用于细胞靶向疗法的组合物和方法
阅读：653发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于细胞靶向疗法的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了用于识别和清除表达特定细胞表面标志物的细胞类型的组合物和 治疗 方法。在一个实施方式中，所述组合物包括选择性结合靶细胞上的CD277的J构型的多肽构建体，其中在工程化的细胞中表达所述多肽构建体。，下面是用于细胞靶向疗法的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种药物组合物，包括选择性结合靶细胞上CD277的J构型的多肽构建体，并且其中所述多肽构建体在细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中与未处于所述J构型的CD277分子相比，所述多肽构建体以更高的选择性结合CD277的J构型。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述靶细胞是癌细胞。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述靶细胞是白血病细胞。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述γ-TCR多肽序列是γ9-TCR多肽序列或其片段。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述δ-TCR多肽序列是δ2-TCR多肽序列或其片段。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述CD277作为二聚体存在。
10.一种治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者提供有效量的药物组合物，所述药物组合物包括当CD277分子处于J构型时选择性结合癌细胞上的所述CD277的多肽构建体，并且其中所述多肽构建体可选地在细胞中表达。
11.一种清除对其有需要的受试者中癌细胞的方法，包括向受试者提供有效量的药物组合物，所述药物组合物包括当CD277分子处于J构型时，选择性结合所述癌细胞上的所述CD277的多肽构建体，或者有效量的表达所述多肽构建体的工程化的细胞。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中与未处于所述J构型的CD277分子相比，所述多肽构建体以更高的选择性识别CD277的J构型。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述J构型的形成需要至少RhoB与CD277的相互作用和/或CD277的区室化。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述J构型的形成需要在所述RhoB与CD277的相互作用之后，胞内磷酸抗原与CD277的相互作用。
15.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种。
16.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。
17.根据权利要求10或11所述的方法，包括施用提高RhoB GTP酶向所述癌细胞的细胞膜的移位的试剂。
18.根据权利要求10或11所述的方法，包括施用调节RhoB GTP酶的试剂，其中所述试剂靶向GTP酶激活蛋白(GAP)、鸟苷酸交换因子(GEF)和鸟苷酸解离抑制剂(GDI)中的至少一种。
19.根据权利要求10或11所述的方法，还包括将所述受试者对于与RhoB GTP酶表达或活性相关的突变基因分型。
20.根据权利要求10或11所述的方法，还包括对选自编码选自GTP酶激活蛋白(GAP)、鸟苷酸交换因子(GEF)和鸟苷酸解离抑制剂(GDI)的蛋白的基因的基因进行基因分型，其中所述蛋白调节RhoB GTP酶。
21.一种工程设计细胞的方法，包括：
a)提供表达少量其他(先天)共受体的免疫细胞；
b)提供编码γ9-T细胞受体链的核酸序列和编码δ2-T细胞受体链的核酸序列，其中当CD277处于J构型时，所述γ9-T细胞受体链和所述δ2-T细胞受体链选择性结合所述CD277；
和
c)将步骤b)的核酸序列引入细胞中以提供具有包括步骤b)的γ9-T细胞受体链和步骤b)的δ2-T细胞受体链的γ9δ2T细胞受体的工程化的细胞。
22.一种对靶细胞筛选导致T细胞受体识别缺失的遗传或表观遗传变化的方法，包括：
a)将表达T细胞受体的细胞与靶细胞接触；
b)检测所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活水平；
c)将所述靶细胞识别为以下各项中的一种：
i)当免疫激活低于阈值水平时，具有所述遗传或表观遗传变化；或
ii)当免疫激活高于阈值水平时，不具有所述遗传或表观遗传变化；和
d)当免疫激活低于阈值水平时，将所述靶细胞基因型与对照基因型相比较以识别所述遗传或表观遗传变化。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述T细胞受体是Vγ9Vδ2T细胞受体。
25.根据权利要求22所述的方法，其中检测免疫激活水平包括定量所述表达T细胞受体的细胞所产生的至少一种细胞因子的产量。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞因子是干扰素-γ和TNFα中的至少一种。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述遗传或表观遗传变化是单核苷酸多态性。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞的合子型与所述具有遗传或表观遗传变化或者所述不具有遗传或表观遗传变化相关。
29.根据权利要求22所述的方法，还包括识别与所述遗传或表观遗传变化邻近的基因的步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述基因位于所述遗传或表观遗传变化的约
300,000个碱基对内。
31.根据权利要求29所述的方法，还包括调节所述基因的表达和评价调节对所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的量的影响的步骤。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述调节包括所述基因的敲除。
33.根据权利要求22所述的方法，其中所述表达T细胞受体的细胞是αβT细胞或γδT细胞中的至少一种。
34.根据权利要求22所述的方法，其中所述对照基因型是对照细胞的基因型，其中当与所述表达T细胞受体的细胞接触时，所述对照细胞导致所述表达T细胞受体的细胞免疫激活。
35.根据权利要求22所述的方法，其中所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少两倍的提高。
36.根据权利要求22所述的方法，其中所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少10倍的提高。
37.根据权利要求22所述的方法，其中所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少100倍的提高。
38.根据权利要求22所述的方法，其中所述接触包括将所述表达T细胞受体的细胞和所述对照细胞添加至相同容器。
39.根据权利要求22所述的方法，其中所述接触包括将所述表达T细胞受体的细胞和所述对照细胞添加至相同容器。
40.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是B细胞白血病细胞系。
41.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是爱泼斯坦巴尔病毒转化的细胞。
42.根据权利要求22所述的方法，其中所述遗传突变位于编码调节RhoGTP酶的蛋白的基因中。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述蛋白是GTP酶激活蛋白或鸟苷酸交换因子。
44.根据权利要求22所述的方法，其中所述遗传突变导致CD277和RhoB GTP酶之间相互作用的降低或抑制。
45.一种方法，包括：
a)对受试者筛选编码蛋白的基因中的突变，其中所述蛋白翻译后调节所述受试者的靶细胞中的RhoGTP酶；和
b)当所述突变不降低或抑制CD277中J构型的形成时，用Vγ9Vδ2TCR+T细胞介导的疗法治疗所述受试者。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述靶细胞是白血病细胞。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述蛋白是GTP酶激活蛋白或鸟苷酸交换因子。
49.根据权利要求45所述的方法，其中筛选包括所述基因或其部分的基因分型。
50.根据权利要求45所述的方法，其中筛选包括选自核酸扩增、测序和寡核苷酸探针杂交的方法。
51.一种清除对其有需要的受试者中癌细胞的方法，包括：
a)向所述受试者施用提高所述受试者的癌细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂；和b)施用表达Vγ9Vδ2T细胞受体的T细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了RhoB GTP酶的稳定性。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用。
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂激活了RhoB GTP酶。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂降低了RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用。
61.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了癌细胞中GTP的量。
62.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了癌细胞中GTP的利用度。
63.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂缀合至结合癌细胞上细胞表面分子的部分，借此将所述试剂靶向所述癌细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述部分包括小分子化合物。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述部分包括肽。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述部分包括抗体或抗原结合片段。
67.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂提高了癌细胞中胞内磷酸抗原的量。
68.根据权利要求51所述的方法，包括施用提高所述癌细胞中胞内磷酸抗原的量的其他试剂。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述其他试剂是甲羟戊酸途径抑制剂。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述甲羟戊酸途径抑制剂是氨基二膦酸酯。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述氨基二膦酸酯是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述受试者患有实体癌和白血病中的至少一种。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述白血病是急性髓细胞性白血病。
74.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试者在导致RhoB GTP酶表达或活性降低的基因中具有突变。
75.一种清除对其有需要的受试者中癌细胞的方法，包括：向所述受试者施用提高所述受试者的癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂。
76.根据权利要求75所述的方法，包括向所述受试者施用T细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述T细胞表达Vγ9Vδ2T细胞受体。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述T细胞已工程设计或基因修饰以表达Vγ9Vδ
2T细胞受体。
79.根据权利要求76所述的方法，其中所述T细胞已工程设计或基因修饰以过表达Vγ
9Vδ2T细胞受体。
80.根据权利要求51所述的方法，还包括施用细胞因子的剂量形式。
81.一种识别与靶细胞中受体激活有关的基因座的方法，所述方法包括：
a)识别在所述靶细胞中引起表型，包括所述受体激活的细胞；
b)识别显示出所述表型的细胞的合子型；
c)获得所述细胞的基因型信息，所述基因型信息限定了在不同细胞的多个基因座的每一个处的基因型；和
d)将所识别的细胞的合子型与整个细胞的多个基因座之一处的基因型相关联以识别激活基因座。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述基因型信息限定了所述多个基因座的每一个处的单核苷酸多态性。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述受体是Vγ9Vδ2T细胞受体或其片段。
84.根据权利要求81所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
85.根据权利要求81所述的方法，其中所述靶细胞是白血病细胞。
86.根据权利要求81所述的方法，其中所述表型是IFNγ的产生。
87.根据权利要求81所述的方法，其中基因与所述多个基因座中的至少一个邻近。
88.根据权利要求81所述的方法，其中所述受体激活包括选择性结合所述细胞类型的细胞上的CD277的J构型的所述靶细胞的多肽构建体。
89.根据权利要求81所述的方法，其中所述J构型与激活基因座有关。
90.一种方法，包括：
a)从受试者获得靶细胞；
b)将所述靶细胞与表达外源多肽构建体的至少一种修饰的效应细胞接触；
c)检测所述表达所述多肽构建体的修饰的效应细胞的免疫激活水平；和
d)当所述免疫激活高于阈值水平时，将所述靶细胞识别为具有核苷酸序列多态性。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述靶细胞中的一个或多个是癌细胞。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述外源多肽构建体包括Vγ9Vδ2T细胞受体或其片段。
93.根据权利要求90所述的方法，其中所述检测免疫激活水平包括定量所述表达外源多肽构建体的修饰的效应细胞所产生的至少一种细胞因子的产量。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述细胞因子是干扰素-γ。
95.根据权利要求90所述的方法，其中所述核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。
96.根据权利要求90所述的方法，还包括识别与所述核苷酸序列多态性邻近的基因的步骤。
97.根据权利要求90所述的方法，其中所述基因位于所述核苷酸序列多态性的约300,
000个碱基对内。
98.根据权利要求90所述的方法，还包括用有效量的所述外源多肽构建体治疗受试者的步骤。
99.根据权利要求90所述的方法，其中所述表达多肽构建体的修饰的效应细胞是T细胞。
100.根据权利要求90所述的方法，其中所述将所述靶细胞与表达外源多肽构建体的至少一种修饰的效应细胞接触包括将所述靶细胞中的至少一种的表面上的CD277分子与所述外源多肽构建体接触。
101.根据权利要求90所述的方法，其中所述外源多肽构建体选择性结合CD277分子的J构型。
102.一种方法，包括：
a)从受试者获得表达CD277的靶细胞；
b)将所述靶细胞与表达选择性结合CD277分子的J构型的外源多肽构建体的细胞接触；
和
c)检测所述多肽构建体对CD277分子的J构型的识别。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述靶细胞中的一个或多个是癌细胞。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述多肽构建体包括Vγ9Vδ2T细胞受体或其片段。
105.根据权利要求102所述的方法，其中所述检测CD277分子的J构型的识别包括定量所述表达多肽构建体的细胞所产生的至少一种细胞因子的产量。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述细胞因子是干扰素-γ。
107.根据权利要求102所述的方法，还包括向所述受试者提供有效量的所述多肽构建体。
108.根据权利要求102所述的方法，其中所述表达多肽构建体的细胞是T细胞。
109.一种预测受试者中对使用能够识别CD277的多肽构建体或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞的治疗的阳性治疗性反应的方法，所述方法包括：
a)将所述患者的靶细胞识别为具有与RhoB活性相关的核苷酸序列多态性；和b)基于所述将所述靶细胞识别为具有核苷酸序列多态性，预测所述受试者将显示出阳性治疗性反应。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述多肽构建体识别CD277的J构型。
111.根据权利要求109所述的方法，还包括向所述受试者施用所述多肽构建体。
112.根据权利要求109所述的方法，其中所述靶细胞中的一个或多个是癌细胞。
113.根据权利要求90所述的方法，其中所述核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。
114.根据权利要求109所述的方法，其中与缺少所述核苷酸序列多态性的受试者中的RhoB活性相比，所述RhoB的活性是高活性。
115.根据权利要求109所述的方法，还包括基于将第二受试者的靶细胞识别为缺少所述核苷酸序列多态性，预测所述第二受试者中不良治疗反应的步骤。
116.一种方法，包括：
a)从第一受试者获得表达CD277分子的第一组细胞；
b)将所述第一组细胞识别为具有以下各项中的至少一种：
i)与得自第二受试者的第二组靶细胞相比，高RhoB活性；和
ii)与RhoB的高活性有关的核苷酸序列多态性；和
c)向所述第一受试者施用与所述第二组细胞上的CD277构型相比，对所述第一组细胞上的CD277构型具有选择性亲和力的多肽构建体，或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述第一组细胞中的一个或多个是癌细胞。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述第一组细胞中的一个或多个是白血病细胞。
119.根据权利要求116所述的方法，其中所述第一组细胞上的CD277构型是J构型。
120.根据权利要求90所述的方法，其中所述核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。
121.一种预测受试者中对使用能够识别CD277分子的多肽构建体或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞的治疗的阳性治疗性反应的方法，所述方法包括：
a)从所述受试者获得表达CD277分子的靶细胞；
b)识别所述靶细胞中所表达的CD277分子的J构型；和
c)基于所述CD277分子的J构型的识别，预测所述受试者将显示出阳性治疗性反应。
122.根据权利要求121所述的方法，还包括向所述受试者施用所述多肽构建体的步骤。
123.根据权利要求121所述的方法，还包括基于将第二受试者的靶细胞的CD277分子识别为缺少所述J构型，预测所述第二受试者中不良治疗反应的步骤。
124.根据权利要求121所述的方法，其中所述靶细胞中的一个或多个是癌细胞。
125.根据权利要求121所述的方法，还包括识别与所述靶细胞中RhoB活性有关的核苷酸序列多态性的步骤。
126.根据权利要求125所述的方法，其中与缺少所述核苷酸序列多态性的受试者中的RhoB活性相比，所述RhoB的活性是高活性。
127.根据权利要求125或126所述的方法，其中所述核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。
128.根据权利要求125或126所述的方法，其中所述预测基于所述CD277分子的J构型的识别和所述核苷酸序列多态性的识别两者。
129.一种治疗受试者中癌症的方法，其中所述受试者具有CD277阳性的癌细胞，其包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括选择性结合至所述癌细胞上的CD277的J构型的药学上可接受的试剂。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述药学上可接受的试剂包括选择性结合至所述癌细胞上的CD277的J构型的多肽构建体。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种。
132.根据权利要求130所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述γ-TCR多肽序列是γ9-TCR多肽序列或其片段。
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述δ-TCR多肽序列是δ2-TCR多肽序列或其片段。
135.根据权利要求129所述的方法，其中与未处于所述J构型的CD277分子相比，所述药学上可接受的试剂以更高的选择性结合CD277的J构型。
136.根据权利要求129所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
137.根据权利要求129所述的方法，其中所述靶细胞是白血病细胞。
138.根据权利要求129所述的方法，其中所述CD277作为二聚体存在。
139.一种药物组合物，其包含：
a.选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的剂量形式或者表达所述选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体的细胞的剂量形式；和
b.以下各项中的至少一种：
i.提高所述癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式；和
ii.提高所述癌细胞中的磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。
140.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和所述提高磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。
141.根据权利要求139所述的药物组合物，其中当所述药物组合物包含所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和所述提高磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式时，在所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂之前、同时或之后施用所述提高磷酸抗原的活性的试剂。
142.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂提高了所述RhoB GTP酶向所述癌细胞的细胞膜的移位，将RhoB GTP酶维持在所述癌细胞的细胞膜，提高了所述RhoBGTP酶远离所述癌细胞核的移位，提高了编码所述RhoB GTP酶的基因或转录本的表达，提高了所述RhoB GTP酶的稳定性，提高了所述RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用，激活了RhoB GTP酶，提高了所述RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用，降低了所述RhoBGTP酶和GDP之间的相互作用，提高了所述癌细胞中GTP的量，提高了所述癌细胞中GTP的利用度，或它们的任何组合。
143.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述CD27处于J构型。
144.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种。
145.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。
146.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中所述γ-TCR多肽序列是γ9-TCR多肽序列或其片段。
147.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中所述δ-TCR多肽序列是δ2-TCR多肽序列或其片段。
148.根据权利要求139所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用于包含实体癌和白血病中的至少一种的受试者。
149.根据权利要求139所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用于包括急性髓细胞性白血病的受试者。
150.根据权利要求139所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用于受试者，并且其中所述受试者在与RhoB GTP酶表达或活性相关的基因中包括突变。
151.根据权利要求139所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用于受试者，并且其中所述受试者在与RhoB GTP酶表达或活性降低相关的基因中包括突变。
152.根据权利要求139所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用于受试者，并且其中所述受试者在与CD277和RhoB GTP酶之间的相互作用降低或抑制相关的基因中包括突变。
153.根据权利要求139所述的药物组合物，其中通过间接或直接结合所述RhoB GTP酶来发挥所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂的作用。
154.根据权利要求139所述的药物组合物，其中通过间接或直接结合所述RhoB GTP酶来发挥所述提高磷酸抗原的活性的试剂的作用。
155.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述多肽构建体的剂量形式包括与表3或表4中的序列具有至少60％的同一性的序列。
156.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述提高磷酸抗原的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂。
157.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述提高磷酸抗原的活性的试剂是氨基二膦酸酯。
158.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述提高磷酸抗原的活性的试剂是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。
159.根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂提高了所述RhoB GTP酶向所述癌细胞的细胞膜的移位，将RhoB GTP酶维持在所述癌细胞的细胞膜，提高了所述RhoBGTP酶远离所述癌细胞核的移位，提高了所述癌细胞中编码所述RhoB GTP酶的基因或转录本的表达，提高了所述癌细胞中所述RhoB GTP酶的稳定性，提高了所述癌细胞中所述RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用，激活了所述癌细胞中的RhoB GTP酶，提高了所述癌细胞中所述RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用，降低了所述癌细胞中所述RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用，提高了所述癌细胞中GTP的量，提高了所述癌细胞中GTP的利用度，或它们的任何组合。
160.一种治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用根据权利要求139至159中任一项所述的药物组合物。
161.根据权利要求160所述的治疗方法，其中所述受试者在与CD277和RhoB GTP酶之间的相互作用降低或抑制相关的基因中包括突变。
162.根据权利要求160所述的治疗方法，其中所述受试者包含实体癌和白血病中的至少一种。
163.一种治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用包含选自：提高所述受试者的癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的试剂的药物组合物，包含选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体的药物组合物。
164.根据权利要求166所述的方法，还包括向所述对其有需要的受试者施用提高所述对其有需要的受试者的所述癌细胞中的磷酸抗原的活性的试剂。
165.一种治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用：
a.选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的剂量形式或者表达所述选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体的细胞的剂量形式；和
b.以下各项中的至少一种：
i.提高所述癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式；和
ii.提高所述癌细胞中的磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述治疗包括施用所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和所述提高磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。
167.根据权利要求165所述的方法，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂。
168.根据权利要求165所述的方法，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂，所述甲羟戊酸途径抑制剂是氨基二膦酸酯。
169.根据权利要求165所述的方法，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂，所述甲羟戊酸途径抑制剂是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。
170.根据权利要求165所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。
171.根据权利要求165所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中所述γ-TCR多肽序列是γ9-TCR多肽序列或其片段。
172.根据权利要求165所述的方法，其中所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中所述δ-TCR多肽序列是δ2-TCR多肽序列或其片段。
173.根据权利要求165所述的方法，其中所述细胞是αβT细胞。
174.根据权利要求165所述的方法，其中通过间接或直接结合所述磷酸抗原来发挥所述提高磷酸抗原的活性的试剂的作用。
175.根据权利要求165所述的方法，还包括施用包含细胞因子的剂量形式。
176.根据权利要求165所述的方法，其中所述多肽构建体的剂量形式包括与表3或表4中的序列具有至少60％的同一性的序列。
177.一种治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用包含提高所述受试者的癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的药物组合物，和包含表达Vγ9Vδ2T细胞受体的细胞的药物组合物，其中与分离自缺少所述施用的相当受试者的相当T细胞相比，分离自所述受试者的T细胞分泌至少1倍的小蛋白。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述小蛋白是细胞因子。
179.根据权利要求177所述的方法，其中所述小蛋白是细胞因子并且是IFNγ。
180.根据权利要求177所述的方法，其中所述分离自所述受试者的T细胞比分离自缺少所述施用的相当受试者的相当T细胞分泌多至少5倍的小蛋白。
181.根据权利要求177所述的方法，其中所述分离自所述受试者的T细胞比分离自缺少所述施用的相当受试者的相当T细胞分泌多至少10倍的小蛋白。
182.一种治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用提高癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和提高所述癌细胞中的磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。
183.根据权利要求185所述的方法，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂。
184.根据权利要求185所述的方法，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂，所述甲羟戊酸途径抑制剂是氨基二膦酸酯。
185.根据权利要求185所述的方法，其中所述提高RhoB GTP酶的活性的试剂是甲羟戊酸途径抑制剂，所述甲羟戊酸途径抑制剂是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。
186.根据权利要求185所述的方法，其中通过间接或直接结合所述磷酸抗原来发挥所述提高磷酸抗原的活性的试剂的作用。
187.根据权利要求182所述的方法，还包括施用选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体的剂量形式或者表达所述选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体的细胞的剂量形式。
用于细胞靶向疗法的组合物和方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本发明申请主张2017年5月18日提交的美国临时专利申请号62/508,272和2017年5月19日提交的美国临时专利申请号62/508,833的优先权，以上每篇专利出于所有目的作为参考完全并入本文。
[0004] 本发明申请包含以ASCII格式电子提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2018年5月17日创建的所述ASCII拷贝的名称为51887-706_601_SL.txt并且大小为
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背景技术
