促甲状腺素即促甲状腺激素(TSH)是一种通过TSHR调节甲状腺 功能的垂体激素(Szkudlinski MW，Fremont V，Ronin C，Weintraub 2002 Thyroid-stimulating hormone and TSHR structure-function relationships. Physiological Reviews 82：473-502)。TSH结合到TSHR引发受体发出信 号，其促进甲状腺激素甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的形成 与释放。有一种反馈机制涉及循环中T4和T3的水平以及由下丘脑分泌 的促甲状腺素释放激素(TRH)，这种机制控制TSH的释放，TSH反过 来控制甲状腺刺激和血清中甲状腺激素的水平。
TSHR是一种G蛋白偶联的受体，其含有三个结构域：富亮氨酸结 构域(LRD)、切割结构域(CD)和跨膜结构域(TMD)(Miguel R， Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M，Richards T，Blundell TL， Rees Smith B，Furmaniak J 2004Analysis of the thyrotropin receptor-thyrotropin interaction by comparative modeling.Thyroid 14： 991-1011)。TSHR与其他糖蛋白激素受体即黄体生成素受体(LHR)和促卵 泡激素受体(FSHR)具有氨基酸和结构类似性。与其配体(即FSH)复合 的FSHR的结构已经在2.9的分辨率下被揭示(Fan QR，Hendrickson WA 2005Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor.Nature 433：269-277)。
本领域的很多资料说明，某些自身免疫性甲状腺病患者(AITD，一 种影响世界范围内不同人群的最常见的自身免疫疾病)具有与TSHR反应 的自身抗体(Rees Smith B，McLachlan SM，Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor.Endocrine Reviews 9： 106-121)。在大多数情况下，这些自身抗体与TSHR结合并模仿TSH的 作用，从而刺激甲状腺产生高水平的T4和T3。这些自身抗体被称为促 甲状腺自身抗体即TSHR自身抗体(TRAb)，其具有刺激活性即TSH激动 活性。反馈机制通常可控制甲状腺功能，但在促甲状腺自身抗体存在的情 况下和在具有甲状腺机能亢进症状(血清中甲状腺激素过多)的患者中不 再有效。这种病症被称为甲亢或Grave氏病。某些患者中具有刺激活性 的TRAb被认为在眼球后组织中与TSHR相互作用，并导致Grave氏病 的眼睛症状。
某些AITD患者中的自身抗体与TSHR结合，从而阻止TSH与所述 受体结合，但没有刺激TSHR活性的能力，这些类型的自身抗体被称为 具有阻断活性即TSH拮抗活性的TRAb。
TSHR自身抗体以高浓度存在于怀孕妇女的血清中时，可穿过胎盘并 导致新生儿甲亢(刺激性自身抗体的情况下)或新生儿甲状腺机能减退(阻 断性自身抗体的情况下)(Rees Smith B，McLachlan SM，Furmaniak J 1988supra)。
作为强力促甲状腺因子(hMAb TSHRl)的人类单克隆自身抗体在国 际专利申请WO2004/050708A2中有详细描述。hMAb TSHRl的结合位点 被发现位于TSHR富亮氨酸结构域(LRD)的表面，并与TSH结合位点广 为重叠。然而，TSH或hMAb TSHRl的结合袋(binding pocket)具有 一定构象，包括折叠在一起的TSHR的不连续区域。hMAb TSHRl的结 合位点的细节特征，尤其是在TSHR和hMAb TSHRl相互作用中重要的 接触氨基酸的细节特征，对旨在提高与TSHR自身免疫反应有关的疾病 的诊断和管理的研究中是非常重要的。
国际专利申请WO 2006/016121A公开了一个包括至少一个点突变的 突变TSHR制剂，其可用于对被筛选的患者体液样品中患者血清刺激性 TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和促甲状腺激素进行 差别筛选和鉴定。国际专利申请号WO2006/016121A所述的发明提供了 关于TSHR区域的有用信息，所述TSHR区域对于与包括hMAb TSHR1、 具有TSHR阻断活性的小鼠单克隆抗体(9D33)在内的多种抗体以及与 TSH的相互作用很重要。然而，即便是最好的实验研究(例如在 WO2006/016121A中描述的涉及TSHR突变的那些研究)也无法得到 TSHR中的氨基酸与hMAb TSHRl中的氨基酸之间在原子水平上的相互 作用的细节。
本发明基于由TSHR LRD片段(参与形成TSH和hMAb TSHRl的 结合袋)和hMAb TSHRl的Fab片段形成的复合物的制剂。为方便起见， 本说明书所述的hMAb TSHRl制剂被称为M22。M22IgG可从RSR公 司购得。包含氨基酸1-260的TSHR片段(TSHR260)与hMAb TSHRl(M22) Fab片段的复合物被称为TSHR260-M22。将TSHR260-M22纯化、浓缩 和结晶。得自X射线衍射的数据用于揭示TSHR260的结构，如本发明所 述。以前的文献描述了在1.65的分辨率下揭示的M22Fab的结构 (Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M，Richards T，Kiddie A， Brereton K，Premawardhana LDKE，Chirgadze DY，Nunez Miguel R， Blundell TL，Furmaniak J，Rees Smith B 2004Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor：sequence structure and function.Thyroid 14：560-570)。将复合物中的M22与未结合的M22 其结构比较。然后在原子水平上精确研究TSHR260和M22之间的相互 作用。
现在，还无法获得其TSH和TRAb结合活性完好无损的经高度纯化 的TSHR制剂。本领域所述的经纯化TSHR制剂是部分变性的，并且没 有达到结晶所需的足够的纯度和均一性。

本发明的一个方面提供了一种可结晶的组合物，包含TSHR多肽， 即含有源于促甲状腺素受体的一级序列的相邻氨基酸的多肽。
本发明的另一方面提供了一种包含TSHR多肽的晶体。
本发明的另一方面提供了一种包含TSHR多肽和TSHR结合实体 (entity)的可结晶复合物。
这种复合物的优点在于TSHR结合实体可稳定所述TSHR多肽。本 发明还提供产生包含TSHR多肽和TSHR结合实体的可结晶复合物的方 法，其中所述TSHR结合实体对所述TSHR多肽与对TSH相比具有相对 高的亲和性，并可稳定所述TSHR多肽。一种合适的TSHR结合实体是 M22。TSHR接头可用于在TSHR多肽产生时对其进行稳定。例如，在 表达编码TSHR-多肽的DNA构建体的细胞如昆虫细胞中产生TSHR多 肽时，可向该细胞加入TSHR接头如M22Fab，从而在TSHR多肽分泌 时将其“捕获”和稳定。
本发明的另一方面提供了一种通过表达编码TSHR多肽的DNA构建 体来产生TSHR多肽和TSHR接头的复合物的方法，所述方法包括表达 TSHR多肽和添加TSHR接头以稳定分泌的TSHR多肽。
本发明的另一方面提供了一种通过表达编码连接至TSHR结合实体 如M22的TSHR多肽的DNA构建体来产生TSHR多肽和TSHR接头的 复合物的方法，所述方法包括表达连接至TSHR结合实体的TSHR多肽。
本发明的另一方面提供了一种包含TSHR多肽和TSHR结合实体的 共结晶(co-crystal)。
TSHR多肽优选地包含哺乳动物TSHR序列。优选地，所述哺乳动 物序列是人源的，但是也可考虑使用猩猩、非洲绿猴、猕猴(rhesus monkey)、犬、猫、猪、马、牛或豚鼠。优选地，所述TSHR多肽包括 TSHR富亮氨酸结构域的至少一部分，最优选的是人类序列。优选地，所 述TSHR多肽包括野生型人类TSHR序列的氨基酸22-260。本发明复合 物中的TSHR多肽可包含完TSHR野生型全长序列。或者，所述TSHR 多肽可包括野生型序列的突变序列。例如，野生型序列的特定氨基酸可被 其他氨基酸所置换。这些取代是保守的，即一个氨基酸被另一个具有相似 性质的氨基酸置换。TSHR结合实体可是一个抗体或其一部分。一个合适 的抗体是一个自身抗体或其一部分或源自此自身抗体的TSHR结合实体。 合适的抗体包括单克隆抗体。一个合适的抗体部分是M22Fab。
本发明的另一方面提供了一种包含晶体形式的TSHR多肽的共结晶， 所述TSHR具有图9a或9b的通过X射线晶体学测定的定位数据 (co-oridinate)。
对本发明共结晶的分析提供了与TSHR260复合的M22在2.55分 辨率下的原子定位数据和结构因子。这种水平的置信度只能从对由这两个 分子(TSHR和M22)形成的复合物的结构在高分辨率下进行的X射线 晶体学分析中得到。这是有益的，因为与预测对于结合而言重要的氨基酸 的其他方法相比，只有对两个分子之间的复合物进行的晶体结构分析可对 相互作用(包括参与的残基的原子间的距离)进行识别。另外，受体和配 体之间的复杂相互作用只能从晶体结构中获得。
与TSHR复合的M22的晶体结构所提供的信息令人惊奇。特别地， 以前无法获得所述信息，诸如建模和突变实验的研究只能提供关于参与 TSHR和TSH之间以及TSHR和TSHR自身抗体之间相互作用的氨基酸 的基本线索。所有这些早期研究都显示在对TSH和TSHR自身抗体的 TSHR结合位点之间存在很大的重叠。还清楚地显示TSHR和FSHR在 结构上密切相关。
然而，没有结果表明TSHR自身抗体(如M22)与TSHR之间的相互作 用的全部复杂程度或TSHRLRD的真实详细结构。
本发明的另一方面提供可机读的数据存储介质，所述介质由与图9a 或9b的TSHR多肽氨基酸或其同系物的至少一部分定位数据有关的数据 编码。优选地，所述数据包括所有图9a或9b的TSHR多肽氨基酸定位 数据。
本发明的另一方面提供一个用于展示TSHR多肽或其同系物的三维 结构图的计算机系统，其中所述同系物距离主干原子具有0到4的均 方根偏差，所述计算机系统包括所存储数据对应图9a或9b的TSHR多 肽氨基酸定位数据的数据存储介质。所述计算机系统还可包括所存储数据 对应与TSHR多肽或其同系物相互作用的化学实体的定位数据的数据存 储介质。
优选地，所述计算机系统用于提供与化学实体相互作用的TSHR多 肽或其同系物的三维结构图。所述化学实体可是一个抗体或其一部分。优 选地，所述抗体部分是M22Fab。
所述计算机系统可包括用于显示TSHR多肽三维结构图的显示器。 优选地，所述计算机系统用于显示与TSHR多肽或其同系物相互作用的 化学实体。
本发明的另一方面提供TSHR多肽的三维结构的电子图像。优选地， 所述TSHR多肽包括人类TSHR的富亮氨酸结构域。更优选地，所述图 像至少显示人类TSHR的氨基酸30-257。本发明的另一方面提供TSHR 多肽及其抗体或它们的一部分的三维结构的电子图像。
本发明的另一方面提供了一种识别与TSHR或其同系物的至少一个 氨基酸相互作用的化学实体的方法，所述TSHR或其同系物的三维结构 由根据本发明的前一方面的计算机系统所提供的图像或者电子图像展示。 所述化学实体可是TSHR激动剂或拮抗剂。与TSHR氨基酸K129、E107、 K58和Y185中的至少一个通过形成氢键相互作用的化学实体可被识别。 或者或另外，与TSHR氨基酸残基R255、R80、Kl29、R38和Kl83的至 少一个形成范德华力相互作用的化学实体可被识别。或者或另外，与 TSHR氨基酸残基D151、K58、Kl29、R80、K209和Kl83的至少一个形 成静电相互作用的化学实体可被识别。或者或另外，与TSHR氨基酸残 基K209通过形成离子对相互作用的化学实体可被识别。
本发明另一方面提供一种识别可能会干扰自身抗体与TSHR结合的 化学实体的方法，所述方法包括识别与在TSHR富亮氨酸结构域N末端 凹面的高度带正电荷的脊相互作用的化学药品。所述自身抗体可能是促甲 状腺自身抗体或TSH拮抗剂即具有阻断活性的TSH自身抗体。合适的化 学实体可与下列TSHR氨基酸中的至少一个相互作用：R38、K58、R80、 Hl05和Kl29。
本发明另一方面提供了一种识别可能会干扰自身抗体与TSHR结合 的化学实体的方法，所述方法包括用本发明前一方面的计算机或电子图像 识别至少基本充满由M22高变区H1、H2和H3(图5)构成的M22表 面上带负电荷的空腔的化学实体的方法。所述自身抗体可能是促甲状腺自 身抗体或TSH拮抗剂即具有阻断活性的TSH自身抗体。
通常这种方法包括识别至少基本破坏TSHR残基R255与促甲状腺自 身抗体结合的化学实体。或者或另外，所述方法包括识别破坏人类TSHR 残基K209与促甲状腺自身抗体结合的化学实体。
本发明方法中，测定了某种化学实体与其它受体可能的相互作用，所 述化学受体被识别为可与TSHR多肽结合，或者可干扰与TSHR接头的 TSHR多肽的结合。一种可能的相互作用的形式是结合。其他受体可能包 括促卵泡激素受体或黄体生成素受体。
本发明的另一方面提供了一种检测TSHR的自身抗体的方法，包括 比较推测的自身抗体和通过本发明方法识别为与TSHR多肽相互作用的 化学实体与TSHR多肽的结合。
本发明在多个方面有利，因为其使得技术人员可设计出特异性阻止促 甲状腺自身抗体与TSHR结合的新药物组合物，从而提供对自身免疫疾 病如Grave氏病的新疗法。本发明还使得技术人员可设计特异性刺激含 有TSHR的组织的新药物组合物。
本发明的另一方面提供通过本发明前一方面的方法识别的化学实体。 本发明的另一方面提供包含至少一个这种化学实体的化合物。本发明的另 一方面提供包含这种化合物和一种药学可接受载体的药物组合物。
