
[0391] 在该反应中，用碱使醇去质子化，以使其成为较强的亲核试剂。通常过量(高达50倍)使用乙醇或甲醇。一般该反应进行的非常慢或完全不进行。可以使用热以及酸或碱来帮助反应更快地进行。酯基转移反应不会消耗酸或碱，因此它们不是反应物而是催化剂。几乎所有的生物柴油均利用碱催化技术生产，因为这个技术仅仅需要低温和低压，并且能够产生超过98％的转化产率(条件是起始油类中的水分和游离脂肪酸较少)。
[0392] 如上文所述，还可以利用酶(如脂酶)而非碱进行酯基转移。例如可以在室温与80℃之间的温度下并且在TAG与低级醇的摩尔比大于1∶1，优选是约3∶1的情况下进行脂酶催化的酯基转移。适用于酯基转移的脂酶包括但不限于列于表9中的脂酶。适用于酯基转移的其它脂酶实例见于例如美国专利第4,798,793号、第4,940,845号、第5,156,963号、第5,342,768号、第5,776,741号以及第WO89/01032号。这些脂酶包括但不限于由根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、毛霉属(Mucor)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根毛霉属(Rhizomucor)、假丝酵母属(Candida)以及腐殖菌属(Humicola)的微生物产生的脂酶以及胰脂酶。
[0393] 表9.适用于酯基转移的脂酶。
[0394]
[0395]
[0396] 利用脂酶生产适用于生物柴油中的脂肪酸酯的一个挑战是脂酶的价格远远高于强碱方法中使用的氢氧化钠(NaOH)的价格。已经利用可以再循环的固定化脂酶来应对这种挑战。然而，在进行最少次数的回收循环后必须保持固定化脂酶的活性，以使基于脂酶的方法在生产成本方面能够与强碱方法竞争。通常用于酯基转移中的低级醇对固定化脂酶有害。美国专利第6,398,707号(2002年6月4日颁予Wu等)描述了增强固定化脂酶的活性并且使活性降低的固定化脂酶再生的方法。一些合适的方法包括将固定化脂酶在碳原子数不少于3的醇中浸泡一段时间，优选0.5小时-48小时，并且更优选0.5小时-1.5小时。
一些合适的方法还包括用碳原子数不少于3的醇对失活的固定化脂酶进行洗涤，然后将失活的固定化脂酶在植物油中浸泡0.5小时-48小时。
一些合适的方法还包括用碳原子数不少于3的醇对失活的固定化脂酶进行洗涤，然后将失活的固定化脂酶在植物油中浸泡0.5小时-48小时。
[0397] 在具体实施方案中，重组脂酶表达于产生脂酶所作用的脂质的相同微生物中。合适的重组脂酶包括列于上表9中的脂酶和/或具有上表9中所列基因库登录号的脂酶，或与上表9中列出的一种脂酶具有至少70％氨基酸一致性并且展现脂酶活性的多肽。在另外的实施方案中，与上述一个序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％一致性的序列存在酶活性，所有这些序列在此以引用的方式并入本文，如同它们被充分阐述一般。编码脂酶和选择标记的DNA优选地是经过密码子优化的cDNA。重编码基因以使其在微藻中表达的方法描述于美国专利7,135,290中。
[0398] 生物柴油的通用国际标准是EN 14214。ASTM D6751是美国和加拿大参照的最常用的生物柴油标准。德国使用DIN EN 14214，而英国要求符合BS EN 14214。确定产品是否符合这些标准的基本工业测试通常包括气相色谱、HPLC以及其它测试。符合质量标准的生物柴油是无毒的，其毒性度(LD50)大于50mL/kg。
[0399] 尽管符合ASTM标准的生物柴油应该是无毒的，但仍然存在污染物，所述污染物可能结晶和/或沉淀以及作为沉积物脱离溶液。当在较低温度下使用生物柴油时，沉积物的形成尤其成难题。沉积物或沉淀物可能引起很多问题，如减少燃料流动、堵塞燃料管、堵塞过滤器等。专门用于除去生物柴油中这些污染物和沉积物以产生质量较高的产品的方法在本领域中是熟知的。所述方法的实例包括但不限于对油类进行预处理以除去污染物(如磷脂和游离脂肪酸)(例如除胶、碱法净化以及硅石吸附过滤)以及冷却过滤。冷却过滤是专门开发用以除去生产后生物柴油中存在的任何微粒和沉积物的方法。这种方法使生物柴油冷却并过滤出在较低温度下使用燃料时可能形成的任何沉积物或沉淀物。这种方法在本领域中是熟知的，并且描述于美国专利申请公布号2007-0175091中。合适的方活可以包括使生物柴油冷却至低于约38℃的温度，以使杂质和污染物在生物柴油液体中以微粒形式沉淀出。然后将硅藻土或其它过滤材料加入到经过冷却的生物柴油中，以形成浆料，然后通过加压叶片或其它类型的过滤器对浆料进行过滤，以除去微粒。然后使经过过滤的生物柴油通过精密过滤器，以除去任何残留的沉积物和硅藻土，产生最终的生物柴油产品。
[0400] 实施例13描述了利用来源于桑椹形原藻的甘油三酯油类生产生物柴油。通过ASTM D6751 A1方法测定，实施例13中生产的生物柴油的低温适应过滤性是120秒(对于300ml体积)。该测试包括过滤300ml的B100，冷却至40℉，持续16小时，升温至室温，并利用具有不锈钢支撑物的0.7微米玻璃纤维过滤器在真空下进行过滤。可以对本发明的油类进行酯基转移，以产生低温适应时间短于120秒、短于100秒以及短于90秒的生物柴油。
[0401] 如果在特别低的温度下使用生物柴油，那么还可以使用后续工艺。所述工艺包括防冻处理和分馏。这两种工艺经过设计以通过降低浊点(生物柴油开始结晶的温度)改良燃料的冷流和防冻效能。有几种使生物柴油防冻的方法。一种方法是将生物柴油与石化柴油共混。另一种方法是使用能够使生物柴油浊点降低的添加剂。另一种方法是任意地通过混入添加剂并且使饱和物质结晶，然后过滤出晶体来除去饱和甲酯。分馏选择性地将甲酯分离成单个的组分或部分，使得能够除去或纳入特定甲酯。分馏方法包括尿素分馏、溶剂分馏以及热蒸馏。
[0402] 由本发明方法提供的另一种有价值的燃料是可再生柴油，其包含烷烃，如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0以及C18:0，因此不同于生物柴油。高质量的可再生柴油符合ASTM D975标准。通过本发明的方法产生的脂质可以被用作生产可再生柴油的原料。因此，在本发明的另一个方面，提供了生产可再生柴油的方法。可以通过至少3种方法生产可再生柴油：热液处理(氢化处理)；加氢处理；以及间接液化。这些方法产生非酯馏出物。在这些方法期间，如本文所述产生并分离的三酰基甘油酯被转化成烷烃。
[0403] 在一个实施方案中，生产可再生柴油的方法包括(a)利用本文公开的方法培育含有脂质的微生物，(b)使微生物溶解，以产生溶胞物，(c)从已溶解的微生物中分离脂质，以及(d)对脂质进行脱氧和氢化处理，以产生烷烃，借此生产可再生柴油。可以通过利用有机溶剂(如己烷)从微生物生物质中进行提取或通过其它方法(如描述于美国专利5,928,696中的方法)获得适于生产可再生柴油的脂质。一些合适的方法可以包括机械加压和离心。
[0404] 在一些方法中，首先使微生物脂质裂化并进行氢化处理，以分别缩短碳链长度和使双键饱和。然后使物质异构化，同时进行氢化处理。然后可以通过蒸馏法除去石脑油组分，随后再通过蒸馏使柴油燃料中的所需组分汽化并蒸馏，以使其符合ASTM D975标准，而留下比符合D975标准的所需组分重的组分。对经过化学修饰的油类(包括甘油三酯油类)进行氢化处理、加氢裂化、脱氧以及异构化的方法在本领域中是熟知的。参见例如欧洲专利申请EP1741768(A1)；EP1741767(A1)；EP1682466(A1)；EP1640437(A1)；EP1681337(A1)；EP1795576(A1)；以 及 美 国 专 利 7,238,277；6,630,066；6,596,155；
6,977,322；7,041,866；6,217,746；5,885,440；6,881,873。
6,977,322；7,041,866；6,217,746；5,885,440；6,881,873。
[0405] 在生产可再生柴油的方法的一个实施方案中，通过对脂质组合物进行氢化处理来对脂质进行处理，以产生烷烃。在热液处理中，通常使生物质在高温和高压下在水中反应，以形成油类和残余固体。转化温度通常是300℉至660℉，压力是100个标准大气压至170个标准大气压(atm)，其足以使水基本上保持液态。反应时间约为15至30分钟。反应完成后，从水中分离有机物。从而生产适用于柴油的馏出物。
[0406] 在制备可再生柴油的一些方法中，对甘油三酯进行处理的第一步骤是进行加氢处理以使双键饱和，随后在氢和催化剂存在下于高温下进行脱氧。在一些方法中，在同一个反应中进行氢化和脱氧。在其它方法中，在氢化之前进行脱氧。然后任选地同样在氢和催化剂存在下进行异构化作用。优选通过蒸馏除去石脑油组分。举例来说，参见美国专利5,475,160(甘油三酯的氢化)；5,091,116(脱氧、氢化以及除气)；6,391,815(氢化)；以及5,888,947(异构化)。
[0407] 将甘油三酯氢化的一种合适的方法包括制备铜、锌、镁以及镧盐的水溶液以及另一种碱金属溶液或优选碳酸铵溶液。可以将这两种溶液加热至约20℃至约85℃的温度，并且以一定比率在沉淀容器中混合，从而使沉淀容器中的pH值保持在5.5与7.5之间，以形成催化剂。可以最初在沉淀容器中使用另外的水或与盐溶液和沉淀溶液同时加入另外的水。然后对所得的沉淀物进行充分洗涤、干燥、于约300℃下煅烧并在约100℃至约400℃范围内的温度下于氢气中活化。然后在反应器中在上述催化剂存在下使一种或多种甘油三酯与氢接触并反应。反应器可以是滴流床反应器、固定床气固反应器、包装鼓泡塔反应器、连续搅拌槽反应器、浆料相反应器或本领域中已知的任何其它合适的反应器类型。该方法可以分批式或以连续方式进行。反应温度通常在约170℃至约250℃的范围内，而反应压力通常在约300psig至约2000psig的范围内。此外，在本发明的方法中，氢与甘油三酯的摩尔-1 -1比通常在约20∶1至约700∶1的范围内。该方法通常以约0.1hr 至约5hr 范围内的
重量时空速度(WHSV)进行。本领域技术人员知晓反应所需的时间将根据所使用的温度、氢与甘油三酯的摩尔比以及氢分压而变化。由所述氢化方法产生的产物包括脂肪醇、甘油、微量的石蜡以及未反应的甘油三酯。通常通过常规方法分离这些产物，所述常规方法如蒸馏、萃取、过滤、结晶等。
重量时空速度(WHSV)进行。本领域技术人员知晓反应所需的时间将根据所使用的温度、氢与甘油三酯的摩尔比以及氢分压而变化。由所述氢化方法产生的产物包括脂肪醇、甘油、微量的石蜡以及未反应的甘油三酯。通常通过常规方法分离这些产物，所述常规方法如蒸馏、萃取、过滤、结晶等。
[0408] 石油提炼利用加氢处理以通过用氢对进料进行处理来除去杂质。加氢处理的转化温度通常是300℉至700℉。压力通常是40atm至100atm。反应时间通常约为10至60分钟。使用固体催化剂以增加某些反应速率、改良对某些产物的选择性，以及优化氢的消耗。
[0409] 使油类脱氧的合适的方法包括将油类加热至约350℉至约550℉范围内的温度，并在至少约大气压至上述范围内的压力下使经过加热的油类与氮气连续接触至少约5分钟。
[0410] 用于异构化的合适的方法包括利用碱的异构化和本领域中已知的其它油类异构化。
[0411] 氢化处理和加氢处理最终使甘油三酯进料的分子量降低。在加氢处理条件下一个甘油三酯分子被还原成4个烃分子：1个丙烷分子和3个较重的烃分子，通常在C8至C18范围内。
[0412] 因此，在一个实施方案中，对本发明的脂质组合物进行的一种或多种化学反应的产物是烷烃混合物，其包含ASTM D975可再生柴油。微生物的烃生产由Metzger等，Appl Microbiol Biotechnol(2005)66：486-496；以及A Look Back at the U.S.Department of Energy′s AquaticSpecies Program：Biodiesel from Algae，NREL/TP-580-24190，JohnSheehan，Terri Dunahay，John Benemann以及Paul Roessler(1998)综述。
[0413] 柴油燃料的蒸馏特性以T10-T90描述(分别是指蒸馏体积为10％时和90％时的温度)。可再生柴油由桑椹形原藻甘油三酯油类生产并且描述于实施例13中。实施例13中产生的物质的T10-T90是57.9℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法利用根据本文公开的方法产生的甘油三酯油类产生具有其它T10-T90范围(如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃以及65℃)的可再生柴油组合物。
[0414] 实施例13中产生的物质的T10是242.1℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法产生具有其它T10值的可再生柴油组合物，诸如T10值在180与295之间、在190与270之间、在210与250之间、在225与245之间以及是至少290。
[0415] 实施例13中产生的物质的T90是300℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法产生具有其它T90值的可再生柴油组合物，诸如T90值在280与380之间、在290与360之间、在300与350之间、在310与340之间以及是至少290。
[0416] 实施例13中产生的物质的FBP是300℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法产生具有其它FBP值的可再生柴油组合物，诸如FBP值在290与400之间、在300与385之间、在310与370之间、在315与360之间以及是至少300。
[0417] 可以对由本发明的方法和组合物提供的其它油类进行氢化处理、异构化以及其它共价修饰的组合，所述其它油类包括脂质型态包括以下的油类：(a)C8-C14占至少1％-5％，优选地占至少4％；(b)C8占至少0.25％-1％，优选地占至少0.3％；(c)C10占至少1％-5％，优选地占至少2％；(d)C12占至少1％-5％，优选地占至少2％；以及(3)C8-C14占至少20％-40％，优选地占至少30％。
[0418] 可以通过两步方法由任何形式的生物质生产传统的超低硫柴油。首先，将生物质转化成合成气(一种富含氢气和一氧化碳的气体混合物)。然后将合成气催化转化成液体。通常利用Fisher-Tropsch(FT)合成法生产液体。这种技术可以应用于煤、天然气以及重油。因此，在生产可再生柴油的方法的又另一个优选实施方案中，通过使脂质组合物间接液化对脂质组合物进行处理以产生烷烃。
[0419] 本发明还提供了生产喷气燃料的方法。喷气燃料是透明至淡黄色的。最常用的燃料是不含铅/基于石蜡油的燃料，其被分类为飞机级A-1，根据一组国际标准化规范生产。喷气燃料是多种不同烃的混合物，可能多达上千种或更多种烃。它们的大小(分子量或碳数)范围受到产品要求的限制，例如凝固点或发烟点。煤油型飞机级燃料(包括Jet A和Jet A-1)的碳数分布在约8个碳数与16个碳数之间。宽馏分或石脑油型飞机级燃料(包括Jet B)通常具有约5个碳与15个碳之间的碳数分布。
[0420] 两种飞机级燃料(Jet A和Jet B)可以含有多种添加剂。可用的添加剂包括但不限于抗氧化剂、抗静电剂、阻蚀剂以及燃料系统防冰剂(FSII)。抗氧化剂防止结胶，并且通常基于经过烷基化的酚，例如AO-30、AO-31或AO-37。抗静电剂消除静电并且防止产生火花。以二壬基萘磺酸(DINNSA)作为活性成分的Stadis 450是一个实例。阻蚀剂，例如DCI-4A被用于民用和军用燃料，而DCI-6A被用于军用燃料。FSII剂包括例如Di-EGME。
[0421] 在本发明的一个实施方案中，通过将藻类燃料与现有的喷气燃料共混来生产喷气燃料。通过本发明的方法产生的脂质可以被用作生产喷气燃料的原料。因此，在本发明的另一个方面，提供了生产喷气燃料的方法。在此提供了两种从由本发明的方法产生的脂质生产喷气燃料的方法：流化催化裂化(FCC)和加氢脱氧(HDO)。
[0422] 流化催化裂化(FCC)是一种用于生产烯烃的方法，特别是从重质原油组分生产丙烯。由本发明的方法产生的脂质可以被转化成烯烃。所述方法包括使产生的脂质流过FCC区并收集包含烯烃的产物流，所述产物流可用作喷气燃料。使所产生的脂质在裂化条件下与裂化催化剂接触，以提供可用作喷气燃料的包含烯烃和烃的产物流。
[0423] 在一个实施方案中，生产喷气燃料的方法包括(a)利用本文公开的方法培育含有脂质的微生物；(b)使含有脂质的微生物溶解，以产生溶胞物；(c)从溶胞物中分离脂质；以及(d)处理脂质组合物，借此产生喷气燃料。在生产喷气燃料的方法的一个实施方案中，可以使脂质组合物流过流化催化裂化区，在一个实施方案中，其可以包括使脂质组合物在裂化条件下与裂化催化剂接触，以提供包含C2-C5烯烃的产物流。
[0424] 在这种方法的某些实施方案中，可能需要除去脂质组合物中存在的任何污染物。因此，在使脂质组合物流过流化催化裂化区之前，对脂质组合物进行预处理。预处理可以包括使脂质组合物与离子交换树脂接触。离子交换树脂是酸性离子交换树脂(诸如TMAmberlyst -15)并且可以在脂质组合物向上或向下流过的反应器中用作床体。其它预处理可以包括通过使脂质组合物与酸(诸如硫酸、乙酸、硝酸或盐酸)接触而进行弱酸洗涤。
一般在环境温度和大气压下用稀酸溶液进行接触。
一般在环境温度和大气压下用稀酸溶液进行接触。
[0425] 使任选地经过预处理的脂质组合物流至FCC区，在此处使烃组分裂化成烯烃。通过使脂质组合物在反应区中与由微细颗粒物质构成的催化剂接触来完成催化裂化。所述反应是催化裂化，其与加氢裂化相对比，在不加入氢或不消耗氢的情况下进行。随着裂化反应进行，大量焦炭沉积在催化剂上。通过在再生区中使催化剂上的焦炭燃烧以在高温下使催化剂再生。含有焦炭的催化剂(在本文被称为“积炭催化剂”)被持续地从反应区运送至再生区，以使其再生并由再生区中基本上不含焦炭的再生催化剂替换。通过各种气流对催化剂颗粒进行流化使得能够在反应区与再生区之间运送催化剂。在催化剂的流化流中使烃(诸如本文所述的脂质组合物中的烃)裂化的方法、在反应区与再生区之间运送催化剂的方法以及在再生器中燃烧焦炭的方法是为FCC方法领域的技术人员所熟知的。示例性FCC应用和用于使脂质组合物裂化以产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利第6,538,169号、第7,288,685号中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0426] 合适的FCC催化剂一般包含处于或不处于相同基质上的至少两种组分。在一些实施方案中，两种组分均在整个反应容器中循环。第一种组分一般包括用于流化催化裂化领域的任何熟知的催化剂，诸如活性无定形粘土型催化剂和/或高活性结晶分子筛。分子筛催化剂优于无定形催化剂，因为分子筛催化剂大大提高了对所需产物的选择性。在一些优选的实施方案中，在FCC方法中可以使用沸石作为分子筛。第一种催化剂组分优选地包含大孔径的沸石(诸如Y型沸石)、活性氧化铝材料、包含硅石或氧化铝的粘合材料以及隋性填料(诸如高岭土)。
[0427] 在一个实施方案中，本发明的脂质组合物的裂化发生在FCC区的提升段或上升段中。通过喷嘴将脂质组合物引入提升段中，以使脂质组合物快速汽化。在与催化剂接触之前，脂质组合物通常具有约149℃至约316℃(300℉至600℉)的温度。催化剂从共混容器流至提升段，在此处其与脂质组合物接触约2秒或更短时间。
[0428] 然后通过出口将共混的催化剂和已反应的脂质组合物蒸气从提升段顶端排出，并分离成包括烯烃的裂化产物蒸气流和覆盖有大量焦炭并且一般被称为“积炭催化剂”的催化剂颗粒收集物。在使脂质组合物与催化剂(可能促进所需产物进一步转化成不合需要的其它产物)的接触时间减至最短的尝试中，可以使用任何分离器安排(诸如旋转臂安排)，以从产物流中快速除去积炭催化剂。分离器(例如旋转臂分离器)位于腔室的上部，其中汽提区位于所述腔室的下部。由旋转臂安排分离的催化剂滴落入汽提区中。包含经过裂化的烃(包括轻烯烃)的裂化产物蒸气流和一些催化剂通过与旋流器相连的管道排出腔室。旋流器除去产物蒸气流中的残留催化剂颗粒，使颗粒浓度降至极低水平。然后产物蒸气流从分离容器顶端排出。由旋流器分离的催化剂返回至分离容器中，然后进入汽提区。汽提区通过与蒸汽逆流接触而除去催化剂表面吸附的烃。
[0429] 低烃分压用以有利于轻烯烃的产生。因此，将提升段压力设定为约172kPa至241kPa(25psia至35psia)，其中烃分压是约35kPa至172kPa(5psia至25psia)，优选的烃分压是约69kPa至138kPa(10psia至20psia)。通过利用蒸汽作为稀释剂达到稀释剂占脂质组合物的10wt％至55wt％，并且优选地占脂质组合物的约15wt％的程度来达到这种相对低的烃分压。可以使用其它稀释剂(诸如干燥气体)来达到等同的烃分压。