[0005] 正在开发具有工程设计的抗肿瘤特异性或抗病原体特异性的T细胞的继承性转移。在这些策略中，将外源免疫受体如αβT细胞受体或者γδT细胞受体或具有特定抗肿瘤特异性或特定抗病原体特异性的嵌合抗原受体转移至来自患者的自体同源的T细胞，或者在向患者同种异体干细胞移植的情况下，转移到相应同种异体T细胞中。例如，经历血液干细胞移植的白血病患者在治疗期间也将是淋巴耗竭(lymphodepleted)的。因此，该患者也可以受益于(例如)已工程设计以表达特定抗白血病T细胞受体的供体T细胞的输注。本文描述了包含表达选择性识别一种或多种MHC相关基因所表达的蛋白中的独特构型的受体的细胞的组合物和方法，其中该独特构型与一种或多种疾病状况有关。
[0006] 作为参考并入
发明内容
[0008] 本文提供了药物组合物，包括选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的剂量形式或者表达所述选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的细胞的剂量形式；和(i)提高RhoB GTP酶在所述癌细胞中的活性的试剂的剂量形式；和(ii)提高磷酸抗原在所述癌细胞中的活性的试剂的剂量形式中的至少一种。在一个方面，药物组合物包括提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和提高磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。在一个方面，药物组合物包括提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和提高磷酸抗原的活性的试剂的剂
量形式，其中在提高RhoB GTP酶的活性的试剂之前，同时或之后施用提高磷酸抗原的活性的试剂。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂提高了RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位，将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜，提高了RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位，提高了编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达，提高了RhoB GTP酶的稳定性，提高了RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用，激活RhoB GTP酶，提高了RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用，降低了RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用，提高了癌细胞中GTP的量，提高了癌细胞中GTP的利用度，或它们的任何组合。在一个方面，CD277可以处于J构型。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中γ-TCR多肽序列可以是γ9-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中δ-TCR多肽序列可以是δ2-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，可以将药物组合物施用于包括实体癌和白血病中的至少一种的受试者。在一个方面，可以将药物组合物施用于包括急性髓细胞性白血病的受试者。在一个方面，可以将药物组合物施用于受试者。受试者可以在与RhoB GTP酶表达或活性相关的基因中包括突变。在一个方面，可以将药物组合物施用于受试者，其中受试者在与RhoB GTP酶表达或活性降低相关的基因中包括突变。在一个方面，可以将药物组合物施用于受试者，其中受试者在与CD277和RhoB GTP酶之间的相互作用降低或受抑制的基因中包括突变。在一个方面，可以通过间接或直接结合RhoB GTP酶来发挥提高RhoB GTP酶的活性的试剂。在一个方面，可以通过间接或直接结合RhoB GTP酶来发挥提高磷酸抗原的活性的试剂。在一个方面，多肽构建体的剂量形式包括与表3或表4中的序列具有至少60％的同一性的序列。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以是氨基二膦酸酯。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂提高了
RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位，将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜，提高了RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位，提高了癌细胞中编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达，提高了癌细胞中RhoB GTP酶的稳定性，提高了癌细胞中RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用，激活了癌细胞中的RhoB GTP酶，提高了癌细胞中RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用，降低了癌细胞中RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用，提高了癌细胞中GTP的量，提高了癌细胞中GTP的利用度，或它们的任何组合。
量形式，其中在提高RhoB GTP酶的活性的试剂之前，同时或之后施用提高磷酸抗原的活性的试剂。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂提高了RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位，将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜，提高了RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位，提高了编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达，提高了RhoB GTP酶的稳定性，提高了RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用，激活RhoB GTP酶，提高了RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用，降低了RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用，提高了癌细胞中GTP的量，提高了癌细胞中GTP的利用度，或它们的任何组合。在一个方面，CD277可以处于J构型。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中γ-TCR多肽序列可以是γ9-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中δ-TCR多肽序列可以是δ2-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，可以将药物组合物施用于包括实体癌和白血病中的至少一种的受试者。在一个方面，可以将药物组合物施用于包括急性髓细胞性白血病的受试者。在一个方面，可以将药物组合物施用于受试者。受试者可以在与RhoB GTP酶表达或活性相关的基因中包括突变。在一个方面，可以将药物组合物施用于受试者，其中受试者在与RhoB GTP酶表达或活性降低相关的基因中包括突变。在一个方面，可以将药物组合物施用于受试者，其中受试者在与CD277和RhoB GTP酶之间的相互作用降低或受抑制的基因中包括突变。在一个方面，可以通过间接或直接结合RhoB GTP酶来发挥提高RhoB GTP酶的活性的试剂。在一个方面，可以通过间接或直接结合RhoB GTP酶来发挥提高磷酸抗原的活性的试剂。在一个方面，多肽构建体的剂量形式包括与表3或表4中的序列具有至少60％的同一性的序列。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以是氨基二膦酸酯。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂提高了
RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位，将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜，提高了RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位，提高了癌细胞中编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达，提高了癌细胞中RhoB GTP酶的稳定性，提高了癌细胞中RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用，激活了癌细胞中的RhoB GTP酶，提高了癌细胞中RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用，降低了癌细胞中RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用，提高了癌细胞中GTP的量，提高了癌细胞中GTP的利用度，或它们的任何组合。
[0009] 本文公开了治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用药物组合物。在一个方面，受试者在与CD277和RhoB GTP酶之间的相互作用降低或受抑制相关的基因中包括突变。在一个方面，受试者包括实体癌和白血病中的至少一种。
[0010] 本文公开了治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用包含选自以下组成的组的试剂的药物组合物：提高受试者的癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂，包含选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体的药物组合物。在一个方面，方法还可以包括向对其有需要的受试者施用提高对其有需要的受试者的癌细胞中的磷酸抗原的活性的试剂。
[0011] 本文公开了治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的剂量形式或者表达所述选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体
的细胞的剂量形式；和(i)提高RhoB GTP酶在所述癌细胞中的活性的试剂的剂量形式；和(ii)提高磷酸抗原在所述癌细胞中的活性的试剂的剂量形式中的至少一种。在一个方面，治疗包括施用提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和提高磷酸抗原的活性的试剂的
剂量形式。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂，其可以是氨基二膦酸酯。
在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂，其可以是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中γ-TCR多肽序列可以是γ9-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中δ-TCR多肽序列可以是δ2-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，细胞可以是αβT细胞。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂通过间接或直接结合磷酸抗原发挥作用。在一个方面，方法还可以包括施用包含细胞因子的剂量形式。在一个方面，多肽构建体的剂量形式包括与表3或表4中的序列具有至少60％的同一性的序列。
的细胞的剂量形式；和(i)提高RhoB GTP酶在所述癌细胞中的活性的试剂的剂量形式；和(ii)提高磷酸抗原在所述癌细胞中的活性的试剂的剂量形式中的至少一种。在一个方面，治疗包括施用提高RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和提高磷酸抗原的活性的试剂的
剂量形式。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂，其可以是氨基二膦酸酯。
在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂，其可以是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中γ-TCR多肽序列可以是γ9-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段，并且其中δ-TCR多肽序列可以是δ2-TCR多肽序列或其片段。在一个方面，细胞可以是αβT细胞。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂通过间接或直接结合磷酸抗原发挥作用。在一个方面，方法还可以包括施用包含细胞因子的剂量形式。在一个方面，多肽构建体的剂量形式包括与表3或表4中的序列具有至少60％的同一性的序列。
[0012] 本文公开了治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用包含提高受试者的癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的药物组合物，和包含表达Vγ9Vδ2 T细胞受体的细胞的药物组合物，其中与分离自缺少施用的相当受试者的相当T细胞相比，分离自受试者的T细胞分泌至少1倍的小蛋白。在一个方面，小蛋白可以是细胞因子。在一个方面，小蛋白可以是细胞因子并且是IFNγ。在一个方面，分离自受试者的T细胞比分离自缺少施用的相当受试者的相当T细胞分泌多至少5倍的小蛋白。在一个方面，分离自受试者的T细胞比分离自缺少施用的相当受试者的相当T细胞分泌多至少10倍的小蛋白。
[0013] 本文公开了治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用提高癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的剂量形式和提高癌细胞中的磷酸抗原的活性的试剂的剂量形式。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂，其可以是氨基二膦酸酯。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以是甲羟戊酸途径抑制剂，其可以是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂通过间接或直接结合磷酸抗原发挥作用。在一个方面，方法还可以包括施用选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的剂量形式或者表达所述选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体的细胞的剂量形式。
[0014] 本文提供了包含表达选择性结合靶细胞上的CD277的J构型(J-configuration)或J结构(J-confirmation)的多肽构建体的工程化的细胞的组合物。在一些情况下，提供了本文所描述的选择性结合靶细胞上的CD277的J构型的多肽构建体，其中在工程化的细胞中表达所述多肽构建体。还提供了引入本文所描述的选择性结合靶细胞上的CD277的J构型的多肽构建体的核苷酸序列。
[0015] 本文提供了包含选择性结合靶细胞上的CD277的J构型的多肽构建体，编码所述多肽构建体的核苷酸或者表达所述多肽构建体的细胞的方法和组合物。在一些实施方式中，结合靶细胞上的CD277的J构型的多肽构建体包括至少一种γδT细胞受体或其片段或变体。
[0016] 本文提供了包含工程化的细胞(engineered cells)的组合物，该工程化的细胞表达选择性结合至由于窘迫细胞(distressed cells)，如癌细胞中的代谢变化所形成的CD277的构型的多肽构建体，其中所述代谢变化导致转化或窘迫时上调的一般胁迫分子的表达。在某些实施方式中，这种构型可以是J构型。在一些情况下，由于所述窘迫细胞内RhoB的迁移形成了CD277的J构型。
[0017] 本文提供了表达包含γδT细胞受体(TCR)或其片段的多肽构建体的工程化的细胞，其选择性结合靶细胞上的CD277的J构型。在某些情况下，γδT细胞受体(TCR)或其片段包括Vγ9和Vδ2链及其片段中的至少一种。在一些情况下，本文描述了可以结合至少一种其他试剂提供至受试者的工程化的细胞，所述其他试剂选自哺乳动物甲羟戊酸途径的中间产物，如异戊烯焦磷酸酯(IPP)和微生物的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸酯(MEP)途径的中间产物。
[0018] 本文提供了识别特定细胞例如肿瘤细胞中预定受体激活介体的无偏的、基因组范围的筛选方法。提供了用于在无偏的、基因组范围的筛选方法中使用的系统和试剂盒。本文还公开了靶向通过本文所描述的筛选方法所识别的介体的组合物。在具体的实施方式中，组合物对于促进或恢复预定受体如Vγ9Vδ2 TCR的最优激活是有用的。
[0019] 在某些实施方式中是为受益于靶向细胞清除的病况如癌症提供有效疗法的方法，所述方法包括提供包含本文所描述的多肽构建体、编码所述多肽构建体的核苷酸或者表达所述多肽构建体的细胞和可选地对于促进CD277的J构型的形成或者多肽构建体与所述J构型的结合有用的至少一种试剂的组合物。
[0020] 本文提供了包含选择性结合靶细胞上的CD277的J构型的多肽构建体的药物组合物，并且其中在工程化的细胞中表达所述多肽构建体。在一些实施方式中，与未处于所述J构型的CD277分子相比，所述多肽构建体以更高的选择性结合CD277的J构型。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，靶细胞是白血病细胞。
[0021] 在一些实施方式中，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种，或者γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。在一些实施方式中，γ-TCR多肽序列是γ9-TCR多肽序列或其片段。在一些实施方式中，δ-TCR多肽序列是δ2-TCR多肽序列或其片段。在另一个实施方式中，CD277作为二聚体存在。
[0022] 本文提供了治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者提供有效量的药物组合物，所述药物组合物包括当所述CD277分子处于J构型时，选择性结合癌细胞上的CD277的多肽构建体，并且其中所述多肽构建体可选地在工程化的细胞中表达。本文还提供了清除对其有需要的受试者中癌细胞的方法，包括向受试者提供有效量的药物组合物，所述药物组合物包括当所述CD277分子处于J构型时，选择性结合所述癌细胞上的CD277的多肽构建体，或者有效量的表达所述多肽构建体的工程化的细胞。
[0023] 在一些情况下，与未处于所述J构型的CD277分子相比，所述多肽构建体以更高的选择性识别CD277的J构型。在一些实施方式中，所述J构型的形成需要至少RhoB与CD277的相互作用和/或CD277的区室化。在一些实施方式中，所述J构型的形成需要在所述RhoB与CD277的所述相互作用之后，胞内磷酸抗原与CD277的相互作用。在一些情况下，所述多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种，或者γ-TCR多肽序列或者δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。
[0024] 在一些情况下，所述方法包括施用提高RhoB GTP酶向所述癌细胞的细胞膜的移位的试剂，或者施用调节RhoB GTP酶的试剂，其中所述试剂靶向GTP酶激活蛋白(GAP)、鸟苷酸交换因子(GEF)和鸟苷酸解离抑制剂(GDI)中的至少一种。在一些情况下，所述方法包括将所述受试者对于与RhoB GTP酶表达或活性相关的突变基因分型。在一些情况下，所述方法包括对选自编码选自GTP酶激活蛋白(GAP)、鸟苷酸交换因子(GEF)和鸟苷酸解离抑制剂(GDI)的蛋白的基因的基因进行基因分型，其中所述蛋白调节RhoB GTP酶。
[0025] 本文提供了工程设计T细胞的方法，包括：a)提供表达少量其他(先天)共受体的免疫细胞；b)提供编码γ9-T细胞受体链的核酸序列和编码δ2-T细胞受体链的核酸序列，其中当CD277处于J构型时，γ9-T细胞受体链和δ2-T细胞受体链选择性结合CD277；和c)将步骤b)的核酸序列引入T细胞中以提供具有包括步骤b)的γ9-T细胞受体链和步骤b)的δ2-T细胞受体链的γ9δ2T细胞受体的工程化T细胞。
[0026] 本文还提供了对靶细胞筛选导致T细胞受体识别缺失的遗传或表观遗传变化的方法，包括a)将表达T细胞受体的细胞与靶细胞接触；b)检测所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活水平；c)将靶细胞识别为以下各项中的一种：i)当免疫激活低于阈值水平时，具有遗传或表观遗传变化；或ii)当免疫激活高于阈值水平时，不具有遗传或表观遗传变化；和d)当免疫激活低于阈值水平时，将靶细胞基因型与对照基因型相比较以识别遗传或表观遗传变化。
[0027] 在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在一些情况下，T细胞受体是Vγ9Vδ2 T细胞受体。在一些情况下，检测免疫激活水平包括定量表达T细胞受体的细胞所产生的至少一种细胞因子的产量。在一些实施方式中，细胞因子是干扰素-γ和TNFα中的至少一种。在一些情况下，遗传或表观遗传变化是单核苷酸多态性。在一些情况下，靶细胞的合子型与所述具有遗传或表观遗传变化或者所述不具有遗传或表观遗传变化相关。在一些情况下，方法还包括识别与遗传或表观遗传变化邻近的基因的步骤。在一些情况下，基因位于遗传或表观遗传变化的约300,000个碱基对内。
[0028] 在一些实施方式中，方法还包括调节基因的表达和评价调节对表达T细胞受体的细胞的免疫激活的量的影响的步骤。在一些情况下，所述调节包括基因的敲除。在一些情况下，表达靶细胞的T细胞受体的细胞是T细胞。在一些情况下，对照基因型是对照细胞的基因型，其中当与表达T细胞受体的细胞接触时，对照细胞导致表达T细胞受体的细胞免疫激活。
在一些情况下，所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少两倍的提高。在一些情况下，表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少10倍的提高。在一些情况下，所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少100倍的提高。在一些情况下，所述接触包括将表达T细胞受体的细胞和对照细胞添加至相同容器。在一些情况下，接触包括将表达T细胞受体的细胞和对照细胞添加至相同容器。
在一些情况下，所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少两倍的提高。在一些情况下，表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少10倍的提高。在一些情况下，所述表达T细胞受体的细胞的免疫激活的特征在于细胞因子的产量或类似功能读数至少100倍的提高。在一些情况下，所述接触包括将表达T细胞受体的细胞和对照细胞添加至相同容器。在一些情况下，接触包括将表达T细胞受体的细胞和对照细胞添加至相同容器。
[0029] 在一些实施方式中，靶细胞是B细胞白血病细胞系。在一些实施方式中，靶细胞是爱泼斯坦巴尔病毒转化的细胞。在一些实施方式中，遗传突变位于编码调节RhoGTP酶的蛋白的基因中。在一些情况下，蛋白是GTP酶激活蛋白或鸟苷酸交换因子。在一些情况下，遗传突变导致CD277和RhoB GTP酶之间相互作用的降低或抑制。
[0030] 本文提供了方法，包括a)对受试者筛选编码蛋白的基因中的突变，其中蛋白翻译后调节受试者的靶细胞中的RhoGTP酶；和b)当突变不降低或抑制CD277中J构型的形成时，用Vγ9Vδ2 TCR+T细胞介导的疗法治疗受试者。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，靶细胞是白血病细胞。在一些实施方式中，蛋白是GTP酶激活蛋白或鸟苷酸交换因子。在一些实施方式中，筛选包括基因或其部分的基因分型。在一些实施方式中，筛选包括选自核酸扩增、测序和寡核苷酸探针杂交的方法。
[0031] 本文提供了清除对其有需要的受试者中癌细胞的方法，包括a)向受试者施用提高受试者的癌细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂；和b)施用表达Vγ9Vδ2 T细胞受体的T细胞。在一些实施方式中，试剂提高了RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位。在一些实施方式中，试剂将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜。在一些实施方式中，试剂提高了RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位。在一些实施方式中，试剂提高了编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达。在一些实施方式中，试剂提高了RhoB GTP酶的稳定性。在一些实施方式中，试剂提高了RhoB GTP酶和CD277之间的相互作用。在一些实施方式中，试剂激活了RhoB GTP酶。在一些实施方式中，试剂提高了RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用。在一些实施方式中，试剂降低了RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用。
[0032] 在一些情况下，试剂提高了癌细胞中GTP的量。在一些情况下，试剂提高了癌细胞中GTP的利用度。在一些情况下，试剂缀合至结合癌细胞上细胞表面分子的部分，借此将试剂靶向癌细胞。在一些情况下，部分包括小分子化合物。在一些情况下，部分包括肽。在一些情况下，部分包括抗体或抗原结合片段。在一些情况下，试剂提高了癌细胞中胞内磷酸抗原的量。
[0033] 在一些情况下，方法包括施用提高癌细胞中胞内磷酸抗原的量的其他试剂。在一些情况下，其他试剂是甲羟戊酸途径抑制剂。在一些实施方式中，甲羟戊酸途径抑制剂是氨基二膦酸酯。在一些实施方式中，氨基二膦酸酯是帕米膦酸和唑来膦酸中的至少一种。在一个方面，受试者患有实体癌和白血病中的至少一种。在一些情况下，白血病是急性髓细胞性白血病。在一些情况下，受试者在导致RhoB GTP酶表达或活性降低的基因中具有突变。
[0034] 本文提供了清除对其有需要的受试者中的癌细胞的方法，包括：向受试者施用提高受试者的癌细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂。在一些情况下，方法包括向受试者施用T细胞。在一些情况下，T细胞表达Vγ9Vδ2 T细胞受体。在一些情况下，对T细胞工程设计或基因修饰以表达Vγ9Vδ2 T细胞受体。在一些情况下，对T细胞工程设计或基因修饰以过表达Vγ9Vδ2 T细胞受体。
[0035] 本文提供了包括多肽构建体和细胞毒细胞的系统，其中当所述CD277复合至所述靶细胞上的RhoB GTP酶时，多肽构建体选择性结合靶细胞上的CD277，并且其中在工程化的细胞中表达所述多肽构建体。
[0036] 本文还提供了识别与靶细胞中受体激活有关的基因座的方法，方法包括a)识别在靶细胞中引起表型的细胞，表型包括所述受体激活；b)识别显示出表型的细胞的合子型(zygocity)；c)获得细胞的基因型信息，基因型信息限定了在不同细胞的多个基因座的每一个处的基因型；和d)将所识别的细胞的合子型与整个细胞的多个基因座之一处的基因型相关联以识别激活基因座。
[0037] 在一些实施方式中，基因型信息限定了多个基因座的每一个处的单核苷酸多态性。在一些情况下，受体是Vγ9Vδ2 T细胞受体或其片段。在一些情况下，靶细胞是癌细胞。
在一些情况下，靶细胞是白血病细胞系。在一些情况下，所述表型是IFNγ的产生。在一些情况下，基因与多个基因座中的至少一个邻近。在一些情况下，所述受体激活包括选择性结合细胞类型的细胞上的CD277的J构型的靶细胞的多肽构建体。在一些情况下，J构型与激活基因座有关。
在一些情况下，靶细胞是白血病细胞系。在一些情况下，所述表型是IFNγ的产生。在一些情况下，基因与多个基因座中的至少一个邻近。在一些情况下，所述受体激活包括选择性结合细胞类型的细胞上的CD277的J构型的靶细胞的多肽构建体。在一些情况下，J构型与激活基因座有关。
[0038] 本文提供了方法，包括a)从受试者获得靶细胞；b)将所述靶细胞与表达外源多肽构建体的至少一种修饰的效应细胞接触；c)检测表达所述多肽构建体的所述修饰的效应细胞的免疫激活水平；和d)当所述免疫激活高于阈值水平时，将靶细胞识别为具有核苷酸序列多态性。
[0039] 在一些情况下，靶细胞中的一个或多个是癌细胞。在一些情况下，外源多肽构建体包括Vγ9Vδ2 T细胞受体或其片段。在一些情况下，所述检测免疫激活水平包括定量表达外源多肽构建体的修饰的效应细胞所产生的至少一种细胞因子的产量。在一些情况下，细胞因子是干扰素-γ。在一些情况下，核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。
[0040] 在一些情况下，方法还包括识别与核苷酸序列多态性邻近的基因的步骤。在一些情况下，基因位于核苷酸序列多态性的约300,000个碱基对内。在一些实施方式中，方法还包括用有效量的所述外源多肽构建体治疗受试者的步骤。在一些情况下，表达多肽构建体的修饰的效应细胞是T细胞。在一些情况下，将靶细胞与表达外源多肽构建体的至少一种修饰的效应细胞所述接触包括将所述靶细胞中的至少一种的表面上的CD277分子与所述外源多肽构建体接触。在一些情况下，所述外源多肽构建体选择性结合CD277分子的J构型。
[0041] 本文提供了方法，包括a)从受试者获得表达CD277的靶细胞；b)将靶细胞与表达选择性结合CD277分子的J构型的外源多肽构建体的细胞接触；和c)检测多肽构建体对CD277分子的J构型的识别。在一些实施方式中，靶细胞中的一个或多个是癌细胞。在一些情况下，多肽构建体包括Vγ9Vδ2 T细胞受体或其片段。在一些情况下，所述检测CD277分子的J构型的识别包括定量表达多肽构建体的细胞所产生的至少一种细胞因子的产量。在一些情况下，细胞因子是干扰素-γ。在一些情况下，方法还包括向所述受试者提供有效量的所述多肽构建体。在一些情况下，表达多肽构建体的细胞是T细胞。
[0042] 本文提供了预测受试者中对使用能够识别CD277的多肽构建体或者表达多肽构建体的工程化的细胞的治疗的阳性治疗性反应的方法，方法包括a)将患者的靶细胞识别为具有与RhoB活性相关的核苷酸序列多态性；和b)基于所述将靶细胞识别为具有核苷酸序列多态性，预测受试者将显示出阳性治疗性反应。在一些实施方式中，多肽构建体识别CD277的J构型并与之直接结合，或者通过一种或多种其他生物试剂间接结合。
[0043] 在一些实施方式中，方法还包括向受试者施用多肽构建体。在一些实施方式中，靶细胞中的一个或多个是癌细胞。在一些情况下，核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。在一些情况下，与缺少核苷酸序列多态性的受试者中的RhoB活性相比，所述RhoB的活性是高活性。在一些情况下，方法还包括基于将第二受试者的靶细胞识别为缺少核苷酸序列多态性，预测第二受试者中不良治疗反应的步骤。
[0044] 本文提供了方法，包括a)从第一受试者获得表达CD277分子的第一组细胞；b)将所述第一组细胞识别为具有以下各项中的至少一种：i)与得自第二受试者的第二组靶细胞相比，高RhoB活性；和ii)与RhoB的高活性有关的核苷酸序列多态性；和c)向所述第一受试者施用与所述第二组细胞上的CD277构型相比，对所述第一组细胞上的CD277构型具有选择性亲和力的多肽构建体，或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞。
[0045] 在一些情况下，所述第一组细胞中的一个或多个是癌细胞。在一些情况下，第一组细胞中的一个或多个是白血病细胞。在一些情况下，所述第一组细胞上的CD277构型是J构型。在一些实施方式中，核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。
[0046] 本文提供了预测受试者中对使用能够识别CD277分子的多肽构建体或者表达多肽构建体的工程化的细胞的治疗的阳性治疗性反应的方法，方法包括a)从受试者获得表达
CD277分子的靶细胞；b)识别靶细胞中所表达的CD277分子的J构型；和c)基于CD277分子的J构型的所述识别，预测受试者将显示出阳性治疗性反应。
CD277分子的靶细胞；b)识别靶细胞中所表达的CD277分子的J构型；和c)基于CD277分子的J构型的所述识别，预测受试者将显示出阳性治疗性反应。
[0047] 在一些情况下，方法还包括向受试者施用多肽构建体的步骤。在一些情况下，方法还包括基于将第二受试者的靶细胞的CD277分子识别为缺少J构型，预测第二受试者中不良治疗反应的步骤。在一些情况下，靶细胞中的一个或多个是癌细胞。在一些情况下，方法还包括识别与靶细胞中RhoB活性有关的核苷酸序列多态性的步骤。在一些情况下，与缺少核苷酸序列多态性的受试者中的RhoB活性相比，RhoB的所述活性是高活性。在一些情况下，核苷酸序列多态性是单核苷酸多态性。在一些实施方式中，所述预测基于所述CD277分子的J构型的识别和所述核苷酸序列多态性的识别两者。
[0048] 本文提供了治疗受试者中癌症的方法，其中受试者具有CD277阳性的癌细胞，其包括向受试者施用有效量的药物组合物，药物组合物包括直接或通过一种或多种其他生物试剂间接选择性结合至所述癌细胞上的CD277的J构型或J结构的药学上可接受的试剂。在一些实施方式中，药学上可接受的试剂包括选择性结合至所述癌细胞上的CD277的J构型的多肽构建体。在一些实施方式中，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种。在一些实施方式中，多肽构建体包括γ-TCR多肽序列或δ-TCR多肽序列中的至少一种的变体或片段。在一些情况下，γ-TCR多肽序列是γ9-TCR多肽序列或其片段。在一些情况下，δ-TCR多肽序列是δ2-TCR多肽序列或其片段。
[0049] 在一些情况下，与未处于所述J构型的CD277分子相比，药学上可接受的试剂以更高的选择性直接或通过一种或多种其他生物试剂间接结合CD277的J构型。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，靶细胞是白血病细胞。在一些情况下，CD277作为二聚体存在。附图说明
[0051] 图1A-图1B显示了用于识别与表达预定受体的工程化的细胞有关的基因座，例如，Vγ9Vδ2TCR介导的识别的CEPH EBV-LCL系。图1A显示了识别表型，其表明在三个独立实验中Vγ9Vδ2 TCR+T细胞识别(+)或未识别(-)EBV-LCL系。图1B显示通过IFNg-ELIspot测定评价EBV-LCL的识别表型(黑色柱：未激活；灰色柱：激活)，其中在存在ABP帕米膦酸的情况下，将EBV-LCL用作针对Vγ9Vδ2TCR+T细胞的靶标。图显示了代表性实验的IFNg斑点的数目。
[0052] 图2A-图2C显示了识别与特定细胞中预定受体的激活有关的基因座的包括shRNA评价的SNP相关计算途径搜索(SAPPHIRE)。图2A显示了Vγ9Vδ2 TCR+T细胞对CEPH EBV-LCL系的识别提供了用于推导每种细胞系中候选基因座的假想合子型的基础(黑色：识别；白色：未识别；正方形：男性；圆形：女性；+/-：杂合；/-：纯合阴性；+/：未确定)。作为实例，显示了两个CEPH家族的成员。对于细胞系的CEPH ID号，参见图1A。图2B显示了遗传相关性分析，其显示了基因型与细胞系的预测合子型100％相关(r2＝1)的17个SNP。指明了SNP的位置和最近邻基因。通过黑色圆圈(对T细胞激活具有显著影响)和白色圆圈(无影响)显示了候选基因的敲低对通过用Vγ9Vδ2 TCR克隆G115或HLA-A*0201限制的WT1126_134特异性aβTCR转导的T细胞对EBV-LCL 48的识别的影响。为了测试WT1 aβTCR+T细胞的识别，用WT1126_134肽脉冲EBV-LCL 48系。图2C显示了由相关性分析所产生的SNP与候选基因的相关性。作为实例，显示了邻近RhoB的SNP的遗传区域。每个柱代表1个SNP，并且r2值代表预测合子型和SNP基因型之间的相关性。