这种药物组合物适用于自身免疫性甲状腺病的治疗。或者，这种药物 组合物可适用于Grave氏病的治疗。还提供一种用于刺激含有TSHR的 组织的药物组合物。
本发明提供的化学实体可能适用于检测TSHR的自身抗体。
本发明的另一方面提供了本发明前述方面的化学实体或化合物在制 备治疗自身免疫性甲状腺病的药剂中的用途。
本发明的另一方面提供了本发明前述方面的化学实体或化合物在制 备治疗Grave氏病的药剂中的用途。
本发明的药物组合物包含任一本发明所述化合物和其药学可接受的 盐，以及任何药学可接受的载体、佐剂或运载体。可用于本发明药物组合 物的药学可接受的载体、佐剂和运载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、 硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、 甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、 盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、 硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤 维素钠、聚丙烯酸酯、蜡，聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛 脂。
本发明的药物组合物的给药可通过口服、非经肠、喷雾吸入、局部、 滴眼液或眼膏、直肠、鼻腔、口腔、阴道或植入储存器。我们优选口服或 注射给药。本发明的药物组合物可含有任何传统的无毒药学可接受的载 体、佐剂或运载体。本文所用的术语“非经肠”包括皮下、皮内、静脉内、 肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输液技术。
所述药物组合物可为无菌可注射制剂的形式，如无菌可注射的水或油 悬浮液。这种悬浮液可依照已知技术使用合适的分散剂或润湿剂(如 Tween 80)和助悬剂制成。无菌可注射试剂也可是由无毒肠外可接受的稀 释剂或溶剂制成的无菌可注射溶液或悬浮液，如溶于1，3-丁二醇的溶液 形式。可使用的可接受的运载体和溶剂是甘露醇、水、林格氏液和等渗氯 化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常被用作溶剂或助悬介质。为此目 的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。脂 肪酸如油酸及其甘油衍生物可用于制备可注射剂，正如天然的药学可接受 的油类(如橄榄油或蓖麻油)尤其是其聚氧乙基化形式一样。这些油溶液 或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂如Ph.Helv或类似的醇。
本发明的药物组合物可以任何口服可接受的药剂形式口服给药，包括 但不限于胶囊、片剂和水悬浮液和溶液。对于口服用片剂，常用的载体包 括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂如硬脂酸镁。对于口服用胶囊形式， 有用的稀释剂包括乳糖和干的玉米淀粉。当水悬浮液用于口服时，其活性 成分与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要，还可加入某些甜味剂和/或调味 剂和/或色素。
本发明的药物组合物也可以直肠给药用栓剂形式给药。可通过将本发 明的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，所述赋形剂 在室温下为固态但在直肠温度下为液体，因而会在直肠中溶解从而释放出 活性组分。这种材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
当所需治疗包括局部施药容易到达的区域或器官时，本发明药物组合 物的局部给药尤其有用。对于局部皮肤给药，所述药物组合物应该制成含 有悬浮或溶解于载体中的活性组分的合适的软膏。用于本发明化合物局部 用药的载体包括但不限于矿物油、液化石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯 聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所述药物组合物可制成含有悬浮或 溶解于载体中的活性化合物的合适的洗剂或霜剂。合适的载体包括但不限 于矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、棕 榈醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的药物组合物也可以合适的 灌肠剂形式用于下消化道。本发明还包括局部经皮膏药。
本发明的药物组合物可以鼻用喷雾剂或吸入剂的形式给药。这些组合 物按照药物制剂领域熟知的技术制备，并可使用苯甲醇或其他合适防腐 剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物/或和其他业内了解的助 溶剂或分散剂来制备为盐水溶液。
本发明的药物组合物可以滴眼液、眼霜或眼膏的形式给药。对于滴眼 液或眼霜，合适的赋形剂包括但不限于水、张度改良剂(如氯化钠)、防 腐剂(如苯扎氯铵)和/或缓冲剂(如一水磷酸二氢钠和/或无水磷酸二钠)。 对于眼膏，合适的赋形剂包括但不限于白凡士林和/或黄凡士林、羊毛脂 和/或液体石蜡。
本发明使得技术人员可设计测定和评估针对TSHR的自身抗体的新 方法。某些现有的测定和评估针对TSHR的自身抗体的方法中所用的通 过重组DNA技术生产的现有TSHR制剂是非常昂贵的。另外，目前使用 的TSHR制剂不溶于水，需要洗涤剂的存在，因此相对“粗糙”，即它们 含有其他蛋白的混合物并代表变性受体和不变性受体的混合物。合成的 TSHR多肽组合物(不含TSHR复杂的7个跨膜区，即可溶于水并易于 处理)可根据在本发明复合物中发现的相互作用被设计为具有TRAb结 合性质。这一组合物可用于建立的灵敏的同位素或非同位素试验以测量 TRAb。这些新方法可基于对M22(或另一TSHR单克隆自身抗体或TSHR 单克隆自身抗体的混合物或来源于它们的组合物)结合的抑制或可基于与 所述组合物的直接结合。所述组合物可(用同位素标记或非同位素标记) 标记或缀合至多种本领域已知的试剂。所述组合物可在沉淀测定中被包被 在固体支持物(珠子、板子、试管)上或用于溶液中。
相反地，合成的TSHR结合组合物可设计用于抑制型试验以取代M22 (或其他TSHR单克隆抗体)或TSH。目前用于这些试验的M22IgG或 TSH的生产和纯化都相对昂贵。由酶消化得到的M22IgG片段(如Fab 或F(ab′)2)不如IgG稳定，生产昂贵，其在用同位素或非同位素标记标 记时不易处理。可取代M22IgG或TSH的TSHR结合组合物在用同位 素或非同位素标记标记或缀合至其他试剂时可更稳定。
而且，TSHR结合表位的合成组合物与合成TSHR接头组合物的结 合可导致建立适于自动化的灵敏、易生产、易使用、经济的TRAb试验。 另外，本发明使得技术人员可设计和测试M22和TSHR中特定氨基酸的 突变，这可导致发现对受体活化起关键作用的氨基酸。
而且，本发明可帮助技术人员理解TSHR(参与甲状腺调控)和促卵 泡激素受体(FSHR；参与生殖)之间的异同。TSHR和FSHR是高度相 关的受体，它们具有相似结构，分别结合具有共同激素亚基(α亚基)并 表现很大结构相似性的配体TSH和FSH。然而，TSHR和FSHR具有不 同的功能活性；TSHR参与甲状腺调控(对全身代谢起重要作用)，而 FSHR参与生殖。这些受体对它们所对应激素的特异性很高，有研究报道 即使使用很高摩尔浓度的激素，也只有低水平的交叉反应性。现在，技术 人员首次可以自动地研究这两种受体，比较它们的结构和与它们所对应配 体的结合机制。例如，如本文所公开，对TSHR结构和FSHR结构的比 较(Fan&Hendrickson 2005infra)表现出显著的相似性(在Cα原子上只 有1.1rmsd)。而且，FSHR和FSH的结合机制与TSHR和M22的非常 相似。现在，可研究TSH与TSHR的结合机制(使用可获得的结构和本 领域已知的方法)，并将其与和FSHR-FSH的结合机制相比较。通过本领 域已知方法可识别造成其各自特异性的TSH或FSH氨基酸，以及分析所 述激素的演化过程。对这2种密切相关的受体-激素相互作用的进一步理 解可帮助技术人员设计具有对TSHR或FSHR高度特异性且不发生不需 要的交叉反应的配体。这种类型的配体可用于生殖系统的调控和用于甲状 腺功能的控制。
本发明也可帮助技术人员理解可促进具体TSH自身抗体和普遍自身 抗体的开发和产生的免疫学机制。
另外，本发明还提供了合成的水溶性TSHR多肽组合物。所述多肽 组合物可包括人类TSHR的氨基酸22-260。
TSHR260-M22的晶体结构提供的数据可帮助设计结合分子(如多 肽)，其模仿TSHR上M22(以及具有相似表面和结合性质的TSHR自 身抗体)的结合位点。这种结合分子可与合适的支持物偶联，用于除去促 甲状腺自身抗体。类似的方法已用于除去乙酰胆碱受体的自身抗体(Guo C-Y et al，Journal of Immunological Methods，2005，303，pp 142-147)。因 此，本发明的另一方面提供一种从含有促甲状腺素受体抗体的样品中除去 这些促甲状腺素受体抗体特别是促甲状腺素受体自身抗体的方法，所述方 法包括提供一个包括或模仿促甲状腺素受体上M22的结合位点的结合分 子，或提供具有与M22相似的表面和结合性质的促甲状腺素受体自身抗 体；再将所述样品与所述结合分子接触从而使得促甲状腺素受体抗体与所 述结合分子结合并从样品中除去。合适的样品可能包括含有高水平的促甲 状腺自身抗体的患者血清。为促进偶联，所述结合分子可与中性蛋白或其 他不影响TSHR自身抗体结合的标记融合。例如可使用麦芽糖结合蛋白， 如Guo C-Y(2005)et al，supra所公开。所述结合分子可与固体支持物如 琼脂糖或树脂直接偶联或通过一个这种标记偶联。然后可使所述含有高水 平促甲状腺自身抗体的患者血清通过免疫吸收剂(一个类似于血浆交换或 血浆除去法的过程)，再使除去TSHR自身抗体的血清返回到患者。这为 有效和快速除去导致甲状腺过度刺激的临床症状的自身抗体提供了一个 良机。这对甲状腺危象尤其重要。而且，从循环中除去TSHR自身抗体 可阻止它们与眼后组织(或其他甲状腺外位点)的TSHR结合，从而提 供控制Grave眼病(或胫骨前粘液水肿)严重病例的有效方法。从怀孕 妇女的循环中除去TSHR自身抗体可阻止所述自身抗体跨胎盘穿过，并 保护胎儿甲状腺免于自身抗体的生物学效果。因此本发明也提供一种如上 所述通过除去自身抗体来治疗这种疾病的方法，所述方法包括从患有这种 疾病的患者或从此患者取得的样品中除去促甲状腺自身抗体的步骤。
附图说明
现在通过参考附图1-10以例证的方式对本发明的产品和方法进行描 述，其中：
图1a表示在不存在或存在M22IgG的情况下对在High Five细胞表 达的TSHR260进行的蛋白印迹分析。图1b表示对从表达相应TSHR构 建体的High Five细胞获得的培养上清液中SHR277、C-del TSHR和 TSHR260在部分纯化前后进行的蛋白印迹分析。图1c表示在High Five 细胞表达的C-del TSHR在部分纯化的不同阶段进行的蛋白印迹分析；
图2a和b显示HPLC凝胶过滤的结果；图2c是TSHR 260-M22Fab 复合物产生之后SDS-PAGE电泳结果的照片；
图3是表示TSHR 260-M22Fab复合物结合界面的2F0-F0电子密度 地图的立体视角图；
图4显示以JOY格式显示的TSHR LRD的二级结构(Mizuguchi K， Deane CM，Blundell TL，Johnson MS，Overington JP 1998JOY：protein sequence-structure representation and analysis.Bioinformatics 14： 617-623)(the TSHR LRD amino acid sequence is SEQ ID NO：14)；
图5是一系列表示M22Fab与TSHR相互作用的图：
图5a表示TSHR-M22Fab复合物的分子表面；
图5b是所述表面区域的开放视角图，其突出和标记的残基相互之间 的距离都在4以内；
图5c显示以不同的阴影突出并标记注明的M22Fab的高变区；
图5d表示TSHR-M22Fab复合物的静电势表面；
图5e是M22Fab高变区的残基列表；
图6a是FSHR-FSH复合物结构与TSHR-M22Fab复合物结构的图 像叠加；
图6b显示图6a沿垂直轴顺时针旋转90度得到的图像；
图6c是TSHR和FSHR按照JOY格式基于结构的序列比对 (Mizuguchi K，Deane CM，Blundell TL，Johnson MS，Overington JP 1998 JOY：protein sequence-structure representation and analysis. Bioinformatics 14：617-623)(the FSHR amino acid sequence is SEQ ID NO：15)；protein sequence-structure representation and analysis. Bioinformatics 14：617-623)(the FSHR amino acid sequence is SEQ ID NO：15)；
图6d是TSHR LRD与M22Fab以及FSHR LRD与FSH接触表面 的空间立体球图像。参与相互作用的氨基酸以深灰色表示；
图7是通过TSHR-M22Fab复合物界面相互作用的氨基酸残基的示 意图；
图8是在TSHR-M22Fab复合物的抗体-受体界面观察到的直接相互 作用(距离＜4)的立体视角图；
图9是得自下述结晶学实验的定位数据表，其中：
图9a＝2.55分辨率列表；