[0430] 提升段出口处的裂化流温度是约510℃至621℃(950℉至1150℉)。然而，提升段出口温度高于566℃(1050℉)会产生更多干燥气体和更多烯烃。而提升段出口温度低于566℃(1050℉)会产生较少乙烯和丙烯。因此，优选在约566℃至约630℃的优选温度、约138kPa至约240kPa(20psia至35psia)的优选压力下进行FCC方法。所述方法的另一个条件是催化剂与脂质组合物的比率，可以在约5至约20之间变化，并且优选地是约10至约15。
[0431] 在生产喷气燃料的方法的一个实施方案中，将脂质组合物引入FCC反应器的上升段。上升段中的温度非常高，并且在约700℃(1292℉)至约760℃(1400℉)范围内，其中催化剂与脂质组合物的比率是约100至约150。可以预期将脂质组合物引入上升段中会产生大量的丙烯和乙烯。
[0432] 在利用如本文所述产生的脂质组合物或脂质生产喷气燃料的方法的另一个实施方案中，脂质组合物或脂质的结构由被称为加氢脱氧(HDO)的方法破坏。HDO意思是借助于氢除去氧，即除去氧的同时破坏物质的结构。使烯属双键氢化，并除去任何硫和氮化合物。硫的除去被称为加氢脱硫(HDS)。对原材料(脂质组合物或脂质)进行预处理和纯化有助于延长催化剂的使用寿命。
[0433] 一般在HDO/HDS步骤中，将氢与原料(脂质组合物或脂质)混合，然后使混合物以单相原料或双相原料形式顺流通过催化剂床。HDO/MDS步骤后，分离产物组分，并且将其通到单独的异构化反应器中。用于生物起始物质的异构化反应器描述于文献(FI 100 248)中(顺流反应器)。
[0434] 还可以通过使脂质组合物或脂质与氢气顺流通过第一氢化区，并随后通过将氢气相对于烃排出物逆流通到第二氢化区以在第二氢化区中对烃排出物进行进一步氢化来进行通过使烃进料(例如本文中的脂质组合物或脂质)氢化来生产燃料的方法。示例性HDO应用和用于使脂质组合物裂化以产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利第7,232,935号中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0435] 通常在加氢脱氧步骤中，使生物组分(如本文中的脂质组合物或脂质)的结构分解，除去氧、氮、磷以及硫化合物和轻烃(作为气体)，并使烯键氢化。在所述方法的第二个步骤中，即在所谓的异构化步骤中，进行异构化以使烃链分支，并且改良低温下石蜡的性能。
[0436] 在裂化法的第一个步骤即HDO步骤中，将氢气和需要氢化的本文中的脂质组合物或脂质顺流或逆流通到HDO催化剂床系统中，所述催化剂床系统包含一个或多个催化剂床，优选1-3个催化剂床。通常以顺流方式进行HDO步骤。在HDO催化剂床系统包含两个或更多个催化剂床的情况下，利用逆流原理对一个或多个催化剂床进行操作。在HDO步骤中，压力在20巴与150巴之间变化，优选地在50巴与100巴之间，并且温度在200℃与500℃之间变化，优选地在300℃-400℃的范围内。在HDO步骤中，可以使用含有元素周期表中第VII族和/或第VIB族金属的已知氢化催化剂。氢化催化剂优选地是负载型Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo催化剂，其中载体是氧化铝和/或硅石。通常使用NiMo/Al2O3和CoMo/Al2O3催化剂。
[0437] 在HDO步骤之前，任选地通过在较温和条件下进行预氢化对本文中的脂质组合物或脂质进行处理，从而避免双键的副反应。在预氢化催化剂存在下，在50℃-400℃的温度和1-200巴的氢气压力下，优选地在150℃与250℃之间的温度和在10巴与100巴之间的氢气压力下进行所述预氢化。催化剂可以含有元素周期表中第VIII族和/或第VIB族的金属。预氢化催化剂优选地是负载型Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo催化剂，其中载体是氧化铝和/或硅石。
[0438] 使HDO步骤中含有氢的气流冷却，然后从中除去一氧化碳、二氧化碳、氮、磷和硫化合物、气态轻烃以及其它杂质。压缩后，使经过纯化的氢或经过再循环的氢返回至第一催化剂床和/或催化剂床之间，以补偿排出的气流。从浓缩的液体中除去水。将液体通到第一催化剂床或催化剂床之间。
[0439] HDO步骤后，使产物进行异构化步骤。在烃与异构化催化剂接触之前尽可能完全地除去杂质对于该过程是重要的。异构化步骤包括任选的汽提步骤，其中通过用水蒸气或合适的气体(诸如轻烃、氮气或氢气)汽提对来自HDO步骤的反应产物进行纯化。以逆流方式在异构化催化剂的上游单元中进行任选的汽提步骤，其中气体与液体相互接触，或利用逆流原理在实际异构化反应器之前在单独的汽提单元中进行任选的洗脱步骤。
[0440] 汽提步骤后，将氢气和经过氢化的本文中的脂质组合物或脂质以及任选地正构石蜡烃混合物通到包含一个或数个催化剂床的异构化反应单元中。异构化步骤的催化剂床可以顺流或逆流方式运行。
[0441] 在异构化步骤中应用逆流原理对于该过程是重要的。在异构化步骤中，这通过以逆流方式进行任选的汽提步骤或异构化反应步骤或这两者来进行。在异构化步骤中，压力在20巴-150巴的范围内变化，优选在20巴-100巴范围内，温度在200℃与500℃之间，优选在300℃与400℃之间。在异构化步骤中，可以使用本领域中已知的异构化催化剂。合适的异构化催化剂含有分子筛和/或第VII族的金属和/或载体。异构化催化剂优选地含有SAPO-11或SAPO41或ZSM-22或ZSM-23或镁碱沸石以及Pt、Pd或Ni以及Al2O3或SiO2。典型的异构化催化剂是例如Pt/SAPO-11/Al2O3、Pt/ZSM-22/Al2O3、Pt/ZSM-23/Al2O3以及Pt/SAPO-11/SiO2。可以在相同的压力容器或单独的压力容器中进行异构化步骤和HDO步骤。在单独的压力容器中或在与HDO和异构化步骤相同的压力容器中进行任选的预氢化。
[0442] 因此，在一个实施方案中，一个或多个化学反应的产物是包含HRJ-5的烷烃混合物。在另一个实施方案中，一个或多个化学反应的产物是包含ASTM D1655喷气燃料的烷烃混合物。在一些实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有少于10ppm的硫含量。在其它实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有低于205℃的蒸馏曲线的T10值。在另一个实施方案中，符合ASTM1655喷气燃料规范的组合物具有低于300℃的终沸点(FBP)。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有至少3
38℃的燃点。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有775K/M 与
3
840K/M 之间的密度。在又另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有低于-47℃的凝固点。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有至少42.8MJ/K的净燃烧热。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有至少13.4质量％的氢含量。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有如通过重量定量JFTOT于260℃下所测试低于3mm Hg的热稳定性。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有低于7mg/dl的实际胶质。
38℃的燃点。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有775K/M 与
3
840K/M 之间的密度。在又另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有低于-47℃的凝固点。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有至少42.8MJ/K的净燃烧热。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有至少13.4质量％的氢含量。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有如通过重量定量JFTOT于260℃下所测试低于3mm Hg的热稳定性。在另一个实施方案中，符合ASTM 1655喷气燃料规范的组合物具有低于7mg/dl的实际胶质。
[0443] 因此，本发明公开了多种方法，其中对微藻脂质进行化学修饰，以产生用于多种工业和其它应用中的产物。对由本文公开的方法产生的油类进行修饰的方法的实例包括但不限于对油类进行水解、对油类进行加氢处理以及对油类进行酯化。对微藻脂质进行的其它化学修饰包括但不限于环氧化、氧化、水解、硫酸化、磺化、乙氧基化、丙氧基化、酰胺化以及皂化。对微藻油类进行修饰会产生基本的油脂化学品，其可以被进一步修饰成所选的衍生油脂化学品以具有所需功能。以类似于上文对于燃料生产方法所述的方式，还可以对由本文所述的微生物培养物产生的油类进行这些化学修饰。基本油脂化学品的实例包括但不限于肥皂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪族氮化合物、脂肪酸甲酯以及甘油。衍生油脂化学品的实例包括但不限于脂肪族腈、酯、二聚酸、季铵盐、表面活性剂、脂肪酸链烷醇酰胺、脂肪醇硫酸酯、树脂、乳化剂、脂肪醇、烯烃、钻井泥浆、多元醇、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸酯、橡胶、蜡烛、化妆品、金属皂、肥皂、α-磺化甲酯、脂肪醇硫酸酯、脂肪醇乙氧基化物、脂肪醇醚硫酸酯、咪唑啉、表面活性剂、清洁剂、酯、季铵盐、臭氧分解产物、脂肪族胺、脂肪酸链烷醇酰胺、乙氧基硫酸酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯(包括中链甘油三酯)、润滑剂、液压液、润滑油、介电液体、脱模剂、金属加工液、传热流体、其它官能流体、工业化学品(例如清洗剂、纺织加工助剂、增塑剂、稳定剂、添加剂)、表面涂料、油漆以及清漆、电线绝缘体以及高级烷烃。
[0444] 使通过本发明方法产生的甘油脂中的脂肪酸成分水解产生游离脂肪酸，可以使所述游离脂肪酸衍生化以产生其它有用的化学品。在水和催化剂(可以是酸或者碱)存在下进行水解。可以使释放的游离脂肪酸衍生化，以产生如下列专利报道的多种产品：美国专利第5,304,664号(高度硫酸化的脂肪酸)；第7,262,158号(清洁组合物)；第7,115,173号(织物软化剂组合物)；第6,342,208号(用于护理皮肤的乳液)；第7,264,886号(防水组合物)；第6,924,333号(油漆添加剂)；第6,596,768号(富含脂质的反刍动物原料)；以及第6,380,410号(用于清洁剂和清洗剂的表面活性剂)。
[0445] 对于水解，在本发明的一个实施方案中，任选地首先在液体介质(诸如水或氢氧化钠)中使甘油三酯油类水解，以获得甘油和肥皂。存在各种合适的甘油三酯水解方法，包括但不限于皂化、酸水解、碱水解、酶促水解(本文称为分解)以及利用热压水的水解。本领域技术人员应当知晓为了生产油脂化学品，不需要对甘油三酯油类进行水解；而是可以通过其它已知的方法将油类直接转化成所需的油脂化学品。举例来说，可以通过酯化作用将甘油三酯油类直接转化成脂肪酸甲酯。
[0446] 在一些实施方案中，通过将油类分解成甘油和脂肪酸来对通过本文公开的方法产生的油类进行催化水解。如上文所述，然后通过几种其它的修饰作用对脂肪酸进行进一步加工，以获得衍生油脂化学品。举例来说，在一个实施方案中，使脂肪酸进行胺化反应，以产生脂肪族氮化合物。在另一个实施方案中，使脂肪酸进行臭氧分解，以产生一元酸和二元酸。
[0447] 在其它实施方案中，通过使本文中产生的油类分解来进行水解，以产生油脂化学品。在本发明的一些优选的实施方案中，在进行其它方法前使甘油三酯油类分解。本领域技术人员应当知晓有很多使甘油三酯分解的合适方法，包括但不限于酶促分解和压力分解。
[0448] 酶促油类分解方法一般使用酶、脂酶作为作用于水/油混合物的生物催化剂。酶促分解然后使油类或脂肪分别分解成甘油和游离脂肪酸。甘油然后迁移至水相中，而有机相富含游离脂肪酸。
[0449] 酶促分解反应一般发生在有机相与水相之间的相边界，其中酶仅存在于相边界。到达相边界的甘油三酯然后进行或参与分解反应。随着反应的进行，与游离脂肪酸相比，相边界处仍然以甘油酯形式化学结合的脂肪酸的占有密度或浓度降低，以使反应减慢。在某些实施方案中，在室温下进行酶促分解。本领域技术人员应当知晓使油类分解成所需脂肪酸的合适条件。
[0450] 举例来说，可以通过增加界面边界表面使反应速度加快。反应完成后，然后从已去除酶的有机相中分离游离脂肪酸，并且将仍然含有以甘油酯形式化学结合的脂肪酸的残余物送回或再循环，并且与即将进行分解的新鲜油类或脂肪混合。用这样的方式，然后使再循环的甘油酯进行进一步酶促分解过程。在一些实施方案中，以这种方式从部分分解的油类或脂肪中提取游离脂肪酸。以那种方式，如果将化学结合的脂肪酸(甘油三酯)返回或送回至分解过程中，可以使酶的消耗显著减少。
[0451] 分解程度被确定为用所测定的酸值除以对于给定油类或脂肪计算出的理论上可能的酸值所得到的比率。优选地根据标准的常用方法通过滴定测量酸值。或者，可以将甘油水相的密度视作分解程度的量度。
[0452] 在一个实施方案中，本文所述的分解方法还适用于使由所产生油类的碱提炼方法产生的所谓的皂料中含有的甘油单酯、甘油二酯以及甘油三酯分解。用这样的方式，可以使皂料定量转化而不需要之前将中性油类皂化成脂肪酸。为了这个目的，优选地在分解之前通过加入酸使在肥皂中化学结合的脂肪酸释放。在某些实施方案中，除了水和酶外，还可使用缓冲溶液进行分解方法。
[0453] 在一个实施方案中，还可以对根据本发明的方法产生的油类进行皂化(一种水解方法)。动物油和植物油通常由三酰基甘油(TAG)组成，其是脂肪酸与三元醇(甘油)形成的酯。在碱水解反应中，TAG中的甘油被除去，留下3个羧酸阴离子，这些阴离子可以与碱金属阳离子(诸如钠或钾)缔合，产生脂肪酸盐。在这种方案中，从甘油部分裂解下羧酸成分，并由羟基置换。通过所需皂化程度确定反应中使用的碱(例如KOH)的量。如果目的是例如生产包含最初存在于TAG组合物中的一些油类的肥皂产品，那么将不足以使所有TAG转化成脂肪酸盐的量的碱引入到反应混合物中。通常在水溶液中进行这个反应，并且反应缓慢进行，但是可以通过加热使其加快。可以通过向反应混合物中加入盐(诸如水溶性碱金属卤化物(例如NaCl或KCl))促使脂肪酸盐沉淀出。碱优选地是碱金属氢氧化物，诸如NaOH或KOH。或者，反应方案中可以使用其它碱，诸如链烷醇胺，包括例如三乙醇胺和氨甲基丙醇。在一些情况下，优选使用这些替代品生产透明肥皂产品。在一个实施方案中，进行皂化的脂质组合物是如本文所述产生的动物脂模拟物(即类似于动物脂的脂质组合物)，或动物脂模拟物与另一种甘油三酯油类的共混物。
[0454] 在一些方法中，化学修饰的第一个步骤可以是加氢处理以使双键饱和，随后在氢和催化剂存在下于高温下进行脱氧。在其它方法中，在同一个反应中进行氢化和脱氧。在再其它方法中，在氢化之前进行脱氧。然后任选地同样在氢和催化剂存在下进行异构化作用。最后，必要时，可以除去气体和石脑油组分。举例来说，参见美国专利5,475,160(甘油三酯的氢化)；5,091,116(脱氧、氢化以及除气)；6,391,815(氢化)；以及5,888,947(异构化)。
[0455] 在本发明的一些实施方案中，使甘油三酯油类部分或完全脱氧。脱氧反应形成所需产物，包括但不限于脂肪酸、脂肪醇、多元醇、酮以及醛。一般来说，在不受任何特定理论限制的情况下，脱氧反应包括各种不同反应通路的组合，包括但不限于：氢解、氢化、连续氢化-氢解、连续氢解-氢化以及联合氢化-氢解反应，使得从脂肪酸或脂肪酸酯中至少部分地脱除氧，以产生反应产物，诸如脂肪醇，所述反应产物可以通过进一步加工而容易地转化成所需化学品。举例来说，在一个实施方案中，可以将脂肪醇通过FCC反应转化成烯烃或通过缩合反应转化成高级烷烃。
[0456] 一种所述化学修饰是氢化，它是使氢加成到甘油脂或游离脂肪酸的脂肪酸成分中的双键上。氢化方法使得可以将液体油类转化成半固体或固体脂肪，所述脂肪更适用于特定应用中。
[0457] 由本文所述的方法产生的油类的氢化可以与本文中提供的一种或多种方法和/或物质结合进行，如下列专利中所报道：美国专利第7,288,278号(食品添加剂或药剂)；第5,346,724号(润滑产品)；第5,475,160号(脂肪醇)；第5,091,116号(食用油)；第
6,808,737号(用于人造黄油和涂抹食品的结构脂肪)；第5,298,637号(低卡路里脂肪替代品)；第6,391,815号(氢化催化剂和硫吸附剂)；第5,233,099号和第5,233,100号(脂肪醇)；第4,584,139号(氢化催化剂)；第6,057,375号(抑泡剂)；以及第7,118,773号(食用乳液涂抹食品)。
6,808,737号(用于人造黄油和涂抹食品的结构脂肪)；第5,298,637号(低卡路里脂肪替代品)；第6,391,815号(氢化催化剂和硫吸附剂)；第5,233,099号和第5,233,100号(脂肪醇)；第4,584,139号(氢化催化剂)；第6,057,375号(抑泡剂)；以及第7,118,773号(食用乳液涂抹食品)。
[0458] 本领域技术人员应当知晓可以使用各种方法使碳水化合物氢化。一种合适的方法包括在氢化反应器中足以形成氢化产物的条件下使碳水化合物与氢气或与合适的气体混合的氢气以及催化剂接触。氢化催化剂一般可以包括Cu、Re、Ni、Fe、Co、Ru、Pd、Rh、Pt、Os、Ir以及其合金或任何组合，其单独或与促进剂一起使用，所述促进剂诸如W、Mo、Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、B、P、Bi以及其合金或任何组合。其它有效的氢化催化剂物质包括负载型镍或经过铼改质的钌。在一个实施方案中，氢化催化剂还包括任一种载体，这取决于催化剂所需的功能。可以用本领域技术人员已知的方法制备氢化催化剂。
[0459] 在一些实施方案中，氢化催化剂包括负载型第VIII族金属催化剂和金属海绵材料(例如海绵镍催化剂)。适用于本发明的经过活化的海绵镍催化剂的一个实例是阮尼镍(Raney nickel)。在其它实施方案中，利用包含镍-铼催化剂或经过钨改质的镍催化剂的催化剂进行本发明中的氢化反应。用于本发明的氢化反应的合适催化剂的一个实例是碳负载型镍-铼催化剂。
[0460] 在一个实施方案中，可以通过用碱水溶液(例如含有约25重量％的氢氧化钠)对约相等重量的镍和铝的合金进行处理来制备合适的阮尼镍催化剂。铝选择性地由碱水溶液溶解，产生海绵形材料，主要包含镍以及少量铝。初始合金包括促进剂金属(即钼或铬)，其量使其在所形成的海绵镍催化剂中保留约1重量％至2重量％。在另一个实施方案中，通过使用亚硝酰硝酸钌(III)、氯化钌(III)的水溶液浸渍合适的支撑材料来制备氢化催化剂。然后使溶液干燥，形成水含量少于约1重量％的固体。然后在旋转式球形炉中在氢气流中于大气压下在300℃(未锻烧)或400℃(锻烧)下将固体还原4小时。冷却并用氮气使催化剂隋化后，使含5体积％氧气的氮气通过催化剂2小时。
[0461] 在某些实施方案中，所描述的催化剂包括催化剂载体。所述催化剂载体使催化剂稳定并且提供支撑。所使用的催化剂载体的类型取决于所选择的催化剂和反应条件。用于本发明的合适的载体包括但不限于碳、硅石、硅石-氧化铝、氧化锆、二氧化钛、二氧化铈、氧化钒、氮化物、氮化硼、杂多酸、羟磷灰石、氧化锌、氧化铬、沸石、碳钠米管、碳富勒烯以及其任何组合。
[0463] 进行氢化反应的条件基于起始物质和所需产物的类型而变化。本领域技术人员在本发明的权益下应当知晓适当的反应条件。一般来说，在80℃至250℃的温度下，并且优选地在90℃至200℃下，并且最优选地在100℃至150℃下进行氢化反应。在一些实施方案中，在500KPa至14000KPa的压力下进行氢化反应。
[0464] 本发明的氢解反应中使用的氢气可以包括外部氢气、再循环氢气、原位产生的氢气以及其任何组合。本文所用的术语“外部氢气”是指不是来源于生物质反应本身而是从另一种来源加入到系统中的氢气。
[0465] 在本发明的一些实施方案中，需要使起始碳水化合物转化成较小分子，所述较小分子更易于被转化成所需高级烃。用于这种转化的一种合适的方法是通过氢解反应。已知各种方法可以进行碳水化合物的氢解。一种合适的方法包括在氢解反应器中，在足以形成包含较小分子或多元醇的反应产物的条件下，使碳水化合物与氢气或与合适气体混合的氢气以及氢解催化剂接触。本文所用的术语“较小分子或多元醇”包括具有较小分子量(碳原子数或氧原子数少于起始碳水化合物)的任何分子。在一个实施方案中，反应产物包括较小分子，所述较小分子包括多元醇和醇。本领域技术人员能够选择适当的方法来进行氢解反应。
