本发明涉及任何一种通过其苷部分共价固定在不溶载体上的单宁酶，本发 明还涉及一种用于制备茶浸出物的新方法，该方法使茶脂增溶成为可能。

红茶，用来制作热饮和冷饮，传统制备红茶的方法是将新鲜的绿茶叶子经 过各种处理，包括叶子用氧化酶发酵，这个步骤主要是为了得到赋予红茶特征 感观和颜色品质的化合物。当红茶用热水浸提时，由于形成部分不溶性的多酚 酯复合体和咖啡因复合体，一旦冷却至55℃以下，甚至60℃以下温度 时就有沉淀出现，这个沉淀通常的说法称作“茶脂”或“脂油”。

因此，制作红茶的冷饮时需要将茶脂除去。所以EP198209( Societe des Produits Nestle S.A.)中提 出将红茶叶用60-130℃水浸提，得到与茶叶分开后第一次浸出液，将 其浓缩至固形物含量5-12.5％，然后冷却至5-15℃以便形成从第 一次浓缩浸出液中分离出来的不溶性脂油，并且再次用40-70℃水浸提， 得到从仍然是不溶的脂油中分离出来的第二次浸出液，然后混合第一次浸出液 和第二次浸出液。该方法的缺点是除掉了固形物。此外，除去脂油引起香味明 显地损失。

为了克服这些问题，有人设想使用鞣酸酰基水解酶，通常叫作单宁酶，去 水解多酚酯，尤其是多酚棓酸酯，而多酚酯会与咖啡因形成复合体并且形成 茶脂。虽然单宁酶确实可以充分地减少茶脂的形成，但是酶的费用高以及在 40℃以上温度时的不稳定阻碍了单宁酶的使用(Thomas R.L.等 人，Journal of Food Science，50，1126- 1129，1985)。

为了解决酶的费用和不稳定问题，GB1，380，135( Unilever N.V.)提出了在高温下用通过其肽部分共价固定在不溶载 体上的单宁酶处理茶的水浸出物。使用的温度一般约为50℃，为的是能够 在沉淀之前处理脂油。遗憾的是，固定化酶没经几次作用物之后就基本上丧失 了活性，这在经济和工业上几乎没有价值。

EP0,391,468(Unilever N.V.)提及了其它一 些缺点，如脂油的增溶作用不足。还常常观察到许多酶从载体上脱离下来。

同样，US4,051,264(Lipton Inc.)提出用自 由单宁酶或通过其肽部分共价固定化单宁酶在厌氧条件下直接处理绿茶叶切成 的薄片，处理的温度和时间足以使低温下叶浸出能力增强，发酵叶子为的是获 得红茶叶，并将其加热直至其水分含量低于5％。还应注意的是用于固定化酶 不引起酶活性基本上丧失的反应温度不能超过4℃(见上述专利的表4)。

本发明的目的是克服现有技术的缺点。为此，本发明涉及任何一种通过其 苷部分共价固定在不溶载体上的单宁酶。

本发明还涉及一种茶浸出物的制备方法。其中制备茶叶的水浸出物，并且 在20-65℃下用其苷部分共价固定在不溶载体上的单宁酶处理浸出物。

根据本发明的固定化单宁酶具有的优点是在大于50℃或55℃甚至 大于60℃温度的整个时期都特别稳定，因此可以证明本发明的单宁酶具有 一个临界温度，超过这个温度酶就变得不稳定，该临界温度比自由酶的临界温 度高15℃-25℃，这在固定化酶领域中是特别不寻常的。

另一个优点在于这样的事实，即没有观察到有单宁酶从载体上脱离并且在 经历了至少400次作用物后酶仍具活性。这个整个时期的稳定性非常令人惊 奇而且不能完全预测，特别是它与GB1,380,135或US4,051, 264中固定化单宁酶的稳定性相比时。

本发明方法的另一优点是可以在不利于细菌生长的温度下操作，这样改进 了该方法的生物卫生条件。

本方法还有一个优点是在55℃-70℃温度时茶脂的可溶性特别好， 这样使固定化单宁酶较好地水解多酚复合体。如果并非不可能的话，本方法避 免了固形物质困难的转移，从而极大地加快速度并且增加脂油增溶的最终产量。