图9b＝3.1分辨率列表(链A＝人类促甲状腺自身抗体M22轻链， 链B＝人类促甲状腺自身抗体M22重链，链C＝人类甲状腺受体(TSHR)， 片段＝富亮氨酸重复结构域(区段22-260)。在M22定位数据中，位置1的 轻链亮氨酸和位置131的重链苏氨酸显示为丙氨酸。在TSHR定位数据 中，位置34、35的谷氨酸，位置36的天冬氨酸；位置37的苯丙氨酸， 位置42的亮氨酸，位置112的精氨酸显示为丙氨酸。这些残基被建模为 丙氨酸或甘氨酸是因为缺少电子密度)；
图10a显示了TSHR的共有氨基酸序列(SEQ ID NO：16)(获取号 P16473，
http://www.ncbi.nhn.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&val＝6229899 4)；
图10b显示了在M Misrahi，H Loosfelt，M Atger，S Sar，A Guiochon-Mantel，E Milgrom.Cloning，sequencing and expression of human TSH receptor.Biochem Biophys Res Commun 1990166：394-403 中识别的序列(SEQ ID NO：17)(获取号M32215， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝30752 4)；
图10c显示了在AL Frazier，LS Robbins，PJ Stork，R Sprengel，DL SegalofiζRD Cone.Isolation of TSH and LH/CG receptor cDNAs from human thyroid：regulation by tissue specific splicing.MoI Endocrinol 19904：1264-1276中识别的序列(SEQ ID NO：18)(获取号M73747， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝90375 9)；
图10d显示了在Y Nagayama，KD Kaufman，P Seto，B Rapoport. Molecular cloning，sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun 1989 165： 1184-1190中识别的序列(SEQ ID NO：19)(获取号M31774， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝34000 3)；
图10e显示了一个对照序列(SEQ ID NO：20)(获取号M73747， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝64085 120)；
以及图10f显示了在EP 0433509A中给出的序列(SEQ ID NO：21)。

在昆虫细胞中产生TSHR260
以全长人类TSHR为模板(Oda Y，Sanders J，Roberts S3 Maruyama M， Kato R，Perez M，Petersen VB，Wedlock N，Furmaniak J，Rees Smith B 1998 Binding characteristics of antibodies to the TSH receptor.Journal of Molecular Endocrinology 20：233-244)，用 5’-cactgcaggatccaaatgaggccggcggacttg-3’(SEQ ID NO：1)和5’-cagtcctctagattatcagt gatggtggtggtgatggttaagagtccaggtgtttcttgctat-3’(SEQ  ID NO：2)引物(Sigma Genosys)扩 增TSHR260构建体(编码图10a中所示的人类TSHR氨基酸1-260)，在 N末端加入一个BamHI限制位点，在C末端加入一个1氨基酸接头(天 冬酰胺)和一个6组氨酸标签、终止密码子和一个XbaI限制位点。所述 PCR反应进行25次95℃1分钟、50℃1分钟和72℃1分钟的循环，然后 用BamHI和Xbal限制位点将TSHR 260克隆到pFastbacl(Invitrogen， UK)中，并用Sanger Coulson法确认DNA序列(Sanger F，Nicklen S， Coulson AR 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74： 5463-5467)。重组杆粒DNA通过Bac to Bac杆状病毒表系统(Invitrogen， UK)制得。简言之，将1ng(5μL)pFastBacl-TSHR 260转染到100μL最 大效率的含有杆粒(杆状病毒穿梭载体)和辅助质粒的D H10Bac细胞 (Invitrogen，UK)中。冰浴30分钟后，将所述细胞在42℃热休克45秒， 然后在冰上冷却2分钟，再加入900μL SOC培养基(Invitrogen，UK)。将 试管在37℃摇动培养4小时然后用SOC培养基10倍连续稀释，接种于 含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mL X-gal(Promega，UK)和40μg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的 LB琼脂平板(胰蛋白胨lOg/L、酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L和20g/L琼 脂)上，再在37℃培养48小时以进行蓝/白色选择。对白色克隆进行培养， 用质粒midi试剂盒(Qiagen，UK)制备重组质粒DNA并用PCR确认重组 杆粒中TSHR260DNA的存在。
将所述重组杆粒DNA转染到Sf-9昆虫细胞(Invitrogen，UK)中，在添 加有10％(v/v)胎牛血清和7μg/ml庆大霉素的TC100培养基(Invitrogen， UK)中进行培养，以获得和扩增重组杆状病毒原种。通过500g离心5分 钟从SF-9培养物中收获病毒原种并将上清液储存于2-8℃。用BacPAK 杆状病毒快速滴定试剂盒(BD Clonetech)根据厂商说明滴定所有的病毒 原种。
另外，还如上所述制备了两个用于在昆虫细胞系统表达的TSHR构 建体。以人类全长TSHR为模板，用引物：5’-caggaaacagctatgac-3’(SEQ ID NO：3) 和5′-gctactcgagctagtggtggtggtggtggtgaaggtcagcccgtgtgaggtgaaggaaactcaag-3’(SEQ ID NO：4) (Sigma Genosys)扩增TSHR277构建体(编码图10a所示的人类TSHR氨 基酸1-277)，所述构建体在C末端被加入了一个6组氨酸标签、终止密 码子和一个Xhol限制位点。所述PCR反应进行25次95℃1分钟、40℃ 1分钟和72℃1分钟的循环，然后用BamHI和XhoI限制位点将TSHR 277 克隆到pFastbacl(Invitrogen，UK)中，并用Sanger Coulson法确认DNA 序列(Sanger F，Nicklen S，Coulson AR 1977DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467)。制得TSHR260的重组杆粒DNA并用PCR确 认重组杆粒的存在。将重组杆粒DNA转染到Sf-9昆虫细胞，如上所述制 备TSHR260构建体的病毒原种并滴定。
还制备了C-del TSHR构建体，所述构建体编码除编码TSHR氨基酸 313-353的序列(被从序列中删除)之外的TSHR氨基酸1-410(TSHR 氨基酸如图10a所示)。另外，所述TSHR C-del构建体含有为了防止溶 蛋白性裂解而引入的三个突变即R312E、E358T和E360T。所述构建体 的制备分四个独立的阶段。首先以全长TSHR为模板引入双突变 E358T/E360T。如之前在WO2006/016121A所述建立两个不同的PCR反 应(PCR1和PCR2)。PCR1反应使用T7启动子引物 5’-taatacgactcactataggg-3’(SEQ ID NO：5)和针对突变的“反向”引物 5’-accaatgatctcatccgtttgtgtttcaaagaagacgta-3’(SEQ ID NO：6)，而PCR2反应使用针对 “突变”的正向引物5′-tacgtcttctttgaaacacaaacggatgagatcattggt-3’(SEQ ID NO：7)和牛生 长激素多腺苷酸化信号反向引物(BGHR)5’-tagaaggcacagtcgagg-3’(SEQ ID NO：8)。用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)进行PCR1和 2反应：94℃5分钟，然后进行30次94℃1分钟、40℃1分钟和72℃2 分钟的循环。将PCR1和PCR2的反应产物从琼脂糖凝胶上切下，然后 用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd，Luton，LU2 OEB，UK)根据厂商说 明纯化。纯化的PCR1和PCR2产物用于进行PCR3以构建含有突变的 完整TSHR序列。所述PCR3反应包含200ng PCR1产物和200ng PCR2 产物。PCR3进行7个94℃1.5分钟、65℃1.5分钟和72℃1.5分钟的循 环。然后再次将温度升高到94℃达2分钟，然后加入T7引物和BGHR 引物，再进行30个94℃1分钟、52℃1分钟和72℃2分钟的循环。用 BamHI和XhoI限制位点将所述PCR3产物(TSHR E358T/E360T)克隆到 pcDNA 5.1/FRT载体(Invitrogen)中，并用Sanger Coulson法确认突变的 存在(Sanger F，Nicklen S，Coulson AR 1977DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467)。
然后将所述TSHR E358T/E360T构建体用作模板DNA使用与上面针 对TSHR E358T/E360T同样的方法引入第三个突变(R312E)。PCR1反应 使用针对突变的“反向”引物5’-gcattcacagatttttcctggcgcaagctcttgca-3’(SEQ ID NO：9) 而PCR2反应使用针对突变的“正向”引物5’-tgcagagcttgcgccaggaaaaatctgtgaatgc-3’ (SEQ ID NO：10)。将纯化的PCR1和PCR2产物如上所述进行PCR3反 应，用BamHI和XhoI限制位点将所述PCR3产物(TSHR E358T/E360T/R312E)克隆到pcDNA 5.1/FRT载体(Invitrogen)中，并用 Sanger Coulson法测序确认突变的存在(Sanger F，Nicklen S，Coulson AR 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467)。
然后将所述TSHR E358T/E360T/R312E(包含三个突变)用作模板 DNA用上述PCR方法使氨基酸313-353缺失。PCR1反应的进行使用针 对缺失的“反向”引物 5’-catccgtttgtgtttcaaagaagacttcctggcgcaagctctgcatactg-3’(SEQ ID NO：11)，而PCR2反应使 用针对缺失的“正向”引物 5’-cagtatgcagagcttgcgccaggaagtcttctttgaaacacaaacggatg-3’(SEQE ID NO：12)。将纯化的 PCR1和PCR2产物如上所述进行PCR3反应，用BamHI和XhoI限制 位点将编码残基313-353缺失的TSHR氨基酸1-764的C-del TSHR产物 克隆到pcDNA 5.1/FRT载体(Invitrogen)中，并用Sanger Coulson法 (Sanger F，Nic klen S，Coulson AR 1977DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467)测序确认缺失，然后作为模板用T7启动子引物 和5’-gctactcgagctagtggtggtggtggtggtggtcttcacacgggttgaactcatcggacttg-3’(SEQ ID NO：13)进 行扩增，其结果是在TSHR氨基酸410后的C末端加入一个6组氨酸标 签、一个终止密码子和XhoI限制位点。所述PCR反应进行25次95℃1 分钟、50℃1分钟和72℃1分钟的循环，然后用BamHI和XhoI限制位 点将所述C-del TSHR克隆到pFastbacl(Invitrogen，UK)中，并用Sanger Coulson法(Sanger F，Nickden S，Coulson AR 1977DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467)测序确认DNA序列。制得TSHR260 的重组杆粒DNA并用PCR确认重组杆粒的存在。将重组杆粒DNA转染 到Sf-9昆虫细胞，如上针对TSHR260所述制备病毒原种并滴定。
纯化M22IgG和Fab的制备