[0466] 在一些实施方案中，可以利用氢解催化剂将5碳和/或6碳糖或糖醇转化成丙二醇、乙二醇以及甘油。氢解催化剂可以包括Cr、Mo、W、Re、Mn、Cu、Cd、Fe、Co、Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Ir、Os以及其合金或任何组合，其单独或与促进剂一起使用，所述促进剂诸如Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、Bi、B、O以及其合金或任何组合。氢解催化剂还可以包括含有过渡金属(例如铬、钼、钨、铼、锰、铜、镉)或第VIII族金属(例如铁、钴、镍、铂、钯、铑、钌、铱以及锇)的碳焦化聚合物催化剂。在某些实施方案中，氢解催化剂可以包括与碱土金属氧化物组合或附着在具催化活性的载体上的上述任何金属。在某些实施方案中，氢解反应中所述的催化剂可以包括如上文对于氢化反应所述的催化剂载体。
[0467] 进行氢解反应的条件基于起始物质和所需产物的类型而变化。本领域技术人员在本发明的权益下应当知晓用于进行该反应的适当的条件。一般来说，在110℃至300℃的温度下，并且优选地在170℃至220℃下，并且最优选地在200℃至225℃下进行其氢解反应。在一些实施方案中，在碱性条件下，优选地在8至13的pH值下，并且更优选地在10至12的pH值下进行氢解反应。在一些实施方案中，在60Kpa与16500Kpa之间范围内的压力下，并且优选地在1700Kpa与14000Kpa之间范围内，并且更优选地在4800Kpa与11000Kpa之间范围内的压力下进行氢解反应。
[0468] 本发明的氢解反应中使用的氢气可以包括外部氢气、再循环氢气、原位产生的氢气以及其任何组合。
[0469] 在一些实施方案中，可以在缩合反应器中通过缩合反应将上述反应产物转化成高级烃。在所述实施方案中，在能够形成高级烃的催化剂存在下对反应产物进行缩合。在不意图受理论限制的情况下，据信通过逐步加成反应产生高级烃，所述反应包括碳-碳键或碳-氧键的形成。所得到的反应产物包括多种含有这些部分的化合物，如下文更详细描述。
[0470] 在某些实施方案中，合适的缩合催化剂包括酸催化剂、碱催化剂或酸/碱催化剂。本文所用的术语“酸/碱催化剂”是指同时具有酸功能和碱功能的催化剂。在一些实施方案中，缩合催化剂可以包括但不限于沸石、碳化物、氮化物、氧化锆、氧化铝、硅石、铝硅酸盐、磷酸盐、氧化钛、氧化锌、氧化钒、氧化镧、氧化钇、氧化钪、氧化镁、氧化铈、氧化钡、氧化钙、氢氧化物、杂多酸、无机酸、酸改质树酯、碱改质树酯以及其任何组合。在一些实施方案中，缩合催化剂还可以包括改质剂。合适的改质剂包括La、Y、Sc、P、B、Bi、Li、Na、K、Rb、Cs、Mg、Ca、Sr、Ba以及其任何组合。在一些实施方案中，缩合催化剂还可以包括金属。合适的金属包括Cu、Ag、Au、Pt、Ni、Fe、Co、Ru、Zn、Cd、Ga、In、Rh、Pd、Ir、Re、Mn、Cr、Mo、W、Sn、Os、其合金以及任何组合。
[0471] 在某些实施方案中，缩合反应中所述的催化剂可以包括如上文对于氢化反应所述的催化剂载体。在某些实施方案中，缩合催化剂是自负载的。本文所用的术语“自负载”意思是催化剂不需要其它材料作为载体。在其它实施方案中，缩合催化剂与适于支持催化剂的单独载体结合使用。在一个实施方案中，缩合催化剂的载体是硅石。
[0472] 进行缩合反应的条件基于起始物质和所需产物的类型而变化。本领域技术人员在本发明的权益下应当知晓用于进行该反应的适当的条件。在一些实施方案中，在对计划进行的反应的热力学有利的温度下进行缩合反应。缩合反应的温度取决于特定起始多元醇或醇而变化。在一些实施方案中，缩合反应的温度在80℃至500℃的范围内，并且优选地在125℃至450℃范围内，并且最优选地在125℃至250℃范围内。在一些实施方案中，在0Kpa至9000Kpa之间范围内的压力下，并且优选地在0Kpa与7000Kpa之间范围内，并且更优选地在0Kpa与5000Kpa之间范围内的压力下进行缩合反应。
[0473] 由本发明形成的高级烷烃包括但不限于具有4至30个碳原子的支链或直链烷烃、具有4至30个碳原子的支链或直链烯烃、具有5至30个碳原子的环烷烃、具有5至30个碳原子的环烯烃、芳基化合物、稠合芳基化合物、醇以及酮。合适的烷烃包括但不限于丁烷、戊烷、戊烯、2-甲基丁烷、己烷、己烯、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烯、辛烷、辛烯、2，2，4-三甲基戊烷、2，3-二甲基己烷、2，3，4-三甲基戊烷、2，3-二甲基戊烷、壬烷、壬烯、癸烷、癸烯、十一烷、十一碳烯、十二烷、十二碳烯、十三烷、十三碳烯、十四烷、十四碳烯、十五烷、十五碳烯、十九烷、十九碳烯、二十烷、二十碳烯、二十一烷、二十一碳烯、二十二烷、二十二碳烯、二十三烷、二十三碳烯、二十四烷、二十四碳烯以及其异构体。这些产物中的一些适用作燃料。
[0474] 在一些实施方案中，环烷烃和环烯烃是未取代的。在其它实施方案中，环烷烃和环烯烃是单取代的。在再其它实施方案中，环烷烃和环烯烃是多取代的。在包含取代的环烷烃和环烯烃的实施方案中，取代基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支链或直链烷基、具有1至12个碳原子的支链或直链亚烷基、苯基以及其任何组合。合适的环烷烃和环烯烃包括但不限于环戊烷、环戊烯、环己烷、环己烯、甲基-环戊烷、甲基-环戊烯、乙基-环戊烷、乙基-环戊烯、乙基-环己烷、乙基-环己烯、其异构体以及任何组合。
[0475] 在一些实施方案中，所形成的芳基化合物是未取代的。在另一个实施方案中，所形成的芳基化合物是单取代的。在包含取代的芳基化合物的实施方案中，取代基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支链或直链烷基、具有1至12个碳原子的支链或直链亚烷基、苯基以及其任何组合。用于本发明的合适的芳基化合物包括但不限于苯、甲苯、二甲苯、乙基苯、对二甲苯、间二甲苯以及其任何组合。
[0476] 本发明中产生的醇具有4至30个碳原子。在一些实施方案中，醇是环状的。在其它实施方案中，醇是支链的。在另一个实施方案中，醇是直链的。用于本发明的合适的醇包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇、二十醇、二十一醇、二十二醇、二十三醇、二十四醇以及其异构体。
[0477] 本发明中产生的酮具有4至30个碳原子。在一个实施方案中，酮是环状的。在另一个实施方案中，酮是支链的。在另一个实施方案中，酮是直链的。用于本发明的合适的酮包括但不限于丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十一酮、十二酮、十三酮、十四酮、十五酮、十六酮、十七酮、十八酮、十九酮、二十酮、二十一酮、二十二酮、二十三酮、二十四酮以及其异构体。
[0478] 另一种这种化学修饰是酯交换。天然产生的甘油脂中脂肪酸成分分布不均匀。对于油类，酯交换是指在不同甘油脂的两个酯基之间进行酰基交换。酯交换方法提供了一种机制，其中甘油脂混合物中的脂肪酸成分可以经过重排，以对分布型式进行调整。酯交换是熟知的化学方法，并且一般包括在催化剂(诸如碱金属或碱金属烷基化物(例如甲醇钠))存在下将油类混合物加热(至约200℃)一段时间(例如30分钟)。这种方法可以用于使油类混合物中脂肪酸成分的分布型式随机化，或可以用于产生所需的分布型式。可以对本文中提供的物质(诸如脂质百分比(以细胞干重计)为至少20％的微生物生物质)进行这种对脂质进行化学修饰的方法。
[0479] 可以通过将油类混合物维持在可能存在的一些TAG的熔点以下的温度下来进行以脂肪酸的特定分布型式为目的的定向酯交换。这使得这些TAG选择性结晶，因TAG结晶而有效地从反应混合物中将其除去。该过程可以持续直至例如油类中的大部分脂肪酸已经沉淀出为止。定向酯交换方法可以被用于例如通过用短链脂肪酸取代长链脂肪酸来生产具有较低卡路里含量的产品。定向酯交换还可以被用于生产具有脂肪混合物的产品，所述脂肪混合物可以提供在食品添加剂或产品(例如人造黄油)中寻求的所需的熔化特性和结构特征而无需进行会产生不期望的反式异构体的氢化。
[0480] 通过本文所述的方法产生的油类的酯交换可以与一种或多种方法和/或物质结合进行，或用于生产产品，如下列专利中所报道：美国专利第6,080,853号(不易消化脂肪的替代品)；第4,288,378号(花生酱稳定剂)；第5,391,383号(食用喷淋油)；第6,022,577号(用于食品的食用脂肪)；第5,434,278号(用于食品的食用脂肪)；第
5,268,192号(低卡路里的坚果产品)；第5,258,197号(卡路里减少的食用组合物)；第
4,335,156号(食用脂肪产品)；第7,288,278号(食品添加剂或药剂)；第7,115,760号(分馏方法)；第6,808,737号(结构脂肪)；5,888,947号(发动机润滑剂)；第5,686,131号(食用油混合物)；以及第4,603,188号(可固化氨基甲酸酯组合物)。
5,268,192号(低卡路里的坚果产品)；第5,258,197号(卡路里减少的食用组合物)；第
4,335,156号(食用脂肪产品)；第7,288,278号(食品添加剂或药剂)；第7,115,760号(分馏方法)；第6,808,737号(结构脂肪)；5,888,947号(发动机润滑剂)；第5,686,131号(食用油混合物)；以及第4,603,188号(可固化氨基甲酸酯组合物)。
[0481] 在根据本发明的一个实施方案中，如上文所述的油类酯基转移后使经过酯基转移的产物与多元醇发生反应，如美国专利第6,465,642号中所报道，以产生多元醇脂肪酸聚酯。这种酯化和分离方法可以包括下列步骤：在肥皂存在下使低级烷基酯与多元醇反应；从产物混合物中除去剩余的肥皂；对产物混合物进行水洗涤并使其干燥以除去杂质；将产物混合物漂白以用于提炼；将产物混合物中的多元醇脂肪酸聚酯与至少一部分未反应的低级烷基酯分离开；以及使经过分离的未反应的低级烷基酯进行再循环。
[0482] 还可以对具有短链脂肪酸酯的微生物生物质进行酯基转移，如美国专利6,278,006中所报道。一般来说，可以通过在合适的催化剂存在下将短链脂肪酸酯加入到油类中并对混合物进行加热来进行酯基转移。在一些实施方案中，油类占反应混合物的约
5重量％至约90重量％。在一些实施方案中，短链脂肪酸酯可以占反应混合物的约10重量％至约50重量％。催化剂的非限制性实例包括碱催化剂、甲醇钠、酸催化剂(包括无机酸，诸如硫酸和经过酸化的粘土，有机酸，诸如甲烷磺酸、苯磺酸以及甲苯磺酸)以及酸性树脂(诸如Amberlyst 15)。金属(诸如钠和镁)和金属氢化物也是有用的催化剂。
5重量％至约90重量％。在一些实施方案中，短链脂肪酸酯可以占反应混合物的约10重量％至约50重量％。催化剂的非限制性实例包括碱催化剂、甲醇钠、酸催化剂(包括无机酸，诸如硫酸和经过酸化的粘土，有机酸，诸如甲烷磺酸、苯磺酸以及甲苯磺酸)以及酸性树脂(诸如Amberlyst 15)。金属(诸如钠和镁)和金属氢化物也是有用的催化剂。
[0483] 另一种这种化学修饰是羟基化，包括将水加成到双键上，以使其饱和并引入羟基部分。羟基化方法提供了将甘油脂的一种或多种脂肪酸成分转化成羟基脂肪酸的机制。例如可以通过美国专利第5,576,027号中报道的方法进行羟基化。经过羟基化的脂肪酸，包括蓖麻油和其衍生物，可以用作多种工业应用中的组分，包括食品添加剂、表面活性剂、颜料润湿剂、消沫剂、防水添加剂、增塑剂、化妆品乳化剂和/或除臭剂，以及电学、药学、油漆、墨水、粘合剂以及润滑剂中的组分。对甘油酯进行羟基化的方式的一个实例如下：可以将脂肪与庚烷一起加热，优选地加热至约30℃-50℃，并在所述温度下保持30分钟或更长时间；然后将乙酸加入到混合物中，随后加入硫酸水溶液，随后以较小增量在1小时内将过氧化氢水溶液加入到混合物中；加入过氧化氢水溶液后，然后将温度升高至至少约60℃并搅拌至少6小时；搅拌后，使混合物静置，并且除去反应形成的下部水层，同时用温度为约60℃的热水对反应形成的上部庚烷层进行洗涤；然后用氢氧化钾水溶液中和已洗涤的庚烷层至pH值为约5至7，然后通过在真空中蒸馏除去；然后在真空下于100℃下使反应产物干燥，并且将已干燥的产物在真空条件下蒸汽除臭，并且利用硅藻土于约50℃至60℃下进行过滤。
[0484] 通过本文所述的方法产生的微生物油类的羟基化可以与一种或多种方法和/或物质结合进行，或用于生产产品，如下列专利中所报道：美国专利第6,590,113号(油基涂料和墨水)；第4,049,724号(羟基化方法)；第6,113,971号(橄榄油脂)；第4,992,189号(润滑剂和润滑物质添加剂)；第5,576,027号(经过羟基化的牛奶)；以及第6,869,597号(化妆品)。
[0485] 经过羟基化的甘油脂可以被转化成交内酯。交内酯由甘油脂组成，在所述甘油脂中，经过羟基化的脂肪酸成分被酯化成另一脂肪酸分子。可以通过使甘油脂与脂肪酸的混合物升温并使该混合物与无机酸接触来使经过羟基化的甘油脂转化成交内酯，如Isbell等，JAOCS71(2)：169-174(1994)所述。交内酯可以用于多种应用中，包括但不限于下列专利中所报道的应用：美国专利第7,196,124(弹性体材料和楼面覆面层)；5,458,795(用于高温应用的增稠油)；5,451,332(用于工业应用的流体)；5,427,704(燃料添加剂)；以及5,380,894(润滑剂、润脂油、增塑剂以及印刷墨水)。
[0486] 另一种这种化学修饰是烯烃复分解。在烯烃复分解中，催化剂切断烯烃(链烯烃)中的次烷基碳并且通过使其各自与不同的次烷基碳配对来形成新的烯烃。烯烃复分解反应提供了如下过程的机制，所述过程诸如通过乙烯醇分解将不饱和脂肪酸烷基链在烯烃处截断、通过自复分解由烯烃键使脂肪酸交联，以及通过与衍生化烯烃进行交叉复分解将新的官能团并入脂肪酸上。
[0487] 结合其它反应(诸如酯基转移和氢化)，烯烃复分解可以使不饱和甘油脂转化成不同的最终产物。这些产物包括甘油脂寡聚物(用于蜡)；短链甘油脂(用于润滑剂)；同型双官能和异型双官能烷基链(用于化学品和聚合物)；短链酯(用于生物燃料)；以及短链烃(用于喷气燃料)。可以例如使用美国专利第7,119,216号、美国专利公布第
2010/0160506号以及美国专利公布第2010/0145086号中所报道的催化剂和方法对三酰基甘油和脂肪酸衍生物进行烯烃复分解。
2010/0160506号以及美国专利公布第2010/0145086号中所报道的催化剂和方法对三酰基甘油和脂肪酸衍生物进行烯烃复分解。
[0488] 生物油类的烯烃复分解一般包括在其它烯烃存在(交叉复分解)或不存在(自复分解)下将Ru催化剂溶液以约10ppm至250ppm的负载量在惰性条件下加入到不饱和脂肪酸酯中。通常使反应进行几小时至几天并且最终产生烯烃产物的分布。可对脂肪酸衍生物进行烯烃复分解的方式的一个实例如下：可以将第一代格拉布催化剂(GrubbsCatalyst)(二氯代[2(1-甲基乙氧基-α-O)苯基]亚甲基-α-C](三环己基-膦))于甲苯中的溶液以222ppm的催化剂负载量加入到容纳经过脱气并且干燥的油酸甲酯的容器中。然后用约60psig的乙烯气体将容器加压并且在约30℃或低于约30℃下保持3小时，借此可以产生约50％产率的9-癸烯酸甲酯。
[0489] 通过本文所述的方法产生的油类的烯烃复分解可以与一种或多种方法和/或物质结合进行，或用于生产产品，如下列专利中所报道：专利申请PCT/US07/081427(α-烯烃脂肪酸)和美国专利申请第12/281,938号(石油乳膏)、第12/281,931号(彩弹枪胶囊)、第12/653,742号(增塑剂和润滑剂)、第12/422,096号(双官能有机化合物)，以及第11/795,052号(烛用蜡)。
[0490] 可以对微生物油类进行的其它化学反应包括使三酰基甘油与环丙烷化试剂反应以增加流动性和/或氧化稳定性，如美国专利6,051,539中所报道；从三酰基甘油生产蜡，如美国专利6,770,104中所报道；以及三酰基甘油的环氧化，如在″The effect of fatty acidcomposition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols″，Journal of the American Oil Chemists′Society，79：1，59-63，(2001)和Free Radical Biology and Medicine，37：1，104-114(2004)中所报道。
[0491] 如上文所述用于燃料和化学产品的产油微生物生物质的产生使得能够产生脱脂生物质粉。脱脂粉是制备藻类油类中的副产物，并且可以用作农畜(例如反刍动物、家禽、猪以及水产养殖动物)的动物饲料。所得到的粉虽然油含量减少，但是仍然含有高质量的蛋白质、碳水化合物、纤维、灰、残余油以及适用于动物饲料的其它营养素。由于通过油类分离方法使细胞绝大部分溶解，所以脱脂粉易于被这些动物消化。任选地可以在动物饲料中，将脱脂粉与其它成分(诸如谷物)组合。由于脱脂粉具有粉末状的稠度，所以可以利用可商购获得的挤压机或扩张器或另一种类型的机器将其挤压成丸状。
[0492] 在下列实施例中对上文详细描述的本发明进行示例，所述实施例仅用于说明本发明，而并不对要求保护的本发明构成限制。
[0493] VII.实施例
[0494] 实施例1：培养原藻的方法
[0495] 对原藻属藻株进行培育，以产生高百分比(以细胞干重计)的油类。使低温保藏的细胞于室温下融化，并将500μl细胞加入到4.5ml培养基(4.2g/L K2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水合物、0.025g/L CaCl2·2H2O、2g/L酵母提取物)+2％葡萄糖中，并使细胞在6孔培养板中于28℃下在振荡(200rpm)下生长7天。通过将1ml培养物在预称重的微量离心管中以14,000rpm离心5分钟来测定细胞干重。弃去培养物上清液，并且用1ml去离子水洗涤所得到的细胞沉淀物。再将培养物离心，弃去上清液，并将细胞沉淀物置于-80℃下直至冷冻为止。然后使样品冻干24小时并且计算细胞干重。为了测定培养物中的脂质总量，取出3ml培养物并利用Ankom系统(Ankom Inc.，Macedon，NY)根据制造商的方案进行分析。利用Amkom XT10提取器根据制造商的方案对样品进行溶剂提取。脂质总量被测定为经过酸水解的干燥样品与经过溶剂提取的干燥样品之间的质量差异。油类占细胞干重的百分比的测量结果展示于表10中。
[0496] 表10.以细胞干重计的油类百分比
[0497]物种 藻株 ％油类
雍滞原藻 UTEX 327 13.14
桑椹形原藻 UTEX 1441 18.02
桑椹形原藻 UTEX 1435 27.17
雍滞原藻 UTEX 327 13.14
桑椹形原藻 UTEX 1441 18.02
桑椹形原藻 UTEX 1435 27.17
[0498] 对来源于原藻属的多种藻株的微藻样品进行基因型分析。如下从藻类生物质中分离基因组DNA。从液体培养物中将细胞(约200mg)以14,000×g离心5分钟。然后在无菌蒸馏水中重悬细胞，以14,000×g离心5分钟并弃去上清液。将直径约2mm的单个玻璃珠加入到生物质中，并且将试管于-80℃下放置至少15分钟。移出样品，并加入150μl研磨缓冲液(1％肌氨酰、0.25M蔗糖、50mM NaCl、20mM EDTA、100mM Tris-HCl(pH 8.0)、核糖核酸酶A 0.5μg/μl)。通过短暂渦旋使沉淀物重悬，随后加入40μl 5M NaCl。短暂渦旋样品，随后加入66μl 5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)并进行最终短暂渦旋。然后将样品在65℃下孵育10分钟，之后以14,000×g离心10分钟。将上清液转移至新试管中并用300μl 12∶12∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇萃取一次，随后以14,000×g离心5分钟。将所得到的水相转移至含有0.7体积异丙醇(约190μl)的新试管中，颠倒混合并于室温下孵育30分钟或在4℃下整夜孵育。通过以14,000×g离心10分钟回收DNA。然后用70％
乙醇洗涤所得到的沉淀物两次，随后用100％乙醇进行最后的洗涤。将沉淀物在室温下空气干燥20分钟至30分钟，随后重悬于50μl10mM TrisCl、1mM EDTA(pH 8.0)中。
乙醇洗涤所得到的沉淀物两次，随后用100％乙醇进行最后的洗涤。将沉淀物在室温下空气干燥20分钟至30分钟，随后重悬于50μl10mM TrisCl、1mM EDTA(pH 8.0)中。
