猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用
阅读：183发布：2023-01-24
专利汇可以提供猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了猪流行性腹泻病毒 荧光 定量检测 试纸 条及其制备方法和应用。所述的荧光定量检测试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、喷有荧 光标 记物探针的荧光标记物结合垫、 喷涂 有检测线T和质控线C的 硝酸 纤维 素膜以及吸 水 纸，还包括位于下方的塑料底衬、其中塑料底衬的作用是提供组装平台，其中，荧光标记物结合垫上喷涂有PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物，所述的硝酸 纤维素 膜上喷涂有PEDV单抗形成的检测线T以及羊抗兔IgG多抗形成的质控线C。实验证明，本发明的试纸条敏感性比现有的RT-PCR和胶体金试纸条检测方法至少提高10倍，而且对检测样本进行了初步定量，并将检测结果数字化，避免了人的主观性偏差，为早期确诊PEDV提供了技术手段。，下面是猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的荧光定量检测试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜以及吸水纸，还包括位于下方的塑料底衬、其中塑料底衬的作用是提供组装平台，其中，荧光标记物结合垫上喷涂有PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物，所述的硝酸纤维素膜上喷涂有PEDV单抗形成的检测线T以及羊抗兔IgG多抗形成的质控线C；
其中，用于制备PEDV单抗荧光微球标记物的PEDV单抗，命名为15B12，由保藏编号为CGMCC NO.16299的杂交瘤细胞分泌产生；
其中，用于喷涂检测线T的PEDV单抗，命名为4H7，由保藏编号为CGMCC NO.16300的杂交瘤细胞分泌产生。
2.如权利要求1所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的样品垫通过以下方法制备得到：用含有10mmol/L EDTA、1％(v/v)的Tween-20、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)的0.2mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2h至完全干燥，即得。
3.如权利要求1所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫通过以下方法制备得到：用含2.5％(w/v)海藻糖、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Tween-20、0.5％(w/v)的PVP的0.1mol/L pH7.4的PBS浸泡荧光标记物结合垫，然后置于37℃烘箱中烘干2h，再将PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物分别用0.1mol/L pH7.4的PBS稀释600倍和800倍后，喷于处理烘干后的荧光标记物结合垫，置于37℃烘箱中烘干2h后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
4.如权利要求1或3所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物是以铕(Eu)元素为发光元素的荧光微球对抗体进行标记。
5.如权利要求4所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的PEDV单抗荧光微球标记物通过以下方法制备得到：
取固体含量为1％的Eu荧光微球100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)和60μL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温置于旋转摇床上50转/min活化15min，然后40000g离心10min，去除上清溶液，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，然后80W超声处理30s，加入50μg的PEDV单抗15B12，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2小时，加入含有50mmol/L的乙醇胺的10％(w/v)的BSA溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
6.如权利要求4所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的兔IgG荧光微球标记物通过以下方法制备得到：
取固体含量为1％的Eu荧光微球100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)，再加入100μg兔IgG，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2h，加入含有50mmol/L的乙醇胺的10％w/v的BSA溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
7.如权利要求1所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜通过以下方法制备得到：
将PEDV单抗4H7用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)十二烷基磺酸钠(SDS)的0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.025mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG多抗用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)SDS的0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度1.0mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2h，置于室温干燥环境中保存备用。