用MabSelectTM蛋白A亲和色谱(GE Healthcare，UK)从异源杂交瘤 培养物上清液制得M22IgG，如Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H， Evans M，Richards T，Kiddie A，Brereton K，Premawardhana LDKE， Chirgadze D Y，Miguel R，Blundell TL，Furmaniak J，Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor：sequence structure and function.Thyroid 14： 560-570所述。以酶/蛋白1∶50的比例用汞木瓜酶(Sigma，UK)处理纯化 的IgG，然后通过MabSelectTM柱从Fab制剂中除去任何完整的IgG或 Fc，如Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M，Richards T，Kiddie A， Brereton K，Premawardhana LDKE，Chirgadze DY，Miguel R3 Blundell T L，Furmaniak J，Rees Smith B 2004Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor：sequence structure and function.Thyroid 14：560-570中所述。在还原性条件下用SDS聚丙 烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析M22Fab以测定纯度。用表达TSHR 的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞通过环腺苷酸刺激试验检测M22Fab的生物 学活性。另外，还分析了M22Fab抑制125I-TSH或125I-M22与TSHR包 被管结合的能力(Sanders J，Oda Y，Roberts S3Kiddie A3Richards T3 Bolton J3 McGrath V3 Walters S3 Jaskolski D3 Furmaniak J3 Rees Smith B 1999 The interaction of TSH receptor autoantibodies with 125I-labelled TSH receptor.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 84：3797-3802)。
TSHR 260-M22复合物的制备
将High FiveTM昆虫细胞(BTI-TN-5B1-4，Invitrogen，UK)置于添加有 0.1mmol/L KI和7μg/mL庆大霉素的EXCell培养基中，在22℃，60rpm 的通风搅拌条件下，在500mL的旋转烧瓶(Techne)中培养。每个烧瓶中 的细胞接种密度为0.5x106细胞/mL，并在22℃下培养24小时，然后用杆 状病毒原种感染，感染复数(MOI)为0.0006pfu/细胞。继续培育细胞培养 物，并在感染后96小时加入纯化的M22Fab，终浓度为2μg/mL。在感 染后120小时通过500g离心10分钟收获含有TSHR260-M22Fab复合物 的培养物上清液。每200mL上清液加入一片Complete蛋白酶抑制剂 (Roche)，然后储存在-70℃直到纯化。
进行一系列独立的实验测定在不存在M22IgG、存在8μg/mL M22 IgG和存在12μg/mL M22IgG的情况下，TSHR260在High Five昆虫细 胞培养物中产生期间即在感染后第3、4、5和6天的稳定度。在感染当天 在High Five细胞培养上清液中加入M22IgG。对培养上清液的各样品进 行蛋白印迹分析，从而测定表达的TSHR260的完整性(图1a)。用1μg/mL 浓度的可与氨基酸246-260之间的TSHR表位(TSHR MAb 18C5)发生反 应的小鼠单克隆抗体进行蛋白印迹(Jeffreys J，Depraetere H，Sanders J， Oda Y，Evans M，Kiddie A，Richards T，Furmaniak J，Rees Smith B 2002 Characterization of the thyrotropin binding pocket.Thyroid 12： 1051-1061)。
具体地，图1a表示在不存在或存在M22IgG的情况下在感染后第3、 4、5和6天(分别为泳道1-4)High Five细胞培养上清液中检测到的TSHR 260。插图1＝在不存在M22IgG的情况下从表达TSHR 260的High Five 细胞获得的细胞培养上清液样品(泳道1-4分别代表感染后第3、4、5和 6天，泳道5是从作为阴性对照的不表达TSHR 260的细胞获得的High Five培养上清液)。插图2＝在存在8μg/mL M22IgG的情况下从表达 TSHR 260的High Five细胞获得的细胞培养上清液样品(泳道1-4分别 代表感染后第3、4、5和6天，泳道5是从作为阴性对照的不表达TSHR 260的细胞获得的High Five培养上清液)。插图3＝在存在12μg/mL M22 IgG的情况下从表达TSHR 260的High Five细胞获得的细胞培养上清液 样品(泳道1-4分别代表感染后第3、4、5和6天，泳道5是从作为阴性 对照的不表达TSHR 260的细胞获得的High Five培养上清液)。
如图1a所示，在不存在M22IgG的条件下培养，代表TSHR 260的 分子量为34kDa的带的强度在感染后第5天增加到最大。然而，在感染 后第6天(插图1；泳道4)大部分TSHR 260产物降解为分子量为29kDa 的蛋白或形成41kDa的聚合带。当培养基中加有8μg/mL的M22IgG时， 可观察到类似的模式，尽管与不存在M22IgG的实验相比在第6天除降 解或聚合的物质之外还存在更多完整的TSHR 260(图1a插图2)。当培 养基中的M22IgG浓度增加到12μg/mL时，在第6天检测到的完整的 TSHR 260的量与第5天的相似。
这些结果表明，TSHR 260通过与M22IgG形成复合物在培养基中 被保护。通过其他实验进一步研究了M22Fab存在(在感染后第4天加 入培养基，终浓度为2μg/ml)时High Five昆虫细胞表达的TSHR 277 和C-del TSHR产物的稳定性。在感染后第5天从被带有相应TSHR构 建体的病毒感染的High Five细胞收集培养上清液，并用Streamline HST 基质上的色谱部分纯化(如下所述)。对各培养上清液样品进行蛋白印迹 分析，从而测定表达的TSHR产物的存在和分子量(图1b和c)。用1μg/mL 浓度的可与氨基酸246-260之间的TSHR表位(TSHR MAb 18C5)发生反 应的小鼠单克隆抗体进行蛋白印迹(Jeffreys J，Depraetere H，Sanders J， Oda Y，Evans M，Kiddie A，Richards T，Furmaniak J，Rees Smith B 2002 Characterization of the thyrotropin binding pocket.Thyroid 12： 1051-1061)。
具体地，图1b显示纯化前和以Streamline柱部分纯化后的存在于收 集的培养上清液的TSHR 277、C-del TSHR和TSHR 260。泳道1＝表达 TSHR 277的High Five细胞的细胞培养上清液样品，泳道2＝部分纯化的 TSHR 277。泳道3＝存在于细胞培养上清液的C-del TSHR，泳道4＝部分 纯化后的相同材料。泳道5和6分别为部分纯化前后的TSHR 260。在泳 道2和4中可观察到TSHR MAb 18C5与M22Fab(分子量为46kDa) 的一些非特异结合。
如图1b所示，在M22Fab存在的条件下培养的High Five细胞表达 分子量约为34kDa的TSHR 277，然而，部分纯化后TSHR 277的分子 量减少至30kDa(图1b泳道1和2)。在M22Fab存在的条件下，在细 胞培养上清液样品中检测到High Five细胞表达的C-del TSHR，表现为 46kDa蛋白带，其在部分纯化后降解为30kDa的蛋白(图1b泳道3和 4)。在此系列实验中的TSHR 260在纯化前后被检测为30-32kDa的蛋白 (图1b泳道5和6)。
此实验显示，具有预期分子量(分别为34kDa和46kDa)的TSHR 277和C-del TSHR产物在High Five细胞中表达，但这两种蛋白在部分 纯化后都降解至TSHR260蛋白的大小(大约30kDa)。
C-del TSHR在部分纯化时降解的另一个实例如图1c所示。在存在2 μg/mL的M22Fab时，C-del TSHR在High Five细胞中表达。
具体地，图1c显示High Five细胞培养上清液中以及在Streamline HST基质上纯化的不同阶段的C-del TSHR。泳道1＝High Five细胞培养 上清液中的TSHR 260；泳道2＝High Five细胞培养上清液中的C-del TSHR；泳道3＝表达C-del TSHR的High Five细胞培养上清液，其被稀 释并调节至可上样到Streamline HST柱；泳道4＝通过Streamline HST柱 的材料；泳道5-8＝洗脱的含有部分纯化C-del TSHR的Streamline HST 柱级份。
如图1c所示，M22Fab存在的条件下培养的High Five细胞将分子 量为46kDa的C-del TSHR表达到培养上清液中(泳道2)。在对Streamline HST柱的上样材料中也检出了完整的C-del TSHR(泳道3)，在柱流出液 中未检出C-del TSHR(泳道4)。然而，从柱上洗脱的C-del TSHR降解 至分子量约为30kDa(泳道5-8)，与泳道1所示的TSHR260的分子量 相当。
此系列实验说明，在M22Fab存在时，具有不同预期长度的TSHR 多肽链由所使用的构建体在High Five细胞中表达。然而，即使在纯化早 期，TSHR 277和C-del TSHR产物也会降解到TSHR 260产物的大小。 没有证据显示TSHR 260在纯化时会降解(也见下)。因此，最可能的是 M22Fab的结合涉及到大部分TSHR 260多肽链并保护其免于蛋白质水 解。TSHR氨基酸序列从残基260开始的C末端不太可能参与M22Fab 的稳定结合，因此氨基酸260和277或260和410之间的TSHR序列被 蛋白质降解。
TSHR260-M22Fab复合物具有惊人的稳定性。这跟以前的不稳定、 在产生条件下迅速变性的TSHR多肽制剂相反。所述TSHR260-M22Fab 复合物在经过用内切糖苷酶F3去糖基化前后的两轮亲和纯化后，用 HPLC凝胶过滤和SDS-PAGE电泳进行分析，如图2a-c所示。
具体地，图2a显示：在去糖基化前纯化的TSHR 260-M22Fab复合 物——通过凝胶过滤HPLC的分析(TSK-GEK G3000SW，在150mmol/L NaCl、10mmol/L Tris pH 7.0中进行；级份体积为0.5mL)。峰 1＝TSHR260-M22Fab复合物。峰2＝只有M22Fab，与单独进行的分析 结果相重叠。图2b显示在去糖基化后纯化的TSHR 260-M22Fab复合物， 在阳离子交换HPLC上的分离和浓缩；即用于结晶的材料——通过凝胶 过滤HPLC分析，如图2a所示。峰1＝TSHR 260-M22Fab复合物，峰 2＝游离M22Fab。图2c中显示了在非还原条件下用SDS-PAGE(12％丙 烯酰胺凝胶)对纯化的TSHR260-M22Fab的分析，并标示出分子量标记 的位置。标记出了去糖基化前后M22Fab和TSHR 260的位置。泳道1＝ 去糖基化前的TSHR260-M22Fab；泳道2＝去糖基化后和在阳离子交换 HPLC柱上纯化前；泳道3＝去糖基化和在阳离子交换HPLC柱上纯化后； 泳道4＝去糖基化和在阳离子交换HPLC柱上纯化和最终浓缩后。泳道1、 2和4每泳道大约上样10μg的TSHR260-M22Fab，泳道3大约上样5μg。
如图2a所示，TSHR260-M22Fab复合物的分析结果为基本单一的 尖峰(峰1)，只有少量(5％)游离的M22Fab存在于样品中。在去糖基化 和在阳离子交换HPLC柱上分离后，如通过凝胶过滤HPLC判断的， TSHR260-M22复合物整体性完整(图2b峰1)，在用于结晶的终制剂中 只检测到少量(7％)游离的M22Fab(图2b峰2)。
SDS-PAGE在非还原条件下对纯化的TSHR260-M22Fab的分析将 此复合物分解为比例大致相等的两个组分(TSHR260和M22Fab；图2c 泳道1)。当根据SDS-PAGE计算时，糖基化M22Fab的分子量大约为 56kDa而TSHR260的分子量约为40kDa。所有去糖基化后的样品(在 通过阳离子交换HPLC与内切糖苷酶F3分离前、阳离子交换HPLC后 及浓缩后；图2c，分别为泳道2、3和4)都显示相似的蛋白带模式。最 上端约56kDa的比例最小的带代表一些残余的未去糖基化的M22Fab。 分子量约54kDa的蛋白带代表去糖基化的M22Fab，而分子量约37kDa 的蛋白带代表去糖基化的TSHR260。
分子量约40kDa的蛋白带的N末端氨基酸分析(如图2c，泳道1 所示)显示如下序列：Met-Gly-X-Ser-Ser-Pro。其中X可能为Cys。这 对应人类TSHR氨基酸22-27之间的序列即Met-Gly-Cys-Ser-Ser-Pro并 与起始于残基22的表达序列一致(残基1-21是信号肽)(Misrahi M， Loosfelt H，Atger M，Sar S，Guiochon-Mantel A，Milgrom E 1990 Cloning， sequencing and expression of human TSH receptor.Biochemical and Biophysical Research Communications 166：394-403)。因此，我们通过N 末端氨基酸测序确定了在纯化的复合物中TSHR260的性质。
TSHR260-M22Fab复合物的纯化