[0499] 将如上文所述制备的5μl总藻类DNA在10mM Tris(pH 8.0)中1∶50稀释。最终体积为20μl的PCR反应如下设置。将10μl 2×iProofHF 母体混合物(BIO-RAD)加入到0.4μl引物SZ02613(5′-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3′(SEQ ID NO：9)，储液浓度为10mM)中。该引物序列来自基因库登录号L43357中的位置567-588并且在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。随后加入0.4μl引物SZ02615(5′-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3′(SEQ ID NO：10)，储液浓度为10mM)。该引物序列与基因库登录号L43357的位置1112-1093互补，并且在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。然后加入5μl经过稀释的总DNA和
3.2μl dH2O。PCR反应如下进行：98℃，45″；98℃，8″；53℃，12″；72℃，20″，进行35个循环，随后72℃持续1分钟并保持在25℃。为了纯化PCR产物，向各反应物中加入20μl
10mM Tris(pH 8.0)，随后用40μl 12∶12∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇进行萃取，渦旋并以
14,000×g离心5分钟。将PCR反应物施加于S-400柱(GE Healthcare)，并且以3,000×g离心2分钟。随后将经过纯化的PCR产物TOPO克隆成PCR8/GW/TOPO，并在LB/Spec培养板上选择阳性克隆。利用M13正向和反向引物对经过纯化的质粒DNA进行双向测序。总共对
12种原藻属藻株进行选择以对其23SrRNA DNA进行测序，而且这些序列列于序列表中。下文包括藻株和序列表编号的概述。对这些序列与UTEX 1435(SEQ ID NO：15)序列的总体差异进行分析。出现了两对差异最大的序列(UTEX 329/UTEX1533和UTEX 329/UTEX 1440)。
在这两种情况下，成对比对的结果是75.0％的成对序列一致性。下文还包括与UTEX 1435的序列一致性百分比：
3.2μl dH2O。PCR反应如下进行：98℃，45″；98℃，8″；53℃，12″；72℃，20″，进行35个循环，随后72℃持续1分钟并保持在25℃。为了纯化PCR产物，向各反应物中加入20μl
10mM Tris(pH 8.0)，随后用40μl 12∶12∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇进行萃取，渦旋并以
14,000×g离心5分钟。将PCR反应物施加于S-400柱(GE Healthcare)，并且以3,000×g离心2分钟。随后将经过纯化的PCR产物TOPO克隆成PCR8/GW/TOPO，并在LB/Spec培养板上选择阳性克隆。利用M13正向和反向引物对经过纯化的质粒DNA进行双向测序。总共对
12种原藻属藻株进行选择以对其23SrRNA DNA进行测序，而且这些序列列于序列表中。下文包括藻株和序列表编号的概述。对这些序列与UTEX 1435(SEQ ID NO：15)序列的总体差异进行分析。出现了两对差异最大的序列(UTEX 329/UTEX1533和UTEX 329/UTEX 1440)。
在这两种情况下，成对比对的结果是75.0％的成对序列一致性。下文还包括与UTEX 1435的序列一致性百分比：
[0500]
[0501] 利用HPLC对上文所列的藻株的子集的脂质样品进行脂质型态分析。结果展示于下表11中。
[0502] 表11.原藻属物种中脂质链的多样性
[0503]
[0504] 分析从桑椹形原藻UTEX 1435中提取(通过溶剂提取或使用压榨机)的油类中的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚、其它甾醇以及生育三烯酚。结果总结于下表12中。
[0505] 表12.对从桑椹形原藻(UTEX 1435)提取的油类进行的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚/甾醇以及生育三烯酚的分析。
[0506]
[0507]
[0508] 使用标准植物油加工方法对单独的四批从桑椹形原藻中提取的油类进行提炼和漂白。简言之，在水平倾析器中净化从桑椹形原藻中提取的粗油类，在水平倾析器中固体与油类分离。然后将经过净化的油类转移至具有柠檬酸和水的贮槽中并且将其静置约24小时。24小时后，混合物在贮槽中形成2个单独的层。底层由水和胶质构成，然后通过倾析将底层除去，之后将经过脱胶的油类转移到漂白槽中。然后将油类与另外一定剂量的柠檬酸一起加热。然后将漂白粘土加入到漂白槽中，并且在真空下进一步加热混合物以蒸发掉存在的任何水。然后经由叶片式过滤器泵出混合物以除去漂白粘土。然后使经过过滤的油类通过最终的5μm精细过滤器，然后进行收集以储存直到使用为止。然后分析经过提炼和漂白(RB)的油类中的类胡萝卜素、叶绿素、甾醇、生育三烯酚以及生育酚。这些分析的结果总结于下表13中。“Nd”表示没有检测到并且检测灵敏度列于下文中：
[0509] 检测灵敏度
[0510] 类胡萝卜素(mcg/g)nd＝＜0.003mcg/g
[0511] 叶绿素(mcg/g)nd＝＜0.03mcg/g
[0512] 甾醇(％)nd＝0.25％
[0513] 生育酚(mcg/g)；nd＝3mcg/g
[0514] 表13.对经过提炼和漂白的桑椹形原藻油类进行的类胡萝卜素、叶绿素、甾醇、生育三烯酚以及生育酚分析。
[0515]
[0516]
[0517] 还对相同四批桑椹形原藻油类进行微量元素分析并且结果总结于下表14中。
[0518] 表14.对经过提炼和漂白的桑椹形原藻油类进行的元素分析。
[0519]
[0520]
[0521]
[0522]
[0523] 实施例2：对原藻进行基因枪转化的一般方法
[0524] 根据制造商的方案制备Seashell金微载体(550纳米)。将质粒(20μg)与50μl结合缓冲液以及60μl(30mg)S550d金载体混合，并在冰上孵育1分钟。加入沉淀缓冲液(100μl)，并将混合物在冰上再孵育1分钟。渦旋后，通过在微量离心管5415C中以
10,000rpm旋转10秒以使涂有DNA的颗粒沉淀。用500μl的冷100％乙醇洗涤金沉淀物一次，在微量离心管中短暂旋转使其沉淀，并用50μl冰冷乙醇重悬。短暂(1-2秒)声波处理后，立即将10μl涂有DNA的颗粒转移至载体膜上。
10,000rpm旋转10秒以使涂有DNA的颗粒沉淀。用500μl的冷100％乙醇洗涤金沉淀物一次，在微量离心管中短暂旋转使其沉淀，并用50μl冰冷乙醇重悬。短暂(1-2秒)声波处理后，立即将10μl涂有DNA的颗粒转移至载体膜上。
[0525] 使原藻属藻株在回转振荡器上生长于朊间质培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)6
以及2％葡萄糖中直至其细胞密度达到2×10 个细胞/毫升为止。收集细胞，用无菌蒸馏
7
水洗涤一次，并重悬于50μl培养基中。将1×10 个细胞涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He基因枪颗粒递送系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1350psi)，并将培养板放在屏/巨载体配件下面6cm处。在25℃下使细胞复苏12小时-24小时。复苏后，用橡皮刮从培养板上刮下细胞，与100μl培养基混合，并涂于含有适当的抗生素选择的培养板上。在25℃下孵育7-10天后，在培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。挑取群落，并点样于选择性(抗生素或碳源)琼脂板上进行第二轮选择。
以及2％葡萄糖中直至其细胞密度达到2×10 个细胞/毫升为止。收集细胞，用无菌蒸馏
7
水洗涤一次，并重悬于50μl培养基中。将1×10 个细胞涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He基因枪颗粒递送系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1350psi)，并将培养板放在屏/巨载体配件下面6cm处。在25℃下使细胞复苏12小时-24小时。复苏后，用橡皮刮从培养板上刮下细胞，与100μl培养基混合，并涂于含有适当的抗生素选择的培养板上。在25℃下孵育7-10天后，在培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。挑取群落，并点样于选择性(抗生素或碳源)琼脂板上进行第二轮选择。
[0526] 实施例3：小球藻的转化
[0527] 载体构建
[0528] 将含有CMV启动子、潮霉素抗性cDNA以及CMV 3′UTR的BamHI-SacII片段(SEQ ID NO：152，pCAMBIA1380载体的子序列，Cambia，Canberra，Australia)克隆至pBluescript的BamHI和SacII位点中并且在本文中称作pHyg。
[0529] 对小球藻进行基因枪转化
[0530] 根据制造商的方案制备S550d金载体(来自Seashell Technology)。将线性化pHyg质粒(20μg)与50μl结合缓冲液以及60μl(30mg)S550d金载体混合，并在冰上孵育1分钟。加入沉淀缓冲液(100μl)，并将混合物在冰上再孵育1分钟。渦旋后，通过在微量离心管5415C中以10,000rpm旋转10秒以使涂有DNA的颗粒沉淀。用500μl的冷100％
乙醇洗涤金沉淀物一次，在微量离心管中短暂旋转使其沉淀，并用50μl冰冷乙醇重悬。短暂(1-2秒)声波处理后，立即将10μl涂有DNA的颗粒转移至载体膜上。
乙醇洗涤金沉淀物一次，在微量离心管中短暂旋转使其沉淀，并用50μl冰冷乙醇重悬。短暂(1-2秒)声波处理后，立即将10μl涂有DNA的颗粒转移至载体膜上。
[0531] 在以75μmol光子m-2sec-1进行连续光照下使原始小球藻培养物(德克萨斯大学培养物保藏中心250)在回转振荡器上生长于朊间质培养基(2g/L酵母提取物、
2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、
6
0.43mMNaCl)中直至其细胞密度达到2×10 个细胞/毫升为止。收集细胞，用无菌蒸馏水
7
洗涤一次，并重悬于50μl培养基中。将1×10 个细胞涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He基因枪颗粒递送系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1100psi和1350psi)，并将培养板放在屏/巨载体配件下面9cm和12cm处。在25℃下使细胞复苏12小时-24小时。复苏后，用橡皮刮从培养板上刮下细胞，与100μl培养基混合，并涂于含有潮霉素的培养板(200μg/ml)上。在25℃下孵育7-10天后，在1100psi和
1350psi裂碟片上以及9cm和12cm距离的培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。
挑取群落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮选择。
2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、
6
0.43mMNaCl)中直至其细胞密度达到2×10 个细胞/毫升为止。收集细胞，用无菌蒸馏水
7
洗涤一次，并重悬于50μl培养基中。将1×10 个细胞涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He基因枪颗粒递送系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1100psi和1350psi)，并将培养板放在屏/巨载体配件下面9cm和12cm处。在25℃下使细胞复苏12小时-24小时。复苏后，用橡皮刮从培养板上刮下细胞，与100μl培养基混合，并涂于含有潮霉素的培养板(200μg/ml)上。在25℃下孵育7-10天后，在1100psi和
1350psi裂碟片上以及9cm和12cm距离的培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。
挑取群落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮选择。
[0532] 通过电穿孔对小球藻进行转化
[0533] 在以75μmol光子m-2sec-1进行连续光照下于回转振荡器上使原始小球藻培养物6
在朊间质培养基中生长直到其细胞密度达到2×10 个细胞/ml为止。收集细胞，用无菌蒸
8
馏水洗涤一次，并且以4×10 个细胞/ml的密度重悬于含有50mM蔗糖的tris-磷酸盐缓冲
8
液(20mMTris-HCl，pH 7.0；1mM磷酸钾)中。将约250μl的细胞悬浮液(1×10 个细胞)放在4mm间隙的一次性电穿孔小槽中。向细胞悬浮液中加入5μg线性化pHyg质粒DNA和
200μg载体DNA(已剪切的鲑精DNA)。然后将电穿孔小槽在水浴槽中于16℃下孵育10分钟。然后使用基因脉冲器II(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)电穿孔装置以25μF的电容(对于电穿孔不使用分流电阻器)向小槽施加电脉冲(1100V/cm)。然后将小槽在室温下孵育5分钟，之后将细胞悬浮液转移至50ml朊间质培养基中，并且在回转振荡器上振荡2天。复苏后，通过低速离心收集细胞，重悬于朊间质培养基中，并且以低密度接种在补充有200μg/-2 -1
ml潮霉素的培养板上。在以75μmol光子m sec 进行连续光照下孵育培养板。转化体在
1周-2周内作为群落出现。挑取群落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮选择。
在朊间质培养基中生长直到其细胞密度达到2×10 个细胞/ml为止。收集细胞，用无菌蒸
8
馏水洗涤一次，并且以4×10 个细胞/ml的密度重悬于含有50mM蔗糖的tris-磷酸盐缓冲
8
液(20mMTris-HCl，pH 7.0；1mM磷酸钾)中。将约250μl的细胞悬浮液(1×10 个细胞)放在4mm间隙的一次性电穿孔小槽中。向细胞悬浮液中加入5μg线性化pHyg质粒DNA和
200μg载体DNA(已剪切的鲑精DNA)。然后将电穿孔小槽在水浴槽中于16℃下孵育10分钟。然后使用基因脉冲器II(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)电穿孔装置以25μF的电容(对于电穿孔不使用分流电阻器)向小槽施加电脉冲(1100V/cm)。然后将小槽在室温下孵育5分钟，之后将细胞悬浮液转移至50ml朊间质培养基中，并且在回转振荡器上振荡2天。复苏后，通过低速离心收集细胞，重悬于朊间质培养基中，并且以低密度接种在补充有200μg/-2 -1
ml潮霉素的培养板上。在以75μmol光子m sec 进行连续光照下孵育培养板。转化体在
1周-2周内作为群落出现。挑取群落，并点样于选择性琼脂板上进行第二轮选择。
[0534] 基因型分析
[0535] 小体积培养经受住第二轮选择的群落子集并且收集。通过渦旋将约5μL-10μL体积的沉淀物重悬于50μL 10mM NaEDTA中，然后在100℃下孵育10。然后短暂渦旋试管并且进行音波处理10秒，然后以12,000×g离心1分钟。在50μL PCR反应中使用2μL上清液作为模板。用于基因型分析的引物是SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154。PCR条件如下：95℃，持续5分钟×1个循环；95℃，持续30秒-58℃，持续30秒-72℃，持续1分钟又30秒×35个循环；72℃，持续10分钟×1个循环。在来自基因枪方法和来自单个电穿孔群落的10个群落中的6个群落中发现预期的992bp片段。在所有泳道中均存在较低大小的非特异性条带。为了确定所扩增的992bp片段的身份，从凝胶上切下两条基因枪条带和电穿孔条带并且单个地进行测序。所有三条条带的序列对应于预期的992bp片段。(DNA分子量标准： All Purpose DNA分子量标准，目录号BN2050)。
[0536] 实施例4：用于微藻中的源自藻类的启动子和基因
[0537] A.来自原始小球藻的5′UTR和启动子序列
[0538] 使用标准技术从兼养生长的原始小球藻(UTEX 250)中产生cDNA文库。基于cDNA序列，使用Seegene的DNA步移试剂盒(Rockville，MD)在某些已知的看家基因中设计出引物以在编码区上游“步移”。所分离的序列包括肌动蛋白(SEQ ID NO：155)和延长因子-1a(EF1a)(SEQ ID NO：156)启动子/UTR(两者都含有内含子(如以小写字体所示)和外显子(斜体的大写字体)以及预测的起始位点(呈粗体))以及两个β-微管蛋白启动子/UTR元件：亚型A(SEQ ID NO：157)和亚型B(SEQ ID NO：158)。
[0539] B.来自原始小球藻的脂质生物合成酶和质体靶向序列
[0540] 从上述cDNA文库中，使用与上文所述相同的方法克隆编码在原始小球藻(UTEX250)脂质代谢中发挥功能的蛋白质的三个cDNA。在下文序列表中包括酰基ACP去饱和酶(SEQ ID NO：159和160)以及两种香叶基香叶基二磷酸合酶(SEQ ID NO：161-164)的核苷酸序列和氨基酸序列。另外，还克隆了具有靶向质体的假定性信号序列的三个cDNA。在下文序列表中包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO：165和166)、放氧复合体蛋白OEE33(SEQ ID NO：167和168)以及Clp蛋白酶(SEQ ID NO：169和170)的核苷酸序列和氨基酸序列。
在核苷酸序列和氨基酸序列中假定性质体靶向序列已加上下划线。可以使用质体靶向序列使转基因产物靶向微生物的质体，所述产物如脂质修饰酶。
在核苷酸序列和氨基酸序列中假定性质体靶向序列已加上下划线。可以使用质体靶向序列使转基因产物靶向微生物的质体，所述产物如脂质修饰酶。
[0541] 实施例5：对原始小球藻进行遗传工程改造以使其表达外源性蔗糖转化酶
[0542] 藻株和培养基：从德克萨斯大学的藻类培养物保藏中心(Austin，TX，USA)获得原始小球藻(UTEX 250)。将原种培养物维持在经过改良的朊间质培养基中。经过改良的朊间质培养基由以下组成：每升0.25g NaNO3、0.09g K2HPO4、0.175g KH2PO4 0.025g、0.025gCaCl2·2H2O、0.075g MgSO4·7H2O以及2g酵母提取物(g/L)。
[0543] 质粒构建：为了在原始小球藻中表达分泌形式的转化酶，使酿酒酵母SUC2基因处于三种不同的启动子控制下：花椰菜花叶病毒35S启动子(CMV)、小球藻病毒启动子(NC-1A)以及小球藻HUP1启动子。合成酵母SUC2基因以提供针对原始小球藻进行优化的密码子使用并且包括引导转化酶细胞外分泌所需的信号序列。在pBluescript KS+中建立各构建体，并且通过PCR扩增使用特异性引物分别将EcoRI/AscI、AscI/XhoI以及XhoI/BamHI位点引入到各启动子、转化酶基因以及CMV 3′UTR中。依序克隆经过纯化的PCR产物。
[0544] 对原始小球藻进行转化：在回转振荡器上在以75μmol光子m-2sec-1进行连续光6
照下使原始小球藻培养物在经过改良的朊间质培养基中生长直到其细胞密度达到6×10个细胞/ml为止。
照下使原始小球藻培养物在经过改良的朊间质培养基中生长直到其细胞密度达到6×10个细胞/ml为止。
[0545] 对于基因枪转化，根据制造商的方案制备S550d金载体(来自SeashellTechnology)。简言之，将线性化构建体(20μg)(BsaI)与50μl结合缓冲液以及
60μl(3mg)的S550d金载体混合，并在冰上孵育1分钟。加入沉淀缓冲液(100μl)，并将混合物在冰上再孵育1分钟。适度渦旋后，通过在微量离心管中以10,000rpm旋转10秒以使涂有DNA的颗粒沉淀。用500μl的冷100％乙醇洗涤金沉淀物一次，在微量离心管中短暂旋转使其沉淀，并用50μl冰冷乙醇重悬。短暂(1-2秒)声波处理后，立即将10μl涂有DNA的颗粒转移至载体膜上。收集细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于50μl培养基中
