总的来说，本发明涉及通过结合到探针上而进行测定的靶分析领域(正 如通常在DNA序列鉴定中所发现的)。本发明还涉及固定化核酸探针在 固相基片上的排列。更具体地说，本发明涉及探针载体细线的包装，其中 探针以阵列的形式单独固定在柔性载体上。

分子结构的鉴定在研究和许多产业中业已变得非常重要，并且对生物 分子诸如核酸及蛋白质的分析形成了临床诊断测定的基础。所采用的方法 通常包括相当多的消耗大量时间的重复步骤(参见，例如，Sambrook，J. 等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)。 冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(第二版1989)。开发在平面基片上 形成的测试位点阵列业已提供了更简便快速的分子分析方法。每一测试位 点都包括与施加到装置上的样品结合的探针。这样的探针可以是寡核苷酸、 蛋白质、抗体或细胞结合分子，并且探针的选择在理论上仅仅局限于与样 品特异性结合或反应的可能性。检测样品与探针的结合并鉴定该探针，借 此鉴定样品。目前主要是围绕二维平面阵列特别是寡核苷酸阵列的应用来 开发技术的，而这些阵列已经足够小而密，足以称作微阵列。
以有效和经济的方式生产微阵列的能力，是全球范围内的研究者相当 感兴趣的，并且具有重要的商业价值。再怎么说也不会夸大微阵列技术对 于生物技术产业以及对于整个卫生保健领域的重要性。微阵列能够显著提 高传统生物化学实验的效率。原来可能花费几年的试验现在几小时甚至几 分钟内就能够完成。该技术的应用不仅影响到卫生保健领域，而且还影响 到基因分型、疾病诊断、药物发现、法学、农学、生物战，甚至生物计算 机。各种类型的微阵列生产设备和技术业已被描述。
目前的技术开发方向仍然是在刚性基片上制备更稠密的二维探针阵 列。但是该途径存在许多问题。首先，随着阵列中测试位点的增多，制造 一个阵列或多个阵列的复杂性也大大增加了。其次，将作为探针的生物分 子放置到特定测试位点上的常规方法(照相平版印刷术、机械点样术和喷 墨术)耗时、昂贵、经常缺少所需的准确度并且不能满足所需的尺寸限制。 探针的原位照相平版印刷合成是一种不能提供满意的准确度并具有有限范 围的探针长度的劳动量大的技术。机械点样术是一种慢工艺过程，其中最 小的测试位点尺寸受到该工艺性质的限制。化学喷墨术具有与原位合成类 似的不准确性以及与机械点样类似的对测试位点尺寸的限制。第三，由于 制造各个阵列所需的复杂性和极高的精确性以及产量较低，因此每一阵列 的制造成本非常高，制造含有足以评估复杂生物样品的探针的阵列往往需 要几千美元。第四，用于检测探针-样品杂交体的读取设备的本已经相当 高的花费和复杂性，都随着阵列密度的增大而增加，并且因为该读取设备 必需以非常高的空间精确度(10μm级)来进行二维扫描，所以每一扫描 的处理时间也随着二维探针阵列密度的增大而延长。
此外，微阵列的基本操作原理包括使固定在基片上的探针与样品液中 的特异性分子反应。杂交需要为探针提供足够的遇到其互补分子的机会。 在现存的系统中，通过扩散或驱动样品液穿过微阵列可实现这一点。前者 是一个随机过程，而后者需要复杂的微流系统。
因此，需要一种容易、快速构建的廉价探针载体，这种载体能够容纳 数千个或数十万个探针、能够压制储存和使用、能够以较高的产率来生产、 易于使探针/靶高效率地相互作用并且无需昂贵和高精度的读取设备、能够 与探针本身一起承载基片上各个探针或探针组的有关详细信息、能够容纳 定制组中不同长度和复杂程度的探针，而且这种载体被压制、易于使用且 廉价到足以以最终形成的高准确度进行一次性使用。
还需要这些探针载体的改进的包装，由此使所需的杂交液量最小并且 大量的探针可以固定在基片上，而尺寸不会如二维标准基因芯片矩阵所需 的那样随之增大。
发明概述
本发明提供了一种制备探针载体或探针构型的新方向和途径，其无需 在刚性基片上建立稠密的二维对称阵列，也不会固有地限制可附着到基片 上的探针的尺寸。另外，通过使用类似流水线的技术，可相当容易地制造 本发明的产品。
本发明提供了一种探针载体，在该载体中，在一长条状柔性基片上， 多种探针固定在不同的区域，每一区域有一种探针，基片的长度与宽度之 比至少大约为5∶1、至少为50∶1、至少为500∶1、至少为10,000∶1或者至少 为100,000∶1。在一实施方案中，每一含有探针的区域的长度不超过1000 微米，在另一实施方案中，每一含有探针的区域的长度不超过500微米， 在又一实施方案中，每一含有探针的区域的长度不超过100微米，在另一 实施方案中，每一含有探针的区域的长度不超过50微米，在又一实施方案 中，每一含有探针的区域的长度不超过20微米。
本发明还提供了一种探针载体，在该载体中，在一柔性基片上，多种 探针固定在不同的区域，每一区域有一种探针，基片的长度与宽度之比至 少大约为5∶1，其中基片具有表面层，而且这些探针固定在层表面上。另一 方面，本发明在第一层和所述基片之间还有第二层。在一实施方案中，第 一层包含硅石，而第二层包含一种金属材料。
本发明还提供了以一个行列的形式固定在柔性基片表面上的线性一维 探针排列，其中探针的线性密度为每线性厘米超过10种探针，或者优选的 是每线性厘米为50种探针。本发明的另一方面是，探针的线性密度为每线 性厘米超过100种探针，本发明的又一方面是，探针的线性密度为每线性 厘米超过200种探针，本发明的再一方面是，探针的线性密度为每线性厘 米超过500种探针。
另外，本发明提供了多种固定在柔性带形基片表面的不同区域上的探 针，每一区域有一种探针，其中该带的厚度不超过500微米。本发明的另 一方面是，该带的厚度不超过100微米，又一方面，该带的厚度不超过20 微米。
本发明还提供了多种固定在柔性纤维基片表面的不同区域上的探针， 每一区域有一种探针，其中纤维的直径不超过500微米。本发明的另一方 面是，纤维的直径不超过200微米，又一方面，纤维的直径不超过100微 米，再一方面，纤维的直径不超过20微米。
本发明的所有上述方面还包括传送有关第一组探针信息的第一标记物 和传送有关第二组探针信息的第二标记物。在一些实施方案中，这些标记 物是光学标记物例如光学条形码或荧光标记物，在另一实施方案中，这些 标记物可以是磁性的。在包括标记物的一个实施方案中，探针是多核苷酸， 在包括标记物的另一个实施方案中，探针是多肽，在包括标记物的又一个 实施方案中，探针是抗体，在包括标记物的另一个实施方案中，探针选自 细胞表面受体、寡糖、多糖和脂质。
而且，在所有上述实施方案中，无论它们是否包括标记物，该装置都 还包括第一层，并且探针固定在该层上；这层可以是由硅石构成的。或者 是，该装置包括第一层和第二层；第一层可以是硅石，而第二层可以是金 属材料。如果第二层是金属的，那么其还是可磁化的。
在所有上述实施方案中，探针可以点的线性结构或者条(与基片的长 轴具有一个角度)的线性结构来排列。
而且，在所有上述实施方案中，这些探针可以是多核苷酸或者多肽或 者抗体或者配体或者选自细胞表面受体、寡糖、多糖和脂质。如果探针是 多核苷酸，那么它们可以是DNA，而且如果是DNA，那么它们可以是单 链DNA。
用于本发明的基片可以是石英玻璃或者塑料或者金属材料或者聚合 物，并且如果是聚合物，那么该聚合物可以选自聚酰亚胺和聚四氟乙烯。 优选的基片是光学纤维。如果基片是金属材料，那么它还可以在基片与探 针之间有一个层，从而使探针固定在该层上；这一层可以是硅石。而且， 金属基片可以磁化。
本发明可以围绕一个转鼓或者多个转鼓来缠绕。它还可以在一有或无 水平支架上自身缠绕为平螺旋，而且还可以固定到平螺旋中心的一个卷筒 上。另外，在该螺旋中的基片的最外端可以延伸并固定到第二卷筒上。
一个不同方面是，本发明包括一种用于将多种探针液输送到基片上以 便印制探针阵列的装置。一般而言，该装置包括具有多个孔的储存器和一 组毛细管，其中毛细管的布置使得每一毛细管的一端都与储存器内的一个 孔相连，从而孔中的内容物可进入毛细管，而毛细管的另一端排列为平的 单一行列。在该装置的一个实施方案中，储存器是微滴定板上的多个孔。 当使用本发明的这种装置时，通过在储存器与毛细管之间施加一个压差和/ 或在储存器与基片之间提供一个电压，可使探针液从储存器的孔内移动到 毛细管内。毛细管可以平行定位并可穿过长条状探针基片的纵轴，以便将 一排探针沉积到基片上。以下还要更详细描述探针沉积的其它方法。
第二种探针输送装置具有以类似于传送带的方式构成的一排探针容 器。这排容器以一个速度和方向移动，从而与以另一个速度和方向移动的 基片交叉，由此将探针一个挨一个地沉积到基片上。在另一种构型中，这 排探针容器移动，从而与一排移动的由柔性材料束制成的点样器交叉，由 此每一点样器与一个容器交叉，从而将探针从容器输送到点样器。输送机 例如也可以移动基片，从而使基片与携带探针的那排点样器交叉，由此每 一点样器在从容器中拾取探针之后将该探针沉积到基片上。这排点样器可 以构建成一个回路，而且这些点样器在将探针沉积到基片上之后以及在返 回容器之前可以在洗涤站进行洗涤。
本发明还包括若干将探针从流体输送装置沉积到基片表面上的方法。 在一种方法中，将探针在基片上涂成条。该探针可以承载在薄的柔软弹性 点样器上，该点样器以涂刷运动接触基片表面，以便涂画该条带。在一实 施方案中，该点样器可以是石英毛细管或纤维。另外地，毛细管或纤维可 以由其它材料诸如能够输送含有探针的流体的金属、陶瓷、聚合物或者其 它材料制成。在其它方法中，这些探针作为多个条或点以非接触的方式来 沉积。这些方法包括磁的、电的、热的、声的和喷墨沉积。在磁沉积法中， 探针附着在磁珠上。当携带固定在磁珠上的探针的点样器与基片交叉时， 放置在基片下面的电磁体被激活。由电磁体产生的磁场将探针从流体输送 装置中吸引出来，从而将探针沉积到基片的表面上。在电沉积方法中，将 适当极性的电压施加到基片与传送装置之间，以建立一个电场，从而将带 电荷的探针(例如寡核苷酸)推到基片表面上。在热沉积方法中，将快速 局部加热引入流体通路中，从而产生快速的局部体积膨胀(气泡)将探针 液推到基片上。可以利用电阻加热线以电的方式或者利用合适的激光以光 的方式来引入快速加热。在声沉积法中，将超声脉冲引入到探针液中，从 而将液滴推到基片表面上。在喷墨沉积法中，在探针液容器中建立一压电 调节器。该压电调节器被电压信号激活，可快速减小容器的体积，由此将 探针推到基片表面上。
在另一替换方法中，利用探针沉积装置可实现将探针以条的形式涂在 基片上，在该装置中将纤维矩阵浸渍到储存器的对应矩阵内，每一储存器 都含有探针，然后纤维矩阵移动穿过基片的第一部分，并且纤维与基片的 位置使得每一纤维沉积一条横穿基片的分离的探针线，而所需的基片在线 与线之间。在该方法中，纤维矩阵可以洗涤并浸渍到储存器的另一矩阵内， 然后移动穿过基片的另一部分，从而沉积另一组探针条。
在所有的上述方法中，基片可以是平行排列的多个纤维，从而几个纤 维利用探针沉积装置的一个通路来接收探针，或者该基片可以是条带，其 中，在探针沉积之后，该条带可沿其长轴进行光学上的切割，从而产生多 个携带探针的条带。
在所有的上述方法中，这些探针可以共价键接到基片上。
在所有的上述方法中，还可包括将标记物施加到基片上的步骤。
在其它因素中，本发明是基于这样的技术发现：即，在柔性基片上具 有一维探针构型的探针载体提供了一种鉴定样品中靶分子存在的简便、经 济、可靠且分类特异的方式。而且，在本发明探针载体上的探针不受尺寸 限制。通过本文的讨论，本发明的这些技术发现和优点以及其它特征都是 显而易见的。
