用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
阅读：189发布：2023-03-12
专利汇可以提供用于诊断和治疗癌症的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于诊断和 治疗 癌症的组合物和方法。本发明描述了一种分离的 抗体 ，所述抗体特异性结合两种以上人类FZD受体的胞外域，并抑制 肿瘤 细胞生长。本发明还描述了一种治疗癌症的方法，所述方法包括施用抑制肿瘤细胞生长有效量的本发明所公开的抗体。，下面是用于诊断和治疗癌症的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种重组多肽，所述重组多肽包含融合到人类Fc的人类Frizzled(FZD)受体的片段，其中所述人类FZD受体的片段由人类FZD受体的Fri域组成，该可溶性受体抑制Wnt介导的信号转导，并且所述人类FZD受体选自由FZD8、FZD4和FZD5组成的组。
2.如权利要求1所述的重组多肽，所述重组多肽抑制由Wnt介导的信号转导，所述Wnt选自由Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b组成的组。
3.如权利要求1所述的重组多肽，其中所述人类FZD受体是FZD8。
4.如权利要求3所述的重组多肽，其中FZD8Fri域由SEQ ID NO：6的约第28个氨基酸残基～第158个氨基酸残基组成。
5.如权利要求4所述的重组多肽，其中FZD8Fri域由SEQ ID NO：6的第28个氨基酸残基～第158个氨基酸残基组成。
6.一种重组多肽，所述重组多肽包含融合到人类Fc的人类FZD8受体的片段，其中所述人类FZD8受体的片段由SEQ ID NO：6组成。
7.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1～6中任一项所述的重组多肽的多核苷酸。
8.一种载体，所述载体包含权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含权利要求8所述的载体。
10.一种抑制细胞内Wnt信号转导的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的权利要求1～5中任一项所述的重组多肽接触。
11.一种组合物，所述组合物包含权利要求1～5中任一项所述的重组多肽。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述组合物是无菌液体组合物。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物适于对受试对象施用。
14.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物能够抑制细胞内的Wnt介导的信号转导。
15.权利要求1～5中任一项所述的重组多肽在制备适于治疗癌的药物中的应用。
用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
[0001] 本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US2006/042375，中国国家申请号为200680040721.9，申请日为2006年10月31日，发明名称为“用于诊断和治疗癌症的组合物和方法”。
技术领域
背景技术
[0003] 癌症是发达世界中死亡的主要原因之一，仅在美国，每年有超过一百万人诊断患有癌症，并且有500,000人死亡。总体而言，据估计在3人当中就有不止1人在他们的一生当中会患上某些形式的癌症。癌症有超过200种不同的类型，其中的四种-乳癌、肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌—超过所有新发现病例的一半(Jemal等，2003，Cancer J.Clin.53：5～26)。
[0004] 乳癌是女性中最常见的癌症，据估计，有12%的女性在她们的一生中存在患上该疾病的风险。尽管由于检查的提早和治疗的改善，死亡率已得到降低，但是乳癌仍然是中年女性死亡的主要原因，并且转移乳癌依然是不可治愈的疾病。患有转移乳癌的大部分患者在显现时只有一个或两个器官系统受到影响，但是随着疾病的发展，常常会使多个部位受累。转移受累的最常见部位是胸腔壁的皮肤和软组织以及腋窝和锁骨上区域中的局部复发。远端转移的最常见的部位是骨(远端转移的30%～40%)，其次是肺和肝。而且，尽管只有约1%～5%的刚诊断患有乳癌的女性在诊断时具有远端转移，但是约有50%的患有局部疾病的患者最终在5年内都出现转移复发。目前，远端转移显现的中位存活为约3年。
[0005] 目前对乳癌进行诊断和分期的方法包括肿瘤结节转移(TNM)体系，该体系依赖于肿瘤尺寸、淋巴结中肿瘤的存在和远端转移的存在(American Joint Committee on Cancer：AJCC Cancer Staging Manual.Philadelphia，Pa.：Lippincott-Raven Publishers，第5版，1997，第171～180页；Harris，JR：“Staging of breast carcinoma”于 Harris，J.R.，Hellman，S.，Henderson，I.C.，Kinne D.W.( 编 )：Breast Diseases.Philadelphia，Lippincott，1991)。这些参数用以提供预后和选择适当的疗法。还可以对肿瘤的形态外观进行评价，但是由于具有相似的组织病理学外观的肿瘤能够表现出明显的临床变化性，因此这种方法具有严重的局限性。最后，细胞表面标记物的测定可用以将某些肿瘤类型分为各亚类。例如，在乳癌的预后和治疗中考虑的一个因素是雌激素受体(ER)的存在，因为ER阳性乳癌通常比ER阴性肿瘤更容易对诸如三苯氧胺或芳香酶抑制剂等激素疗法作出应答。这些分析尽管有用，但是只能部分地预测乳腺肿瘤的临床行为，并且在目前诊断工具无法检测并且目前疗法无法治疗的乳癌中还存在大量的表型多样性。
[0006] 前列腺癌是发达世界的男性中最为常见的癌症，在美国所有新发现的癌症病例中估计占33%，是频率次高的死亡原因(Jemal等，2003，CA Cancer J.Clin.53：5～26)。由于前列腺特异性抗原(PSA)血液测试的引入，前列腺癌的早期检测显著提高了存活率；诊断时患有局部区域性阶段前列腺癌的患者的5年存活率接近100%。但是仍有超过50%的患者最终将发展为局部晚期疾病或转移疾病(Muthuramalingam等，2004，Clin.Oncol.16：505～16)。
[0007] 目前，根治性前列腺切除术和放射疗法为大部分的局部化的前列腺肿瘤提供了治愈性治疗。然而对于晚期病例，可选择的治疗方案非常有限。对于转移疾病，单独使用黄体生成素释放激素(LHRH)激动药或者结合使用黄体生成素释放激素(LHRH)激动药与抗雄激素的雄激素阻断是标准治疗。尽管使雄激素得到最大程度的阻断，但是疾病病情几乎总还是发展，大部分逐渐形成雄激素非依赖性疾病。目前对激素难以医治的前列腺癌还没有普遍接受的治疗，并且常用的是化学疗法(Muthuramalingam等，2004，Clin.Oncol.16：505～16；Trojan等，2005，AnticancerRes.25：551～61)。
[0008] 结肠直肠癌在世界范围内是第3位最常见癌症，并且是第4位频率最高的癌症死亡原因(Weitz等，2005，Lancet 365：153～65)。所有结肠直肠癌中约有5%～10%是遗传的，其主要形式之一是家族性腺瘤性息肉病(FAP)，该家族性腺瘤性息肉病是常染色体显性疾病，其中有约80%的受影响个体在结肠腺瘤性息肉病(APC)基因中含有种系突变。结肠直肠癌通过周向生长而局部侵入，在其他位置则通过淋巴扩散、血行扩散、跨腹膜扩散和周围神经扩散来侵入。淋巴外受累的最常见部位是肝，腹部外器官受影响的频率最高的是肺。血行扩散的其他部位包括骨、肾、肾上腺和脑。
[0009] 结肠直肠癌的现有分期体系基于肿瘤穿过肠壁的程度以及结节受累的有无。这种分期体系被限定为3个主要的Duke分级：DukeA级疾病限制于结肠或直肠的黏膜下层；Duke B级疾病具有侵入穿过固有肌层并可能穿过结肠或直肠壁的肿瘤；Duke C级疾病包括任何程度的带有区域性淋巴结转移的肠壁侵入。虽然对于结肠直肠癌来说手术切除术是非常有效的，在Duke A级患者中提供95％的治愈率，但是在Duke B级患者中该比率下降到
75％，在Duke C级疾病中阳性淋巴结的存在预示在5年内复发可能性为60％。采用化学疗法的术后疗程对Duke C级患者进行治疗可将复发率降低至40%～50%，这是目前这些患者的护理标准。
75％，在Duke C级疾病中阳性淋巴结的存在预示在5年内复发可能性为60％。采用化学疗法的术后疗程对Duke C级患者进行治疗可将复发率降低至40%～50%，这是目前这些患者的护理标准。
[0010] 肺癌是世界上最常见的癌症，在美国是所诊断到的癌症中第三大最常见的癌症，是迄今为止频率最高的癌症死亡原因(Spiro等，2002，Am.J.Respir.Crit.Care Med.166：1166～96；Jemal等，2003，CA Cancer J.Clin.53：5～26)。据认为，吸烟造成的肺癌占所有肺癌的比例估计有87%，使得肺癌成为最致命的可预防疾病。肺癌分为两种主要类型：
小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，这两种类型肺癌占所有肺癌的比例超过90%。
SCLC病例占15%～20%，其特征在于，这类肺癌根源于大的中心气道和组织学组成为几近没有细胞质的小细胞的片层。SCLC比NSCLC更具有侵袭性，并且生长快、转移早。NSCLC占所有病例的80%～85%，并基于组织学而进一步分为3个主要亚型：腺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)和大细胞未分化癌。
小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，这两种类型肺癌占所有肺癌的比例超过90%。
SCLC病例占15%～20%，其特征在于，这类肺癌根源于大的中心气道和组织学组成为几近没有细胞质的小细胞的片层。SCLC比NSCLC更具有侵袭性，并且生长快、转移早。NSCLC占所有病例的80%～85%，并基于组织学而进一步分为3个主要亚型：腺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)和大细胞未分化癌。
[0011] 肺癌通常在其病程中显现较晚，因此诊断后的中位存活率只有6～12个月，总5年存活率仅有5%～10%。虽然手术提供了治愈的最好机会，但是只有少部分患者适合手术，大部分依赖于化学疗法和放射疗法。尽管尝试控制这些疗法的时机和剂量强度，但是在过去15年中存活率几乎没有提高(Spiro等，2002，Am.J.Respir.Crit.Care Med.166：1166～96)。
[0012] 这四种癌症以及其他癌症表现为由异源性细胞群组成的实体瘤。例如，乳癌是癌细胞和正常细胞(包括间质(基质)细胞、炎性细胞和内皮细胞)的混合体。癌症的数种模型为这种异源性的存在提供了不同的解释。一种模型(癌症的经典模型)认为表型明显不同的癌细胞群都具有增殖和形成新肿瘤的能力。在该经典模型中，肿瘤细胞异源性源自于环境因子以及癌细胞内正在发生的突变，从而形成多样的致癌细胞群。这一模型基于这样的观点，即，肿瘤细胞的所有群体都具有某种程度的致癌潜能(Pandis等，1998，Genes，Chromosomes & Cancer 12：122～129；Kuukasjrvi等，1997，Cancer Res.57：1597～1604；Bonsing等，1993，Cancer 71：382～391；Bonsing等，2000，Genes Chromosomes & Cancer
82：173～183；Beerman H等，1991，Cytometry 12：147～54；Aubele M和Werner M，1999，Analyt.Cell.Path.19：53；Shen L等，2000，Cancer Res.60：3884)。
82：173～183；Beerman H等，1991，Cytometry 12：147～54；Aubele M和Werner M，1999，Analyt.Cell.Path.19：53；Shen L等，2000，Cancer Res.60：3884)。
[0013] 所观测到的实体瘤细胞异源性的一种替代性模型源自于干细胞对肿瘤发展的影响。根据该模型，癌症起因于控制正常组织发育和维持的机制的失调(Beachy等，2004，Nature 432：324)。在正常动物的发育过程中，绝大部分或所有组织的细胞都来自于正常前体，即所谓的干细胞(Morrison等，1997，Cell 88：287～98；Morrison等，1997，Curr.Opin.Immunol.9：216～21；Morrison等，1995，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.11：35～71)。干细胞是这样的细胞：(1)具有广泛的增殖能力；(2)能够非对称性细胞分裂以生成一种或多种增殖潜力和/或发育潜力下降的子代；和(3)能够进行对称性细胞分裂而自我再生或自我维持。通过干细胞分化实现成体细胞再生的最佳研究例子是造血系统，其中发育未成熟的前体(造血干细胞和祖细胞)响应分子信号而形成各种血细胞和淋巴样细胞类型。其他细胞(包括内脏、乳管系统和皮肤的细胞)从各自组织的小群体干细胞得到持续的补充，最近研究认为，绝大多数其他成体组织(包括脑)同样存在干细胞。源自于“实体瘤干细胞”(或来自于实体瘤的“癌干细胞”)的肿瘤随后通过对称性和非对称性细胞分裂过程而经历无序的发育。在该干细胞模型中，实体瘤含有明显不同且有限的(甚至可能是稀有的)具有正常“干细胞”性质的细胞亚组，原因在于它们广泛增殖并有效地形成另外的实体瘤干细胞(自我再生)和形成实体瘤的缺乏致瘤潜能的大部分瘤细胞。实际上，长寿干细胞群中的突变可以引发癌干细胞的形成，癌干细胞成为肿瘤生长和维持的基础，并且癌干细胞的存在促成当前治疗方法的失败。
[0014] 癌症的干细胞性质首先在血癌(急性髓系白血病(AML))中得到揭示(Lapidot等，1994，Nature 17：645～8)。新近，已证明恶性人乳腺肿瘤也类似地具有小而明显不同的癌干细胞群，其被富集而能够在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤。已发现，与未分级肿瘤细胞相比，致瘤性细胞的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-细胞群被富集50倍(Al-Hajj等，2003，Proc.Nat’l Acad.Sci.100：3983～8)。有望分离致瘤性癌细胞的能力使得可以研究成为这些细胞中的致瘤性的基础的关键生理学途径，因此有望为癌症患者研发出更好的诊断测定和治疗。这正是本发明所针对的目的。
发明内容
[0015] 本发明提供了一种分离的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人类FZD8受体的胞外域，并抑制肿瘤细胞的生长。本发明还提供了一种分离的抗体，所述抗体特异性结合两种以上的人类FZD受体的胞外域，并抑制肿瘤细胞的生长。本发明进一步提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明所公开的抗体和药学可接受的载质(vehicle)。本发明另外还提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括施用抑制肿瘤细胞生长有效量的本发明所公开的抗体。
[0016] 本发明的另外的目的和优点，一部分将在随后说明中给出，一部分根据所述说明也得以明了或者通过本发明的实践而获悉。本发明的目的和优点将借助所附权利要求书中指出的要素和要素组合来实现和达到。应当理解的是，上文的概述和下文的详细说明只是用于例示和解释，而不是用于限制所要求保护的发明。合并在本说明书中或者构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的多个实施方式，其与所述说明一起用以解释本发明的原理。在本说明书和所附权利要求书中，单数形式的“一个”、“一种”或“所述”，除非上下文另有明确说明，否则包括复数形式所指对象。
附图说明
[0017] 图1：抗FZD10、抗FZD7、抗FZD5、抗FZD6、抗FZD4和抗FZD8抗体与它们相应的膜连受体的特异性结合的分析。没有与GFP共转染(A)或与GFP共转染(B、C、D、E和F)的表达全长FZD10、FZD7、FZD5、FZD6、FZD4和FZD8的HEK293细胞与抗FZD抗体或对照IgG温育并通过FACS分选。(A)显示了对于各抗体来说，抗FZD10的抗体与IgG同种型阴性对照的FACs比较分析。与抗FLAG抗体匹配的带FLAG标签的构建体显示为阳性对照(底图)。(B)与对照IgG进行比较，表达FZD7和GFP的细胞中的抗FZD7的抗体的FACs分析。与抗FLAG抗体匹配的带FLAG标签的构建体显示为阳性对照(底图，最右边)。(C)与对照IgG进行比较，表达FZD5和GFP的细胞中的抗FZD5的抗体的FACs分析。来自经FZD5抗原免疫动物的血清显示在右边底图。(D)与对照IgG进行比较，表达FZD6和GFP的细胞中的抗FZD6的抗体的FACs分析。与抗FLAG抗体匹配的带FLAG标签的构建体显示为阳性对照(底图，右边)。(E)与对照IgG进行比较，表达FZD4和GFP的细胞中的抗FZD4的抗体的FACs分析。与抗FLAG抗体匹配的带FLAG标签的构建体显示为阳性对照(底图，右边)。(F)表达FZD8和GFP的细胞中的抗FZD8抗体的FACs分析。
[0018] 图2：FZD Fc可溶性受体抑制了Wnt的信号转导。在不同Wnt配体(包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b)的存在下，稳定转染有8xTCF-荧光素酶报告基因的HEK 293细胞与浓度不断增加的FZD Fc可溶性受体温育。根据荧光素酶活性丧失所示，FZD4Fc、FZD5Fc和FZD8Fc融合蛋白抑制了由所有5个Wnt配体介导的Wnt信号转导。
[0019] 图3：干扰Wnt3a配体结合的抗FZD5抗体的鉴定。根据荧光素酶活性，测量在Wnt3a和32个不同的抗FZD5抗体存在(单独存在(左侧条)或在可溶性FZD5Fc的存在下(右侧条))下，转染有Wnt 8xTCF-荧光素酶报告基因载体的HEK 293细胞中的Wnt信号转导。干扰FZD5Fc和Wnt3a之间的结合的抗体导致Wnt信号转导的显著激活(右侧条)。
[0020] 图4：抗FZD6和抗FZD5的抗体减缓了肿瘤生长。注射有UM-C4结肠肿瘤细胞并经3
抗FZD6或抗FZD5的抗体处理的NOD/SCID小鼠中8周内的肿瘤生长(mm)作图在x轴上。
用抗FZD6抗体23M2(空白条)和抗FZD5抗体44M13(斜纹条)处理相对于PBS注射对照(黑色条)，显著减缓了肿瘤的生长。
抗FZD6或抗FZD5的抗体处理的NOD/SCID小鼠中8周内的肿瘤生长(mm)作图在x轴上。
用抗FZD6抗体23M2(空白条)和抗FZD5抗体44M13(斜纹条)处理相对于PBS注射对照(黑色条)，显著减缓了肿瘤的生长。
具体实施方式
[0021] 术语“抗体”用以指这样的免疫球蛋白分子，即能够通过该免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合等靶的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，本发明的抗体包括拮抗剂抗体，该拮抗剂抗体与癌干细胞标记物蛋白特异性结合并干扰例如配体结合、受体二聚化、癌干细胞标记物蛋白的表达和/或癌干细胞标记物蛋白的下游信号转导。在某些实施方式中，所公开的抗体包括激动剂抗体，该激动剂抗体与癌干细胞标记物蛋白特异性结合并促进例如配体结合、受体二聚化和/或通过癌干细胞标记物蛋白进行的信号转导。在某些实施方式中，所公开的抗体不干扰或促进癌干细胞标记物蛋白的生物活性，但是通过例如抗体内化和/或由免疫系统识别来抑制肿瘤生长。本文所使用的术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(如由至少两个完整抗体生成的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和其他任何包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示出所需的生物活性即可。抗体可以属于免疫球蛋白的5种主要类别(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中的任意一种类别或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，根据它们的重链恒定区的性质分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的公知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的或者与诸如毒素、放射性同位素等其他分子偶联。