[0053] 图3A显示使用CRISPR/Cas系统在293HEK细胞中敲除RhoB，和对于稳定的完全敲除表型所选择的单细胞克隆，以及通过测量IFNγ评价完全敲除对通过Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的识别的影响(左图)。将靶向不相关序列的向导RNA用作对照。使用胞内流式细胞术确定敲除水平(右图)。数据显示了两个重复样品中的两个独立实验的平均值±S.E.M，其中将曼-惠特尼检验用于分析统计显著性。图3B显示用靶向RhoB的shRNA慢病毒转导Daudi细胞，并且通过测量IFNγ评价RhoB敲低对通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞对表达表面CD277的细胞的识别的影响(左图)。数据显示了重复样品中的三个独立实验的平均值±S.E.M，其中将曼-惠特尼检验用于分析统计显著性。将编码不相关shRNA的载体用作阴性对照。通过胞内流式细胞术确定RhoB的敲低水平(右图)。图3C显示使用CRISPR/Cas系统在293HEK细胞中敲除RhoA、B和C。将靶向不相关序列的向导RNA用作对照。使用qPCR确定敲除水平。图显示了代表性实验。图3D显示通过免疫印迹分析在所识别的EBV-LCL系48和91以及未识别的系22和93中测量的RhoB蛋白水平。将β-微管蛋白用作加样对照。图显示了代表性实验。图3E显示通过胞内流式细胞术分析在识别的EBV-LCL系6、12、48、69、70和99以及未识别的系22、83、93和37中测量RhoB蛋白水平。数据显示了至少三个独立实验的平均值±
S.E.M。图3F显示通过使用G-Lisa确定在C3-转移酶处理之后的293HEK细胞的Rho抑制。图显示了与未处理的样品相比，RhoA活性的相对抑制的代表性实验。
S.E.M。图3F显示通过使用G-Lisa确定在C3-转移酶处理之后的293HEK细胞的Rho抑制。图显示了与未处理的样品相比，RhoA活性的相对抑制的代表性实验。
[0054] 图4A-图4E显示基于所述多肽构建体与CD277的J构型的结合，RhoB活性与通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞的靶细胞识别相关联。图4A显示使用CRISPR/Cas系统，在肾癌细胞系MZ1851RC中部分敲除RhoB。用帕米膦酸或HLA-A*0201限制的WTlI
26+134肽处理MZ1851RC细胞，并且通过测量IFNγ产生，分别确定对通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞和WT1 o43TCR+T细胞的靶细胞识别的影响。将靶向不相关序列的向导RNA用作敲除的对照，而将培养基或加载不相关肽的肿瘤细胞用作T细胞刺激的对照。
数据显示了重复样品中三个独立实验的平均值±S.E.M。通过胞内流式细胞术确定敲除水
平。图4B显示通过测量IFNγ产生评价293HEK细胞中RhoA、B和C的敲除对通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞的识别的影响。将靶向不相关序列的向导RNA用作对照。图显示了对于重复样品中三个独立实验的不相关敲除样品归一化的IFNγ产生。图4C显示在未识别(黑色柱)或识别(白色柱)的EBV-LCL和肿瘤细胞系中，通过qPCR测量RhoB的RNA表
达。数据表示2个重复实验。图4D显示与帕米膦酸或IPP结合，用calpeptin或C3转移酶预处理未识别的EBV-LCL系93或者识别的EBV-LCL 48，并通过测量IFNγ评价对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞刺激的影响。平行测量Rho-调节化合物对通过WT1 aβTCR+T细胞对WTlI 26+134肽-脉冲的EBV-LCL 48细胞的识别。数据显示了至少三个独立实验的平均值±S.E.M。图4E显示用显性负性(RhoB-DN)、组成型活性(RhoB-CA)或者野生型RhoB(RhoB-WT)转染HEK 293细胞，并且通过测量IFNγ确定活性变体对存在帕米膦酸的情况下通过Vγ9Vδ2 TCR+T细胞对靶细胞的识别的影响。图显示了对于三个独立实验的野生型RhoB样品归一化的IFNγ产生。对图4A、B和D通过曼-惠特尼检验，并且对图4E通过Knisltal-Wallis检验和邓恩多次对比检验分析数据的显著性。
26+134肽处理MZ1851RC细胞，并且通过测量IFNγ产生，分别确定对通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞和WT1 o43TCR+T细胞的靶细胞识别的影响。将靶向不相关序列的向导RNA用作敲除的对照，而将培养基或加载不相关肽的肿瘤细胞用作T细胞刺激的对照。
数据显示了重复样品中三个独立实验的平均值±S.E.M。通过胞内流式细胞术确定敲除水
平。图4B显示通过测量IFNγ产生评价293HEK细胞中RhoA、B和C的敲除对通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞的识别的影响。将靶向不相关序列的向导RNA用作对照。图显示了对于重复样品中三个独立实验的不相关敲除样品归一化的IFNγ产生。图4C显示在未识别(黑色柱)或识别(白色柱)的EBV-LCL和肿瘤细胞系中，通过qPCR测量RhoB的RNA表
达。数据表示2个重复实验。图4D显示与帕米膦酸或IPP结合，用calpeptin或C3转移酶预处理未识别的EBV-LCL系93或者识别的EBV-LCL 48，并通过测量IFNγ评价对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞刺激的影响。平行测量Rho-调节化合物对通过WT1 aβTCR+T细胞对WTlI 26+134肽-脉冲的EBV-LCL 48细胞的识别。数据显示了至少三个独立实验的平均值±S.E.M。图4E显示用显性负性(RhoB-DN)、组成型活性(RhoB-CA)或者野生型RhoB(RhoB-WT)转染HEK 293细胞，并且通过测量IFNγ确定活性变体对存在帕米膦酸的情况下通过Vγ9Vδ2 TCR+T细胞对靶细胞的识别的影响。图显示了对于三个独立实验的野生型RhoB样品归一化的IFNγ产生。对图4A、B和D通过曼-惠特尼检验，并且对图4E通过Knisltal-Wallis检验和邓恩多次对比检验分析数据的显著性。
[0055] 图5显示了RhoB的胞内分布与通过表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞对靶细胞中CD277的J构型的识别相关。图5A显示用帕米膦酸处理未识别的健康T细胞、白血病细胞系ML-I和EBV-LCL 93细胞以及识别的白血病细胞系K562、结肠癌细胞系SW480、EBV-LCL 48和EBV-LCL 70细胞，并将其加载至聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上。将所连接的细胞固定并透性化，并且使用RhoB特异性抗体，然后使用Alexa Fluor 488缀合的第二抗体染色。
随后，通过共聚焦显微镜检查分析RhoB分布，并且显示代表性的图像(白色：RhoB；黑色：核[DAPI])。图5B显示用帕米膦酸处理来自健康供体的T细胞、EBV-LCL系93、48和70、肿瘤细胞系ML-I、K562、SW480、Raji、原代AML胚细胞AML2913、AML2907、AML2889、AML2905和鼠科动物及人DC，并在共聚焦显微镜检查中分析RhoB的胞内分布。白色柱代表具有非激活表型的靶细胞，而黑色柱表示能够激活表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞的靶细胞。使用ImageJ图像分析软件测量核和核外细胞区室之间的RhoB信号比率。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用克鲁斯凯-沃利斯检验和邓恩多次对比检验确定与PBL相比的统计显著性。图5C显示了胞内RhoB分布，图5D显示了核外/核RhoB信号比率，其中如A和B中所示，对于识别的ABP/IPP-敏感的EBV-LCL 48分析了ABP帕米膦酸和可溶性IPP的敏化。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用曼-惠特尼检验确定与未处理的EBV-LCL 48相比的统计显著性。图5E显示在来自两个不同供体的单核细胞来源的人树突状细胞中确定了存在或不存在ABP帕米膦酸的情况下的胞内RhoB分布。用ABP帕米膦酸处理骨髓来源的小鼠树突状细胞(>95％CD11c+)并用于RhoB的胞内标记。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用曼-惠特尼检验确定与LPS处理的人DC相比的统计显著性。图5F显示对来自分别识别(AML 2889、AML 1665、AML 2575)和未识别(AML 2907)其白血病胚细胞的4位患者的CD34+CD38—白血病干细胞进行分选，并且测量了核外和核RhoB信号之间的比值。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用曼-惠特尼检验确定与CD34+CD38—健康干细胞相比的统计显著性。
随后，通过共聚焦显微镜检查分析RhoB分布，并且显示代表性的图像(白色：RhoB；黑色：核[DAPI])。图5B显示用帕米膦酸处理来自健康供体的T细胞、EBV-LCL系93、48和70、肿瘤细胞系ML-I、K562、SW480、Raji、原代AML胚细胞AML2913、AML2907、AML2889、AML2905和鼠科动物及人DC，并在共聚焦显微镜检查中分析RhoB的胞内分布。白色柱代表具有非激活表型的靶细胞，而黑色柱表示能够激活表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞的靶细胞。使用ImageJ图像分析软件测量核和核外细胞区室之间的RhoB信号比率。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用克鲁斯凯-沃利斯检验和邓恩多次对比检验确定与PBL相比的统计显著性。图5C显示了胞内RhoB分布，图5D显示了核外/核RhoB信号比率，其中如A和B中所示，对于识别的ABP/IPP-敏感的EBV-LCL 48分析了ABP帕米膦酸和可溶性IPP的敏化。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用曼-惠特尼检验确定与未处理的EBV-LCL 48相比的统计显著性。图5E显示在来自两个不同供体的单核细胞来源的人树突状细胞中确定了存在或不存在ABP帕米膦酸的情况下的胞内RhoB分布。用ABP帕米膦酸处理骨髓来源的小鼠树突状细胞(>95％CD11c+)并用于RhoB的胞内标记。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用曼-惠特尼检验确定与LPS处理的人DC相比的统计显著性。图5F显示对来自分别识别(AML 2889、AML 1665、AML 2575)和未识别(AML 2907)其白血病胚细胞的4位患者的CD34+CD38—白血病干细胞进行分选，并且测量了核外和核RhoB信号之间的比值。图显示了至少10个不同细胞的平均比+S.E.M.。通过使用曼-惠特尼检验确定与CD34+CD38—健康干细胞相比的统计显著性。
[0056] 图6A显示了识别和未识别的原代AML样品中RhoB胞内分布的代表性图像。图6B显示通过共聚焦显微镜检查，在EBV-LCL 48中测量的存在或不存在ABP帕米膦酸的情况下的胞内RhoA分布。图6C显示在来自两个不同供体的单核细胞来源的人树突状细胞中确定了存在或不存在ABP帕米膦酸的情况下的胞内RhoB分布。用ABP帕米膦酸处理小鼠骨髓来源的树突状细胞(>95％CD11c+)并用于RhoB的胞内标记。图6D显示了胞内RhoB分布与肿瘤靶细胞的Vγ9Vδ2TCR T细胞激活能力的相关性。当将相同肿瘤细胞与表达本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞共培养时，将肿瘤细胞中的核外：核RhoB强度比的平均值对IFNg斑点数目作图。
[0057] 图7A-图7B显示RhoB活性调节CD277膜移动性及其与肌动蛋白细胞骨架的结合，借此调节CD277的J构型的形成。图7A显示用CD277-emGFP融合构建体转染HEK 293细胞并用培养基、ABP唑来膦酸或者calpeptin处理。还将唑来膦酸处理应用于其中通过CRISPR/Cas敲除RhoB的HEK 293 CD277-emGFP+细胞或者还用C3-转移酶处理的细胞。图显示了通过所应用的处理，CD277不移动部分的百分比(+)。符号代表2个实验的单一细胞测量。图7B显示用帕米膦酸或用calpeptin预处理HEK 293细胞，并且分别使用荧光标记的抗CD277抗体和荧光鬼笔环肽对BTN3分子和丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)染色。随后，通过确定两种信号的定位相关性来评价CD277和F-肌动蛋白的共定位。符号代表单一实验的单一细胞测量。中心线和误差线代表平均值和S.E.M.，p值表示通过使用曼-惠特尼检验分析的显著性。
[0058] 图8A-图8E显示RhoB与形成CD277的J构型的CD277分子相互作用，并且在磷酸抗原处理之后解离。图8A显示用培养基或ABP帕米膦酸处理EBV-LCL 48细胞，将其加载至聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上并透性化。随后，使用抗RhoB和抗CD277抗体，通过Duolink PLA评价RhoB和CD277之间的相互作用。将不使用抗RhoB和BTN3抗体的Duolink PLA用作阴性对照(红色：PLA信号；蓝色：核[DAPI]；点线：细胞膜)。图表示两个独立实验。图8B显示用培养基或帕米膦酸处理HEK 293细胞，并用等量的抗CD277-PE(供体)以及抗CD277-DyLight 680
(受体)抗体共染色，并如材料和方法中，测量细胞中的FRET效率。数据显示了三个重复样品中的三个独立实验的平均值±S.E.M，其中将曼-惠特尼检验用于分析统计显著性。图8C显示用培养基或帕米膦酸预处理HEK 293细胞，胰蛋白酶化、透性化并用抗RhoB-Alexa Fluor
488(FRET供体)和抗CD277-DyLight 680(FRET受体)抗体染色。随后如材料和方法中，通过流式细胞术测量FRET效率。数据显示了三个重复样品中的三个独立实验的平均值+S.E.M，其中将曼-惠特尼检验用于分析统计显著性。图8D显示存在或不存在磷酸抗原cHDMAPP的情况下，全长CD277胞内域(BFI)与RhoGTP酶的浓度依赖性结合。在不存在cHDMAPP(左图)或者存在cHDMAPP(1:1)(右图)的情况下，使用生物膜干涉测量法(BM)测量BFI与RhoGTP酶的结合。上图中所示的CD277 BFI的浓度为以灰色显示的6.25、12.5、25、50和100uM。将动力学拟合曲线显示为黑色。在下图中，所示的CD277 BFI浓度为以灰色显示的3.75、7.5、15、30和
60uM。将动力学拟合曲线显示为黑色。图8E显示了相同的实验结构，但具有重组CD277
B30.2域，其缺少跨膜域的N末端区连接子。在左图中，在没有cHDMAPP的情况下测量了相互作用。所示的BTN3A1 B30.2的浓度为以灰色显示的12.5、25、50、100和200uM。将动力学拟合曲线显示为黑色。在下图中，使用cHDMAPP(1:1)测量相互作用。所示的B30.2域的浓度为以灰色显示的3.75、7.5、15、30和60uM。
(受体)抗体共染色，并如材料和方法中，测量细胞中的FRET效率。数据显示了三个重复样品中的三个独立实验的平均值±S.E.M，其中将曼-惠特尼检验用于分析统计显著性。图8C显示用培养基或帕米膦酸预处理HEK 293细胞，胰蛋白酶化、透性化并用抗RhoB-Alexa Fluor
488(FRET供体)和抗CD277-DyLight 680(FRET受体)抗体染色。随后如材料和方法中，通过流式细胞术测量FRET效率。数据显示了三个重复样品中的三个独立实验的平均值+S.E.M，其中将曼-惠特尼检验用于分析统计显著性。图8D显示存在或不存在磷酸抗原cHDMAPP的情况下，全长CD277胞内域(BFI)与RhoGTP酶的浓度依赖性结合。在不存在cHDMAPP(左图)或者存在cHDMAPP(1:1)(右图)的情况下，使用生物膜干涉测量法(BM)测量BFI与RhoGTP酶的结合。上图中所示的CD277 BFI的浓度为以灰色显示的6.25、12.5、25、50和100uM。将动力学拟合曲线显示为黑色。在下图中，所示的CD277 BFI浓度为以灰色显示的3.75、7.5、15、30和
60uM。将动力学拟合曲线显示为黑色。图8E显示了相同的实验结构，但具有重组CD277
B30.2域，其缺少跨膜域的N末端区连接子。在左图中，在没有cHDMAPP的情况下测量了相互作用。所示的BTN3A1 B30.2的浓度为以灰色显示的12.5、25、50、100和200uM。将动力学拟合曲线显示为黑色。在下图中，使用cHDMAPP(1:1)测量相互作用。所示的B30.2域的浓度为以灰色显示的3.75、7.5、15、30和60uM。
[0059] 图9A显示了在大肠杆菌(E.coli)中表达的RhoB GTP酶的凝胶过滤谱图。17.8ml至19.2ml的峰含有纯化的RhoB GTP酶单体。图9B显示了SDS-PAGE，其显示了从凝胶过滤实验收集的含有RhoB GTP酶的部份(17.5-19.5ml，0.5ml/部分)。图9C显示存在或不存在磷酸抗原IPP(上图)的情况下，全长CD277胞内域(BFI)与RhoGTP酶的浓度依赖性结合。在不存在IPP(左图)或者存在IPP(1:1)(右图)的情况下，使用生物膜干涉测量法(BLI)测量BFI与
RhoGTP酶的结合。所示的CD277 BFI的浓度为以灰色显示的3.75、7.5、15、30和60uM。相同实验结构，但具有重组CD277 B30.2域，其缺少跨膜域的N末端区连接子(下图)。在左图中，在没有IPP的情况下测量了相互作用。所示的CD277 B30.2的浓度为以灰色显示的3.75、7.5、
15、30和60uM。在右图中，使用IPP(1:1)测量相互作用。
RhoGTP酶的结合。所示的CD277 BFI的浓度为以灰色显示的3.75、7.5、15、30和60uM。相同实验结构，但具有重组CD277 B30.2域，其缺少跨膜域的N末端区连接子(下图)。在左图中，在没有IPP的情况下测量了相互作用。所示的CD277 B30.2的浓度为以灰色显示的3.75、7.5、
15、30和60uM。在右图中，使用IPP(1:1)测量相互作用。
[0060] 图10显示胞内磷酸抗原积累引起CD277中的胞外构象变化，从而导致CD277的J构型的形成。用培养基、C3转移酶和/或帕米膦酸预处理HEK 293细胞，并且随后用荧光脂质缀合物BODIPY FL(FRET供体)对细胞表面膜染色，并且用来源于克隆20.1或克隆103.2的小鼠抗CD277 mAb标记BTN3分子，并随后用第二Alexa Fluor 594缀合的Fab片段(GaM)(FRET受体)染色。通过流式细胞术测量FRET效率，并且数据表示三个重复样品中的至少三个独立实验的平均值+S.E.M。通过曼-惠特尼检验分析数据的统计显著性。
[0061] 图11显示了导致通过表达本文所描述的多肽构建体TCR的工程化的细胞对CD277的J构型的识别的肿瘤细胞中的两组分机制模型。非激活阶段：无来自核外区域的磷酸抗原的积累(pAg：黄色星：其保留了GDP结合的RhoB(红色圆圈+GDP))。激活阶段组分I：磷酸抗原的积累之后是更多GTP结合的RhoB的形成(红色圆圈+GTP)。GTP结合的RhoB经历了核外区域中积累的亚细胞再区室化(黑色箭头)并且通过促进结合至CD277的B30.2域近端连接子区
(CR)(蓝色六边形)的质膜中的细胞骨架捕集(从膜延伸出的线)，有利于CD277的空间重新分布。激活阶段组分II：GTP结合的RhoB在与pAg解离(黑色箭头)的同时，结合至CD277的B30.2域，其引发了CD277的胞外区(ER)的构象变化，从而形成了导致本文所描述的多肽构建体的结合的CD277的J构型。
(CR)(蓝色六边形)的质膜中的细胞骨架捕集(从膜延伸出的线)，有利于CD277的空间重新分布。激活阶段组分II：GTP结合的RhoB在与pAg解离(黑色箭头)的同时，结合至CD277的B30.2域，其引发了CD277的胞外区(ER)的构象变化，从而形成了导致本文所描述的多肽构建体的结合的CD277的J构型。
[0062] 图12A-图12B显示了多种细胞类型中的RhoB分布及其由于细胞胁迫所造成的变化。在图12A中，将EBV-LCL系93、CLM细胞系K562和新近分离自外周血的健康供体来源的CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD14+细胞与100uM帕米膦酸一起培育，并随后通过共聚焦显微镜检查分析RhoB的胞内分布。显示了核区外部vs内部所检测的RhoB信号的比。在图12B中，随后对用3500cGy辐照并且用100uM帕米膦酸预处理的细胞分析了胞内RhoB分布如图12A所示。
比值表明当与未辐照的细胞相比时，RhoB的分布改变。
比值表明当与未辐照的细胞相比时，RhoB的分布改变。
[0063] 图13A通过IFNγ的产生显示了分离的克隆的抗肿瘤反应性。将T细胞与靶细胞系Daudi以1:1的E:T比共培育过夜。在不使用(上图)和存在100μM PAM的情况下(下图)进行刺激测定。柱表示1或2个(其中存在误差线)实验。误差线代表2个生物复制的SEM。箭头表示具有已知TCR序列的克隆。图13B显示了IFNγ针对Daudi vs不存在或存在100uM PAM的情况下的HEK293FT细胞系的产生的散点图。图13C显示了使用HEK293FT细胞作为靶标的刺激测定。
[0064] 图14A显示了供体C的完全TRDV组库。百分比表示克隆型的普遍性。在分析中排除了频率为1读序/克隆型的序列。图14B显示了紧邻对照TCR，在转导至PBMC和选择过程之后，所选TCR的γδTCR表达的MFI(n＝7)。图14C显示了紧邻对照TCR，TEG形式的所选TCR对细胞系Daudi的功能亲和性。基于相当的γδTCR表达，在图中包括TEG。
[0065] 图15A显示了使用TCR四聚体的Daudi细胞的染色，使用作为生物素对照或者含有γδTCR LM1或CL5的100nM SA-PE四聚体对1*10^5个Daudi细胞(n＝4)在室温下染色30分
钟，并且随后用可固着存活染料染色。在染色之前，将细胞与100μM帕米膦酸(+PAM条件)一起培育2h。在BD FACSCanto II(BD Bioscience)上分析染色的细胞。图15B显示了使用TCR葡聚糖体的Daudi细胞的染色。使用与图15A相同的方式，通过100nM SA-PE葡聚糖体对1*10^5个Daudi细胞(n＝4)染色并分析。图15C显示了使用YG珠的Daudi细胞的染色。使用与图
15A相同的方法，用0.33mg/ml YG珠(非缀合的或用γδTCRs LM1、CTE-CL3或CTE-CL5缀合的)对7.5*10^4个细胞(n＝3)染色并分析。图15D显示了使用YG珠的Daudi细胞的染色。使用
2种抗CD277单克隆抗体(20.1和103.2)进行结合竞争测定。将7.5*104个Daudi细胞(n＝2)与抗体预培育并与CL5珠在室温下培育30分钟。在BD FACS Diva中进行所有FACS数据分析，并且在Graphpad Prism中产生图。
钟，并且随后用可固着存活染料染色。在染色之前，将细胞与100μM帕米膦酸(+PAM条件)一起培育2h。在BD FACSCanto II(BD Bioscience)上分析染色的细胞。图15B显示了使用TCR葡聚糖体的Daudi细胞的染色。使用与图15A相同的方式，通过100nM SA-PE葡聚糖体对1*10^5个Daudi细胞(n＝4)染色并分析。图15C显示了使用YG珠的Daudi细胞的染色。使用与图
15A相同的方法，用0.33mg/ml YG珠(非缀合的或用γδTCRs LM1、CTE-CL3或CTE-CL5缀合的)对7.5*10^4个细胞(n＝3)染色并分析。图15D显示了使用YG珠的Daudi细胞的染色。使用
2种抗CD277单克隆抗体(20.1和103.2)进行结合竞争测定。将7.5*104个Daudi细胞(n＝2)与抗体预培育并与CL5珠在室温下培育30分钟。在BD FACS Diva中进行所有FACS数据分析，并且在Graphpad Prism中产生图。
[0066] 图16显示将表达无功能TCR LM1、中等亲合力CTE-CL3或高亲合力CTE-CL5的TEG与和100uM帕米膦酸或和培养基预培育的HEK293FT细胞共培育。在清洗掉非缀合细胞之后，进行长达120分钟的共培育。用抗CD3e抗体和DAPI对样品进行免疫染色，并将其用于共聚焦显微镜分析。对于DAPI+细胞(总细胞)和CD3阳性细胞(TEG)数目定量图像，并且显示比值。对至少10幅独立图像进行分析，并且通过非参数ANOVA确定显著性。结果显示了包括平均值和SD值的单个测量。
[0067] 图17A显示了免疫学突触和定量方法。图17B显示通过计算突触区内部vs外部的TCR信号强度的比值，确定IS中TCR的富集。对至少7幅独立图像进行分析，并且通过非参数ANOVA确定显著性。结果显示了包括平均值和SD值的单个测量。图17C和图17D显示用100uM帕米膦酸或者用培养基处理靶标HEK-293FT肿瘤细胞的团簇大小，并使用CD277-AF647对其进行免疫染色。随后，将样品用于通过超分辨率显微镜的分析。使用聚类算法DBSCAN分析图像。图17E显示了免疫学突触的聚类紧密度(cluster compactness)。图17F显示了每个ROI的聚类数目。
[0068] 图18A显示了使用TCR四聚体的ML1细胞的染色。使用作为生物素对照或含有γδTCR“LM1”或“CL5”的100nM SA-PE四聚体对1*10^5个ML1细胞(n＝4)在室温下染色30分钟，并随后用可固着存活染料染色。在BD FACSCanto II(BD Bioscience)上分析染色的细胞。
图18B显示了使用葡聚糖体的ML1细胞的染色。用100nM SA-PE葡聚糖体对1*10^5个ML1细胞(n＝4)染色。图18C和图18D显示了使用YG珠的ML1细胞的染色。用0.33mg/ml YG珠(非缀合的或者用γδTCR“LM1”、“CTE CL3”或“CTE CL5”缀合的)对7.5*10^4个ML1细胞(n＝3)染色。
图18B显示了使用葡聚糖体的ML1细胞的染色。用100nM SA-PE葡聚糖体对1*10^5个ML1细胞(n＝4)染色。图18C和图18D显示了使用YG珠的ML1细胞的染色。用0.33mg/ml YG珠(非缀合的或者用γδTCR“LM1”、“CTE CL3”或“CTE CL5”缀合的)对7.5*10^4个ML1细胞(n＝3)染色。
[0069] 图19显示了用sTCR缀合珠染色的Daudi和ML1细胞的代表性流式细胞点图。
具体实施方式
[0070] 在一个方面，本文提供了引起稳健抗肿瘤反应的T细胞。可以通过表达受体如γ9δ2 TCR的免疫细胞和靶标如肿瘤细胞之间的结合来调节抗肿瘤反应。可以通过改善的受体-靶标相互作用来改善肿瘤细胞与免疫细胞的结合。在一个方面，本文可以提供改善靶标和表达γ9δ2 TCR的免疫细胞之间的结合的组合物和方法。在一个方面，方法可以包括提高RhoB GTP酶的活性。在一个方面，方法可以包括提高磷酸抗原的活性如积累。RhoB GTP酶和磷酸抗原可以参与改善肿瘤细胞表面的CD277的表达，借此改善或允许表达CD277的肿瘤细胞和包含γ9δ2 TCR的免疫细胞之间的相互作用。在一个方面，本文可以提供方法，包括改善肿瘤细胞由内向外的信号转导，借此使其能够被免疫细胞识别。在一个方面，本文可以提供通过改善表面上CD277的表达来提高肿瘤细胞由内向外的信号转导的试剂。试剂可以直接或间接作用于CD277。可以通过刺激肿瘤细胞中的RhoB GTP酶和磷酸抗原来改善CD277的表达。在一个方面，试剂可以直接或间接作用于RhoB GTP酶。在一个方面，试剂可以直接或间接作用于磷酸抗原。在一个方面，可以提高RhoB GTP酶、磷酸抗原或它们的组合的活性的试剂可以直接或间接作用。在一个方面，可以提高RhoB GTP酶、磷酸抗原或它们的组合的活性的试剂可以结合反过来提高RhoB GTP酶和/或磷酸抗原的活性的第二因子。在一个方面，可以提高RhoB GTP酶、磷酸抗原或它们的组合的活性的试剂可以结合反过来提高RhoB GTP酶和/或磷酸抗原的活性的一些上游因子。在一个方面，可以刺激多达10个RhoB GTP酶或磷酸抗原的上游因子，并且反过来提高RhoB GTP酶和/或磷酸抗原的可作用性。
[0071] 在一个方面，本文可以提供包含γ9δ2 TCR的免疫细胞的组合物和包含提高RhoB GTP酶和磷酸抗原的活性的试剂的组合物。在一个方面，可以通过试剂如帕米膦酸，并且作为另外一种选择通过其他粘附剂的表达来提高γ9δ2TCR介导的反应。在一些方面，激活之后可以是靶标如表达CD277的癌性细胞的识别。可以通过γ9δ2TCR的CDR3区以及CD277中的构型变化来调节靶标的识别。在一些方面，T细胞激活可以使用膜的柔性来形成包含T细胞和肿瘤细胞的突触。在一些方面，T细胞激活可以包括通过γ9δ2TCR的相互作用，CD277在细胞膜处的微团簇(microclustering)。
[0072] 所有术语旨在被理解为它们将是本领域技术人员所理解的。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0073] 本文所使用的小节标题仅是出于组织的目的，并且不应将其视为对所述主题的限制。
[0074] 尽管在单一实施方式的背景中描述了本发明的多个特征，但是所述特征还可以单独或以任何适合的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在不同的实施方式的背景中描述本发明，但是本发明还可以在单一实施方式中实现。
[0075] 以下定义是对本领域中的那些的补充并且针对本发明申请，并且不应归因于任何相关或无关情况，例如，不应归因于任何共有专利或专利申请。尽管可以在测试本发明公开的实践中使用与本文所描述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。因此，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且其不意欲进行限制。
[0076] 在本发明申请中，除非另外具体指明，否则单数的使用包括复数。必须指出除非上下文明确规定，否则如在本说明书中所使用的，单数形式的“一种”、“一个”和“该”包括复数对象。在本发明申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。
[0077] 如本文所使用的，术语“自体同源的”及其语法等价形式可以表示来源于相同生物。例如，可以将样品(例如，细胞)除去、加工并随后返回至相同受试者(例如，患者)。自体同源过程不同于其中供体和受体是不同受试者的同种异体过程。
[0078] 如本文所使用的，术语“激活”及其语法等价形式可以表示其中细胞从静止状态向活动状态过渡的过程。该过程可以包括对抗原的应答、迁移和/或表型或遗传变化为功能活性状态。例如，术语“激活”可以表示T细胞激活的逐步过程。例如，T细胞可以需要至少两个信号来变为完全激活。第一信号可以发生在抗原-MHC复合物与TCR的接合之后，而第二信号可以通过共刺激性分子的接合发生。抗CD3可以体外模拟第一信号，抗CD28可以体外模拟第二信号。
[0079] 在本说明书中对“一些实施方式”、“实施方式”、“一个实施方式”或者“其他实施方式”的提及表示结合所述实施方式所述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一些实施方式中，但不必需包括在所有实施方式中。
[0080] 如在本说明书和权利要求中所使用的，单词“包含”(和包含的任何形式)、“具有”(和具有的任何形式)、“包括”(和包括的任何形式)或者含有(和含有的任何形式)是包含的或开放的，并且不排除其他、未提及的元素或方法步骤。考虑可以相对于本发明的任何方法或组合物来实施在本说明书中所讨论的任何实施方式，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
[0081] 如本文所使用的，与参考数值有关的术语“约”及其语法等价形式可以包括数值本身以及相对于该数值正负10％的数值范围。例如，“约10”的量包括10以及9至11的任何量。例如，与参考数值有关的术语“约”还可以包括相对于该值的正负10％、9％、8％、7％、6％、
5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。
5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。
[0082] 如在本说明书中所使用的术语“细胞毒性”是指细胞正常状态的无意或不期望的改变。细胞的正常状态可以表示在细胞暴露于细胞毒性组合物、试剂或条件之前所显示或存在的状态。通常，处于正常状态的细胞是处于体内平衡的细胞。细胞正常状态中的无意或不期望的改变可以表现为以下形式：例如，细胞死亡(例如，程序性细胞死亡)、复制潜能降低、细胞完整性如膜完整性降低、代谢活性降低、发育能力降低或者在本发明申请中所公开的任何细胞毒性作用。
[0083] “分离的”表示核酸从其自然环境中的除去。“纯化的”表示给定核酸(无论是从自然界移除的核酸(包括基因组DNA和mRNA)还是在实验室的条件下合成(包括cDNA)和/或扩增的核酸)的纯度提高，其中“纯度”是相对术语，不是“绝对纯度”。然而，应理解可以将核酸和蛋白与稀释剂或佐剂一起配制，并且从实践目的来说，仍是分离的。例如，当用于引入细胞时，核酸通常与可接受的载体或稀释剂混合。
[0084] 如本文所使用的，术语“百分比(％)同一性”是指为了实现最大同一性百分比(即可以在候选和参考序列之一或两者中引入缺口以用于最优比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)，在序列比对和引入缺口(如有必要)之后，与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于确定同一性百分比的目的，可以通过本领域技术范围内的多种方式实现比对，例如，使用公开可用的计算机软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过使用BLAST将测试序列与比较序列进行比对，确定比对的测试序列中与比较序列的相同位置中的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目，并用相同的氨基酸或核苷酸的数目除以比较序列中氨基酸或核苷酸的数目来计算两条序列的同一性百分比。
[0085] 如本文所使用的，术语“外周血单核细胞”(PBL)及其语法等价形式可以表示在血液(例如，外周血)中循环的淋巴细胞。外周血单核细胞可以表示未定位至器官的淋巴细胞。外周血单核细胞可以包括T细胞、NK细胞、B细胞或它们的任何组合。
[0086] 如本文所使用的，术语“表型”及其语法等价形式可以表示生物可观察的特征或性状如其形态、发育、生物化学或生理学性质、物候学、行为和行为结果的复合。基于上下文，术语“表型”有时可以表示群体可观察特征或性状的复合。
[0087] 如本文所使用的，“多核苷酸”或“寡核苷酸”表示具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸)的多聚形式。该术语仅表示分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA、三螺旋DNA以及双链和单链RNA。它还包括(例如)通过甲基化和/或通过封端修饰的和未修饰的多核苷酸形式。该术语还表示包括分子，所述分子包括非天然存在或合成的核苷酸以及核苷酸类似物。
[0088] 如本文所使用的，术语“外周血单核细胞”(PBL)及其语法等价形式可以表示在血液(例如，外周血)中循环的淋巴细胞。外周血单核细胞可以表示未定位至器官的淋巴细胞。外周血单核细胞可以包括T细胞、NK细胞、B细胞或它们的任何组合。
[0089] “多肽”与术语“多肽”和“蛋白”可互换使用并且表示氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白”是全长并且可选地包括对于给定细胞环境中的蛋白来说典型的糖基化或其他修饰的蛋白。