本发明包括一种新的改善与靶物杂交或与靶物反应的效率的方式。该 方法包括移动探针载体使之穿过样品液，从而增强了固定在载体上的探针 与样品液中其靶分子混合的机会。载体可以采用各种形式，这些形式包括 细线、条带、片、旋管、转鼓或针。该运动形式包括探针载体的平移、转 动或振动，既可是单独一种运动形式也可以是几种运动形式的联合。
本发明还包括杂交设备的几种设计，其中将探针载体插入含有样品液 的室内。使探针载体与室内壁之间的缝隙最小，以减小样品液的体积。驱 动探针载体，使之在室内移动，从而改善了探针/靶物相互作用的效率。增 强杂交的另一种方法包括在探针载体与杂交室的壁之间施加一个电压。在 一极，电场将靶分子向载体上的探针处吸引，从而增大了靶分子的局部浓 度并改善了杂交的可能性。在相反极，电场将靶分子从探针处排斥开，从 而有助于增大杂交的特异性。通过以适当的频率改变极性，可以提高靶物 与探针之间的杂交效率。
本发明可用于公知的点突变分析、表达分析、基因组指纹分析、多态 性分析、连锁分析、mRNAs和mRNA群体的鉴定、序列测定、序列确证、 疾病诊断以及本领域技术人员显而易见的其它应用中。
附图简述
图1示出了探针载体的一个实施方案，其中探针以点的形式被固定在 基片上，载体还携带光学条形码形式的标记物。探针还可以多个条或多排 点的形式来固定，而标记物可以是光学的、磁的或任何其它可鉴定标记；
图2a是探针-载体的剖面图，其中探针被固定在载体的凹槽内；图 2b是探针-载体的两个层的剖面图，其中探针被固定在载体的凹槽内，并 且该图阐述了凹槽中固定的探针位置是如何使其避免与下一层发生摩擦 的。
图3示出了制造探针载体的装置和方法，其中多个管将探针从储存器 运送到基片并以条的形式将探针“涂”在基片上。
图4示意性表示出一种制造探针载体的方法，其中分立的探针容器穿 过一个或多个基片并且在每个探针容器经过基片上时将探针沉积到基片 上。
图5示出了可用于前述制造技术中的多种类型的探针容器，以及每种 探针容器用于将探针从载体沉积到基片上的装置。
图6a-6e示出了制造探针载体的多种方法。图6a示出了其中探针以液 体形式包含在各个储存器内的一种制造探针载体的方法。图6b示出了一种 制造探针载体的方法，其中具有多个点样器的移动带与储存器交叉，从而 每一点样器都拾取一种分离的探针。图6c示出了一种制造探针载体的方 法，其中具有多个结合有探针的点样器的移动带与一个或多个基片交相并 将探针沉积到其上。图6d示出了一种制造探针载体的方法，其中可将多个 点样器排列成一个连续的回路，在该回路中各个点样器可被洗涤并重新用 于点样由储存器阵列提供的新探针。图6e绘出了一种将探针从储存器转移 到点样器的方法。在这种结构中，点样器在基片下面移动并且将基片表面 面朝下定位，从而使点样器从基片的下面沉积探针。
图7a和7b示出了构造探针载体的另一种方法，其中点样器的矩阵浸 渍到孔的相应矩阵内，矩阵中的每个孔都含有一种探针，其次点样器矩阵 以每一点样器沉积一条分离的线的角度刷过一个或多个基片，然后点样器 阵列可被洗涤并移动到一个新的含有多个孔的探针矩阵中，并在基片的一 个新的截面部分上重复浸渍-涂刷-洗涤这一循环操作。
图8示出了探针载体针和探针载体棒的构造。
图9示出了探针载体针和探针载体棒的制造方法。
图10a是旋管构型的柔性探针载体的俯视图。图10b是旋管构型的柔 性探针载体的侧视图。图10c是探针-载体细线的两个相邻线圈的剖面图， 其中探针固定在载体上的凹槽内。
图11a示出了包装在小型盒内的卷筒结构的柔性探针载体。图11b是 卷筒形式的探针-载体的两个层的剖面图，其中探针固定在载体上的凹槽 内，该图示出了凹槽内固定的探针位置是如何使其避免与下一层摩擦的。
图12示出了一种利用电场控制探针载体杂交的方法。
图13示出了一种探针载体针杂交的方法。
图14示出了一种利用探针载体针对标准微滴定板上的多个靶样品进 行平行杂交的方法。
图15是沿棒的长轴所观察到的用于探针载体棒的杂交设备的视图。
图16是用于探针载体旋管的杂交设备的侧视图。
图17a和17b示出了用于探针载体卷筒的杂交设备。
图18示出了用于扫描探针载体针或探针载体棒的读取仪。
图19示出了用于扫描探针载体旋管的读取仪。
图20示出了用于扫描探针载体卷筒的读取仪。 发明详述
1、探针载体装置
A一般描述
利用一维探针阵列能够容易地进行微阵列的扫描和成像，这是因为这 样的阵列无需二维成像所需的高精度。在以下文献中可找到利用结合到光 学纤维上的多核苷酸的许多装置：“核酸生物传感器诊断法”Krull等人， WO#98/58079和WO#95/26416；“用于选择性检测混合流体样品中的寡 核苷酸样本的纤维光学生物传感器”Walt等人，WO#98/50782；“用于检 测和测定特异性序列化核酸的分析方法”Sutherland等人，EP#0245206； “基因探针生物传感器方法”Squirrel，WO#93/06241；“核酸测定方法” Hirschfield，US 5,242,797；Piunno等人，用于荧光核酸测定的纤维光学 DNA传感器，分析化学(Anal.Chem.)67：2635-2643，1995；Uddin等人， 用于荧光检测三螺旋DNA的纤维光学生物传感器，核酸研究(Nucleic Acids.Res.)25：4139-4146，1997；Abel等人，用于检测寡核苷酸的光学纤 维渐消波生物传感器，分析化学68：2905-2912，1996；Kleinjung等人，用于 特异性测定飞摩尔的DNA寡聚体的纤维光学基因传感器，分析化学学报 (Anal.Chim.Acta)150：51-58，1997；Zhang等人，用于检测DNA杂交的 化学发光纤维光学生物传感器，分析通讯(Anal.Lett.)32：2725-2736，1999； Ferguson等人，用于分析基因表达的纤维光学DNA生物传感器微阵列， 自然生物技术(Nature Biotech.)，14：1681-1684，1996。
然而，这些装置一般包括仅仅将一种探针分子序列附着到单个光学纤 维的玻璃表面上。Krull等人(WO#98/58079)业已建立了使用多于一种 探针类型的未示差混合物的理论，然而，探针分子的无组织分布明显限制 了这些技术中的不同探针序列的数目，探针分子的无组织分布需要每一单 个探针分子由例如荧光标记物来标记(正如Krull等人所建议的)，以便 鉴定该探针分子并将它与其本位的相邻物(可以是具有不同序列的探针) 区分开。另外，以前的方法仅仅使用了短的纤维(几厘米或更少)，从而 限定了能够固定的探针的数目和种类。最后，以前的这些技术利用其上固 定有探针的光学纤维，将光传导给杂交标记物(一般为荧光团)或者传导 来自杂交标记物的光。该检测技术依赖于来自光学纤维的渐消发光，而该 发光固有地局限于与纤维表面紧紧相邻的区域，因此不能辨别多组探针并 在灵敏度上受到限制。而且，利用光学纤维本身来激发和发射光线限制了 单独利用光学纤维作为其上固定有探针的基片，并且阻碍使用其它基片例 如金属线或聚合物，而这些基片具有其它优点诸如承载有关各个探针或探 针组的信息的能力，以及杂交方面的优点。
与所建立的DNA探针在平片上形成二维点矩阵的“基因芯片”技术 不同，“探针载体细线”沿一定长度的薄柔性细线以一维阵列的形式固定 探针。探针载体细线系统由以下三个基本要素构成：探针载体细线的构造 和制造、杂交和读取。通过利用探针载体针、探针载体棒、探针载体旋管 和探针载体卷筒技术而改进的探针载体细线的包装，增大了探针的密度并 增强了探针载体细线技术的固有优点。本文所用的“柔性”，是指能够弯 曲、缠绕、盘绕或者另外弯曲到本发明的操作所需的程度而不会折断。
如图1所示，在本发明的一个实施方案中，探针作为长而薄的柔性基 片(100)中心处的多个点(110)或者作为贯穿基片(100)宽度的窄条(参 见图4，404)来固定。或者是，探针可作为若干连续行列的点来固定，所 述行列与基片的长轴呈一角度。基片的长度与宽度的比例至少大约为5∶1， 优选的是至少为50∶1，更优选的是至少为500∶1，最优选的是至少为 10,000∶1。基片含有探针的部分的长度与宽度的比例至少大约为5∶1，优选 的是至少为50∶1，更优选的是至少为500∶1，最优选的是至少为10,000∶1。 这些长度与宽度的比例、基片的柔性以及探针以一维或者近似一维的排列 来定位的特点使得制造、使用和分析探针载体的方法新颖而简便。
本文所用的“一种探针”是能够与特定样品或部分样品发生特异性结 合或特异性反应的一种分子或一种分子结构的一组拷贝。该组可含有任何 数目的分子或多分子结构拷贝。本文所用的“多种探针”是指多于一种的 这样的分子或多分子结构系列。这些分子或多分子结构可以是多核苷酸、 多肽、寡糖、多糖、抗体、细胞受体、配体、脂质、细胞、小分子(在筛 分药物中诸如用来筛分药)或者这些结构的组合，或者任一与感兴趣的样 品或感兴趣的部分样品特异性结合或反应的其它结构。这些探针可以通过 共价或非共价附着的方式固定到基片上。本文所用的“柔性”是指能够弯 曲、缠绕、盘绕或者另外弯曲到本发明的操作所需的程度而不会折断。基 片的“宽度”被定义为整个包含在基片内的与基片的长轴垂直的最长长度。 含有探针的圆柱形部分诸如细线基片的“宽度”被定义为与基片的含有探 针的部分的长轴垂直的、包含在基片的含有探针的部分内的最长弧的线性 距离。基片的含有探针的部分的长度是沿基片的长轴从基片上多种探针的 第一种探针到最后一种探针的线性距离，或者，如果在形成探针组的探针 之间具有相当大的间隔，那么长度是这组探针中的第一种探针到最后一种 探针的线性距离。
与排列在平面上的常规二维微阵列一样，本发明的装置用于通过以下 步骤来分析样品：1)首先，将已经同样品或样品片段结合或反应的探针与 没有结合样品的探针区分开，然后2)鉴定已经结合样品的那些探针。
鉴定探针的其它方式是利用能够鉴定单种探针或探针组的标记物。这 样的标记物可用来传送更多的信息，而不单单是鉴定探针。
探针载体的这种长、薄且具柔性的性质使其本身适合于许多新的负载 方式和用途。可以许多形式来包装探针载体，这些形式包括(但不限于)： 针、棒、旋管和卷筒。由于只需要极少的杂交液并加强了混合，因此显著 增强了杂交方法。以卷筒形式包装的柔性探针在需要大体积、低至中等规 模的微阵列的应用中特别有优势，诸如大医院的疾病诊断和治疗中所涉及 的那些。在这些应用中，阵列中所需的探针数目较少(在几百到几千的范 围内)，但是每天可消耗相当多的同一类型的阵列。利用这种柔性探针载 体形式，相同的若干组探针的数万个拷贝沿细线的连续长度重复排列并密 封在一个大旋管或卷筒内。完全自动化的系统使用与分析过程的每一阶段 的设备(诸如杂交站和扫描仪)一体化。该机器在整个过程中以完全自动 化的方式吸入病人的DNA样品、传送给柔性探针载体并产生分析结果， 而无需人工介入。
B具体描述
1.1基片
本发明的基片可由不同材料制成。基片的要求是，其具有足够的柔性 来承受该装置的制造和使用中所需的结构变化，并且其能够固定待使用的 特定探针或者能够变型(例如，通过涂布)，以便能够进行这样的固定。 基片还可包括由不同材料制成的不同的层，每一层在该装置中都具有功能。
具体的实施方案需要不同程度的柔性。可通过承受缠绕到某一直径(例 如，10cm、5cm、2cm、1cm、0.5cm或0.1cm的直径)的能力来测量柔性。 用于本发明基片的优选材料是石英玻璃、金属材料、塑料以及强度足以承 受制造和使用过程的聚合物。