最后，本发明还具有茶浸出物可以在搅拌罐型反应器和在包括固定化单宁 酶固定床或流化床的反应器中被水解的优点。

在以下的描述中，“搅拌罐型反应器”意思是指悬浮体中含有固定化单宁 酶的机械搅拌系统。还应说明“固定化单宁酶固定床”意思指固定在载体上或 固定在载体中的单宁酶被压紧在反应器中，用来连续处理液体茶浸出物。同样 “固定化单宁酶流化床”指固定在载体上的单宁酶被放置但并不压紧在用来连 续处理液体茶浸出物的反应器中。茶浸出物流从底部循环至顶部，然后产生载 体颗粒的悬浮体。

应说明红茶和乌龙茶分别是山茶属(Camellia)、茶树上得到的 绿茶叶、特别是普洱茶(C.Sinesis)和毛蕊茶(C. assaimica)茶树上的绿茶叶经过完全和部分酶氧化的产品。还可以 使用叶睛珠属(phyllanthus)。儿茶属(Catechu)、 棕儿茶属(Gambir)或钩藤属(Uncaria)的品种。

最后，以30℃下1分钟内水解1μmol pH5的棓酸甲酯所需 单宁酶的量确定为单宁酶的单位。

为实施本方法，将任一品种茶树上得到的茶叶最好是红茶或乌龙茶的叶用 水浸提。通过本领域技术人员公知的任何一种浸提茶叶的方法制备茶的水浸出 物。例如，每份干重量茶叶可以用2-25份重量的水，优选用4-15份重量 特别优选5-12份重量的水。浸提过程可以按常规，例如最多30分钟，优选 2-15分钟且特别优选5-12.5分钟。水温可以是惯用温度、如最高达 130℃，优选60℃-125℃，且特别优选75℃-120℃， 甚至85℃-110℃。

浸提叶可在包括水和叶子的搅拌罐中进行。浸提还可以通过渗滤或者在逆 流系统中连续进行，其中在逆流系统中水在包括茶叶的槽中朝着与重力相反的 方向流动。有关制备茶浸出物的学说描述于EP198209.EP481 262.EP654221和EP95202228.3，本发明的说明书将 这些内容引入进来。

接下来分离开茶叶，并且用本领域技术人员公知的任何方法处理含有1％ -11％重量固形物的水浸出物，例如用浓缩的方法处理直至得到5-15％ 重量的茶浸出物。还可以将浸出物冷却至4℃-20℃，提浓浸出物的脂 油部分，造成脂油出现，然后用例如过滤或离心的方式分离脂油。还可以用热 水优选60℃-80℃的水对分离后的脂油进行再增溶。

还可以进行香味物质的提取，在例如该工序结束阶段重新掺入浸出物中。

最终，含有希望用单宁酶增溶的脂油的水浸出物可能具有1％-30％干 物质含量、优选1％-20％。

然后用其苷部分共价固定在不溶载体上的单宁酶处理浸出物。所用单宁酶 是公知的水解茶多酚化合物棓酸酯的糖蛋白。单宁酶可以从曲霉属 (Aspergillus)的某真菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)或米曲霉 (Aspergillus oryzae)，或者从青霉属 (Penicillium)的如黄青霉(penicillium chrysogenum)，还可以从假丝酵母属(Candida)的酵母中 获取。有两株微生物公知产生相当多量的单宁酶，如Aspergillus oryzae ATCC No.9362和Aspergillus niger ATCC No.16888。此外可以从市售得到提纯粉末状 的单宁酶，例如由公司Enzyme Development Corporation(Tannase SN.Y.USA) 或Kikkoman(Tannase Kikkomann50000 U/gJapon)市售的)。

优选所选的载体具有数量级为20-2000nm的平均直径的微孔，尤 其是50-1000nm。它可以是无机载体，可选自硅石、玻璃、金属氧化 物如矾土、或天然矿石如皂土的颗粒。它还可以是有机载体，可选自聚糖如纤 维素、糊精或几丁质、蛋白、如丝，或者含有聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基 丙烯酸酯类如Eupergit(Rohm，Germany)、聚乙 烯和聚酰胺如尼龙类型的合成聚合物。

通过把载体上能够接合的基团导入至单宁酶的氧化苷部分，如载体的游离 胺基或酰肼基，以此可活化载体。很多活化载体的方法对本领域技术人员是公 知的，他们能够根据载体选择适于和单宁酶苷部分接合的活性基团。作为举例 可效仿Marek等人描述的固定化方法(Biotechnology and Bioengineering，26，1223-1226， 1984)。

单宁酶还可以预先改良，例如可用常规氧化单宁酶的方法。可以这样：用 0.01-1M的pH4-6高碘酸盐溶液在0℃-25℃温度下氧化1 -120分钟。加入还原溶液如1-3M乙二醇溶液停止氧化反应。氧化单宁 酶然后优选从氧化溶液或还原溶液中纯化一下，例如在合适的缓冲液中透析， 尤其在0.01-1M的pH5-7磷酸钠缓冲液中。