8.权利要求1-7任一项所述的荧光定量检测试纸条在制备检测猪流行性腹泻病毒试剂中的应用。
猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用，特别涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用。本发明属于病毒检测技术领域。
背景技术
[0002] 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性肠道传染病，主要临床特征为腹泻、呕吐和脱水，其临床症状、病理变化与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)极其相似难以区分。PEDV感染可发生于不同年龄段的猪，其中感染最严重的是仔猪，发病率和死亡率常达100％。PEDV在我国猪群中一直广泛传播，经粪口途径传播是其主要的传播方式。2010年10月，由于PEDV变异引发了PED在我国大规模的爆发，造成大量仔猪死亡，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003] PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒，在分类地位上隶属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)I群，与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcinerespiratory coronavirus，PRCoV)、人冠状病毒229E同属。PEDV有两种基因型：G1和G2。PEDV粒子呈多形性，大多数呈球形，直径大小为95～190nm(平均直径约为130nm)囊膜上分布着长度为18～23nm的纤突，由内向外呈放射状排列。PEDV的基因组全长约为28kb，5’端非编码区(5’-untranslatedregion，UTR)有帽子结构，3’端有poly(A)尾巴和至少7个开放阅读框(ORF)，同时有编码S、E、N、M基因的4个结构蛋白和ORF1a、ORF1b以及ORF3基因的3个非结构蛋白。整个基因组从5’到3’的顺序依次为：5’-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’。
Duarte等通过研究证实了PEDV各蛋白片段的大小，其中编码非结构蛋白的ORF(1a和1b)占到整个基因组的三分之二大小的长度，而编码基因组结构蛋白的S蛋白为150～220kDa、E蛋白为7kDa、M蛋白为20～30kDa、N蛋白为58kDa，ORF3是一种调节基因，编码一种辅助蛋白。
Duarte等通过研究证实了PEDV各蛋白片段的大小，其中编码非结构蛋白的ORF(1a和1b)占到整个基因组的三分之二大小的长度，而编码基因组结构蛋白的S蛋白为150～220kDa、E蛋白为7kDa、M蛋白为20～30kDa、N蛋白为58kDa，ORF3是一种调节基因，编码一种辅助蛋白。
[0004] 到目前为止，检测PEDV感染和接种疫苗后常用的方法有基于RNA的RT-PCR、实时定量PCR、多重PCR和RT-环介导等温扩增技术，以及检测抗体的IgG和IgA检测方法，检测病原的间接免疫荧光方法和电镜技术以及胶体金试纸条。上述各种诊断方法除胶体金检测方法外，需要在实验室进行操作，专业性强需要专人操作，不适合应用于现地检测和猪场快速诊断。目前市面上常用的检测PEDV抗原的胶体金试纸条主要来自于韩国，价格较高。
[0005] 本发明以PEDV N蛋白作为目标检测抗原，以铕元素为发光元素的荧光微球对抗体标记获得了PEDV荧光定量快速检测试纸条，实验证明，本发明试纸条的敏感性比RT-PCR和胶体金试纸条的敏感性提高了至少10倍，而且对检测样本进行了初步定量，并将检测结果数字化，避免了人的主观性偏差；在微量病毒存在的情况下即可检测到病毒，为早期确诊PEDV提供了技术手段。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种能够快速、定量、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0008] 本发明将表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的重组表达质粒pGEX-PEDV-N转化入BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆进行扩大培养，并纯化出PEDV N蛋白。以纯化出的PEDV-N蛋白为抗原，免疫BalB/C小鼠，获得两株稳定分泌针对于PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株命名为15B12(CGMCC No.16299)和4H7(CGMCC No.16300)，重链均为IgG1亚型，轻链为κ型。为建立快速检测PEDV抗原的荧光定量检测试纸条，将纯化的15B12单抗和兔IgG抗体用以铕元素为发光元素的荧光微球进行标记，用喷金仪喷于结合垫上；以4H7单抗作为捕获抗体用喷膜机喷涂在硝酸纤维膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG单克隆抗体用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜形成质控线C，组成检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量快速检测试纸条。当用该PEDV荧光定量检测试纸条检测含有PEDV N蛋白的样品时，将加入样品后的试纸条插入检测仪器内时，会有数值显现。当检测值大于0.066时，可证明该样品含有PEDV N蛋白。用该试纸条检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)的病毒液时均呈阴性反应。敏感性试验结果表明，本发明PEDV荧光检测试纸条的灵敏度要高于现有的胶体金试纸条和RT-PCR检测方法，而且操作方便。