为了固定多核苷酸和多肽，硅石即纯玻璃是优选的材料，这是因为多 核苷酸和多肽能够共价附着到处理过的玻璃表面上，并且硅石发出最小的 荧光噪音信号。硅石可以是在另一种材料上的一层，或者可以是该装置的 核心或基层材料基片，或者二者兼具。本发明的一个实施方案包括利用金 属线作为核心基片，而在其上涂布有用于固定探针的硅石。另一实施方案 包括利用塑料或聚合物带作为基层基片，而在其上涂布用于固定探针的硅 石。在该实施方案中，可加入另一金属材料层，该层既可在带的与硅石层 相反的那一面，也可夹在硅石层与聚合物或塑料之间。本发明的又一实施 方案是，在硅石核上具有一层金属材料而在金属材料上又有另一硅石层的 硅石纤维；探针可固定在外面的硅石层上。
光学纤维。探针载体细线可由不同材料制成。优选的材料是硅石，这 是因为DNA可共价附着到处理过的玻璃表面上并且硅石发出最小的荧光 噪音。与玻璃是硬性易破碎的材料这一常见认识相反，由硅石制成的纤维 是柔性的并具有较大的弹性强度。例如，目前大规模生产的用于无线电通 讯产业的光学纤维就是由硅石制成的。光学纤维是主要由硅石制成的基片 材料并满足所必需的要求。虽然这样的纤维是为了传输光的目的制造的， 但是本发明并不需要纤维的这个性质(虽然该性质在一些实施方案中用 到)。相反地，是光学纤维的其它性质使其对于本发明具有特别的优越性。 测得的光学纤维的机械强度为7Gpa，大约为最强的钢的4倍，而重量仅为 这种钢的1/6。光学纤维还具有高度柔性。标准的125μm直径的纤维可旋 绕成5mm以下直径的回路而不会折断。
而且，制造光学纤维的过程使其本身可按规格改制，特别是按纤维的 截面形状而改制。光学纤维是由预制件制成的，预制件一般长为1米、直 径为3厘米并且用硅石制造。预制件的中心部分掺杂有锗，从而产生引导 光穿过的具有较高折射率的核芯。然后将预制件安装到清洁室内环境中的 纤维牵引塔上，后者将预制件加热到熔点并将纤维拉出到一个大的转鼓上。 纤维的截面形状一般酷似预制件的截面形状，并且可利用抽拉速度来控制 纤维的直径。市场上的大部分光学纤维都具有环形截面并且外径为125μ m。然而，其它直径和形状特别是“D”截面形状也是有用的。如果为了储 存和易于使用，最终形成的探针载体围绕自身进行缠绕，那么这种形状尤 其有用。如图2a所示，可利用具凹槽的D形预制件来调节纤维的截面， 从而纤维(200)具有其内可固定探针(110)的凹槽或沟槽(202)。这种 设计避免一层的探针与后续层的基片发生摩擦(如图2b所示)，其中两个 连续层的截面所表示出的是，一个在另一个的顶部。
另外，由于材料的高纯度和制造过程的细心控制，光学纤维几乎没有 结构缺陷。而且，光学纤维具有完美的尺寸精度。直径被控制在±1μm之 内。最后，光学纤维的成本非常低，大约为1-2美金/米。这是因为纤维 的制造过程相当地简单明了并且一个预制件能够产生高达100千米的标准 无线通讯纤维。
采用结合到光学纤维上的多核苷酸的许多装置在以下文献中都有所描 述：“核酸生物传感器诊断法”Krull等人，WO#98/58079和WO# 95/26416；“用于选择性检测混合流体样品中的寡核苷酸样本的纤维光学生 物传感器”Walt等人，WO#98/50782；“用于检测和测定特异性序列化核 酸的分析方法”Sutherland等人，EP#0245206；“基因探针生物传感器方 法”Squirrel，WO#93/06241；“核酸测定方法”Hirschfield，US 5,242,797； Piunno等人，用于荧光核酸测定的纤维光学DNA传感器，分析化学 67：2635-2643，1995；Uddin等人，用于荧光检测三螺旋DNA的纤维光学生 物传感器，核酸研究25：4139-4146，1997；Abel等人，用于检测寡核苷酸的 纤维光学渐消波生物传感器，分析化学68：2905-2912，1996；Kleinjung等 人，用于特异性测定飞摩尔的DNA寡聚体的纤维光学基因传感器，分析 化学学报150：51-58，1997；Zhang等人，用于检测DNA杂交的化学发光纤 维光学生物传感器，分析通讯32：2725-2736，1999；Ferguson等人，用于分 析基因表达的纤维光学DNA生物传感器微阵列，自然生物技术 14：1681-1684，1996。
这些装置一般包括仅仅将一种探针分子序列附着到单个光学纤维的玻 璃表面上，从而大大限制了它们的使用价值。以前的方法只使用纤维的短 短一部分(几厘米或者更少)，因此限制了能够固定的探针的数目和种类。 最后，以前的技术采用其上固定有探针的光学纤维将光传导给杂交标记物 (一般为荧光团)或者传导来自杂交标记物的光。该检测技术依赖于来自 光学纤维的渐消发光，而该发光固有地局限于与纤维表面紧紧相邻的区域， 因此不能辨别多组探针并在灵敏度上受到限制。而且，利用光学纤维本身 来激发和发射光线限制了单独利用光学纤维作为其上固定有探针的基片， 并且阻碍使用其它基片例如金属线或聚合物，而这些基片具有其它优点诸 如承载有关各个探针或探针组的信息的能力，以及杂交的优点(如下所述)。
商业上的无线电通讯纤维涂布有一层无孔聚合物，这对于探针固定不 是最佳的。可利用本领域公知的技术(诸如US专利5,948,202中所描述的 那些技术，该文献在此全部并入本文作为参考)来去除这个涂层。然而， 没有该涂层的裸露纤维易于受到水蒸气的攻击，从而在纤维表面产生微裂 纹并使其强度降解。结果，裸露的硅石纤维可能经受不住杂交阶段非常恶 劣的环境。有几种解决这个问题的方法。
一种方法是在探针固定之后沿长条状圆柱或转鼓将纤维缠绕成螺状旋 管。纤维并排就位于转鼓上并附着到其固相表面上。探针沿纤维的一侧排 列，该侧远离附着到转鼓上的纤维的那一侧。转鼓在样品的杂交和杂交模 式的检测过程中为纤维提供机械支撑。
第二种方法是通过将一个或若干个涂层施加到硅石纤维上而增大了该 纤维的强度，从而避免纤维被水蒸气损坏并同时保持良好地结合探针。然 后强化纤维可以缠绕在例如一个专门设计的卷筒上并装入密封盒内以便运 输和操纵。基片强化方法的一个例子是用金属材料涂布纤维，然后添加一 个硅石层。为了避免裸露的硅石纤维吸入潮气，可添加一个或多个气密层。 适宜的涂布材料包括金、银和钛，这是由于这些金属在化学溶液中具有相 当的惰性。在纤维光学无线通讯产业中还广泛地使用碳涂料，以进行气密 密封。本发明在一个实施方案中还提供了在气密层之上的另外一个硅石涂 层，以便与DNA探针共价结合。通过低成本的溶胶-凝胶过程可形成这 样的涂层，并且该涂层提供了一个用于固定探针特别是通过共价结合固定 探针的表面。
除了硅石以外，其它材料也可用作基片的主体。其包括薄金属线或强 聚合物(例如聚酰亚胺或聚四氟乙烯(PTFE))带。再者，溶胶-凝胶硅 石涂层可施加到基片上，以便易于结合探针。对于聚合物带形基片，可以 在带与硅石之间施加一层金属材料。
以上所述的所有基片设计中的金属材料部分不仅保护和/或强化基片， 而且在探针载体的制造过程中以及在结合带电荷样品的过程中还具有其它 益处(以下将有所描述)。
基片是长条状的。本文所用的“长条状”是指，基片的长度与宽度的 比例超过大约5∶1，优选的是超过100∶1，更优选的是超过1000∶1，最优选 的是超过10,000∶1。认为长度∶宽度之比可以更大，如至少100,000∶1或至 少1,000,000∶1。正如以上所定义的，基片的“宽度”是指整个包含在基片 内的与基片长轴垂直的最长长度。如果基片具有不同的宽度，那么用于计 算长度与宽度的比例的宽度是最长的宽度。基片的含有探针的部分的“宽 度”是指最长的弧度(对于含有探针的弧形区域来说，正如通常在类似于 圆柱形螺旋的基片中所见到的)或者平面基片的大线性距离，其包含在基 片的含有探针的部分内并与基片的含有探针的部分的长轴垂直。基片的“长 度”是指基片长轴的长度。如果基片具有多于一个的长度，那么利用这些 长度中的最短长度来计算长度与宽度的比例。
基片的截面可以是任何形状。本文所用的“截面”是指穿过基片、与 基片的长轴垂直的平面部分。虽然截面可以是任何形状，但是有两种特定 形状代表了本发明的不同实施方案。首先，本文所用的“带”是指应用带 状、条状或片状基片的实施方案，其截面是长条状或近似于长条状或者是 平行四边形的。这样的带将具有与截面区域的宽度对应的厚度。在本发明 的不同实施方案中，该厚度不超过500微米，或者不超过100微米，或者 不超过50微米，或者不超过20微米。其次，本文所用的“纤维”是指应 用纤维状、细线状或丝线状基片的实施方案，其截面是圆形的。截面可以 是环形、椭圆形或部分环形，例如纤维具有D形截面。该截面具有一直径， 该直径在本文中是指截面的最长线性尺寸。在本发明的多个实施方案中， 纤维的直径不超过500微米，或者不超过200微米，或者不超过100微米， 或者不超过50微米，或者不超过20微米。术语“带”和“纤维”指代表 截面形状范围中的两个部分。然而，本发明可具有任何形状的截面。基片 可具有大约与纤维长轴平行运行的一个或多个凹槽，而探针固定在这些沟 槽内(如图2a所示)。这样的沟槽在截面上被看成一个凹槽。利用这样的 沟槽或凹槽可减小或消除固定在沟槽内的探针与其它表面之间的摩擦；例 如，当基片围绕自身缠绕成螺旋形时，固定在一个绕组上的探针由于凹入 沟槽内而避免与下一绕组上的基片接触。具有这种凹槽的D形截面易于将 一层绕组堆积在下一层上，并保护探针。其它实施方案可采用不同的截面， 这些截面在使用本装置时是有用的并且对于本领域的技术人员是显而易见 的。
1.2.探针
本文所用的“探针”是能够与特定样品或部分样品特异性结合的一种 分子或多分子结构的一组拷贝。本文所用的“多种探针”是指多于这样一 组分子的结构。利用共价或非共价附着法可以将探针固定到基片上。探针 可以是多核苷酸、多肽、寡糖、多糖、抗体、细胞受体、配体、脂质、细 胞或这些结构的组合，或者是任一与感兴趣的样品或感兴趣的部分样品特 异性结合的其它结构。这组探针的选择取决于该装置的用途。例如，如果 该装置用多核苷酸作为探针，那么如果进行的是序列分析，则优选一整组 或接近整组的n个核苷酸；美国专利US 5,700,637和6,054,270中较充分描 述了这些探针组的用途，这两篇专利在此全部并入本文作为参考。另一方 面，如果利用装置来分析基因或基因组中的突变或多态性，那么对于感兴 趣的特定基因或多个基因中，探针优选代表一完整突变组或所选择的突变 组(突变例如替换、缺失以及插入突变)的多核苷酸。作为另一个例子， 在诸如癌症相关的突变诊断中，已知与某一种癌症或几种癌症相关的一组 基因中的特定突变“热点”，是其互补多核苷酸用作探针组的区域。这些 例子仅仅示出了为特定装置所选的不同定制组的探针，并集中在多核苷酸， 这是由于这些是现在最常用的探针种类；应该理解，其它种类的探针和其 它多核苷酸组对于本领域的技术人员来说也是显而易见的。
本文所周的“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，这些核 苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。本文所用的术 语“多核苷酸”和“核苷酸”可以互换使用。多核苷酸可具有任何三维结 构并且可以实施已知或未知的任何功能。术语“多核苷酸”包括双链或单 链的以及三螺旋分子。除非另外专指或需要，否则本文所述的包括多核苷 酸的本发明的任何实施方案均包含双链形式和已知或预测构成双链形式的 两个互补单链形式中的每一种。相对短的多核苷酸(少于大约100个核苷 酸)还可称作寡核苷酸。