用500mmol/L NaH2PO4将培养上清液(14.4和17.4L的两批)调 节到pH 6.2并上样到Streamline25膨胀床色谱系统(GE Healthcare，UK) 中的75mL treamline Direct HST基质上。另一批培养上清液(11.9L)在独 立试验中以同样方式处理。用50mmol/L磷酸钠(pH 6.0)、50mmol/L NaCl 洗涤，再用100mmol/NaCl、50mmol/L Tris-HCl(pH 6.5)洗涤，并用 100mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗脱。用1μg/mL浓度的 可与氨基酸246-260之间的TSHR表位(TSHR MAb 18C5)发生反应的小 鼠单克隆抗体进行蛋白印迹以确认洗脱级份中TSHR260-M22复合物的 存在(Jeffreys J，Depraetere H，Sanders J，Oda Y，Evans M，Kiddie A， Richards T，Furmaniak J，Rees Smith B 2002Characterization of the thyrotropin binding pocket.Thyroid 12：1051-1061)。
再用偶联到CNBr活化琼脂糖凝胶-4B(Sigma，UK)的抗体TSHR MAb 14C4通过亲和色谱对TSHR260-M22复合物进行纯化(Jeffreys J， Depraetere H，Sanders J，Oda Y，Evans M，Kiddie A，Richards T， Furmaniak J，Rees Smith B 2002Characterization of the thyrotropin binding pocket.Thyroid 12：1051-1061)，所述抗体与TSHR胞外结构域的 氨基酸22-261之间的构象表位结合。简言之，将所述复合物上样到4mL 亲和柱中，用100mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗涤，用 100mmol/L NaCl、100mmol/L柠檬酸盐(pH 4.0)洗脱，收集到等体积的 中和缓冲液中(0.5mol/L Tris-HCl，pH 8.0)，然后透析到50mmol/L NaCl、 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。
然后用Nickel亲和色谱对经透析的复合物进一步纯化。将所述复合 物上样到Ni-NTA琼脂糖柱中(Qiagen，UK)，用洗涤缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0)洗涤再用加有20mmol/L咪唑的洗涤 缓冲液洗脱复合物。将所述复合物透析到50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中并用于进行去糖基化反应。所述复合物的浓度根据在 280nm的吸收度计算，其基础是1个吸收单位相当于0.69mg/mL的 TSHR260-M22Fab。
TSHR 260-M22复合物的去糖基化和最后纯化
用内切糖苷酶F3(Sigma，UK)在pH 4.5的50mmol/L醋酸钠缓冲液 中将从31.8L培养上清液获得的16mg(或在另一实验中从11.9L培养上 清液获得的7.5mg)纯化的复合物去糖基化，酶和复合物的比例为152 mU/mg复合物，反应在20℃下进行5天。将所述去糖基化反应物上样到 阳离子交换HPLC Bioassist S柱(TOPOH)。简言之，用200mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)以1∶1的比例稀释所述反应物，通过0.22μm过滤器过 滤，然后上柱。然后用20mmol/L NaCl(pH 6.5)洗涤所述柱，再用pH梯 度液(pH 6.5-pH 9.0)洗脱所述复合物。然后用Microcon YM-10浓缩器 (Millipore，UK)将5mg(或另一实验中2.4mg)纯化的复合物浓缩到32.8 mg/mL(或32mg/mL)，用HPLC TSK凝胶G3000SW柱(TOSOH)通过 凝胶过滤分析来测定所述复合物的完整性并通过SDS-PAGE分析来测定 纯度。此材料用于结晶筛选试验或以等分式样形式储存在-20℃。
TSHR 260的蛋白测序
将纯化的TSHR260-M22Fab复合物(30μg)在12％SDS-PAGE上跑 胶(在非还原条件下)，然后印迹到在10mmol/L的3-环己氨基-1-丙磺酸 (CAPS)(pH 11)和10％甲醇中的Immobilon pSQ转移膜(Millipore， Watford，UK)上。将所述膜用考马斯亮蓝染色，切下代表TSHR260的带 并分析N末端氨基酸序列(Alta Biosciences，Birmingham，UK)。 M22重链(HC)或轻链(LC)的氨基酸突变
“C”末端带有6组氨酸标签的M22HC和LC序列被克隆到衍生自 pUC 18的载体中，如Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M， Richards T，Kiddie A，Brereton K，Premawardhana LDKE，Chirgadze DY， Nunez Miguel R，Blundell TL，Furmaniak J，Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor：sequence structure and function.Thyroid 14：560-570所述。
针对每个突变设计了具体的“正向”和“反向”PCR引物，以改变 HC或LC的核苷酸编码序列来编码正确的氨基酸突变。所述引物由Sigma Genosys(Cambridge，UK)制备。进行两个独立的PCR反应(PCR1和 PCR2)。对于LC的PCR1反应，使用M13反向测序引物和针对突变的“反 向”引物；而对于PCR2反应，使用针对突变的“正向”引物和-20M13“正 向”测序引物。对于HC的PCR1反应，使用M13“反向”测序引物和针对 突变的“正向”引物；而对于PCR2反应，使用针对突变的“正向”引物和-20 M13“正向”测序引物。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems，UK)进行PCR1和PCR2反应，先94℃5分钟然后进行94℃ 1分钟、42℃1分钟和72℃2分钟的30个循环。从琼脂糖凝胶上切下PCR1 和PCR2产物并用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd，UK)根据厂商说明 进行纯化。然后将纯化的PCR1和PCR2产物用于进行PCR3以构建含 有突变的完整HC或LC序列。所述PCR3反应物包含200ng PCR1产物 和200ng PCR2产物。PCR3进行7个94℃1.5分钟、65℃1.5分钟和72℃ 1.5分钟的循环。然后将温度再度升高到94℃达2分钟，加入-20M13“正 向”测序引物和M13“反向”测序引物，再进行30个94℃1分钟、42℃1 分钟和72℃2分钟的循环。
将野生型或突变的M22HC克隆到Xhol和Spel限制位点中，并将 野生型或突变的M22LC克隆到Immunozap H/L载体(Stratagene Europe； Amsterdam，Netherlands)的SacI和Xbal限制位点中，并用过本领域的 Sanger-Coulson法测序确认突变的存在。
含有M22HC和LC序列的质粒DNA被转化到HB2151细胞 (Amersham Bio sciences)中并预培养；将被转化HB2151的一个集落在10 mL含有1％葡萄糖的LB氨苄青霉素培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提 取物5g/l、NaCl 10g/l、氨苄青霉素100μg/mL)中在30℃摇动培养过 夜。然后将预培养物稀释(5mL稀释于500mLLB氨苄青霉素培养基中) 并在30℃培养，直到600nm吸收值达到1.2。然后加入1.8mol/L蔗糖至 终浓度为0.3mol/L，并将培养物在30℃培育直至600nm吸收值回到1.2。 此后加入异丙醇-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L并将培养 物在23℃连续摇动培养24小时。然后将培养物在4℃下以9000rpm离 心30分钟，加入1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和每100ml上清液加入 1片Complete蛋白酶抑制剂(Roche)，并在纯化前将上清液置于-70℃储 存。用抗人IgG(Fab特异的)抗体(Sigma，UK)进行蛋白印迹分析确认 重组Fab的表达。蛋白印迹分析可检测10ng的野生型重组M22。 重组野生型和突变M22Fab的纯化
用500mmol/L的磷酸二氢钠(pH 4.0)将含有重组M22Fab的上清液 (每次纯化用4升)调节到pH 6.0并上样到75mLStreamline Direct HST 柱上(GE Healthcare，UK)。用10mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)、0.1mol/L NaCl洗涤所述柱直到280nm吸收值达到0.1以下，再用0.3mol/L NaCl 和10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)洗脱M22Fab。将洗脱的材料上样到 Ni-NTA琼脂糖柱中(Qiagen，UK)，用0.3mol/L NaCl和含有40mmol/L 咪唑的10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)洗涤，再用120mmol/L的咪唑洗脱 M22Fab。
通过SDS-PAGE测得洗脱的Fab的纯度＞95％，并根据280nm的吸 收值计算Fab的浓度，其基础是1个吸收单位相当于0.7mg/mL的Fab。 人类TSHR序列的氨基酸突变
用于在TSHR序列中引入特定突变的方法如WO2006/016121A中所 述。
简言之，按照标准克隆方法利用BamHI和Xhol限制位点将TSHR 全长核苷酸序列克隆到pcDNA5.1/FRT载体(Invitrogen)中。针对每个突 变设计了具体的“正向”和“反向”PCR引物，以将核苷酸编码序列改 变来编码正确的氨基酸突变。所有引物都由Sigma Genosys(Cambridge， UK)制备。进行两个独立的PCR反应(PCR1和PCR2)。PCR1反应使 用T7和针对突变的“反向”引物，而PCR2反应使用针对突变的“正向”引 物和牛生长素多腺苷酸化信号反向引物(BGHR引物)。用GeneAmp PCR 系统9700(Applied Biosystems)进行PCR1和2反应：94℃5分钟，然后 进行30次94℃1分钟、40℃1分钟和72℃2分钟的循环。将PCR1和2 的产物从琼脂糖凝胶上切下，然后用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd， Luton，LU2OEB，UK)根据厂商说明纯化。纯化的PCR1和PCR2产物用 于进行PCR3以构建含有突变的完整TSHR序列。所述PCR3反应物包 含200ng PCR1产物和200ng PCR2产物。PCR3进行7个94℃1.5分钟、 65℃1.5分钟和72℃1.5分钟的循环。然后将温度升高到94℃达2分钟， 加入T7引物和BGHR引物，再进行30个94℃1分钟、52℃1分钟和 72℃2分钟的循环。用BamHI/XhoI限制位点将所述PCR3产物克隆到 pcDNA 5.1/FRT载体(Invitrogen)中，并用本领域的Sanger Coulson法确 认突变的存在。
用FIp-In系统将突变的TSHR构建体转染到CHO细胞
所用方法如WO2006/016121A所述。简言之，所述FIp-In系统 (Invitrogen)用于将野生型(Wt)和突变TSHR cDNA转染到CHO细胞。每 个FIp-In-CHO细胞含有一个FIp-In位点，因此在每个试验中TSHR DNA 都会插入到基因组的相同位置，且每细胞只会存在一个拷贝。将一烧瓶汇 合的FIp-In-CHO细胞用来接种24孔板，每孔接种1x105-1.5x105个细 胞，孔中含有DMEM(Invitrogen)和10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen)，不 含抗生素，将所述细胞在37℃、5％CO2和＞95％湿度的条件下培育过夜。 然后用lipofectamine(Invitrogen)根据厂商说明将pcDNA5.1/FRT TSHR DNA和POG44DNA(Invitrogen)转染进FIp-In CHO细胞。用含600 μg/mL潮霉素(Invitrogen)的培养基选择细胞，被POG44质粒DNA和 pcDNA5.1/FRT TSHR转染的那些细胞能够将TSHR插入到FIp-In-CHO 细胞基因组中并表现潮霉素抗性。
对环腺苷酸生成的刺激的分析
WO2006/016121A详细描述了用于检测对被野生型或突变TSHR转 染的CHO细胞中环腺苷酸生成的刺激，以确认所述构建体的功能的方法。
简言之，将CHO细胞接种到96孔板中(每孔12500-20000个细胞)， 并在含有10％胎牛血清的DMEM中培育48小时。然后将DMEM除去， 加入在环腺苷酸分析缓冲液(不含NaCl，但含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/l 3- 异丁基-1-甲基黄嘌呤的Hank’s缓冲的盐溶液，pH 7.4)中稀释的猪 TSH(RSR Ltd；0.01-3ng/mL)和野生型或突变的M22Fab(0.1-10ng/mL)， 再在37℃、空气中有5％CO2的氛围下培育1小时。除去测试溶液后， 裂解细胞并用Amersham Biosciences的Biotrak酶免疫试验系统测定裂解 物中的环腺苷酸浓度。
溶于洗涤剂的野生型和突变TSHR制剂的制备
所用方法如WO2006/016121A所述。