[0009] 因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量检测试纸条，所述的荧光定量检测试纸条的连接顺序依次包括样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜以及吸水纸，还包括位于下方的塑料底衬；其中，塑料底衬的作用是提供组装平台；其中，荧光标记物结合垫上喷涂有PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物，所述的硝酸纤维素膜上喷涂有PEDV单抗形成的检测线T以及羊抗兔IgG多抗形成的质控线C；
[0010] 其中，用于制备PEDV单抗荧光微球标记物的PEDV单抗，命名为15B12，由保藏编号为CGMCC NO.16299的杂交瘤细胞分泌产生；
[0011] 其中；用于喷涂检测线T的PEDV单抗，命名为4H7，由保藏编号为CGMCC NO.16300的杂交瘤细胞分泌产生。
[0012] 其中，优选的，所述的样品垫通过以下方法制备得到：用含有10mmol/L EDTA、1％(v/v)的Tween-20、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)的0.2mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2h至完全干燥，即得。
[0013] 其中，优选的，喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫通过以下方法制备得到：用含2.5％(w/v)海藻糖、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Tween-20、0.5％(w/v)的PVP的0.1mol/L pH7.4的PBS浸泡荧光标记物结合垫，然后置于37℃烘箱中烘干2h，再将PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物分别用0.1mol/L pH7.4的PBS稀释600倍和800倍后，喷于处理烘干后的荧光标记物结合垫，置于37℃烘箱中烘干2h后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
[0014] 其中，优选的，所述的PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物是以铕(Eu)元素为发光元素的荧光微球对抗体进行标记。
[0015] 其中，优选的，所述的PEDV单抗荧光微球标记物通过以下方法制备得到：
[0016] 取固体含量为1％的Eu荧光微球100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)和60μL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温置于旋转摇床上50转/min活化15min，然后40000g离心10min，去除上清溶液，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，然后80W超声处理30s，加入50μg的PEDV单抗15B12，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2h，加入含有50mmol/L的乙醇胺的10％(w/v)的BSA溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
[0017] 其中，优选的，所述的兔IgG荧光微球标记物通过以下方法制备得到：
[0018] 取固体含量为1％的Eu荧光微球100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)，再加入100μg兔IgG，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2h，加入含有50mmol/L的乙醇胺的10％(w/v)的BSA溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
[0019] 其中，优选的，所述的喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜通过以下方法制备得到：
[0020] 将PEDV单抗4H7用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)SDS的0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度0.025mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG多抗用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)SDS的
0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度1.0mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2h，置于室温干燥环境中保存备用。
0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度1.0mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2h，置于室温干燥环境中保存备用。
[0021] 进一步的，本发明还提出了所述的荧光定量检测试纸条在制备检测猪流行性腹泻病毒中的应用。
[0022] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0023] 1、本发明的试纸条中通过检测PEDV N蛋白为抗原来指示PEDV感染，具有代表性。N蛋白为PEDV的核蛋白，在病毒感染的宿主和细胞内大量存在。N蛋白是PEDV结构蛋白中高度保守的蛋白，不易突变。因此，以检测N蛋白为抗原建立的PEDV荧光快速检测试纸条能够检测临床中的流行毒株(G2)及经典毒株(G1)。
[0024] 2、本发明以铕元素为发光元素的荧光微球对抗体标记获得了PEDV荧光定量快速检测试纸条，实验证明，本发明的试纸条的敏感性比RT-PCR和胶体金试纸条的敏感性至少提高10倍，能够检测出10个TCID50/mL的PEDV，即在微量病毒存在的情况下即可检测到PEDV病毒，为早期确诊PEDV提供了技术手段。