[0022] 在此所用的“抗体片段”是指完整抗体的一部分，还指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0023] “Fv抗体”是指含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段，其可以是其中一条重链和一条轻链可变区形成非共价二聚体的双链，也可以是其中一条重链和一条轻链可变区通过柔性肽接头共价连接从而使所述两条链以类似二聚体结构联合的单链(scFv)。在这种构型中，各可变区的互补决定区(CDR)相互作用来限定该Fv二聚体的抗原结合特异性。作为选择，单个可变区(或者Fv的一半)可以用来识别和结合抗原，不过亲和性通常较低。
[0024] 本文所用的“单克隆抗体”是指具有高度特异性识别和单抗原决定簇或表位结合的同源抗体群。这与多克隆抗体相反，多克隆抗体通常包括针对抗不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv)、单链Fv(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和其他任何包含抗原识别位点的修饰免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”还指通过任意种方式制得的抗体，所述方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
[0025] 本文所用的术语“人源化抗体”是指作为含有最少的非人序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的各种形式的非人(例如鼠类)抗体。通常，人源化抗体是这样的人类免疫球蛋白，其中来自互补性决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的具有所需特异性、亲和性和能力的来自CDR的残基所置换。在一些情况中，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被来自非人物种的抗体中具有所需特异性、亲和性和能力的相应残基所置换。人源化抗体还可以通过Fv骨架区中和/或所置换的非人类残基内的额外残基取代进行进一步的修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。人源化抗体通常包含至少一个(通常为两个或三个)可变区的几乎全部，所述可变区包含所有或几乎所有与非人类免疫球蛋白对应的CDR区，而所有或几乎所有的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区或域(Fc)的至少一部分，通常包含的是人类免疫球蛋白的至少一部分。用以生成人源化抗体的方法的例子在美国专利5,225,539中有描述。
[0026] 本文所用的术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体或采用本领域已知的任何技术制得的具有与由人类产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的定义包括完整或全长抗体、该抗体的片段和/或包含至少一条人类重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠类轻链多肽和人类重链多肽的抗体。
[0027] “杂交抗体”是这样的免疫球蛋白分子，其中将来自具有不同抗原决定簇区域的抗体的重链轻链对组装在一起，使得两种不同的表位或两种不同的抗原能够为所形成的四聚体所识别和结合。
[0028] 术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来自两种以上物种。通常，轻链和重链这两者的可变区对应于来自于哺乳动物的一个物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和性和能力的抗体的可变区，但是恒定区与来自于另一种物种(通常为人类)的抗体中的序列同源，以避免在那个物种中引发免疫应答。
[0029] 术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可相互交换使用，是指抗原的能够被特定抗体识别和特异性结合的部分。当抗原是多肽时，表位既可以由相邻氨基酸形成，也可以由经蛋白的三级折叠而并置的非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位在蛋白变性时通常仍得以保持，而由三级折叠形成的表位在蛋白变性时通常会丧失。表位通常包括至少3个(更多情况下常常为至少5个或8个～10个)处于独特空间构型中的氨基酸。
[0030] 抗体“选择性结合”或“特异性结合”是指抗体更频繁地、更迅速地、更持久地、亲和性更强地或者以上的某些组合而与表位反应或联合(相比于与包括不相关的蛋白在内的替代性物质的反应或联合相比)。“选择性结合”或者“特异性结合”是指例如抗体以至少约0.1mM，但是更常见的是至少约1μM的KD与蛋白结合。“选择性结合”或者“特异性结合”有时是指抗体有时以至少约0.1μM的KD或者更佳的KD与蛋白结合，在其它时候是指以至少约0.01μM的KD或者更佳的KD与蛋白结合。由于不同物种中的同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括识别不止一种物种中的癌干细胞标记物蛋白的抗体的特异性结合。
[0031] 本文所用的术语“非特异性结合”和“背景结合”当在涉及抗体和蛋白或肽的相互作用中使用时是指不依赖于特定结构的存在的相互作用(即，抗体普遍与蛋白结合，而不是与特定的结构如表位结合)。
[0032] 术语“分离的”或“纯化的”是指材料基本上或实质上不含有天然状态中与该材料通常相伴的成分。纯度和均质性通常采用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来确定。本发明所公开的在制剂中所存在的主要物种种类的蛋白(例如抗体)或核酸经过了充分的纯化。特别是，分离的核酸与开放阅读框分开，该开放阅读框天然位于该基因的侧翼并编码不同于该基因所编码的蛋白的蛋白。分离的抗体与其他非免疫球蛋白分开，并与具有不同的抗原结合特异性的免疫球蛋白分开。所述术语还指核酸或蛋白在一些实施方式中具有至少80%的纯度，在一些实施方式中具有至少85%的纯度，在一些实施方式中具有至少90%的纯度，在一些实施方式中具有至少95%的纯度，而在一些实施方式中具有至少99%的纯度。
[0033] 本文所用的术语“癌症”和“癌”是指或描述其中细胞群具有细胞生长失调特征的哺乳动物的生理状态。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部的腺癌、肺部的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌和各种类型的头颈部癌症。
[0034] 本文所用的“增殖病症”和“增殖疾病”是指与诸如癌症等异常细胞增殖有关的病症。
[0035] 本文所用的“肿瘤”和“瘤”是指由细胞过度生长或增殖引起的任何组织块，其为良性(非癌性)或恶性(癌性，包括癌前病变)。
[0036] 本文所用的“转移”是指癌症播散或者从原初部位转移到身体的其他区域且在该新的位置发展有类似癌性病变的过程。“转移性”或“转移”细胞是失去与相邻细胞的粘附接触并通过血流或淋巴从最初患病部位转移而侵入相邻身体结构的细胞。
[0037] 术语“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”在本文中可以相互交换使用，并指来自实体瘤的这样细胞群：(1)具有广泛的增殖能力；(2)能够进行非对称性细胞分裂，生成一种或多种增殖潜力或发育潜力下降的分化子代；和(3)能够进行对称性细胞分裂而自我再生或自我维持。“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”的这些性质使得这些癌干细胞具有在连续移植到免疫受损的小鼠后形成可触诊的肿瘤(与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比)的能力。癌干细胞经历无序方式的自我再生与分化，从而形成带有因发生突变而能够随时间而变化的异常细胞类型的肿瘤。根据美国专利No.6,004,528所提出的，实体瘤干细胞不同于“癌干系”。在该专利中，“癌干系”被定义为缓慢生长的祖细胞类型，其自身很少发生突变，而且由于在细胞环境内出现致瘤性变化的原因而进行对称性细胞分裂而不是非对称性细胞分裂。所述“癌干系”假说因而提出，作为异常环境的结果，大量出现高度突变的快速增殖的肿瘤细胞，从而导致相对正常的干细胞积累然后发生突变，这导致这些细胞变成肿瘤细胞。美国专利No.6,004,528提出，这种模型可用以促进癌症的诊断。实体瘤干细胞模型根本不同于“癌干系”模型，结果展示出“癌干系”模型所不能提供的应用。第一，实体瘤干细胞不是“突变缺乏的”。美国专利No.6,004,528所述的“突变缺乏的癌干系”可以认为是癌前病变，而实体瘤干细胞是本身含有从癌前阶段到整个后期阶段癌症的造成致瘤性的突变的癌细胞。即，实体瘤干细胞(“癌干细胞”)应当包含在与美国专利No.6,004,528所述的“癌干系”明显不同的高度突变的细胞中。第二，导致癌症的基因突变本质上明显属于实体瘤干细胞并且受到环境的影响。实体瘤干细胞模型预测，分离的实体瘤干细胞在移植时能够形成另外的肿瘤(由此可以解释转移)，而“癌干系”模型预测，经移植的“癌干系”细胞不能形成新的肿瘤，这是正是因为它们的异常环境是致瘤性的。实际上，解离的表型分离的人类实体瘤干细胞移植到小鼠(进入到与正常肿瘤环境非常不同的环境)中仍能形成新的肿瘤的能力使本发明明显区别于“癌干系”模型。第三，实体瘤干细胞很可能同时进行对称性细胞分裂和非对称性细胞分裂，使得对称细胞分裂并不是必有的性质。第四，实体瘤干细胞能够快速或缓慢分裂，这取决于很多变数，因此缓慢增殖速度并不是确有的特性。
[0038] 术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”以及文法上的等同表述是指衍生自肿瘤或癌前病变(包括非致瘤性细胞)的细胞总群，其包含大多数肿瘤细胞群和致瘤性干细胞(癌干细胞)。
[0039] 本文所用的“致瘤性”是指实体瘤干细胞的功能特征，包括自我再生性(形成另外的致瘤性癌干细胞)和生成所有其他肿瘤细胞(发生分化并因此形成非致瘤性肿瘤细胞)从而使实体瘤干细胞形成肿瘤的增殖性。自我再生性和生成所有其他肿瘤细胞的增殖性的这些性质使本发明的癌干细胞具有在连续移植到免疫受损的小鼠后形成可触诊的肿瘤(与连续移植后不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比)。肿瘤细胞，即非致瘤性肿瘤细胞，在从实体瘤获得肿瘤细胞后可在移植到免疫受损的小鼠后形成肿瘤有限次数(例如一次或两次)。
[0040] 本文所用的术语“干细胞癌标记物”、“癌干细胞标记物”、“肿瘤干细胞标记物”或“实体瘤干细胞标记物”是指一条或多条基因、或者所述一条或多条基因所表达的蛋白、多肽或肽，所述一条或多条基因的表达水平本身或与其他基因的组合与致瘤性癌细胞的存在相关联(与非致瘤性细胞相比)。这种相关与所述基因表达的增加或减少有关(即所述基因的mRNA或所编码的肽的增加的或减少的水平)。
[0041] 本文所用的术语“未分级的肿瘤细胞”、“分选前细胞”、“肿瘤细胞块”及其文法上等同表述可以相互交换使用，是指分离自患者样品(例如肿瘤活检样品或侧腹流出物)还未根据细胞表面标记物表达而分开或分级的肿瘤细胞群。
[0042] 本文所用的术语“非ESA+CD44+肿瘤细胞”、“非ESA+44+”、“分选的非致瘤性肿瘤细胞”、“非致瘤性肿瘤细胞”、“非干细胞”、“肿瘤细胞”及其文法上等同表述可以相互交换使用，是指基于细胞表面标记物表达而从中已分开或移取本发明癌干细胞的肿瘤群体。
[0043] 本文所用的术语“活检样品”或“活检组织”是指取自受试对象的组织样品或流体样品以确定该样品是否含有癌组织。在一些实施方式中，获得活检组织或流体是因为怀疑受试对象患有癌症，于是检查所述活检组织或流体是否存在癌症。
[0044] 本文所用的术语“受试对象”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物和啮齿动物等，所述受试对象是特定处理的接受者。术语“受试对象”和“患者”在本文中提及人类受试对象时通常可以相互交换使用。
[0045] “药学可接受的”是指已由或可由联邦管理机构或州政府批准或者列于美国药典或其他受普遍认可的药典而用于动物(包括人类)。
[0046] “药学可接受的盐”是指药学可接受并且具有母体化合物的所需药理学活性的化合物的盐。
[0047] “药学可接受的赋形剂、载体或佐药”是指这样的赋形剂、载体或佐药，即可以与本发明所公开的至少一种抗体一起施用于受试对象、不破坏所述抗体的药理学活性并且按足以输送治疗量的所述化合物的剂量施用时是无毒的。
[0048] “药学可接受的载质”是指与本发明所公开的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐药、赋形剂或载体。
[0049] “前药”是指需要在体内转化生成治疗有效化合物的该治疗有效化合物的衍生物。前药可以在被转化为治疗有效的母体化合物之后才具有药学活性。
[0050] 术语“治疗有效量”是指抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其他药物有效“治疗”受试对象或哺乳动物中的疾病或病症的量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减少肿瘤尺寸；抑制或阻止癌细胞浸润到周围器官，包括例如癌散播到软组织和骨中；抑制并阻止肿瘤转移；抑制并阻止肿瘤生长；一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状，减少发病率和死亡率；改善生命质量；或这些效果的组合。达到药物防止所存在的癌细胞的生长和/或杀死所存在的癌细胞的程度，其可以称为抑制细胞和/或细胞毒性。
[0051] 本文所用的“提供诊断”或“诊断信息”是指可用于确定患者是否具有疾病或病状和/或将疾病或病状分级为表型类别或在疾病或病状的预后或可能的治疗(可以普通治疗也可以是特定治疗)反应方面具有意义的任何类别的任何信息。类似地，诊断是指提供任何类型的诊断信息，包括但不限于受试对象是否可能具有病状(例如肿瘤)、与肿瘤分级性质有关的信息如高风险肿瘤或低风险肿瘤、与预后有关的信息和/或与可用于选择适当治疗的信息。治疗选择可以包括特定化学治疗剂或其他治疗形式如手术或放射的选择或者与是否停止或提供治疗有关的选择。
[0052] 本文所用的术语“提供预后”、“预后信息”或“预测信息”是指提供与癌症(例如，通过本发明的诊断方法确定的)的存在对受试对象日后的健康(例如，预期发病或死亡，患上癌症的可能性以及转移的风险)的影响有关的信息。
[0053] 术语如“进行治疗”或“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解”同时指1)治愈、减慢、减轻所诊断病理病状或病症的症状和/或防止所诊断病理病状或病症的前进的治疗措施，和2)防止和/或减缓目标病理病状或病症的发展的预防措施或防止措施。因此，需要治疗的那些患者包括已经具有病症的那些患者；倾向具有病症的那些患者；和病症需要防止的那些患者；如果受试对象显示出一种或多种以下效果则该患者根据本发明的方法成功地得到“治疗”：癌细胞数量的减少或完全消失；肿瘤尺寸的减小；抑制或不再出现癌细胞在周围器官的浸润，包括例如癌在软组织和骨中的播散；抑制或不再发生肿瘤的转移；抑制或不再出现肿瘤的生长；减轻一种或多种与特定癌症有关的症状；减少发病和死亡；改善生命质量；或某些组合效果。
[0054] 本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指多个核苷酸单元(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或有关结构变体)通过磷酸二酯键连接构成的聚合物，包括但不限于DNA或RNA。该术语涵盖包括DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列。术语“基因”是指包含生成多肽、前体、或RNA(例如rRNA、tRNA)所需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以由全长编码序列编码，或者由该编码序列的任何部分编码，只要保留有该全长编码序列或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)即可。该术语还涵盖结构基因的编码区和临近该编码区并距离5′端和3′端任意一端约1kb以上定位使得该基因相当于全长mRNA长度的序列。定位于编码区的5′端并出现在mRNA上的序列是指5′端非翻译区序列。定位于编码区的3′端或下游并出现在mRNA上的序列是指3′端非翻译区序列。术语“基因”涵盖cDNA和基因组形式的基因。基因组形式的基因或基因克隆包含被非编码序列(称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”)间断的编码区。内含子是转录到核RNA(hnRNA)中的基因片段；内含子可以含有诸如增强子等调节元件。内含子被从核转录本或初级转录本除掉或“剪切掉”；因此内含子并没有出现在信使RNA(mRNA)转录本中。mRNA在翻译过程中起到确定新形成多肽中的氨基酸序列或顺序的作用。除了含有内含子之外，基因组形式的基因还可以包含位于出现在RNA转录本上的序列的5′端和
3′端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或“侧翼”区(这些侧翼序列位于出现在RNA转录本上的非翻译序列的5′端或3′端)。5′端侧翼区可以含有控制或影响基因转录的诸如启动子和增强子等调节序列。3′端侧翼区可以包含指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
3′端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或“侧翼”区(这些侧翼序列位于出现在RNA转录本上的非翻译序列的5′端或3′端)。5′端侧翼区可以含有控制或影响基因转录的诸如启动子和增强子等调节序列。3′端侧翼区可以包含指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
[0055] 在涉及细胞、核酸、蛋白或载体时所使用的术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白进行了修饰，或者所述细胞来源于经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达出未见于天然(非重组)形式的细胞的基因或表达出过表达或异常表达(例如表达为非天然存在的片段或剪切变体)的基因。本文所用的“重组核酸”是指这样的核酸，其最初通常通过操纵核酸(例如使用聚合酶和内切酶)在体外形成，并且为通常未见于自然界的形式。采用这种方式可以实现不同序列的可操作连接。因此，线性形式的分离的核酸或者通过连接通常未连在一起的DNA分子而在体外形成的表达载体都认为是用于本发明用途的重组体。应当理解的是，重组核酸一旦制得并导入宿主细胞或生物体，其将非重组地(即利用宿主细胞的体内细胞器而不是体外操纵)复制；然而，这样的核酸一旦重组制得，虽然随后进行非重组地复制，但是仍然认为是用于本发明用途的重组体。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术(即通过以上所述的重组核酸的表达)所制得的蛋白。