将氧化单宁酶固定到能够与由此产生的醛基反应的载体上。为此，可以例 如用0.1-1M pH4-9己二酰二肼溶液、用0.1-1M pH4-9乙 二胺溶液、或用0.1-1M pH4-9六亚甲基二胺溶液改良 Eupergit-C。1g当量干重量的改良载体可以和至少10 mg氧化单宁酶在4-30℃下混合1-30小时，优选20-300mg。

用二胺偶联的话，还可以用氢硼化钠或氢硼化氰还原使亚胺基固结。

在最后的分析过程中，最好用本领域技术人员公知的技术钝化剩余的官能 团。但是这个钝化步骤在获取活性固定化单宁酶时并不重要。

固定到载体上单宁酶的量为每g载体上至少10mg单宁酶、优选20- 100mg。固定化单宁酶活性至少为40单宁酶单位/每g载体，例如40 -200单位。

当用本发明的固定化单宁酶水解茶浸出物时，在使用酶的开始阶段发现有 茶的成份吸收到载体上。这些成份偏巧与茶的颜色和味道有关。因此最好使用 在茶浸出物中预先保温过至少一次的本发明的固定化单宁酶。

在本发明的第一个优选实施方案中，茶浸出物是在搅拌罐型反应器用本发 明固定化单宁酶水解的。系统可以根据以下三个阶段自动并且以半连续模式操 作。第一步，将需要处理的茶浸出物填入罐中，然后随着机械搅拌进行水解， 最后在一定时期后排空罐。在罐的下部安装滤器，通过这个方式可以达到酶保 留在反应器中。这个滤器例如可以保留40μm以上直径的任何颗粒。为了处 理茶浸出物，在罐中将1份重量的浸出物与少于1份重量的载体混合，如与 0.0001-0.1份的载体混合，然后在20-65℃下搅拌并保温10- 200分钟，优选在50-65℃甚至55-65℃下保温10-100 分钟。

根据这个水解方式，可以发现本发明的固定化单宁酶具有显著的稳定性， 因为它们在最高60℃时多次反复使用之后，尤其是在30℃-60℃ 温度下经过5-420次30分钟的循环后保留100％的酶活性，大量的循 环次数相对应于低温，相反则不然。最终在65℃下酶渐渐地随时间丧失其 活性，最好标注为其使用的上限。

本发明第二个优选实施方案中，将液体茶浸出物在本发明包括固定化单宁 酶固定床的反应器中连续水解。每份重量固定床优选通过至少1份重量的浸出 物，例如在20-65℃优选50-65℃甚至在55-65℃温度下 通过10-10,000份浸出物。

本发明的第三个优选实施方案，将液体茶浸出物在本发明包括固定化单宁 酶流化床的反应器中连续水解。每份重量固定床优选通过至少1份重量的浸出 物，例如在20-65℃优选50-65℃甚至在55-65℃温度下 通过10-10,000份浸出物。

即使经过本发明固定化单宁酶的全面水解后，处理过的浸出物仍可能具有 单宁酶不能增溶的不溶物。因此必须在将浸出物冷却至4-20℃后通过过 滤或离心把它们分开。这个常规叫作“精练”的操作早已于GB1,380, 135和EP391468中有所描述。

然后可以用传统方法将处理后的浸出物制备成速溶茶粉。如果浸出物是直 接从茶叶的粗浸出物中获得的，可以将其浓缩并干燥，例如通过冷冻干燥或喷 雾干燥。如果浸出物是从茶叶粗浸出物预先分出的茶脂中获得的，可以将其与 粗浸出物混合后再浓缩且干燥。

用水沏泡后的茶粉优选含有0.25-0.3％重量的茶固形物并且具有 4.5-5.5的pH值。它具有浊度，在10℃下用Hatch Ratio Turbimeter(Hatch Company，Colorado， USA)以“浊度比浊计单位”(NTU)测定时，小于50NTU，优选小 于35NTU，例如5-15NTU。通过本发明方法获得的茶粉是只含有茶 浸出物的产品，它速溶于冷水，得到的饮品其颜色和滋味经很长时间都特别稳 定而且得到品尝者的赞赏。