以下是多核苷酸的非限定性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、 mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、 质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针以 及引物。多核苷酸可包括修饰核苷酸例如甲基化核苷酸以及核苷酸类似物。 嘌呤和嘧啶的类似物在本领域内是公知的，包括(但不限于)：吖丙啶基 胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基 -2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、 1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2 -二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5- 甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、5-戊炔尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。利用尿 嘧啶来取代脱氧核糖核酸中的胸腺嘧啶，也被认为是嘧啶的类似物形式。
如果存在的话，在装配聚合物之前或之后进行核苷酸结构的修饰。可 利用非核苷酸成分来中断核苷酸的序列。在聚合之后诸如通过与标记成分 结合还可以进一步修饰多核苷酸。该定义中所包括的其它类型的修饰为， 例如“帽结构”、将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替换、核苷酸 间修饰例如具有不带电荷键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、膦酰胺化物、 氨基甲酸酯等)的那些修饰以及具有电荷键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等)的那些修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些修饰、 含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰、含 有烷基化物的那些修饰、具有修饰键(例如α-端基异构核酸等)的那些 修饰，以及多核苷酸的未修饰形式。
另外，通常存在于糖中的任何羟基都可被膦酸酯基团、磷酸酯基团所 取代，或者被标准的保护基团所保护，或者被激活从而又与其它核苷酸或 固相支持体键合。5’和3’端OH基可以被磷酸化或用胺或1-20个碳原子 的有机封端基团部分来取代。其它羟基也可被衍生成标准的保护基团。
多核苷酸还含有本领域内通常所公知的核糖或脱氧核糖的类似物形 式，其包括(但不限于)2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-氟或2’-叠 氮-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖诸如阿拉伯糖、 木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类 似物(例如甲基核苷)。正如以上所指出的，一个或多个磷酸二酯键可被 替代连接基团所取代。这些替代连接基团包括(但不限于)这样一些实施 方案，在这些实施方案中，磷酸酯被P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫 代”)、(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲 酰化”)所取代，其中每个R或R’各自为H或任选地含有醚(-O-)键的取 代或未取代烷基(1-20个碳)、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或环氧 基。并不是多核苷酸中的所有键都必需相同。糖、嘌呤和嘧啶的类似物形 式的取代在设计最终产物时是有益处的，例如可替换像聚酰胺主链这样的 主链结构。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使 用，是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可是线性的或者分支的，它 可包括修饰氨基酸并可被非氨基酸中断。这些术语还包含已经天然或者间 插修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、类脂化、乙酰化、 磷酸化或任何其它操作或修饰(诸如与标记成分结合)。该定义内还包括 的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然的氨基酸等)的 多肽，以及本领域内公知的其它修饰。多肽可以单链或缔合链存在。
本文所用的“配体”是与特异受体结合的分子。该受体可以是细胞受 体或者是另一分子的一部分，例如酶别构改性剂的受体。配体的例子包括 (但不限于)酶辅因子、底物和抑制剂、酶的别构改性剂、细胞膜受体、 毒素和毒液的激动剂和拮抗剂、病毒表位、半抗原、激素、凝集素和药物 (例如鸦片制剂和类固醇)。
本文所用的“细胞受体”是细胞分子，其通常既可以位于胞内也可以 与细胞膜相连，并且对于给定的配体具有亲和性。这些细胞受体的例子包 括(但不限于)激素受体、细胞转运蛋白、细胞因子受体和神经递质受体。
1.3.探针的固定
利用任何可获得的方式将本发明的寡核苷酸探针添加、固定、提供和/ 或施加到固相支持体的表面上，从而将寡核苷酸固定、定位、提供和/或施 加到固相支持体上的某一部位。利用喷墨印刷法(US 4,877,745)、照相平 版印刷术(参见US专利号5,919,523、5,837,832、5,831,070、5,770,722和 5,593,839)、丝印法、胶版印刷法、击打法、利用x-y单元和光栅技术使 用微量移液管的机械施加法、或者在放置结合成分时可提供所需的准确度 和空间分离程度的任何其它方法，将不同样本放置到特定的位点上。
正如在Southern等人的(US专利号5,770,367、5,700,637和5,436,327)、 Pirrung等人的(US专利号5,143,854)、Fodor等人的(US专利号5,744,305 和5,800,992)以及Winkler等人的(US专利号5,384,261)中所描述的， 组合阵列法业已成功地用于需要短序列聚合物的情形中。在这些“基因芯 片”中，寡核苷酸探针(20-25个核苷酸)或者肽核酸(PNAs)的制备 既可在微阵列制造过程中原位产生，也可利用传统方法脱机并点到微阵列 上。Fodor等人的US专利号5,445,934和5,744,305描述了含有多个序列 的基片(密度为每平方厘米含有400个或更多的不同探针)的制造过程。 利用固相化学和照相平版印刷术来合成这些芯片。这些组合方法产生了明 显的生物和化学多样性，但是却不能构建大的高分子的微阵列并且实施起 来也比较昂贵和困难。
利用喷墨分配器设备将小滴液体沉积在固相基片上。以下文献中已经 记载利用这样的技术制造生物和化学阵列：Brennan(US专利号5,474,796)、 Tisone(US专利号5,741,554)和Hayes等人(US专利号5,658,802)。这些非 接触技术不能轻而易举地排列大量样品，也不能控制最终获得的微阵列的 质量。
正如在Augenlicht(US专利号4,981,783)、Drmanac等人的(US 专利号5,525,464)、Roach等人的(US专利号5,770,151)、Brown等人 的(US专利号5,807,522)和Shalon等人的(US专利号6,110,426)中所描 述的，第三类列阵设备利用直接表面接触印刷术来工作。在这种形式中， 探针是长的互补DNAs(cDNAs)(500-5000碱基长)，其是在固定之前 利用传统方法合成的。这些技术作为基于套管轴的点样器所存在的缺陷是， 不能精确地摄取和分配样品并且缺乏耐用性。
Martinsky等人(US专利号6,101,946)描述了一种电子放电机(EDM) 的应用，该机器可固定到用于精确和自动进行三维运动的运动控制系统上。 如Brown和Shalon的US专利号5,807,522(1998)所述，寡核苷酸引物也 可以施加到固相支持体上。另外，利用机器人系统(诸如由Genetic MicroSystems(Woburn，MA)、GeneMachines(San Carlos，CA)或Cartesian Technologies(Irvine，CA)制造的机器人系统)可以将引物施加到固相支持 体上。
可以利用各种方法将寡核苷酸结合到固相基片上。通过采用可发生化 学反应的固相基片，可以提供存在于核酸上的化学反应基团，该基团将与 化学活性固相基片表面发生反应。可以形成硅酯，以便将核酸共价键合到 表面上。可利用有机加聚物(例如苯乙烯、丙烯酸酯和异丁烯酸酯、乙烯 醚和酯等)来代替硅石的官能度，其中所存在的官能度可以与核酸上存在 的官能度反应。还可按照常规方式提供氨基、活性卤化物、羧基、硫醇基、 环氧化物等。这些键可以是酰胺、脒、胺、酯、醚、硫醚、二硫醚等。用 于形成这些共价键的方法在US专利号5,565,324以及其中所提到的参考文 献中有所描述。
可以利用引物延伸法或者采用修饰NTPs制备具有用于结合的配体和 序列标志的核酸，其中引物可以具有配体和/或序列标志，修饰dNTPs具 有配体和/或序列标志。对于RNA，可以使用体外转录，即利用噬菌体启 动子(例如T7、T3或SP6)和由DNA编码的序列标志，以及在包括标记 NTP(例如生物素-16-UTP)的NTPs的存在下，分别用T7、T3或SP6 聚合酶进行转录，由此最终得到的RNA在预定位点上具有寡核苷酸序列 标志和相对随机地分布在链中的结合配体。
在本发明中，探针可以在基片上原位合成或者先制备然后固定到基片 上。对于多核苷酸，该技术在US专利号5,419,966中已经有所描述，该文 献在此作为参考并入本文。或者是，可以用分段的方式从单个的单体或者 较小的多核苷酸或其它亚单位来合成多聚探针(诸如多核苷酸)。优选的 是，探针被固定在基片的不同区域。另外，一个特定区域中固定有多于一 种的探针，而通过诸如利用不同颜色的荧光标志进行差异标记，将一种特 定类型的单一探针分子与其它探针分子区分开来。本文所用的“固定”是 指，利用共价或非共价的方式使探针附着到基片上，二者之间的亲和力足 以承受制造、样品结合、样品分析这些步骤，并且如果需要的话，还可以 重新使用。
用于衍生固相支持体以固定多核苷酸和多肽的方法和材料在本领域内 是公知的并且在诸如US专利号5,744,305和5,919,523中有所描述，这两 篇文献在此作为参考全部并入本文。对于非共价附着，优选的方法是利用 生物素-链亲和素结合法，但是能够提供必需的亲和力的任何非共价结合 法都可用于本发明。
除了寡核苷酸或任何其它有机本体以外，还可以使用分子集合体，如 为细胞器(例如细胞核、线粒体、细胞质、脂质体等)或者细胞(原核的 和真核的)的情形。结合成分可以直接结合到固相基片上或者利用一种或 多种中间体间接结合到固相基片上，其中这些中间体用作结合成分与固相 基片之间的桥梁。一般来说，在分子共价结合到固相基片表面上的情形中， 可以利用各种反应官能度来激活基片表面，这取决于结合成分的性质以及 固相基片表面的性质。