[0056] 本文所用的术语“异源基因”是指未处于其天然环境中的基因。例如，异源基因包括来自某一物种的但被导入到另一种物种的基因。异源基因还包括天然来源于某一生物体但在某些方面已经改变了的(例如，突变了的、加入了多拷贝的、连接到非天然调节序列上的，等等)基因。异源基因明显不同于内源性基因，原因在于异源基因序列通常连接到未发现与染色体中的基因序列天然有关或与自然界未发现的染色体的各部分有关的DNA序列(例如，大肠杆菌(coli)所表达的通常其并没有表达的基因)。
[0057] 本文所用的术语“载体”用于指将一条或多条DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。术语“载质”有时与“载体”相互交换使用。载体通常来自于质粒、噬菌体或者植物病毒或动物病毒。
[0058] “连接”是指在双链核酸片段之间形成二酯键的过程。除非另有说明，否则连接可以使用已知缓冲液和10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)/0.5μg(约等摩尔量)待连接DNA片段的条件完成。核酸的连接可以用来在框架内将两个蛋白连接在一起以生成单个蛋白或融合蛋白。
[0059] 本文所用的术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(例如，通过RNA聚合酶的酶作用)将基因中所编码的遗传信息转化为RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，以及对于蛋白编码基因则通过mRNA“翻译”而将该基因转化为蛋白的过程。基因表达可以在该过程中的很多阶段得以调节。“上调”或“激活”是指提高基因表达产物(例如，RNA或蛋白)生成的调节，而“下调”或“抑制”是指降低生成的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)常常分别称为“活化剂”和“抑制剂”。
[0060] 术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白片段”在本文中可以相互交换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一种或多种氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0061] 术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸酸以及具有与天然存在的氨基酸类似的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码子编码的氨基酸以及那些经后期修饰的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如α碳连接到氢、羧基、氨基和R基团的氨基酸，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物可以具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架但仍保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的普通化学结构但是具有与天然存在的氨基酸类似的功能的化合物。
[0062] “保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。“氨基酸变体”是指氨基酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况中指基本相同或相关的(例如天然临近的)序列。由于遗传密码子的简并性，大多数蛋白都由大量功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU编码的氨基酸均是丙氨酸。因此，在由密码子规定的丙氨酸的每一个位置，该密码子可以改变为另一个相应的所述密码子而没有改变所编码的多肽。这样的核酸变异为“沉默变异”，是一种保守修饰变异。此处编码多肽的每一核酸序列也描述了核酸的沉默变异。本领域技术人员应当知道，在某些情况下，也可以对核酸中的各密码子(除了一般是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和一般是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)加以修饰以获得功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变异隐含在关于表达产物的所述序列中，但不隐含在关于实际探针序列的所述序列中。对于氨基酸序列，本领域技术人员知道，核酸的取代、缺失或增加、在经编码的序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或少量百分比的氨基酸的肽、多肽或蛋白序列是“保守修饰变体”，包括改变的结果导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代的情况。提供有功能相似的氨基酸的保守取代的表格在本领域内是已知的。除包括这样的保守修饰变体之外，并没有排除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。通常，保守取代包括：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰氨(N)、谷氨酰氨(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton，Proteins(1984))。
[0063] 本文所用的术语“带表位标签的”是指包含癌干细胞标记物蛋白或其域序列或部分的、与“表位标签”融合的嵌合多肽。表位标签多肽包含足够的氨基酸残基以提供由抗体识别的表位，但仍然足够的短使得其不影响癌干细胞标记物蛋白的活性。适宜的表位标签通常具有至少6个氨基酸残基，一般在约8～约50个氨基酸残基之间，有时在约10～约20个残基之间。常用的表位标签包括Fc、HA、His和FLAG标签。
[0064] 本发明提供了一种分离的抗体，所述抗体与人类FZD8受体的胞外域特异性结合，并抑制肿瘤细胞的生长。在某些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人类抗体。
[0065] 本发明还提供了一种分离的抗体，所述抗体与两种以上的人类FZD受体的胞外域特异性结合，并抑制肿瘤细胞的生长。在某些实施方式中，所述抗体与人类FZD2和FZD6的胞外域特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类FZD7和FZD10的胞外域特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类FZD4和FZD5的胞外域特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类FZD4和FZD8的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，所述抗体与人类FZD5和FZD8的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人类抗体。
[0066] 本发明还提供了一种分离的抗体，所述抗体与三种以上的人类FZD受体的胞外域特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类FZD4、FZD5和FZD8的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人类抗体。
[0067] 本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明所公开的抗体和药学可接受的载质。
[0068] 本发明还提供了一种产生本发明所公开的抗体的杂交瘤。
[0069] 本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括施用抑制肿瘤细胞生长有效量的本发明所公开的抗体或药物组合物。在某些实施方式中，所述抗体与细胞毒性部分进行了偶联。在某些实施方式中，所述方法进一步包括施用至少一种适于进行联合疗法的额外治疗剂。在某些实施方式中，所述肿瘤细胞选自乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和头颈部肿瘤。
[0070] 实体瘤类似于其来源组织，由异源细胞群组成。大部分这些细胞缺乏致瘤性，这表明实体瘤的发展和维持也依赖于小群体的干细胞(即，致瘤性癌细胞)，这些干细胞具有增殖并有效地同时形成另外的肿瘤干细胞(自我再生)和大部分的更分化的、缺乏致瘤潜能的肿瘤细胞(即，非致瘤性癌细胞)。癌干细胞概念是在发现HSC之后不久首次引入的，并在急性髓性白血病(AML)中得到试验确证(Park等，1971，JNatl.Cancer Inst.46：411～22；Lapidot等，1994，Nature 367：645～8；Bonnet和Dick，1997，Nat.Med.3：730～7；
Hope等，2004，Nat.Immunol.5：738～43)。来自实体瘤的干细胞新近基于它们的细胞表面受体独特的表达模式和对它们在培养物和异种移植物动物模型中自我再生和增殖性能的评价而得到分离。已发现，ESA+、CD44+、CD24-/低谱系群体为具有形成肿瘤的能力而富集超过非分级肿瘤细胞的50倍(Al-Hajj等，2003，Proc.Nat’l.Acad.Sci.100：3983～8)。
从大量非致瘤性肿瘤细胞中分离出致瘤性癌干细胞的能力使得可以使用微阵列分析来鉴定癌干细胞标记物、相对于非致瘤性肿瘤细胞或正常乳腺上皮在癌干细胞中具有差异表达的基因。本发明利用对这些所鉴定的癌干细胞标记物的认识来诊断和治疗癌症。
Hope等，2004，Nat.Immunol.5：738～43)。来自实体瘤的干细胞新近基于它们的细胞表面受体独特的表达模式和对它们在培养物和异种移植物动物模型中自我再生和增殖性能的评价而得到分离。已发现，ESA+、CD44+、CD24-/低谱系群体为具有形成肿瘤的能力而富集超过非分级肿瘤细胞的50倍(Al-Hajj等，2003，Proc.Nat’l.Acad.Sci.100：3983～8)。
从大量非致瘤性肿瘤细胞中分离出致瘤性癌干细胞的能力使得可以使用微阵列分析来鉴定癌干细胞标记物、相对于非致瘤性肿瘤细胞或正常乳腺上皮在癌干细胞中具有差异表达的基因。本发明利用对这些所鉴定的癌干细胞标记物的认识来诊断和治疗癌症。
[0071] 本发明的癌干细胞标记物涉及人类FZD受体，包括例如作为癌干细胞标记物的人类FZD4、FZD5和FZD8，该受体涉及癌干细胞维持中的Wnt信号转导途径，并通过消除这些致瘤性细胞而作为癌症治疗靶。Wnt信号转导途径是胚胎模式形成、胚胎后的组织维持和干细胞生物学的多个关键调节因素之一。更具体地说，Wnt信号转导在细胞极性的产生和细胞命运特化(包括干细胞群的自我再生)中发挥重要的作用。Wnt途径的失控激活与大量人类癌症有关，其中该途径可以改变肿瘤细胞的发育命运而使它们维持在未分化和增殖状态。因此，致癌作用能够通过盗用控制正常发育和由干细胞进行的组织修复的稳态机制而进行(Reya和Clevers，2005，Nature 434：843；Beachy等，2004，Nature 432：324中的综述)。
[0072] Wnt信号转导途径首次阐述在果蝇(Drosophila)发育突变体Wingless(wg)并源自于鼠类原癌基因int-1(目前称为Wnt1)(Nusse和Varmus，1982，Cell 31：99～109；Van Ooyen和Nusse，1984，Cell 39：233～40；Cabrera等，1987，Cell 50：659～63；Rijsewijk等，1987，Cell 50：649～57)。Wnt基因编码分泌的脂改性的糖蛋白，该糖蛋白在哺乳动物中已经鉴定到19个。这些分泌出的配体激活由Frizzled(Fzd)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LPR5/6)构成的受体复合物。Fzd受体是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的七跨膜域蛋白，含有带10个保守半胱氨酸的大胞外N端配体结合域(称为富含半胱氨酸域(CRD)或Fri域)。人类FZD受体有10个：FZD1～10。不同Fzd CRD对特定的Wnt具有不同结合亲和性(Wu和Nusse，2002，J.Biol.Chem.277：41762～9)，并且Fzd受体被分为激活以下所述的规范β-连环蛋白途径的受体和激活非规范途径的受体(Miller等，1999，Oncogene 18：7860～72)。为了形成结合FZD配体的受体复合物，FZD受体与LRP5/6(单通道跨膜蛋白，带有由6个YWTD氨基酸重复物分开的4个胞外EGF样域)相互作用(Johnson等，2004，J.Bone Mineral Res.19：1749)。
[0073] 受体结合激活的规范Wnt信号转导途径由与Fzd受体直接相互作用的胞质蛋白Dishevelled(Dsh)所介导，并导致胞质稳定和β-连环蛋白积累。在没有Wnt信号时，β-连环蛋白定位于包含肿瘤抑制剂结肠腺瘤息肉病(APC)蛋白和生长素的胞质破坏复合物。这些蛋白起到让糖原合成酶激酶(GSK)-3β结合和磷酸化β-连环蛋白的关键支架作用，使得其可以通过泛素/蛋白酶途径降解。Dsh的激活导致GSK3β的磷酸化和所述破坏复合物的解离。累积的胞质β-连环蛋白然后转运至核内，并在那里与Tcf/Lef家族的DNA结合蛋白相互作用而激活转录。
[0074] 除了规范信号转导途径之外，Wnt配体还激活β-连环蛋白非依赖途径(Veeman等，2003，Dev.Cell 5：367～77)。非规范Wnt信号转导参与到很多过程，但确信大多数是通过类似于果蝇平面细胞极性(PCP)途径的机制而参与原肠胚形成活动。非规范Wnt信号转导的其他可能机制包括钙通量、JNK以及小G蛋白和异三聚G蛋白。经常观察到规范途径和非规范途径之间的拮抗作用，有一些证据表明，非规范信号转导可以抑制癌症形成(Olson和Gibo，1998，Exp.Cell Res.241：134；Topol等，2003，J.Cell Biol.162：899～908)。因此在某些情况下，Fzd受体起到规范Wnt信号转导途径的负调节剂作用。例如，FZD6在与FZD1共表达时通过TAKl-NLK途径抑制Wnt-3a诱导的规范信号转导(Golan等，2004，JBC279：14879～88)。类似地，Fzd2在Wnt-5a存在的情况下通过TAKl-NLK MAPK级联来拮抗规范Wnt信号转导(Ishitani等，2003，Mol.Cell.Biol.23：131～9)。
[0075] 造血干细胞(HSC)是体内了解最好的干细胞，并且Wnt信号转导同时参与了它们的正常维持和白血病转化(Reya和Clevers，2005，Nature 434：843)。HSC是位于成体骨髓中的小孔龛(stomal niche)内的稀有细胞群。这些细胞的特征在于独特的基因表达模式以及持续产生更加分化的祖细胞以再建整个造血系统的能力。HSC及其基质微环境细胞均表达Wnt配体，并且Wnt受体激活存在于体内HSC中。而且，β-连环蛋白和纯化的Wnt3A促进了鼠类HSC体外的自我再生，增强了它们体内再建造血系统的能力，而Wnt5A促进了人类造血祖细胞的体外扩展和NOD-SCID异种移植物模型中的再群集(Reya等，2003，Nature423：409～14；Willert等，2003，Nature 423：448～52；Van Den Berg等，1998，Blood 92：
3189～202；Murdoch等，2003，Proc.Nat′l Acad.Sci.100：3422～7)。
3189～202；Murdoch等，2003，Proc.Nat′l Acad.Sci.100：3422～7)。
[0076] 新近发现，Wnt信号转导在髓系谱系和淋巴样谱系的致瘤性生长中均发挥作用。例如，来自慢性髓性白血病的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)显示出它们生长和再生依赖激活的Wnt信号转导(Jamieson等，2004，N.Engl.J.Med.351：657～67)。虽然白血病似乎没有包含Wnt途径中的突变，但是自分泌和/或旁分泌Wnt信号转导可以维持癌性自我再生(Reya和Clevers 2005，Nature 434：843)。
[0077] 规范Wnt信号转导途径在小肠和结肠的干细胞群的维持中也起到核心作用，该途径的不当激活在结肠直肠癌中发挥突出的作用(Reya和Clevers，2005，Nature 434：843)。吸收性的肠上皮分布在绒毛和隐窝中。干细胞位于隐窝中并缓慢分裂而生成快速增殖的细胞，由此产生移动到隐窝外而占据肠绒毛的所有分化细胞群。Wnt信号转导级联在控制沿着隐窝-绒毛轴的细胞命运中发挥主导作用，并且对干细胞群的维持而言是必要的。通过同源重组造成Tcf7/2的基因缺失(Korinek等，1998，Nat.Genet.19：379)或Dickkopf-1(Dkk1)(一种有效的分泌的Wnt拮抗剂)的过表达(Pinto等，2003，Genes Dev.17：1709～13；Kuhnert等，2004，Proc.Nat′l Acad.Sci.101：266～71)中断Wnt信号转导，会导致肠干细胞群的耗竭。
[0078] 结肠直肠癌最常见的是通过激活Wnt信号转导级联中的突变来引发。所有结肠直肠癌中约有5%～10%是遗传的，其主要形式之一是家族性腺瘤性息肉病(FAP)，该家族性腺瘤性息肉病是常染色体显性疾病，其中有约80%的受影响个体在结肠腺瘤性息肉病(APC)基因中含有种系突变。在包括生长素和β-连环蛋白在内的Wnt途径其他组分中也己鉴定到突变。个体腺瘤是含有第二非激活的等位基因的上皮细胞的克隆过生长，大量的FAP腺瘤不可避免地通过癌基因和/或肿瘤抑制剂基因的添加突变而导致腺癌的发育。而且，Wnt信号转导途径的激活，包括APC和β-连环蛋白中的功能获得性突变，可以诱导小鼠模型中的增生性发育和肿瘤生长(Oshima等，1997，Cancer Res.57：1644～9；Harada等，1999，EMBO J.18：5931～42)。
[0079] Wnt信号转导在癌症中的作用由于Wnt1(最初为int1)被鉴定为附近插入鼠类病毒而转化的哺乳动物肿瘤中的癌基因而得到首次揭示(Nusse和Varmus，1982，Cell 31：99～109)。从此积累了Wnt信号转导在乳癌中的作用的其他证据。例如，哺乳动物腺体中的β-连环蛋白转基因过表达导致增生症和腺癌(Imbert等，2001，J.Cell Biol.153：
555～68；Michaelson和Leder，2001，Oncogene 20：5093～9)，而Wnt信号转导的缺失破坏了正常哺乳动物腺体的发育(Tepera等，2003，J.Cell Sc.116：1137～49；Hatsell等，
2003，J.Mammary Gland Biol.Neoplasia 8：145～58)。最近，已经证明哺乳动物干细胞由Wnt信号转导所激活(Liu等，2004，Proc.Nat′l Acad.Sci.101：4158)。在人类乳癌中，β-连环蛋白积累暗示有超过50％的癌症中出现受激活的Wnt信号转导，尽管还没有鉴定到具体的突变，但是已经观察到Frizzled受体表达的上调(Brennan和Brown，2004，J Mammary Gland Neoplasia 9：119～31；Malovanovic等，2004，Int.J.Oncol.25：1337～
42)。
555～68；Michaelson和Leder，2001，Oncogene 20：5093～9)，而Wnt信号转导的缺失破坏了正常哺乳动物腺体的发育(Tepera等，2003，J.Cell Sc.116：1137～49；Hatsell等，