[0026] 图1为PEDV N重组蛋白的鉴定结果；
[0027] 其中，M：蛋白maker；1：菌体上清；2：菌体沉淀；
[0028] 图2为WB鉴定单抗与PEDV培养物的反应；
[0029] 其中，M：蛋白maker；1、3、5、7分别为：15B12、4H7、2G3和PEDV阳性血清与PEDV细胞培养物反应；2、4、6分别为15B12、4H7、2G3和PEDV阳性血清与Vero E6反应情况；
[0030] 图3为试纸条组装示意图；
[0031] 图4为临界值的判定；
[0032] 图5为检测试纸条的敏感性；
[0033] 其中，M：DNA maker；1-5为PEDV含量为10000、1000、100、10和1个TCID50/mL的样本；a图为用RT-PCR检测方法检测PEDV核酸电泳图；b图为用胶体金检测结果；
[0034] 图6为临床样品的RT-PCR检测；
[0035] 其中，1-6：送检6份仔猪肠道样品；P：阳性对照；N：阴性对照；M：DNA marker。
[0036] 菌种保藏信息：
[0037] 1、稳定表达抗PEDV N蛋白的杂交瘤细胞株，命名为15B12，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.16299，保藏时间为2018年9月13日。
[0038] 2、稳定表达抗PEDV N蛋白的杂交瘤细胞株，命名为4H7，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.16300，保藏时间为2018年9月13日。
具体实施方式
[0039] 下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0040] 本发明实施例所涉及的细胞、试验动物、抗体和试剂：
[0041] SP2/0和Vero-E6细胞系由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队保存；RPMI1640培养液(Gibco)；HAT和HT培养基、PEG(MW4000)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；Balb/c小鼠由本所实验动物中心代为购买。辣根过氧化物酶(HRP)购自Sigma公司；2，2-连氮基双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)为BBI产品；PEDV LNCT2毒株由本实验室分离和培养；HiTrap Protein G HP抗体纯化柱购自GE Healthcare公司。
[0042] 实施例1抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备
[0043] 1方法
[0044] 1.1PEDV N基因的扩增及重组质粒构建
[0045] 按照病毒基因组RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit,QIAGEN)说明书提取病毒RNA，RNA经反转录合成cDNA后，用带有BamH I和Xho I酶切位点的特异性引物(PEDV-N-F1:CTGGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCAG；PEDV-N-R1326:CCGCTCGAGTTAATTTCCTGTGTCGAAG)扩增PEDV N基因。PCR反应条件为98℃30s进行预变性,随后98℃10s,60℃30s,68℃1min扩增30个循环,随后68℃再延伸7min。PCR产物经核酸凝胶电泳鉴定后，PCR产物和pGEX-6p-1空载体经BamH I和Xho I限制性内切酶切割，通过胶回收得到目的基因，获得的目的基因经T4DNA连接酶(NEB)连接，产物转化至TOP10感受态细胞中(天根生化科技有限公司)。筛选阳性克隆，提取质粒并测序(吉林省库美生物科技有限公司)。序列正确的质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中(天根生化科技有限公司)，用IPTG进行诱导表达。
[0046] 1.2重组蛋白的表达及纯化
[0047] SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况，对表达重组蛋白的菌株进行大量诱导表达，按照GST标签蛋白的纯化步骤进行蛋白纯化。
[0048] 1.3抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备
[0049] 1.3.1BALB/c小鼠的免疫
[0050] 将纯化的PEDV N蛋白与等量弗氏佐剂混合后腹部皮下接种6周龄BALB/c小鼠5只，每只接种抗原剂量为100μg。2周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原。细胞融合前3d，用等量不加佐剂的抗原(每只200μg)腹腔注射加强免疫1次，即可进行细胞融合。
[0051] 1.3.2细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的建立
[0052] 免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5:1比例混合后加PEG融合，于96孔培养板中37℃、CO2培养箱中培养。当杂交瘤细胞的培养液开始变黄，或杂交瘤细胞长满至孔底面积的1/10时，吸取上清液，经间接ELISA和WB法筛选阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法对阳性孔连续3次亚克隆，至所有单克隆孔均为阳性为止。将最终获得的单克隆扩大培养后建株，冻存。
[0053] 1.3.3单抗腹水的制备及效价的测定
[0054] 取8周龄BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(每只0.5ml)，7d后将生长状态良好的杂交瘤细胞，以每只约5×105个腹腔注射BALB/c小鼠。7d左右小鼠腹部开始明显膨大，反复抽取腹水，以2 000r/min离心10min除去细胞成分和其他沉淀，收集上清液。纯化后加入0.02％叠氮钠，分装，-70℃保存。将腹水用PBS递增稀释，以ELISA测定单抗的效价。