例如，可以利用各种方法将寡核苷酸结合到固相基片上。在使用化学 反应固相基片时，可提供一种存在于核酸上的化学反应基团，该基团将与 化学活性固相基片表面发生反应。可以形成硅酯，以便将核酸共价键合到 表面上。可利用有机加聚物(例如苯乙烯、丙烯酸酯和异丁烯酸酯、乙烯 醚和酯等)来代替硅石的官能度，其中有机加聚物所存在的官能度可以与 核酸上存在的官能度反应。还可按照常规方式提供氨基、活性卤化物、羧 基、硫醇基、环氧化物等。键可以是酰胺、脒、胺、酯、醚、硫醚、二硫 醚等。用于形成这些共价键的方法在US专利号5,565,324以及其中所提到 的参考文献中有所描述。
可以用引物延伸法或者采用修饰NTPs制备具有用于结合的配体和序 列标志的核酸，其中引物可以具有配体和/或序列标志，修饰dNTPs具有 配体和/或序列标志。对于RNA，可以使用体外转录，即利用噬菌体启动 子(例如T7、T3或SP6)和由DNA编码的序列标志，以及在包括标记的 NTP(例如生物素-16-UTP)的NTPs的存在下，分别用T7、T3或SP6 聚合酶进行转录，由此最终得到的RNA在预定位点上具有寡核苷酸序列 标志和相对随机地分布在链中的结合配体。
1.4.标记物
通过利用探针或探针组的标记物可以确定每一探针在基片上的位置以 及有关探针和/或探针-样品复合物的其它信息。这些标记物可用于常规的 二维阵列以及本发明的一微结构中。本文所用的“标记物”是指在基片和/ 或探针上、在基片和/或探针中或与基片和/或探针相连的任何可鉴定标记、 排列或其它结构或模式，它们传送与某一探针或探针组有关的信息。一种 类型的标记物是光学的。标记物还可以空间标记物(即基片上探针排的间 隔)和/或条形码、荧光标记物、化学发光标记物或者能够用光检测的任何 其它标记物。另一种类型的标记物是磁标记物。因为基片含有可磁化的金 属元件，所以本发明本身为这样的标记物。这些标记物可以与探针位于基 片的同一侧面上，也可以位于探针所在的基片的另一侧面上，或者可以夹 在中间或掺入基片内部。用于空间标记和/或其它信息的一种方法是用一层 磁薄膜覆盖探针所在的基片的相反侧面。然后在制造过程中利用磁的方式 记录空间或探针鉴定。这种方法的一个重要优点是，在杂交阶段可以把与 靶物有关的其它信息写在基片自身上。并且在扫描阶段，也可以将扫描参 数和其它数字输出值写在同一带上，以便进一步参照。其它类型的标记物 对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
1.5探针组
探针可以成组固定在基片上，每一组具有一些共同的特征。例如，如 果探针是核苷酸，那么需要共同杂交条件的一组核苷酸可以沿基片的某一 长度进行固定，而需要与之不同的杂交条件的另一组可以沿基片的另一长 度进行固定。利用这种方式，每一组探针都可在一组不同的条件下暴露给 样品，从而使样品的结合最佳化。
另外地，单一探针载体可承载不同组的探针，以便诊断不同的疾病。 例如，沿一段载体定位的一组探针用于诊断HIV，而另一组探针用于诊断 疱疹等疾病。另一个例子是，一个载体或载体的一部分专用于HER-2/neu 基因。HER-2基因也称作HER-2/neu和c-erbB2，它在正常细胞生长的 调节中起关键作用，但是在癌的发育过程中，该基因得到扩增。扩增的HER -2基因导致在肿瘤细胞表面上的蛋白质受体过度产生。这些特异性蛋白 质与其它循环生长因子结合，从而导致肿瘤的生长失控。该探针载体含有 HER-2/neu基因及其变体的探针。
在另一实施方案中，探针组是重复的，从而使一个载体可重复用于相 同的测定，而一组新的探针可用于每一后续测定。
1.6装置的结构
探针可以任何结构固定到基片上，这些结构使得能够将已经结合有样 品的探针与那些未结合有样品的探针区分开或者鉴定出来。实现这一点的 最简单方式是，将探针放在不同的区域，每一区域有一种探针。这些区域 可以是多个点(如图1所示)或者多条线(如图4，404所示)。这些区域 可以作为沿基片的长轴或者与之平行的一排来构成。探针可直接附着到基 片上，或者，在另一实施方案中，探针可以先附着到小珠上，然后将小珠 附着到基片上。使探针附着到不同材料的小珠上的方法在本领域内是公知 的并且在诸如WO 99/60170中有所描述，该文献在此作为参考全部并入本 文。另一可能的替代结构是有多排点，从而在给定的一排上含有多种探针。
如图1所示，以位于长而薄的柔性细线基片100中心处的点或者贯穿 基片100的宽度的窄条的形式来固定DNA探针110。通过印在探针组之间 的空间130内的空间标记物和/或条形码120来实现探针的鉴定。或者是， 将这些标记物印在细线基片的另一侧上。如果必要的话，细线100可具有 特定的截面形状。如图2a所示，可调节纤维的截面，以便使纤维200具有 一个凹槽或者沟槽202，而探针110固定在其中。这种设计避免一层的探 针与后续层的基片发生摩擦(如图11B所示)，两个连续层的截面所表示 出的是，一个在另一个的顶部。
探针载体的长而薄以及柔软的特性使其适合于许多新的负载方式、设 置和使用方式。可以许多形式来包装该探针载体，这些形式包括(但不限 于)针、棒、旋管和卷筒。由于只需要很少的杂交液并且增强了混合，因 此相当增强了杂交方法。以卷筒形式包装的柔性探针载体在需要大体积、 低至中等规模的微阵列的应用(诸如与疾病诊断有关的那些应用)中特别 具有优势。在这些应用中，阵列中所需的探针数少(在几百至几千的范围 内)，但是每天却需要消耗相当大量的同一类型的阵列。利用这种柔性探 针载体形式，相同探针组的数万个拷贝沿细线的一个连续长度反复排列并 密封在一个大的旋管或卷筒内。
通过围绕圆筒或管的一部分细线缠绕一定长度的现成的柔性探针载 体，而制备针或棒形包装。在优选实施方案中细线并排地紧紧位于支撑圆 筒的外表面上，并且可利用胶水、粘固剂或其它方式永久地固定到其上。 探针载体针与探针载体棒之间的差别在于尺寸。探针载体针通常具有小于 10mm的直径，而探针载体棒要大些并且可以具有更大的直径，由此可容 纳非常多的探针。例如，1.5米长、50μm直径的细线在缠绕到5mm直径 的探针载体针上之后仅仅占据一个5mm的较短部分，但是假定沿细线具 有100μm的探针空间，其可承载大约15,000个探针。另一方面，30mm宽、 40mm直径的探针载体棒在沿70米长、50μm直径的细线可容纳700,000 个探针。
在一探针载体旋管中，将现成的柔性探针载体细线缠绕到一个平盘形 旋管内。在本发明的一个优选实施方案中，细线上的探针暴露在盘的一侧， 而另一侧利用环氧、粘固剂或其它适宜的方式永久地固定到固相盘形平面 支持体上。任选地，将探针沉积在探针载体细线表面上的凹槽内。可以用 一导电层预先覆盖该平面支持体，以便易于杂交控制。假设50μm直径的 细线，40mm直径的探针载体旋管可容纳高达24米的探针载体细线，承载 240,000个探针。
探针载体卷筒的结构非常类似于探针载体旋管。然而，与探针载体旋 管不同的是，探针载体细线不会永久地附着到支撑表面上，由此为了杂交、 读取或其它目的，可使得细线从卷筒上展开。另外，由于在卷筒内每一圈 细线都堆积在彼此的顶部，因此探针载体细线的截面形状的设计要避免 DNA探针与相邻圈内的探针载体细线发生摩擦。还是如图17所示，可以 制备一个盒，以便保护探针载体卷筒并使其易于缠绕和展开。另外，多个 卷筒可堆积在一个盒内。
2.探针载体的制造
在本文所述的探针沉积技术的某些实施方案中，类似于纤维或带的基 片确实适合连续、高速的大批生产。图3-7示出了制造系统设计的例子。 虽然常规的点样技术可用来产生不同的区域(每一区域含有一种探针)， 但是本发明的一方面是，采用在基片上涂刷或喷涂探针的技术。这样的技 术与基片的实质上一维的性质结合，使其适合制造系统，在这些制造系统 中，可高速并高精度地一次生产相同带或纤维的多个拷贝。
2.1多股刷
图3表示的是这种装置及其制造方法的一个示范实施方案。一种制造 方法(如图3所示)包括将在适当的液体中或者本身就是液体(例如，在 室温下是液体或者在适当的温度下能够液化的脂质)的探针传送到管内， 并且通过相对于基片移动管、同时将探针液从管中驱动到基片上，从而将 探针从管中沉积到基片上。应该理解，这种运动是相对的并且通过移动管 组件、移动基片或者二者都移动来完成的。在沉积过程中，毛细管尖可与 基片表面接触。另外，该尖端可在基片表面之上或之下移动一段较短的距 离。利用非接触沉积方法之一将探针液沉积到基片上。这些方法包括将探 针附着到悬浮在探针液中的磁珠上并将一个电磁体放在基片下面。当毛细 管与基片交叉(毛细管经过基片的邻近处)时该磁体被激活，从而将磁珠 及其相连的探针吸引到基片表面上。另一非接触沉积方法是，将一金属层 覆盖到毛细管的两个端面以及基片表面或者基片下面的支持体上，然后在 毛细管与基片或者基片的支持体之间施加一个高压。所产生的电场将带电 荷的探针(例如寡核苷酸)拉到基片表面上。利用上述两种方法的任一种， 如果电激发信号是一非常短的脉冲，那么探针将作为一个点沉积到基片上。 如果信号代表的是毛细管与基片交叉的大多数时间或者全部时间，那么结 果将是基片上的一个探针条。可以选择条件以确保探针固定到基片上。可 以将多个管合并到一起，从而制成一个能够同时沉积多个探针条的“刷子”。 而且，可以排列多个这样的刷子，以便当不同的刷子相对于基片移动并沉 积探针条时，可以使沉积的探针数目同时或者顺序地成倍增加。另外，如 果基片是纤维，则可以将几个纤维基片放在适当位置以使一个刷子的一划 动作将探针条沉积在所有的基片上。或者是，利用一较宽的带形基片来接 收探针条，然后将该带在纵向上切成多个单独的更薄的带。可以理解，这 样一种制造方法大大地增加了可以同时产生的探针载体的数目，从而增加 了产量并降低了成本。还应该理解，易于采用标准的大批量生产方法(诸 如传送带的使用)以自动实施并控制本文提到的这种制造方法以及其它制 造方法。
在图3中，将一排柔性毛细管300胶粘到标准微滴定板302的每一个 孔下面的一个洞内。毛细管300也可从顶部插入孔内。然后毛细管300排 成一个线性阵列，从而形成“刷子”304。将每种单独的DNA探针储藏到 板上分离的孔内并通过压差或者通过在孔与刷子304的尖端之间施加一个 电压而将其驱动到与孔相连的毛细管300内。因为DNA分子带负电荷， 所以应该向孔端施加负极。可以构建多个这样的毛细管刷子。填充毛细管 之后，使毛细管阵列移动，以“刷”过固定的探针载体带形基片306并沉 积DNA探针110阵列，然后带形基片306移向新的位置，以便使第二毛 细管“刷”304能够将更多的探针110沉积到后序的部位上。或者是，利 用同一刷子沿带形基片306沉积相同探针阵列的更多拷贝。另外，将大量 的细线基片平行放置到刷子的下面，以便使每一个“涂刷”动作都能够在 不同的细线或带上产生一维探针阵列的多个拷贝。
该技术以及提到的所有技术的另一个精华是，还沉积或者获得探针 110的标记物(参见，例如图1)。这些标记物可为探针之间或者在其周围 的间隔，或者它们可以是光学条形码(图1，120)或荧光标记物或编码在 基片的金属部件上的磁标记物，或者是用于鉴定特定探针或探针组的任何 其它方式。这些标记物可以在基片的沉积有探针的那一侧或者在与之相反 的那一侧，或者两侧都有。应该理解，基片可以只有一个表面(例如，具 有环形截面的纤维)，并且上下文中的词语“侧面”是指沉积有探针的表 面的特定区域。在具有更确定的顶部表面和底板表面的带形基片中，“侧 面”是指这些顶部或底板表面之一。
可以利用各种方式来提供将探针从储存器驱动到管内并驱动到基片上 的力。例如，可以建立压差。或者是，如果探针带电荷(例如当探针为DNA 时)，那么在储存器与基片之间可以建立电位差，从而探针从储存器和管 中移动到基片上。该基片可含有形成电极的金属部件(例如金属层)。