2003，J.Mammary Gland Biol.Neoplasia 8：145～58)。最近，已经证明哺乳动物干细胞由Wnt信号转导所激活(Liu等，2004，Proc.Nat′l Acad.Sci.101：4158)。在人类乳癌中，β-连环蛋白积累暗示有超过50％的癌症中出现受激活的Wnt信号转导，尽管还没有鉴定到具体的突变，但是已经观察到Frizzled受体表达的上调(Brennan和Brown，2004，J Mammary Gland Neoplasia 9：119～31；Malovanovic等，2004，Int.J.Oncol.25：1337～
42)。
[0080] FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5是10个已经鉴定到的人类Wnt受体中的5个。在小鼠胚胎中，Fzd10在神经管、肢芽和苗勒管中与Wnt7a一起表达(Nunnally和Parr，2004，Dev.Genes Evol.214：144～8)，并且在肢芽发育过程中起到Wnt-7a受体的作用(Kawakami等，2000，Dev.Growth Differ.42：561～9)。FZD10在肺中与Wnt7b共表达，并且细胞转染研究显示，FZD10/LRP5共受体激活响应Wnt7b的规范Wnt信号转导途径(Wang等，2005，Mol.Cell Biol.25：5022～30)。FZD10mRNA在许多癌细胞系(包括子宫颈细胞系、胃细胞系和成胶质细胞瘤细胞系)和原发性癌(包括约40％的原发性胃癌、结肠癌和滑膜肉瘤)中受到上调(Saitoh等，2002，Int.J.Oncol.20：117～20；Terasaki等，2002，Int.J.Mol.Med.9：107～12；Nagayama等，2005，Oncogene 1～12)。FZD8在数种人类癌细胞系、原发性胃癌和直肠癌中受到上调(Saitoh等，2001，Int.J.Oncol.18：991～96；Kirikoshi等，2001，Int.J.Oncol.19：111～5；Janssens等，2004，Tumor Biol.25：161～71)。FZD7在整个胃肠管中表达，并且在人类原发性胃癌病例中有六分之一受到上调(Kirikoshi等，2001，Int.J.Oncol.19：111～5)。结肠癌细胞系的FZD7胞外域的表达诱导形态学变化并减缓异种外植体模型中的肿瘤生长(Vincan等，2005，Differentiation 73：142～53)。FZD5在卵黄囊和胎盘血管生成中发挥必要作用(Ishikawa等，2001，Dev.128：25～33)，并在与Wnt/β-连环蛋白信号转导有关的肾癌中受到上调(Janssens等，2004，Tumor Biology
25：161～71)。FZD4在肠隐窝上皮细胞中高度表达，并且是在正常组织与肿瘤组织中显示出差异表达的数种因子之一(Gregorieff等，2005，Gastroenterology 129：626～38)。因此FZD受体作为癌干细胞标记物的鉴定使得这些蛋白成为癌症治疗的理想靶。
25：161～71)。FZD4在肠隐窝上皮细胞中高度表达，并且是在正常组织与肿瘤组织中显示出差异表达的数种因子之一(Gregorieff等，2005，Gastroenterology 129：626～38)。因此FZD受体作为癌干细胞标记物的鉴定使得这些蛋白成为癌症治疗的理想靶。
[0081] 本发明提供了一种癌干细胞标记物，所述癌干细胞标记物的表达可用于分析，以诊断或监测与癌干细胞标记物表达相关的疾病。在一些实施方式中，癌干细胞标记物的表达例如由编码所述癌干细胞标记物的多核苷酸(例如mRNA)表达来确定。可以通过本领域已知的众多手段中任意一种来检测和定量所述多核苷酸。在一些实施方式中，采用从例如患者活检样品的组织切片的原位杂交来检测编码癌干细胞标记物的mRNA。在一些实施方式中，将RNA从组织中分离并通过例如Northern印迹、定量RT-PCR或微阵列等进行检测。例如可以从组织样品中提取总RNA，并可以利用RT-PCR，使用特异性杂交和扩增癌干细胞标记物的引物来检测癌干细胞标记物多核苷酸的表达。
[0082] 在某些实施方式中，可以通过检测相应的多肽来检测癌干细胞标记物的表达。可以通过本领域已知的众多手段中的任意一种来检测和定量所述多肽。在一些实施方式中，例如使用分析生物化学方法例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)或薄层层析(TLC)来检测癌干细胞标记物多肽。还可以根据标准的技术对所分离的多肽进行测序。在某些实施方式中，利用例如组织切片上的免疫荧光或免疫组织化学，以抗癌干细胞标记蛋白而产生的抗体来检测所述蛋白。作为选择，使用例如ELISA、FACS、Western印迹、免疫沉淀或蛋白微阵列，以抗癌干细胞标记物的抗体检测表达。例如，可从患者活检样品中分离出癌干细胞，利用FACS以荧光标记抗体检测癌干细胞标记物蛋白的表达。在另一种方法中，可以利用标记抗体在典型成像系统中体内检测表达癌干细胞标记的细胞。例如，可以使用顺磁性同位素标记的抗体进行磁共振成像(MRI)。
[0083] 在本发明的一些实施方式中，诊断测定包括使用例如免疫组织化学、原位杂交或RT-PCR确定癌干细胞标记物在肿瘤细胞中的表达与否。在另外的实施方式中，诊断测定包括使用例如定量RT-PCR确定癌干细胞标记物的表达水平。在一些实施方式中，诊断测定还包括例如与对照组织例如正常上皮组织比较来确定癌干细胞标记物的表达水平。
[0084] 然后，癌干细胞标记物表达的检测可用以提供预后和选择疗法。预后可以基于癌干细胞标记物指示的任意已知风险表达。而且，癌干细胞标记物的检测可以用以选择适当的疗法，包括例如用抗被检测的癌干细胞标记物蛋白的抗体所进行的治疗。在某些实施方式中，所述抗体特异性结合诸如人类FZD受体等癌干细胞标记物蛋白的胞外域。
[0085] 在本发明的范围内，适当的抗体是具有例如以下一种或多种效果的物质：干扰癌干细胞标记物的表达；通过例如在空间上抑制癌干细胞标记物与其配体、受体或共受体之间的相互作用来干扰癌干细胞信号转导途径的激活；通过例如作为配体或促进内源性配体的结合而激活癌干细胞信号转导途径；或结合癌干细胞标记物并抑制肿瘤细胞增殖。
[0086] 在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体起到胞外调节癌干细胞标记物蛋白功能的作用。在一些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体的胞外结合可以通过例如抑制癌干细胞标记物的固有激活(例如激酶活性)和/或通过在空间上抑制例如癌干细胞标记物与其配体、与其受体、与共受体或与胞外基质之间的相互作用来抑制癌干细胞标记物蛋白的信号转导。在一些实施方式中，例如抗癌干细胞标记物的抗体的胞外结合可以通过例如癌干细胞标记物蛋白的内化或减少癌干细胞标记物的细胞表面运输来下调癌干细胞标记物的细胞表面表达。在一些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体的胞外结合可以通过例如发挥作为诱饵配体的作用或增加配体结合来促进癌干细胞标记物蛋白的信号转导。
[0087] 在某些实施方式中，抗癌干细胞标记物的抗体结合到癌干细胞标记物蛋白上并具有以下一种或多种效果：抑制肿瘤细胞的增殖，触发肿瘤细胞的细胞死亡或防止肿瘤细胞的转移。在某些实施方式中，针对癌干细胞标记的抗体通过所偶联的毒素、化疗剂、放射性同位素或其他类似试剂来触发细胞死亡。例如，针对癌干细胞标记物的抗体与在表达该癌干细胞标记物的肿瘤细胞中通过蛋白内化而被激活的毒素偶联。在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导表达所述癌干细胞标记物蛋白的细胞的细胞死亡。ADCC通过能识别抗体的Fc部分的效应细胞而介入细胞的裂解。许多淋巴细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、粒细胞和嗜酸性细胞例如具有Fc受体并能够介导细胞裂解(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497)。
[0088] 在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体通过激活补体依赖性细胞毒性(CDC)而触发表达癌干细胞标记物蛋白的细胞的细胞死亡。CDC参与血清补体与抗体的Fc部分的结合和随后补体蛋白级联的激活，从而导致细胞膜破坏，并最终造成细胞的死亡。抗体的生物学活性已知在很大程度上由抗体分子的恒定区或Fc区决定(Uananue和Benacerraf，Textbook of Immunology，第2版，Williams和Wilkins，第218页(1984))。如同属于相同亚类但是来自于不同物种的抗体一样，属于不同类别和亚类的抗体在这方面是不同的。在人类抗体中，IgM是与补体结合最有效的抗体类别，其次是IgG1、IgG3和IgG2，但是IgG4似乎在激活补体级联中非常缺乏(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497；
Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59～76)。根据本发明，可以制备具有所需生物学活性的那类抗体。
Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59～76)。根据本发明，可以制备具有所需生物学活性的那类抗体。
[0089] 可以测定针对癌干细胞的任何特定抗体通过补体激活和/或ADCC介导靶细胞裂解的能力。使感兴趣的细胞在体外生长并标记；将抗体与血清补体或可被抗原抗体复合物激活的免疫细胞一起加到细胞培养物中。通过例如从裂解细胞释放标记而检测靶细胞的细胞裂解。实际上，可以使用患者自己的血清作为补体源和/或免疫细胞源来筛查抗体。然后可以将能够在体外测试中激活补体或介导ADCC的抗体用于该特定患者的治疗。
[0090] 在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体可触发细胞死亡，从而抑制血管生成。血管生成是这样的过程，即，通过血管生成，由先前存在的血管形成新的血管，并且血2
管生成是在例如胚胎发育、伤口愈合和产卵反应中正常生长所需的基本过程。大于1mm ～
2
2mm 的实体瘤生长也需要血管生成以补充营养和氧，如果没有血管生成，肿瘤细胞将会死亡。在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体靶向表达该癌干细胞标记物的血管细胞，包括例如内皮细胞、平滑肌细胞或胞外基质的血管组装所需的组分。在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体抑制血管细胞募集、组装、维持或存活所需的生长因子信号转导。
管生成是在例如胚胎发育、伤口愈合和产卵反应中正常生长所需的基本过程。大于1mm ～
2
2mm 的实体瘤生长也需要血管生成以补充营养和氧，如果没有血管生成，肿瘤细胞将会死亡。在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体靶向表达该癌干细胞标记物的血管细胞，包括例如内皮细胞、平滑肌细胞或胞外基质的血管组装所需的组分。在某些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体抑制血管细胞募集、组装、维持或存活所需的生长因子信号转导。
[0091] 针对癌干细胞标记物的抗体可以用于本文所述的诊断和治疗方法。在某些实施方式中，本发明抗体例如用以检测生物学样品如患者组织活检样品、胸腔积液或血液样品中的癌干细胞标记物蛋白的表达。可以将组织活检样品做成切片并使用例如免疫荧光或免疫组织化学对蛋白进行检测。此外，可以分离来自样品的个体细胞并通过FACS分析来检测经固定的细胞或活细胞。在某些实施方式中，可以在蛋白阵列上使用抗体来检测例如肿瘤细胞上、细胞裂解物中或其他蛋白样品中的癌干细胞标记物的表达。在某些实施方式中，本发明的抗体通过将抗体与基于体外细胞的测定或体内动物模型等中的肿瘤细胞接触而用以抑制肿瘤细胞的生长。在某些实施方式中，通过施用治疗有效量的针对癌干细胞标记物的抗体而使用所述抗体来治疗患者中的癌症。
[0092] 可以通过任何已知方法制备多克隆抗体。多克隆抗体可以通过多次皮下注射或腹膜内注射相关抗原(纯化的肽片段、全长重组蛋白、融合蛋白等)来免疫动物(例如兔、大鼠、小鼠、驴等)而产生，所述抗原可任选与稀释在无菌盐水中的匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白等偶联和与佐剂(例如完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂)联合以形成稳定乳液。然后从经如此免疫的动物的血液和腹水等中回收多克隆抗体。让所收集的血液凝结，倾析出血清并通过离心使其澄清并测定蛋白滴度。可以根据本领域标准方法，包括亲和层析、离子交换色谱、凝胶电泳、透析等从血清或腹水中纯化出多克隆抗体。
[0093] 单克隆抗体可以采用例如Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495)所描述的杂交瘤方法来制备。采用杂交瘤方法，按照如上所述对小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物进行免疫以引发淋巴细胞生成与免疫性抗原特异性结合的抗体。还可以在体外对淋巴细胞进行免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与适当骨髓瘤细胞系融合，从而形成随后可以从未融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出的杂交瘤细胞。然后根据免疫沉淀、免疫印迹和体外结合测定(例如放射性免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))确定的产生特异性抗所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986)在培养物中体外繁殖或作为动物腹水肿瘤体内繁殖。然后从如以上针对多克隆抗体所描述的培养基或腹水液中纯化出单克隆抗体。
[0094] 作为选择，还可以使用如美国专利4,816,567所描述的重组DNA法来制备单克隆抗体。使用能够特异性扩增编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，通过例如RT-PCR从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离出编码所述抗体的多核苷酸，并使用常规程序确定它们的序列。然后将所分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到适当的表达载体中，当将该表达载体转染到诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞等否则不生成免疫球蛋白的宿主细胞中，由该宿主细胞产生单克隆抗体。另外，可以从表达所述的所需物种的CDR的噬菌体展示文库中分离出所需物种的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty等，1990，Nature，348：552～554；Clackson等，1991，Nature，352：624～628；和Marks等，1991，J.Mol.Biol，222：581～597)。
[0095] 可以使用重组DNA技术，以许多不同的方式进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生替代性抗体。在一些实施方式中，可以将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定区取代为1)例如人类抗体的恒定区，以产生嵌合抗体或2)非免疫球蛋白多肽，以产生融合抗体。在一些实施方式中，截断或去除所述恒定区以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可以使用可变区的定向诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。
[0096] 在本发明的一些实施方式中，针对癌干细胞标记物的单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体是可变区中含有来自非人类(例如鼠类)抗体的最少量序列的抗体。这样的抗体在治疗上用于施用于人类受试对象时减少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)应答。在实践中，人源化抗体通常是带有最少量的或不带有非人类序列的人类抗体。人类抗体是由人类产生的抗体或者是具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列。
[0097] 可以使用本领域已知的各种技术来制备人源化抗体。可以使用具有所需特异性、亲和性和能力的非人类抗体(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的CDR取代人类抗体的CDR来对抗体进行人源化(Jones等，1986，Nature，321：522～525；Riechmann等，1988，Nature，332：323～327；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534～1536)。可以通过Fv骨架区中和/或所置换的非人类残基内的额外残基的取代来进一步修饰人源化抗体，以改进和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。
[0098] 可以使用本领域已知的各种技术来直接制备人源化抗体。可以产生经体外免疫的永生化人类B淋巴细胞或从能够生成用于抗靶抗原的抗体的免疫个体中分离得到的永生化人类B淋巴细胞(参见，例如Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等，1991，J.Immunol.，147(1)：86～95；和美国专利5,750,373)。而且，可以从其中表达人类抗体的噬菌体文库中选择人类抗体(Vaughan等，
1996，Nat.Biotech.，14：309～314；Sheets等，1998，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，95：6157～
6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，
222：581)。还可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制得人源化抗体，所述人类免疫球蛋白基因座能够在没有内源性免疫球蛋白生成的情况下在免疫后生成人类抗体的所有组成成员。该方法在美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；
5,633,425；和5,661,016中有描述。
1996，Nat.Biotech.，14：309～314；Sheets等，1998，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，95：6157～
6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，
222：581)。还可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制得人源化抗体，所述人类免疫球蛋白基因座能够在没有内源性免疫球蛋白生成的情况下在免疫后生成人类抗体的所有组成成员。该方法在美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；
5,633,425；和5,661,016中有描述。
[0099] 本发明还涵盖特异性识别癌干细胞标记物的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别和结合至少两种不同表位的抗体。所述不同表位可以处在同一分子(例如，同一癌干细胞标记物多肽)中或者处在不同的分子中，使得例如这两个抗体可以特异性识别并结合癌干细胞标记物以及例如1)诸如T细胞受体等白细胞上的效应分子(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)，或者2)将在下文详述的细胞毒剂。双特异性抗体可以是完整的抗体或抗体片段。