[0055] 1.3.4单抗的亚型鉴定
[0056] 按照亚型鉴定试剂盒操作说明书对以上试验中得到的单克隆抗体进行亚型鉴定。
[0057] 1.3.5腹水纯化
[0058] 腹水纯化按照HiTrap Protein G HP(GE Healthcare)抗体纯化说明书进行。
[0059] 2结果
[0060] 2.1PEDV N重组蛋白的表达及纯化
[0061] pGEX-PEDV-N重组质粒转化至BL21感受态细胞中，进行诱导表达。经SDS-PAGE鉴定可见重组蛋白成功表达于菌体上清中(图1)。对菌体上清对目的蛋白进行纯化。
[0062] 2.2稳定表达抗PEDV N蛋白的杂交瘤细胞株的筛选及鉴定
[0063] 将纯化的PEDV N蛋白经三次免疫小鼠后，无菌取脾脏后将脾细胞与SP2/0细胞融合，融合的杂交瘤细胞株培养上清经ELISA和WB筛选，共获得8株稳定表达抗PEDV N蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为15B12、4H7、2G3、12B9、11A3、11C3、7A7、7B9。WB鉴定部分结果如图2所示。经鉴定8株抗体的重链亚类均为IgG1，轻链亚类均为κ。15B12、4H7、2G3、12B9、11A3、11C3、7A7、7B9单抗细胞上清液抗体效价分别为1:1000、1:800、1:800、1:600、1:1000、
1:800、1:600、1:800；腹水抗体效价分别为1:1000000、1:100000、1:100000、1:80000、1:
400000、1:60000、1:80000、1:80000。
1:800、1:600、1:800；腹水抗体效价分别为1:1000000、1:100000、1:100000、1:80000、1:
400000、1:60000、1:80000、1:80000。
[0064] 2.3荧光微球标记抗体及捕获抗体的筛选
[0065] 经实验鉴定可知：在8株抗PEDV N蛋白的抗体中，15B12适用于用荧光微球标记；4H7抗体适用于在试纸条上作为捕获抗体。其他抗体株分泌的抗体用于标记时可能与荧光微球的结合影响了抗体与抗原的结合位点，标记后用于评价时特异性不佳或检测阳性样本数值较低，不适用于该试纸条的制备。因此，本研究选取15B12和4H7抗体进行试纸条的建立。
[0066] 其中，将筛选获得的稳定表达抗PEDV N蛋白的杂交瘤细胞株命名为15B12，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.16299，保藏时间为2018年9月13日。
[0067] 将筛选获得的另一株稳定表达抗PEDV N蛋白的杂交瘤细胞株命名为4H7，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.16300，保藏时间为2018年9月13日。
[0068] 实施例2试纸条的组装及在检测PEDV中的应用
[0069] 1方法
[0070] 1.1PEDV抗体荧光微球标记物的制备
[0071] 取固体含量为1％的Eu荧光微球(南京微测生物科技有限公司)100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)和60μL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，室温置于旋转摇床上50转/min活化15min，然后40000g离心10min，去除上清溶液，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，然后80W超声处理30s，加入50μg的PEDV单抗15B12(由保藏号为CGMCC NO.16299的杂交瘤细胞分泌产生)，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2h，加入50mmol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
[0072] 1.2兔IgG荧光微球标记物的制备
[0073] 取固体含量为1％的Eu荧光微球(南京微测生物科技有限公司)100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)，再加入100μg兔IgG(购自长沙博优生物科技有限公司)，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2h，加入
50mmol/L的乙醇胺、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜，最后
40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
50mmol/L的乙醇胺、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜，最后
40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
[0074] 1.3试纸条的制备
[0075] 1.3.1硝酸纤维素膜检测线T和质控线C的制备
[0076] 将PEDV单抗4H7(由保藏号为CGMCC NO.16300的杂交瘤细胞分泌产生)用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)SDS的0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度0.025mg/mL，用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端依次为15mm处形成检测线T；将羊抗兔IgG抗体用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)SDS的0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度1.0mg/mL，用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端22mm处形成质控线C。将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2min，置于室温干燥环境中保存备用。