[0090] 当它们天然或人工来源于相同祖先的核酸或核酸序列时，核酸和/或核酸序列是“同源的”。当它们的编码DNA天然或人工来源于相同祖先的核酸或核酸序列时，蛋白和/或蛋白序列是同源的。同源分子可以称为同源物。例如，如本文所描述的，可以通过任何可用的突变方法来修饰任何天然存在的蛋白。当表达时，这种突变的核酸编码与原始核酸所编码的蛋白同源的多肽。通常根据两个或更多个核酸或蛋白(或其序列)之间的序列同一性来推断同源性。在建立同源性中有用的序列之间准确的同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白而变，但是通常将低至25％的序列同一性用于建立同源性。还可以使用更高的序列同一性水平，例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高来建立同源性。
[0091] 在两条核酸序列或者多肽的氨基酸序列的背景中，术语“同一的”或者“序列同一性”是指当在指定的比较窗内对于最大对应进行比对时，两条序列中相同的残基。在一类实施方式中，本文的多肽与参考多肽或其片段至少80％、85％、90％、98％、99％或100％同一，例如，如使用缺省参数通过BLASTP(或CLUSTAL，或者任何其他可用的比对软件)所测量的。类似地，也可以参考起始核酸来描述核酸，例如，它们可以对于参考核酸或其片段具有
50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％的同一性，例如，如使用缺省参数通过BLASTN(或CLUSTAL，或者任何其他可用的比对软件)所测量的。当一个分子据称与较大分子具有特定序列同一性百分比时，它表示当所述两个分子最优比对时，根据所述两个分子最优比对时的顺序，所述较小分子中的残基与所述较大分子中的残基相匹配的百分
比。
50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％的同一性，例如，如使用缺省参数通过BLASTN(或CLUSTAL，或者任何其他可用的比对软件)所测量的。当一个分子据称与较大分子具有特定序列同一性百分比时，它表示当所述两个分子最优比对时，根据所述两个分子最优比对时的顺序，所述较小分子中的残基与所述较大分子中的残基相匹配的百分
比。
[0092] 如本文所使用的，术语“T细胞”及其语法等价形式可以表示来自任何来源的T细胞。例如，T细胞可以是原代T细胞，例如，自体同源T细胞、细胞系等。所述T细胞还可以是人或非人的。
[0093] 如本文所使用的，术语“TIL”或肿瘤浸润淋巴细胞及其语法等价形式可以表示分离自肿瘤的细胞。例如，TIL可以是已迁移至肿瘤的细胞。TIL还可以是已浸润肿瘤的细胞。TIL可以是存在于肿瘤内的任何细胞。例如，TIL可以是T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞或它们的任何组合。TIL可以是细胞的混合群体。TIL群体可以包括具有不同表型的细胞、具有不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞或它们的任何组合。
[0094] “转座子”或“转位因子”(TE)是可以改变其在基因组内的位置的载体DNA序列，其有时会产生或回复突变并且改变细胞基因组的大小。转座经常导致TE的重复。I类TE以两个阶段复制：首先，它们从DNA转录为RNA，然后所产生的RNA反转录为DNA。然后，这种复制的DNA插入基因组中新的位置。通过反转录酶催化反转录步骤，其可以通过TE本身编码。反转座子的特征类似于反转录病毒如HIV。II类TE的复制和粘贴转座机制不涉及RNA中间产物。通过几种转座酶来催化转座。一些转座酶非特异性结合至DNA中的任何靶标位点，然而其他结合至特异性的DNA序列靶标。转座酶在靶标位点产生交错切割，从而导致产生了单链5'或
3'DNA悬突(粘端)。该步骤切掉DNA转座子，然后将其连接至新的靶标位点；该过程包括填充缺口的DNA聚合酶活性和封闭糖-磷酸酯主链的DNA连接酶活性。这导致了靶标位点的复制。
可以通过短直接重复序列识别DNA转座子的插入位点，所述短直接重复序列可以通过靶标DNA中的交错切割来产生并通过DNA聚合酶填充，然后是对于通过转座酶的TE切除重要的一系列倒位重复。当供体位点已复制，但靶标位点尚未复制时如果它们的转座发生在细胞周期的S期期间，则可以复制剪切和复制的TE。在I类和II类TE两者中，转座可以分为“自主的”或“非自主的”。自主TE可以通过自身移动，而非自主TE需要另一个TE的存在来移动。这通常是因为非自主TE缺少转座酶(对于II类)或反转录酶(对于I类)。
3'DNA悬突(粘端)。该步骤切掉DNA转座子，然后将其连接至新的靶标位点；该过程包括填充缺口的DNA聚合酶活性和封闭糖-磷酸酯主链的DNA连接酶活性。这导致了靶标位点的复制。
可以通过短直接重复序列识别DNA转座子的插入位点，所述短直接重复序列可以通过靶标DNA中的交错切割来产生并通过DNA聚合酶填充，然后是对于通过转座酶的TE切除重要的一系列倒位重复。当供体位点已复制，但靶标位点尚未复制时如果它们的转座发生在细胞周期的S期期间，则可以复制剪切和复制的TE。在I类和II类TE两者中，转座可以分为“自主的”或“非自主的”。自主TE可以通过自身移动，而非自主TE需要另一个TE的存在来移动。这通常是因为非自主TE缺少转座酶(对于II类)或反转录酶(对于I类)。
[0095] “转座酶”表示结合至转座子末端并且通过剪切和复制机制或者复制转座机制催化转座子向基因组的另一部分移动的酶。在一些实施方式中，可以使用转座酶的催化活性来将基因从载体移动至基因组。
[0096] 可以通过“转染”、“转化”、“核转染”或“转导”将本文所公开或考虑的核酸序列和载体引入到细胞。如本文所使用的，“转染”、“转化”或“转导”表示通过使用物理或化学方法将一个或多个外源多核苷酸引物宿主细胞。多种转染技术在本领域中是已知的并且包括(例如)磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(主编),Methods in Molecular
Biology,第7卷,Gene Transfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；
DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒-辅助的微粒轰击(Johnston,
Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-
2034(1987))；和核转染(Trompeter等人,J.Immunol.Methods 274:245-256(2003))。在感染性颗粒在适合的包装细胞(它们中的多数是可商购的)中生长之后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞。
Biology,第7卷,Gene Transfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；
DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒-辅助的微粒轰击(Johnston,
Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-
2034(1987))；和核转染(Trompeter等人,J.Immunol.Methods 274:245-256(2003))。在感染性颗粒在适合的包装细胞(它们中的多数是可商购的)中生长之后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞。
[0097] “启动子”是指引起编码序列转录的多核苷酸区。启动子位于基因转录起始位点附近，在相同链上并且位于DNA的上游(朝着有义链的5'区)。一些启动子是组成型的，因为它们在细胞中，在所有情况下是具有活性的，而其他的则是对特定刺激响应而受调控变为活性的，例如，诱导型启动子。
[0098] 术语“启动子活性”是指可操作性地连接至正在测量其活性的启动子上的核苷酸序列的表达程度。可以通过确定所产生的RNA转录本的量，例如，通过RNA印迹分析或者间接通过确定所连接的核酸序列如与启动子连接的报告核酸序列所编码的产物的量来测量启动子活性。
[0099] 如本文所使用的，“诱导型启动子”是指通过转录调节子，例如，生物或非生物因子的存在或不存在来诱导为活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为可以在生物的特定发育阶段或者在特定组织中打开或关闭可操作性地连接至它们的基因的表达。诱导型启动子的实例是醇调控的启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子、病理发生调控的启动子、温度调控的启动子和光调控的启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是遗传开关的一部分。
[0100] 如本文所使用的，术语“增强子”是指提高(例如)与之可操作性连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以距核酸序列的编码区数千个碱基，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自多种不同来源的大量增强子在本领域中是熟知的并且是作为克隆多核苷酸可用的或位于多核苷酸内的(来自(例如)保藏中心如ATCC以及其他商品化或个体来源)。一些包含启动子(如常用的CMV启动子)的多核苷酸还包括增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。术语“Ig增强子”是指来源于定位在免疫球蛋白(Ig)基因座内的增强子区的增强子元件(这些增强子包括(例如)重链(μ)5'增强子、轻链(κ)5'增强子、κ和μ内含子增强子和3'增强子)(通常，参见Paul W.E.(主编),Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993),353-363页；和美国专利号5,885,827)。
[0101] 如本文所使用的，“编码序列”是指编码多肽的多核苷酸节段。通过起始密码子将所述区域或序列限制在更靠近5'端的位置，通过终止密码子将所述区域或序列限制在更靠近3'端的位置。编码序列还可以被称为开放阅读框。
[0102] 如本文所使用的，“可操作地连接的”是指DNA节段与另一个DNA节段以使得所述节段能够以它们的预定方式起作用的物理和/或功能连接。当连接至调控序列如(例如)启动子、增强子和/或沉默子时，编码基因产物的DNA序列以直接或间接允许所述DNA序列的转录调控的方式可操作性地连接至调控序列。例如，当相对于启动子的转录起始位点连接至启动子下游时，DNA序列可操作性地连接至相对于转录起始位点的正确阅读框中的启动子并且允许转录伸长进行通过所述DNA序列。当以分别提高或降低DNA序列的转录的方式连接至所述DNA序列时，增强子或沉默子可操作性地连接至编码基因产物的DNA序列。增强子和沉默子可以位于DNA序列编码区的上游、下游或嵌入在所述编码区内。如果信号序列作为参与多肽分泌的前蛋白表达的话，则将所述信号序列的DNA可操作性地连接至编码所述多肽的DNA。通常通过在适合的限制性位点或通过使用本领域技术人员已知的限制性核酸内切酶插入所述序列的连接物(adapter)或接头(linker)的连接来完成DNA序列与调控序列的连接。
[0103] 术语“转录调控子”是指在特定环境条件下起作用以防止或抑制启动子驱动的DNA序列的转录(例如，阻遏子或核抑制蛋白)，或者在特定环境条件下起作用以允许或刺激启动子驱动的DNA序列的转录(例如，诱导子或增强子)的生物化学元件。
[0104] 术语“诱导”是指相对于一些基础转录水平，通过转录调控子所导致的核酸序列转录、启动子活性和/或表达的升高。
[0105] “靶标”基因或“异源”基因或“所关心的基因(GOI)”是指通过基因转移引入宿主细胞的基因。在某些情况下，在工程化的细胞中作为一种或多种异源基因编码本文所描述的多肽构建体。
[0106] 如本文所使用的，“重组酶”是指可以有利于限定位点之间的位点特异的重组的一组酶，其中所述位点在单一DNA分子上是物理分离的，或者其中所述位点存在于不同的DNA分子上。限定重组位点的DNA序列不必相同。重组的起始取决于蛋白-DNA相互作用，在该组内，存在多种催化噬菌体整合和切除(例如，λ整合酶、 )、环形质粒解离(例如，Tn3、γδ、Cre、Flp)、用于交替基因表达的DNA倒位(例如，Hin、Gin、Pin)、发育期间的基因组装(例如，鱼腥藻(Anabaena)固氮基因)和转座(例如，IS607转座子)。基于进化和机制相关性，大部分的位点特异的重组酶属于两个家族中的一个。这些是λ整合酶家族或酪氨酸重组酶(例如，Cre、Flp、Xer D)和解离酶/整合酶家族或者丝氨酸重组酶家族(例如， TP901-1、Tn3、γδ)。
[0107] “重组附着位点”是本文所描述的重组酶所识别的特异性多核苷酸序列。通常，包括两个不同的位点(其称为“互补位点”)，一个存在于靶标核酸(例如，真核生物或原核生物的染色体或附加体)中，而另一个位于要在靶标重组位点整合的核酸上。在本文中使用了术语“attB”和“attP”，其分别表示最初来自细菌靶标和噬菌体供体的连接(或重组)位点，尽管特定酶的重组位点可以具有不同的名称。重组位点通常包括通过核心区或间隔区相分离的左臂和右臂。因此，attB重组位点由BOB'组成，其中B和B'分别是左臂和右臂，而O是核心区。类似地，attP是POP'，其中P和P'是臂，而O还是核心区。一旦在attB和attP位点之间重组以及相伴的核酸在靶标位置的整合，则将侧接所述整合的DNA的重组位点称为“attL”和“attR”。使用以上术语，因此attL和attR位点分别由BOP'和POB'组成。在本文的一些表示中，省略了“O”，并且例如，将attB和attP分别表示为BB'和PP'。
[0108] 如本文所使用的，术语“CRISPR”是指包含半胱天冬氨酸酶如Cas9的基于半胱天冬氨酸酶的核酸内切酶，和通过杂交至基因组DNA中的识别位点来指导半胱天冬氨酸酶的DNA切割的向导RNA。
[0109] 如本文所使用的，术语“窘迫细胞”或“受胁迫的细胞”是指显示出疾病或病症状态的细胞。不良的表现可以包括相对于正常或非胁迫状态，细胞功能的任何变化，其包括基因转录或翻译、转录后或翻译后修饰、蛋白或酶活性、多肽构象、细胞粘附、细胞表面特征以及识别其他细胞或被其他细胞识别的能力的变化。在一些实施方式中，窘迫细胞的具体表型(例如，改变的基因表达模式)与胞内异常如遗传突变相关。在其他实施方式中，窘迫细胞的表型与胞外环境的异常或胁迫因子有关。窘迫细胞的实例是肿瘤细胞。在具体的实施方式中，窘迫细胞的特征可以在于RhoB向细胞膜的迁移。在某些情况下，窘迫细胞的特征在于细胞表面上CD277的J构型的存在。
[0110] 如本文所使用的，术语“表观遗传变化”或“表观遗传修饰”是指DNA序列变化以外的任何DNA的共价或非共价修饰。在某些实施方式中，表观遗传变化影响或改变一个或多个基因的调控和/或表达。考虑了表观遗传变化可以影响与表观遗传修饰的染色体位点相对近(例如，1Mbp内)以及与表观遗传修饰位点相对远(例如，在相同染色体上远离大于1Mbp或者在不同染色体上)的基因的调控。表观遗传改变的非限制性实例包括DNA甲基化和羟甲基化，组蛋白修饰如赖氨酸乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化、丝氨酸和苏氨酸磷酸化和赖氨酸泛素化和类泛素化，以及染色质结构的变化。
[0111] 在一个方面，可以提供包含γδT细胞的组合物。γδT可以是表达γδT细胞受体的非常规T细胞群体。γδT可以是TCR-确保的特异性和广泛的非HLA限制的抗癌反应性的融合，其特征可以在癌症免疫疗法中打开新的道路。例如，肿瘤浸润性γδT细胞的检测已与癌症患者中的阳性临床结局相关。在一个方面，γδT细胞可以参与早期癌症免疫监督。在一个方面，就功能和受体表达而言，γδT可以是异质的。在一个方面，可以将γδTCR引入免疫细胞。例如，可以将γδTCR引入αβT细胞。在一个方面，包括将γδTCR引入到免疫细胞如αβT细胞中的方法可以改善基于γδTCR的治疗剂的持久性。在一个方面，包括将γδTCR引入到免疫细胞如αβT细胞中的方法可以改善基于γδTCR的治疗剂的增殖。在一个方面，包括将γδTCR引入到免疫细胞如αβT细胞中的方法可以克服晚期癌患者中肿瘤细胞的克隆异质性，这是优于基于αβTCR的方法的改善。在一个方面，这种改善可以是由于γδTCR不同的不依赖于HLA的激活线索(activationcues)如脂类代谢的变化。在一个方面，可以将γδTCR治疗剂施用于包含具有低突变负荷的癌症的受试者。
[0112] 在一个方面，本文可以提供结合癌细胞上的靶标如CD277的γδTCR治疗剂。γδTCR治疗剂的结合可以包括靶标上表达的CD277中的空间和/或构象变化。在一个方面，结合可以表示直接相互作用。在一个方面，结合可以表示间接相互作用。结合可以表示结合CD277上游的试剂。在一个方面，结合CD277上游的试剂可以结合远离CD277的约20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个因子。在一些方面，被称为CD277的J构型或者CD277J的导致产生CD277的激活状态的事件级联可以引起TCR依赖性γ9δ2 T细胞激活。
[0113] 在一个方面，γ9δ2TCR的CDR3区域中的多样性可以有助于γ9δ2 T细胞群体内的功能异质性以及其他共受体的表达。在一个方面，γ9δ2 T细胞群体内的功能异质性可以归因于不同的表型和转录谱。在一个方面，在多种γ9δ2 T细胞组库内，对于肿瘤细胞可以具有不同的激活阈值克隆水平。通过在αβT细胞中表达γδTCR，可以在γ9δ2 T细胞克隆的功能中存在变化。在一些方面，这种变化可以不只与通过不同γ9δ2TCR所介导的功能亲和性相关。在一个方面，γ9δ2TCR与CD277J可以具有低亲合相互作用。在一个方面，γδTCR对其靶标可以存在初始扫描模式。这种初始扫描可以是不依赖于CDR3的并且可以使用γδTCR的其他接触残余部分。在一个方面，扫描还可以使用帕米膦酸诱导的粘附分子。扫描模式之后可以是CDR3依赖性同源识别，其可以使用γ9δ2TCR的膜柔性以及突触形成期间的高密度招募，从而使得能够感知由CD277J构型和靶标侧可能的其他膜分子所组成的纳米簇。在一个方面，TCR可以包括与表4中的序列约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者多至约100％的同一性百分比。在一个方面，γ9δ2可以包括与表
4中的序列约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者多至约100％的同一性百分比。在一个方面，使用表3中所包括的序列或者使用包含与表3中的序列具有约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或者多至约100％的同一性百分比的序列产生γ9δ2。
4中的序列约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者多至约100％的同一性百分比。在一个方面，使用表3中所包括的序列或者使用包含与表3中的序列具有约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或者多至约100％的同一性百分比的序列产生γ9δ2。
[0114] 在一个方面，未处理过的脐血来源的γδT细胞和分离自健康成年个体的外周血的γδT细胞之间的γδTCR组库多样性比较可以显示出所选克隆型的优先扩增。在一个方面，所述组库向少数主要克隆型的偏移可以表示特定功能益处。在一个方面，在各个克隆的克隆型频率和抗癌功能潜能之间可以不存在相关性。在一个方面，与不同的表型谱的获得同时发生的组库聚焦(repertoire focusing)可以是个体T细胞抗原刺激史，而不是所选克隆的体外效力的反映。在一个方面，γ9δ2TCR以外的受体可以参与γ9δ2 T细胞克隆的耐性的诱导。
[0115] 在一个方面，在其亲代克隆环境以外采集的γ9δ2TCR可以非常有效地用于靶向恶性疾病。在一个方面，当在相同背景表达时，γ9δ2TCR亲合力可以是αβTCR的激活潜能的决定因素。在一个方面，激活潜能可以存在固有差异如通过γ9δ2TCR介导的功能亲合性所测量的，其可以不与亲代γδT细胞克隆的固有能力相关。
[0116] 在一个方面，γ9δ2 TCR的亲合力可以处于甚至低于αβTCR的范围内。例如，仅通过将γ9δ2TCR多聚体的价态提高至大于在珠表面具有104个γ9δ2TCR的YG珠的尺寸来实现可检测的TCR结合。在一个方面，一旦实现足够的相互作用亲合性，则个体γ9δ2TCR之间的结合亲合力的差异可以是显著的。在一个方面，胞外CD277域和γ9δ2TCR之间的直接相互作用可以发生。
[0117] 在一个方面，CD277可以经历空间和构象变化。在一个方面，γ9δ2TCR可以参与流体细胞膜与CD277的相互作用，其可以产生更高的局部密度并稳定细胞-细胞相互作用。在一个方面，癌细胞的帕米膦酸刺激可以导致癌细胞上的粘附分子的上调，从而提高细胞-细胞接触并稳定突触，并因此稳定亲合性。在一个方面，γ9δ2TCR的CDR3区可以参与向表达CD277的癌细胞的突触的招募。在一个方面，本文所提供的试剂可以在CD277中直接或间接诱导特殊和构象的变化。
[0118] 在一个方面，可以存在BTN3A1簇尺寸的增加以及簇密度的降低。在一个方面，簇密度的变化为BTN3A簇内的其他蛋白产生了大部分的空间。在一个方面，约10％、20％、30％、40％、50％、60％或以上的簇表面可以被BTN3A二聚体占据。在一个方面，可以存在对移入CD277突触的其他因子的包括以及通过RhoB精心安排的CD277中的构象变化。
[0119] 在一个方面，可以存在γ9δ2 T细胞的功能多样性和“组库聚焦”。
[0120] 载体
[0121] 可以将编码直接或通过一种或多种其他生物试剂间接选择性结合CD277的J构型的多肽构建体的多核苷酸引入本文所描述的载体。“表达载体”或“载体”是任何基因元件，例如，质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单元(即能够在其自身控制下复制)或者通过插入到细胞染色体中，并将其连接至另一多核苷酸节段，从而导致所连接的节段的复制和/或表达而使得能够复制。适合的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可以含有引起载体向所期望的宿主细胞的连接或插入和引起所连接的节段的表达所必需的多核苷酸序列。基于宿主生物，这些序列是不同的；它们包括引起转录的启动子序列，提高转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。可替代地，表达载体可以能够直接表达其中所编码的核酸序列产物而无需将载体连接或整合到宿主细胞DNA序列中。
[0122] 载体还可以包括“可选择标志物基因”。如本文所使用的，术语“可选择标志物基因”是指在存在相应选择性试剂的情况下，使得表达核酸序列的细胞能够被具体选择的所述核酸序列。适合的可选择标志物基因在本领域中是已知的并且(例如)在国际专利申请公开WO 1992/08796和WO 1994/28143；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567(1980)；O’Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981)；Mulligan&Berg,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.,150:1
(1981)；Santerre等人,Gene,30:147(1984)；Kent等人,Science,237:901-903(1987)；
Wigler等人,Cell,11:223(1977)；Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:
2026(1962)；Lowy等人,Cell,22:817(1980)；和美国专利号5,122,464和5,770,359中描述。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.,150:1
(1981)；Santerre等人,Gene,30:147(1984)；Kent等人,Science,237:901-903(1987)；
Wigler等人,Cell,11:223(1977)；Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:
2026(1962)；Lowy等人,Cell,22:817(1980)；和美国专利号5,122,464和5,770,359中描述。
[0123] 在一些实施方式中，所述载体是能够在宿主细胞中复制并且在存在适当的选择压力的情况下在宿主细胞内作为染色体外DNA节段保持的“游离表达载体”或“游离体”(参见，例如，Conese等人,Gene Therapy,11:1735-1742(2004))。代表性的可商购的游离表达载体包括但不限于使用爱泼斯坦巴尔核抗原1(EBNA1)和爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)复制起点(oriP)的游离质粒。来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的载体pREP4、pCEP4、pREP7和
pcDNA3.1以及来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的pBK-CMV代表了使用T抗原和SV40复制起点来代替EBNA1和oriP的游离载体的非限制性实例。
pcDNA3.1以及来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的pBK-CMV代表了使用T抗原和SV40复制起点来代替EBNA1和oriP的游离载体的非限制性实例。
[0124] 载体修饰
[0125] 用于本文所描述的方法和组合物的多核苷酸载体可以是优良制造规范(GMP)相容的载体。例如，GMP载体可以比非GMP载体更纯。在一些情况下，可以通过生物负荷来测量纯度。例如，生物负荷可以是需氧菌、厌氧菌、产孢菌、真菌或其组合在载体组合物中的存在或不存在。在一些情况下，纯载体可以是低内毒素或无内毒素的。还可以通过双-链引物-步移测序来测量纯度。质粒特性(plasmid identity)可以是确定载体纯度的来源。本发明的GMP载体可以比非GMP载体纯10％至99％。GMP载体可以比非GMP载体纯10％、15％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％如通过生物负荷的存在、内毒素、测序或其组合所测量的。
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％如通过生物负荷的存在、内毒素、测序或其组合所测量的。
[0126] 在一些情况下，使用位于第一基因程序末端的终止子序列。终止子序列可以确保在起始第二基因程序之前终止转录本。例如，表达载体可以含有转录终止和mRNA稳定所必需的序列。这些序列通常得自真核或病毒DNA或cDNA的5'，并且有时3'未翻译区。这些区域可以含有在所述mRNA的未翻译部分中作为多聚腺苷酸化的片段转录的核苷酸节段。使包含所述表达载体的细胞在提供所期望的多肽的体内或体外表达的条件下生长。
[0127] 在一些情况下，可以在通过载体中的多核苷酸所编码的第一多肽的末端使用间隔序列。在其他情况下，可以在载体中的第二基因的末端使用间隔序列。还可以在载体中的第一基因和第二基因之后使用间隔序列。
[0128] 这些载体可以用于表达基因或所关心的基因部分所编码的多肽。可以通过使用任何病毒或非病毒方法插入基因或基因部分。例如；方法可以是非病毒基技术。
[0129] 接头
[0130] 在一些实施方式中，可以在编码本文所描述的多肽构建体的多核苷酸中使用多核苷酸接头。多核苷酸接头可以是含有可以添加以产生与包含本文所描述的多核苷酸的载体相容的末端结构的所期望的限制性位点的双链DNA节段。在一些情况下，多核苷酸接头可以用于修饰包含本文所描述的多核苷酸的载体。例如，包含多核苷酸接头的载体修饰可以是多克隆位点的变化或者多聚组氨酸尾的添加。多核苷酸接头还可以用于改造插入DNA的平端以用于向限制性内切酶切割的具有粘性末端的载体克隆。多核苷酸接头的使用可以比平端连接至载体更有效，并且可以在下游应用中提供从载体中释放插入物的方法。在一些情况下，插入物可以是编码用于治疗应用的多肽的多核苷酸序列。
[0131] 多核苷酸接头可以是寡聚物。多核苷酸接头可以是DNA双链、单链或它们的组合。在一些情况下，接头可以是RNA。在一些情况下，可以通过T4连接酶将多核苷酸接头连接至包含本文所描述的多核苷酸的载体。为了有利于连接，可以将过量的多核苷酸接头添加至包含插入物和载体的组合物中。在一些情况下，在引入接头之前对插入物和载体进行预处理。例如，使用甲基酶的预处理可以防止不希望的插入DNA的切割。
[0132] 在一些实施方式中，可以在本文所描述的多核苷酸中使用接头。接头可以是柔性接头、刚性接头、体内可切割接头或它们的任何组合。在一些情况下，接头可以将功能域连接在一起(如在柔性和刚性接头中)或者体内释放游离的功能域如在体内可切割的接头中。
[0133] 接头可以改善生物活性，提高表达得率，并且实现所期望的药物动力学谱。接头还可以包括腙、肽、二硫化物或硫醚。
[0134] 在一些情况下，本文所描述的接头序列可以包括柔性接头。当所连接的域需要特定程度的移动或相互作用时，可以应用柔性接头。柔性接头可以由小的、非极性(例如，Gly)或极性(例如，Ser或Thr)氨基酸组成。柔性接头可以具有主要由Gly和Ser残基延伸所组成的序列(“GS”接头)。柔性接头的实例可以具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示的序列(SEQ ID NO:1)。通过调整拷贝数“n”，可以优化这种示例性GS接头的长度以实现适当的功能域的分离或者维持必需的域内相互作用。除GS接头之外，可以将其他柔性接头用于重组融合蛋白。在一些情况下，柔性接头还可以富含小的或极性氨基酸如Gly和Ser，但是可以含有其他氨基酸如Thr和Ala以维持柔性。在其他情况下，极性氨基酸如Lys和Glu可以用于改善溶解度。
[0135] CD277的J构型
[0136] 在本文中“CD277”是指膜表达的蛋白嗜乳脂蛋白BTN3A1，它是本文所描述的磷酸抗原诱导的工程化的细胞的激活中的关键分子。CD277蛋白是可以呈现出多种构型的细胞表面蛋白如(例如)本文中图11所示。当通过促进结合至CD277的B30.2域近端连接子区的质膜中的细胞骨架捕集，GTP结合的RhoB有利于CD277的空间重新分布时，有利于CD277的J构型或J结构。GTP结合的RhoB的解离以及胞内磷酸抗原(pAG)与CD277的B30.2域的相应结合引发了CD277胞外区的构象变化，其在本文中称为CD277的J构型。在肿瘤细胞及其他窘迫细胞中特有地观察到了J构型，其中代谢变化可以导致某些胁迫分子的表达并且导致肿瘤细胞或窘迫细胞内RhoB以最终导致CD277的J构型形成的方式的迁移。在本文中以及在任何相关专利和/或专利申请中，术语“J构型”、“J构象(conformation)”和“J结构”是可互换使用的。
[0137] 在某些实施方式中，本文提供了包含特异性结合这些肿瘤细胞和窘迫细胞表面上的CD277的J构型的多肽构建体的方法和组合物。在某些实施方式中，本文所描述的多肽构建体包含γδTCR或其片段。在某些实施方式中，本文描述了编码多肽构建体的多核苷酸以及编码所述多核苷酸的载体。在一些情况下，提供了编码本文所描述的多肽构建体的工程化的细胞。
[0138] 多肽构建体
[0139] 在一些方面，本文提供了包含多肽构建体的药物组合物，其中所述多肽构建体与靶细胞上的CD277的J构型特异性相互作用。在某些实施方式中，在工程化的细胞上表达多肽构建体。在一些实施方式中，CD277是人CD277。在一些情况下，所述多肽构建体以比CD277的其他构型高至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的选择性结合CD277的J构型。在一些情况下，与CD277的其他构型相比，所述多肽构建体以至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或8倍的亲和力结合CD277的J构型。在一些实施方式中，一旦CD277的构象变化为CD277的J构型，则所述多肽构建体结合至CD277，所述构象变化是在RhoB-GTP酶向细胞膜的迁移时，通过CD277与RhoB GTP酶的相互作用所引起的。在一些实施方式中，在CD277与RhoB GTP酶相互作用之后，所述多肽构建体结合至CD277。在一些实施方式中，当CD277与磷酸抗原相互作用时，所述多肽构建体结合至CD277。在一些实施方式中，当CD277与磷酸抗原相互作用时并且在CD277与RhoB GTP酶相互作用之后，所述多肽构建体结合至CD277。在一些实施方式中，当RhoB GTP酶定位至靶细胞的细胞膜时，所述多肽构建体结合至CD277。在一些实施方式中，当RhoB GTP酶远离靶细胞核定位时，所述多肽构建体结合至CD277。
[0140] 可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定本文所描述的多肽构建体对于CD277的J构型的选择性或亲合性。例如，配体结合测定可以用于检测CD277-多肽构建体复合物形成的存在，以及多肽构建体与CD277的J构型的结合程度或强度。在一些实施方式中，使用荧光能量共振转移(FRET)来确定多肽构建体和CD277的J构型之间的结合亲合力。FRET能够检测和测量通常非常接近放置的一对光敏分子(例如，荧光团)之间的能量转移。作为光敏分子之一的供体分子(例如，供体荧光团)开始存在于电子激发态并且能够将能量转移至另一个光敏分子，即受体分子(例如，受体荧光团)。从供体向受体的能量转移可以是(例如)通过偶极-偶极偶合所产生的。基于能量转移效率(即FRET效率)与供体和受体之间的距离的六次方成反比，从受体分子向供体分子所转移的能量的测量可以用于估计受体和供体之间的距离。FRET的测量可以(例如)通过荧光-检测显微镜(例如，共聚焦显微镜)或者通过荧光敏感的细胞分选(例如，流式细胞术、荧光-激活的细胞分选)来进行。使用FRET的荧光定量可以通过一些技术中的任何一种或多种来进行，其包括敏化发射、受体光致漂白、荧光-寿命成像显微镜(FLIM)FRET、光谱成像和/或同源-FRET和极化各向异性成像。在一些实施方式中，通过使用供体和受体荧光团来使用FRET。在一些实施方式中，通过使用对细胞表面上的抗原特异的一种或多种荧光标记的抗体来使用FRET。在一些实施方式中，通过使用疏水性的且能够结合至疏水性细胞组分如质膜的一种或多种荧光标记染料来使用FRET。在一些实施方式中，将一种或多种荧光标记的抗体和一种或多种疏水性荧光染料的组合用于进行FRET。在一些实施方式中，将荧光脂质缀合物BODIPY FL与对CD277蛋白上的表位特异的荧光标记的抗体组合使用。在一些实施方式中，单独或与FRET组合使用其他配体结合测定以检测本文所描述的多肽构建体对于CD277的选择性。本文所考虑的配体结合测定的非限制性实例包括其他基于荧光的方法如荧光极化、使用表面等离子共振的细胞表面组分的光反射角的变化的检测、基于放射的配体测定和抗体标记的细胞表面组分的免疫沉淀以及之后的结构分析。
[0141] 在一些实施方式中，在细胞中表达本文所公开的多肽构建体。在一些实施方式中，在细胞的细胞膜上表达所述多肽构建体。在一些实施方式中，多肽构建体可以与细胞相互作用。在一些实施方式中，多肽构建体能够通过细胞的细胞表面蛋白结合。在一些实施方式中，细胞是细胞毒细胞。细胞毒细胞的非限制性实例包括T细胞，表达至少T细胞受体的功能部分(例如，传递免疫活性)的细胞和自然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞表达T细胞受体。在一些实施方式中，细胞表达T细胞受体的至少一部分，其中部分具有T细胞功能(例如，免疫调控)。在一些实施方式中，对细胞工程设计或基因修饰以表达T细胞受体的至少一条链。至少一条链可以是γ-T细胞受体链。至少一条链可以是δ-T细胞受体链或其片段。至少一条链可以是γ9-T细胞受体链或其片段。至少一条链可以是δ2-T细胞受体链或其片段。在一些实施方式中，多肽构建体因此是具有至少一条链或其片段(例如，γ-T细胞受体链或其片段；δ-T细胞受体链或其片段；γ9-T细胞受体链或其片段；或者δ2-T细胞受体链或其片段)的TCR。在一些实施方式中，多肽构建体可以是具有不止一条链的TCR(例如，同源二聚体或异源二聚体)。
[0142] 在一些实施方式中，不通过细胞表达本文所公开的多肽构建体。在一些实施方式中，多肽构建体是合成的(例如，不通过细胞产生)。在一些实施方式中，体外产生多肽构建体。在一些实施方式中，多肽构建体能够结合本文所公开的靶细胞和细胞毒细胞。在一些实施方式中，多肽构建体能够结合本文所公开的靶细胞和细胞毒细胞，借此使靶细胞与细胞毒细胞足够接近以使得细胞毒细胞对靶细胞是细胞毒性的。