表达野生型或突变TSHR的FIp-In-CHO细胞在175cm2的烧瓶中培 养至汇合，用Dulbecco氏PBS(不含钙和镁离子)(Invitrogen)洗涤细 胞，然后刮到10mL冰冷缓冲液A(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl， pH 7.5)中，缓冲液含有1mmol/L苯甲基磺酰氟且每200mL缓冲液含有 1片Complete蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)。所述细胞在4℃下以 1000xg离心得到沉淀，再将沉淀重悬浮于1mL缓冲液A中并在冰上用 玻璃匀浆器匀浆。细胞膜在4℃下以12000xg离心30分钟得到沉淀，再 重悬浮于加有0.5g/L叠氮化钠和2.75g/L6mL碘乙酰胺的缓冲液A中， 并如上所述再次沉淀。然后将膜沉淀物重悬浮于1mL冰冷的含有1％ Triton X-100和0.5g/L叠氮化钠的缓冲液A中并匀浆。所述被溶解的 TSHR制剂在4℃下以9000xg离心2小时，将上清液储存在-70℃。 对125I-M22IgG或125I-TSH与TSHR结合的抑制
用包被有野生型TSHR的试管进行125I标记的M22IgG或125I标记 的TSH结合抑制试验，如Sanders J，Oda Y，Roberts S，Kiddie A， Richards T，Bolton J，McGrath V，Walters S，Jaskolski D，Furmaniak J， Rees Smith B 1999The interaction of TSH receptor autoantibodies with 125I-labeled TSH receptor.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 84：3797-3802所述(试剂购自RSR Ltd)。每个试验都包括一 个用M22Fab制备的校准曲线(1-100ng/mL)，所述M22Fab是用从M22 杂交瘤细胞培养物上清液纯化的IgG制备的。
在此试验中，将100μL纯化的野生型或突变的Fab(在试验缓冲液(50 mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH 7.8、0.1％Triton X-100)中稀释到 0.001-100μg/mL)置于TSHR包被的试管中在室温下轻轻摇动培育2小 时。抽出液体后，用1mL试验缓冲液洗涤试管两次，然后加入100μL 125I-M22IgG(50,000cpm)或125I-TSH(80,000cpm)并在室温下摇动培养 1小时。然后用1mL试验缓冲液洗涤试管两次，吸出液体并用γ计数器 计数。对M22IgG或TSH结合的抑制根据下式计算：

结晶和衍射数据的收集
浓度为32.8mg/mL的去糖基化TSHR-M22Fab复合物用于蒸汽扩散 悬滴结晶实验。在大约两周后在Wizard Crystal Screen I，条件 #46(Emerald BioStructures，Inc.)中出现小晶体簇。然后将结晶溶液在8％ PEG8000、0.1mol/L MES pH 6.0、0.25mol/L乙酸锌中优化，这会使结 晶更大但仍会成簇。使用宏观/微观种晶技术以获得单晶体的尝试是不成 功的。将大小为0.02x0.02x0.05mm3的单晶体从簇中人工分离并在含有 26％乙二醇(作为冷冻保护剂)的液氮中快速冷却。
用“自制”铜轮阳极放射源(发生器RU-H3R，Rigaku-MSC Ltd.，装 备有Max-Flux共聚焦多层膜镜片，Osmic Inc.)在100K进行X射线衍 射数据收集实验。用Raxis IV++图像板检测仪(Rigaku-MCS Ltd.)记录衍 射数据。在一度摆动步骤(总共收集129度)用单晶体收集原始衍射数据， 然后用HKL衍射数据处理套装索引、整合、量度和还原这些数据 (Otwinowski Z，Minor W 1997Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.Methods in Enzymology：Macromolecular Crystallography，part A 276：307-326)。所述晶体属于正交I212121空间群， 其在不对称单位具有TSHR-M22Fab复合物(54％的溶剂含量)并衍射 至3.1Bragg’s间距。精化(refinement)统计数据如表1所示。
按描述再制备TSHR260与M22Fab的复合物，浓缩至32mg/mL并 进行结晶试验，按照与第一系列试验相同的结晶条件获得晶体。用同步加 速器放射源(工作站PXl 4.2，Council for the Central Laboratory of the Research Councils，Daresbury，UK)进行X射线衍射数据收集。在100K 从单晶体收集数据且衍射分辨率提高至2.55Bragg’s间距。然后用新获 得的2.55分辨率数据将以3.1的分辨率获得的初始结构再精化，至R 因子(R-factor)为18.1％(Rfree＝24.5％)。精化统计数据如表1所示。
结果
结构测定和精化
部分去糖基化的TSHR260-M22Fab复合物成功结晶但是只生成多 晶体簇，该晶体簇不能进一步开发以获得单晶体。适于X射线衍射分析 的单晶体可通过手工分裂晶体簇获得。
所述结构通过分子替换解析。M22Fab(Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M，Richards T，Kiddie A，Brereton K，Premawardhana LDKE， Chirgadze DY，Nunez Miguel R，Blundell TL，Furmaniak J，Rees Smith B 2004Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor：sequence structure and function.Thyroid 14： 560-570)和FSHR(Fan QR，Hendrickson WA 2005Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor.Nature 433： 269-277)晶体结构用来作为分子替换搜索模型；计算在CCP4程序组 (Bailey S 1994 The CCP4suite-programs for protein crystallography. Acta Crystallography Section D 50：760-763)的AmoRe(Navaza J 1994 Amore-an automated package for molecular replacement.Acta Crystallography Section D 50：157-163)上完成。M22Fab搜索探针进一步 分成两个：一个只含有可变区，另一个只含恒定区。成功得到了不对称单 位内TSHR和M22Fab可变区的位置，导致了48.2％的R因子。但是， 对恒定区未得到解析，因此使用在第一轮精化后计算出的电子密度图人工 安置这些恒定区。精化前，得到的模型具有43.5％的R因子和45.5％的 Rfree。总共进行8轮晶体学精化和人工重建。原子晶体学精化使用CNS (Brunger AT，Adams PD，Clore GM，DeLano WL，Gros P， Grosse-Kunstleve RW，Jiang JS，Kuszewski J，Nigles M，Pannu NS，Read RJ，Rice LM，Simonson T，Warren GL 1998Crystallography and NMR system：a new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallography Section D 54：905-921)，并在后阶段使用 REFMAC(Murshudov GN，Vagin AA，Dodson EJ 1997Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.Acta Crystallography Section D 53：240-255)包完成。CNS中使用的模拟退火方 法用于前两轮精化，但是在后面步骤中被Powell最小化方法取代。使用 sigmaA加权的2Fo-Fc，Fo-Fc和退火遗漏图在Coot(Emsley P，Cowtan K 2004Coot：model-building tools for assessing the accuracy of crystal structures.Nature 355：472-475)上进行人工重建。Zn2+离子、N-乙酰氨基 葡萄糖残基和水分子只用于后期精化/重建步骤上。复合物结构模型在 3.1分辨率上被精化至R因子为20.7％(Rfree＝28.3％)。然后使用在2.55 分辨率新获得的数据再次精化在3.1分辨率获得的初始结构至R因子 为18.1％(Rfree＝24.5％)(表1)。
最终结构由M22LC(残基1-208)、HC(残基1-127和134-213)、 TSHR(残基30-257)、6个N-乙酰氨基葡萄糖残基、5个锌离子和289 个水分子组成。在TSRH所有N联糖基化位点(N77、N99、Nl13、Nl77 和Nl98)和M22的一个位点(LC N26)观察到连续电子密度。由于无序， M22HC128-133的成环残基和某些末端残基(M22Fab LC 209-212，M22 Fab HC 214-220、TSHR残基22-29、258-260和C末端6-组氨酸)没有 电子密度。TSHR E35的侧链原子缺乏清晰的电子密度，因此该残基被建 模为丙氨酸。
电子密度图的一个实例参见图3。具体地，图3显示了TSHR(大致 朝该图顶部)和M22Fab重链(大致朝该图底部)之间的部分界面。该 图在1.2σ水平上勾画出轮廓，所有显示的残基都被标记。
TSHR结构
TSHR呈轻微弯曲管状，有相对凹凸表面，带一个位于凹面的10链 β-折叠。管的内表面排满疏水残基。最接近TSHR的同源物是FSHR，其 与TSHR共享40.9％序列同一性(Misrahi M，Loosfelt H，Atger M，Sar S， Guiochon-Mantel A，Milgrom E 1990Cloning，sequencing and expression of human TSH receptor.Bioc hemical and Biophysical Research Communications 166：394-403(图10b)和Fan QR，Hendrickson WA 2005 Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor. Nature 433：269-277)；两者结构之间Cα核心原子上的均方根偏 差(rmsd)为1.1人类TSHR富含亮氨酸的重复结构的凹面在一个平 行的β折叠内存在10条β链，且形成9个重复。每条链从N-端开始的残 基数量为：4、5、5、5、5、7、5、6、3、3。另外那个在第一个重复链之 前的β链则形成β发夹结构。在LRD结构的凸面有8个小链(每链有两 个残基)，形成两个3-链β折叠和1个2-链β折叠。在TSHR LRD结构 中没有螺旋，如图4所示。使用David Keith Smith(1989，未公开数据) 基于DSSP算法(Kabsch W，Sander C 1983Dictionary of protein secondary structure：pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features.Biopolymers 22：2677-2637)开发的SSTRUC软件识 别二级结构。TSHR上全部五个(N77、N99、N113、Nl77和Nl98)糖基 化位点都位于凸面。
TSHR-M22Fab复合物
TSHR-M22Fab复合物的结构显示M22Fab与TSHR 260的凹面相 结合，并且该TSRH“管”的对称轴几乎与自身抗体轻重链之间的界面平 行，如图5所示。相比没有结合M22的那些残基(所有原子的rmsd均 为0.4)，位于M22的抗体可变区的结合界面的大部分残基在结合到 TSHR时几乎处于同样的位置。对于HC P97的Cα原子，观察到M22主 干残基的原子的最大偏差只有1.1此外，与未结合的M22相比，只有 6个M22残基的侧链存在大于2的偏差(表5)。
M22Fab恒定区的总体位置与未结合M22Fab结构的总体位置的差 异在于围绕恒定区和可变区之间的轴有约20度的旋转，该旋转是由于晶 体中分子堆积所致。有足够的电子密度对受体上所有5个可能的糖基化位 点和M22Fab上的一个糖基化位点(N26)的碳水化合物残基进行建模。 所有位于TSHR260上的糖基化位点都远离结合界面，不影响M22Fab 结合。TSHR260-M22Fab复合物与FSH-FSH LRD复合物的比较结果见 图6。图6显示了两种结构的动画图，仅使用FSHR和TSHR的残基进 行重叠。
复合物中结合排列的有些方面尤其让人惊讶，这些方面包括：
(a)M22以非常类似于FSH扣住TSHR LRD的方式扣住TSHR LRD 的凹面。而且，M22的2重轴(2 fold axis)和FSH的2重轴在它们各 自的复合物中完全重叠。明显地，自身抗体与激素具有几乎相同的结合特 征。现有技术没有关于此的提示。
(b)此外，与M22相互作用的TSHR LRD的凹面面积很大(2500)， 且从N末端延伸到C末端。
这是令人惊讶的和意外的，且现有技术对这种广泛的相互作用没有提 示。
(c)除了具有与LRD结合的大面积外，在复合物晶体结构中观察到 的不同类型的相互作用的强度和数量是惊人的。例如，在两个相互作用的 蛋白之间有22个氢键和盐桥的网络是最罕见的。
(d)对复合物中的M22和游离的M22的结构的比较表明，参与TSHR 结合的M22残基的原子基本上不移动。这也让人惊讶，因为有些诱导契 合本来是可以预知的。当FSH与FSHR结合时也有明显的移动。
关于TSHR LRD自身的结构，其与FSHR LRD惊人地类似，但是 也有某些重要差异，包括β链的数量。
自身抗体-受体相互作用