2.2探针印刷头
图4示出了探针载体细线制造系统的第二种设计，其中每种探针储藏 在印刷系统408的“印刷头”410内。在以恒定速度Vh移动的传送带400 上将大量这样的印刷头410排列成一维阵列。传送带可通过带轮或绞盘412 缠绕到卷筒406内，以便节省空间。印刷头之间的空间有几毫米大并且足 以容纳每种探针的储存器。将探针载体带形基片402放在印刷头阵列下面， 并且基片402也以恒定的较慢速度Vt移动。当印刷头与探针载体带形基片 402交叉时，其将一个点或一个条“印刷”在探针载体带形基片402上。 假设传送带上的两个相邻印刷头之间的空间是Lh，而探针载体带形基片 402上的两个相邻探针之间所需的空间为Lp，则可以精确控制印刷头传送 带的速度Vp和探针载体带形基片402的速度Vt，以便满足Vp/Vt＝Lp/Lt。 在这种方式中，DNA条404的线性阵列可以连续的方式高速沉积到探针载 体带形基片402上。由于基片正在移动或者基片与传送带以导致探针线与 基片长轴垂直的一个角度交叉，因此探针线可以斜穿过基片。反之，使基 片停止，而印刷头进行印刷，然后在施加下一种探针之前前进到下一印刷 部位。
系统内的每一印刷头包括容纳一定量探针样品的储存器和将探针传送 到探针载体或带形细线基片上的装置。将探针分散到为探针传送和固定到 基片上提供必要条件的液体内(或者探针本身就是液体)，而该液体的确 切性质取决于特定的探针和特定的基片。
图5示出了印刷头的一些可能设计。在图5a中，一非常薄的柔性纤维 500附着于探针储存器504下面的一个小开口502。纤维500是亲水的，从 而通过表面张力或毛细管效应将探针液拉到其表面上。另外，纤维500必 须为薄(＜80μm)的柔性且不变形的塑炼材料。涂布有金属或尼龙的固相 或空心硅石纤维是一种较好的候选材料。当印刷头与探针载体带形基片 402交叉时，它将探针当作“墨水”“涂”探针条至探针载体带形基片402 的表面。在为金属涂布的纤维时，可以将负压施加到纤维上，以便将DNA 样品推到探针载体细线或者带上。
图5(b)-(h)示出了基于喷墨原理的不同设计，其中在探针储存器的底 部产生一个针孔。将脉冲能量引入储存器，该能量将来自针孔的液滴喷射 到其下面的探针载体细线上。在图5b中，压环506胶粘在储存管的壁上， 这个环在一电压下挤压管并喷射液滴。在图5c中，压膜506覆盖在储存器 504顶部的隔膜508上，该压膜与压环具有相同的功能，但是当采用大量 的储存器504时压膜更便宜些。在图5d中，经过电阻线510的电流脉冲利 用局部加热产生气泡，气泡又推出液滴。在图5e中，通过外部超声转换器 512引入喷射能量。在图5f中，储存管是透明的并且通过将激光器514聚 焦到管内的光吸收片上而实现加热。在图5g中，储存器516是由金属制成 的。在储存器与探针载体带形基片402(或者探针载体带形基片402之下 的物体)之间施加一个高压且负极位于储存器。由于DNA载体带负电荷， 因此电场将样品喷射到探针载体带形基片402的表面上。在图5h中，探针 分子附着到悬浮在储存器518内的流体520中的磁珠上。将电流脉冲施加 到基片下面的电磁体519上，以便将探针从储存器下面的小开口吸引到基 片表面402上。注意，在设计5e-5h中，致动器在外部并且不与印刷头一 起移动。由于每个储存器(504或516或518)只在固定部位与探针载体带 形基片402交叉一次，因此在系统中仅仅需要一个这样的致动器。假设储 存器的间隔为2mm，则150,000个储存器阵列就是300米长并且能够容纳 在直径小于80cm的一个卷筒内。
2.3点样器和储存器
图6示出了另一探针载体制造系统设计，其中前述设计的印刷头结构 被分成“点样器结构”和“储存器结构”。每种探针都有自己的储存器， 为了降低成本，储存器的结构保持简单。图6a示出了可能的储存器设计之 一，其中液体内压与表面张力的总和导致含有探针110的液体600在开口 612处稍稍膨胀。在传送带上组装大量的储存器602，从而形成一个线性阵 列。如图6b所示，通过例如将薄金属带制成微型齿的线性结构或者将短的 硅石纤维606胶粘到柔性金属带608上，可制造点样器结构604。可以使 用产生一排适合传送探针的纤维的任何材料或若干材料的组合。点样器尖 端悬挂在储存器开口之上，两者之间有一小段距离，以使尖端接触探针液。 当点样器由高弹性材料(例如硅石纤维)制成时，点样器尖端实际上可以 稍稍降低开口，从而使点样器能够微触到开口内，以便收集探针液。按照 箭头614和616所指示的不同方向以诸如恒定的速度驱动点样器和储存器 结构进行移动。当点样器与储存器602的开口612交叉时，一滴探针液600 将从储存器中转移出来，从而在点样器上形成液滴610。利用交叉持续时 间以及点样器的形状和尺寸来控制液滴中的液量。以这样的方式(以后将 有所描述)来设计点样器和储存器结构的移动模式：即，使每一连串的点 样器与相应连串的储存器交叉，以便使每一点样器承载不同的探针液滴。 然后，如图6c所示，点样器结构604移动并与按照使点样器结构与基片交 叉的方向移动的基片618交叉。与储存器的设置一样，每一点样器606的 尖端可以物理形式接触基片或者可以悬挂在基片之上一小段距离(几十毫 米)，该距离使得液滴610接触基片618。将探针液滴从点样器结构传送 到基片上，以便在基片上形成线性探针结构630。如果探针带电，那么当 一特定的点样器与带有电荷的探针储存器(将吸引探针)交叉时，可通过 电子学方式使其带电，然后当该点样器随后与基片交叉时，使其上的电荷 变成相反电荷，以便将探针从点样器排斥到基片上。这种高超的设计使得 能够始终如一地精确控制点样器上的液滴尺寸。这种将探针材料传送到基 片上的方法称作“点样”，并广泛地在实验室内手工使用。
另外，如图6d所示，点样器结构604可在一个环中移动，而结构中 点样器的数目远远小于探针总数。点样器离开基片618之后，它可以在洗 涤区620进行洗涤、在干燥区622进行干燥并且通过环绕移动而重新用来 使626又与探针储存器结构624交叉。由于洗涤是与点样平行完成的，因 此其不影响制造产量。按照本发明的点样器易于清洗。
在图6e所示的另一结构中，探针储存器可以是在其底部638具有小开 口636的直管632或孔634。由于重力和毛细管力的综合作用，探针液600 在开口处向下膨胀。点样器606从探针储存器的下面与其交叉并将一些探 针液600收集在其尖端。然后，点样器移动并与探针载体基片610交叉并 以与图6c类似的结构(只是点样器载体406现在是在基片下面通过而不是 在其上通过)在基片上涂画一窄条。使基片面向下定位，以便用点样器涂 画。包括探针收集、点样、洗涤和干燥的整个制造系统的结构都与图6d 所示的类似。
在上述两种制造系统中，每种成分以预先规定的恒定速度移动。这样 减小了运动控制和精确要求的复杂性。另外，可以连续制造大量探针载体 100而无需人工介入。结果，制造产量非常高。而且，如果采用硅石纤维 或薄线作为探针载体基片，那么许多纤维可平行附着到用于制造阶段的宽 载体带。于是，可以同时制造同一探针载体细线的多个拷贝。
在加工厂可以采用宽带基片，而探针液滴沉积在贯穿带的一条线上(如 图6d的区域628中所示出的)。在探针沉积之后切割这条宽带，从而产生 相同探针载体细线100的许多拷贝(如图1所示)。另外，还显著增加了 产量。这两个系统设计因此适合于在专门的中心微阵列制造厂进行大批量 生产。在本发明的一个系统中，细线上的探针之间的间隔和储存器(以及 点样器)之间的间隔分别为100μm和5mm。假设细线基片以1cm/s的速 度移动，则储存器和点样器阵列以50cm/s的速度移动(这是易于做到的)。 而且，在载体带618被分成20个细线基片的情形中，上述两个系统设计每 7.5秒应该能够制造出150,000个探针阵列。
2.4点样器矩阵
图7示出了第四种制造系统设计，该系统具有更大的灵活性并且特别 适合于小规模探针载体的定制。图7a是系统的俯视图，而图7b是系统的 前视图。在此处，探针储藏在标准的微滴定板或类似的矩阵容器700内。 一个匹配点样器矩阵702与板上的孔矩阵具有相同的间隔。与常规的点样 针不同，正如在前一系统中所用的那样，每个点样器都是薄的柔性亲水纤 维704。点样器矩阵首先浸渍到孔矩阵内，然后移动以与探针载体带形基 片706交叉，其中探针载体带形基底706暂时保持静止状态。点样器移动 的方向与探针载体带形基片706垂直，但是矩阵排的方向以小角度α倾斜。 每个点样纤维将产生贯穿探针载体带形基片706的分离的线708(参见放 大图)，此处：α＝arc.sin[LC/(C+1)LR]               (1)
其中LC和LR分别是点样器矩阵的列和行内的纤维间距，而C是点样 器矩阵中的列的数目。
点样器矩阵阵列在清洗区710进行洗涤和清洗并且在干燥站712进行 干燥。同时，探针载体带形基片706前进到一个新的部分并承载新的孔矩 阵712，以便准备下一个“浸渍和点样”循环。在这种设计中，探针载体 带形基片706上的探针之间的间距由LC/(R+1)给出，并且大约为250μm。 当以259um的探针间距承载10,000种探针的探针载体带形基片706有2.5 米长时(其可缠绕到直径小于3cm的一个卷筒内)，这样的密度对于较小 规模的定制阵列是有用的。
3.探针载体的包装
探针载体细线平台的柔性使所制造的探针载体细线可被包装成各种不 同形式，这些形式包括(但不限于)探针载体针、探针载体棒、探针载体 旋管和探针载体卷筒。探针载体细线基片的优良强度、精度和柔性对于探 针载体细线制造和读取过程中所要求的精确的探针定位和传送是理想的。 假设探针的间距和细线厚度都是100μm，则沿15米的细线可容纳整个人 类基因组(约150,000个基因)，而该细线可缠绕成1.5cm高、3cm直径 的立体旋管或者0.1mm厚、直径小于4cm的卷筒。于是，对于较大探针 的成型而言探针载体细线包装是优选的。以下描述了包装探针载体细线和 带的几种方式。
3.1探针载体针和探针载体棒
如图8所示，通过围绕长条状支撑件804(例如固相圆筒或管)立体 缠绕一定长度的所制造的探针载体细线100，可制成探针载体针810和探 针载体棒820。紧紧缠绕的细线100并排806位于支撑圆筒804外表面的 一部分802上，并通过胶结剂、粘合剂或其它方式永久地附着到其上。为 了控制杂交，在缠绕过程之前用导电材料涂布圆筒804。探针110位于探 针载体细线100的一侧上，该侧远离探针载体细线100的与支撑件804接 触的那一侧。
正如以前所讨论的，探针载体针810与探针载体棒820之间的差别是 相对尺寸和形状。探针载体针810通常具有小于10mm的直径，而探针载 体棒820更大些并因此容纳更多的探针。例如，1.5米长、50μm直径的细 线在缠绕到直径为5mm的针810上之后只占据5mm这么短的部分，但是 却大约可承载15,000种探针(假设沿细线100的探针间距为100μm)。另 一方面，30mm宽、40mm直径的探针载体棒820沿70米长、50μm直径 的细线100可容纳700k的探针。在一实施方案中，柔性探针载体可以是承 载以二维阵列固定的探针的带形基片。例如在图3和4中表示出这种阵列 的制造。这种柔性探针载体带可以围绕针810或棒820进行盘绕，而不是 缠绕探针载体细线100。