[0143] 本文所公开的多肽和蛋白(包括其功能部分和功能变体)可以包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这些合成氨基酸在本领域中是已知的，并且包括(例如)氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、N',N'-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
[0144] 如本文所使用的，“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。全抗体通常由4个多肽组成：重(H)链多肽的两个相同拷贝和轻(L)链多肽的两个相同拷贝。每条重链含有一个N末端可变(VH)区和三个C末端恒定(CH1、CH2和CH3)区，并且每条轻链含有一个N末端可变(VL)区和一个C末端恒定(CL)区。每对轻链和重链的可变区形成了抗体的抗原结合位点。所述VH和VL区具有类似的一般结构，其中每个区包含4个框架区，其序列是相对保守的。通过三个互补决定区(CDR)连接所述框架区。被称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR形成了负责抗原结合的抗体“高变区”。
[0145] “抗原识别部分或域”是指分子或特异性结合至抗原的分子部分。在一个实施方式中，抗原识别部分是抗体、类抗体分子或其片段，并且所述抗原是肿瘤抗原。
[0146] “类抗体分子”可以是(例如)作为能够选择性结合伴侣的Ig-超家族的成员的蛋白。MHC分子和T细胞受体是这些分子。在一个实施方式中，所述类抗体分子是TCR。
[0147] 术语“抗体片段”、“抗体功能片段”和“抗原结合部分”在本文中可互换使用以表示保留了特异性结合至抗原的能力的一个或多个抗体片段或部分(一般地参见，Holliger等人,Nat.Biotech.,23(9):1126-1129(2005))。所述抗体片段所期望地包含(例如)一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH1域所组成的一价片段；(ii)F(ab')2片段，它是包含在茎区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)单链Fv(scFv)，它是由通过使得两个域作为单一多肽链合成的合成接头连接的Fv片段(即VL和VH)的两个域所组成的一价分子(参见，例如，Bird等人,Science,242:423-426
(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)；和Osbourn等人,
Nat.Biotechnol.,16:778(1998))和(v)双链抗体，它是多肽链二聚体，其中每条多肽链包含通过过短以使得相同多肽链上的VH和VL之间不能配对的肽接头连接至VL的VH，借此促使不同VH-VL多肽链上的互补域之间配对以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分
子。抗体片段在本领域中是已知的并且在(例如)美国专利号8,603,950中进行了更详细地描述。
(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)；和Osbourn等人,
Nat.Biotechnol.,16:778(1998))和(v)双链抗体，它是多肽链二聚体，其中每条多肽链包含通过过短以使得相同多肽链上的VH和VL之间不能配对的肽接头连接至VL的VH，借此促使不同VH-VL多肽链上的互补域之间配对以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分
子。抗体片段在本领域中是已知的并且在(例如)美国专利号8,603,950中进行了更详细地描述。
[0148] 工程化T细胞受体(TCR)
[0149] 在一些实施方式中，选择性结合CD277的J构型的多肽构建体包含T细胞受体(TCR)、工程化TCR或其片段。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)由在T细胞表面上配对以形成杂二聚体受体的两条链(αβ或者γδ)组成。αβTCR在体内的大部分T细胞上表达并且已知涉及特定MHC限制性抗原的识别。每个α和β链由两个域组成：将蛋白锚点至细胞膜并且与CD3信号器的恒定亚基有关的恒定域(C)；和通过六个环赋予抗原识别的可变域(V)，其称为互补决定区(CDR)。V域中的每一个包含三个CDR；例如，CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3作为高变区。这些CDR与结合至主要组织相容性复合体(pepMHC)所编码的蛋白的抗原性肽之间所形成的复合物(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA或者HLA-DRB1复合物)相互作用。在一些情况下，恒定域还包含将恒定域连接至可变域的连接区。在一些情况下，β链还包含组成连接区部分的短多变区。
[0150] 在一些情况下，这种TCR对特定肿瘤抗原，例如，NY-ESO、Mage A3、Titin具有反应性。在其他情况下，这些TCR对患者肿瘤内所表达的特异性新抗原具有反应性(即通过肿瘤表达的患者特异的、体细胞的非同义突变)。在一些情况下，工程化TCR可以是亲合力提高的。
[0151] 在一些实施方式中，使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名描述TCR，并将TCR与IMGT TCR序列公共数据库相联系。例如，可以存在通过它们的骨架、CDR1、CDR2和CDR3序列相区分的几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区。照此，可以在IMGT命名中通过独特的TRAV编号来表示Vα类型。例如，“TRAV21”定义了具有独特骨架以及CDR1和CDR2序列，和CDR3序列的TCR Vα区，CDR3序列由在TCR与TCR之间保守的氨基酸序列部分限定，但是其还包括在TCR与TCR之间变化的氨基酸序列。类似地，“TRBV5-1”限定了具有独特骨架以及CDR1和CDR2序列，但是仅具有部分限定的CDR3序列的TCR Vβ区。
[0152] 在一些情况下，在IMGT命名中通过缩写TRBD表示β链多变区。
[0153] 在一些情况下，通过IMGT命名限定的唯一序列是广泛已知的并且是TCR领域的工作者可访问的。例如，它们可见于IMGT公共数据库和“T cell Receptor Factsbook”,
(2001)LeFranc and LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8。
(2001)LeFranc and LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8。
[0154] 在一些实施方式中，作为具有胞质和跨膜域两者的全长链转染(例如)αβ杂二聚体TCR。在一些情况下，TCR在各个恒定域的残基之间含有所引入的二硫键如(例如)WO 2006/000830中所述的。
[0155] 在一些情况下，本文所描述的TCR处于单链形式，例如，参见WO 2004/033685。单链形式包括Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ、Vα-Cα-L-Vβ-Cβ型的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，并且L是接头序列。在某些实施方式中，本发明公开的单链TCR可以在各个恒定域的残基之间具有所引入的二硫键如WO 2004/033685中所述的。
[0156] 与αβTCR相反，γδTCR由一个γ链和一个δ链组成。尽管体内比αβT细胞中的丰度要低得多，但是γδT细胞将有效力的抗肿瘤效应因子功能与广泛表达的肿瘤结合分子的识别相组合，并因此在癌症免疫疗法中是临床应用的有力候选。大部分γδT细胞以不依赖于MHC的方式激活，并且不需要抗原处理，这与MHC限制性αβT细胞相反。作为替代，γδT细胞依赖于和抗原递呈细胞的细胞-细胞接触，并且直接识别处于完整蛋白或非肽化合物形式的抗原。对于这种相互作用，可变区的CDR3域是特别重要的。对于这种相互作用，可变区的CDR3域是特别重要的。与αβTCR或抗体相比，γδTCR的可变(V)和恒定(C)区的取向是独特的，并且由Vγ和Cγ域之间的小角度产生。尽管γδTCR V域在结构上与αβTCR类似，但是γδTCR C域是明显不同的。Cγ和Cδ中的结构差异，包括它们之间二硫键的位置可以使得γδTCR能够形成与αβTCR不同的识别/信号转导复合物(Allison等人“,Structure of a human γδ T-cell antigen receptor,”Nature,411:820-824)。通过靶细胞上TCR介导的抗原识别的γδT细胞的激活可以导致细胞因子和趋化因子的产生以及靶细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞溶解。
[0157] 作为人外周血中的主要γδT细胞亚型，Vγ9Vδ2 T细胞表达由Vγ9和Vδ2链组成的γδTCR，并且通过哺乳动物甲羟戊酸途径的中间产物如异戊烯焦磷酸酯(IPP)或者微生物2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸酯(MEP)途径的中间产物特异性激活。肿瘤细胞中由于甲羟戊酸途径的调控异常或者由于微生物感染所造成的胞内磷酸抗原(pAg)水平积累使得能够通过Vγ9Vδ2细胞靶向转化或感染的细胞。类似地，可以通过用甲羟戊酸途径抑制剂如氨基二膦酸酯(ABP)处理细胞来通过药物提高胞内pAg水平，借此使细胞对通过Vγ9Vδ2 T细胞的识别敏化。
[0158] 在一些实施方式中，可以在工程设计以表达一种或多种Vγ9Vδ2 TCR的αβT细胞中表达通过Vγ9Vδ2 T细胞内源表达的TCR，借此对αβT细胞重新编程。例如，工程设计以表达一种限定的Vγ9Vδ2 TCR的CD4+αβT细胞可以用于在功能上对肿瘤细胞筛选对于T细胞识别重要的蛋白，以消除通过多种γδTCR组库的识别中的波动。
[0159] 在一些实施方式中，本文所描述的Vγ9Vδ2 TCR识别靶细胞(例如，肿瘤细胞)所表达的CD277(BTN3A1)蛋白。在一些实施方式中，本文所描述的Vγ9Vδ2 TCR识别包括在靶细胞表面上表达的CD277蛋白的J构型的表位。在一些实施方式中，本文所描述的Vγ9Vδ2 TCR识别限制于在靶细胞表面上表达的CD277蛋白的J构型的表位。
[0160] 在一些实施方式中，本文所描述的药物组合物包含多肽构建体，其包括包含能够识别靶细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞表面上的CD277蛋白的γ-TCR氨基酸序列或者δ-TCR氨基酸序列中的至少一种的Vγ9Vδ2 TCR。在一些实施方式中，多肽构建体包括能够识别靶细胞的细胞表面上的CD277蛋白的γ-TCR氨基酸序列或者δ-TCR氨基酸序列中的至少一种的变体或片段。本发明公开考虑了包含能够通过CD277细胞表面分子识别靶细胞(例如，肿瘤细胞)的γδTCR的任何部分或片段或变化的多肽构建体。在一些实施方式中，多肽构建体包含γδTCR的Cγ或Cδ区的至少一部分和Vγ或Vδ区的至少一部分。在一些实施方式中，多肽构建体包含γδTCR的Cγ或Cδ区的至少一部分和Vγ或Vδ域的至少CDR3域。在一些实施方式中，多肽构建体包含Vγ9Vδ2 TCR的所有CDR区，并且所有CDR区可以参与和靶细胞表面上的细胞表面分子(例如，CD277分子)的结合(例如，参见，Wang等人,“V{gamma}2V{delta}2 T cell receptor recognition of prenyl pyrophosphates is dependent on all CDRs,”J Immunol,184,6209-6222(2010))。
[0161] 本文所描述的TCR可以与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相关。
[0163] 效应细胞
[0164] 提供了修饰以表达一种或多种异源基因或编码本文所公开的多肽构建体的基因的效应细胞，其中所述多肽构建体选择性结合CD277的J构型。
[0165] 可以相对于表达αβTCR的T淋巴细胞的功能定义“αβΤ细胞”或者“αβΤ细胞”，其识别结合至MHC分子(主要组织相容性复合体)的肽，其在多种细胞表面上表达。MHC提供了来源于细胞蛋白的肽。当(例如)用病毒感染细胞时，MHC将提供病毒肽，并且αβTCR和MHC-复合物之间的相互作用激活了特定类型的T细胞，其引起免疫应答以消除感染的细胞。因此，可以在功能上将αβΤ细胞定义为能够识别结合至MHC分子的肽的细胞。可以使用如下的对αβT细胞受体特异的抗体(例如，对人αβTCR特异的BW242抗体)识别αβΤ细胞。αβΤ细胞可以(例如)通过CD3抗原选自外周血，因为大多数的T细胞具有αβTCR。这种选择还将包括γδΤ细胞。根据这些所选的细胞，可以确定对应于αΤ细胞受体链和βΤ细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列。因此，αβΤ细胞还可以定义为包含对应于αΤ细胞受体链和/或βΤ细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列的细胞。
[0166] “γδΤ细胞”或者“γδΤ细胞”代表了小的T细胞亚型，对于这些T细胞亚型来说，引发其激活作用的抗原性分子是基本未知的。γδT细胞可以认为是适应性免疫组分，其中它们使TCR基因重排以产生功能多样性并将发展出记忆表型。然而，多种亚型也可以认为是先天免疫的一部分，其中将限制性TCR用作模式识别受体。可以使用对γδT细胞受体特异的抗体来识别γδΤ细胞。适合于FACS的抗体是广泛可用的。选择条件如通过抗体生产商所提供的允许选择阴性和/或阳性细胞的条件。可以是适合的抗体的实例可得自BD Pharmingen(BD,1Becton Drive,Franklin Lakes,NJ USA)、TCR-APC(克隆B1，#555718)或者如得自Beckman Coulter的泛-TCR-PE(克隆I MMU510，#I M1418U)。同样，根据这些所选的细胞，可以确定对应于γΤ细胞受体链和/或δΤ细胞受体链的核酸(或氨基酸序列)序列。因此，γδΤ细胞还可以定义为包含对应于γΤ细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列的细胞。
[0167] 在一个方面，本文所公开的组合物可以使用细胞。细胞可以是原代细胞。细胞可以是重组细胞。细胞可以得自一些非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸膜积液、脾脏组织和肿瘤。例如，可以使用任何T细胞系。可替代地，细胞可以来源于健康供体，来源于诊断患有癌症的患者或者来源于诊断患有感染的患者。在另一个实施方式中，细胞可以是表现出不同表型特征的混合细胞群体的一部分。细胞还可以得自细胞疗法库。可以获得对免疫抑制治疗耐受的破裂的细胞。还可以在修饰之前选择所期望的细胞群体。选择可以包括以下各项中的至少一种：磁力分离、流式细胞选择、抗生素选择。一种或多种细胞可以是任何血细胞如外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。一种或多种细胞可以是任何免疫细胞如淋巴细胞、B细胞或T细胞。细胞还可以得自受试者的全血、单采或肿瘤样品。细胞可以是肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，单采可以是白细胞除去法。白细胞除去法可以是其中从血液分离血细胞的程序。在白细胞除去法期间，可以从受试者手臂中的针头中移除血液，将其在将全血分为红细胞、血浆和淋巴细胞的机器中循环，然后将血浆和红细胞通过另一手臂中的针头返回至受试者。在一些情况下，在治疗方案和细胞疗法的施用之后分离细胞。例如，可以与细胞施用依次或同时进行单采。在一些情况下，在细胞产物施用之前和之后多至约6个月进行单采。在一些情况下，在细胞产物施用之后-3周、-2周、-1周、0、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或多至约10年进行单采。在一些情况下，通过单采所获得的细胞可以经历对特异性溶胞、细胞因子释放、代谢组学研究、生物能学研究、胞内细胞因子产生的FAC、ELISA斑点测定和淋巴细胞亚型分析的测试。在一些情况下，可以将细胞产物或单采产物样品冷冻保存以用于输注细胞表型和功能的回顾性分析。
[0168] 在一个方面，本文提供的组合物可以包含TIL。TIL可以分离自罹患癌症的器官。一个或多个细胞可以分离自患有癌症的器官，所述器官可以是脑、心脏、肺、眼、胃、胰脏、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指甲、耳、腺、鼻、口、唇、脾脏、齿龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃腺、咽、食管、大肠、小肠、直肠、肛门、甲状腺、胸腺、骨、软骨、腱、韧带、肾上腺、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、精巢、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结或淋巴管。一个或多个TIL可以来自脑、心脏、肝、皮肤、肠、肺、肾、眼、小肠或胰脏。TIL可以来自胰脏、肾、眼、肝、小肠、肺或心脏。TIL可以来自胰脏。所述一个或多个细胞可以是胰岛细胞，例如，胰腺β细胞。在一些情况下，TIL可以来自胃肠癌症。可以通过一些方法制备TIL培养物。例如，可以从非癌性组织或坏死区剪掉肿瘤。然后，可以将肿瘤破碎成约2-3mm长。在一些情况下，可以将肿瘤破碎成约0.5mm至约5mm大小，约1mm至约2mm，约2mm至约3mm，约3mm至约4mm，或者约4mm至约5mm。然后，可以使用培养基和细胞刺激剂如细胞因子离体培养肿瘤碎片。在一些情况下，可以使用IL-2从肿瘤片段扩增TIL。
[0169] 在一些实施方式中，修饰的效应细胞是包含修饰以编码用于表达本文所描述的多肽构建体的特定核酸序列的T细胞和/或自然杀伤细胞的修饰的免疫细胞。
[0170] 具有本文所描述的外源免疫受体的工程化T细胞是已工程设计，从而使得它们表达外源受体，例如，特异性结合至CD277的J构型的多肽构建体的T细胞。可以从转基因构建体而非内源基因座表达外源受体。外源受体可以具有与工程设计以提供具有外源受体的工程化T细胞的T细胞的来源不同的来源，即来自另一物种。外源受体可以具有与工程设计以提供具有外源受体的工程化T细胞的T细胞的来源相同的来源，即来自相同物种。外源受体还可以是工程γδT细胞受体或工程αβT细胞受体，其工程设计以选择性结合CD277的J构型。
[0171] 在一些情况下，工程化T细胞受体是其氨基酸序列已修饰从而使其具有与内源T细胞受体的相应氨基酸序列相比不同的氨基酸序列的T细胞受体。
[0172] 辅助T细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其他白血球，包括B细胞向浆细胞和记忆B细胞的成熟以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。在一些情况下，由于细胞表面上CD4糖蛋白的表达，因此将TH细胞称为CD4+T细胞。当通过抗原递呈细胞(APC)表面上表达的MHC II型分子的肽抗原递呈时，辅助性T细胞被激活。一旦激活，它们快速分裂并分泌被称为细胞因子的调节或帮助主动免疫应答的小蛋白。这些细胞可以分化为几种亚型中的一种，其包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以有利于不同类型的免疫应答。
来自APC的信号将T细胞导向至具体亚型。
来自APC的信号将T细胞导向至具体亚型。
[0173] 细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒-感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞还被称为CD8+T细胞，因为它们在它们的表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合至在所有有核细胞表面上递呈的与MHC I型分子有关的抗原来识别它们的靶标。
通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷酸及其他分子，CD8+细胞可以失活为无反应性状态，其防止了自体免疫疾病。
通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷酸及其他分子，CD8+细胞可以失活为无反应性状态，其防止了自体免疫疾病。
[0174] 记忆T细胞是在感染消除之后长期持续的抗原特异性T细胞亚型。一旦再次暴露于它们的同源抗原，则它们快速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供了抵抗以往感染的“记忆”。记忆T细胞包括亚型：干细胞样记忆T细胞(TSCM)、中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞可以表达细胞表面蛋白CD45RO、CD45RA和/或CCR7。
[0175] 调节性T细胞(Treg细胞)，先前被称为抑制T细胞，它在免疫耐受性的维持中起作用。它们的主要作用是关闭对免疫反应终点的T细胞介导的免疫性和抑制逃避胸腺中的阴性选择过程的自体反应性T细胞。
[0176] 自然杀伤T细胞(NKT细胞)将适应性免疫系统与天然免疫系统相连接。不同于识别通过主要组织相容性复合体(MHC)分子递呈的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别通过被称为CD1d分子所递呈的糖脂质抗原。一旦激活，这些细胞可以发挥归因于Th和Tc细胞两者的功能(即细胞因子的产生和溶胞/细胞杀死分子的释放)。它们还能够识别和消除一些肿瘤细胞以及被疱疹病毒感染的细胞。
[0177] 自然杀伤(NK)细胞是一类天然免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。在一些情况下，NK细胞提供了对病毒感染和/或肿瘤形成的一线防御。NK细胞可以检测感染或癌性细胞上所递呈的MHC，引发细胞因子释放并随后引起溶胞和细胞凋亡。NK细胞可以在不存在抗体和/或MHC的情况下进一步检测受胁迫的细胞，借此允许快速免疫应答。
[0178] 在一些情况下，可以在细胞疗法中利用的细胞或可以在本文所提供的方法中使用的细胞对于给定因子可以是阳性或阴性的。在一些实施方式中，细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择素+细胞、L-选择素-细胞、CD25+、CD25-细胞、CD27+、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞、IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞或其分化或去分化的细胞。通过细胞所表达的因子的实例不意欲是限制性的，并且本领域的技术人员将理解细胞对于本领域中已知的任何因子可以是阳性或阴性的。在一些实施方式中，细胞可以对于两种或更多种因子是阳性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8+。在一些实施方式中，细胞可以对于两种或更多种因子是阴性的的。例如，细胞可以是CD25-、CD44-和CD69-。在一些实施方式中，细胞可以对于一种或多种因子是阳性的，并且对于一种或多种因子是阴性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8-。然后，可以将所选细胞输注至受试者。在一些实施方式中，可以对细胞选择具有或不具有一种或多种给定因子(例如，可以基于一种或多种因子的存在或不存在来分离细胞)。在一些实施方式中，还可以体外扩增所选细胞。在输注前，可以体外扩增所选细胞。应理解在本文所公开的任何方法中所使用的细胞可以是本文所公开的任何细胞的混合物(例如，两种或更多种不同的细胞)。例如，本发明公开所述的方法可以包含细胞，并且所述细胞是CD4+细胞和CD8+细胞的混合物。在另一个实例中，本发明公开所述的方法可以包含细胞，并且所述细胞是CD4+细胞和原初细胞的混合物。在一些情况下，细胞可以是干细胞样记忆TSCM细胞，其包括CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+，干细胞样记忆细胞还可以表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并且显示出多种干细胞样记忆细胞特有的功能属性。
工程化的细胞还可以是包含L-选择素和CCR7的中央记忆TCM细胞，其中所述中央记忆细胞可以分泌(例如)IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。工程化的细胞还可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并且产生(例如)效应细胞因子如IFNγ和IL-4。在一些情况下，可以将细胞群体引入受试者。例如，细胞群体可以是T细胞和NK细胞的组合。在其他情况下，群体可以是原初细胞和效应细胞的组合。细胞群体可以是TIL。
工程化的细胞还可以是包含L-选择素和CCR7的中央记忆TCM细胞，其中所述中央记忆细胞可以分泌(例如)IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。工程化的细胞还可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并且产生(例如)效应细胞因子如IFNγ和IL-4。在一些情况下，可以将细胞群体引入受试者。例如，细胞群体可以是T细胞和NK细胞的组合。在其他情况下，群体可以是原初细胞和效应细胞的组合。细胞群体可以是TIL。
[0179] 具体地，可以通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或者固定在表面上的抗CD2抗体接触，或者通过与有时与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)接触来体外刺激T细胞群体。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，可以使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可以在刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。在一些情况下，4-1BB可以用于刺激细胞。例如，可以用4-1BB和IL-21或另一种细胞因子来刺激细胞。为了刺激CD4 T细胞或CD8 T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供信号的试剂可以处于溶液中或者与表面偶联。颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的粒径。在其他实施方式中，可以将细胞如T细胞与试剂涂覆珠结合，其中随后可以分离株和细胞，并可选地培养。可以用抗CD3抗体或抗CD28抗体中的任一种，或者在一些情况下，用两者的组合涂覆每一个珠。在替代实施方式中，在培养之前，试剂涂覆珠和细胞不分离，而是一起培养。可以通过使抗CD3和抗CD28可以连接的顺磁珠(3×28珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一些情况下，将细胞和珠(例如，比例为1:1的 M-450CD3/
CD28T顺磁珠)在缓冲液，例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，无二价阳离子如钙和镁)中合并。可以使用任何细胞浓度。可以将混合物培养或培养约几个小时(例如，约3个小时)至或者至约14天或者它们之间的任何整数小时值。在另一个实施方式中，可以将混合物培养或培养约21天或者多至或多至约21天。适合于T细胞培养的条件可以包括适当的培养基(例
如，最低必需培养基或RPMI Media 1640或者，X-vivo 5(Lonza))，其可以含有增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎儿牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TNFα或者细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1 M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer，并且具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，培养基是无血清的或补充有对于T细胞的生长和扩增来说足够的适当的量的血清(或血浆)或者限定的激素组
和/或适当的量的细胞因子。在一些情况下，865mL的RPMI瓶可以具有100mL人血清，25mL Hepes 1M，10mL青霉素/链霉素(10,000U/mL和10,000μg/mL)和0.2mL 50mg/mL的庆大霉素。
在添加剂添加之后，可以使用0.2μm×1L过滤器过滤RPMI培养基并在4℃储存。在一些实施方式中，仅在实验培养中包含抗生素，例如，青霉素和链霉素，而在将向受试者输注的细胞培养中不包含。在一些情况下，人血清可以在37℃水浴中融化，然后热失活(例如，对于
100mL瓶，56℃，30min)。在添加培养基之前，可以通过0.8μm和0.45μm过滤器过滤血清。
CD28T顺磁珠)在缓冲液，例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，无二价阳离子如钙和镁)中合并。可以使用任何细胞浓度。可以将混合物培养或培养约几个小时(例如，约3个小时)至或者至约14天或者它们之间的任何整数小时值。在另一个实施方式中，可以将混合物培养或培养约21天或者多至或多至约21天。适合于T细胞培养的条件可以包括适当的培养基(例
如，最低必需培养基或RPMI Media 1640或者，X-vivo 5(Lonza))，其可以含有增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎儿牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TNFα或者细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1 M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer，并且具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，培养基是无血清的或补充有对于T细胞的生长和扩增来说足够的适当的量的血清(或血浆)或者限定的激素组
和/或适当的量的细胞因子。在一些情况下，865mL的RPMI瓶可以具有100mL人血清，25mL Hepes 1M，10mL青霉素/链霉素(10,000U/mL和10,000μg/mL)和0.2mL 50mg/mL的庆大霉素。
在添加剂添加之后，可以使用0.2μm×1L过滤器过滤RPMI培养基并在4℃储存。在一些实施方式中，仅在实验培养中包含抗生素，例如，青霉素和链霉素，而在将向受试者输注的细胞培养中不包含。在一些情况下，人血清可以在37℃水浴中融化，然后热失活(例如，对于
100mL瓶，56℃，30min)。在添加培养基之前，可以通过0.8μm和0.45μm过滤器过滤血清。
[0180] 在一个方面，可以将细胞维持在支持生长所必需的条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。在一些情况下，已暴露于不同刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。在一些情况下，可以使用抗人CD3、CD28、CD2或它们的任何组合的可溶性单特异性四聚体抗体。
[0181] 修饰的效应细胞剂量
[0182] 本文提供了编码选择性结合细胞表面CD277的J构型的多肽构建体的修饰的效应细胞。在一些实施方式中，向对其有需要的受试者施用一定量的修饰的效应细胞，并且基于引起细胞因子相关毒性的效力和潜能来确定所述量。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约103至约1010个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约104至约108个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约105至约107个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约106至约109个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约106至约108个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约107至约108个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约105至约106个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约106至约107个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约107至约108个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约108至约
109个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约109个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约108个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约107个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约106个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约105个修饰的效应细胞/kg。
109个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约109个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约108个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约107个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约106个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的量包括约105个修饰的效应细胞/kg。
[0183] 在一些实施方式中，修饰的效应细胞是编码选择性结合CD277的J构型的γδTCR或其片段的修饰的T细胞。在一些情况下，工程γδTCR T细胞的量包括约105至约109个γδTCR细胞/kg。在一些情况下，工程γδTCR细胞的量包括约105至约108个γδTCR细胞/kg。在一些情况下，工程γδTCR细胞的量包括约107至约109个γδTCR细胞/kg。在一些情况下，工程γδTCR细胞的量包括约105至约106个γδTCR细胞/kg。
[0184] 细胞因子
[0185] 本文提供了编码本文所描述的多肽构建体和细胞因子或其变体或衍生物的多核苷酸，以及引入它们的方法和系统。细胞因子是参与细胞信号转导的约5-20kDa之间的小蛋白种类。在一些情况下，细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些实施方式中，趋化因子起化学引诱剂的作用以引导细胞的迁移，并且将趋化因子分为4个亚家族：CXC、CC、CX3C和XC。示例性的趋化因子包括来自CC亚家族的趋化因子：
CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28；来自CXC亚家族的趋化因子：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；来自XC亚家族的趋化因子：XCL1和XCL2；和来自CX3C亚家族的CX3CL1。
CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28；来自CXC亚家族的趋化因子：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；来自XC亚家族的趋化因子：XCL1和XCL2；和来自CX3C亚家族的CX3CL1。
[0186] 干扰素(IFN)包括I型干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω)、II型干扰素(例如，IFN-γ)和III型干扰素。在一些实施方式中，IFN-α进一步分为约13个亚型，其包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。
[0187] 白细胞或白血球表达白介素，并且白介素促进T和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。示例性的白介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35和IL-36。
[0188] 肿瘤坏死因子(TNF)是一组调节细胞凋亡的细胞因子。在一些情况下，TNF家族内存在约19个成员，其包括但不限于TNFα、淋巴细胞毒素-α(LT-α)、淋巴细胞毒素-β(LT-β)、T细胞抗原gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。
[0189] 集落刺激因子(CSF)是与造血干细胞表面上的受体蛋白相互作用的分泌的糖蛋白，其随后调节特定种类的血细胞的细胞增殖和分化。在一些情况下，CSF包括巨噬细胞集落刺激因子、粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)或者promegapoietin。
[0190] 在一些实施方式中，本文所描述的一种或多种方法还包括细胞因子的施用。在一些情况下，细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些情况下，本文所描述的一种或多种方法还包括细胞因子的施用，细胞因子选自趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。
[0191] 适应症
[0192] 在一些实施方式中，本文公开了向患有病症，例如，癌症的受试者施用编码本文所描述的多核苷酸的修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，癌症是转移性癌症。在其他情况下，癌症是复发性或难治性癌症。
[0193] 在一些情况下，癌症是实体瘤或恶性血液病。在一些情况下，癌症是实体瘤。在其他情况下，所述癌症是恶性血液病。
[0194] 在一些情况下，所述癌症是实体瘤。示例性的实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆管癌(即肝胆管型肝癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；原发不明癌症(CUP)；食道癌；眼癌；输卵管癌；胃肠癌；肾癌；肝癌；肺癌；成神经管细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；咽喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；或者外阴癌。
[0195] 在一些情况下，癌症是恶性血液病。在一些情况下，恶性血液病包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。在一些情况下，恶性血液病包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些情况下，示例性恶性血液病包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高风险CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、节边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、非伯基特氏高度B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或者淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方式中，恶性血液病包括骨髓性白血病。在一些实施方式中，恶性血液病包括急性髓细胞性白血病(AML)或者慢性粒细胞性白血病(CML)。
[0196] 在一些情况下，本文公开了向患有恶性血液病的受试者施用本文所描述的修饰的效应细胞的方法，所述恶性血液病选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高风险CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、节边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、非伯基特氏高度B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或者淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情况下，本文公开了向患有选自AML或CML的恶性血液病的受试者施用修饰的效应细胞的方法。
[0197] 免疫效应细胞来源
[0198] 在某些方面，本文所描述的实施方式包括制备和/或扩增免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞或NK T细胞)的方法，包括用含有编码选择性结合细胞表面CD277的J构型的多肽的DNA(或RNA)构建体的表达载体转染细胞，然后可选地，用饲养细胞、重组抗原或所述受体的抗体刺激所述细胞以使所述细胞增殖。在某些方面，工程设计以表达选择性结合细胞表面CD277的J构型的多肽的细胞(或细胞群体)是干细胞、iPS细胞、免疫效应细胞或这些细胞的前体。
[0199] 免疫效应细胞的来源可以包括同种异体来源和自体同源来源两者。在一些情况下，免疫效应细胞可以与干细胞或者诱导的多潜能干细胞(iPSC)相区分。因此，根据实施方式的工程化的细胞可以分离自脐带血、外周血、人胚胎干细胞或者iPSC。例如，可以修饰同种异体T细胞以包含嵌合抗原受体(和可选地，缺少功能性TCR)。在一些方面，所述免疫效应细胞主要是人T细胞如来源于人外周血单核细胞(PBMC)的T细胞。PBMC可以采集自外周血，或者在用G-CSF(粒性白细胞集落刺激因子)刺激之后，采集自骨髓，或者采集自脐带血。在转染或转导(例如，用CAR表达构建体)之后，可以立即输注所述细胞或者可以将所述细胞低温保存。在某些方面，在转染后，可以在基因向细胞转移后约1、2、3、4、5天或更长时间内，细胞可以作为整体群体离体增殖数日、数周或数月。在另一个方面，在转染后，将所述转染子克隆，并且将显示出单一整合或游离基因维持的表达盒或质粒的存在以及显示出嵌合抗原受体的表达的克隆离体扩增。选择进行扩增的克隆显示出特异性识别和裂解抗原表达靶细胞的能力。可以通过用IL-2或结合γ公共链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-
21等)刺激来使重组T细胞扩增。可以通过用人工抗原递呈细胞的刺激来扩增重组T细胞。可以在人工抗原递呈细胞上或使用交联T细胞表面上的CD3的抗体如OKT3使重组T细胞扩增。
可以通过使用磁珠基分离方法和/或荧光激活细胞分选术技术进一步选择重组T细胞亚型，并与AaPC一起进一步培养。在另一个方面，可以将基因修饰的细胞冷冻保存。
21等)刺激来使重组T细胞扩增。可以通过用人工抗原递呈细胞的刺激来扩增重组T细胞。可以在人工抗原递呈细胞上或使用交联T细胞表面上的CD3的抗体如OKT3使重组T细胞扩增。
可以通过使用磁珠基分离方法和/或荧光激活细胞分选术技术进一步选择重组T细胞亚型，并与AaPC一起进一步培养。在另一个方面，可以将基因修饰的细胞冷冻保存。
[0200] T细胞还可以得自一些来源，其包括外周血、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸膜积液、脾脏组织和肿瘤(肿瘤浸润的淋巴细胞)。在本发明公开的某些实施方式中，可以使用在本领域中可用的多种T细胞系。在本发明公开的某些实施方式中，T细胞可以得自使用多种技术人员已知的技术如 分离从受试者采集的血液单元。在实施方式中，通过单采法从个体循环血液中获得细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒性白细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可以清洗通过单采所采集的细胞以除去血浆部份并且将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。在替代实施方式中，清洗溶液缺少钙，并且可以缺少镁，或者可以缺少多种二价阳离子(如果不是全部的话)。在不存在钙的情况下的初始激活步骤导致激活作用放大。如本领域常规技术人员将容易理解的，可以通过本领域中已知的方法完成清洗步骤如根据生产商的说明，通过使用半自动化“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或者Haemonetics Cell Saver 5)。清洗后，可以将细胞在多种生物相容的缓冲液中再悬浮如(例如)无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或者使用或不使用缓冲液的其他盐溶液。可替代地，可以除去单采样品中不期望的成分并且将细胞直接在培养基中再悬浮。
[0201] 在另一个实施方式中，通过红细胞溶胞和(例如)通过 梯度离心或通过逆流离心淘选的单核细胞消除，从外周血单核细胞中分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。
[0202] 可以通过抗阴性选择的细胞所特有的表面标志物的抗体的组合来实现通过阴性选择的T细胞群体的富集。一种方法是通过使用抗阴性选择细胞上所存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的阴性磁免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可以期望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、
CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。可替代地，在某些实施方式中，通过抗CD25缀合珠或其他类似的选择方法来消除调节性T细胞。
CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。可替代地，在某些实施方式中，通过抗CD25缀合珠或其他类似的选择方法来消除调节性T细胞。
[0203] 对于通过阳性或阴性选择的所期望的细胞群体的分离，细胞和表面(例如，颗粒如珠)的浓度可以是不同的。在某些实施方式中，可以期望显著降低其中珠和细胞混合在一起的体积(即，提高细胞的浓度)，以保证细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用了20亿个细胞/毫升的浓度。在一个实施方式中，使用了10亿个细胞/毫升的浓度。在其他实施方式中，使用了大于1亿个细胞/毫升。在其他实施方式中，使用了1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/毫升的细胞浓度。在另一个实施方式中，使用了7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/毫升的细胞浓度。在其他实施方式中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可以使得细胞得率、细胞激活作用和细胞扩增提高。此外，高细胞浓度的使用使得能够更有效地捕获可以微弱表达所关心的靶标抗原的细胞如CD28-阴性T细胞，或者来自其中存在多种肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这些细胞群体可以具有治疗价值并且将是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞使得能够更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
[0204] 在相关实施方式中，可以期望使用低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠)的混合物，使得颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量要结合至所述颗粒的所期望的抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且与稀浓度中的CD8+T细胞相比，能够更有效地捕获所述CD4+T细胞。在一个实施方式中，所使用的细胞浓度是5×106/ml。在其他实施方式中，所使用的浓度可以是约1×105/ml至1×106/ml，以及它们之间的任何整数值。
[0205] 在其他实施方式中，可以将细胞在回转装置上，在2-10℃或在室温下以不同的速度培育不同的时间长度。
[0206] 在清洗步骤之后，还可以将用于刺激的T细胞冷冻。在除去血浆和血小板的清洗步骤之后，可以将细胞在冷冻溶液中混悬。尽管多种冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在该背景中将是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或者含有10％Dextran 40和5％葡萄糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或者31.25％Plasmalyte-A，31.25％葡萄糖5％，0.45％NaCl，10％Dextran 40和5％葡萄糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或者含有(例如)羟乙基淀粉和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻媒介，然后将细胞以1°/分钟的速度冷冻至-80℃，并在液氮贮槽的汽相中保存。可以使用其他受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中不受控制的速冻法。
[0207] 在某些实施方式中如本文所描述的将冷冻保存的细胞融化并清洗，并在使用本发明公开所述的方法激活之前，使其在室温下静置1小时。
[0208] 还在本发明公开的背景中考虑了在可能需要如本文所描述的扩增细胞之前的时间段内，从受试者采集血液样品或单采产物。照此，可以在任何所需的时间点收集要扩增的细胞来源，并且将所期望的细胞如T细胞分离并冷冻以用于随后在将受益于T细胞疗法的多种疾病或病况如本文所描述的那些的T细胞疗法中使用。在一个实施方式中，血液样品或单采样品采集自一般健康受试者。在某些实施方式中，血液样品或单采样品采集自处于发生疾病的风险，但是尚未出现疾病的一般健康受试者，并且将所关心的细胞分离并冷冻以用于随后的使用。在某些实施方式中，T细胞可以扩增、冷冻并随后使用。在某些实施方式中，在如本文所描述的特定疾病的诊断后不久，但在任何治疗之前，从患者采集样品。在其他实施方式中，在多种相关治疗方式之前，从来自受试者的血液样品或单采样品分离细胞，所述治疗方式包括但不限于使用试剂如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂、化疗、辐射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐射的治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙神经素(环胞霉素和FK506)或者抑制对于生长因子所引起的信号转导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66:
807-815,(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321,(1991)；Bierer等人,
Curr.Opin.Immun 5:763-773,(1993))。在其他实施方式中，对于患者分离细胞，并将细胞冷冻以结合(例如，之前、同时或之后)骨髓或干细胞移植、使用化疗剂如氟达拉滨、外放射线疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法用于后期使用。在另一个实施方式中，在B细胞消融疗法之前分离细胞，并且可以将细胞冷冻以用于B细胞消融疗法如与CD20反应的试剂，例如，利妥昔单抗(Rituxan)之后的后期治疗使用。
807-815,(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321,(1991)；Bierer等人,
Curr.Opin.Immun 5:763-773,(1993))。在其他实施方式中，对于患者分离细胞，并将细胞冷冻以结合(例如，之前、同时或之后)骨髓或干细胞移植、使用化疗剂如氟达拉滨、外放射线疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法用于后期使用。在另一个实施方式中，在B细胞消融疗法之前分离细胞，并且可以将细胞冷冻以用于B细胞消融疗法如与CD20反应的试剂，例如，利妥昔单抗(Rituxan)之后的后期治疗使用。
[0209] 在本发明公开的其他实施方式中，T细胞直接得自治疗后的患者。在这方面，已观察到在某些癌症治疗之后，具体地，在使用破坏免疫系统的药物治疗之后，在患者通常将从治疗中恢复的时间段内的治疗后不久，对于离体扩增能力来说，所获得的T细胞的品质可以是最优的或者改善的。同样地，在使用本文所描述的方法的离体操作之后，这些细胞可以处于移植和体内扩增提高的优选状态。因此，在本发明公开的背景内，考虑在该恢复期内采集血细胞，包括T细胞、树突状细胞或其他造血系细胞。此外，在某些实施方式中，动员(例如，使用GM-CSF动员)和调节方案可以用于在受试者中产生其中特别是在疗法后的限定时间窗内，有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件。示例性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞及其他免疫系统的细胞。
[0210] T细胞的激活和扩增
[0211] 在某些实施方式中，T细胞包含编码选择性结合CD277的J构型的本文所描述的多肽构建体的多核苷酸。在T细胞遗传修饰以表达所期望的多肽构建体之前或之后，可以一般地使用如以下专利中所描述的方法来激活和扩增T细胞，所述专利(例如)美国专利号6,
352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,
575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,
867,041和美国专利申请公开号20060121005。
352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,
575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,
867,041和美国专利申请公开号20060121005。
[0212] “继承性T细胞转移”是指肿瘤特异性T细胞的分离和离体扩增以实现比可以通过单独疫苗接种或者患者的天然肿瘤反应所获得的数目更大数目的T细胞。对于本发明公开，可以(例如)通过工程设计T细胞以表达选择性结合细胞表面CD277的J构型的本文所描述的多肽构建体来获得肿瘤特异性T细胞。然后，可以将所述肿瘤特异性T细胞输注到患有癌症的患者中以为他们的免疫系统提供通过可以攻击和杀死癌症的T细胞来压制剩余肿瘤的能力。存在多种形式的过继性T细胞疗法，其正在用于癌症治疗；培养肿瘤浸润淋巴细胞或TIL，分离和扩增一种特定的T细胞或克隆，并且甚至使用已工程设计的T细胞来有效识别和攻击肿瘤。
[0213] 药物组合物和剂量形式
[0214] 在一些实施方式中，本文公开了用于在受试者中施用的包含本文所公开的多肽构建体、编码多肽构建体的多核苷酸或者表达多肽构建体的工程化的细胞的组合物。在一些情况下，修饰的效应细胞组合物编码本文所公开的多核苷酸或多肽，并且可选地含有细胞因子和/或其他治疗剂如哺乳动物甲羟戊酸途径如异戊烯焦磷酸酯(IPP)和微生物的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸酯(MEP)途径的中间产物。在一些实施方式中，药物组合物可以包含提高受试者的靶细胞(例如，癌细胞)中的RhoB GTP酶的活性的试剂。在一些实施方式中，试剂可以提高RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位。在一些实施方式中，试剂可以将RhoB GTP酶维持在癌细胞的细胞膜。在一些实施方式中，试剂可以提高RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位。在一些实施方式中，试剂可以提高编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达。在一些实施方式中，试剂可以提高RhoB GTP酶的稳定性。在一些实施方式中，试剂可以提高RhoB GTP酶和BNT3蛋白之间的相互作用。在一些实施方式中，试剂可以激活RhoB GTP酶。在一些实施方式中，试剂可以提高RhoB GTP酶和GTP之间的相互作用。在一些实施方式中，试剂可以降低RhoB GTP酶和GDP之间的相互作用。在一些实施方式中，试剂可以提高癌细胞中GTP的量。在一些实施方式中，试剂可以提高癌细胞中GTP的利用度。在一些实施方式中，试剂可以缀合至结合癌细胞上细胞表面分子的部分，借此将试剂靶向癌细胞。在一些实施方式中，部分包含小分子化合物、肽或者抗体或抗原结合片段。在一个方面，通过结合至反过来刺激RhoB GTP酶的活性的第二因子，提高RhoB GTP酶的活性的试剂进行间接结合。第二因子可以参与RhoB GTP酶激活作用级联。在一个方面，第二因子可以参与信号转导、结构变化、构象变化、构型变化等。在一个方面，提高RhoB GTP酶的活性的试剂可以提高RhoB GTP酶刺激途径上游任一点处的活性。例如，试剂可以是“A”，其反过来刺激“B”，“B”反过来刺激“C”，“C”反过来刺激RhoB GTP酶。在一个方面，试剂直接刺激RhoB GTP酶而不涉及任何第二因子。与缺少RhoB GTP酶刺激性试剂的相当的方法或组合物相比，试剂可以将RhoB GTP酶的活性提高约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多至约100％。
[0215] 在一些实施方式中，试剂可以提高癌细胞中胞内磷酸抗原的量。在一些实施方式中，其他试剂是甲羟戊酸途径抑制剂。甲羟戊酸途径的抑制剂可以抑制参与甲羟戊酸的产生的因子。在一个方面，甲羟戊酸途径的抑制剂可以抑制参与甲羟戊酸途径的反应。在一个方面，甲羟戊酸抑制剂可以抑制酶如：乙酰乙酰辅酶A、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸-5-磷酸酯、法呢基焦磷酸酯合酶(FPPS)、甲羟戊酸-5-激酶、甲羟戊酸-3-磷酸酯-5-激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸酯异构酶、ATP及其组合。在一些实施方式中，甲羟戊酸途径抑制剂是氨基二膦酸酯。在一个方面，试剂可以是硫化氢(H2S)。在一个方面，试剂可以是DM-22。在一些实施方式中，氨基二膦酸酯是唑来膦酸。在一个方面，试剂可以是抑制素。在一个方面，抑制素可以抑制甲羟戊酸途径。在一个方面，试剂可以用于治疗骨病、多发性骨髓瘤或它们的组合。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以直接结合磷酸抗原以刺激其活性。在一个方面，通过结合至反过来刺激肿瘤细胞的细胞质中的磷酸抗原的活性或积累的第二因子，提高磷酸抗原的活性的试剂进行间接结合。第二因子可以参与磷酸抗原产生级联。在一个方面，第二因子可以参与翻译、信号转导、结构变化、构象变化、构型变化等。在一个方面，提高磷酸抗原的活性的试剂可以提高磷酸抗原途径上游任一点处的活性。例如，试剂可以是“A”，其反过来刺激“B”，“B”反过来刺激“C”，“C”反过来刺激磷酸抗原在细胞质中积累。在一个方面，试剂直接刺激磷酸抗原积累而不涉及任何第二因子。与缺少磷酸抗原刺激性试剂的相当的方法或组合物相比，试剂可以将磷酸抗原的活性如磷酸抗原积累提高约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多至约100％。
[0216] 在一个方面，本文可以提供用于肿瘤细胞毒性的协同方法。在一个方面，治疗方法可以包括施用改善细胞表面上CD277的表达的一种或多种试剂。可以改善CD277的表达的试剂可以通过提高肿瘤细胞的细胞质中的RhoB GTP酶和/或磷酸抗原的活性来起作用。在一个方面，与缺少磷酸抗原刺激性试剂，缺少RhoGTP酶刺激性试剂或者它们的组合的相当方法或组合物相比，肿瘤的细胞毒性可以提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多至约100％。
[0217] 在一个方面，可以提供改善肿瘤细胞表面上CD277的表达的方法，包括提高结合CD277的内部部分的胞内因子的活性。
[0218] 在一些实施方式中，可以在相同药物组合物中将本文所描述的不同的药物活性成分施用于对其有需要的受试者。例如，可以在相同药物组合物中作为多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞施用提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂。因此，在含有多种药物活性成分的这些药物组合物中，同时向对其有需要的受试者施用所述多种药物活性成分。在其他实施方式中，可以在不同的药物组合物中向对其有需要的受试者施用本文所描述的不同的药物活性成分。例如，可以在不同药物组合物中作为多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞施用提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂。在这些组合物中，可以在包含第二药物活性成分的第二组合物之前、之后或同时施用包含第一药物活性成分的第一组合物。例如，在一些实施方式中，在包含提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂的第二组合物的施用之前，向对其有需要的受试者施用包含多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞的第一组合物。在一些实施方式中，在包含提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂的第二组合物的施用之后，向对其有需要的受试者施用包含多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞的第一组合物。在一些实施方式中，在包含提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂的第二组合物的同时，向对其有需要的受试者施用包含多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞的第一组合物。在一些情况下，可以在相对于包含第二药物活性成分的第二组合物的预定时间间隔施用包含第一药物活性成分的第一组合物。在一些情况下，向受试者一天施用一次包含多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体或者表达所述多肽构建体的工程化的细胞的第一
组合物的单一剂量，并且在一天中的不同时间，以多个剂量递送包含提高靶细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的第二组合物。在一些情况下，将包含提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂的组合物作为控释剂型递送以用于在预定时间段内持续释放，并且在所述预定时间段内，以不同时间间隔递送包含本文所描述的多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体或者工程化的细胞的第二组合物。
组合物的单一剂量，并且在一天中的不同时间，以多个剂量递送包含提高靶细胞中的RhoB GTP酶的活性的试剂的第二组合物。在一些情况下，将包含提高靶细胞中RhoB GTP酶的活性的试剂的组合物作为控释剂型递送以用于在预定时间段内持续释放，并且在所述预定时间段内，以不同时间间隔递送包含本文所描述的多肽构建体、编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体或者工程化的细胞的第二组合物。
[0219] 在一个方面，包含细胞的组合物可以包括细胞的剂量形式。根据本发明申请，技术人员可以确定用于施用的细胞的治疗有效量。在一些情况下，将约5×1010个细胞施用于受试者。在一些情况下，约5×1010个细胞代表施用于受试者的细胞的中值量。在一些实施方式中，可以将约5×1010个细胞引入受试者。在一些实施方式中，将至少约1×106个细胞，至少约2×106个细胞，至少约3×106个细胞，至少约4×106个细胞，至少约5×106个细胞，至少约6×106个细胞，至少约6×106个细胞，至少约8×106个细胞，至少约9×106个细胞，1×107个细胞，至少约2×107个细胞，至少约3×107个细胞，至少约4×107个细胞，至少约5×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少约6×107个细胞，至少约8×107个细胞，至少约9×107个细
胞，至少约1×108个细胞，至少约2×108个细胞，至少约3×108个细胞，至少约4×108个细
8 8 8 8
胞，至少约5×10个细胞，至少约6×10 个细胞，至少约6×10 个细胞，至少约8×10个细
胞，至少约9×108个细胞，至少约1×109个细胞，至少约2×109个细胞，至少约3×109个细
胞，至少约4×109个细胞，至少约5×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约6×109个细
胞，至少约8×109个细胞，至少约9×109个细胞，至少约1×1010个细胞，至少约2×1010个细
10 10 10 10
胞，至少约3×10 个细胞，至少约4×10 个细胞，至少约5×10 个细胞，至少约6×10 个细
胞，至少约6×1010个细胞，至少约8×1010个细胞，至少约9×1010个细胞，至少约1×1011个细胞，至少约2×1011个细胞，至少约3×1011个细胞，至少约4×1011个细胞，至少约5×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约8×1011个细胞，至少约9×1011个细
12
胞或至少约1×10 个细胞施用于受试者。
胞，至少约1×108个细胞，至少约2×108个细胞，至少约3×108个细胞，至少约4×108个细
8 8 8 8
胞，至少约5×10个细胞，至少约6×10 个细胞，至少约6×10 个细胞，至少约8×10个细
胞，至少约9×108个细胞，至少约1×109个细胞，至少约2×109个细胞，至少约3×109个细
胞，至少约4×109个细胞，至少约5×109个细胞，至少约6×109个细胞，至少约6×109个细
胞，至少约8×109个细胞，至少约9×109个细胞，至少约1×1010个细胞，至少约2×1010个细
10 10 10 10
胞，至少约3×10 个细胞，至少约4×10 个细胞，至少约5×10 个细胞，至少约6×10 个细
胞，至少约6×1010个细胞，至少约8×1010个细胞，至少约9×1010个细胞，至少约1×1011个细胞，至少约2×1011个细胞，至少约3×1011个细胞，至少约4×1011个细胞，至少约5×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约6×1011个细胞，至少约8×1011个细胞，至少约9×1011个细
12
胞或至少约1×10 个细胞施用于受试者。
[0220] 在一个方面，受试者可以接受其他治疗或治疗剂。本文所公开的组合物和方法可以包括其他试剂的施用。例如，其他试剂可以包括细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂。细胞毒性/抗肿瘤剂可以定义为攻击并杀死癌细胞的试剂。一些细胞毒性/抗肿瘤剂可以是使肿瘤细胞中的基因材料烷基化的烷化剂，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基噻替派、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪(dacabazine)。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可以是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、咪唑硫嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可以是抗生素，例如，多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、普卡霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。对于这些化合物，存在多种可商购的脂质体制剂。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可以是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。其他细胞毒性/抗肿瘤剂包括红豆杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
[0221] 在一些情况下，试剂可以包括免疫刺激剂。免疫刺激剂可以是特异或非特异性的。特异性免疫刺激剂可以提供抗原特异性如疫苗或抗原。非特异性免疫刺激剂可以增强免疫应答或刺激免疫应答。非特异性免疫刺激剂可以是佐剂。免疫刺激剂可以是疫苗、集落刺激剂、干扰素、白介素、病毒、抗原、共刺激因子、免疫原性剂、免疫调节剂或免疫治疗剂。免疫刺激剂可以是细胞因子如白介素。可以与本发明的细胞一起引入一个或多个细胞因子。可以使用细胞因子来促使细胞毒T淋巴细胞(包括继承性转移的肿瘤特异性细胞毒T淋巴细
胞)在肿瘤微环境内扩增。在一些情况下，IL-2可以用于辅助本文所描述的细胞的扩增。还可以使用细胞因子如IL-15。还可以使用免疫疗法领域中其他相关细胞因子如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或它们的任何组合。在一些情况下，将IL-2、IL-7和IL-15用于培养本发明的细胞。白介素可以是IL-2，或者阿地白介素。可以以低剂量或高剂量施用阿地白介素。
高剂量的阿地白介素方案可以包括以约0.037mg/kg(600,000IU/kg)，每8小时静脉内施用阿地白介素如耐受，施用多至约14个剂量。可以在细胞施用后的24小时内施用免疫刺激剂(例如，阿地白介素)。可以在细胞输注之后，作为约15分钟内的输注，约每8小时施用免疫刺激剂(例如，阿地白介素)，施用多至约4天。可以以约100,000IU/kg、200,000IU/kg、300,
000IU/kg、400,000IU/kg、500,000IU/kg、600,000IU/kg、700,000IU/kg、800,000IU/kg、
900,000IU/kg或多至约1,000,000IU/kg的剂量施用免疫刺激剂(例如，阿地白介素)。在一些情况下，可以以约100,000IU/kg至300,000IU/kg，300,000IU/kg至500,000IU/kg，500,
000IU/kg至700,000IU/kg，700,000IU/kg至约1,000,000IU/kg的剂量施用阿地白介素。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以施用1个剂量至约14个剂量。