共有2500溶剂可及表面积被掩藏在自身抗体和受体之间的界面。 TSHR和M22Fab之间的相互作用代表一个广泛的氢键网络、盐桥(22 个氢键和盐桥)、非氢键极性相互作用和疏水性接触(表2；图7和图8) 的混合。在图8中，相互作用的残基用棒表示并被标出。氢键用虚线表示。
虽然两个链都形成大量氢键和盐桥(重链14个，轻链8个)，但是与 TSHR相互作用的M22Fab的重链残基比轻链多。M22Fab大多数相互 作用的残基位于Kabat(Kabat E，Perry H，Wu T，Gottesman K，Foeller C 1991 Sequences of proteins of immunological interest，5th ed.US Public Service Health Service.Bethesda，MD)定义的高变区L2、H1、H2和H3， 如图5e所示。在图5e，参与受体结合的残基都以粗体和下划线表示 (Otwinowski Z，Minor W 1997Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.Methods in Enzymology：Macromolecular Crystallography，part A 276：307-326)。埋藏于TSHR LRD和M22LC 之间界面的表面，TSHR LRD的为526.9并且M22LC的为526.5 而对于TSHR LRD和M22HC之间的相互作用，TSHR LRD的面积为 730.1并且M22HC的面积为730.4
TSHR LRD和M22LC之间有7个氢键，TSHR LRD和M22HC 之间也有7个氢键。具体而言，M22HC Y99与两个TSHR残基El07(包 括M22Y99的主干氮和TSHR E107的侧链)以及K58(包括这两个残基 的侧链)以氢键结合。M22LC Q53也产生两个氢键(与TSHR N208和 Q235)。TSHR K129产生包括M22HC T30和T53在内的3个氢键，而 TSHR Q235与2个M22残基(LC D52和LC Q53)以氢键结合。
TSHR260-M22Fab相互作用还包括14个水介导的氢键(见表2)。 参与与M22以强范德华力相互作用(即相互作用表面积超过60)的 TSHR残基为R255(102.2)、R80(91.9)、R38(76.6)、K129 (75.5)、K183(64.4)和R109(60.6)。参与与TSHR260以强 范德华力相互作用(即相互作用表面积超过70)的M22残基为HC R28 (115.8)、HC Y56(86.6)、LC Y50(86.4)、HC Y99(79.4)、 LC Q53(76.7)和HC P97(70.8)。在TSHR260-M22Fab复合物内 存在的静电相互作用涉及下列残基(以强度降低为序)：TSHR D1 51和 M22HC R28(最小距离2.76)、TSHR K58和M22LC D95A(最小距 离2.60)、TSHR R80和M22HC D54(最小距离2.75)、TSHR K183 和M22HC E96(最小距离3.04)、TSHR K209和M22LC D52(最小 距离3.57)、TSHR R80和M22HC D52(最小距离3.20)、TSHR K129 和M22HC R28(最小距离4.05)、TSHR K209和M22HC D51(最小 距离4.50)、TSHR R255和M22LC D60(最小距离4.39)、TSHR K129和M22LC D52(最小距离5.27)(表3)，这些相互作用通过用 于计算残基侧链电荷的Henderson-Hasselbalch等式确定，并且在执行用 于评估原子电荷以及带电原子之间的距离的自编程序中，要将pH纳入考 虑之中。
TSHR残基中，TSHR R80与M22残基产生最强烈的累积静电作用， 而M22HC R28与TSHR残基产生最强烈的累积静电作用。M22Fab重 链的高变区H1、H2和H3的残基形成了带负电空腔的外缘，所述带负电 空腔与TSHR(R38、K58、R80、Hl05、K129)高度带正电荷的区域相 互作用。
TSHR LRD中的突变对M22对在与TSHR260-M22Fab晶体结构中所见 的相互作用有关的表达TSHR的CHO细胞中环磷酸腺苷生产的刺激的影 响
通过试验测定的TSHR LRD中的氨基酸突变对M22刺激的环AMP 活性的作用效果如WO2006/016121A所述。然后根据TSHR260-M22晶 体结构中发现的相互作用来分析这些作用效果。
例如，突变R80A、E107A、R109A、K129A、K183A、Y185A、R255A 对M22刺激活性有显著影响(比野生型TSHR活性低60％) (WO2006/016121A)，并且复合物晶体结构中TSHR260和M22Fab之间 的相互作用分析显示所有这些TSHR残基均与M22Fab相互作用(表2 和3)。而且，它们参与该结构中22个氢键中的9个和盐桥的作用(表2)， 而TSHR R109生成两个水介导的氢键(表2)和强范德华力相互作用。 R80、E107、R109、K183、Y185和R255也参与两个非氢键极性相互作 用和与M22的疏水性接触(表2)。
如WO2006/016121A所述在TSHR LRD中对M22刺激性活性有显 著影响的另一个突变是F130A，且晶体结构显示出与M22HC P97和HC G98(表2)疏水性接触的F130。
在TSHR LRD中进行了几个新的突变(在WO2006/016121A中没有 描述)并对其进行了测试。突变K209E对M22刺激活性有显著影响(小 于野生型TSHR活性的20％)。TSHR K209参与了与M22LC Y50的非 氢键极性相互作用，与M22LC Q53(表2)形成疏水性接触，并与M22 LC D51和LC D52(表4)形成有吸引静电作用，这给突变TSHR K209E 为什么会导致M22活性损失(小于野生型活性TSHR的20％)提供了解 释。
与M 22中的突变对与TSHR260-M22Fab晶体结构中所见的相互作用有 关的TSHR转染CHO细胞中环AMP的M22刺激的作用效果
几个单氨基酸突变被引入M22Fab重链和轻链序列中，并研究了这 些突变对表达野生型TSHR的CHO细胞中环腺苷酸生成的M22刺激的 作用效果(表4)。
在几个在突变时表现对M22刺激活性(低于野生型的80％)有作用 的氨基酸中，HC R28与TSHR D151形成3个盐桥，与TSHR F153和 I152形成了极性相互作用，并与TSHR I152和F153形成了疏水性接触 (表2)。M22HC D52与TSHR R80发生强烈的静电作用，且与TSHR H105发生极性相互作用(表2和3)。M22HC D54与TSHR R80发生强 烈的静电相互作用，且通过水与TSHR T104以氢键结合(表2和3)， M22HC Y56与TSHR R38发生极性相互作用，并与TSHR R38、T56和 R80发生强烈的疏水性接触(表2)。最后，M22LC D52与TSHR Q235 形成氢键，并与TSHR K209发生强烈的静电相互作用(表2和3)。
将TSHR和M22中的突变对M22刺激活性的影响结果的分析与其 复合物晶体结构中TSHR和M22Fab之间的相互作用的分析结合起来， 可识别TSHR和M22Fab中在引起生物活性的相互作用上是很重要的残 基。具体而言，TSHR R38与M22HL T57氢键结合，而TSHR R80与 M22Fab(HC D52和HC D54)形成3个盐桥，并参与与M22HC Y56的 疏水性接触(表2)。此外，TSHR K129与M22Fab(HC T30和HC T53) 形成了3个氢键。因此，TSHR LRD凹面的N-末端带正电荷的残基簇在 与引起生物活性的M22相互作用上是很重要的(图5d)。
然而，我们的试验还发现TSHR LRD中凹面的C末端部分的残基对 于M22的生物活性也很重要，并参与复合物晶体结构中TSHR和M22 之间的相互作用。在这些残基中，TSHR R255尤其受到关注，这是因为 R255的突变对M22活性有显著影响，但是对TSH活性没有影响 (WO2006/016121A)。TSHR R255与晶体结构中M22Fab发生数个相互 作用(与M22LC V58形成两个氢键，与M22LC D60形成静电相互作 用，与LC D60形成极性相互作用，并与LC L54形成疏水性相互作用) (参见上文及表2和3)。
在M22重链和轻链中有许多残基都参与与复合物中的TSHR LRD的 相互作用(表2)。这其中有一些(M22HC R28、HC D52、HC D54、 HC Y56和LC D52)尤其受到关注，因为如我们试验所示，这些残基的 突变对M22的生物活性具有影响(见上和表2和4)。
结论
总之，TSHR或M22中的各种突变对M22刺激活性的效果的分析与 TSHR260-M22Fab的晶体结构中观察到的相互关系之间具有良好的一致 性。这表明与M22Fab复合的TSHR260晶体结构提供了设计分子结构 的方法，该分子结构将与TSHR相互作用或者与诸如M22的分子以干扰 受体-自身抗体相互作用的这种方式发生相互作用。这种干扰作用提供了 一种预防Graves氏病患者的TSHR自身抗体刺激作用的方法。
例如，设计来填充M22表面(由M22H1、H2和H3形成)带负电 荷的空腔的小分子应该阻止M22(以及具有相似表面特征的TSHR自身 抗体)结合到受体上，其中所述带负电荷的空腔与TSHR LRD凹面的 N-端高度带正电荷的脊相互作用。相反，设计来与上述TSHR LRD上的 带正电荷的脊相互作用的小分子被预期能阻止M22(以及具有相似表面 特征的TSHR自身抗体)与TSRH相互作用。此外，可设计小分子来阻 止重要TSRH残基R255与M22和其他TSRH自身抗体相互作用。
TSHR LRD和M22中的特定氨基酸突变可被设计来研究TSHR激 活机制，由此指出进一步防止TSHR自身抗体激活TSHR的方法。而且， 从这些研究中获得的对TSHR激活机制的理解可以提供研究和理解促性 腺素受体激活的方法，因为促性腺素受体与TSHR结构上密切相关。
而且，对由复合物晶体结构提供的M22和TSHR之间的相互作用的 详细理解，再结合上面提及的受体结合机制的进一步研究，可设计出用作 TSHR激动剂的新分子。当含有TSHR的组织需要被刺激时，这种甲状 腺刺激分子在体内会起作用。例如，作为当前被用来刺激在消融治疗之后 留下的任何残留甲状腺癌的131I摄入的人重组TSH的替代物。
TSHR-M22晶体结构提供的详细信息也允许设计新的改良的配体用 来测量和评估患者血清样品中的TSHR自身抗体。
TSHR和M22之间的相互作用广泛而复杂。而且，与FSH(Fan QR， Hendrickson WA 2005Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor.Nature 433：269-277)复合的FSHR的晶体结构 与TSHR-M22晶体结构的比较表明，M22以与FSH相对FSHR定位几 乎一样的方式相对TSHR定位自身(表6)。具体而言，M22和FSH在 相对于受体管长轴大约90°方向扣住各自的受体。TSH-TSHR相互作用的 比较模型表明，由FSH及其受体形成的复合物与由FSH与FSHR复合形 成的复合物具有极其类似的结构(Nunez Miguel R，Sanders J，Jeffreys J， Depraetere H，Evans M，Richards T，Blundell TL，Rees Smith B， Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor-thyrotropin interaction by comparative modeling.Thyroid 14：991-1011and Nunez Miguel R，Sanders J，Blundell TL，Rees Smith B3 Furmaniak J 2005 Comparative Modeling of the Thyrotropin Receptor.Thyroid 15： 746-747)。
免疫系统和TSHR的进化压力是有意义的，其导致自身抗体的形成， 所述自身抗体通过与受体相互作用以模拟TSH的作用，其中与受体的相 互作用方式与激素类似。现在，在分子水平上清楚地确定了M22-TSHR 相互作用的细节，对这些进化压力以及TSHR为什么会出现自身免疫的 一些理解可能变得清晰。
表1.2.55分辨率下的晶体数据收集和精化统计



圆括号内值表示在最高分辨率范围下的对应统计。
1Rsym＝∑|Ih-|/∑hIh，这里Ih是反射h的强度，是所有相对对称反射 的平均强度。
2Rcryst＝∑‖Fobs|-|Fcalc|/∑|Fobs|，Fobs和Fcalc实测和计算的结构因子振幅。
3Rfree对于Rcryst使用排除在精化外的数据随意子集(大约5％)(Brunger AT 1992Free R value：a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures.Nature 355：472-475)。
4估计定位数据误差，基于REFMAC计算的Rfree值(Murshudov GN，Vagin AA，Dodson EJ 1997Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.Acta Crystallograpy Selection D53：240-255)。
5用PROCHECK计算(Laskowski RA，MacArthur MW，Moss DS， Thornton JM 1993PROCHECK：a program to check the stereochemical quality of protein structures.J Appl Crystallogr 26：283-281)。
表2.在复合物的晶体结构中观察到的TSHR260和M22Fab之间的相互 作用

*代表盐桥。
水介导的氢键



1氢键距离范围在2.3-3.4之间。
2括号中的字母表示M22Fab链残基属于：A-轻链，B-重链。
3极性接触的距离介于3.4至4.0之间。
4碳碳接触在4.0内。
表3.