可以高产量地有效生产上述的探针载体针810和探针载体棒820。如 图9所示，在细线制造过程中以及将细线或带放到支撑圆筒上之前，在沿 探针载体细线或带100的任何两组探针之间插入一定长度的“空”间距904。 然后沿长的支撑圆筒804连续缠绕探针载体细线100。在某些位置用环氧 或其它粘合剂预先涂布圆筒804，以便粘附承载探针110的部分探针载体 细线100。在环氧凝固之后，以适当的间隔切割其上具有细线100的长圆 筒804，从而产生多个具有探针载体细线100的探针载体针810或探针载 体棒820，其中细线100附着有探针100并围绕圆筒缠绕，而且在圆筒的 某一部分902上。因为未用环氧预先涂布空白细线所附着的支撑圆筒804 的904部分，所以在切割之后该空白细线将松开并从该圆筒断开，由此使 原始支撑圆筒的904部分暴露出来，该部分在杂交过程中可用于装配入适 配器中。
3.2 探针载体旋管
在图10示出的探针载体旋管中，将所制造的探针载体细线100缠绕成 平的盘形旋管1012。图10a示出了探针载体旋管1012组件的俯视图，而 图10b示出了该组件的侧视图。细线100上的探针110暴露在盘1012的一 侧，而另一侧通过环氧、粘合剂或其它适当的方式永久地附着到固相平面 支撑盘1010上。注意，在图10c(该图是探针载体旋管1012的截面1000 的放大图)中，探针110沉积在探针载体细线100表面上的凹槽202内。 该特性在这种包装形式中是任选的。用导电层预先覆盖平面支撑体1010， 以便易于控制杂交，这将在以下详细讨论。假设细线的直径为50μm，则 直径为40mm的探针载体旋管1012可容纳承载240,000种探针的高达24 米的细线。
3.3探针载体卷筒
探针载体卷筒1110的结构非常类似于探针载体旋管的结构。然而，与 探针载体旋管1012不同的是，探针载体细线100不会永久附着到支撑表面 1010上，由此为了杂交、读取和其它目的，使细线从圆筒展开(虽然细线 的端部可附着到基片上)。另外，如图11b所示，由于细线100的每一圈 在卷筒1110内都堆积在彼此的顶部，因此可以设计探针载体细线100的截 面形状，以避免DNA探针与相邻圈的细线发生摩擦。可以选择用来生产 探针载体细线100的基片的截面，以便纤维200具有凹槽或沟槽202(探 针110固定在其内)。这种设计避免一层探针与后序层的基片发生摩擦。 而且，如图11a所示，可以制备盒1100，以保护卷筒1110并使其易于缠 绕和展开。另外，多个卷筒1110可堆积在一个盒1100内。
4.杂交
本发明的装置的用途包括：1)制备样品；2)形成探针-样品复合物； 以及3)分析结合模式，以便鉴定样品所结合的各种探针。
样品的制备随着样品种类的不同而不同。用于分析多核苷酸的样品制 备方案包括用荧光标志标记样品，以便易于进行步骤3)，即分析结合模 式，该制备方案在本领域内是公知的。参见例如，US专利号5,800,992， 该文献在此作为参考全部并入本文。在为多核苷酸的情况下，利用公知技 术(例如限制性内切酶消化法)使样品片断化，然后将其转化为单链形式 并且用适当的荧光标志标记该单链片段。
当样品与该装置接触时，对特定探针具有亲和力的样品或样品片段与 那些探针结合。本发明的微阵列通常利用DNA的互补链的杂交作为结合 方法。DNA的杂交很大程度上取决于杂交条件，这些条件已经得到广泛的 研究和描述(参见例如，US专利号6,054,270和5,700,637，这两篇文献在 此作为参考全部并入本文)。
然而，本发明还包括任何类型的样品-探针结合，该结合使得可从测 定已经与样品或样品片段结合的探针中得到信息。这些例子包括通过分别 利用不同的抗体或抗原作为探针而测定样品中抗原或抗体的特性，或者利 用与激素结合的受体来鉴定样品中的激素等。对样品/探针对的列表可扩大 到任何配对组，这些配对组能够以足以进行鉴定的亲和力和特异性彼此互 相结合，而且样品/探针对的例子对于本领域的技术人员来说也是显而易见 的。
核酸的杂交通常包括以高度特异性检测大量非靶核酸中的少数靶核酸 (DNA和RNA)。严格的杂交条件是保持所需程度的特异性所必需的， 并且诸如盐、温度、溶剂、变性剂和去污剂这些试剂与条件的多种组合可 用于此目的。业已在各种形式的固相支持体上进行核酸的杂交(参见例如， Beltz，G.A.等人的“酶学方法”(Methods in Enzymology)，100卷，B部 分，19：266-308，Academic Press，NY(1985))。
最近对DNA微阵列技术的开发使得在一个固相支持体上进行多种靶 分子的大规模测定成为可能。通常，包括寡核苷酸阵列的DNA芯片由许 多以规则的模式与固相支持体相连的单个寡核苷酸组成，从而每种寡核苷 酸都位于已知的部位上。阵列产生以后，将含有靶序列的样品暴露到阵列 中，并与阵列上所结合的互补寡核苷酸杂交，然后利用各种方法、最常用 的是放射性或荧光标记物进行检测。US专利号5,837,832(Chee等人)以及 相关的专利申请中都描述了固定用于杂交的寡核苷酸探针阵列，以及检测 样品中的特异性核酸序列。
本发明还提供了一些专门设计的用于基于微阵列的探针载体细线杂交 的设备。在现存系统中，通过自然扩散或强制液体循环来实现杂交。装置 形式较慢并且随后的系统制造起来较复杂。在本发明的一个实施方案中， 杂交室的设计可确保在探针载体细线或其包装形式与杂交室内壁之间只有 一非常薄的靶流层。以这种方式，杂交只需非常少量的靶液，从而改善了 探针分子与靶分子之间的接触。由此通过例如使探针载体细线100或其包 装形式穿过靶流移动而使杂交加速。
另外，通过在探针载体细线的支持体与杂交室内壁之间施加一个电压， 还可控制杂交过程。在该过程中，通过加入阳离子、体积排阻和离液剂， 也可使杂交加速。当一个阵列包括几千个地址时，重要的是，正确连接的 产物序列有与适当地址杂交的机会。通过使寡核苷酸在所用的高温下进行 热运动，或者通过使与阵列表面接触的流体进行机械运动，或者通过利用 电场使寡核苷酸穿过阵列移动，可实现这一点。杂交之后，用低严格性洗 涤缓冲液和高严格性洗涤缓冲液依次洗涤阵列。
如图12所示，当探针载体细线100具有正极时，靶液中的DNA分子 被引向探针载体细线100，在细线表面附近产生暂时的局部浓度，从而使 杂交增强。如果极性相反，则电场将排斥不相配的核酸分子使之远离探针 110，而杂交探针保留其靶分子，由此使杂交的特异性增大。因此，可以在 探针载体细线100或其支持体1200与杂交室壁1210之间施加AC振荡电 压1220，以改善该过程的效率。支持体1200和杂交室壁1210具有导电涂 层1212，以便使该过程易于进行。如下所述，所有的探针载体细线形式还 可以在杂交过程中转动，从而增大了搅拌和混合并由此使探针与靶分子之 间的接触改善。可以利用刷子的滑环在移动电极上传导电压。这种电滑环 的设计在本领域内是公知的。
如图13所示，通过将探针载体针810直接塞入含有靶液1310的孔1300 内，可使探针载体针810杂交。孔1300的直径仅仅稍稍大于探针载体针 810的外径。由于在探针载体针810与液孔1300的内壁之间只有一层非常 薄的靶液1310，因此所需的靶液最少。例如，假设孔的直径为8mm，探 针载体针的直径只有50μm，缠绕的截面有5mm高，则3μl的靶液就足以 覆盖探针载体针的整个有效截面。探针载体针可进行上下移动1330或前后 1332转动，或者这两种运动的组合，以便增大杂交速度。因为探针载体针 810、探针载体棒820和探针载体旋管1012上的螺旋缠绕模式，所以转动 运动不仅沿包装的圆环方向而且沿包装的轴向或径向方向来驱动靶液。它 在由探针载体细线100覆盖的整个表面区域上有效地移动靶液中的分子。
可以将多个探针载体针810塞入适配器1400内，以便形成与空间螺距 和标准微滴定板1420的模式匹配的矩阵。以这种方式，可通过以下步骤在 标准微滴定板1420内直接平行完成多个杂交过程：首先将每个探针载体针 810浸渍到标准微滴定板1420的相应孔1410内(如图4所示)，然后任 意上下移动适配板或者转动各个探针载体针。
探针载体棒820可以在与探针载体针类似的但较大杂交室内进行杂 交。或者是，采用图15所示的杂交室设计1500。转动探针载体棒820到 1520处以便使靶液1510在探针之上移动。因为探针载体棒820上的探针 载体细线100的螺旋缠绕模式，所以靶液1510不仅沿棒820的圆环方向而 且还沿其轴向方向移动，由此覆盖探针载体棒820上的所有探针部位。在 探针载体细线100与杂交室壁1500之间施加AC振荡电压1530，以便改 善该过程的效率。
探针载体旋管1012的杂交室设计1600如图16所示，通过机械驱动或 磁驱动将前后转动1620引入到该旋管中，并且在旋管支持体与室之间施加 AC振荡电压变换1630，以增强杂交效率。
图17a示出了用于从探针载体转筒1110上展开的探针载体细线100 杂交的室设计1700，其中通过将盖1770盖在基片1780上的窄槽上，形成 基本上不透水的毛细管1760。槽的截面尺寸稍稍大于探针载体细线(如图 17b所示)。在盖上盖之前将靶液1750引入槽的中间部分，或者在将盖盖 到槽上之后使靶液通过盖上的小开口1790引入。使探针载体细线100通过 杂交室前后移动，以增强杂交效率。由于细线是疏水性的，因此通过毛细 管力将靶液保留在槽内。再者，通过在探针载体细线100上的金属层与杂 交室1700的毛细管1760内壁之间施加交流电压1730，可进一步改善杂交 效率。
5.读取仪
利用具有激光或宽带激发的扫描显微镜可读取上述的所有探针载体细 线包装。利用扫描电子显微镜、共聚焦显微镜、电荷耦合装置、扫描隧道 电子显微镜、红外显微镜、原子力显微镜、电导以及荧光或磷成像，可完 成扫描。然而，在用于不同探针载体细线形式的读取仪器中，优选提供特 殊的扫描运动。
正如图18中所示意性示出的，将探针载体针810和探针载体棒820 都可插入读取仪的适配器中，该仪器设计为可固定针或棒的端部并以预定 的速率沿纵轴转动1810和/或移动1812。该运动使得所有探针沿光学激发 和读取透镜1800下面的探针载体细线100分布。或者是，探针载体针810 或探针载体棒820可转动1810，而光学头1800沿针或棒的轴移动，以便 扫描固定在探针载体针810或探针载体棒820上的探针载体细线100的长 度。
同样，如图19所示，通过引入旋管1012的转动1910和沿旋管的径向 方向在旋管1012与光学读取头1900之间的相对移动(1912运动)，可扫 描探针载体旋管1012。
在图20所示的探针载体转筒扫描器中，包含在盒1100内的探针载体 卷筒1110使在光学读取头2002和标记物读取仪2004之下经过的一段未缠 绕的探针载体细线100展开。这个未缠绕的探针载体细线100承载在光学 读取头2002之下移动的所有探针组并能够保持静止。可以将该未缠绕的探 针载体细线100收集到第二卷筒2012内。
6.探针载体的使用方法
该装置使其适用于许多领域。利用多核苷酸作为探针的装置可用于已 知点的突变分析、基因组指纹分析、连锁分析、mRNAs和mRNA群体的 鉴定、序列测定、疾病诊断以及多态性分析。利用抗体作为探针的装置在 诊断中是特别有用的。与其它探针有关的其它用途对于本领域的技术人员 是显而易见的。
这些装置的用途包括：1)制备样品(如果必要的话)；2)形成探针 -样品复合物；3)分析结合模式以便鉴定结合有样品的各种探针。
6.1.样品的制备
样品的制备随着样品种类的不同而不同。用于多核苷酸分析的样品制 备方案包括用荧光标志标记样品以便易于进行步骤3)即分析结合模式， 并且该方案在本领域内是公知的(参见例如，US专利号5,800,992，该文 献在此作为参考全部并入本文)。在多核苷酸的情形中，利用已知技术例 如限制性内切酶消化法使样品片段化，再使其传化为单链形式，并且用适 当的荧光标志标记该单链片段。