胞)在肿瘤微环境内扩增。在一些情况下，IL-2可以用于辅助本文所描述的细胞的扩增。还可以使用细胞因子如IL-15。还可以使用免疫疗法领域中其他相关细胞因子如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或它们的任何组合。在一些情况下，将IL-2、IL-7和IL-15用于培养本发明的细胞。白介素可以是IL-2，或者阿地白介素。可以以低剂量或高剂量施用阿地白介素。
高剂量的阿地白介素方案可以包括以约0.037mg/kg(600,000IU/kg)，每8小时静脉内施用阿地白介素如耐受，施用多至约14个剂量。可以在细胞施用后的24小时内施用免疫刺激剂(例如，阿地白介素)。可以在细胞输注之后，作为约15分钟内的输注，约每8小时施用免疫刺激剂(例如，阿地白介素)，施用多至约4天。可以以约100,000IU/kg、200,000IU/kg、300,
000IU/kg、400,000IU/kg、500,000IU/kg、600,000IU/kg、700,000IU/kg、800,000IU/kg、
900,000IU/kg或多至约1,000,000IU/kg的剂量施用免疫刺激剂(例如，阿地白介素)。在一些情况下，可以以约100,000IU/kg至300,000IU/kg，300,000IU/kg至500,000IU/kg，500,
000IU/kg至700,000IU/kg，700,000IU/kg至约1,000,000IU/kg的剂量施用阿地白介素。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以施用1个剂量至约14个剂量。
[0222] 在一些情况下，其他试剂可以包括作为疗法方案一部分的免疫抑制剂。免疫抑制剂可以表示放射疗法剂、生物试剂或化学试剂。在一些情况下，免疫抑制剂可以包括化学试剂。例如，化学试剂可以包括以下各项中的至少一种：环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、塞替派、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类抗生素、丝裂霉素C、博来霉素和普卡霉素。化学试剂可以是环磷酰胺或氟达拉滨。
[0223] 另外，免疫抑制剂可以包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、抗免疫亲和素或其任何衍生物。糖皮质激素可以抑制过敏反应、炎症和自身免疫病况。糖皮质激素可以是泼尼松、地塞米松和氢化可的松。免疫抑制疗法可以包括抑制免疫系统的任何治疗。免疫抑制疗法可以帮助减轻、最大程度减小或消除受体中的移植排斥。例如，免疫抑制疗法可以包括免疫抑制药物。可以在移植之前、期间和/或之后使用的免疫抑制药物包括但不限于MMF(吗替麦考酚酯(Cellcept))、ATG(抗胸腺细胞球蛋白)、抗CD154(CD4OL)、抗CD40(2C10、ASKP1240、CCFZ533X2201)、阿仑珠单抗(Campath)、抗CD20(利妥昔单抗)、抗IL-6R抗体(托珠单抗、Actemra)、抗IL-6抗体(sarilumab、奥洛珠单抗(olokizumab))、CTLA4-Ig
(Abatacept/Orencia)、贝拉西普(belatacept)(LEA29Y)、西罗莫司(Rapimune)、依维莫司、他克莫司(Prograf)、达昔单抗(daclizumab)(Ze-napax)、巴利昔单抗(Simulect)、英利昔单抗(Remicade)、环孢菌素、脱氧精呱素、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒因子、坎普他汀、抗C5抗体(依库珠单抗/Soliris)、甲泼尼龙、FTY720、依维莫司、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，可以将一个或一个以上免疫抑制剂/药物一起或顺序使用。一个或一个以上免疫抑制剂/药物可以用于诱导疗法或用于维持疗法。可以在诱导和维持阶段使用相同或不同的药物。在一些情况下，达昔单抗
(Zenapax)可以用于诱导疗法，并且他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可以用于维持疗法。达昔单抗(Zenapax)还可以用于诱导疗法，并且低剂量的他克莫司(Prograf)和低剂量西罗莫司(Rapimune)可以用于维持疗法。还可以使用非药物方案实现免疫抑制，其包括但不限于全身辐射、胸腺辐射和完全和/或部分脾切除。
(Abatacept/Orencia)、贝拉西普(belatacept)(LEA29Y)、西罗莫司(Rapimune)、依维莫司、他克莫司(Prograf)、达昔单抗(daclizumab)(Ze-napax)、巴利昔单抗(Simulect)、英利昔单抗(Remicade)、环孢菌素、脱氧精呱素、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒因子、坎普他汀、抗C5抗体(依库珠单抗/Soliris)、甲泼尼龙、FTY720、依维莫司、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，可以将一个或一个以上免疫抑制剂/药物一起或顺序使用。一个或一个以上免疫抑制剂/药物可以用于诱导疗法或用于维持疗法。可以在诱导和维持阶段使用相同或不同的药物。在一些情况下，达昔单抗
(Zenapax)可以用于诱导疗法，并且他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可以用于维持疗法。达昔单抗(Zenapax)还可以用于诱导疗法，并且低剂量的他克莫司(Prograf)和低剂量西罗莫司(Rapimune)可以用于维持疗法。还可以使用非药物方案实现免疫抑制，其包括但不限于全身辐射、胸腺辐射和完全和/或部分脾切除。
[0224] 在一些情况下，使用一种或多种生理学可用的载体，以常规方式配制药物组合物，生理学可用的载体包括有利于将活性化合物加工成可以药物使用的制剂的赋形剂和助剂。正确的配制取决于所选择的施用途径。本文所描述的药物组合物的总结见于(例如)
Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack
Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.and Lachman,L.主编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&
Wilkins1999)。
Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack
Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.and Lachman,L.主编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&
Wilkins1999)。
[0226] 在某些实施方式中，组合物还可以包括一种或多种pH调节剂或缓冲剂，其包括酸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲剂如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。以将所述组合物的pH维持在可接受的范围内所需的量包含这些酸、碱和缓冲剂。
[0227] 在其他实施方式中，组合物还可以以使所述组合物的渗透压处于可接受的范围所需的量包括一种或多种盐。这些盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯化物、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子；适合的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
[0228] 通过任何适合的施用途经施用本文所描述的药物组合物，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、口腔、舌下或直肠施用途径。在一些情况下，将所述药物组合物配制用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。
[0229] 将本文所描述的药物组合物配制成任何适合的剂量形式，其包括但不限于口服水性分散剂、液体剂、凝胶剂、糖浆、酏剂、浆剂、混悬剂等，以用于要治疗个体的口服摄入，固体口服剂量形式、气溶胶、控释制剂、速融制剂、泡腾剂、冷冻干燥制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖锭、胶囊剂、延迟释放制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂和混合的即释和控释制剂。在一些实施方式中，将药物组合物配制成胶囊剂。在一些实施方式中，将药物组合物配制成溶液(例如，用于IV施用)。在一些情况下，作为输注剂配制药物组合物。在一些情况下，作为注射剂配制药物组合物。
[0230] 本文所描述的药物固体剂型可选地包括本文所描述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂如相容性载体、粘结剂、填充剂、助悬剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。
[0231] 在其他方面，使用标准涂覆程序如Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版(2000)中所描述的那些，提供了围绕组合物的薄膜包衣。在一些实施方式中，将组合物配制成颗粒(例如，用于通过胶囊剂施用)，并且涂覆一些或全部颗粒。在一些实施方式中，将组合物配制成颗粒(例如，用于通过胶囊剂施用)，并且将一些或全部颗粒微包封。在一些实施方式中，将组合物配制成颗粒(例如，用于通过胶囊剂施用)，并且一些或全部颗粒未微包封并且未涂覆。
[0232] 在某些实施方式中，本文提供的组合物还可以包括一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。适合的防腐剂包括含汞-物质如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；和季铵化合物如苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲基铵和氯化十六烷吡啶。
[0233] 如本文所提及的，“增殖性疾病”是指过量的细胞增殖和细胞基质周转显著促进了一些疾病，包括癌症的病理发生的统一概念。
[0234] 如本文所使用的，“受试者”或“患者”是指诊断为或怀疑患有或出现生理病况，例如，癌症或自身免疫病况或感染的哺乳动物受试者。在一些实施方式中，术语“患者”或“受试者”是指具有高于癌症发生的平均可能性的哺乳动物受试者。示例性的患者可以是人、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿类及其他可以受益于本文所公开的疗法的哺乳动物。示例性的人受试者可以是男性和/或女性。
[0235] 在本文中将“施用”称为向患者提供本发明公开所述的组合物。通过举例而非限制，可以通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌内(i.m.)注射来进行组合物的施用，例如，注射。可以使用一种或多种这些途径。肠胃外施用可以(例如)通过弹丸注射或通过随时间的逐渐灌注。作为另外一种选择或同时，施用可以通过口服途径。另外，施用还可以通过细胞丸剂或颗粒的手术沉积或医疗装置的定位。
[0236] “对其有需要的受试者”或者“对其有需要的患者”在本文中表示诊断为或怀疑患有疾病或病症，例如，但不限于增殖性病症如癌症的受试者或患者。在一个实施方式中，所述受试者或患者具有或可能出现实体瘤或白血病。在一些实施方式中，白血病可以是(例如)急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性粒细胞性白血病(CML)。
[0237] 本发明公开所述的组合物可以以治疗或预防增殖性病症有效的量包括表达编码结合CD277的J构型的多肽构建体的核酸序列或者包含所述核酸序列的载体的工程化的细
胞。如本文所使用的，术语“治疗”、“处治”等表示获得所期望的药理学和/或生理学效果。在实施方式中，效果是治疗性的，即部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不利症状。为此，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的包含表达本发明的核酸序列或者包含本发明的核酸序列的载体的宿主细胞的组合物。
胞。如本文所使用的，术语“治疗”、“处治”等表示获得所期望的药理学和/或生理学效果。在实施方式中，效果是治疗性的，即部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不利症状。为此，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的包含表达本发明的核酸序列或者包含本发明的核酸序列的载体的宿主细胞的组合物。
[0238] “治疗有效量”是指以所需的剂量和持续时间，对于实现所期望的治疗结果有效的量。治疗有效量可以根据以下因素而改变如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明的核酸序列在个体中引起所期望的反应的能力。
[0239] 可替代地，药理学和/或生理学效果可以是“预防性的”，即完全或部分预防疾病或其症状。
[0240] “预防有效量”是指以所需的剂量和持续时间，对于实现所期望的预防结果(例如，预防疾病发病)有效的量。
[0242] “抗氧化剂”包括(例如)丁基化羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠和维生素E。在某些实施方式中，当需要时，抗氧化剂提高了化学稳定性。
[0243] 本文所描述的制剂可以受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物及其他常规稳定剂。这些稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v的甘油，(B)约0.1％至约1％w/v的蛋氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v的硫代甘油，(d)约1mM至约10mM的EDTA，(e)约
0.01％至约2％w/v的抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v的聚山梨酯80，(g)0.001％至约
0.05％w/v的聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)葡聚糖硫酸酯，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯及其他类肝素，(m)二价阳离子如镁和锌；或(n)其组合。
0.01％至约2％w/v的抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v的聚山梨酯80，(g)0.001％至约
0.05％w/v的聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)葡聚糖硫酸酯，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯及其他类肝素，(m)二价阳离子如镁和锌；或(n)其组合。
[0244] “粘结剂”赋予粘合品质并且包括(例如)海藻酸及其盐；纤维素衍生物如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如， )、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如， )、乙基纤维素(例如， )和微晶纤维素(例如， )；微晶葡
萄糖；直链淀粉；硅酸铝镁；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶凝淀粉；黄芪胶、糊精、糖如蔗糖(例如， )、葡萄糖、葡萄糖、糖蜜、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇(例如， )和乳糖；天然或合成胶如阿拉伯
胶、黄芪胶、印度树胶、依莎贝果壳粘液(mucilage of isapol husks)、聚乙烯吡咯烷酮(例如， CL、 CL、 XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、
聚乙二醇、蜡、海藻酸钠等。
萄糖；直链淀粉；硅酸铝镁；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶凝淀粉；黄芪胶、糊精、糖如蔗糖(例如， )、葡萄糖、葡萄糖、糖蜜、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇(例如， )和乳糖；天然或合成胶如阿拉伯
胶、黄芪胶、印度树胶、依莎贝果壳粘液(mucilage of isapol husks)、聚乙烯吡咯烷酮(例如， CL、 CL、 XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、
聚乙二醇、蜡、海藻酸钠等。
[0245] “载体”或“载体材料”包括任何药学中常用的赋形剂并且应基于与本文所公开的化合物如依鲁替尼化合物和抗癌剂的相容性以及所期望的剂量形式的释放分布图性质进行选择。示例性的载体材料包括(例如)粘结剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。“药物相容的载体材料”可以包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖、硬脂酰乳酰乳酸钠、卡拉胶、单酸甘油酯、甘油二酯、预胶凝淀粉等。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第
19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s
Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；
Liberman,H.A.and Lachman,L.主编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s
Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；
Liberman,H.A.and Lachman,L.主编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
[0246] “分散剂”和/或“粘度调节剂”包括控制通过液体媒介或造粒法或共混法的药物的扩散和均一性的材料。在一些实施方式中，这些试剂还有利于涂层或腐蚀基质的有效性。示例性的扩散促进剂/分散剂包括(例如)亲水聚合物、电解质、 60或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商品名为 )和基于碳水化合物的分散剂如(例如)羟丙基纤维素
(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)，非结晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)，乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物(S630)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚与环氧乙烷和甲醛的聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，Pluronics和 它是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；和泊洛沙胺(例如，
Tetronic 也称为Poloxamine 它是来源于环氧丙烷和环氧乙烷向乙二胺的顺
序添加的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation,Parsippany,N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮
K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25、或者聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇，例如，聚乙二醇可以具有约300至约6000，或者约
3350至约4000，或者约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-
80、海藻酸钠、胶如(例如)黄芪胶和阿拉伯树胶、瓜耳豆胶、黄原胶，包括黄原胶、糖、纤维素塑料如(例如)羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯-80、海藻酸钠、多乙氧基化的单月桂酸山梨聚糖酯、多乙氧基化的单月桂酸山梨聚糖酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。在脂质体分散系和自乳化分散系中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自鸡蛋的天然磷脂酰胆碱、来自鸡蛋的天然磷脂酰甘油、胆固醇和豆蔻酸异丙酯。
(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)，非结晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)，乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物(S630)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚与环氧乙烷和甲醛的聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，Pluronics和 它是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；和泊洛沙胺(例如，
Tetronic 也称为Poloxamine 它是来源于环氧丙烷和环氧乙烷向乙二胺的顺
序添加的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation,Parsippany,N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮
K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25、或者聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇，例如，聚乙二醇可以具有约300至约6000，或者约
3350至约4000，或者约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-
80、海藻酸钠、胶如(例如)黄芪胶和阿拉伯树胶、瓜耳豆胶、黄原胶，包括黄原胶、糖、纤维素塑料如(例如)羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯-80、海藻酸钠、多乙氧基化的单月桂酸山梨聚糖酯、多乙氧基化的单月桂酸山梨聚糖酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。在脂质体分散系和自乳化分散系中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自鸡蛋的天然磷脂酰胆碱、来自鸡蛋的天然磷脂酰甘油、胆固醇和豆蔻酸异丙酯。
[0247] 还可以在本发明的组合物中使用一种或多种腐蚀促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合。
[0248] 术语“稀释剂”是指在递送前，用于稀释所关心的化合物的化合物。稀释剂也可以用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。在本领域中，将溶于缓冲溶液(其也可以提供pH控制或维持)中的盐用作稀释剂，其包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方式中，稀释剂增加了组合物的体积以有利于挤压或者为胶囊剂填充的均匀共混产生足够的体积。这些化合物包括(例如)乳糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、微晶纤维素如磷酸氢钙、二水合磷酸二钙；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶凝淀粉、可压缩糖如 (Amstar)；甘露糖醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤
维素硬脂酸酯、基于蔗糖的稀释剂、糖果店里的糖；一水合单碱式硫酸钙、二水合硫酸钙；三水合乳酸钙、葡聚糖结合剂；谷物水解固形物、直链淀粉；粉末纤维素、碳酸钙；甘氨酸、白陶土；甘露糖醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
维素硬脂酸酯、基于蔗糖的稀释剂、糖果店里的糖；一水合单碱式硫酸钙、二水合硫酸钙；三水合乳酸钙、葡聚糖结合剂；谷物水解固形物、直链淀粉；粉末纤维素、碳酸钙；甘氨酸、白陶土；甘露糖醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
[0249] “填充剂”包括化合物如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉、葡萄糖、葡聚糖结合剂、右旋糖酐、淀粉、预胶凝淀粉、蔗糖、木糖醇、拉克替醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇等。
[0250] “润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料的粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括(例如)硬脂酸、氢氧化钙、滑石、硬脂酰醇富马酸钠、烃如矿物油，或氢化植物油如氢化豆油 高级脂肪酸和它们的碱金属和碱土金属盐如铝、钙、镁、锌、硬脂酸、硬脂酸钠、甘油、滑石、蜡、 硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙
二醇(例如、PEG-4000)或者甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM、油酸钠、苯甲酸钠、甘油山嵛酸酯、聚乙二醇、月桂基硫酸镁或钠、胶体氧化硅如SyloidTM、 淀粉如玉米淀粉、
硅油、表面活性剂等。
二醇(例如、PEG-4000)或者甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM、油酸钠、苯甲酸钠、甘油山嵛酸酯、聚乙二醇、月桂基硫酸镁或钠、胶体氧化硅如SyloidTM、 淀粉如玉米淀粉、
硅油、表面活性剂等。
[0251] “增塑剂”是用于软化微囊包封材料或者薄膜包衣以使它们不太脆的化合物。适合的增塑剂包括(例如)聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。在一些实施方式中，增塑剂也可以用作分散剂或润湿剂。
[0252] “增溶剂”包括化合物如三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、月桂基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚、卡必醇(transcutol)、丙二醇和二甲基异山梨醇等。
[0253] “稳定剂”包括化合物如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等。
[0254] “混悬剂”包括化合物如聚乙烯吡咯烷酮，例如，聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或者聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇，例如，所述聚乙二醇可以具有约300至约6000，或者约3350至约4000、或者约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟甲基纤维素硬脂酸酯、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、海藻酸钠、胶如(例如)黄芪胶和阿拉伯树胶、瓜耳豆胶、黄原胶，包括黄原胶、糖、纤维素塑料、如(例如)羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、海藻酸钠、多乙氧基化的单月桂酸山梨聚糖酯、多乙氧基化的单月桂酸山梨聚糖酯、聚维酮等。
[0255] “表面活性剂”包括化合物如月桂基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或者80、三乙酸甘油酯、维生素E TPGS、单油酸脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯单油酸脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如，(BASF)等。一些其他表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化的蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯昔醇10、辛苯昔醇40。在一些实施方式中，可以包括表面活性剂以提高物理稳定性或用于其他目的。
[0256] “增粘剂”包括(例如)甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基醋酸纤维素硬脂酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
[0257] “润湿剂”包括化合物如油酸、单硬脂酸甘油酯、单油酸脱水山梨糖醇酯、单月桂酸山梨聚糖酯、油酸三乙醇胺酯、聚氧乙烯单油酸脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯单月桂酸山梨聚糖酯、多库酯钠、油酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等。
[0258] 试剂盒/制品
[0259] 在某些实施方式中，本文公开了用于和本文所描述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。这些试剂盒包括分隔以容纳一个或多个容器如小瓶、管等的载体、包装或容器，所述容器中的每一个包含要在本文所描述的方法中使用的单独的元件中的一种。适合的容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方式中，容器由多种材料如玻璃或塑料形成。
[0260] 本文所提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶和适合于所选制剂以及预期施用形式和治疗的任何包装材料。
[0261] 例如，容器包括表达选择性结合CD277的J构型的多肽构建体的工程化的细胞，和可选地，另外具有细胞因子和/或化疗剂和/或本文所公开的其他试剂，例如，哺乳动物甲羟戊酸途径的中间产物如异戊烯焦磷酸酯(IPP)和微生物的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸酯(MEP)途径的中间产物。这些试剂盒可选地包括与其在本文所描述的方法中的使用有关的标识描述或标签或说明书。
[0262] 试剂盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明书的包装说明书。通常还将包括一组说明。
[0263] 在一些实施方式中，标签位于所述容器上或与所述容器结合。在一个实施方式中，当形成标签的字母、数字或其他性质附接、模制或雕刻在容器本身上时，标签位于容器上；当它存在于还保持所述容器的容器或载体内时，标签与容器结合，例如，作为包装说明书与容器结合。在一个实施方式中，标签用于表示将用于特定治疗应用的含量。标签还表示含量的用法说明如在本文所描述的方法中的用法说明。
[0264] 识别表型
[0265] 在本文所提供的某些实施方式中，多肽构建体、编码多肽构建体的核苷酸和/或具有所述核苷酸的工程化的细胞可以识别靶细胞(例如，肿瘤细胞)。在一些实施方式中，工程化T细胞可以表达对靶细胞表面上表达的特定抗原(例如，CD277)特异的Vγ9Vδ2 TCR。本文描述了用于识别能够识别靶细胞上特定抗原的一种或多种T细胞的方法。可以通过测定由于T细胞的TCR(例如，Vγ9Vδ2 TCR)和靶细胞表面上表达的蛋白、抗原、配体或细胞表面分子(例如，CD277)之间的物理相互作用而发生的识别表型来识别能够识别特定抗原的T细胞或T细胞群体。在一些实施方式中，所述识别表型可以是由于Vγ9Vδ2 TCR对靶细胞的识别而在T细胞中发生的细胞状态的变化。例如，细胞状态的变化可以包括由Vγ9Vδ2 TCR介导的T细胞激活所造成的干扰素(IFN)-γ产生水平的变化，其通过本领域中已知的方法(例如，IFN-γELISPOT分析)是可检测的。在其他实例中，指示识别表型的细胞状态的变化可以包括由Vγ9Vδ2 TCR介导的靶细胞识别所产生的分子变化，其包括基因表达(例如，通过qRT-PCR或微阵列分析识别)和/或蛋白表达(例如，通过免疫印迹或免疫细胞化学测定识
别)的定性或定量变化。在其他实施方式中，识别表型可以包括T细胞的TCR和靶细胞的细胞表面蛋白、配体或抗原之间的相互作用的物理表现。例如，识别表型可以包括T细胞的Vγ9Vδ2 TCR与靶细胞的细胞表面蛋白、配体或抗原的物理结合。在某些实施方式中，识别表型包括包含Vγ9Vδ2 TCR和靶细胞表面上的CD277分子的J构型的物理复合物的形成。当识别表型包括包含受体和配体的复合物的形成时，可以通过已知方法，包括免疫沉淀、细胞分选或免疫细胞化学识别表型。
别)的定性或定量变化。在其他实施方式中，识别表型可以包括T细胞的TCR和靶细胞的细胞表面蛋白、配体或抗原之间的相互作用的物理表现。例如，识别表型可以包括T细胞的Vγ9Vδ2 TCR与靶细胞的细胞表面蛋白、配体或抗原的物理结合。在某些实施方式中，识别表型包括包含Vγ9Vδ2 TCR和靶细胞表面上的CD277分子的J构型的物理复合物的形成。当识别表型包括包含受体和配体的复合物的形成时，可以通过已知方法，包括免疫沉淀、细胞分选或免疫细胞化学识别表型。
[0266] 在本文所描述的实施方式中，识别表型可以在不同受试者之间和/或得自不同受试者的细胞之间改变。例如，在一些实施方式中，得自不同受试者的靶细胞可以在工程化的细胞中所表达的Vγ9Vδ2 TCR识别靶细胞(例如，通过靶细胞表面上表达的CD277)的程度方面改变。工程化的细胞中表达的Vγ9Vδ2 TCR可以以高亲和力识别得自一些受试者的靶细胞的表面分子。对于得自其他受试者的靶细胞，可以以低亲和力识别或者完全不识别靶细胞的表面分子。在不同受试者的靶细胞之间通过Vγ9Vδ2 TCR的识别的变化可以表现为通过那些细胞所表达的识别表型的变化。例如，在暴露于表达Vγ9Vδ2 TCR的T细胞之后，不同受试者的靶细胞可以在IFN-γ的产量、基因或蛋白表达水平或模式和/或T细胞的Vγ9Vδ2 TCR和靶细胞的细胞表面蛋白(例如，CD277)之间的物理相互作用程度方面改变。