[0077] 1.3.2荧光标记物结合垫的制备
[0078] 首先用含2.5％(w/v)海藻糖、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Tween-20、0.5％(w/v)的PVP的0.1mol/L pH7.4的PBS浸泡荧光标记物结合垫Fusion5(购自GE公司)，然后置于37℃烘箱中烘干2min。再将PEDV抗体荧光微球标记物用0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液稀释500倍、600倍、700倍、800倍、1000倍，将兔IgG荧光微球标记物用0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液分别稀释500倍、600倍、700倍、800倍、1000倍，用喷金仪将上述两种抗体的荧光微球标记物分别喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37℃烘箱中烘干2h后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
[0079] 1.3.3样品垫的处理
[0080] 用含有10mmol/L EDTA、1％(v/v)的Tween-20、0.5％(w/v)PVP、0.5％(w/v)的BSA的PBS缓冲液(0.2mol/L，pH8.0)浸泡玻璃纤维素膜样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2h至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用。
[0081] 1.3.4试纸条的组装
[0082] 试纸条的组装示意图如图3所示。在PVC背衬上依次搭接并粘贴：处理过的样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有检测线T线和质控线C线的硝酸纤维素膜以及吸水纸，组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可，保质期可达两年以上。
[0083] 1.4临界值的判定
[0084] 经RT-PCR检测筛选出来的62份PEDV阴性样本和46份阳性样本用于该试纸条阴性和阳性临界值的判定。根据试纸条测出的阴性样本的数值计算出份阴性样品的平均值和标准方差(SD)，确定样品的阴、阳性临界值。取 为临界值。
[0085] 1.5敏感性检测及比较
[0086] 将1ml PEDV LNCT2的细胞培养液(TCID50为104)用稀释液按10倍倍比稀释，稀释成1000、100、10和1个TCID50/mL，从病毒原液和各稀释样品中各吸取100μL加入试纸条的加样孔中，8分钟后插入荧光免疫分析仪(南京微测生物科技有限公司)读数。同时对病毒原液和各稀释样品用胶体金试纸条和RT-PCR检测，根据检测结果评价三者的敏感性。RT-PCR检测PEDV核酸的扩增引物为：PEDV-ORF3-F1：5’-GGAGCTCAATGTAGTTCCAA-3’；和PEDV-ORF3-R1：
5’-AGCTGCTTTACCATTGAGAA-3’。
5’-AGCTGCTTTACCATTGAGAA-3’。
[0087] 1.6特异性检测
[0088] 分别将已知含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)的细胞培养物与试纸条进行反应，检测其反应结果。
[0089] 1.7临床病料检测及比较
[0090] 对发生仔猪腹泻猪场(内蒙通辽某猪场)送检病料进行试纸条检测和PCR检测，评价临床应用性。
[0091] 2结果
[0092] 2.1荧光标记物最佳使用浓度的确定
[0093] 经实验鉴定可知：PEDV抗体荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物用0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液分别稀释600倍和800倍时作为使用浓度效果最佳。
[0094] 2.2临界值的判定
[0095] 62份阴性样本经本发明试纸条检测得出数据并计算得出 为0.021，SD为0.015，为0.066。因此判定该试纸条的阴性、阳性临界值为0.066，即当检测数值小于0.066时判定为阴性，大于0.066时判定为阳性(图4)。
[0096] 2.3检测试纸条的敏感性
[0097] 将稀释后的已知病毒毒价的PEDV LNCT2细胞培养物按照操作说明书用rt-PCR检测和胶体金试纸条进行检测(图5a和5b)，样品同时用本研究建立的试纸条检测方法检测。检测结果如下：当病毒含量在100个TCID50/mL时，用RT-PCR和胶体金试纸条检测显示为阳性，当病毒含量低于100个TCID50/mL时结果显示为阴性；用本发明的试纸条检测显示，当病毒含量为10个TCID50/mL时，检测结果为0.14，当病毒含量为1个TCID50/mL时，检测结果为
0.01，根据试纸条临界值(0.066)可得出结果当病毒含量为10个TCID50/mL时检测结果为阳性(表1)。根据此结果可得出本发明的试纸条的敏感性比胶体金试纸条和RT-PCR检测方法提高10倍。
0.01，根据试纸条临界值(0.066)可得出结果当病毒含量为10个TCID50/mL时检测结果为阳性(表1)。根据此结果可得出本发明的试纸条的敏感性比胶体金试纸条和RT-PCR检测方法提高10倍。
[0098] 表1用本发明试纸条检测含有不同浓度的病毒样本
[0099]
[0100] 2.4试纸条的临床应用
[0101] 内蒙通辽某猪场送检6份仔猪肠道样品进行检测，RT-PCR检测结果如下：病料中有5份样品检测PEDV核酸阳性，只有3号呈PEDV阴性反应(图6)。用本发明试纸条进行检测，检测结果如表2所示，根据0.066的临界值可定只有3号样本为PEDV阴性，其他五份均为PEDV阳性这一结果与RT-PCR检测结果一致。
[0102] 表2本发明试纸条检测临床样本数据及判定结果
[0103]
[0104] 表注：“+”指示该样品为PEDV阳性，“-”指示该样品为PEDV阴性。
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