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(1×10 个细胞)，并且涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He基因枪颗粒递送系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1100psi和1350psi)，并将培养板放在屏/巨载体配件下面9cm-12cm处。在25℃下使细胞12小时-24小时。复苏后，用橡皮刮从培养板上刮下细胞，与100μl培养基混合，并涂于具有1％蔗糖的经过改良的朊间质培养板上。在25℃下于暗处孵育7-10天后，在培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。
60μl(3mg)的S550d金载体混合，并在冰上孵育1分钟。加入沉淀缓冲液(100μl)，并将混合物在冰上再孵育1分钟。适度渦旋后，通过在微量离心管中以10,000rpm旋转10秒以使涂有DNA的颗粒沉淀。用500μl的冷100％乙醇洗涤金沉淀物一次，在微量离心管中短暂旋转使其沉淀，并用50μl冰冷乙醇重悬。短暂(1-2秒)声波处理后，立即将10μl涂有DNA的颗粒转移至载体膜上。收集细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于50μl培养基中
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(1×10 个细胞)，并且涂于非选择性朊间质培养板的中间三分之一区域。用PDS-1000/He基因枪颗粒递送系统(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1100psi和1350psi)，并将培养板放在屏/巨载体配件下面9cm-12cm处。在25℃下使细胞12小时-24小时。复苏后，用橡皮刮从培养板上刮下细胞，与100μl培养基混合，并涂于具有1％蔗糖的经过改良的朊间质培养板上。在25℃下于暗处孵育7-10天后，在培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。
[0546] 对于用电穿孔进行转化，收集细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，并且以4×108个细胞/毫升的密度重悬于含有50mM蔗糖的Tris-磷酸盐缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.0；1mM8
磷酸钾)中。将约250μl的细胞悬浮液(1×10 个细胞)放在4mm间隙的一次性电穿孔小槽中。向细胞悬浮液中加入5μg线性化质粒DNA和200μg载体DNA(已剪切的鲑精DNA)。
然后将电穿孔小槽在冰水浴槽中于16℃下孵育10分钟。然后使用基因脉冲器II(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)电穿孔装置以25μF的电容(对于电穿孔不使用分流电阻器)向小槽施加电脉冲(1100V/cm)。然后将小槽在室温下孵育5分钟，之后将细胞悬浮液转移至50ml经过改良的朊间质培养基中，并且在回转振荡器上振荡2天。复苏后，以低速(4000rpm)收集细胞，重悬于经过改良的朊间质培养基中，并且以低密度接种在具有1％蔗糖的经过改良的朊间质培养板上。在25℃下于暗处孵育7-10天后，在培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。
磷酸钾)中。将约250μl的细胞悬浮液(1×10 个细胞)放在4mm间隙的一次性电穿孔小槽中。向细胞悬浮液中加入5μg线性化质粒DNA和200μg载体DNA(已剪切的鲑精DNA)。
然后将电穿孔小槽在冰水浴槽中于16℃下孵育10分钟。然后使用基因脉冲器II(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)电穿孔装置以25μF的电容(对于电穿孔不使用分流电阻器)向小槽施加电脉冲(1100V/cm)。然后将小槽在室温下孵育5分钟，之后将细胞悬浮液转移至50ml经过改良的朊间质培养基中，并且在回转振荡器上振荡2天。复苏后，以低速(4000rpm)收集细胞，重悬于经过改良的朊间质培养基中，并且以低密度接种在具有1％蔗糖的经过改良的朊间质培养板上。在25℃下于暗处孵育7-10天后，在培养板上可以看到代表经过转化的细胞的群落。
[0547] 筛选转化体以及基因型分析：从暗处生长的具有1％蔗糖的经改良的朊间质培养板上挑取群落，并且将大约相同量的细胞转移至含有1ml具有1％蔗糖的经过改良的朊间质液体培养基的24孔培养板中。将培养物保持在暗处并且通过回转式振荡器(Labnet，Berkshire，UK)以430rpm振荡5天。
[0548] 为了证实引入小球藻转化体中的转化酶基因的存在，分离出各转化体的DNA并且用一组基因特异性引物进行扩增(CMV构建体：正向引物(CAACCACGTCTTCAAAGCAA)(SEQ ID NO：153)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：171)；CV构建体：正向引物(TTGTCGGAATGTCATATCAA)(SEQ ID NO：172)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：171)；以及HUP1构建体：正向引物(AACGCCTTTGTACAACTGCA)(SEQ ID NO：173)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：171))。对于快速DNA分离，将一定体积的细胞(体积约5-10μL)重悬于50μL 10mMNa-EDTA中。在100℃下孵育细胞悬浮液10分钟并且音波处理10秒。以12000g离心1分钟后，使用3μL上清液进行PCR反应。在DNA热循环器(Perkin-Elmer GeneAmp 9600)中进行PCR扩增。根据制造商的说明书，反应混合物(50μL)含有3μL经过提取的DNA、100pmol各上述相应引物、200μM dNTP、0.5单位Taq DNA聚合酶(NEB)以及Taq DNA聚合酶缓冲液。在95℃下使DNA变性5分钟，持续第一个循环，然后持续30秒。分别在58℃下(30秒)和在72℃下(1分钟)进行引物退火和延长反应。然后使PCR产物在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上显现。
[0549] 在液体培养物中生长：在暗处生长五天后，基因型阳性的转化体可以在暗处利用极小量的液体朊间质培养基+1％蔗糖生长，而野生型细胞在暗处于相同培养基中不能生长。
[0550] 实施例6：用源自于酿酒酵母的分泌型转化酶转化藻类藻株
[0551] 分泌型转化酶：将编码分泌型蔗糖转化酶的基因(基因库登录号NP_012104，来自于酿酒酵母)重新合成为1599bp Asc I-Xho片段，随后将所述片段亚克隆至具有花椰菜花叶病毒35s启动子和3′UTR(分别为EcoR I/Asc I和Xho/Sac I盒)的pUC19衍生物中。
[0552] 藻类细胞的生长：这些实验中所使用的培养基是液体基础培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mMMgSO4·7H2O、0.4mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)以及含有呈蔗糖或葡萄糖(如所指定)形式的最终浓度是1％的固定碳的固体基础培养基(+1.5％琼脂糖)。这个实验中所使用的藻株在暗处在不存在另外的固定碳源的情况下不能利用基础培养基生长。将物种划线接种于培养板上，并且使其在暗处于
28℃下生长。挑取单个群落并且用于接种500mL含有1％葡萄糖的液体基础培养基，并且使其在暗处生长直到对数生长中期为止，每天测量细胞计数。先前已经针对在暗处利用蔗糖作为仅有碳源的生长对下列各藻株进行测试并且这些藻株均不能生长，而因此被挑选出以用于用分泌型转化酶进行转化：(1)原始小球藻(UTEX 31)；(2)极微小球藻(UTEX 2341)；
以及(3)浮水小球藻(CCAP 211/15)。
28℃下生长。挑取单个群落并且用于接种500mL含有1％葡萄糖的液体基础培养基，并且使其在暗处生长直到对数生长中期为止，每天测量细胞计数。先前已经针对在暗处利用蔗糖作为仅有碳源的生长对下列各藻株进行测试并且这些藻株均不能生长，而因此被挑选出以用于用分泌型转化酶进行转化：(1)原始小球藻(UTEX 31)；(2)极微小球藻(UTEX 2341)；
以及(3)浮水小球藻(CCAP 211/15)。
[0553] 通过粒子轰击对藻类细胞进行转化：将足够的培养物离心以得到总共约1-5×108个细胞。用没有加入固定碳源的基础培养基洗涤所得到的沉淀物。再将细胞离心并且将7 8
沉淀物重悬于足以达到5×10 个至2×10 个细胞/毫升的体积的基础培养基中。然后将
250-1000μl细胞接种在补充有1％蔗糖的固体基础培养基上并且使其在培养板上于无菌罩中干燥。根据制造商的建议(Seashell Technology，La Jolla，CA)使质粒DNA沉淀于金粒子上。使用BioRad PDS He-1000粒子递送系统，利用1350psi的裂碟片，在将巨载体配件相距裂碟片固定器的距离设定在9cm的情况下进行转化。转化后，在暗处于28℃下孵育培养板。所有藻株均产生多个转化体群落。在无转化酶插入的情况下进行转化，但以相同方式另外制备的对照培养板不含群落。
沉淀物重悬于足以达到5×10 个至2×10 个细胞/毫升的体积的基础培养基中。然后将
250-1000μl细胞接种在补充有1％蔗糖的固体基础培养基上并且使其在培养板上于无菌罩中干燥。根据制造商的建议(Seashell Technology，La Jolla，CA)使质粒DNA沉淀于金粒子上。使用BioRad PDS He-1000粒子递送系统，利用1350psi的裂碟片，在将巨载体配件相距裂碟片固定器的距离设定在9cm的情况下进行转化。转化后，在暗处于28℃下孵育培养板。所有藻株均产生多个转化体群落。在无转化酶插入的情况下进行转化，但以相同方式另外制备的对照培养板不含群落。
[0554] 对原始小球藻转化体的分析：如下从原始小球藻野生型细胞和转化体群落中提取基因组DNA：将细胞重悬于100μl提取缓冲液(87.5mM Tris Cl(pH 8.0)、50mM NaCl、5mM EDTA(pH 8.0)、0.25％SDS)中并且在60℃下孵育，其中偶尔通过颠倒进行混合，持续30分钟。对于PCR，在20mM Tris Cl(pH 8.0)中1∶100稀释样品。
[0555] 对从WT、转化体以及质粒DNA提取的基因组DNA进行基因型分析。针对标记基因对样品进行基因型分析。在这个基因型分析PCR中使用引物2383(5′CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC3′)(SEQ ID NO：174)和2279(5′CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3′)(SEQ ID NO：175)。所用的PCR型态如下：94℃变性，持续5分钟；35个循环，94℃-30秒、60℃-30秒、72℃-3分钟；72℃-5分钟。从阳性对照(质粒)和两种原始小球藻(UTEX
31)转化体中扩增出大小相同的条带。
31)转化体中扩增出大小相同的条带。
[0556] 对极微小球藻和浮水小球藻转化体的分析：如下从小球藻野生型细胞和转化体中提取基因组DNA：将细胞重悬于100μl提取缓冲液(87.5mM Tris Cl(pH 8.0)、50mM NaCl、5mM EDTA(pH 8.0)、0.25％SDS)中并且在60℃下孵育，其中偶尔通过颠倒进行混合，持续
30分钟。对于PCR，在20mM Tris Cl(pH 8.0)中1∶100稀释样品。对从WT、转化体以及质粒DNA提取的基因组DNA进行基因型分析。针对标记基因对样品进行基因型分析。引物2336(5′GTGGCCATATGGACTTACAA 3′)(SEQ ID NO：176)和2279(5′CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3′)(SEQ ID NO：175)为指定的引物组2(1215bp的预期产物)，而引物
2465(5′CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG3′)(SEQ ID NO：177)和2470(5′CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3′)(SEQ ID NO：178)是指定的引物组4(1442bp的预期产物)。所用的PCR型态如下：94℃变性，持续2分钟；29个循环，94℃-30秒、
60℃-30秒、72℃-1分钟又30秒；72℃-5分钟。含有分泌型转化酶的质粒对照被用作PCR对照。
30分钟。对于PCR，在20mM Tris Cl(pH 8.0)中1∶100稀释样品。对从WT、转化体以及质粒DNA提取的基因组DNA进行基因型分析。针对标记基因对样品进行基因型分析。引物2336(5′GTGGCCATATGGACTTACAA 3′)(SEQ ID NO：176)和2279(5′CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3′)(SEQ ID NO：175)为指定的引物组2(1215bp的预期产物)，而引物
2465(5′CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG3′)(SEQ ID NO：177)和2470(5′CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3′)(SEQ ID NO：178)是指定的引物组4(1442bp的预期产物)。所用的PCR型态如下：94℃变性，持续2分钟；29个循环，94℃-30秒、
60℃-30秒、72℃-1分钟又30秒；72℃-5分钟。含有分泌型转化酶的质粒对照被用作PCR对照。
[0557] 转化酶构建体的序列对应于SEQ ID NO：8。
[0558] 实施例7：原藻属物种中的同源重组
[0559] 转基因的同源重组具有多种优势。首先，不利用同源重组而将转基因引入是不可预测的，因为不能控制引入细胞中的质粒拷贝的数目。此外，不利用同源重组而将转基因引入是不稳定的，因为质粒可能保持游离状态并在随后细胞分裂过程中丢失。同源重组的另一个优势是能够“敲除”靶基因，引入表位标签，转变内源性基因的启动子以及另外改变靶基因(例如引入点突变)。
[0560] 利用命名为KE858的桑椹形原藻(UTEX 1435)基因组的特定区域来构建两个载体。KE858是一个1.3kb基因组片段，它包含与蛋白质的转移RNA(tRNA)家族共有同源性的蛋白质编码区的一部分。DNA印迹法已展示KE858序列在桑椹形原藻(UTEX 1435)基因组中存在单个拷贝。构建第一种类型的载体，将其命名为SZ725(SEQ ID NO：179)，其由整个1.3kb KE858片段克隆到pUC19载体骨架中组成，所述pUC19载体骨架还含有经过优化的酵母转化酶(suc2)基因。KE858片段含有独特的SnaB1位点，该位点不存在于靶向构建体中的任何位置上。构建第二种类型的载体，将其命名为SZ726(SEQ IDNO：180)，其由通过在KE858基因组序列内的SnaB1位点处插入酵母转化酶基因(suc2)而受到破坏的KE858序列组成。可以通过用在KE858区域两端进行切割的EcoRI消化，从载体骨架中将含有侧接酵母转化酶基因的KE858序列的整个DNA片段切除。
[0561] 使用这两个载体将酵母转化酶基因(suc2)直接同源重组到桑椹形原藻(UTEX1435)基因组相应的KE858区域中。通过用SnaB1消化载体构建体SZ725以及用EcoRI消化载体构建体SZ726使与同源重组所靶向的基因组区域同源的线性DNA末端重组。然后利用上述方法将经过消化的载体构建体引入到桑椹形原藻培养物中。然后利用蔗糖培养板对各载体构建体的转化体进行选择。对由各载体转化产生的10个单独的、纯克隆性转化体进行关于酵母转化酶基因成功重组到所需基因组位置的分析(利用DNA印迹法)和关于转基因稳定性的分析。
[0562] 对SZ725转化体进行的DNA印迹分析显示，所挑选的用于分析的10个转化体中有4个转化体含有预测的重组条带，表明载体中的KE858序列与基因组中的KE858序列之间发生单次交换事件。相反，所有10个SZ726转化体均含有预测的重组条带，表明带有侧接酵母转化酶转基因的KE858序列的pSZ726的EcoRI片段与基因组中相应的KE858区域之间发生双重交换事件。
[0563] 通过使转化体在不进行选择的情况下生长超过15代，对蔗糖转化酶的表达和转基因的稳定性进行评估。选择通过DNA印迹法显示转基因阳性的4个SZ725转化体和10个SZ276转化体，并使各转化体的48个单个群落连续生长：首先在不进行选择的情况下在含有葡萄糖的培养基中生长，然后在进行选择的情况下在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长。所有10个SZ276转化体(100％)在15代后均保持其利用蔗糖生长的能力，而约97％的SZ725转化体在15代后保持其利用蔗糖生长的能力。通过双重交换事件引入的转基因(SZ726载体)在传代中具有极高的稳定性。相反，通过单次交换事件引入的转基因(SZ725载体)在传代中显示一定的不稳定性，因为所引入的是转基因的串联拷贝，侧接转基因的重复同源区域可能发生重组并切除位于其之间的转基因DNA。
[0564] 这些实验表明，成功地利用同源重组制备了含有稳定整合到有机体核染色体中的异源蔗糖转化酶基因的原藻转化体。成功进行同源重组使得能够在原藻中发生其它基因组变化，包括基因缺失、点突变以及使所需基因产物带有表位标签。这些实验还首次公开了在真核微藻核基因组中进行同源重组的系统。
[0565] 利用同源重组敲除内源性桑椹形原藻基因：在桑椹形原藻cDNA/基因组筛选中(如上文在实施例4中所述的筛选)，鉴定出了内源性硬脂酰基-ACP去饱和酶(SAPD)cDNA。硬脂酰基-ACP去饱和酶是脂质合成通路的一部分，而且它们的功能是将双键引入到脂肪酰基链中。在一些情况下，为了改变脂肪酸型态，敲除脂质通路酶或减少其表达是有利的。
制备同源重组构建体，以评估内源性硬脂酰基-ACP去饱和酶的表达是否减少(或敲除)以及是否可以观测到宿主细胞脂质型态中的不饱和脂肪酸相应减少。鉴定出桑椹形原藻(UTEX 1435)中的硬脂酰基-ACP去饱和酶基因的约1.5kb编码序列并对其进行克隆(SEQID NO：181)。用5′端上0.5kb的SAPD编码序列(5′端靶向位点)构建同源重组构建体，所述SAPD编码序列后面是莱茵衣藻β-微管蛋白启动子，所述启动子驱动含有普通小球藻
3′UTR的经过密码子优化的酵母蔗糖转化酶suc2基因。然后将余下的(约1kb)桑椹形原藻SAPD编码序列插入到普通小球藻3′UTR后面，以产生3′端靶向位点。这种同源重组盒的序列列于SEQ ID NO：182中。如上所示，可以通过在转化微藻之前使同源重组盒线性化从而使末端暴露来增加同源重组盒整合到核基因组中的成功率。使靶向桑椹形原藻中内源性SAPD酶的同源重组盒线性化，然后转化到宿主细胞(桑椹形原藻，UTEX 1435)中。成功的整合能够通过双重交互重组事件从宿主基因组中去除内源性SAPD酶编码区，而新插入的suc2基因的表达会受莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的调节。利用含有蔗糖作为唯一碳源的培养板/培养基对所得到的克隆进行筛选。同源重组盒成功整合的克隆能够利用蔗糖作为唯一碳源生长，并且将脂质型态中脂肪酸总体饱和度的变化作为次要确定因素。此外，还可以通过DNA印迹测定(利用酵母蔗糖转化酶suc2基因特异性探针)和RT-PCR确定阳性克隆中转化酶基因的存在和表达。或者，可以使用不含β-微管蛋白启动子的相同构建体来切除内源性SAPD酶的编码区。在这种情况下，新插入的酵母蔗糖转化酶suc2基因会受内源性SAPD启动子/5′UTR调节。
制备同源重组构建体，以评估内源性硬脂酰基-ACP去饱和酶的表达是否减少(或敲除)以及是否可以观测到宿主细胞脂质型态中的不饱和脂肪酸相应减少。鉴定出桑椹形原藻(UTEX 1435)中的硬脂酰基-ACP去饱和酶基因的约1.5kb编码序列并对其进行克隆(SEQID NO：181)。用5′端上0.5kb的SAPD编码序列(5′端靶向位点)构建同源重组构建体，所述SAPD编码序列后面是莱茵衣藻β-微管蛋白启动子，所述启动子驱动含有普通小球藻