[0100] 示例性的双特异性抗体可以结合两种不同的表位，其中至少一个表位来自于本发明的多肽。作为选择，可以将免疫球蛋白分子的抗抗原臂与能够和诸如T细胞受体分子等白细胞上的触发分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或者IgG的Fc受体结合的臂组合，以着眼于表达特定抗原的细胞的细胞防御机制。还可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂导入表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和能够结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。制备双特异性抗体的技术在本领域内是常见的(Millstein等，1983，Nature 305：537～539；Brennan等，1985，Science 229：81；Suresh等，1986，Methods in Enzymol.121：120；Traunecker等，1991，EMBO J.10：3655～3659；Shalaby等，1992，J.Exp.Med.175：217～225；Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547～
1553；Gruber等，1994，J.Immunol.152：5368；和美国专利5,731,168)。还设想有多于两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。
1553；Gruber等，1994，J.Immunol.152：5368；和美国专利5,731,168)。还设想有多于两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。
[0101] 在某些实施方式中，提供了抗体片段以例如提高肿瘤穿透性。已知有多种用于生成抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化来获得(例如，Morimoto等，1993，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107～117；Brennan等，1985，Science，229：81)。在某些实施方式中，抗体片段通过重组产生。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达和分泌，从而可以生成大量的这些片段。还可以从以上所讨论的抗体噬菌体文库中分离出所述抗体片段。抗体片段还可以是例如美国专利5,641,870中所述的线性抗体，并且可以是单特异性抗体或双特异性抗体。本领域技术人员清楚生成抗体片段的其他技术。
[0102] 根据本发明，有各种技术适用于生成对本发明的多肽具有特异性的单链抗体(参见美国专利No.4,946,778)。另外，也有各种方法适用于构建Fab表达文库(Huse等，Science 246：1275～1281(1989))，以快速有效地鉴定对FZD受体或其衍生物、片段、类似物或同系物具有所需特异性的单克隆抗体Fab片段。可以通过本领域技术生成含有本发明多肽的独特型的抗体片段，所述抗体片段包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab′)2片段；(b)通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生的Fab片段；(c)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段；和(d)Fv片段。
[0103] 还可以根据需要，特别是在抗体片段的情况下，对抗体进行修饰以延长其血清半衰期。这可以通过例如以下方法来实现：通过抗体片段中适当区域的突变而将补救受体结合表位引入到抗体片段中，或者将所述表位引入到肽标签中，然后将肽标签融合到抗体片段的任一端或抗体片段的中间(例如通过DNA或肽合成)。
[0104] 异源偶联抗体也处在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体构成。已经提出例如利用这样的抗体将免疫细胞靶向到有害细胞上(美国专利No.4,676,980)。还想到的是，可以使用合成蛋白化学中已知的方法，包括那些涉及使用交联剂的方法体外制备所述抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的适当试剂的例子包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methy-4-mercaptobutyrimidate)。
[0105] 应当理解，为本发明目的，所修饰的抗体可以包含使所述抗体和人类FZD受体相关联的任何类型的可变区。在这方面，所述可变区可以包含或来自于可以被诱导而加强体液应答和产生抗所需的肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。这样，所修饰抗体的可变区可以例如来源于人类、鼠类、非人类灵长动物(例如食蟹猴、短尾猴等)或狼。在一些实施方式中，所修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区均是人类的可变区和恒定区。
在其他实施方式中，相容性抗体(一般来自于非人类来源)的可变区可以改造或特异性定制以改善结合性能或减少该分子的免疫原性。在这方面，可以通过包含引入的氨基酸序列而对本发明有用的可变区进行人源化或加以改变。
在其他实施方式中，相容性抗体(一般来自于非人类来源)的可变区可以改造或特异性定制以改善结合性能或减少该分子的免疫原性。在这方面，可以通过包含引入的氨基酸序列而对本发明有用的可变区进行人源化或加以改变。
[0106] 通过一个或多个CDR的至少一部分置换来同时改变重链和轻链中的可变域，并且如果需要，可以通过部分骨架区置换和序列变化来进行所述改变。尽管CDR可以来自于与骨架区来源抗体类别或者甚至是亚类相同的抗体，但是还想到的是，CDR可以来自于不同类别的抗体，优选来自于不同物种的抗体。可能不需要用来自供体可变区的全部CDR来置换所有的CDR以将一个可变区的抗原结合能力转移到另一个可变区。更合适的是，可以只需要转移对维持抗原结合位点活性所必须的那些残基。在美国专利No.5,585,089、5,693,761和5,693,762中给出了解释。本领域技术人员完全有能力通过实施常规的试验或通过试错法测试来获得免疫原性降低的功能性抗体。
[0107] 尽管改变可变区，但是本领域技术人员应当理解，本发明的经修饰的抗体将包含这样的抗体或其免疫反应性片段，其中，当与具有近似相同免疫原性的包含天然或未改变的恒定区的抗体相比时，所述抗体中的一个或多个恒定区域的至少一部分已被删除或其它方式改变从而提供所述的生物化学特性，如增强的肿瘤定位或缩短的血清半衰期。在某些实施方式中，经修饰的抗体的恒定区包含人类恒定区。对与本发明相容的恒定区所进行的修饰包括在一个或多个结构域中有一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文所公开的经修饰的抗体可以包含三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)的一个或多个恒定区和/或轻链恒定区(CL)所进行的改变或修饰。在本发明的一些实施方式中，想到了其中部分缺失或完全缺失一个或多个结构域的经修饰的恒定区。在一些实施方式中，经修饰的抗体包含其中已经去除了整个CH2域的结构域缺失构建体或变体(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，所省掉的恒定区域将被能够提供通常由缺失恒定区赋予的某些分子柔性的短氨基酸间隔子(例如10个残基)所置换。
[0108] 除了它们的构型之外，本领域已知的是，恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体的结合激活补体系统。补体激活对细胞病原体的调理和裂解非常重要。补体激活还刺激炎性反应，并且还能够参与自身免疫超敏反应。另外，抗体通过Fc区与细胞结合，其中抗体Fc区上的Fc受体位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)。有大量的对不同类别抗体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)具有特异性的Fc受体。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合会触发许多重要而多样的生物学应答，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞实施的抗体包被靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎性中介体的释放、免疫球蛋白生成的胎盘转移和控制。尽管各种Fc受体和受体位点已有一定程度的研究，但是对它们的定位、结构和功能还有很多未知之处。
[0109] 虽然不是要限制本发明的范围，但是据信包含按本文所述修改的恒定区的抗体能够提供改变了的效应子功能，这反过来又影响了所施用抗体的生物学概况。例如，恒定区域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以减少循环中经修饰抗体与Fc受体的结合，由此加强肿瘤的定位。在另外的情况中，与本发明吻合的是，修饰恒定区调节了补体结合并由此缩短血清半衰期和偶联的细胞毒素的非特异性连接。不过，可以使用恒定区的其他修饰来消除二硫键或寡聚糖部分，从而使得可提高抗原特异性或抗体柔性，因此可以加强定位。类似地，可以使用本领域技术人员熟知的生物化学或分子工程技术来容易地实现根据本发明对恒定区所进行的修饰。
[0110] 应当注意的是，经修饰的抗体可以被改造而将CH3域直接融合到相应的经修饰抗体的铰链区。在另外的构建体中，可能希望在铰链区和经修饰的CH2和/或CH3域之间提供肽间隔子。例如，可以表达相容性构建体，其中CH2已经缺失，并且余下的CH3域(修饰或未修饰的)通过5～20个氨基酸间隔子而连接到铰链区上。可以增加这样的间隔子例如以确保恒定域的调节元件保持自由且是可接近的或者使铰链区保持柔性。然而，应当注意的是，在某些情况中，能够证实氨基酸间隔子具有免疫原性并能够诱发抗所述构建体的不需要的免疫应答。因此，加到所述构建体的任何间隔子应当相对无免疫原性，或者如果可以保持所修饰的抗体的所需生物化学质量，甚至可以完全省掉间隔子。
[0111] 除了缺失整个恒定区域之外，应当理解的是，可以通过部分缺失或少量或者甚至是单个氨基酸的取代来提供本发明的抗体。例如，CH2域的所选区域中的单氨基酸突变可能足以显著降低Fc结合并由此加强肿瘤的定位。类似地，可能希望简单地缺失控制待调节的效应子功能(例如补体CLQ结合)的一个或多个恒定区域的一部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的所选特性(血清半衰期)同时保持受试对象的恒定区域有关的其他所需功能的完整性。而且，如上文顺便提到的，可以通过能够改善所得构建体概况的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰所公开的抗体的恒定区。在这方面，有可能可以破坏由保守的结合位点(例如Fc结合)提供的活性的同时，基本保持所修饰的抗体的构型和免疫原性特性。某些实施方式可以包含添加到恒定区的一个或多个氨基酸以增强所需特性如效应子的功能或者提供更多的细胞毒素或碳水化合物吸附。在这样的实施方式中，可能希望插入或复制来自所选恒定区域的特异性序列。
[0112] 本发明还包括基本与本文提出的嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体或它们的抗体片段相类似的变体和等效物。这些变体或等效物可以含有例如保守取代突变，即一个或多个氨基酸被类似的氨基酸取代。例如，保守取代是指一个氨基酸被同一大类内的另一个氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代，或者一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代。保守氨基酸取代在本领域内是公知的。
[0113] 本发明还涉及包含偶联到细胞毒剂的抗体的免疫偶联物。细胞毒剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、放射活性同位素(即，放射性偶联物)等。可用于产生所述免疫偶联物的化疗剂包括例如甲氨蝶呤、亚德里亚霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordica charantia inhibitor)、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂(sapaonaria officinalis inhibitor)、白树毒蛋白、丝裂蛋白(mitogellin)、局限菌素、酚霉素、依诺霉素、和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。各种放射性核素可212 131 131 90 186
以用于制备放射性偶联的抗体，包括 Bi、 I、In、Y和 Re。可以使用以下物质制备抗体与细胞毒剂的偶联物：各种双官能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-2-(吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨硫杂戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如己二亚胺二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-二氮鎓衍生物(如双-(对二氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如亚甲苯基2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。还可以使用抗体和一种或多种小分子毒素的偶联物，所述小分子毒素例如为刺孢霉素、美登醇(maytansinoid)、单端胞菌毒素(trichothene)和CC1065以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
以用于制备放射性偶联的抗体，包括 Bi、 I、In、Y和 Re。可以使用以下物质制备抗体与细胞毒剂的偶联物：各种双官能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-2-(吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨硫杂戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如己二亚胺二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-二氮鎓衍生物(如双-(对二氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如亚甲苯基2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。还可以使用抗体和一种或多种小分子毒素的偶联物，所述小分子毒素例如为刺孢霉素、美登醇(maytansinoid)、单端胞菌毒素(trichothene)和CC1065以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
[0114] 偶联物抗体由两个共价连接的抗体构成。已经提出例如利用这样的抗体将免疫细胞靶向到有害细胞(美国专利No.4,676,980)。想到的是，可以使用在合成蛋白化学中已知的方法(包括涉及交联剂的那些方法)体外制备所述抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的适当试剂的例子包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
[0115] 不管获得多么有用的量，本发明的抗体可以以众多偶联形式(即，免疫偶联物)或未偶联形式中的任意一种使用。作为选择，本发明的抗体可以以非偶联形式或“裸露”形式使用以控制受试对象的天然防御机制，包括补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来消除恶性细胞。在一些实施方式中，可以使用众多已知螯合剂中任意一种90 125 131 123 111 105 153 67 67
或者直接标记，将抗体偶联到放射线同位素如 Y、I、 I、I、 In、Rh、 Sm、Cu、Ga、
166 177 186 188
Ho、 Lu、Re和 Re。在另外的实施方式中，所公开的组合物可包含偶联到药物、前药或生物学应答修饰剂，如甲氨蝶呤、亚德里亚霉素和淋巴因子(如干扰素)。本发明的另一些实施方式包含与特定生物毒素如篦麻毒素或白喉毒素等偶联的抗体的应用。在另一些实施方式中，经修饰的抗体可以与其他免疫活性配体(例如抗体或其片段)复合，其中所得分子能够同时结合到瘤细胞和效应细胞如T细胞上。选择使用偶联或未偶联的修饰抗体将取决于癌症的类型和所处的阶段、辅助治疗(例如化学疗法或外部辐射)的使用和患者的状况。
应当理解的是，本领域技术人员根据本文的教导能够容易地作出这样的选择。
或者直接标记，将抗体偶联到放射线同位素如 Y、I、 I、I、 In、Rh、 Sm、Cu、Ga、
166 177 186 188
Ho、 Lu、Re和 Re。在另外的实施方式中，所公开的组合物可包含偶联到药物、前药或生物学应答修饰剂，如甲氨蝶呤、亚德里亚霉素和淋巴因子(如干扰素)。本发明的另一些实施方式包含与特定生物毒素如篦麻毒素或白喉毒素等偶联的抗体的应用。在另一些实施方式中，经修饰的抗体可以与其他免疫活性配体(例如抗体或其片段)复合，其中所得分子能够同时结合到瘤细胞和效应细胞如T细胞上。选择使用偶联或未偶联的修饰抗体将取决于癌症的类型和所处的阶段、辅助治疗(例如化学疗法或外部辐射)的使用和患者的状况。
应当理解的是，本领域技术人员根据本文的教导能够容易地作出这样的选择。
[0116] 可以通过本领域任意已知方法测定本发明的抗体的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于使用诸如BIAcore分析法、FACS分析法、免疫荧光法、免疫细胞化学法、Western印迹法、放射性免疫测定法、ELISA法、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应法、凝胶扩散沉淀素反应法、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等的竞争性和非竞争性测定系统。这样的测定法是本领域内常规和公知的(参见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley和Sons，Inc.，New York，在此通过参考的方式将其全部引入)。
[0117] 在一些实施方式中，使用ELISA来确定针对癌干细胞标记物的抗体的免疫特异性。ELISA测定法包括制备抗原、用抗原包被96孔滴定板的板孔，向板孔中加入偶联到可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的针对癌干细胞标记物的抗体，温育一段时间并检测抗原的存在。在一些实施方式中，针对癌干细胞标记物的抗体不与可检测化合物偶联，而是替代性地向板孔中加入与能够识别该针对癌干细胞标记物的抗体的第二偶联抗体。在一些实施方式中，不用抗原包被板孔，而是可用针对癌干细胞标记物的抗体包被板孔并在向经包被的板孔中加入抗原后加入与可检测化合物偶联的第二抗体。本领域技术人员应当知道可加以改变而加强被检测信号的参数以及本领域已知的ELISA变量(参见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley和Sons，Inc.，New York，于11.2.1)。