6.2.探针-样品复合物的形成
当样品与装置接触时，对特定探针具有亲和力的样品或样品片段与那 些探针结合。目前的微阵列一般利用DNA的互补链的杂交作为结合方法。 DNA的杂交很大程度上取决于杂交条件，这些条件已经得到广泛的研究和 描述(参见例如，US专利号6,054,270和5,700,637，这两篇文献在此作为 参考全部并入本文)。
然而，本发明还包括任何类型的样品-探针结合，该结合使得从确定 何种探针已经与样品或样品片段结合中得到信息。仅仅作为一个例子，样 品可包括许多种分子，其中一些是酶。用来分析该样品的装置的探针是多 种酶的底物(此处，“底物”一词的意思是，酶作为催化剂起作用时的反 应物)，并且通过确定何种底物-探针在接触后与酶结合来获得样品中酶 的特性。其它例子包括通过利用不同的抗原作为探针来确定样品中抗体的 特性，或者利用与激素结合的受体来鉴定样品中的激素等。样品/探针对目 录表可扩大到任何配对组，这些配对能够以足以进行鉴定的亲和力和特异 性彼此互相结合，而且样品/探针对的例子对于本领域的技术人员来说也是 显而易见的。
本发明一方面能够大大增强带电样品的结合。该性能是在基片上施加 电压的结果，其中基片含有金属元件或者是导电的。例如，如果DNA是 待分析样品，那么穿过基片的振荡电压将交替地吸引带负电荷的DNA到 探针载体上，然后再排斥它。吸引使互补链易于结合，而排斥期间将有利 于非特异性结合或不完全杂交样品的释放。相同的原理适用于任何种类的 带电样品，并且增大了样品结合的效率和保真度。
6.3结合模式的分析
在结合模式的分析中一般有两个步骤：定位已经结合样品的探针，以 及对那些探针进行鉴定。可能的是，如果特定样品与其相应探针的结合产 生对于该样品/探针对来说是独一的变化，那么对于特定的样品/探针对，这 两个步骤可减为一个。
可以利用允许定位的任何方式将探针-样品对与未结合样品的探针区 分开来。许多这样的技术在本领域内都是公知的。例如，利用检测所用的 标记物类型的标准方法，可进行标记的样品多核苷酸的检测。于是，例如可 直接检测荧光标记物或放射性标记物。其它标记技术要求标记物(例如生 物素或洋地黄毒甙)是在样品的制备过程中掺入样品中的，并且利用抗体 或者其它结合分子(例如链亲和素)来检测该标记物，其中所述结合分子 是被标记的或者自身可与标记分子结合，例如标记分子可为与荧光分子(例 如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红和罗丹明)结合或者与酶活性分子结合的 抗-链亲和素抗体或抗-洋地黄毒甙抗体。无论新合成分子上的标记物是 什么，以及无论标记物是直接在样品内还是连接在与样品结合的分子上(或 者结合与样品结合的分子)，这些标记物(例如荧光的、酶的、化学发光 的或比色的)都可用激光扫描仪或CCD摄像机或X射线胶片(取决于标 记物)或用于检测特定标记物的其它适宜装置来检测。例如，在用于基因 分析的多核苷酸微阵列的大部分应用中，将样品多核苷酸片段化，然后用 荧光标记物标记每一样品片段。与探针多核苷酸阵列接触之后，利用样品 上的荧光标志定位已经与互补探针多核苷酸杂交的样品片段。没有结合样 品片段的探针就没有这样的荧光标记物。可对其它类型的分子例如抗体、 酶等进行类似的荧光标记。其它类型的标志例如放射性标记物、化学发光 标记物、磷光标记物、磁标记物等对于本领域的技术人员来说是显而易见 的。
对于检测结合有样品的探针，光检测方式是优选的，虽然也可以采用 其它检测方法例如放射性方法、原子光谱法等。对于光检测方式，可以采 用荧光法、磷光法、吸收法、化学发光法等。最便利的是荧光法，其可以 有许多形式。可以利用单独的荧光剂或者成对的荧光剂，特别是在希望具 有多个发射波长(具有大的斯托克斯漂移(至少20nm))时。所例举的 荧光剂包括荧光素、罗丹明、德克萨斯红、花菁、藻红素、噻唑橙和蓝等 等。当使用成对染料时，可以在一种分子上使用一种染料，而在与第一种 分子结合的另一种分子上使用另一种染料。重要的因素是，当两种成分结 合时这两种染料靠得足够近，足以进行有效的能量传输。
本发明提供了使分析中的第二步骤(即鉴定结合有样品或样品片段的 特异性探针的步骤)流水线化并扩大的机会。在常规的探针微阵列中(例 如多核苷酸阵列)，通过确定探针在阵列中的x-y位置可鉴定探针；每种 探针的x-y位置是已知的。利用公知技术确定探针的位置需要复杂和昂贵 的成像设备。因为本发明的探针是以一维行列排列的，所以位置分析要容 易得多并且不需要复杂的设备，这是因为仅仅有一维(而不是二维)需要 跟踪(如同在被卷绕的细线中)。
在本发明的任何实施方案中，使用与探针或探针组相联的标记物提供 了掌握探针线索的方式。这一点在前面已经讨论过。标记物可以是简单的 或复杂的，可以与探针在基片的同一侧或不同侧，可以多于一种类型，可 以含有更多的，而非仅仅含有该探针或多种探针特性的信息。
本发明的探针载体可用来构建以最小体积包装的非常大的探针阵列， 这些阵列随后与靶核酸杂交。芯片的杂交模式的分析提供了靶核苷酸序列 的立即指纹鉴定结果。可以对模式进行人工或计算机分析，但是显然，由 杂交进行的位置测序适合于计算机分析和自动化。已经开发出可应用于本 文所述方法中的序列重建的算法和软件(R.Drmanac等人，J.Biomol.Struc. & Dyn.5：1085-1102，1991；P.A.Pevzner，J.Biom0l.Struc.& Dyn.7：63-73， 1989，它们在此专门引用作为参考)。
按照本发明制备的含有固定化核酸序列的柔性探针载体可用于许多基 因应用中的大规模杂交分析，这些分析包括已知点的突变分析、基因组指 纹分析、连锁分析、mRNAs和mRNA群体的鉴定、序列测定、疾病诊断 以及多态性分析。利用抗体作为探针的装置在诊断中是特别有用的。与其 它探针有关的其它用途对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
对于基因作图，将基因或克隆DNA片段与DNA片段的一个有序阵列 杂交，并且通过被检测阵列的象素或象素模式而明确确定施加到阵列上的 DNA特性。Nelson等人的“自然遗传学(Nature Genetics)”，4：11- 18(1993)中描述了此类用于产生基因图的阵列的一种应用。在构建基因 组的物理图谱时，使固定化的克隆DNA片段阵列与其它的克隆DNA片段 杂交，以便确定探针混合物中的克隆片段是否重叠并因此邻接阵列上的固 定化克隆。例如，基因组分析，I卷：基因图谱和物理图谱(Genome Analysis， vol.I：Genetic and Physical Mapping.)(K.E.Davies和S.M.Tilghman 编辑)冷泉港实验室出版社，39-81页Lehrach等人的“基因组作图和测序 中的杂交指纹分析”(1990)描述了这种过程。
固定化DNA片段的柔性探针载体还可用于遗传诊断。为了说明起见， 可以用病人的DNA的标记混合物来探测含有多种形式的一个突变基因或 多个基因的探针载体，而病人的DNA标记混合物只与基因的固定形式之 一相互作用。这种相互作用的检测可导致医学诊断结果。而且，某些基因 的表达水平的检测可诊断某些医学疾病。例如，在大约25％的早期乳腺癌 中可扩增出导致p185HER-2生长因子受体过度表达的HER- 2/neu(c-erbB-2)基因。已确定HER-2/neu为一大群病人和具有非常长(30 年)的随访期的群体中早期乳腺癌的一个重要的独立预后因素。新的数据 已开始暗示，HER-2/neu不仅可以用作预后因素，而且还可用作预见性 HER-2/neu单克隆抗体。HER-2/neu编码185kD跨膜癌基因蛋白，该 基因在一些乳腺癌病人中被扩增和/或过表达，与无HER-2/neu扩增的妇 女相比它是通常与较差预后相关的一个特性。虽然对该基因座已经研究了 许多年，但是与最常用的方法(Southern印迹法和免疫组织化学染色法) 相关的技术问题业已导致数据有一些不一致。Pegram M.D.等人的“HER -2/neu作为响应乳腺癌治疗的预见性标志物”，乳腺癌研究与治疗Breast Cancer Research and Treatment 52(1-3)：65-77，1998。由本发明获得的多个 样品的快速处理使得可以快速测试多个对照组，从而避免了数据的不一致。
7.探针载体的应用
固定化DNA片段的柔性探针载体还可用于DNA探针的诊断。例如， 通过使未知病原体的DNA样品与含有许多种类的已知病原体DNA的探针 载体进行杂交，可以明确鉴定病原体微生物的特性。类似的技术还可用于 任何有机体的明确基因分型。有遗传兴趣的其它分子例如cDNAs和RNAs 可以固定到探针载体上或者另外地用作施加到探针载体上的被标记探针的 混合物。
在一种应用中，代表多个基因的cDNA克隆的探针载体与来自有机体 的总cDNA进行杂交，以便为了研究和诊断目的而监测基因表达。用一种 有色荧光团标记来自正常细胞的总cDNA，而用另一种有色荧光团标记来 自病理细胞的总cDNA，然后将这两种cDNA样品同时杂交到相同的cDNA 克隆阵列上，使得可以这两种荧光团强度之比来测定差异基因表达。该双 色实验可用来监测不同组织类型、疾病状态、对药物的反应或对环境因素 的反应中的基因表达。
这种方法仅仅作为举例而并不是对本发明范围的限制，它可用来针对 疾病基因中的所有已知突变同时筛选许多病人。本发明可以例如一个矩阵 内的96个相同探针载体针的形式来使用，其中每一探针载体针都含有例如 代表给定基因的所有已知突变的1500个DNA片段。可对来自96位病人 的每一DNA样品的感兴趣的区域扩增、标记并杂交到96个单独的阵列中， 并且每一测定都是在10微升的杂交液中进行的。将该衔接矩阵作为一片材 料来孵育、漂洗并利用标准的放射性、荧光或比色检测装置检测和分析 (Maniatis等人，1989)，其中所述衔接矩阵含有用96位病人的样品测定 的全部96个相同的探针载体针。以前，这样的方法包括在96个分离的密 封室内对96个分离的膜进行操纵、处理和示踪。通过用最少的杂交液在一 个步骤中处理全部96个病人的样品，可明显地节省时间和成本。
该测定方式可反转，其中将病人或有机体的DNA作为探针成分来固 定，并且每一探针载体与不同的突变等位基因或遗传标志物进行杂交。还 可用探针载体矩阵来进行平行的非DNA ELISA测定。而且，本发明可采 用所有的标准检测方法。
本发明一方面包括利用偶联的连接酶检测反应(LDR)和聚合酶链反 应(PCR)来检测核酸序列差异(正如Baranyi等人的题为“利用偶联的 连接酶检测反应和聚合酶链反应来检测核酸序列差异”的US专利号 6,027,889中所公开的，该文献在此作为参考全部并入本文)。
除了上述所列的基因应用以外，利用本发明所述的装置可以制造所有 细胞、肽、酶、抗体、抗原、受体、配体、磷脂、聚合物、药物制品或化 学物质阵列，以便医学诊断、药物探索、分子生物学、免疫学和毒理学中 的大规模筛选测定。
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请都可以相同程度作为参考 并入本文，尽管每一种独立的出版物或专利申请都专门和单独指出是作为 参考引用的。
虽然为了清楚和理解起见，已经借助阐述和举例对本发明的优选实施 方案进行了描述，但是这并不意味着将本发明穷举或限定为所公开的这些 确切形式。在不脱离本发明精髓的情况下所作出的许多改变和变型，都是 本领域的普通技术人员在本发明的教导下容易实现的。因此本发明的范围 只由后面所附的权利要求书及其等同物来限定。