3′UTR的经过密码子优化的酵母蔗糖转化酶suc2基因。然后将余下的(约1kb)桑椹形原藻SAPD编码序列插入到普通小球藻3′UTR后面，以产生3′端靶向位点。这种同源重组盒的序列列于SEQ ID NO：182中。如上所示，可以通过在转化微藻之前使同源重组盒线性化从而使末端暴露来增加同源重组盒整合到核基因组中的成功率。使靶向桑椹形原藻中内源性SAPD酶的同源重组盒线性化，然后转化到宿主细胞(桑椹形原藻，UTEX 1435)中。成功的整合能够通过双重交互重组事件从宿主基因组中去除内源性SAPD酶编码区，而新插入的suc2基因的表达会受莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的调节。利用含有蔗糖作为唯一碳源的培养板/培养基对所得到的克隆进行筛选。同源重组盒成功整合的克隆能够利用蔗糖作为唯一碳源生长，并且将脂质型态中脂肪酸总体饱和度的变化作为次要确定因素。此外，还可以通过DNA印迹测定(利用酵母蔗糖转化酶suc2基因特异性探针)和RT-PCR确定阳性克隆中转化酶基因的存在和表达。或者，可以使用不含β-微管蛋白启动子的相同构建体来切除内源性SAPD酶的编码区。在这种情况下，新插入的酵母蔗糖转化酶suc2基因会受内源性SAPD启动子/5′UTR调节。
[0566] 实施例8：各种硫酯酶在原藻中的表达
[0567] 使异源性硫酯酶基因在原藻属物种中表达的方法和影响先前已描述于PCT申请第PCT/US2009/66142号中，所述申请在此以引用的方式并入本文。进一步研究来自高等植物物种的其它硫酯酶基因/基因产物的影响。这些硫酯酶包括来自下列高等植物的硫酯酶：
[0568]
[0569]
[0570] 在所有情况下，使用基因枪粒子轰击将上述各硫酯酶构建体转化至桑椹形原藻(UTEX 1435)中。包括如PCT申请第PCT/US2009/66142号中所公开的同源重组在内的其它转化方法也适用于目标基因的异源性表达。使用实施例2中所述的方法用上述各硫酯酶构建体对桑椹形原藻(UTEX 1435)进行转化。各构建体含有NeoR基因并且使用100μg/ml G418对阳性克隆进行选择。所有编码区经过密码子优化以反映桑椹形原藻UTEX 1435(参见表2)核基因所固有的密码子偏倚性。所用的构建体的氨基酸序列和cDNA序列列于序列识别号表中。各高等植物硫酯酶的转运肽被替换成桑椹形原藻δ-12脂肪酸去饱和酶(SEQID NO：48)或原始小球藻硬脂酰基-ACP去饱和酶(SEQ ID NO：49)的经过密码子优化的藻类转运肽。所有硫酯酶构建体由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR驱动。将所选择的阳性克隆的生长和脂质生产与野生型(未经过转化)的桑椹形原藻(UTEX 1435)相比较。使野生型和所选择的阳性克隆生长于2％葡萄糖G418培养板上。对各构建体的所选择的阳性克隆进行的脂质型态分析概述于下表15中(以面积％表示)。
[0571] 表15.表达各种异源性硫酯酶的桑椹形原藻的脂质型态。
[0572]
[0573] 结果显示，所表达的所有硫酯酶均在一定程度上影响脂肪酸型态。看到“总饱和物质”一行，饱和度显著地受到多种硫酯酶的表达的影响，所述硫酯酶包括来自加州月桂、樟树以及美国榆(影响最显著)的硫酯酶。总饱和物质的百分比方面的这些变化是出乎意外的，来自高等植物的硫酯酶的异源性表达显然并不仅仅影响脂质链长；它还可以影响由微藻产生的脂质型态的其它属性，即脂肪酸的饱和度。
[0574] 使所选择的用湿地萼距花C8硫酯酶、细叶萼距花硫酯酶、加州月桂和樟树硫酯酶转化的克隆在不同量的G418(25mg/L至50mg/L)中以及在不同温度(22℃至25℃)下进一步生长并且测定这些克隆的脂质型态。表16总结了含有各硫酯酶的代表性克隆的脂质型态(以面积％表示)。构建含有美国榆硫酯酶的第二构建体并且使用上述基因枪法将其转化到桑椹形原藻(UTEX 1435)中。通过同源重组将这种第二构建体引入到细胞中。在原藻属物种中进行同源重组的方法先前已描述于PCT申请第PCT/US2009/66142号中。所用的同源DNA来自于桑椹形原藻UTEX 1435中6S rRNA的基因组DNA序列。选择因素是使用由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动的来自酿酒酵母的经过密码子优化的suc2基因而能够利用蔗糖生长的能力。原生美国榆转运肽由原始小球藻(UTEX 250)硬脂酰基-ACP去饱和酶转运肽替换。这种构建体的cDNA在序列表中列为SEQ ID NO：50。在2％蔗糖培养板上对阳性克隆进行选择，并且也使所得到的用于进行脂质型态测定的培养物生长于含有2％蔗糖的培养基中。这种含有经过同源重组的异源性美国榆硫酯酶的桑椹形原藻藻株的代表性脂质型态总结于表16中。
[0575] 表16.含有异源性硫酯酶基因的桑椹形原藻藻株的脂质型态。
[0576]
[0577] 如同上述克隆的情况一样，与野生型(未经过转化)桑椹形原藻相比，含有异源性硫酯酶基因的所有转化体显示出脂肪酸型态受到一定程度的影响，并且饱和脂肪酸的总百分比也发生改变。含有通过同源重组引入的美国榆硫酯酶的桑椹形原藻的总饱和物质含量增加的程度最大。
[0578] 另外，评估含有外源性细叶萼距花、樟树、加州月桂或美国榆硫酯酶的转基因克隆的新型脂质型态。含有细叶萼距花硫酯酶的克隆在2％葡萄糖、25mg/ml G418中于22℃下生长时获得下列脂质型态：C8:0占5.10％；C10:0占18.28％；C12:0占0.41％；C14:0占1.76％；C16:0占16.31％；C18:0占1.40％；C18:1占40.49％；以及C18:2占13.16％。含有樟树硫酯酶的克隆(还含有外源性蔗糖转化酶)在2％蔗糖中于25℃下生长时获得下列脂质型态：C10:0占0.04％；C12:0占6.01％；C14:0占35.98％；C16:0占19.42％；C18:0占
1.48％；C18:1占25.44％；以及C18:2占9.34％。含有加州月桂硫酯酶的克隆在2％葡萄糖、25-100mg/ml G418中于22℃下生长时获得下列脂质型态：C8:0占0％；C10:0占0.11％；
C12:0占34.01％；C14:0占5.75％；C16:0占14.02％；C18:0占1.10％；C18:1占28.93％；
以及C18:2占13.01％。含有美国榆硫酯酶的克隆在2％葡萄糖中于28℃下生长时获得下列脂质型态：C10:0占1.54％；C12:0占0.43％；C14:0占7.56％；C16:0占39.45％；C18:0占2.49％；C18:1占38.49％；以及C18:2占7.88％。
1.48％；C18:1占25.44％；以及C18:2占9.34％。含有加州月桂硫酯酶的克隆在2％葡萄糖、25-100mg/ml G418中于22℃下生长时获得下列脂质型态：C8:0占0％；C10:0占0.11％；
C12:0占34.01％；C14:0占5.75％；C16:0占14.02％；C18:0占1.10％；C18:1占28.93％；
以及C18:2占13.01％。含有美国榆硫酯酶的克隆在2％葡萄糖中于28℃下生长时获得下列脂质型态：C10:0占1.54％；C12:0占0.43％；C14:0占7.56％；C16:0占39.45％；C18:0占2.49％；C18:1占38.49％；以及C18:2占7.88％。
[0579] 实施例9：用多种外源性异源硫酯酶基因对原藻进行转化
[0580] 使用上文公开的方法转化微藻藻株桑椹形原藻(UTEX 1435)以使多种硫酯酶在单个克隆中表达。使多种硫酯酶在单个克隆中表达使得微藻能够产生脂肪酸型态与在使任何单个硫酯酶单独表达时所阐述的脂肪酸型态(如前述实施例中所表明)完全不同的油类。首先利用同源重组用樟树硫酯酶(C14优先型硫酯酶)以及蔗糖转化酶基因(来自酿酒酵母的suc2)(选择因素是利用蔗糖生长的能力)转化桑椹形原藻(UTEX 1435)。用于这种同源重组构建体的DNA来自于如上述第III部分中所述的桑椹形原藻基因组DNA的KE858区域。这种构建体的相关部分在序列表中列为SEQ ID NO：51。在含有蔗糖的培养板上筛选阳性克隆。然后用以下三种盒中的一种再转化阳性克隆，各盒编码针对抗生素G418的抗性以及另外的硫酯酶：(1)来自细叶萼距花的硫酯酶基因(C8-10优先型)，SEQ ID NO：52；(2)来自加州月桂的硫酯酶基因(C12优先型)，SEQ ID NO：53；或来自美国榆的硫酯酶(广泛；C10-C16优先型)，SEQ ID NO：54。序列表中包括各构建体的相关部分的序列。在含有蔗糖及50μg/ml G418的培养基中筛选表达两种硫酯酶基因的克隆。选择阳性克隆并且测定生长和脂质型态。表17总结了代表性阳性克隆的脂质型态(以面积％表示)。
[0581] 表17.用多种硫酯酶转化的桑椹形原藻的脂质型态。
[0582]
[0583] 另外，在22℃下使具有樟树和加州月桂硫酯酶的双重硫酯酶克隆生长于含有2％蔗糖以及50mg/L G418的培养基中。在这些生长条件下由这种藻株获得的脂肪酸型态是：C8:0(0)；C10:0(0.10)；C12:0(31.03)；C14:0(7.47)；C16:0(15.20)；C18:0(0.90)；C18:1(30.60)；C18:2(12.44)；以及C18:3α(1.38)，其中总饱和物质是54.7。
[0584] 用含有樟树硫酯酶的两种同源重组构建体(一种靶向6S区域而另一种靶向KE858区域)产生双重硫酯酶克隆。阳性代表性克隆具有如下的脂肪酸型态：C8:0占0％；C10:0占0.06％；C12:0占5.91％；C14:0占43.27％；C16:0占19.63％；C18:0占0.87％；C18:1占13.96％；以及C18:2占13.78％，其中总饱和物质占69.74％。这种克隆的C12-C14水平超过49％，是野生型细胞中C12-C14水平的37倍以上。
[0585] 上述数据显示，多种硫酯酶可以成功地共表达于微藻中。多种硫酯酶共表达会使得脂肪酸型态发生改变而不仅与野生型藻株显著不同，并且还与通过表达任何一种单个硫酯酶所获得的脂肪酸型态显著不同。使多种具有重叠的链长特异性的硫酯酶表达可以使那些特异性脂肪酸累积增加。
[0586] 使异源性硫酯酶(单独或组合)在桑椹形原藻中表达不仅会改变宿主藻株的脂肪酸/脂质型态，而且当与目前可以从多种种子作物中获得的油类(表5)相比时，这些型态是属于没有在其它现用系统中发现的事实上独特的油类所特有的。转基因藻株不仅与未经过转化的野生型藻株存在显著差异，它们还与表5中所示的任何可商购油类具有显著不同的型态。举例来说，椰子油和棕榈仁油的C8-C10脂肪酸水平在5.5％-17％范围内。表达湿地萼距花C8优先型硫酯酶或细叶萼距花C10优先型硫酯酶的转基因藻株分别积聚了3.66％至8.65％。这些C8-C10脂肪酸水平类似于椰子油和棕榈仁油，然而，转基因藻类藻株没有显著较高的C12:0脂肪酸，而且它们具有非常高的C16:0(转基因油类中的23％分别相比于椰子油或棕榈仁油中的11％-16％)和/或18:1(转基因油类中的50％-57％分别相比于椰子油或棕榈仁油中的8％-19％)。
[0587] 实施例10：鉴定内源性氮依赖性原藻启动子
[0588] A.鉴定和表征内源性氮依赖性启动子。
[0589] 利用标准技术从桑椹形原藻(UTEX 1435)中制备cDNA文库。使桑椹形原藻细胞在氮充足的条件下生长48小时。然后将5％接种物(v/v)转移至低氮中，并在7天内每24小时收集细胞。培养约24小时后，使培养基中的氮供应完全被消耗。利用干冰和异丙醇将所收集的样品立即冷冻。随后从冷冻的细胞沉淀物样品中分离总RNA，并保留各样品的一部分总RNA以用于RT-PCR研究。对从样品中获得的总RNA的余下部分进行多聚腺苷酸选择。然后汇集各种条件中等摩尔量的经过多聚腺苷酸选择的RNA，并用于在载体pcDNA3.0(Invitrogen)中制备cDNA文库。从所得到的汇集的cDNA文库中随机挑选约1200个克隆，并进行双向测序。从这些1200个序列中选择约68个不同的cDNA，并用于设计实时RT-PCR研究中使用的cDNA特异性引物。
[0590] 从细胞沉淀物样品中分离的备用RNA在利用上文制备的cDNA特异性引物组的实时RT-PCR研究中用作底物。将该备用RNA转化成cDNA，并用作RT-PCR中68个基因特异性引物组各自的底物。利用循环阈值或CT数值表示时程内所收集的各RNA样品中68个cDNA中各cDNA的相对转录丰度。将在氮充足和氮缺乏条件之间显示显著增加(大于3倍)的cDNA作为其表达被氮缺乏上调的潜在基因。如本说明书中所论述，氮缺乏/限制是产油微生物中脂肪生成的已知诱导因素。
[0591] 为了鉴定氮缺乏/限制时表达被上调的cDNA中的假定性启动子/5′UTR序列，从在氮充足条件下生长的桑椹形原藻(UTEX 1435)中分离总DNA，然后利用454测序技术(Roche)进行测序。利用BLAST将上面RT-PCR结果中被上调的cDNA与454基因组测序读数产生的组装重叠群相对比。将cDNA的5′末端定位至特定的重叠群，并且如果可能，那么利用大于500bp的5′侧翼DNA假定性鉴定启动子/UTR。随后通过对基因组DNA进行PCR扩增证实启动子/5′UTR的存在并且进行克隆。利用单个cDNA的5′末端设计3′端引物，并利用454重叠群组装的5′末端设计5′端基因特异性引物。
[0592] 作为第一次筛选，将一个假定性启动子即从Aat2(铵转运蛋白，SEQ ID NO：63)中分离的5′UTR/启动子克隆到具有原始小球藻硬脂酰基-ACP去饱和酶转运肽的樟树C14硫酯酶构建体中，替代耐热性小球藻谷氨酸脱氢酶启动子。该构建体被列为SEQ ID NO：81。为了测试该假定性启动子，将硫酯酶构建体转化到桑椹形原藻细胞中以通过利用上述方法针对在低/无氮条件下C14/C12脂肪酸增加进行筛选来证实实际启动子活性。可以利用相同方法对从cDNA/基因组筛选中分离出的假定性氮调节型启动子进行类似测试。
[0593] 从cDNA/基因组筛选中分离出的其它假定性氮调节型启动子/5′UTR是：
[0594]
[0595]
[0596] 增加倍数是指在低氮培养基中培养24小时后cDNA丰度的增加倍数。
[0597] 为了进一步了解这些假定性启动子/5′UTR的潜在调节，选择八个序列进行进一步测试：(1)FatB/A；(2)SulfRed亚硫酸盐还原酶；(3)SugT糖转运蛋白；(4)Amt02-铵转运蛋白02；(5)Aat01-氨基酸转运蛋白01；(6)Aat03-氨基酸转运蛋白03；(7)Aat04-氨基酸转运蛋白04；以及(8)Aat05-氨基酸转运蛋白05。利用Illumina测序读数对从各个时间点的桑椹形原藻细胞分离出的RNA进行高分辨率转录组分析：T0(种子细胞)；在从种子细胞进行接种后第20小时；第32小时；第48小时；第62小时；以及第114小时。在T0(种子细胞)时培养基中的氮是充足的，而当第20小时以及更长时间的时候，培养基几乎不含至不含氮。然后独立地用先前鉴定的八个转录物中的各转录物对由各时间点分离的RNA产生的经过组装的转录物重叠群进行序列局部比对(blast)。结果总结于下表18中。
[0598] 表18.八个假定性启动子/5′UTR的转录组表达型态。
[0599]
[0600] 从上文总结的结果，多种转录物显示出随时间推移累积增加，但有趣的是，亚硫酸盐还原酶mRNA显示出独特的随时间推移mRNA累积减少。
[0601] 将这八个假定性启动子/5′UTR区克隆于原生转运肽被去掉而用原始小球藻(UTEX 250)硬脂酰基-ACP去饱和酶的转运肽置换的樟树硫酯酶编码区上游。通过同源重组利用6S rRNA的基因组序列的DNA将各假定性启动子/5′UTR区构建体引入到桑椹形原藻UTEX1435中。构建体内还含有来自酿酒酵母的suc2蔗糖转化酶基因以在含有蔗糖的培养基/培养板上选择阳性克隆。Aat01的构建体的相关部分的cDNA序列在序列表中列为SEQ ID NO：67。对于其它构建体，使用相同骨架，唯一可变的是假定性启动子/5′UTR序列。制备另一对照转基因藻株，其中使用莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动樟树硫酯酶基因表达。已显示，这个启动子驱动目标基因进行组成型表达，并且因此提供了测量在由所测试的各种假定性氮调节型启动子/5′UTR驱动时相同硫酯酶信使的表达的有用对照。
[0602] 在产生转基因克隆后，进行三个单独的实验。前两个实验通过利用RT-PCR测量稳定状态的硫酯酶mRNA水平、测量脂肪酸型态以及培养物上清液中的氨水平来评估所有八个假定性启动子的潜在氮可调节性。最初在28℃下于振荡(200rpm)下使克隆在富含氮的种子细胞培养基(1g/L硝酸铵-15mM氮(以氨计)、4g/L酵母提取物)中生长24小时至48小时，此时使用20OD单位(A750)接种50ml低氮培养基(0.2g/L硫酸铵-3mM氮(以氨计)、0.2g/L酵母提取物)。在6天内每24小时对细胞进行取样，并且还在即将向低氮条件转换时收集样品。然后使用各样品中的一部分细胞以利用Trizol试剂(根据制造商建议的方法)进行总RNA提取。氨测定揭示在低氮培养基中上清液中的氨水平在24小时后低于检测极限(约100μM)。
[0603] 对于实时RT-PCR，针对各时间点桑椹形原藻(UTEX 1435)中所表达的内对照RNA水平将所有RNA水平归一化。称作cd189的内对照RNA是编码N-乙酰基鸟氨酸转氨酶的ARG9基因的产物。在这些实验中用于实时RT-PCR的引物组是：
[0604]
[0605] 还获得了各时间点的各转化体的脂质型态并且与RT-PCR结果相比较。基于氨水平、RT-PCR结果以及C12-C14脂肪酸水平的改变，可以得出以下结论：氨基酸转运蛋白01(Aat-01)、氨基酸转运蛋白04(Aat-04)以及铵转运蛋白02(Amt-02)序列确实含有功能性氮可调节启动子/5′UTR。
[0606] 从RT-PCR结果中，Aat-01表现出能够驱动稳定状态的樟树硫酯酶mRNA水平达对照(莱茵衣藻β-微管蛋白启动子)的四倍的能力。mRNA水平还与氮限制以及C12-C14脂肪酸水平显著增加相关。这些结果表明与Aat-01启动子缔合的5′UTR在驱动脂质生物合成中的蛋白质合成方面可能比对照莱茵衣藻启动子有效。如同Aat-01启动子，Aat-04启动子能够驱动mRNA累积达莱茵衣藻对照启动子所驱动的mRNA累积的五倍。然而，Aat-04启动子构建体仅能够适度地影响C12-C14脂肪酸水平。这些数据表明Aat-04启动子可明显地受到氮缺乏的调节，但与启动子缔合的UTR充当翻译增强子的功能可能较差。最终，Amt-02启动子类似于Aat-01启动子，因为其能够驱动mRNA累积达对照启动子所驱动的mRNA累积的三倍。mRNA水平还与氮限制以及C12-C14脂肪酸水平显著增加相关。总之，已经证明，所有这三种启动子均受到氮调节。
[0607] B.对铵转运蛋白3(amt03)启动子进行进一步表征以及使各种硫酯酶表达。
[0608] 如上文所述，鉴定出称作铵转运蛋白02和03(amt02和amt03)的部分cDNA。连同这两个部分cDNA一起，还鉴定出称作铵转运蛋白01(amt01)的第三个部分cDNA。将部分cDNA和假定性经过转译的氨基酸序列进行比对。结果显示，amt01在这三个序列中的相关性较远，而amt02与amt03仅相差单个氨基酸。
[0609] 最初以计算机模拟方式通过将部分cDNA序列与如上文所述的Roche 454基因组DNA组装和Illumina转录组组装进行序列局部比对而产生启动子/5′UTR。鉴定出与编码amt01、amt02以及amt03的cDNA显示一致性的转录物重叠群，然而，转录物重叠群不能将三个mRNA区分开，这是因为重叠群含有所有三个mRNA所共有的序列。Roche 454基因组DNA组装针对amt02和amt03cDNA序列有命中并且含有N端蛋白质序列。进行PCR以克隆5′端侧翼区域。用于验证克隆amt02和amt03启动子/UTR的PCR引物是：
[0610] Amt03正向引物：5′-GGAGGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCA-3′(SEQ ID NO：85)[0611] Amt03反向引物：5′-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTGTG-3′(SEQ ID NO：86)[0612] Amt02正向引物：5′-GGAGGAATTCTCACCAGCGGACAAAGCACCG-3′(SEQ ID NO：87)[0613] Amt02反向引物：5′-GGAGACTAGTGGCTGCGACCGGCCTCTGG-3′(SEQ ID NO：88)[0614] 在两种情况下，5′端和3′端引物含有可用于预期克隆到表达载体中以验证这些启动子/5′UTR区的功能的限制性位点。