[0118] 可以通过竞争性结合测定法来确定抗体与癌干细胞标记物抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合测定法的一个例子是放射性免疫测定法，该3 125
方法包括在存在含量不断增加的未标记抗原的情况下，将经标记的抗原(例如 H或 I)或其片段或变体与感兴趣的抗体温育，然后检测结合到经标记的抗原的抗体。可以根据scatchard作图分析数据确定针对癌干细胞标记物的抗体的亲和性和结合解离速率。在某些实施方式中，使用BIAcore动力学分析来确定针对癌干细胞标记物的抗体的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗体与表面上固定有癌干细胞标记物抗原的芯片的结合和解离。
方法包括在存在含量不断增加的未标记抗原的情况下，将经标记的抗原(例如 H或 I)或其片段或变体与感兴趣的抗体温育，然后检测结合到经标记的抗原的抗体。可以根据scatchard作图分析数据确定针对癌干细胞标记物的抗体的亲和性和结合解离速率。在某些实施方式中，使用BIAcore动力学分析来确定针对癌干细胞标记物的抗体的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗体与表面上固定有癌干细胞标记物抗原的芯片的结合和解离。
[0119] 在某些实施方式中，本发明涵盖分离的多核苷酸，该多核苷酸编码含有抗人类FZD受体的抗体或其片段的多肽。因此，术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖包含仅该多肽的编码序列的多核苷酸和包含额外的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，如果是单链，其可以是编码链或非编码链(反义链)。
[0120] 本发明还涉及以上所述编码例如片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变体。多核苷酸的变体可以是该多核苷酸天然存在的等位基因变体或该多核苷酸的非天然存在的变体。在某些实施方式中，多核苷酸可以具有这样的编码序列，该编码序列是所公开的多肽的编码序列的天然存在的等位基因变体。如本领域已知的，等位基因变体是多核苷酸序列的具有例如一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加但是没有明显改变所编码多肽的功能的替代性形式。
[0121] 在某些实施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合有有助于例如在宿主细胞中表达和分泌多肽的多核苷酸(例如用作控制多肽从细胞中转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是一种前体蛋白，可具有被宿主细胞切除的前导序列以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码这样的前体蛋白，该前体蛋白是成熟蛋白加上额外的5′端氨基酸残基。具有前体序列的成熟蛋白是一种前体蛋白，并且是一种非活性形式的蛋白。切除前体序列后，留下的即是具有活性的成熟蛋白。
[0122] 在某些实施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合有可以用于例如纯化所编码多肽的标记序列。例如，在细菌宿主的情况中，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签以纯化与该标记融合的成熟蛋白，或者，当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，该标记序列可以是源自于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
[0123] 在某些实施方式中，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子与编码含有抗人类FZD受体的抗体或其片段的多肽的多核苷酸具有至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少95%的同一性，在一些实施方式中，具有至少96%、97%、98%或99%的同一性。
[0124] 具有与对照核苷酸序列的“同一性”为例如至少95％的核苷酸序列的多核苷酸是指，除了多核苷酸序列可包含至多5个点突变/100个对照核苷酸序列的核苷酸之外，多核苷酸的核苷酸序列与对照序列是相同的。换言之，为了获得具有与对照核苷酸序列的同一性为至少95％的核苷酸序列的多核苷酸，对照序列中至多有5％的核苷酸可以缺失或被另外的核苷酸取代，或者占对照序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可以插入到对照序列中。对照序列的这些突变可以发生在对照核苷酸序列的氨基末端位置或羧基末端位置，或者这些末端位置之间的任意位置，或者单个地散布在对照序列的核苷酸之中，或者以一个或多个相邻的组散布在对照序列中。
[0125] 作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，用于Unix的第8个版本，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)，按常规方法确定任何特定核苷酸分子是否与对照序列具有至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性，在一些实施方式中，是否具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。Bestfit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2：482489(1981))的局部同源性算法来找到两条序列之间的最优同源性片段。当使用Bestfit或其他任意的序列比对程序来确定一条特定的序列是否与本发明的对照序列具有例如95％的同一性时，参数设置使得可在全长的对照核苷酸序列上计算同一性百分比并允许有占对照序列的核苷酸总数的至多5％的同源性缺口。
[0126] 多核苷酸变体可以在编码区和/或非编码区中含有变化。在一些实施方式中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性能或活性的变化。在一些实施方式中，核苷酸变体利用遗传密码子的简并性由沉默取代产生。可以根据各种理由，例如优化用于特定宿主的密码子表达(将人类mRNA中的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌偏好的那些密码子)来产生多核苷酸变体。
[0127] 本发明的多肽可以是包含抗人类FZD受体的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域中应当知道的是，可以改变本发明的某些氨基酸序列而没有明显影响蛋白的结构和功能。因此，本发明还包括显示出基本活性的多肽变体或者包含抗人类FZD受体蛋白的抗体或其片段的区域的多肽变体。这样的突变体包括缺失、插入、倒位、重复以及各种类型的取代。
[0128] 多肽和类似物可以被进一步修饰以含有额外的化学部分(蛋白的非常见部分)。这些衍生部分可以提高蛋白的溶解度、生物学半衰期或吸收性。所述部分还可以减少或消除蛋白等的任意所需的副作用。有关这些部分的综述可以在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第20版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(2000)找到。
[0129] 本文所述的分离的多肽可以通过本领域已知的任意适当的方法制备。所述方法包括从直接蛋白合成法乃至构建编码该分离的多肽序列的DNA序列并将这些序列表达在适当的转化宿主中表达。在一些实施方式中，通过或合成编码感兴趣的野生型蛋白的DNA序列，利用重组技术构建DNA序列。可选的是，可以通过定点诱变来诱变所述序列以提供该序列的功能类似物(参见例如Zoeller等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA81：5662～5066(1984)和美国专利No.4,588,585)。
[0130] 在一些实施方式中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码感兴趣的多肽的DNA序列。这样的寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列进行设计并选择用以生成感兴趣的重组多肽的宿主细胞偏好的那些密码子。可以应用标准方法来合成编码感兴趣的分离的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可以使用完整的氨基酸序列来构建反翻译的基因(back-translated gene)。另外，可以合成含有用于编码分离的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成用于编码所需多肽的各部分的数条短的寡核苷酸然后进行连接。各条寡核苷酸通常含有用于互补组装的5′或3′突出末端。
[0131] 一旦组装(通过合成、定位诱变或其他方法)，编码感兴趣的分离的特定多肽的多核苷酸序列就被插入到表达载体中，并被可操纵地连接到适用于使所述蛋白在所需宿主中表达的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制图谱、生物活性多肽在适当的宿主中的表达来证实组装的正确性。如本领域所公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因必须可操纵地连接到在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列上。
[0132] 使用重组表达载体来扩增和表达编码癌干细胞标记物多肽融合体的DNA。重组表达载体是可复制DNA构建体，其具有编码癌干细胞标记物多肽融合体或生物等效类似物的合成DNA片段或cDNA来源的DNA片段，所述融合体或生物等效类似物可操纵地连接到来自于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适当的转录或翻译调节元件。转录单元一般包括以下物质的组装体(1)在基因表达中具有调节作用的一个或多个基因元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA和翻译成蛋白的结构或编码序列，和(3)适当的转录和翻译启始和终止序列，如上文所详细描述的序列。这样的调节元件可以包括控制转录的操纵子序列。可以额外引入在宿主中复制的能力(一般由复制起点提供)和便于识别转化体的选择基因。当各DNA区在功能上相互关联时，将它们可操纵地进行连接。例如，在其作为参与多肽分泌的前体表达时，信号肽序列(分泌性前导序列)的DNA被可操纵地连接到多肽的DNA上；在启动子控制序列转录时，启动子被可操纵地连接到编码序列上；或者在核糖结合位点被定位以允许翻译时，核糖结合位点被可操纵地连接到编码序列上。通常，可操纵地连接意味着是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中意味着相邻的且位于阅读框内。拟用在酵母表达系统中的结构元件包括能够使得宿主细胞进行所翻译的蛋白的胞外分泌的前导序列。作为选择，在表达重组蛋白而无需前导序列或转运序列的情况下，所述结构元件可以包括N-末端甲硫氨酸残基。该残基随后可以任选从所表达的重组蛋白上切除以提供最终的产物。
[0133] 表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以采用很多不同的表达宿主和/或载体组合。用于真核宿主的有用表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用病毒载体包括已知的细菌质粒(如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)、大范围宿主质粒(如M13)和丝状单链DNA噬菌体。
[0134] 适用于表达癌干细胞标记物蛋白的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母和昆虫或高级真核生物细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌属细菌(bacilli)。高级真核生物细胞包括如下文所述的哺乳动物来源的已确立的细胞系。也可以采用无细胞翻译系统。细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主适用的克隆和表达载体是Pouwels等所述的载体(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，1985)，在此通过参考的方式引入其相关的公开内容。
[0135] 可以有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为这样的蛋白一般能够正确地折叠、适当的修饰并具有完整的功能。适当的哺乳动物宿主细胞系的例子包括如Gluzman(Cell 23：175，1981)所述的猴肾细胞的COS-7细胞系和能够表达适当载体的其他细胞系，例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含连接到待表达基因的非转录元件如复制起点、适当的启动子和增强子、和其他5′或3′侧翼非转录序列以及5′或3′非翻译序列，如必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪切供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统由Luckow和Summers(Bio/Technology 6：47(1988))所概述。
[0136] 可以根据任意适当的方法纯化由转化宿主产生的蛋白。这样的标准方法包括色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法和分级柱色谱法)、离心法、差异溶解度法或用于蛋白纯化的任意其他标准方法。可以将诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感被膜序列(influenza coat sequence)和谷胱甘肽-S-转移酶连接到蛋白上以易于通过适当亲和柱进行纯化。还可以适用蛋白水解、核磁共振和x射线晶体法等技术对所分离的蛋白进行物理表征。
[0137] 例如，首先可以使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元来浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。在浓缩步骤之后，可以将浓缩液加到适当的纯化介质中。作为选择，可以采用阴离子交换树脂，例如悬附有二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基材。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白纯化中常用的其他类型。作为选择，可以采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换剂包括含有磺基丙基或羧基甲基的各种不溶性基质。最后，可以采用使用疏水性反相高效液相色谱(RP-HPLC)介质(例如具有悬附的甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱步骤的来进一步纯化癌干细胞蛋白-Fc组合物。也可以采用某些或所有前述纯化步骤的各种组合来提供同源性重组蛋白。
[0138] 可以通过从细胞沉淀中的初始提取，然后进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤来分离细菌培养物中生成的重组蛋白。高效液相色谱(HPLC)可以用来进行最后的纯化步骤。表达重组蛋白所用的微生物细胞可以通过任何常规方法来破碎，所述方法包括循环冻融法、超声处理法、机械破碎法或使用细胞裂解剂的方法。
[0139] 本发明提供了抑制表达癌干细胞标记物的致瘤性细胞的生长的方法，该方法使用抗本文所述的癌干细胞标记物的抗体。在某些实施方式中，抑制表达癌干细胞标记物的致瘤性细胞的生长的所述方法包括在体外使所述细胞与抗癌干细胞标记物的抗体接触。例如，将表达癌干细胞标记物的永生化细胞系或癌细胞系培养在培养基中，该培养基添加有抗所表达的癌干细胞标记物的抗体以抑制细胞的生长。在一些实施方式中，从例如组织活检样品、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离出含有肿瘤干细胞的肿瘤细胞，并将其培养在添加有针对癌干细胞标记物的抗体的培养基中以抑制细胞生长。
[0140] 在一些实施方式中，抑制表达癌干细胞标记物的致瘤性细胞的生长的方法包括在体内使所述细胞与针对癌干细胞标记物的抗体接触。在某些实施方式中，在动物模型中使致瘤性细胞与针对癌干细胞标记物的抗体接触。例如，将表达癌干细胞标记物的异种外植体生长在免疫受损的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中，该小鼠被施用针对癌干细胞标记物的抗体以抑制肿瘤的生长。在一些实施方式中，从例如组织活检样品、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离出表达癌干细胞标记物的癌干细胞，并将其注射到免疫受损的小鼠中，然后对该小鼠施用针对癌干细胞标记物的抗体以抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方式中，在将致瘤性细胞导入动物中的同时或之后的短时间内施用针对癌干细胞标记物的抗体以防止肿瘤的生长。在一些实施方式中，在致瘤性细胞已生长到一定尺寸之后施用针对癌干细胞标记物的抗体作为治疗物。
[0141] 本发明还提供了包含靶向癌干细胞标记物的抗体的药物组合物。所述药物组合物可以用于抑制肿瘤细胞生长和治疗人类患者中的癌症。
[0142] 通过将本发明的纯化抗体与药学可接受的载质(例如载体、赋形剂)组合来制备用于保存和使用的制剂(Remington，The Science and Practice of Pharmacy(第20版)Mack Publishing，2000)。适当的药学可接受的载质包括但不限于非毒性缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；诸如氯化钠等盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(例如小于约10个氨基酸残基)；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、麦芽糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和非离子表面活性剂，如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
[0143] 本发明的药物组合物可以以众多方式中的任一种方式施用以用于局部治疗或全身治疗。施用可以是局部施用(例如粘膜施用，包括阴道输送和直肠输送)，如采用透皮贴剂，软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液剂和粉剂的施用；肺部施用(例如通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括使用喷雾器的施用；气管内、鼻内、表皮和透皮施用)；口服施用；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内的注射或输注；或颅内(例如鞘内或脑室内)施用。