下面给出的实施例用来说明本发明的方法和固定化单宁酶。这些实施例中 使用市售的商标为kikkoman50000U/g的单宁酶，而且 在某些实施例中，使用能够便于并精确评价根据本发明所制备固定化单宁酶卓 越稳定性的棓酸甲酯溶液作为典型作用物。在描述这些实施例之前先介绍测 定单宁酶酶活性的方法，测定茶中棓酸的方法以及附图介绍。 单宁酶酶活性

使用高效液体色谱法(HPLC)测定棓酸甲酯水解后释放的棓酸来确 定单宁酶的活性。为此，将0.5ml酶溶液与1.5ml在50mM pH5乙 酸盐缓冲液中的棓酸甲酯溶液混合。实际操作中，酶样品在保温前要稀释， 以便反应结束时棓酸浓度不超过1mM。

混合物在30℃下保温15分钟，用0.2ml的2M HCl结束反 应，具有2％乙酸∶乙腈(78∶22v/v)作为流动相的反相KS 250/6/4Nucleosil100-5C18柱中注入 10μl混合物，在异构裂化条件下(isocratic conditions)以1ml/min的速率进行洗脱，用分光光度检 测法在278nm下进行评测。 测定棓酸

用与上述相同的柱通过HPLC测定由单宁酶在茶中产生的棓酸，测定 速率为1ml/min，柱使用下列成份：0-5分钟，88％A和12％B； 5-16分钟；75％A和25％B；16-25分钟：88％A和12 ％B(A＝乙酸，B＝乙腈)。 附图

图1：棓酸释放作为在30℃“搅拌罐”型反应器中水解循环次数 的函数。

图2：棓酸释放作为“搅拌罐”型反应器中温度从30℃变化至 65℃时水解循环次数的函数。 对比实施例

将酶固定到Eupergit上的常规方式是让酶蛋白部份的胺残 基和载体的环氧乙烷基团反应。通过磷酸浓度为1M在与EP676145实 施例3显示的相似条件下引发反应。

我们可以观察到在以下表1显示的条件下将单宁酶Kikkoman 50000/g固定到不同Eupergit载体上是不可能 的，这种情况更是当单宁酶被渗析以便得到提纯时或者当使用具有大孔径或无 孔Eupergit-C使单宁酶较易进入到载体环氧乙烷基的时候。

因此单宁酶不是那种通过其肽部分可容易被共价固定的酶。这可以部份地 解释现有技术中描述的固定化单宁酶具有没有工业和经济吸引力的缺点的原因。 表1 试验1 试验2 实验3 实验4 载体 Eupergit-C Eupergit-C Eupergit 250L Eupergit -C12 排阻限 200KD 200KD 1000KD 无孔 载体(干)浓度 133g/l 133g/l 133g/l 75-125-250 g/l (三次试验) 单宁酶 (蛋白)浓度 10g/l 10g/l 10g/l 4g/l 介质 1M 磷酸钾 PH6 1M 磷酸钾 PH7.5 1M 磷酸钾 PH6 1M 磷酸钾 PH6 反应时间 70小时 48小时 48小时 48小时 反应温度 22℃ 22℃ 22℃ 22℃ 优先渗透 没有 有 没有 有 单宁酶的固定 没有 没有 没有 没有 实施例1

在控制条件下用高碘酸盐氧化单宁酶kikkomann50000U/g。为 此，将4.5ml含有22.22g/l单宁酶粉末的0.1MPH5.5醋酸钠 缓冲液和0.5ml含有0.1mM高碘酸钠的0.1MPH5.5醋酸钠缓冲液 混合。让混合物在0℃下暗处氧化60分钟，添加0.5ml的2M乙二醇 溶液结束反应，然后在0.1MPH6磷酸钠缓冲液4℃条件下渗析混合物。

另一方面，将20ml含有0.2M己二酰二肼的0.2MPH8磷酸钠缓 冲液和1g干Eupergit-CR混合。混合物在室温下经轻搅拌保 温16小时，然后用蒸馏水彻底洗涤载体并用0.1MPH6磷酸钠缓冲液彻 底冲洗。

然后将1g当量干重量的湿改良Eupergit-C和5.4 ml氧化单宁酶溶液混合，混合物在4℃下经轻搅拌保温16小时，在0.1 MPH6磷酸钠缓冲液中洗涤载体。最后载体具有每g干载体有20mg单宁 酶蛋白。 实施例2

在传统搅拌罐型反应器中，用150mg当量干重量实施例1的固定化 单宁酶处理40ml由20mM在50mMPH5醋酸钠缓冲液中的棓酸甲 酯组成的作用物。然后调整单宁酶用量，使作用物在30分钟得以水解75％。