[0615] 在通过这种联合的计算机模拟和基于PCR的方法克隆的DNA与编码amt02(SEQ ID NO：61)和amt03(SEQ ID NO：60)的初始cDNA之间进行成对比对。这些比对的结果显示初始cDNA与经过克隆的基因组序列之间存在显著差异，表示铵转运蛋白有可能代表不同的基因家族。另外，amt03的基于联合的方法的启动子/5′UTR克隆不同于初始amt03序列，而amt02序列则是相同的。进行进一步实验以表征amt03启动子/UTR序列(SEQ ID NO：89)并且描述于下文中。
[0616] 上文所鉴定的amt03启动子/UTR序列(SEQ ID NO：89)是通过克隆这个假定性启动子/UTR序列以驱动四种不同的硫酯酶表达来测试。表达盒含有基因组的6S基因座上游和下游的同源重组序列(分别是SEQ ID NO：82和84)。表达盒还含有酿酒酵母SUC2蔗糖转化酶cDNA以能够在含有蔗糖的培养基中对阳性克隆进行选择。蔗糖转化酶表达是由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子所驱动的并且还含有普通小球藻硝酸还原酶3′UTR。然后将amt03启动子/UTR序列克隆到蔗糖转化酶盒下游，后面是以下四种硫酯酶基因中的一种硫酯酶基因的框内硫酯酶cDNA序列：(1)来自樟树的C14硫酯酶；(2)来自加州月桂的C12硫酯酶；(3)来自美国榆的C10-C16硫酯酶；或(4)来自细叶萼距花的C10硫酯酶；并且还含有普通小球藻硝酸还原酶3′UTR。C14樟树硫酯酶、C12加州月桂硫酯酶以及C10-C16美国榆硫酯酶均含有原始小球藻硬脂酰基-ACP去饱和酶的转运肽。C10细叶萼距花硫酯酶含有桑椹形原藻δ-12脂肪酸去饱和酶(FAD)的转运肽。在所有情况下，序列经过密码子优化以在桑椹形原藻中表达。上述硫酯酶构建体的序列描述于序列表中：
[0617]
[0618]
[0619] 通过对野生型桑椹形原藻细胞进行如上文在实施例2中所述的基因枪转化法来制备转基因株系并且在含有蔗糖的培养板/培养基上进行选择。然后针对脂肪酸型态改变的程度来筛选阳性株系。然后对分别使用上述四种构建体中每一种进行转化而产生的四种株系进行另外的分析。株系76表达樟树C14硫酯酶，株系37表达加州月桂C12硫酯酶，株系60表达美国榆C10-C16硫酯酶，并且株系56表达细叶萼距花C10硫酯酶。使各株系在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长48小时并且在第14小时、第24小时、第36小时以及第48小时取出细胞样品(种子细胞培养)以通过GC-FID(上述)经由将脂肪酸直接酯基转移形成脂肪酸甲酯来测定脂肪酸型态以及进行后续的分析并且分离总RNA。在48小时结束时，使用这些细胞接种维持在pH 5.0(柠檬酸盐缓冲，0.05M最终浓度)或pH 7.0(HEPES缓冲，0.1M最终浓度)的不含氮或含有低水平氮的培养物(含有蔗糖作为唯一碳源)。在第12小时、第24小时、第72小时以及第108小时(产生脂质)取出培养物样品以进行脂肪酸型态分析以及分离总RNA。对这些培养物进行的氨测定揭示，在低氮培养基中在24小时后氨水平低于检测极限(约100μM)。
[0620] 对上述所收集的各时间点的总RNA进行对硫酯酶mRNA水平的实时RT-PCR测定并且针对内对照RNA(cd189)的水平将所有mRNA水平归一化。用于实时PCR中的引物组展示于下表19中：
[0621] 表19.用于实时PCR的引物组。
[0622]
[0623]
[0624] 种子细胞培养阶段中各时间点的脂肪酸型态的结果显示，硫酯酶几乎没有产生影响。随着脂质产生阶段开始，脂肪酸型态受到显著影响，其中与维持于pH 5.0下的培养物相比，维持于pH 7.0下的培养物的脂质增加程度要显著得多。虽然pH 7.0与pH 5.0之间在目标脂肪酸累积方面的差异的量值随所测试的各硫酯酶而变化，但总体影响是相同的：即在pH 5.0下生长的细胞中所积聚的目标脂肪酸的水平显著较低，但多于对照野生型细胞。
[0625] 对从这些相同样品中分离出的RNA进行的分析在培养物pH值对各硫酯酶的稳定状态的mRNA水平存在明显影响方面与脂肪酸型态数据极为相关。将脂肪酸累积数据与mRNA数据联系在一起，在转录水平、mRNA稳定性或这两者方面明显地介导了pH值对由amt03启动子/UTR驱动的硫酯酶基因表达的调节作用。另外，观测到稳定状态加州月桂mRNA水平低于稳定状态细叶萼距花mRNA水平四对数。这个观测结果与单个mRNA序列在控制表达中起作用的假设一致。这些数据表示桑椹形原藻中由amt03转运蛋白家族进行的铵吸收直接与pH值有关。
[0626] 对通过用驱动美国榆C10-C16硫酯酶表达的amt03启动子/UTR构建体对桑椹形原藻细胞进行转化而产生的十二种株系进行另外的脂肪酸型态分析。上述株系60是下列分析的一部分。下表20显示了所分析的十二种株系中的三种株系以及野生型对照的脂质型态。
[0627] 表20.含有由amt03启动子/UTR驱动的美国榆TE的转化体的脂肪酸型态。
[0628]面积％ C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 总饱和物质
野生型 0.00 0.01 0.04 1.27 27.20 3.85 58.70 7.18 32.36
株系40 2.38 20.61 3.41 28.41 29.92 1.91 8.57 3.74 86.64
株系44 1.50 20.16 4.44 31.88 26.66 1.88 6.95 5.42 86.50
株系60 0.98 14.56 3.15 27.49 31.76 2.14 12.23 6.36 80.06
野生型 0.00 0.01 0.04 1.27 27.20 3.85 58.70 7.18 32.36
株系40 2.38 20.61 3.41 28.41 29.92 1.91 8.57 3.74 86.64
株系44 1.50 20.16 4.44 31.88 26.66 1.88 6.95 5.42 86.50
株系60 0.98 14.56 3.15 27.49 31.76 2.14 12.23 6.36 80.06
[0629] 如上表中所示，与野生型相比，总饱和物质的水平显著增加，其中在株系40的情况下，与野生型相比，总饱和物质的水平增加到2.6倍以上(所分析的十二种株系中的总饱和物质在约63％至超过86％的范围内)。另外，美国榆硫酯酶在以这些水平表达时会使不饱和物质(尤其是C18:1和C18:2)的水平显著降低(参见株系40和44)，其中在株系44中，C18:1水平降低到野生型的八分之一以下。而且，美国榆硫酯酶(由amt03启动子驱动)会使中链脂肪酸的水平极大地增加。株系44中C10:0-C14:0的水平超过56％(是野生型藻株中所见到的水平的约42倍)而且C8:0-C14:0的水平超过57％。经过驱动美国榆硫酯酶表达的Amt03启动子构建体转化的另外的藻株具有如下代表性脂质型态：C8:0占
0.23％；C10:0占9.64％；C12:0占2.62％；C14:0占31.52％；C16:0占37.63％；C18:0占
5.34％；C18:1占7.05％；以及C18:2占5.03％，其中总饱和物质所占的百分比是86.98％。
0.23％；C10:0占9.64％；C12:0占2.62％；C14:0占31.52％；C16:0占37.63％；C18:0占
5.34％；C18:1占7.05％；以及C18:2占5.03％，其中总饱和物质所占的百分比是86.98％。
[0630] 通过用驱动细叶萼距花C10硫酯酶(SEQ ID NO：94)表达的amt03启动子/UTR构建体(SEQ ID NO：89)对桑椹形原藻细胞进行转化产生另外的脂质型态。选择表达这种构建体的阳性克隆并且使其在pH 7.0条件下生长。阳性克隆的代表性脂质型态是：C8:0占9.87％；C10:0占23.97％；C12:0占0.46％；C14:0占1.24％；C16:0占10.24％；C18:0占2.45％；C18:1占42.81％；以及C18:2占7.32％。这种克隆中C8-C10所占的百分比是33.84％。
[0631] 总之，所述数据表明amt03启动子/UTR以及与其类似的其它启动子可以被用作紧密调节型启动子，所述启动子尤其可以用于表达可能具有毒性的化合物并且需要严格迫使基因表达。桑椹形原藻能够在范围较宽(至少pH 5.0至7.0)的pH值条件下生长的能力使得这种有机体尤其可与调节元件(如amt03启动子/UTR)组合使用。另外，上述脂质型态数据表明，amt03启动子/UTR能够显著驱动基因表达。
[0632] 实施例11：改变微藻桑椹形原藻中饱和脂肪酸的水平
[0633] 作为利用基于生物信息学的途径(基于cDNA)、Illumia转录组以及Roche 454测序对桑椹形原藻(UTEX 1435)的基因组DNA进行基因组筛选的一部分，鉴定出两组参与脂肪酸去饱和的特异性基因：硬脂酰基-ACP去饱和酶(SAD)和δ-12脂肪酸去饱和酶(Δ12FAD)。硬脂酰基-ACP去饱和酶是脂质合成通路的一部分，而且它们的功能是将双键引入到脂肪酰基链中，例如从C18:0脂肪酸合成C18:1脂肪酸。δ-12脂肪酸去饱和酶也是脂质合成通路的一部分，而且它们的功能是将双键引入到已不饱和的脂肪酸中，例如从C18:1脂肪酸合成C18:2脂肪酸。利用基于在生物信息学研究期间所鉴定出的两类脂肪酸去饱和酶基因的探针进行的DNA印迹分析表明，各类去饱和酶基因均可能包含多个家族成员。另外，编码硬脂酰基-ACP去饱和酶的基因分成两个不同的家族。基于这些结果，三种基因破坏构建体经过设计以通过靶向各去饱和酶家族内保守性较高的编码区来潜在地破坏多个基因家族成员。
[0634] 利用以下来设计三种同源重组靶向构建体：(1)δ-12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)家族成员的编码序列中的高度保守部分，以及(2)两种分别靶向两个不同的SAD家族中的一个家族的构建体，各构建体分别靶向各家族的编码序列中的保守区域。这个策略将选择标记基因(来自酿酒酵母的赋予水解蔗糖的能力的suc2蔗糖转化酶盒)嵌入这些高度保守的编码区中(靶向多个家族成员)而非传统的基因置换策略，在传统的策略中，同源重组将靶向目标基因的侧翼区域。
[0635] 利用上述方法通过基因枪转化将所有构建体引入到细胞中，并且在被射入细胞中之前将构建体线性化。在含有蔗糖的培养板/培养基中选择转化体并且利用上述方法测定脂质型态的改变。三种靶向构建体中的每一种的相关序列列于下文中。
[0636]
[0637] 挑选通过用各构建体进行转化而产生的代表性阳性克隆并且测定这些克隆的脂质型态(以面积％表示)并且总结于下表21中。
[0638] 表21.去饱和酶敲除物的脂质型态。
[0639]
[0640] 各构建体对所需的脂肪酸类别具有可测量到的影响并且在所有三种情况下，C18:0水平显著增加，尤其在两种SAD敲除物的情况下。对通过SAD敲除产生的多个克隆进行的进一步比较表明，SAD2B敲除株系中的C18:1脂肪酸与在SAD2A敲除株系的情况下所观测到的C18:1脂肪酸水平相比出现显著较大幅度的减少。
[0641] 在桑椹形原藻背景下利用上述方法产生了另外的Δ12脂肪酸去饱和酶(FAD)敲除物。为了鉴定Δ12FAD的潜在同源性，使用下列引物来扩增编码假定性FAD的基因组区域：
[0642] 引物15′-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3′SEQ ID NO：101
[0643] 引物25′-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3′SEQ ID NO：102
[0644] 通过利用上述引物使桑椹形原藻基因组DNA进行基因组扩增而产生的序列是高度相似的，但表明，在原藻中存在Δ12FAD的多基因或等位基因。
[0645] 基于这个结果，设计两种基因破坏构建体以设法使一个或多个Δ12FAD基因失活。所述策略是将蔗糖转化酶(来自酿酒酵母的suc2)盒(从而赋予水解蔗糖的能力而作为选择标记)嵌入到高度保守的编码区中，而非使用传统的基因置换策略。称作pSZ1124的第一种构建体含有侧接驱动酿酒酵母suc2基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的5′端和3′端基因组靶向序列以及普通小球藻硝酸还原酶3′UTR(酿酒酵母suc2盒)。
称作pSZ1125的第二种构建体含有侧接驱动酿酒酵母suc2基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的5′端和3′端基因组靶向序列以及普通小球藻硝酸还原酶3′UTR。所述构建体的相关序列列于序列表中：
称作pSZ1125的第二种构建体含有侧接驱动酿酒酵母suc2基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的5′端和3′端基因组靶向序列以及普通小球藻硝酸还原酶3′UTR。所述构建体的相关序列列于序列表中：
[0646]
[0647] 将pSZ1124和pSZ1125各自引入到桑椹形原藻背景中，并且基于水解蔗糖的能力选择阳性克隆。表22总结了在利用pSZ1124和pSZ1125靶向载体的两个转基因株系中获得的脂质型态(以面积％表示，利用上述方法产生)。
[0648] 表22.Δ12FAD敲除物的脂质型态
[0649]C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3α
亲本 0.01 0.03 1.15 26.13 1.32 4.39 57.20 8.13 0.61
FAD2B 0.02 0.03 0.80 12.84 1.92 0.86 74.74 7.08 0.33
FAD2C 0.02 0.04 1.42 25.85 1.65 2.44 66.11 1.39 0.22
亲本 0.01 0.03 1.15 26.13 1.32 4.39 57.20 8.13 0.61
FAD2B 0.02 0.03 0.80 12.84 1.92 0.86 74.74 7.08 0.33
FAD2C 0.02 0.04 1.42 25.85 1.65 2.44 66.11 1.39 0.22
[0650] 含有FAD2B(pSZ1124)构建体的转基因株系在脂质型态方面产生了极其令人感兴趣并且出乎意外的结果，因为预期将减少的C18:2水平仅减少了约1面积％。然而，C18:1脂肪酸水平显著增加，几乎仅以C16:0水平(显著降低)作为代价。含有FAD2C(pSZ1125)构建体的转基因株系也产生了脂质型态的变化：C18:2水平显著降低而C18:1水平相应增加。
[0651] 牛脂模拟物
[0652] 选择由如上文所述的上述SAD2B敲除实验产生的一个阳性克隆用作进一步引入C14优先型脂肪酰基-ACP硫酯酶基因的背景。引入樟树C14优先型硫酯酶的构建体含有6S rRNA基因组区域的靶向序列(使得能够通过同源重组将转化DNA靶向整合)，并且表达构建体含有驱动neoR基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子及普通小球藻硝酸还原酶3′UTR，后面是驱动经过密码子优化的樟树硫酯酶(含有原始小球藻硬脂酰基-ACP去饱和酶转运肽)表达的第二莱茵衣藻β-微管蛋白启动子及第二普通小球藻硝酸还原酶
3′UTR。5′端6S rRNA基因组供体序列列于SEQ ID NO：82中；3′端6S rRNA基因组供体序列列于SEQ ID NO：84中；并且樟树硫酯酶的相关表达构建体列于SEQ ID NO：83中。
3′UTR。5′端6S rRNA基因组供体序列列于SEQ ID NO：82中；3′端6S rRNA基因组供体序列列于SEQ ID NO：84中；并且樟树硫酯酶的相关表达构建体列于SEQ ID NO：83中。
[0653] 利用如上文所述的基因枪法进行转化并且在含有2％蔗糖的培养板上使细胞复苏24小时。之后，使细胞重悬并且再接种于含有2％蔗糖以及50μg/ml G418的培养板上以进行选择。针对脂质产生和脂质型态选择所产生阳性克隆当中的9个克隆。如上文所述培养9个转基因克隆(SAD2B被敲除并且表达樟树C14优先型硫酯酶)并且分析脂质型态。结果总结于下表23中。动物脂的脂质型态也包括在下表23中(美国国家研究委员会(1976年)：动物产品的脂肪含量和组成)。
[0654] 表23.经过硫酯酶转化的克隆的脂质型态。
[0655]
[0656]
[0657] 可以在表23中看到，转基因株系的脂质型态与动物脂的脂质型态十分相似。总的来说，所述数据表明，将特定的转基因背景(在这种情况下，是SAD2B敲除与C14优先型硫酯酶(来自樟树))组合可以用于制备所产生的油类的脂质型态类似于动物脂的转基因藻类藻株。
[0658] 用于通过靶向敲除途径下调β-酮酰基合酶II(KASII)表达的构建体
[0659] 将通过靶向敲除途径下调KASII基因表达的载体引入到UTEX1435的经过传统诱变处理的衍生物S1331中。利用酿酒酵母转化酶基因作为选择标记，赋予利用蔗糖生长的能力。将在莱茵衣藻B-微管蛋白启动子控制之下的转化酶表达盒插入315bp长的KASII基因组区域中间以允许进行靶向整合(pSZ1503)。
[0660] pSZ1503中的相关限制性位点以小写字母、粗体以及加下划线方式指示并且分别是5′-3′BspQ 1、Kpn I、AscI、Xho I、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5′末端和3′末端。粗体小写字母序列表示S1331中使得能够通过同源重组在KASII基因座上进行靶向整合的基因组DNA。沿5′端至3′端方向，驱动酵母蔗糖转化酶基因(赋予S1331代谢蔗糖的能力)表达的莱茵衣藻B-微管蛋白启动子由加方框的文字指示。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写粗斜体字指示，而编码区以小写的斜体字指示。普通小球藻硝酸还原酶3′UTR由小写的加下划线的文字指示。
[0661] pSZ1503_[KASII_btub-y.inv-nr_KASII]中所含的转化DNA的核苷酸序列：
[0662]
[0663]
[0664] 分别以SEQ ID NO：279和280标示KAS II等位基因1和等位基因2的cDNA。分别以SEQ ID NO：281和282标示等位基因1和2的氨基酸序列。
[0665] 为了确定KASII失活对脂质组成的影响，将pSZ1503载体DNA转化到S1331中以产生靶向KASII敲除表型。分离初始单个克隆并且使其在pH 5.0下生长于标准的脂质产生条件下。最佳代表性克隆和野生型细胞的所得到的型态展示于下表31中。
[0666] 表31.S1331和用pSZ1503DNA转化的衍生转基因株系的脂肪酸型态。
[0667]
[0668] 实施例12：用替代选择标记对原藻进行工程改造
[0669] A.使可分泌的α-半乳糖苷酶在桑椹形原藻中表达
[0670] 使异源性蔗糖转化酶基因在原藻属物种中表达的方法和影响先前已描述于PCT申请第PCT/US2009/66142号中，所述申请在此以引用的方式并入本文。在本实施例中研究其它异源性多糖降解酶的表达。测试具有编码α-半乳糖苷酶的下列外源性基因之一的桑椹形原藻UTEX 1435利用蜜二糖(α-D-gal-glu)生长的能力：来自卡尔酵母的MEL1基因(氨基酸序列对应于NCBI登录号P04824(SEQ ID NO：108))、来自黑曲霉的AglC基因(氨基酸序列对应于NCBI登录号Q9UUZ4(SEQ ID NO：116))，以及来自高等植物瓜尔豆的α-半乳糖苷酶(氨基酸序列对应于NCBI登录号P14749(SEQ ID NO：120)。上述登录号以及相应的氨基酸序列在此以引用的方式并入本文。在所有情况下，根据桑椹形原藻中的优先密码子使用来优化基因。表达盒的相关部分以及序列表编号列于下文中。所有表达盒使用用于稳定基因组整合的5′端和3′端Clp同源重组靶向序列、莱茵衣藻TUB2启动子/5′UTR以及普通小球藻硝酸还原酶3′UTR。
[0671]
[0672]
[0673] 用含有卡尔酵母MEL1、黑曲霉AlgC或瓜尔豆α-半乳糖苷酶基因的三个表达盒中的每一个表达盒利用如上文在实施例2中所述的基因枪转化法使桑椹形原藻细胞转化。利用含有2％蜜二糖作为唯一碳源的培养板筛选阳性克隆。在培养板上没有看到瓜尔豆表达盒转化体的群落。从含有卡尔酵母MEL1转化体和黑曲霉AlgC转化体的培养板上挑选阳性克隆。利用PCR，使用靶向一部分普通小球藻3′UTR和3′端Clp同源重组靶向序列的引物确定转化DNA的整合。
[0674] 5′引物普通小球藻3′UTR：下游Clp序列(SEQ ID NO：123)
[0675] ACTGCAATGCTGATGCACGGGA
[0676] 3′端引物普通小球藻3′UTR：下游Clp序列(SEQ ID NO：124)
[0677] TCCAGGTCCTTTTCGCACT
[0678] 作为阴性对照，也用所述引物组扩增未经过转化的桑椹形原藻细胞中的基因组DNA。没有从野生型细胞中的基因组DNA扩增到产物。