[0144] 所述治疗制剂可以是单位剂量形式。所述制剂包括用于口服、肠胃外施用、直肠施用或通过吸入施用的片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、在水中或非水性介质中的溶液剂或悬浮剂、或者栓剂。在诸如片剂等固体组合物中，可以将基本活性组分与药物载体混合。常规压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢二钙或树胶，以及其他稀释剂(例如水)，以形成含有本发明化合物或其非毒性药学可接受的盐的均相混合物的固体前制剂组合物。然后将所述固体前制剂组合物再分为上述类型的单位剂量形式。可以对所述新型组合物的片剂、丸剂等进行包衣，或者进行其他方式的复合而提供具有长效优点的剂量形式。例如，所述片剂或丸剂可以包含由外部组分包被的内部组合物。而且，所述两种组分可以由肠衣层隔开，该肠衣层起到耐崩解并使内部组分能够完好地通过胃部或者延缓释放。有各种材料可以用于所述肠衣层或包衣，这样的材料包括众多聚合酸和聚合酸的混合物，这样的材料例如为紫胶、十六烷基醇和醋酸纤维素。
[0145] 药物制剂包括与脂质体(Epstein，等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688；Hwang等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030；和美国专利4,485,045和4,544,545)络合的本发明抗体。具有延长的循环时间的脂质体公开在美国专利5,013,556中。有些脂质体可以通过使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物的反相蒸发来制备。脂质体可以通过具有确定的孔径的过滤器挤出而获得具有所需直径的脂质体。
[0146] 所述抗体还可以包载在微囊中。这样的微囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别为在胶质药物输送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米颗粒和纳米囊)或大乳液中的羟基甲基纤维素或明胶-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，如在Remington，The Science and Practice of Pharmacy(第20版)Mack Publishing(2000)中所述。
[0147] 此外，可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当例子包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成型品形式(例如膜或微囊)。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体))、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
[0148] 在某些实施方式中，治疗包括本发明抗体和化疗剂或多种不同化疗剂的混合物的联合施用。施用抗体进行的治疗可以在施用化疗药物之前、同时或之后进行。本发明想到的化疗药物包括本领域已知并且可以商购获得的化学物质或药物，例如多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、细胞毒素(Cytoxin)、泰素、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱和卡铂。联合施用可以包括共施用和依次施用，所述共施用可以是单个药物制剂的施用，也可以是使用分开的制剂的施用，所述依次施用可以是以任意顺序的施用，但通常是在一定的时间内施用以使所有的活性剂能够同时发挥它们的生物活性。所述化疗剂的制剂和剂量给药方案可以根据制造商的说明书使用，或者由本领域熟练从业者根据经验确定。化疗药物的制剂和剂量方案在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams和Wilkins，Baltimore，Md.(1992)中也有描述。
[0149] 在另外的实施方式中，治疗包括本发明抗体和放射疗法的联合施用。施用抗体进行的治疗可以在施用放射疗法之前、同时或之后进行。可以使用本领域熟练从业者确定的所述放射疗法的任何剂量给药方案。
[0150] 在另外的实施方式中，治疗可以包括本发明抗体和抗另外肿瘤相关抗原的其他抗体的联合施用，所述其他抗体包括但不限于与EGFR、HER2和VEGF结合的抗体。而且治疗可以包括一种或多种细胞因子的施用，该治疗可以伴随癌细胞的手术去除或治疗医生认为必要的其他治疗。
[0151] 对于疾病的治疗，本发明抗体的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重性和疾病的进程、疾病的响应性、施用该抗体的目的是治疗性目的还是预防性目的、先前的疗法、患者的临床病史等，所有这些都根据治疗医生的判断。抗体可以施用一次，也可以在持续数天至数月的系列治疗中施用，或直至实现痊愈或者达到疾病状态的消减(例如肿瘤尺寸的减小)。优化剂量方案可以根据患者体内的药物累积确定结果来计算，并且可以根据个别抗体的相对效力的不同而改变。主治医生可以容易地确定最优剂量、剂量给药方法和重复频率。剂量通常为0.01μg～100mg/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次。主治医生可以根据药物在体液或组织中的滞留时间和浓度来估算剂量给药的重复频率。
[0152] 本发明提供了包含本文所述抗体并可以用以实施本文所述方法的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包含位于一个或多个容器中的针对癌干细胞标记物的至少一种纯化抗体。在一些实施方式中，所述试剂盒包含进行检测测定必需的和/或足以进行该检测测定的所有组分，包括所有的对照、进行测定的说明以及用于结果分析和呈现的任何必需软件。本领域技术人员应当容易地知道，本发明公开的抗体可以容易地加入到本领域公知的已确立的试剂盒形式之一中。
[0153] 本发明所公开的实施方式可以参考以下实施例进行进一步的说明，所述实施例详细地描述了本发明所公开的抗体的制备以及使用本发明所公开的抗体的方法。本领域技术人员知道，可以在不脱离本公开内容范围的情况下对材料和方法进行诸多改变。相同的附图标记在整个附图中都尽可能地表示相同或相似的对象。
[0154] 实施例
[0155] 实施例1
[0156] FZD抗体的制备
[0157] 抗原制备
[0158] 将人类FZD受体的胞外域的重组多肽片段制备为用于抗体制备的抗原。使用标准重组DNA技术来分离编码FZD10的第1～227个氨基酸(SEQ ID NO：1)、FZD7的第1～255个氨基酸(SEQ ID NO：2)、FZD5的第1～233个氨基酸(SEQ ID NO.3)、FZD6的第1～207个氨基酸(SEQ ID NO：4)、FZD4的第1～224个氨基酸(SEQ ID NO：5)和FZD8的第1～158个氨基酸(SEQ ID NO：6)的多核苷酸。这些多核苷酸以框内N末端连接到人类Fc标签或组氨酸标签上，并克隆到转运质粒载体中，以在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达。使用标准的转染、感染和细胞培养程序来制得表达相应FZD多肽的重组昆虫细胞(O′Reilley等，Baculovirus expression vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994))。
[0159] 使用切割预测软件SignalP 3.0模拟勾画人类FZD受体的内源性信号序列的切割，但是实际的体内切割点可能由于氨基酸偶联或定向而不同。FZD10的预测切割位于第20～21个氨基酸之间，因此FZD10抗原蛋白包含约第21个氨基酸～第227个氨基酸。FZD7的预测切割位于第31～32个氨基酸之间，因此FZD7抗原蛋白包含约第32个氨基酸～第
255个氨基酸。FZD5的预测切割位于第26～27个氨基酸之间，因此FZD5抗原蛋白包含约第27个氨基酸～第233个氨基酸。FZD6的预测切割位于第17～18个氨基酸之间，因此FZD6抗原蛋白包含约第18个氨基酸～第207个氨基酸。FZD4的预测切割位于第39～40个氨基酸之间，因此FZD4抗原蛋白包含约第40个氨基酸～第224个氨基酸。FZD8的预测切割位于第27～28个氨基酸之间，因此FZD8抗原蛋白包含约第28个氨基酸～第158个氨基酸。
255个氨基酸。FZD5的预测切割位于第26～27个氨基酸之间，因此FZD5抗原蛋白包含约第27个氨基酸～第233个氨基酸。FZD6的预测切割位于第17～18个氨基酸之间，因此FZD6抗原蛋白包含约第18个氨基酸～第207个氨基酸。FZD4的预测切割位于第39～40个氨基酸之间，因此FZD4抗原蛋白包含约第40个氨基酸～第224个氨基酸。FZD8的预测切割位于第27～28个氨基酸之间，因此FZD8抗原蛋白包含约第28个氨基酸～第158个氨基酸。
[0160] 使用蛋白A和Ni++螯合剂亲和色谱法从昆虫细胞条件介质(conditioned medium)中纯化出抗原蛋白。利用PBS(pH=7)将经纯化的抗原蛋白透析、浓缩至1mg/ml，并在免疫用制剂中过滤灭菌。
[0161] 免疫
[0162] 用经纯化的FZD10、FZD7、FZD5、FZD6、FZD4和FZD8抗原蛋白(抗体溶液；Mountain View，CA)按照标准的技术免疫小鼠(n=3)。在初免后约70天，采用ELISA和FACS分析来筛查个体小鼠的血液的抗原识别(如下详述)。选择抗体滴度最高的两只动物进行最后的抗原加强(antigen boost)，之后分离出脾细胞用于杂交瘤制备。杂交瘤细胞在96孔板中按1个细胞/孔铺板，通过针对抗原蛋白的ELISA和FACS分析筛查每个板孔的上清液。选择数个抗体滴度高的杂交瘤并在静态瓶装培养物中扩大培养。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖色谱法从杂交瘤上清液纯化出抗体。纯化的单克隆抗体用FACS再次测试并进行同种型分析以选择IgG和IgM抗体。
[0163] 表位作图
[0164] 为了鉴定能够识别包含富含半胱氨酸域的FZD胞外域的特定区域的抗体，进行表位作图。使用标准重组DNA技术，制备在编码FZD胞外域的片段的多核苷酸上游包含CMV启动子的哺乳动物表达质粒载体。然后利用瞬时转染，将重组蛋白表达在所培养的哺乳动物细胞中。转染后24～48小时，收获细胞，并在SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶上分离细胞裂解蛋白，以使用来自经FZD抗原免疫的小鼠的抗体进行Western印迹。可以用Wnt蛋白通过ELISA进一步分析识别FZD的配体结合域的抗体的竞争性结合。
[0165] 为了鉴定胞外域中为抗FZD的抗体所识别的特定表位，使用了SPOT系统(Sigma Genosys，The Woodlands，TX)。采用SPOT合成技术，合成由一个氨基酸重叠的并覆盖整个FZD胞外域的一系列十残基线性肽，并将其共价结合到纤维素膜上。所述膜在室温下与封闭缓冲液一起预温育8小时，并用抗体在4℃杂交过夜。然后洗膜、与偶联有辣根过氧化物酶(HRP)(Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)的二抗温育、再洗并用含有3-氨基-9-乙基咔唑的信号显色液使之可视。由此确定被抗体识别的特定表位。
[0166] FACS分析
[0167] 为了选择由杂交瘤克隆生成的识别天然细胞表面FZD蛋白的单克隆抗体，采用了FACs分析。HEK293细胞单独用编码相应FZD(FZD10)的全长cDNA克隆的表达载体转染或用该表达载体与表达GFP的载体(FZD7、FZD5、FZD6、FZD4和FZD8)共转染。在FZD10、FZD7、FZD6和FZD4表达载体的情况中，Flag表位标签在氨基末端导入，使得可以验证带标签的FZD受体在细胞表面上的表达。转染后24～48小时，将细胞收集到悬浮液中并在冰上与抗FZD抗体、FLAG抗体、免疫血清(用于FZD5表达细胞)或用以检测背景抗体结合的对照IgG温育。洗涤细胞，用偶联有荧光发色团的抗小鼠二抗检测一抗。然后通过FACS分选所标记的细胞，以鉴定特异性识别相应FZD受体的细胞表面表达的抗FZD抗体。鉴定到识别FZD10(图1A)；FZD7(图1B)；FZD5(图1C)；FZD6(图1D)；FZD4(图1E)和FZD8(图1F)的抗体。类似地，使用如用于小鼠免疫的抗原一样结合的胞外配体，生成识别FZD1、FZD2、FZD3和FZD9的抗体。
[0168] 嵌合抗体
[0169] 鉴定特异性识别FZD受体的单克隆抗体后，修饰这些抗体以克服在使用啮齿动物抗体作为治疗剂时人类抗小鼠抗体(HAMA)免疫应答。通过RT-PCR从杂交瘤细胞分离出所选单克隆抗体的重链和轻链的可变区，并将该可变区分别框内连接到哺动物表达载体中的人类IgG1重链和κ轻链恒定区上。作为选择，使用诸如TCAE 5.3等人类Ig表达载体，该载体含有在同一质粒上的人类IgGl重链和κ轻链恒定区基因(Preston等，1998，Infection & Immunity 66：4137～42)。编码嵌合重链和轻链的表达载体然后共转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以生成嵌合抗体。通过ELISA和FACS比较嵌合抗体与鼠类亲本抗体的免疫反应性和亲和性。
[0170] 人源化抗体
[0171] 由于嵌合抗体治疗物仍经常具有抗原性，而产生人类抗嵌合抗体(HACA)免疫应答，因此可以对抗FZD受体的嵌合抗体进一步进行人源化。为了产生人源化抗体，使用重组DNA技术，将抗体的特异性决定基序的关键位置(可能包括来自3条短的高变序列或互补决定区(CDR))和/或正确定位如上所述的抗体重链和轻链可变域的CDR区所需的骨架区分别构建入人类重链和轻链抗体基因的种系DNA序列中，然后克隆到哺乳动物表达载体中，以用于在CHO细胞表达。通过ELISA和FACS比较人源化抗体与亲本嵌合抗体的免疫反应性和亲和性。另外，可以使用可变区的定位诱变或高密度诱变来优化人源化抗体的特异性、亲和性等。
[0172] 人类抗体
[0173] 在一些实施方式中，使用噬菌体展示技术来分离特异性识别FZD受体的胞外域的人类抗体。筛查含有展示为单链Fv或展示为fab域的人类抗体可变区的噬菌体展示抗体文库对上述FZD受体抗原的特异性的、高亲和性的识别作用。然后将所鉴定到的可变区抗体序列再转化成含有人类IgG1重链和κ轻链的Ig表达载体的形式，以用于在CHO细胞中表达人类抗体。
[0174] 实施例2
[0175] 识别多个FZD家族成员的抗体的制备
[0176] 为了靶向多于一个的人类FZD受体，制备特异性识别多个FZD受体家族成员的抗体。融合到人类Fc的包含N末端Frizzled或Fri、FZD4、FZD5和FZD8中任一个的配体结合域的可溶性蛋白结合并防止通过包括β-连环蛋白的稳定化在内的机制来传递信号的所有类别的Wnt配体(包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b)的信号转导(图2)。具体地说，将稳定转染有8xTCF荧光素酶报告基因的HEK 293细胞与其量不断加大的FZD Fc可溶性受体在不同Wnt配体(包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b)存在的情况下温育。FZD4Fc、FZD5Fc和FZD8Fc融合蛋白抑制了由所有5个Wnt配体介导的Wnt信号转导(图
2)。因此，在某些实施方式中，生成了特异性识别FZD4、FZD5和FZD8受体中的两个以上受体的抗体。
2)。因此，在某些实施方式中，生成了特异性识别FZD4、FZD5和FZD8受体中的两个以上受体的抗体。
[0177] 在某些实施方式中，按照实施例1中详细描述的方法，用一种或多种FZD受体抗原免疫小鼠来制得抗体。然后测试所制得的抗各FZD受体的抗体与其他FZD受体的交叉反应性。然后按照下文详细描述的方法鉴定和测试特异性识别FZD2和FZD6；FZD7和FZD10；FZD4和FZD5；FZD4和FZD8；FZD5和FZD8；以及FZD4、FZD5和FZD8的抗体防止肿瘤细胞生长的能力。
[0178] 在某些实施方式中，使用噬菌体展示文库来鉴定识别多个FZD家族成员的抗体。使用人类FZD受体的N末端胞外域中高度同源的区域来筛查文库中展示特异性识别两个以上FZD受体的抗原结合域的噬菌体。例如，将人类FZD受体的同源区表达为FZD-Fc蛋白，并以10μg/mL将重组蛋白包被在适当的表面上。然后通过两轮富集淘选(pan)人类噬菌体文库(参见例如Griffiths等，EMBO J.12：715～34)。之后，从噬菌体回收编码抗原结合域的基因，并通过将该抗原结合域与恒定区连接，构建完整的人类抗体分子，以用于在适当的宿主细胞系中表达。在某些实施方式中，按照下文详细描述的方法，鉴定和测试识别FZD2和FZD6；FZD7和FZD10；FZD4和FZD5；FZD4和FZD8；FZD5和FZD8；以及FZD4、FZD5和FZD8的抗体防止肿瘤细胞生长的能力。
[0179] 在某些实施方式中，开发了通过借助规范Wnt信号转导途径干扰信号转导来拮抗Wnt信号转导途径的抗体。例如，通过噬菌体展示法鉴定了特异性识别FZD4、FZD5和FZD8中的两种以上FZD的抗体。在某些实施方式中，开发了通过激活拮抗性非规范Wnt信号转导途径来拮抗Wnt信号转导途径的抗体。例如，通过噬菌体展示法鉴定了特异性识别FZD6和FZD2的抗体。
[0180] 实施例3
[0181] 用以评价抗FZD受体的抗体的体外测定
[0182] 本实施例描述了代表性的体外测定，该体外测定用于测试所生成的抗FZD受体的抗体对细胞增殖、途径激活和细胞毒性的活性。
[0183] 增殖测定
[0184] 使用Taqman分析定量不同癌细胞系所表达的FZD受体。在96孔组织培养微型4
板中，按10 个细胞/孔的密度对鉴定为表达FZD受体的细胞系进行铺板并让其展开24小时。随后在含有2%FCS的新鲜DMEM中再将细胞培养12小时，此时将抗FZD抗体与对照抗体在存在10μmol/L BrdU的情况下加到培养基中。BrdU标记后，去除培养基并将细胞于室温下在乙醇中固定30分钟，并与过氧化物酶偶联的抗BrdU单克隆抗体(BMG 6H8克隆，Fab片段)反应90分钟。在含有四甲基联苯胺的溶液中使底物显色，在15分钟后用25μl的1mol/LH2SO4终止。使用450nm的滤波器以自动ELISA读板仪(UV Microplate Reader；
Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)测量颜色反应。所有试验都进行3次重复。与对照抗体比较而确定抗FZD抗体抑制细胞增殖的能力。
板中，按10 个细胞/孔的密度对鉴定为表达FZD受体的细胞系进行铺板并让其展开24小时。随后在含有2%FCS的新鲜DMEM中再将细胞培养12小时，此时将抗FZD抗体与对照抗体在存在10μmol/L BrdU的情况下加到培养基中。BrdU标记后，去除培养基并将细胞于室温下在乙醇中固定30分钟，并与过氧化物酶偶联的抗BrdU单克隆抗体(BMG 6H8克隆，Fab片段)反应90分钟。在含有四甲基联苯胺的溶液中使底物显色，在15分钟后用25μl的1mol/LH2SO4终止。使用450nm的滤波器以自动ELISA读板仪(UV Microplate Reader；
Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)测量颜色反应。所有试验都进行3次重复。与对照抗体比较而确定抗FZD抗体抑制细胞增殖的能力。
[0185] 途径激活测定
[0186] 在某些实施方式中，在体外确定了抗FZD受体的抗体阻断Wnt信号转导途径的激活的能力。例如，将培养在补充有抗生素和10%FCS的DMEM中的HEK293细胞与：1)用以激活Wnt信号转导途径的Wnt7B和FZD10表达载体；2)用以测量规范Wnt信号转导水平的在萤火虫荧光素酶报告基因上游含有3或8个拷贝的TCF结合域的TCF/Luc野生型或突变型报告基因载体(Gazit等，1999，Oncogene 18：5959～66)；和3)用于作为转染效率的内部对照的海肾(Renilla)荧光素酶报告基因(Promega；Madison，WI)进行共转染。然后向细胞培养基中加入抗FZD10和对照抗体。转染后48小时，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega；Madison，WI)测量荧光素酶水平，其中将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。