TSHR260-M22Fab复合物中的离子对相互作用



所显示的用于比较的相互作用强度，单位是牛顿，使用自编程序 (ELECINT，R.Nunez Miguel，unpublished)计算，其中对静电场计算取ε＝ 1，对使用Henderson-Hasselbalch公式计算带电残基的侧链原子电荷取 pH＝7.4。
表4.M22中的突变对表达野生型TSHR的CHO细胞中环腺苷酸生成的 M22刺激的影响
  突变的M22Fab制剂   M22Fab对cAMP产生的刺激   野生型   +++++   HC R28D   +++   HC T30A   +++++   HC D52A   ++   HC D52K   -   HC D54R   +   HC Y56A   ++   HC K64E   +++++   HC K73D   +++++   HC R94E   +++   HC E96A   ++++   HC E96R   没有检测到表达   LC D51K   +++++   LC D52A   +++   LC D52R   没有检测到表达   LC D93R   +++++
+++++＝野生型活性(100％)，
++++＝＜野生型活性的100-80％，
+++＝＜野生型活性的80-60％，
++＝＜野生型活性的60-40％，
+＝＜野生型活性的40-20％，
-＝＜野生型活性的20％。
每种突变对M22Fab抑制标记的M22和标记的TSH与TSHR结合的能力 的作用与对环腺苷酸的刺激作用是相似的。
表5.
在未结合的M22和结合的M22结构中原子位置的偏差
主干
主干上唯一可被考虑的变化是：
Pro97HC，其Cα原子发生1.1的偏移
侧链
偏移(大于2)
Arg28HC，其NH2原子发生4.8的偏移。
Trp33HC，其NE1原子发生4.0的偏移。
Arg66LC，其NH1原子发生3.2的偏移。
Lys64HC，其NZ原子发生3.0的偏移。
Asp95LC，其OD1原子发生2.2的偏移。
Asp 52HC，其OD1原子发生2.1的偏移。
偏移(大于1.3且小于2)
Ser56LC，其OG原子发生1.8的偏移。
Tyr99HC，其OH原子发生1.6的偏移。
AspóO LC，其OD2原子发生1.4的偏移。
Pro97HC，其CB原子发生1.3的偏移。
表6.
FSHR-FSH和TSHR-M22复合物的比较
A.分别与FSH或M22Fab(HC＝重链；LC＝轻链)以范德华力相互作用 的FSHR或TSHR残基。
B.分别与FSH或M22Fab(HC＝重链；LC＝轻链)以氢键相互作用的 FSHR或TSHR残基。
C.分别与FSH或M22Fab(HC＝重链；LC＝轻链)以强的离子对相互作 用的FSHR或TSHR残基。
表A-C中的残基编号对应FSHR和TSHR序列相同位置的残基。
A.范德华力相互作用

＊产生强的相互作用的残基(ΔASA＞40)。
B.氢键

X3该残基与相应的链产生三个氢键
C.离子对相互作用(相互作用强度大于4.0e-10N)

X2表示两个离子对相互作用，X3表示三个相互作用。
序列表
<110>RSR有限公司
<120>THSR受体的晶体结构
<130>P108061PCT
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<151>2006-08-31
<150>GB 0703070.3
<151>2007-02-16
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tg                                                                   62
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<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln
1               5                   10                  15
Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu
            20                  25                  30
Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn
        35                  40                  45
Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu
    50                  55                  60
Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg
65                  70                  75                  80
Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu
                85                  90                  95
Pro Leu Leu Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe
            100                 105                 110
Pro Asp Leu Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu
        115                 120                 125
Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln
    130                 135                 140
Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe
145                 150                 155                 160
Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val
                165                 170                 175
Tyr Leu Asn Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe
            180                 185                 190
Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser
        195                 200                 205
Val Thr Ala Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile
    210                 215                 220
Ala Arg Asn Thr
225
<210>15
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<213>人(Homo sapiens)
<400>15
Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys Gln
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Ile
            20                  25                  30
Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Gln Lys Gly Ala
        35                  40                  45
Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn Asp
    50                  55                  60
Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asp Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys Leu
65                  70                  75                  80
His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asn Pro
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145                 150                 155                 160
Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly Thr
                165                 170                 175
Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu Leu
            180                 185                 190
Pro Asn Asp Val Phe His Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp Ile
        195                 200                 205
Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn Leu
    210                 215                 220
Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro Thr
225                 230                 235                 240
Leu Glu
<210>16
<211>764
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
            20                  25                  30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
    50                  55                  60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
                85                  90                  95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
                165                 170                 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
            180                 185                 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
        195                 200                 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
                245                 250                 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
            260                 265                 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
    290                 295                 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
                325                 330                 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
            340                 345                 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
        355                 360                 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
    370                 375                 380
Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
                405                 410                 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
            420                 425                 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
        435                 440                 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
    450                 455                 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465                 470                 475                 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
                485                 490                 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
            500                 505                 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
        515                 520                 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
    530                 535                 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545                 550                 555                 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
                565                 570                 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
            580                 585                 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
        595                 600                 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
    610                 615                 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625                 630                 635                 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
                645                 650                 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
            660                 665                 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
        675                 680                 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
    690                 695                 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705                 710                 715                 720
Val Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
                725                 730                 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
            740                 745                 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
        755                 760
<210>17
<211>764
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
            20                  25                  30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
    50                  55                  60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
                85                  90                  95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
                165                 170                 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
            180                 185                 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
        195                 200                 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
                245                 250                 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
            260                 265                 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
    290                 295                 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
                325                 330                 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
            340                 345                 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
        355                 360                 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
    370                 375                 380
Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
                405                 410                 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
            420                 425                 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
        435                 440                 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
    450                 455                 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465                 470                 475                 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
                485                 490                 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
            500                 505                 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
        515                 520                 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
    530                 535                 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545                 550                 555                 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
                565                 570                 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
            580                 585                 590
Ala Phe Val Ile ValCys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
        595                 600                 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
    610                 615                 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625                 630                 635                 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
                645                 650                 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
            660                 665                 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
        675                 680                 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
    690                 695                 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705                 710                 715                 720
Val Gln Lys Val Thr His Glu Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
                725                 730                 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Lys Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
            740                 745                 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
        755                 760
<210>18
<211>763
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
            20                  25                  30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
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Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
                85                  90                  95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
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Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Ser Leu Ala Phe Ser Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145                 150                 155                 160
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                165                 170                 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
            180                 185                 190
Gln Gly Tyr Asp Phe Phe Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
        195                 200                 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
                245                 250                 255
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Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
    290                 295                 300
Ser Ile Glu Thr Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
                325                 330                 335
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Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
                405                 410                 415
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545                 550                 555                 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
                565                 570                 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
            580                 585                 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
        595                 600                 605
Arg Asn Pro His Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg
    610                 615                 620
Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser
625                 630                 635                 640
Phe Tyr Ala Val Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val Ser
                645                 650                 655
Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala
            660                 665                 670
Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp Val
        675                 680                 685
Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln Ala
    690                 695                 700
Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln Val
705                 710                 715                 720
Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu Asp
                725                 730                 735
Val Tyr Glu Leu Ile Glu Ash Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln Gly
            740                 745                 750
Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
        755                 760
<210>19
<211>764
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
            20                  25                  30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
    50                  55                  60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
                85                  90                  95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
                165                 170                 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
            180                 185                 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
        195                 200                 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
                245                 250                 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
             260                 265                 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
    290                 295                 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
                325                 330                 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
            340                 345                 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
        355                 360                 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
    370                 375                 380
Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
                405                 410                 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
            420                 425                 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
        435                 440                 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
    450                 455                 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465                 470                 475                 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
                485                 490                 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
            500                 505                 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
        515                 520                 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
    530                 535                 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545                 550                 555                 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
                565                 570                 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
            580                 585                 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys His Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
        595                 600                 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
    610                 615                 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625                 630                 635                 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
                645                 650                 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
            660                 665                 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
        675                 680                 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
    690                 695                 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705                 710                 715                 720
Val Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
                725                 730                 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
            740                 745                 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
        755                 760
<210>20
<211>764
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
            20                  25                  30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
    50                  55                  60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
                85                  90                  95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
                165                 170                 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
            180                 185                 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
        195                 200                 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
                245                 250                 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
            260                 265                 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
    290                 295                 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
                325                 330                 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
            340                 345                 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
        355                 360                 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
    370                 375                 380
Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
                405                 410                 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
            420                 425                 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
        435                 440                 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
    450                 455                 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465                 470                 475                 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
                485                 490                 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
            500                 505                 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
        515                 520                 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
    530                 535                 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545                 550                 555                 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
                565                 570                 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
            580                 585                 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
        595                 600                 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
    610                 615                 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625                 630                 635                 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
                645                 650                 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
            660                 665                 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
        675                 680                 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
    690                 695                 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705                 710                 715                 720
Val Gln Lys Val Thr His Glu Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
                725                 730                 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
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Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
        755                 760
<210>21
<211>764
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
            20                  25                  30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
    50                  55                  60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Leu Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
                85                  90                  95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
                165                 170                 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
            180                 185                 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
        195                 200                 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
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Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
                245                 250                 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
            260                 265                 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
    290                 295                 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305                 310                 315                 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
                325                 330                 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
            340                 345                 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
        355                 360                 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
    370                 375                 380
Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385                 390                 395                 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
                405                 410                 415
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            420                 425                 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
        435                 440                 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
    450                 455                 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465                 470                 475                 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
                485                 490                 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
            500                 505                 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
        515                 520                 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
    530                 535                 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545                 550                 555                 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
                565                 570                 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
            580                 585                 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
        595                 600                 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
    610                 615                 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625                 630                 635                 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
                645                 650                 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
            660                 665                 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
        675                 680                 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
    690                 695                 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705                 710                 715                 720
Val Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
                725                 730                 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
            740                 745                 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
        755                 760