[0679] 测试由卡尔酵母MEL1转化体和黑曲霉AlgC转化体中的每一者产生的多个阳性克隆(如通过PCR所确定)利用液体培养基中的蜜二糖作为唯一碳源生长的能力。在上述实施例1中所述的条件和基础培养基中在使用蜜二糖作为唯一碳源的情况下使这些经过选择的克隆生长3天。含有任一α-半乳糖苷酶编码基因的所有克隆在这段时间内稳固地生长，而未经过转化的野生型藻株和表达酿酒酵母SUC2蔗糖转化酶的桑椹形原藻较差地利用蜜二糖培养基生长。这些结果表明可以使用α-半乳糖苷酶编码基因作为转化的选择标记。并且，这些数据表明，存在于卡尔酵母MEL1(SEQ ID NO：109)或黑曲霉AlgC(SEQ IDNO：117)中的原生信号肽可用于使蛋白质靶向桑椹形原藻细胞中的外周胞质。
[0680] B.THIC基因补充原藻中的硫胺素营养缺陷
[0681] 利用外源性THIC基因的表达来研究桑椹形原藻细胞的硫胺素原养性。在植物和藻类中硫胺素生物合成通常在质体中进行，因此参与其产生的大部分核编码蛋白质需要有效地靶向质体。对桑椹形原藻细胞进行DNA测序和转录组测序揭示，除THIC外，编码硫胺素生物合成酶的所有基因均存在于基因组中。为了在生物化学层面上剖析导致硫胺素营养缺陷的机能障碍，研究桑椹形原藻细胞在以下五种不同的条件下的生长：(1)在2μM盐酸硫胺素存在下；(2)不存在硫胺素；(3)不存在硫胺素，但存在2μM羟乙基噻唑(THZ)；(4)不存在硫胺素，但存在2μM 2-甲基-4-氨基-5-(氨甲基)嘧啶(PYR)；以及(5)不存在硫胺素，但存在2μM THZ和2μM PYR。在这5种不同的条件下进行的生长实验的结果表明，桑椹形原藻细胞能够从头合成，但仅在提供PYR前体的情况下产生焦磷酸硫胺素(TPP)。这个结果与以下假设一致：桑椹形原藻的硫胺素营养缺陷的原因是不能从氨基咪唑核糖核苷酸合成羟甲基嘧啶磷酸(HMP-P)，这种合成是由THIC酶催化的转化。
[0682] 利用上文在实施例2中所述的基因枪转化法对桑椹形原藻细胞进行转化，以使其表达胶球藻C-169THIC(氨基酸序列对应于JGI蛋白质识别号30481，并且在此以引用的方式并入本文)和酿酒酵母SUC2蔗糖转化酶(作为选择标记)。这种表达构建体含有胶球藻C-169THIC的原生转运肽序列、基因组DNA的6S区域的上游和下游同源重组靶向序列、莱茵衣藻TUB2启动子/5′UTR区(SEQ ID NO：104)以及普通小球藻硝酸还原酶3′UTR(SEQ ID NO：115)。酿酒酵母SUC2表达同样由莱茵衣藻TUB2启动子/5′UTR区(SEQ ID NO：114)驱动并且含有普通小球藻硝酸还原酶3′UTR(SEQ ID NO：115)。根据桑椹形原藻中的优先密码子使用来优化基因。相关表达盒序列列于序列表中并且详述于下文中：
[0683]
[0684] 在不含硫胺素而含有蔗糖作为唯一碳源的培养板上对阳性克隆进行选择。利用PCR，使用结合于胶球藻C-169 THIC基因内的5′端引物和在6S基因座上转化DNA下游进行退火的3′端引物来确定阳性克隆。还利用DNA印迹测定确定经过PCR确定的阳性克隆。
[0685] 为了观测野生型桑椹形原藻细胞的硫胺素营养缺陷，需要首先消耗细胞的内部硫胺素储备。为了测试在不含硫胺素的培养基中的生长，首先使细胞在含有2μM硫胺素的培养基中生长到静止期，然后将细胞在不含硫胺素的培养基中稀释到750nm下的光学密度(OD750)达到约0.05为止。然后再次使经过稀释的细胞在不含硫胺素的培养基中生长到静止期(约2天至3天)。使用这些缺乏硫胺素的细胞接种培养物以在不含硫胺素的培养基中进行生长研究。使野生型细胞在含有葡萄糖作为碳源的培养基(含有或不含硫胺素)中生长并且使具有原生转运肽胶球藻C-169THIC构建体的阳性克隆在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长。通过监测在750nm下的吸光度来测量生长。生长实验的结果显示，表达转基因的藻株在无硫胺素的培养基中的生长程度显著大于野生型细胞在无硫胺素的培养基中的生长。然而，转化体没能达到野生型细胞在含有硫胺素的培养基中的生长速率和细胞密度。转化体克隆在无硫胺素的培养基中的生长量与经过整合的胶球藻酶的拷贝数之间还存在强相关(即转基因的拷贝数越大，细胞在无硫胺素的培养基中的生长越好)。
[0686] 利用含有胶球藻THIC、拟南芥THIC基因以及集胞藻属PCC6803thiC基因的表达构建体产生另外的转化体。在胶球藻和拟南芥THIC基因的情况下，用原始小球藻硬脂酰基-ACP去饱和酶(SAD)基因的转运肽序列置换原生转运肽序列。集胞藻属是蓝藻细菌并且thiC蛋白质不含原生转运肽序列。在集胞藻属thiC构建体中，将原始小球藻SAD基因的转运肽序列融合到集胞藻属thiC的N端上。在所有情况下，序列经过密码子优化以在桑椹形原藻中表达。所有三个上述构建体均含有基因组的6S区域的上游和下游同源重组靶向序列(SEQID NO：82和84)、原始小球藻肌动蛋白启动子/5′UTR以及原始小球藻EF1A基因3′UTR。所有三个构建体均含有由莱茵衣藻TUB2启动子/5′UTR(SEQ ID NO：114)驱动的neoR基因并且含有普通小球藻3′UTR(SEQ ID NO：115)(可以由G418进行选择)。拟南芥THIC的氨基酸序列对应于NCBI登录号NP_180524，而且集胞藻属thiC的氨基酸序列对应于NCBI登录号NP_442586，两个序列在此以引用的方式并入本文。相关表达盒序列列于序列表中并且详述于下文中：
[0687]
[0688]
[0689] 在含有G418的培养板上筛选阳性克隆并且挑选由各转化产生的多个克隆以通过PCR进行验证。利用PCR分析，使用下列引物确定分别含有胶球藻C-169(具有原始小球藻转运肽)、拟南芥以及集胞藻属PCC 6803 THIC基因的转化DNA构建体在基因组的6S基因座中的整合：
[0690] 5′端THIC胶球藻确定引物序列(SEQ ID NO：141)
[0691] ACGTCGCGACCCATGCTTCC
[0692] 3′端THIC确定引物序列(SEQ ID NO：142)
[0693] GGGTGATCGCCTACAAGA
[0694] 5′端THIC拟南芥确定引物序列(SEQ ID NO：143)
[0695] GCGTCATCGCCTACAAGA
[0696] 5′端thiC集胞藻属确定引物序列(SEQ ID NO：144)
[0697] CGATGCTGTGCTACGTGA
[0698] 在含有G418的培养基中利用各不同构建体的转化体的经过选择和确定的阳性克隆进行对缺乏硫胺素的细胞所进行的生长实验(如上文所述)。所有转化体均能够在无硫胺素的培养基中生长(稳固度不同)。将转化体在无硫胺素的培养基中的生长与野生型细胞在含有硫胺素的培养基中的生长进行比较显示，就它们在无硫胺素的培养基中维持生长的能力来说排列如下：(1)拟南芥转化体；(2)胶球藻C-169(具有原始小球藻转运肽)转化体；以及(3)集胞藻属转化体。这些结果表明，虽然单个拟南芥THIC拷贝能够补充桑椹形原藻细胞的硫胺素营养缺陷，但胶球藻C-169(具有原生转运肽序列或原始小球藻的转运肽序列)和集胞藻属THIC的多个拷贝是为能够在不存在硫胺素的情况下迅速生长所需的。鉴于来自不同来源的不同THIC的结果的可变性，不能够预测任何特定THIC基因能够完全补充原藻属物种中存在的机能障碍的能力。
[0699] 对三个THIC氨基酸序列进行比对。虽然集胞藻属的thiC与胶球藻和拟南芥的THIC之间存在显著的序列保守性(在氨基酸层面上有41％一致性)，但蓝藻细菌蛋白质中缺失了N端上在藻类和植物蛋白质中非常保守的结构域。尽管缺失所述结构域(并且可能导致结构差异)，但表达集胞藻属thiC的构建体仍能够至少部分地恢复桑椹形原藻细胞的硫胺素原养性。
[0700] 实施例13：燃料生产
[0701] A.利用压榨机和压榨辅助物从微藻中提取油类
[0702] 利用转鼓式干燥机使含有38％油类(以DCW计)的微藻生物质干燥，使得水分含量达到5％-5.5％。将所述生物质送入到French L250压榨机中。使30.4kg(67lbs.)生物质通过压榨机，并且不回收油类。将相同的经过干燥的微生物生物质与不同百分比的柳枝稷(作为压榨辅助物)组合，并使其通过压榨机。将经过干燥的微生物生物质与20％w/w的柳枝稷组合能够产生油类回收的最佳总体百分比。然后对压榨饼进行己烷提取，并且对于20％柳枝稷的情况，最终产率是61.6％的总可用油(以重量计算)。含有超过50％油类(以细胞干重计)的生物质不需要使用压榨辅助物(如柳枝稷)来释放油类。利用压榨机从微藻中提取油类的其它方法描述于PCT申请第PCT/US2010/31108号中并且所述申请在此以引用的方式并入本文。
[0703] B.从原藻油类生产生物柴油
[0704] 对根据上述方法从桑椹形原藻UTEX 1435中产生的脱胶油进行酯基转移，以产生脂肪酸甲酯。结果展示于下表24中。
[0705] 油类的脂质型态是：
[0706] C10:0 0.02
[0707] C12:0 0.06
[0708] C14:0 1.81
[0709] C14.1 0.07
[0710] C16:0 24.53
[0711] C16:1 1.22
[0712] C18:0 2.34
[0713] C18:1 59.21
[0714] C18:2 8.91
[0715] C18:3 0.28
[0716] C20:0 0.23
[0717] C20:1 0.10
[0718] C20:1 0.08
[0719] C21:0 0.02
[0720] C22:0 0.06
[0721] C24:0 0.10
[0722] 表24.由桑椹形原藻甘油三酯油类生产的生物柴油的型态
[0723]
[0724]
[0725]
[0726] 生物柴油的脂质型态与原料油类的脂质型态高度相似。可以对由本发明的方法和组合物提供的其它油类进行酯基转移，以产生脂质型态包括以下的生物柴油：(a)C8-C14占至少4％；(b)C8占至少0.3％；(c)C10占至少2％；(d)C12占至少2％；以及(3)C8-C14占至少30％。
[0727] 通过ASTM D6751 A1方法测定，所生产的生物柴油的低温适应过滤性是120秒(对于300ml体积)。该测试包括过滤300ml的B100，冷却至40℉，持续16小时，升温至室温，并利用具有不锈钢支撑物的0.7微米玻璃纤维过滤器在真空下进行过滤。可以对本发明的油类进行酯基转移，以产生低温适应时间短于120秒、短于100秒以及短于90秒的生物柴油。
[0728] C.可再生柴油的生产
[0729] 对根据上述方法从桑椹形原藻UTEX 1435产生并且脂质型态与上述本实施例中用于生产生物柴油的油类相同的脱胶油进行酯基转移，以生产可再生柴油。
[0730] 首先对油类进行热液处理，以除去氧和甘油主链，产生正构石蜡烃。然后使正构石蜡烃裂化和异构化。该物质的色谱图示出于图1中。然后对该物质进行冷却过滤，除去约5％的C18物质。冷却过滤后，将该物质的总体积减少至闪点体积并且对闪点、ASTM D-86蒸馏分布、浊点以及粘度进行评价。闪点是63℃；粘度是2.86cSt(厘斯)；浊点是4℃。ASTM D86蒸馏值显示于表25中：
[0731] 表25.ASTM D86蒸馏值。
[0732] 读数(以℃计)：
[0733]
[0734]
[0735] 所产生的物质的T10-T90是57.9℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法利用根据本文公开的方法产生的甘油三酯油类产生具有其它T10-T90范围(如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃以及65℃)的可再生柴油组合物。
[0736] 所产生的物质的T10是242.1℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法产生具有其它T10值的可再生柴油组合物，诸如T10值在180与295之间、在190与270之间、在210与250之间、在225与245之间以及是至少290。
[0737] 所产生的物质的T90是300℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法产生具有其它T90值的可再生柴油组合物，诸如T90值在280与380之间、在290与360之间、在300与350之间、在310与340之间以及是至少290。
[0738] 所产生的物质的FBP是300℃。可以使用氢化处理方法、异构化方法以及本文公开的对油类进行其它共价修饰的方法以及本文公开的蒸馏和分馏(如冷却过滤)方法产生具有其它FBP值的可再生柴油组合物，诸如FBP值在290与400之间、在300与385之间、在310与370之间、在315与360之间以及是至少300。
[0739] 可以对由本发明的方法和组合物提供的其它油类进行氢化处理、异构化以及其它共价修饰的组合，所述其它油类包括脂质型态包括以下的油类：(a)C8-C14占至少4％；(b)C8占至少0.3％；(c)C10占至少2％；(d)C12占至少2％；以及(3)C8-C14占至少30％。
[0740] 实施例14：生产特制油
[0741] 利用本文所公开的方法和物质生产各种特制油。表32显示藻株、赋予表型的基因和基因的基因库登录号，以及由所示藻株产生的各种脂肪酸型态。藻株A和B都是桑椹形原藻(UTEX 1435)藻株，由收费的实验室对这两者进行传统地诱变处理以改良油产率。然后如本文所述用适当的DNA构建体对藻株A和B进行遗传工程改造以使其表达所需基因。如所示，还对藻株进行工程改造以使内源性去饱和酶失活。对硫酯酶的核苷酸序列进行密码子优化以使其表达并且将其用于原藻中。
[0742] 没有经过工程改造的野生型原藻的脂肪酸型态显示于表32的第一行中。可以看到，已在不同的藻株中以不同的方式使脂肪酸型态发生显著改变。举例来说，由没有经过遗传工程改造的桑椹形原藻细胞产生的C8:0的百分比是0％。然而，经过工程改造而表达细叶萼距花硫酯酶的桑椹形原藻细胞所产生的C8:0从占总甘油三酯0％增加到占总甘油三酯13.2％。再举例来说，经过工程改造的藻株中C8:0与C10:0的组合总量占总脂肪酸的约39％。相比之下，野生型细胞中C8:0与C10:0的组合总量是0.01％。再举例来说，通过使美国榆硫酯酶在内源性SAD2b的表达遭到破坏的细胞中表达使饱和脂肪酸的总量从约32％增加到约90％。这增加了几乎300％。
[0743] 如下文所公开的各种脂肪酸型态可以用于多种牵涉甘油三酯油类的应用中。举例来说，包含高水平的短碳链长度的饱和脂肪酸的甘油三酯(C12:0、C14:0、C16:0)尤其适用于生产可再生喷气燃料。对于生物柴油生产，需要C18:1的量较高。对于条皂生产，需要控制和实现饱和度与短链脂肪酸之间的适当平衡。举例来说，高量的C12:0为起泡特性所需，而较长的链长提供较多的结构，而含有亚油酸和亚麻酸的甘油三酯因它们会导致氧化不稳定性而不那么合乎需要。对于液体皂，需要C12:0和C14:0的量较高。另外，对于条皂和液体皂生产，需要C6:0、C8:0以及C10:0的量较低，因为这些短链甘油三酯是皮肤刺激物。
[0744]
[0745]
[0746] 棕榈仁油
[0747] 我们生产出类似于棕榈仁油(PKO)的微生物棕榈仁油模拟物。为了生产棕榈仁油模拟物，构建质粒并且将其用于转化藻株A，而且进行油类生产。构建体pSZ1413(SEQ ID NO：231)包含经过密码子优化的赖特氏萼距花FATB2基因(SEQ ID NO：284)(基因库登录号U56106)和SAD2B(硬脂酰基-ACP去饱和酶)基因破坏。
[0748] 如下表33中所示，棕榈仁油模拟物类似于棕榈仁油。PKO模拟物中三种含量最高的脂肪酸(C12:0、C14:0以及C18:1)的百分比与棕榈仁油相同或与棕榈仁油相差10％以内。
[0749] 表33.棕榈仁油模拟物的甘油三酯型态。
[0750]
[0751] 棕榈油
[0752] 我们生产出类似于棕榈油的微生物棕榈油模拟物。构建多种不同的质粒并且将其单个地转化到藻株A中，并且进行油类生产。设计构建体pSZ1503(SEQ ID NO：283)以破坏内源性KASII基因。构建体pSZ1439(SEQ ID NO：237)包含经过密码子优化的油棕TE基因(SEQID NO：205)(基因库登录号AAD42220.2)。构建体pSZ1420(SEQ IDNO：225)包含经过密码子优化的细叶萼距花TE基因(SEQ ID NO：201)(基因库登录号Q39513)。构建体pSZ1119(SEQ ID NO：227)包含经过密码子优化的细叶萼距花KAS IV基因(SEQ ID NO：186)(基因库登录号AF060519)以及赖特氏萼距花FATB2基因(SEQ ID NO：184)(基因库登录号U56104)。
[0753] 如下表34中所示，棕榈油模拟物类似于棕榈油。棕榈油模拟物中三种含量最高的脂肪酸(C16:0、C18:1以及C18:2)的百分比与棕榈油相同或与棕榈油相差10％以内。
[0754] 表34.棕榈油模拟物的甘油三酯型态。
[0755]
[0756] 可可脂
[0757] 我们生产出类似于可可脂的微生物可可脂模拟物。构建构建体pSZ1451并且将其转化到藻株A中并且进行油类生产。构建体pSZ1451(SEQ ID NO：239)包含经过密码子优化的红花TE基因(SEQID NO：187)(基因库登录号AAA33019.1)。
[0758] 如下表35中所示，可可脂油类模拟物类似于可可脂。可可脂模拟物中三种含量最高的脂肪酸(C16:0、C18:0以及C18:1)的百分比与可可脂相同或与可可脂相差10％以内。
[0759] 表35.可可脂模拟物的甘油三酯型态。
[0760] C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2[0761] 可可脂 0 0-1 0-1 0-4 22-38 24-37 29-38 0-3[0762] pSZ1451 0.05 0.14 0.99 28.34 27.39 29.40 10.26[0763] 猪油
[0764] 我们生产出类似于猪油的微生物猪油模拟物。构建多种不同的质粒并且将其单个地转化到藻株A中，并且进行油类生产。设计构建体pSZ1493(SEQ ID NO：241)以破坏内源性SAD 2B基因并且同时表达经过密码子优化的加州月桂TE基因(SEQ ID NO：285)(基因库登录号M94159)。设计构建体pSZ1452(SEQ ID NO：240)以破坏内源性SAD 2B基因并且表达经过密码子优化的山竹TE基因(SEQ ID NO：196)(基因库登录号AAB51525.1)。设计构建体pSZ1449(SEQ ID NO：238)以表达经过密码子优化的甘蓝型油菜TE基因(SEQ ID NO：195)(基因库登录号CAA52070.1)。构建体pSZ1458的多聚核苷酸序列与pSZ1449一致，例外为用经过密码子优化的编码细叶萼距花硫酯酶的多聚核苷酸序列(基因库登录号U39834)置换编码甘蓝型油菜TE基因的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：195)(基因库登录号CAA52070.1)。
[0765] 如下表36中所示，猪油模拟物类似于猪油。猪油模拟物中三种含量最高的脂肪酸(C16:0、C18:0以及C18:1)的百分比与猪油相同或与猪油相差10％以内。
[0766] 表36.猪油模拟物的甘油三酯型态。
[0767]
[0768] 虽然已经对本发明连同其特定实施方案进行了描述，但是应当理解，能够对其进行进一步改进。本申请意图涵盖依照本发明的原理并且包括偏离本文公开内容的本发明的任何变化、用途或调整，本发明所属领域中已知或惯例以及适用于上文中阐述的重要特征。
[0769] 本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请以及公布(包括基因库登录号)在此以引用的方式整体并入本文，无论先前是否具体并入。引用本文所提及的出版物的目的是描述并公开用于本发明的试剂、方法以及概念。本文并不视作承认这些参考文献是与本文所述的本发明相关的现有技术。具体来说，下列专利申请在此为了所有目的以引用的方式整体并入本文：2008年6月2日提交的名称为“Production of Oil in Microorganisms”的PCT申 请 第PCT/US2008/065563号；2010年4月14 日提 交 的 名 称为“Methods ofMicrobial Oil Extraction and Separation”的PCT申请第PCT/US2010/31108号；以及2009年11月30日提交的名称为“Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms”的PCT申请第PCT/US2009/066142号。
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