以3次重复进行3个独立的试验。由此确定FZD10抗体抑制Wnt途径激活的能力。
以3次重复进行3个独立的试验。由此确定FZD10抗体抑制Wnt途径激活的能力。
[0187] 在一些实施方式中，在体外确定了抗人类FZD10受体的抗体干扰Wnt配体结合的能力。例如，用Wnt应答性荧光素酶报告基因TOPFLASH(Upstate Group LLC；货号为21-170)和Wnt3A表达载体转染HEK293细胞以激活被转染细胞中的内源性Wnt信号转导。
将含有FZD5的框内连接到人类IgG1 Fc的胞外域(第1～233个氨基酸)的可溶性FZD5 Fc添加到转染细胞的培养基中，以单独与Wnt3A结合(图3；HT培养基，Wnt3A，右侧条)或在存在所生成的抗FZD5的各抗体的情况下与Wnt3A结合(图1C；44M1-32)。根据荧光素酶活性测量，在没有FZD5抗体的情况下，FZD5 Fc完全消除了转染细胞中的Wnt信号转导，但是干扰FZD5 Fc与Wnt3A的配体结合的FZD5抗体的加入恢复了Wnt信号转导(图3)。
将含有FZD5的框内连接到人类IgG1 Fc的胞外域(第1～233个氨基酸)的可溶性FZD5 Fc添加到转染细胞的培养基中，以单独与Wnt3A结合(图3；HT培养基，Wnt3A，右侧条)或在存在所生成的抗FZD5的各抗体的情况下与Wnt3A结合(图1C；44M1-32)。根据荧光素酶活性测量，在没有FZD5抗体的情况下，FZD5 Fc完全消除了转染细胞中的Wnt信号转导，但是干扰FZD5 Fc与Wnt3A的配体结合的FZD5抗体的加入恢复了Wnt信号转导(图3)。
[0188] 在一些实施方式中，体外确定了特异性结合两个以上人类FZD受体(例如FZD2和FZD6)的抗体通过例如用作非规范Wnt信号转导的激动剂而拮抗FZD介导的规范Wnt信号转导的能力。例如，使用Wnt应答性荧光素酶报告基因TOPFLASH转染HEK 293细胞。转染后48小时，将特异性识别人类FZD2和FZD6或同种型对照的抗体与诸如Wnt-3a等Wnt配体一起添加到培养基中。然后通过测量荧光素酶活性来确定存在或者不存在抗体的情况下规范Wnt信号转导的激活。
[0189] 补体依赖性细胞毒素测定
[0190] 在某些实施方式中，使用表达FZD受体的癌细胞系或从患者样品中分离到的作为异种移植物传代到免疫受损小鼠中的癌干细胞(如下文所详述)，测量由抗FZD受体的抗体6
介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)。按10 个细胞/ml，将细胞悬浮在200μl的补充有抗生素和5%FBS的RPMI 1640培养基中。然后将悬浮细胞与200μl血清或热灭活血清或抗FZD受体或对照抗体的混合，设3个重复。将细胞混合物于37℃在5%CO2中温育1～4小时。然后收集所处理的细胞，并将其重悬于稀释在培养基中的100μl FITC-标记的膜联蛋白V并在室温温育10分钟。加入稀释在HBSS中的100μl碘化丙啶溶液(25μg/ml)，并在室温下温育5分钟。收集细胞，将其悬浮在培养基中，并用流式细胞术分析。FITC染色细胞的流式细胞术分析提供了总细胞计数，而死细胞的碘化丙啶吸收(作为总细胞数的百分比)用于测量在血清和抗FZD抗体存在下的细胞死亡(与热灭活血清和对照抗体相比)。
由此确定抗FZD抗体介导补体依赖性细胞毒性的能力。
介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)。按10 个细胞/ml，将细胞悬浮在200μl的补充有抗生素和5%FBS的RPMI 1640培养基中。然后将悬浮细胞与200μl血清或热灭活血清或抗FZD受体或对照抗体的混合，设3个重复。将细胞混合物于37℃在5%CO2中温育1～4小时。然后收集所处理的细胞，并将其重悬于稀释在培养基中的100μl FITC-标记的膜联蛋白V并在室温温育10分钟。加入稀释在HBSS中的100μl碘化丙啶溶液(25μg/ml)，并在室温下温育5分钟。收集细胞，将其悬浮在培养基中，并用流式细胞术分析。FITC染色细胞的流式细胞术分析提供了总细胞计数，而死细胞的碘化丙啶吸收(作为总细胞数的百分比)用于测量在血清和抗FZD抗体存在下的细胞死亡(与热灭活血清和对照抗体相比)。
由此确定抗FZD抗体介导补体依赖性细胞毒性的能力。
[0191] 抗体依赖性细胞胞毒测定
[0192] 在某些实施方式中，使用表达FZD受体的癌细胞系或从患者样品中分离到的作为异种移植物传代到免疫受损小鼠的癌干细胞(如下文所详述)，测量由抗FZD受体的抗体6
介导的抗体依赖性细胞胞毒(ADCC)。按10 个细胞/ml，将细胞悬浮在200μl的补充有抗生素和5%FBS的不含酚红的RPMI 1640培养基中。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从肝素化外周血中分离出外周血单核细胞(PBMC)，以用作效应细胞。然后在至少一种FZD受体的抗体或对照抗体存在的情况下，将靶细胞(T)与PBMC效应细胞(E)按25：1，10：1和5：1的E/T比混合在96孔板中。对照包括在抗体存在的情况下单独温育靶细胞和单独温育效应细胞。将细胞混合物于37℃在5%CO2中温育1～6小时。然后用比色测定法(CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay；Promega；Madison，WI)测量所释放的乳酸脱氢酶(LDH，一种细胞裂解时释放的稳定的胞质酶)。用标准96孔板读板仪收集在490nm处的吸收数据并进行背景校正。根据下式计算特异细胞毒性的百分比：%细胞毒性=100×(试验LDH释放－效应器自发LDH释放－靶自发LDH释放)／(靶最大LDH释放－靶自发LDH释放)。由此确定抗FZD受体的抗体介导抗体依赖性细胞胞毒的能力。
介导的抗体依赖性细胞胞毒(ADCC)。按10 个细胞/ml，将细胞悬浮在200μl的补充有抗生素和5%FBS的不含酚红的RPMI 1640培养基中。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从肝素化外周血中分离出外周血单核细胞(PBMC)，以用作效应细胞。然后在至少一种FZD受体的抗体或对照抗体存在的情况下，将靶细胞(T)与PBMC效应细胞(E)按25：1，10：1和5：1的E/T比混合在96孔板中。对照包括在抗体存在的情况下单独温育靶细胞和单独温育效应细胞。将细胞混合物于37℃在5%CO2中温育1～6小时。然后用比色测定法(CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay；Promega；Madison，WI)测量所释放的乳酸脱氢酶(LDH，一种细胞裂解时释放的稳定的胞质酶)。用标准96孔板读板仪收集在490nm处的吸收数据并进行背景校正。根据下式计算特异细胞毒性的百分比：%细胞毒性=100×(试验LDH释放－效应器自发LDH释放－靶自发LDH释放)／(靶最大LDH释放－靶自发LDH释放)。由此确定抗FZD受体的抗体介导抗体依赖性细胞胞毒的能力。
[0193] 实施例4
[0194] 体内使用抗FZD受体的抗体防止肿瘤生长
[0195] 本实施例描述了抗FZD受体的抗体在防止异种移植物模型内的肿瘤生长中的应用。在某些实施方式中，制备来自患者样品(例如实体瘤活检样品或胸腔积液)的已作为异种移植物传代到小鼠中的肿瘤细胞，以再传代到试验动物中。在无菌条件下取出肿瘤组织，切成小块，用无菌刀片完全切碎，并通过酶消化和机械破碎获得单细胞悬浮液。具体地说，将胸腔积液细胞或所得肿瘤块与超纯胶原酶III于培养基中混合(200～250单位胶原酶/mL)并在37℃温育3～4小时，期间每15～20分钟通过10mL移液器上下吸打。通过45μM尼龙网过滤所消化的细胞，用RPMI/20%FBS洗涤，并用HBSS洗涤两次。然后将解离的肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中以引发肿瘤生长。
[0196] 在某些实施方式中，在注射到试验动物之前，首先根据细胞表面标记物将所解离的肿瘤细胞分选为致瘤性细胞和非致瘤性细胞。具体地说，用含有2%热灭活牛血清(HICS)6
的Hepes缓冲盐水溶液(HBSS)洗涤按上述解离的肿瘤细胞2次，并以10 个细胞/100μl重新悬浮。加入抗体，在冰上温育细胞20分钟，然后用HBSS/2%HICS洗涤两次。抗体包括抗ESA(Biomeda，Foster City，CA)、抗CD44、抗CD24和种系标记物抗CD2、抗CD3、抗CD10、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64和抗CD140b(统称为Lin；PharMingen，San Jose，CA)。
将抗体直接偶联到荧光染料上以对表达这些标记物的细胞进行阳性或阴性选择。通过选择抗H2Kd+细胞而排除小鼠细胞，并通过使用存活力染料(viability dye)7AAD排除死细胞。
在FACSVantage(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上实施流式细胞术。利用侧向角散射图和前向角散射图排除细胞团块。然后将所分离的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-致瘤性细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中以引发肿瘤生长。
的Hepes缓冲盐水溶液(HBSS)洗涤按上述解离的肿瘤细胞2次，并以10 个细胞/100μl重新悬浮。加入抗体，在冰上温育细胞20分钟，然后用HBSS/2%HICS洗涤两次。抗体包括抗ESA(Biomeda，Foster City，CA)、抗CD44、抗CD24和种系标记物抗CD2、抗CD3、抗CD10、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64和抗CD140b(统称为Lin；PharMingen，San Jose，CA)。
将抗体直接偶联到荧光染料上以对表达这些标记物的细胞进行阳性或阴性选择。通过选择抗H2Kd+细胞而排除小鼠细胞，并通过使用存活力染料(viability dye)7AAD排除死细胞。
在FACSVantage(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上实施流式细胞术。利用侧向角散射图和前向角散射图排除细胞团块。然后将所分离的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-致瘤性细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中以引发肿瘤生长。
[0197] 在某些实施方式中，分析了抗FZD6和抗FZD5抗体减缓UM-C4结肠肿瘤细胞生长的能力。将解离的UM-C4细胞(10,000个细胞/只动物)皮下注射到6～8周龄的NOD/SCID小鼠的胁腹区。肿瘤细胞注射后两天，按每周两次，用10mg/kg的抗FZD6或抗FZD5受体的抗体对动物进行腹膜内注射(i.p.)。每周监测肿瘤的生长直至检测到生长，之后，在总共8周的时间内每周对点肿瘤生长进行两次测量。与注射PBS的对照相比，用抗FZD6抗体23M2和抗FZD5抗体44M13治疗动物可以显著减缓肿瘤的生长(图4)。
[0198] 实施例5
[0199] 使用抗FZD受体的抗体对肿瘤进行体内治疗
[0200] 本实施例描述了抗FZD受体的抗体在治疗异种移植物模型内的癌症中的应用。在某些实施方式中，制备来自患者样品(例如实体瘤活检样品或胸腔积液)的已作为异种移植物传代到小鼠中的肿瘤细胞，以再传代到试验动物中。取出肿瘤组织，切成小块，用无菌刀片完全切碎，并通过酶消化和机械破碎获得单细胞悬浮液。然后将解离的肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫(用于乳腺肿瘤)、注射到胁腹(用于非乳腺肿瘤)中以引发肿瘤生长。作为选择，按上文所详细描述的方法分离ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-致瘤性肿瘤细胞并进行注射。
[0201] 注射肿瘤细胞后，监测动物的肿瘤生长。一旦肿瘤的平均尺寸达到约150mm～200mm，即开始进行抗体处理。在总共6周内，按每周2～5次，通过腹膜内注射，使每只动物接受100μg FZD受体的抗体或对照抗体。在这些6周过程中，每周评价肿瘤尺寸两次。由此确定FZD受体的抗体防止进一步的肿瘤生长或减小肿瘤尺寸的能力(与对照抗体比较)。
[0202] 在抗体处理终点，收获肿瘤以进行进一步分析。在某些实施方式中，一部分肿瘤通过免疫荧光法分析以评价抗体对肿瘤的穿透和肿瘤反应。一部分各获自抗FZD受体的抗体处理小鼠和对照抗体处理小鼠的肿瘤在液氮中鲜冻，包埋在O.C.T.中，并用低温恒温器切成位于载玻片上的10μm切片。在一些实施方式中，各个肿瘤的一部分用福尔马林固定、石蜡包埋并用超薄切片机切成位于载玻片上的10μm切片。对所述切片进行后固定并与生色团标记的特异性识别所注射抗体的抗体温育，以检测肿瘤活检样品中存在的抗FZD受体的抗体或对照抗体。另外，可以使用以下抗体或方法来评价抗体处理对例如血管生成、肿瘤生长和肿瘤形态的效果：例如检测不同肿瘤和肿瘤募集的细胞类型的抗体例如抗VE连环蛋白(CD144)或抗PECAM-1(CD31)抗体以检测血管内皮细胞、抗平滑肌α-肌动蛋白抗体以检测血管平滑肌细胞、抗Ki67抗体以检测增殖细胞、TUNEL测定以检测垂死细胞、抗β-连环蛋白抗体以检测Wnt信号转导，以及抗胞内域(ICD)Notch片段抗体以检测Notch信号转导。
[0203] 在某些实施方式中，还评价了抗FZD受体的抗体处理对肿瘤细胞基因表达的效果。从一部分各获自FZD抗体处理小鼠和对照抗体处理小鼠的肿瘤中提取总RNA，并用该总RNA进行定量RT-PCR。分析FZD受体、Wnt信号转导途径的组分(包括例如Wnt1和β-连环蛋白)以及所加入的先前鉴定到的癌干细胞标记物(例如CD44)相对于作为内部对照的管家基因GAPDH的表达水平。由此确定FZD受体的抗体处理时肿瘤细胞基因表达的变化。
[0204] 另外，评价了抗FZD受体的抗体处理对肿瘤中的癌干细胞的存在的效果。将来自FZD抗体处理小鼠和对照抗体处理小鼠的肿瘤样品切成小块，用无菌刀片完全切碎，并通过酶消化和机械破碎获得单细胞悬浮液。然后按上文所详细描述的方法，根据ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表面细胞标记物表达，采用FACS分析，分析所解离的肿瘤细胞的致瘤性癌干细胞的存在。
[0205] 然后可以根据ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表达评价抗FZD抗体处理后所分离的细胞的致瘤性。将分离自FZD抗体处理小鼠和对照抗体处理小鼠的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-癌干细胞再皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。然后根据形成可靠肿瘤(consistent tumor formation)所需的被注射细胞的数量，确定癌干细胞的致瘤性。
[0206] 实施例6
[0207] 使用抗FZD受体的抗体治疗人类癌症
[0208] 本实施例描述了使用用以靶向肿瘤的抗FZD受体的抗体治疗癌症的方法，所述肿瘤包含其中已经检测到FZD受体表达的癌干细胞和/或肿瘤细胞。首先，可以从肿瘤活检样品确定癌干细胞标记物表达的存在。在无菌条件下从诊断患有癌症的患者的活检样品取出肿瘤细胞。在一些实施方式中，将组织活检样品鲜冻在液氮中，包埋在O.C.T.中并利用低温恒温器切成位于载玻片上的10μm切片。在一些实施方式中，将组织活检样品用福尔马林固定、石蜡包埋，并用超薄切片机切成位于载玻片上的10μm切片。将切片与抗FZD受体的抗体温育，以检测蛋白表达。
[0209] 还可以确定癌干细胞的存在。将组织活检样品切成小块，用无菌刀片完全切碎，并对细胞进行酶消化和机械破碎，以获得单细胞悬浮液。然后将所解离的肿瘤细胞与抗ESA、抗CD44、抗CD24、抗Lin和抗FZD抗体温育，以检测癌干细胞，并通过上文所详细描述的流式细胞术确定ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-、FZD+肿瘤干细胞的存在。
[0210] 用抗FZD受体的抗体治疗其肿瘤经诊断表达FZD受体的癌症患者。在某些实施方式中，纯化上述制得的抗FZD受体的人源化或人类单克隆抗体并与适当的药学可接受的载质配制用于注射。在一些实施方式中，在至少10周内，按每月至少一次，使用FZD抗体对患者进行治疗。在一些实施方式中，在至少约14周内，按每周至少一次，使用FZD抗体对患者进行治疗。抗体的每次施用量应当是药学有效剂量。在一些实施方式中，施用约2mg/ml～约100mg/ml的抗FZD的抗体。在一些实施方式中，施用约5mg/ml～约40mg/ml的抗FZD的抗体。所述抗体可以在常规放射治疗方案或使用一种或多种化疗剂(例如奥沙利铂、氟尿嘧啶、亚叶酸或链佐星)的化疗方案之前、同时或之后施用。例如根据肿瘤消退、新肿瘤发生情况减少、肿瘤抗原表达降低、癌干细胞数量减少或评估疾病预后的其他手段，对患者进行监测，以确定这样的治疗是否已经产生抗肿瘤反应。
[0211] 从本文所公开的发明的说明和实践考虑，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员而言是显而易见的。所述说明和实施例应当视为仅为示例目的，本发明的实际范围和精神由所附权利要求书给出。
[0212] 序列表
[0213] SEQ ID NO：1
[0214] FZD10 N-末端胞外域
[0215] MQRPGPRLWLVLQVMGSCAAISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKIPNKNDPNYLCMEAPNNGSDEPTRGSGLFPPLFRPQRPHSAQEHPLKDGGPGRGGCDNPGKFHHVEKSASCAPLCTPGVDVYWSREDKRFA
[0216] SEQ ID NO：2
[0217] FZD7 N-末端胞外域
[0218] MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGAQPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDLAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARL
[0219] SEQ ID NO：3
[0220] FZD5 N-末端胞外域
[0221] MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATTAPPRPFPAKPTLPGPPGAPASGGECPAGGPFVCKCREPFVPILKESHPLYNKVRTGQVPNCAVPCYQPSFSADERT
[0222] SEQ ID NO：4
[0223] FZD6 N-末端胞外域
[0224] MEMFTFLLTCIFLPLLRGHSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNLETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLGPQKKTEQVQRDIGFWCPRHLKTSGGQGYKFLGIDQCAPPCPNMYFKSDELEFAKSFIGTVSI
[0225] SEQ ID NO：5
[0226] FZD4 N-末端胞外域
[0227] MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQPGEECHSVGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYSRSAKEFTDI[0228] SEQ ID NO：6
[0229] FZD8Fri 域
[0230] MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICIEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
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