具体说该反应器包括一个管式玻璃体，玻璃体下部包含一个联接蠕动泵、 孔隙度约40μm的滤器，以便收集水解产物，其顶部包含蠕动泵的出口，以 便作用物进入。反应器浸入30℃水浴中。

第一步，作用物进入反应器中，约110秒后混合27分又20秒钟，最 后收集50秒的反应介质。这个约30分钟的循环要连续进行420次，然后 用上述HPLC法测定每次循环反应介质中释放的棓酸的量。示于图1的结 果表明实施例1的固定化单宁酶在420次30℃连续水解循环之后保留着 100％活性。 实施例3

1g干Eupergit-C和20ml含有0.175M乙二 胺的0.3MPH8磷酸钠缓冲液混合，然后在室温下将混合物经轻搅拌保 温16小时，用蒸馏水然后再用0.1MPH6磷酸钠缓冲液彻底洗涤。得 到经乙二胺改良的Eupergit-C。

1g当量干重量改良湿Eupergit-C和5.43ml实施 例1描述的氧化单宁酶溶液混合，室温下轻搅拌混合物并保温16小时，然后 在0.1MPH6磷酸钠缓冲液中洗涤载体。得到每g干载体含有25mg 单宁酶蛋白的Eupergit-C。 实施例4

用148mg当量干重量实施例3的固定化单宁酶在实施例2描述的反应 器中于30℃下处理40ml实施例2的作用物。至于35℃-65℃ 循环时酶的量减至88mg。

在30℃下连续进行139次循环，35℃下循环61次，40℃ 时循环189次，45℃循环42次，在50℃下循环10次，55℃ 下循环37次，60℃循环8次65℃下循环8次。

示于图2的结果与示于图1的结果相似，即在实施例3固定化单宁酶在 30℃下连续水解139次循环后保留着100％活性。实施例3的固定化 单宁酶整个时间都令人惊奇地稳定，但应注意到温度。事实上，在充分使用酶 的条件下最高到60℃酶才真正保持100％的活性。最终在65℃时酶 随时间逐渐丧失活性。

作为对比，自由单宁酶在大于40℃温度时便很快丧失活性 (Thomas等人)。 实施例5

制备茶浸出物，是通过将1kg优质红茶叶(Darjeeling Fop)和15升95℃的去离子水混合10分钟，并且通过40μ滤器热 滤去除茶叶来制备茶浸出物的。从而得到含有2.29％固形物的浸出物。

根据实施例3描述的工艺制备的大量固定化单宁酶，用上述茶浸出物漂洗 数次，使制备物饱和并平衡。

将15g这种湿固定化单宁酶加入到1升55℃的浸出物中。在 55℃下搅拌混合物1小时，然后通过40μ滤器分离浸出物。这样回收后 的固定化单宁酶用同样的初始浸出物并在同样条件下陆续重复使用3次。用氢 氧化钠溶液调节浸出物至PH5，然后冷却至4℃，测定所形成不溶物质的 量并和未处理初始浸出物产生的不溶物质量相比较。

下列表2显示得到的结果。可以看到处理物使茶脂的量得以明显地减少， 甚至在重复使用固定化单宁酶之后也是如此。 表2   浸出物中总   的固形物％    4℃时的不溶    物％(基于总    的固形物)   4℃时，没有   增溶的可溶物   ％     释放的棓     酸(g/l) 未处理 第1次处理 第2次处理 第3次处理 第4次处理     2.29     2.29     2.29     2.29     2.29     28.7     4.24     4.20     4.30     4.20   100   14.8   14.6   15.0   14.6      -     2.19     2.17     2.19     2.17

将四份处理过的浸出物合并然后当其冷却时以10,000转/分钟条件 离心15分钟。蒸发掉上清液后冷冻干燥。得到茶粉，当沏泡时它在冷水中具 有非常好的溶解性，典型茶浸出物的棕红色和红茶的口味特征，即保留着红茶 的天然涩味。饮品的浊度小于30NTU。 实施例6

使用实施例5的红茶叶浸出物，这次是将其通过保持55℃且含有25 g实施例5湿固定化单宁酶的柱。浸出物以1l/h速度泵入，并且在平衡之 后在柱的出口处回收。用氢氧化钠溶液调节每11等分试样的PH值至5，然 后冷却至4℃。

冷离心之后，去掉上清液，浓缩并冷冻干燥。得到的粉末当低温的情况下 也完全溶解，还具有品尝者所需要的口味和颜色。饮品浊度小于30NTU。