[0267] 当用于治疗对其有需要的受试者时，本文所描述的多肽构建体，编码多肽构建体的多核苷酸和具有多核苷酸的工程化的细胞可以具有不同的治疗效果。本文公开了基于患者或患者细胞所表现出的特定表型的强度，将患者群体(例如，癌症患者群体)划分为多个治疗组的方法。在一些实施方式中，用于将患者划分为治疗组的表型是识别表型。例如，可以基于暴露于表达Vγ9Vδ2 TCR的T细胞之后，得自患者的靶细胞中识别表型的存在、不存在或程度，包括IFN-γ的产生水平或基因表达的定量或定性模式，将患者群体划分为不同的组。在一些实施方式中，用于将患者划分为不同的治疗组的表型不是基于表达Vγ9Vδ2 TCR的T细胞和靶细胞之间的识别程度的识别表型。作为替代，用作划分基础的表型可以是暴露于T细胞之前存在于靶细胞中的标志物(即，生物标志物)。例如，细胞表面表达的CD277分子中J构型的存在或不存在可以是在患者的靶细胞(例如，肿瘤细胞)之间改变并因此可以用作将患者分为或划分为当施用本文所描述的多肽构建体时，具有不同治疗成功概率的不同的组的基础的表型。
[0268] 在一些实施方式中，将患者划分为至少两个治疗组，其包括具有积极治疗预后的划分组和具有不良治疗预后的划分组。在一些实施方式中，划分为积极治疗预后划分组的患者具有显示出以下识别表型的靶细胞如IFN-γ的产生和Vγ9Vδ2 TCR和靶细胞的CD277分子之间的物理相互作用(例如，以包括TCR和CD277分子两者的复合物的形式)。在一些实施方式中，划分为积极治疗预后划分组的患者具有在与Vγ9Vδ2 T细胞接触之前显示出具有J构型的CD277细胞表面分子的靶细胞。在一些实施方式中，划分为不良治疗预后划分组的患者具有缺少或具有降低的一种或多种识别表型的表达(例如，IFN-γ产生)或者不能显示出具有J构型的CD277细胞表面分子的靶细胞。
[0269] 多态性变化和遗传相关性
[0270] 术语“核苷酸多态性”、“遗传多态性”和“核苷酸序列多态性”是可互换使用的并且表示单个个体中或个体之间基因组的特定位置(即“基因座”)处核苷酸序列的变化。在一些情况下，遗传多态性存在于个体的细胞内的基因座处(即所述个体对于特定核苷酸序列在基因座处是杂合的)。在其他情况下，个体特定基因座处的核苷酸序列是不变的(即所述个体对于核苷酸序列在特定基因座处是纯合的)，但是当与第二个体的DNA相比时，所述基因座处的核苷酸序列是多态的。在某些实施方式中，所述核苷酸多态性包括基因座处单个核苷酸的变化。在这些情况下，核苷酸多态性被称为单核苷酸多态性或者SNP。在其他实施方式中，作为SNP的替代或者除了SNP之外，所述核苷酸多态性可以包括其他类型的DNA变化。在本文中，术语“多态性”考虑了任何形式的DNA变化，包括单核苷酸多态性和结构变化如插入、缺失、倒位和重复。
[0271] 在某些实施方式中，核苷酸多态性(例如，SNP)可以是导致具有不同形式的多态性的细胞、组织或生物之间表型差异的功能变化。例如，SNP可以位于基因的开放阅读框中并借此直接影响引入所述基因所编码的蛋白中的氨基酸序列。在其他非限制性实例中，多态性可以通过改变从基因转录的mRNA的剪接(例如，其中SNP位于剪接位点)，改变基因的表达水平(例如，其中SNP位于基因的启动子中)或者影响蛋白的翻译后修饰(例如，其中SNP影响负责翻译后修饰另一种蛋白的因子的表达或功能)来产生个体之间的表型差异。在某些其他实施方式中，核苷酸多态性可以是不直接导致具有不同形式的多态性的个体之间的表型差异的非功能或中性变化。
[0272] 在某些实施方式中，可以在与特定性状(例如，细胞、组织或生物表型)有关的相关性研究中识别遗传多态性(功能或非功能的)。在本文中，当个体群体或来源于不同个体的细胞群体内的一种或多种基因型与表型性状一起发生的频率比将期待偶然发生的频率更高时，存在“遗传相关性”。在一些实施方式中，表型性状可以包括表现为表达Vγ9Vδ2TCR的T细胞对靶细胞(例如，肿瘤细胞)的识别结果的识别表型。在一些实施方式中，表型性状可以包括靶细胞的一个或多个细胞表面分子的构象。在一些实施方式中，表型性状可以包括靶细胞的细胞表面CD277分子的J构型的存在或不存在。在一些实施方式中，表型性状可以包括特定个体在特定基因座的合子型。在一些实施方式中，表型性状可以包括靶细胞(例如，肿瘤细胞)中RhoB的活性。在本文中，当对于蛋白(例如，RhoB)使用时，术语“活性”表示蛋白的细胞功能。蛋白的活性受多种细胞事件和因素的影响，其包括编码蛋白的基因的核苷酸序列(例如，其中基因突变)，基因转录的水平和时机，转录的mRNA的剪接模式，蛋白的翻译后修饰，蛋白或编码蛋白的mRNA在细胞中的移位模式以及蛋白与通过(例如)改变其构象和/或活性或者将蛋白定位在细胞的正确位置(例如，细胞表面)以发挥其功能来影响其功能的细胞因子的正确相互作用。因此，改变蛋白活性(例如，提高或降低蛋白活性)考虑了可以导致细胞中进行的蛋白功能的变化的任何细胞机制。例如，就RhoB来说，在一些实施方式中，可以通过影响RhoB GTP酶向癌细胞的细胞膜的移位来改变活性。在一些实施方式中，可以通过影响RhoB GTP酶是否保持在癌细胞的细胞膜来改变活性。在一些实施方式中，可以通过影响RhoB GTP酶远离癌细胞核的移位的增加或减少来改变活性。在一些实施方式
中，可以通过提高或降低编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达来改变活性。在一些实施方式中，可以通过改变转录本的修饰(例如，可变剪接)来改变活性。在一些实施方式中，可以通过提高或降低细胞中RhoB GTP酶的稳定性来改变活性。在一些实施方式中，可以通过提高或降低RhoB GTP酶和第二蛋白(例如，BNT3蛋白)之间的相互作用来改变活性。在一些实施方式中，可以通过使RhoB GTP酶激活或失活来改变活性。在一些实施方式中，可以通过提高或降低RhoB GTP酶和非蛋白小分子(例如，GTP)之间的相互作用来改变活性。
中，可以通过提高或降低编码RhoB GTP酶的基因或转录本的表达来改变活性。在一些实施方式中，可以通过改变转录本的修饰(例如，可变剪接)来改变活性。在一些实施方式中，可以通过提高或降低细胞中RhoB GTP酶的稳定性来改变活性。在一些实施方式中，可以通过提高或降低RhoB GTP酶和第二蛋白(例如，BNT3蛋白)之间的相互作用来改变活性。在一些实施方式中，可以通过使RhoB GTP酶激活或失活来改变活性。在一些实施方式中，可以通过提高或降低RhoB GTP酶和非蛋白小分子(例如，GTP)之间的相互作用来改变活性。
[0273] 在一些实施方式中，将一种或多种核苷酸序列多态性的存在或不存在用于将患者划分为不同的治疗组，其可以在对使用本文所公开的多肽构建体的治疗的治疗反应方面不同。例如，可以认为特定形式的SNP的存在与已知预测治疗成功的表型性状(例如，J构型的存在/不存在或者RhoB的相对高或低活性)有关。基于所识别的遗传相关性，可以对作为接受本文所公开的特定疗法的候选的患者筛选(即基因分型)与表型性状有关的多态性的存在或不存在。然后，可以基于多态性的存在或不存在将所筛选的患者分为多个患者群体或组。每个患者群体可以代表不同的划分组，划分组可以表示划分组中的特定患者将以积极反应或不良反应对特定治疗干预反应的概率(即对不同划分组中的患者分配不同的对治疗性治疗起积极反应的可能性)。在本文中，当对于治疗反应或划分组使用时，术语“积极的”是指实现或部分实现治疗应用目的的治疗结果。例如，在一些实施方式中，患者对治疗的积极反应包括通过暴露于本文所描述的组合物清除至少一些癌细胞。在本文中，相对于“不良”反应使用“积极”反应，在一些实施方式中，“不良”反应是划分组对治疗的反应，其小于显示出积极反应的第二划分组的反应。在一些实施方式中，可以将患者划分为至少两个患者组，其中预测第一患者组对治疗显示出积极反应(即积极治疗预后划分组)，而预测第二患者组显示出相对不良的治疗反应(即不良治疗预后划分组)。
[0274] 根据以上描述将理解患者靶细胞的特定表型性状(例如，CD277的J构型、RhoB活性)和/或核苷酸序列多态性可以表示对于患者对包括本文所公开的组合物的施用的治疗
的治疗反应的预测或预后的一种或多种生物标志物。在一些实施方式中，可以基于患者靶细胞中生物标志物的存在或不存在将患者划分为不同的划分组。在一些实施方式中，所述生物标志物是核苷酸序列多态性(例如，SNP)或表观遗传修饰，并且将具有核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为积极划分组，而将缺少核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为不良划分组。在一些实施方式中，所述生物标志物是核苷酸序列多态性(例如，SNP)或表观遗传修饰，并且将缺少核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为积极划分组，而将具有核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为不良划分组。在如上所述的一些实施方式中，所述生物标志物是与不良或积极治疗反应有关的识别表型(例如，IFN-γ的产生)或靶细胞表型(例如，细胞表面CD277分子中J构型的存在)。在一些实施方式中，将一个生物标志物用于将患者划分为不同的划分组。在其他实施方式中，将多个生物标志物用于划分患者。例如，当患者的靶细胞显示出特定核苷酸序列多态性或表观遗传修饰和特定识别表型或靶细胞表型两者时，可以将患者划分为积极划分组。
的治疗反应的预测或预后的一种或多种生物标志物。在一些实施方式中，可以基于患者靶细胞中生物标志物的存在或不存在将患者划分为不同的划分组。在一些实施方式中，所述生物标志物是核苷酸序列多态性(例如，SNP)或表观遗传修饰，并且将具有核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为积极划分组，而将缺少核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为不良划分组。在一些实施方式中，所述生物标志物是核苷酸序列多态性(例如，SNP)或表观遗传修饰，并且将缺少核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为积极划分组，而将具有核苷酸序列多态性或表观遗传修饰的患者划分为不良划分组。在如上所述的一些实施方式中，所述生物标志物是与不良或积极治疗反应有关的识别表型(例如，IFN-γ的产生)或靶细胞表型(例如，细胞表面CD277分子中J构型的存在)。在一些实施方式中，将一个生物标志物用于将患者划分为不同的划分组。在其他实施方式中，将多个生物标志物用于划分患者。例如，当患者的靶细胞显示出特定核苷酸序列多态性或表观遗传修饰和特定识别表型或靶细胞表型两者时，可以将患者划分为积极划分组。
[0275] 本发明公开考虑了将基因组信息，包括核苷酸序列、多态性的存在和同一性以及特定基因座的合子型归档的数据集合的使用。数据集合的实例是来自Centre d'Etude du Polymorphisms Huain(CEPH)的细胞系文库，其含有得自几个家族谱系并且对于数百万个SNP基因分型的爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)转化的B细胞系(EBV-LCL)的大集合。数据集合的另一个实例是通过国际人类基因组单体型图计划所产生的单倍体图谱。在一些实施方式中，数据集合可以归档假想或预测的基因组参数。例如，可以使用来自家族谱系内的经典孟德尔遗传模式来推导候选基因座的假想合子型。
[0276] 本文还公开了用于识别受试者的靶细胞中作为对特定治疗反应的预测或预后的遗传和表观遗传变化的方法。例如，可以通过将细胞与包含表达T细胞受体的工程化的细胞(例如，T细胞)的组合物接触，然后检测识别表型如由于暴露于所述组合物所造成的细胞免疫激活水平(例如，IFN-γ的水平或活性)来筛选患者的靶细胞(例如，肿瘤细胞)。基于靶细胞对暴露于组合物的反应，可以将受试者分为特定(例如，积极)划分组。例如，当靶细胞对组合物的暴露在T细胞中引起免疫激活时，可以将患者分为阳性划分组。在一些实施方式中，靶细胞中免疫激活的存在或不存在可以与靶细胞中遗传和/或表观遗传变化有关。在一些实施方式中，获得(例如，从数据集合获得)与靶细胞有关的遗传型或表观遗传信息，从而将靶细胞的特定表型性状(例如，识别表型)与遗传或表观遗传变体相关联。本发明公开考虑了相对于另一位患者的细胞，识别患者靶细胞中遗传或表观遗传变化以将遗传或表观遗传变化与特定识别表型和/或预测的治疗反应相关联的任何方法。例如，可以实施基因组范围的相关性研究(GWAS)以确定特定遗传变异(例如，SNP)是否与靶细胞的表型性状(例如，识别表型)相关。在其他情况下，可以将来自不同受试者的靶细胞的DNA的表观遗传数据(例如，甲基化状态)进行比较以识别可以与识别表型和/或治疗反应相关的候选表观遗传标
记。在其他实例中，可以使用来自家族谱系的数据来假设特定基因座的合子型以识别可以与特定表型性状相关的候选基因座。
记。在其他实例中，可以使用来自家族谱系的数据来假设特定基因座的合子型以识别可以与特定表型性状相关的候选基因座。
[0277] 在某些实施方式中，将多个基因座处预测的合子型与CEPH个体的SNP基因型相关，并且可以使用软件工具如ssSNPer进行计算。例如，可以使用r2＝0.8作为连锁不平衡的阈值，通过查询SNP注释和代理搜索(SNAP)工具来收集ssSNPer所产生的500kb的SNP内的代理SNP(proxy SNP)。可以使用Genevar(基因表达变化(GENe Expression VARiation))工具来进行ssSNPer SNP以及它们的代理的eQTL分析。
[0278] SAPPHIRE
[0279] 本文公开了使用被称为包括shRNA评价的SNP相关计算途径搜索(SNP-associated computational pathway hunt including shRNA evaluation)(SAPPHIRE)的技术，识别与受体介导的靶细胞识别有关的基因座的方法。例如，肿瘤细胞的遗传背景中的差异可以影响Vγ9Vδ2 TCR工程化T细胞，例如，本文所描述的细胞对这些细胞的识别。在一些实施方式中，可以使用细胞系文库，其含有得自几个家族谱系并且对数百万SNP基因分型的EBV转化的B细胞系(EBV-LCL)的大集合(Dausset等人,Centre d’etude dupolymorphisme humain(CEPH):collaborative genetic mapping ofthe human genome.Genomics.1990；6:575–7；INTERNATIONAL HAPMAP,C.The International HapMap Project.Nature.2003；426:
789–96)。可以通过IFNγ产生来评价通过Vγ9Vδ2 TCR T细胞的EBV-LCL的识别表型。使用CD4+或CD8+Vγ9Vδ2 T细胞，可以降低或提高NK样受体对表型分析的影响。CD4+T细胞表达较低的量的NK样受体，从而导致其易于分析。可以使用CEPH核心家系(family trios)内的经典孟德尔遗传模式来推导候选基因座的假想合子型，其中候选等位基因对受体介导的识别的影响，例如，Vγ9Vδ2 TCR介导的识别可以假定是主要的。在一个实施方式中，通过IFNγ产生所评价的通过Vγ9Vδ2 TCR T细胞的EBV-LCL的识别表型可以显示出EBV-LCL亚型的激活表型和另一种EBV-LCL亚型的非激活表型。然后，可以与CEPH细胞系的家族谱系组合使用识别表型来预测激活和非激活EBV-LCL亚型的合子型。然后，可以通过研究群体，将假想的基因座合子型与可用的SNP的基因型信息相关，从而导致其基因型与预测的合子型强相关的SNP的识别。在本文中，在一些实施方式中，“强相关”可以表示大于80％，大于85％，大于90％，大于95％或者大于99％。
789–96)。可以通过IFNγ产生来评价通过Vγ9Vδ2 TCR T细胞的EBV-LCL的识别表型。使用CD4+或CD8+Vγ9Vδ2 T细胞，可以降低或提高NK样受体对表型分析的影响。CD4+T细胞表达较低的量的NK样受体，从而导致其易于分析。可以使用CEPH核心家系(family trios)内的经典孟德尔遗传模式来推导候选基因座的假想合子型，其中候选等位基因对受体介导的识别的影响，例如，Vγ9Vδ2 TCR介导的识别可以假定是主要的。在一个实施方式中，通过IFNγ产生所评价的通过Vγ9Vδ2 TCR T细胞的EBV-LCL的识别表型可以显示出EBV-LCL亚型的激活表型和另一种EBV-LCL亚型的非激活表型。然后，可以与CEPH细胞系的家族谱系组合使用识别表型来预测激活和非激活EBV-LCL亚型的合子型。然后，可以通过研究群体，将假想的基因座合子型与可用的SNP的基因型信息相关，从而导致其基因型与预测的合子型强相关的SNP的识别。在本文中，在一些实施方式中，“强相关”可以表示大于80％，大于85％，大于90％，大于95％或者大于99％。
[0280] 在一些实施方式中，所识别的SNP可以位于能够影响(例如，通过所述基因的上调或下调)表达T细胞受体的细胞(例如，Vγ9Vδ2 TCR T细胞)的免疫激活的相应基因的近端染色体上。在一些实施方式中，“近端”是指大于10,000bp，大于50,000bp，大于100,000bp，大于200,000bp，大于300,000bp，大于500,000bp或者大于1Mbp。在其他实施方式中，所识别的SNP可以位于与能够影响(例如，通过所述基因的上调或下调)表达T细胞受体的细胞(例如，Vγ9Vδ2 TCR T细胞)的免疫激活的相应基因不同的染色体上。
[0281] 描述和实例详细显示了本发明的实施方式。应理解本发明不局限于本文所描述的具体实施方式并照此可以是不同的。本领域技术人员将认识到本发明存在多种改变和修改，其涵盖在其范围内。
[0282] 实施例
[0283] 仅出于说明性的目的提供了这些实施例，而不是为了限制本文所提供的权利要求的范围。
[0284] 实施例1.通过包括shRNA评价的SNP相关计算途径搜索(SAPPHIRE)识别与Vγ9Vδ2 TCR介导的靶细胞识别有关的基因座
[0285] 肿瘤细胞的遗传背景中的差异影响Vγ9Vδ2 TCR工程化T细胞对这些肿瘤细胞的识别。因此，使用了来自Centre d'Etude du Polymorphisme Humain(CEPH)的细胞系文库，其含有得自几个家族谱系(Dausset等人,1990)并且对数百万SNP基因分型(International HapMap,2003)的EBV转化的B细胞系(EBV-LCL)的大集合。将工程设计以表达一种限定的Vγ
9Vδ2 TCR的CD4+aβT细胞用于功能筛选以消除多种γδTCR组库和不同NK受体表达的识别中的波动。通过IFNγ产生评价了通过Vγ9Vδ2 TCR T细胞的EBV-LCL的识别表型，并且其对于
33种EBV-LCL显示出激活表型，而对7种，显示出非激活表型(图1A和图1B)。合子型分析显示具有非激活表型的EBV-LCL代表比具有激活表型的那些更强的能力如通过SAPPHIRE所分析的。使用CEPH核心家系(family trios)内的经典孟德尔遗传模式来推导候选基因座的假想合子型，其中候选等位基因对Vγ9Vδ2 TCR介导的识别的影响假定是主要的。与CEPH细胞系的家族谱系结合，所得的识别表型克服了筛选大量LCL系的需要，并且允许精确预测12个CEPH个体的候选基因座的合子型(图2A。然后，将假想基因座合子型与研究群体内可用的SNP的基因型信息相关，从而导致识别了其基因型与预测合子型完全相关(100％)的17个
SNP(图2B)。由于这17个SNP中无一且它们在高连锁不平衡内的代理SNP(r2>0.8)均不通过导致蛋白编码序列的变化而直接影响基因，因此推测所识别的SNP可以代表与对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞识别的敏感性有关的遗传区域的替代标志物，而不是起直接作用。另外，在所述
17个SNP的基因组附近查询了相邻候选基因(图2C)。
9Vδ2 TCR的CD4+aβT细胞用于功能筛选以消除多种γδTCR组库和不同NK受体表达的识别中的波动。通过IFNγ产生评价了通过Vγ9Vδ2 TCR T细胞的EBV-LCL的识别表型，并且其对于
33种EBV-LCL显示出激活表型，而对7种，显示出非激活表型(图1A和图1B)。合子型分析显示具有非激活表型的EBV-LCL代表比具有激活表型的那些更强的能力如通过SAPPHIRE所分析的。使用CEPH核心家系(family trios)内的经典孟德尔遗传模式来推导候选基因座的假想合子型，其中候选等位基因对Vγ9Vδ2 TCR介导的识别的影响假定是主要的。与CEPH细胞系的家族谱系结合，所得的识别表型克服了筛选大量LCL系的需要，并且允许精确预测12个CEPH个体的候选基因座的合子型(图2A。然后，将假想基因座合子型与研究群体内可用的SNP的基因型信息相关，从而导致识别了其基因型与预测合子型完全相关(100％)的17个
SNP(图2B)。由于这17个SNP中无一且它们在高连锁不平衡内的代理SNP(r2>0.8)均不通过导致蛋白编码序列的变化而直接影响基因，因此推测所识别的SNP可以代表与对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞识别的敏感性有关的遗传区域的替代标志物，而不是起直接作用。另外，在所述
17个SNP的基因组附近查询了相邻候选基因(图2C)。
[0286] 为了测试这些基因对于Vγ9Vδ2 TCR+T细胞介导的靶标识别的相关性，我们在Vγ9Vδ2 TCR+T细胞激活性EBV-LCL系48中敲低了所有17个SNP-相邻的基因。然后，我们通过测量IFNγ产生评价了敲低对Vγ9Vδ2TCR+T细胞的激活的影响，通过三个基因(RAB4A、RHOB和UBE3C)的敲低，使激活作用降低(图2B)。为了确保潜在的敲低作用指向选择性影响Vγ9Vδ2 TCR依赖性激活的基因，使用胚胎性癌肉瘤1(WT1)肽对EBV-LCL系48的三个敲低变体进行脉冲，并使用工程设计以表达同源WT1特异性aβTCR的T细胞测试识别(Kuban等人,2007)。小GTP酶RhoB的选择性敲低显著影响Vγ9Vδ2 TCR的激活，但是不影响aβTCR工程化T细胞(图
2B)。在原型Vγ9Vδ2 T细胞靶细胞系Daudi中部分RhoB敲低后(图3B)以及在肾癌细胞系
MZ1851RC中CRISPR/Cas介导的部分RhoB敲除后(图4A)观察到了类似的数据。有趣地，在
293HEK细胞中即使完全敲除RhoB也仅导致产生了靶细胞介导的Vγ9Vδ2 TCR T细胞激活的部分消除(图3A)。另外，293HEK细胞中RhoA或者RhoC基因的敲除不会显著影响它们激活Vγ
9Vδ2 TCR+T细胞的能力(图4B和图3C)，从而强调RhoB在非冗余作用中调节限定的Vγ9Vδ2 TCR对肿瘤细胞的识别。
2B)。在原型Vγ9Vδ2 T细胞靶细胞系Daudi中部分RhoB敲低后(图3B)以及在肾癌细胞系
MZ1851RC中CRISPR/Cas介导的部分RhoB敲除后(图4A)观察到了类似的数据。有趣地，在
293HEK细胞中即使完全敲除RhoB也仅导致产生了靶细胞介导的Vγ9Vδ2 TCR T细胞激活的部分消除(图3A)。另外，293HEK细胞中RhoA或者RhoC基因的敲除不会显著影响它们激活Vγ
9Vδ2 TCR+T细胞的能力(图4B和图3C)，从而强调RhoB在非冗余作用中调节限定的Vγ9Vδ2 TCR对肿瘤细胞的识别。
[0287] 实施例2.本文所描述的多肽构建体对靶细胞上CD277的J构型的识别取决于Rho GTP酶活性
[0288] 通过将不同的肿瘤细胞系与Rho GTP酶激活剂calpeptin或抑制剂C3转移酶一起预热来评价RhoB GTP酶活性对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞激活的影响。使用calpeptin的预处理使EBV-LCL 93细胞对于Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的识别显著敏化，相反，C3转移酶对Rho GTP酶的抑制导致LCL 48细胞对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的激活显著降低(图4D)。Rho GTP酶活性的调节不影响通过WT1 aβTCR转导的T细胞对WT1肽-脉冲的EBV-LCL 48细胞的识别。为了指明RhoB的酶活力通过Vγ9Vδ2 TCR+T细胞调节肿瘤细胞的识别，我们用RhoB的野生型或对应于GDP结合状态的显性负性形式(RhoB-DN)，或者用对应于GTP结合形式的组成型激活形式(RhoB-CA)转染HEK 293细胞(Kamon等人,2006)并且使用它们作为Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的靶细胞
(图4E)。过表达RhoB-CA突变体的HEK细胞能够引发比表达野生型RhoB的细胞显著更强的Vγ9Vδ2 TCR特异性应答，而与表达野生型RhoB的细胞相比，RhoB-DN转染的HEK细胞显示出显著降低的刺激Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的能力。这些结果表明癌细胞中RhoB GTP酶的生化活性的调节可以用于通过表达选择性结合CD277的J构型或J结构的多肽的工程化的细胞，例如，Vγ9Vδ2 TCR+T细胞对那些癌细胞的识别。
(图4E)。过表达RhoB-CA突变体的HEK细胞能够引发比表达野生型RhoB的细胞显著更强的Vγ9Vδ2 TCR特异性应答，而与表达野生型RhoB的细胞相比，RhoB-DN转染的HEK细胞显示出显著降低的刺激Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的能力。这些结果表明癌细胞中RhoB GTP酶的生化活性的调节可以用于通过表达选择性结合CD277的J构型或J结构的多肽的工程化的细胞，例如，Vγ9Vδ2 TCR+T细胞对那些癌细胞的识别。
[0289] 实施例3.靶细胞上CD277的J构型的识别取决于RhoB的胞内分布在能够激活Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的细胞中的核区中选择性排除RhoB(图5A，图5B，图6A和图6D)。在细胞系中，通过ABP以及通过可溶性磷酸抗原IPP诱导RhoB从核，或者从核膜向核外位点的重新定位
(图5C和图5D)，从而强调该过程取决于胞内磷酸抗原的积累。通过ABP处理不会改变其他GTP酶如RhoA的均匀胞内分布(图6B)，从而支持了RhoA敲低不影响Vγ9Vδ2 TCR介导的识别的观察结果(图4B)。在用ABP选择性处理的人树突状细胞的核中排除RhoB，而在小鼠中不排除，尽管两个物种中RhoB蛋白序列是相同的(图5E和图6C)。为了测试在白血病癌干细胞以及白血病胚细胞中，通过ABP处理是否发生RhoB的重新分配，基于流动标志物对来自相同供体的癌干细胞和健康干细胞进行分选并定量RhoB的分布。的确，在来自急性髓细胞性白血病患者供体的原代胚细胞中，RhoB的定位与Vγ9Vδ2 TCR工程化T细胞的识别相关(图5B和图6A)，包括在白血病干细胞中，但是在来自相同供体的健康干细胞中不是(图5F)。总的来说，这些结果表明肿瘤细胞中小GTP酶RhoB的胞内分布的调节(例如，从核排除RhoB)将提高它们对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的靶向的敏感性。
(图5C和图5D)，从而强调该过程取决于胞内磷酸抗原的积累。通过ABP处理不会改变其他GTP酶如RhoA的均匀胞内分布(图6B)，从而支持了RhoA敲低不影响Vγ9Vδ2 TCR介导的识别的观察结果(图4B)。在用ABP选择性处理的人树突状细胞的核中排除RhoB，而在小鼠中不排除，尽管两个物种中RhoB蛋白序列是相同的(图5E和图6C)。为了测试在白血病癌干细胞以及白血病胚细胞中，通过ABP处理是否发生RhoB的重新分配，基于流动标志物对来自相同供体的癌干细胞和健康干细胞进行分选并定量RhoB的分布。的确，在来自急性髓细胞性白血病患者供体的原代胚细胞中，RhoB的定位与Vγ9Vδ2 TCR工程化T细胞的识别相关(图5B和图6A)，包括在白血病干细胞中，但是在来自相同供体的健康干细胞中不是(图5F)。总的来说，这些结果表明肿瘤细胞中小GTP酶RhoB的胞内分布的调节(例如，从核排除RhoB)将提高它们对Vγ9Vδ2 TCR+T细胞的靶向的敏感性。
[0290] 实施例4.RhoB调节CD277的膜移动性，和癌细胞上CD277的J构型的形成
[0291] 测试了作为肌动蛋白应力纤维的细胞骨架重构和形成中的重要作用因子的ABP和RhoB对CD277移动性的影响。使用ABP唑来膦酸处理293HEK细胞导致CD277膜移动性降低。明显地，使用calpeptin处理引起了与单独ABP处理类似水平的CD277的固定化，而C3-转移酶抵消了这种ABP-作用(图7A)。这表明了Rho GTP酶活性对CD277在甲羟戊酸途径上游的膜固定化起作用的可能性。通过CRISPR/Cas的RhoB选择性减少将ABP引起的CD277固定化抑制至与媒介物对照相当的水平，这表明ABP介导的CD277移动性的变化依赖于RhoB。
[0292] 为了然后评价RhoB诱导的细胞骨架重排在介导所观察到的CD277移动性的变化和J构型形成中的作用，通过吸引(tantalization)实验研究了CD277分子和F-肌动蛋白之间的关系。用荧光标记的抗CD277和鬼笔环肽对HEK 293细胞染色，并确定对使用ABP和
calpeptin的处理起反应的吸引(tantalization)系数。在培养基中的细胞中，观察到了
CD277和F-肌动蛋白之间可变但明显的共定位，并且这种共定位被ABP处理显著降低(图
7B)。显著地，并且与它对CD277膜移动性的影响类似，calpeptin将CD277和F-肌动蛋白之间的吸引(tantalization)降低至与使用ABP处理所观察到的相当的水平。这种降低表明磷酸抗原积累和Rho激活两者均可以引起由细胞骨架所围绕的膜域的形成，在此可以捕集并固定CD277分子以形成CD277的J构型。重要地，C3-转移酶防止ABP引起的CD277-肌动蛋白的分离，再次表明活性Rho在该过程中的关键性参与。总的来说，这些数据表明通过细胞骨架重排调节CD277膜移动性和形成CD277的J构型有助于表达特异地结合J构型的多肽的工程化
的细胞如Vγ9Vδ2TCR+T细胞的靶标识别。
calpeptin的处理起反应的吸引(tantalization)系数。在培养基中的细胞中，观察到了
CD277和F-肌动蛋白之间可变但明显的共定位，并且这种共定位被ABP处理显著降低(图
7B)。显著地，并且与它对CD277膜移动性的影响类似，calpeptin将CD277和F-肌动蛋白之间的吸引(tantalization)降低至与使用ABP处理所观察到的相当的水平。这种降低表明磷酸抗原积累和Rho激活两者均可以引起由细胞骨架所围绕的膜域的形成，在此可以捕集并固定CD277分子以形成CD277的J构型。重要地，C3-转移酶防止ABP引起的CD277-肌动蛋白的分离，再次表明活性Rho在该过程中的关键性参与。总的来说，这些数据表明通过细胞骨架重排调节CD277膜移动性和形成CD277的J构型有助于表达特异地结合J构型的多肽的工程化
的细胞如Vγ9Vδ2TCR+T细胞的靶标识别。
[0293] 实施例5.RhoB与本文所描述的多肽构建体，例如，Vγ9Vδ2 TCR所识别的癌细胞中的CD277同源二聚体相互作用
[0294] 考虑到在形成J构型的CD277的膜固定化中对RhoB活性的强烈需要，测试了CD277的调控是否包括与RhoB的直接相互作用。使用原位/邻位连接测定(PLA)，只有当使用ABP预处理时，在所识别的EBV-LCL 48细胞中观察到了RhoB和CD277紧密靠近(图8A，图5A)。重要地，PLA信号通常不包括核区并且靠近质膜分布，这与我们的数据：通过调节膜表达的CD277的J构型的形成，RhoB参与Vγ9Vδ2 TCR+T细胞识别一致。
[0295] 为了确定当在细胞背景中表达时，CD277是否作为同源二聚体存在，并且为了在更高的分辨率研究RhoB-CD277相互作用，通过使用荧光能量共振转移(FRET)检查了密切相互作用。通过过表达FRET相容性融合蛋白或者用与FRET-相容性荧色物偶联的抗体标记内原蛋白，对ABP-敏感的HEK 293细胞进行流式细胞术FRET测量。这些实验显示作为同源二聚体在癌细胞的细胞表面上表达CD277分子(图8B)，然而CD277分子配对对ABP诱导的磷酸抗原的积累不敏感。RhoB和CD277之间的紧密结合在ABP未处理的HEK细胞中是不可检测的，但是在用ABP处理细胞之后显著提高(图8C)。将生物膜干涉测量法(BLI)用于正式限定RhoB在CD277胞内域上可能的对接位点。使用重组全长BTN3A1胞内域(BFI)检测RhoB结合(图8D；左图和表1)，然而当使用缺少跨膜域的N末端区连接子的重组CD277 B30.2域时，显著降低(图
8E；左图)。这些数据表明CD277胞内域的膜近端区在与RhoB GTP酶的结合中的重要作用。有趣地，在存在可溶性磷酸抗原cHDMAPP的情况下，RhoB与BFI的结合几乎完全地消(图8D；右图)。当在相同实验中，应用生理学更相关，但亲合力低得多的pAg IPP时，BLI不能分辨pAg诱导的RhoB与BFI的解离(图9C)，这很可能是由于该测定的技术限制所造成的。总之，这些数据表明设计以促进RhoB和CD277分子之间在膜表面上的密切相互作用的方法和组合物将促进J构型的形成以及Vγ9Vδ2 TCR对其的识别。
8E；左图)。这些数据表明CD277胞内域的膜近端区在与RhoB GTP酶的结合中的重要作用。有趣地，在存在可溶性磷酸抗原cHDMAPP的情况下，RhoB与BFI的结合几乎完全地消(图8D；右图)。当在相同实验中，应用生理学更相关，但亲合力低得多的pAg IPP时，BLI不能分辨pAg诱导的RhoB与BFI的解离(图9C)，这很可能是由于该测定的技术限制所造成的。总之，这些数据表明设计以促进RhoB和CD277分子之间在膜表面上的密切相互作用的方法和组合物将促进J构型的形成以及Vγ9Vδ2 TCR对其的识别。
[0296] 表1.在存在或不存在pAg的情况下，RhoB GTP酶和BFI或B30.2域之间的结合相互作用的速率和亲合常数
[0297]
[0298] 实施例6.磷酸抗原积累与CD277二聚体向J构型的构象变化有关
[0299] 为了研究CD277对磷酸抗原水平提高响应而向J构型的构象变化，用荧光脂质缀合物BODIPY FL(供体)标记未刺激或ABP刺激的HEK 293细胞的表面膜，并随后在冰上用受体染料标记的BTN3特异性抗体染色，以避免生理学条件下可能由这些抗体所驱动的构象变化。在没有ABP刺激的情况下，在染色膜和两种抗体之间观察到了强FRET效率(图10B)，表明CD277 Ig-V域非常接近于细胞膜。然而，显著地，用ABP处理细胞导致FRET信号显著降低(图
10B)，表明胞内磷酸抗原积累与BTN3分子的构象变化有关。这种变化包括Ig-V域与细胞膜的显著相距。重要地，细胞的Rho-抑制剂C3-转移酶处理(图3F)不会防止CD277同源二聚体的ABP驱动的构象变化(图10B)，这表明这种构象变化与RhoB的酶活力无关。这些数据表明促进CD277二聚化的方法和组合物起到Vγ9Vδ2 TCR所识别的分子特征，即CD277的J构型的作用，或者有助于这种作用。
10B)，表明胞内磷酸抗原积累与BTN3分子的构象变化有关。这种变化包括Ig-V域与细胞膜的显著相距。重要地，细胞的Rho-抑制剂C3-转移酶处理(图3F)不会防止CD277同源二聚体的ABP驱动的构象变化(图10B)，这表明这种构象变化与RhoB的酶活力无关。这些数据表明促进CD277二聚化的方法和组合物起到Vγ9Vδ2 TCR所识别的分子特征，即CD277的J构型的作用，或者有助于这种作用。
[0300] 图11显示了基于本文所提供的数据的Vγ9Vδ2 TCR T细胞激活的模型。在非激活阶段期间，不存在来自核外区域的磷酸抗原的积累(pAg，黄色星，其保留了GDP结合的RhoB(圆圈+GDP)。在激活阶段组分I期间，磷酸抗原的积累之后是更多GTP结合的RhoB的形成(圆圈+GTP)。GTP结合的RhoB经历了核外区域中积累的亚细胞再区室化(黑色箭头)并且通过促进结合至CD277的B30.2域近端连接子区(CR)(蓝色六边形)的质膜中的细胞骨架捕集(从膜延伸出的线)，有利于CD277向J构型的空间重新分布。在激活阶段组分II期间，GTP结合的RhoB在与pAg解离(黑色箭头)的同时，结合至CD277的B30.2域，其引发了CD277的胞外区(ER)的构象变化，从而导致CD277的J构型的形成并导致Vγ9Vδ2TCR T细胞激活。
[0301] 实施例7.所识别的SNP不仅预测LCL系的识别，而且还预测其他肿瘤细胞系，包括实体瘤细胞系的识别。
[0302] SNP A/G或者G/G的阳性预测值比A/A的阴性预测值更大，并且取决于TCR亲合力(参见表2)。在表2中，克隆5编码γ9δ2 TCR，其具有比克隆115所编码的γ9δ2 TCR更大的亲合力(Marcu-Mallna等人,“RedirectingαβT cells against cancer cells by transfer of a broadly tumor-reactiveγδT-cell receptor,”Blood,118:50-59(2011))。因此，基于该数据，TCR亲合力越高：
[0303] 1.)则阳性预测值越好(即所包括的患者具有作为起反应者的大的机会)
[0304] 2.)则阴性预测值越差(即可以排除作为起反应者的患者)。
[0305] 相对于表2中的数据，通过测序评价了不同肿瘤细胞的基因型。通过IFNg-ELIspot测定或者ELISA评价了肿瘤细胞的识别，其中将所表明的肿瘤细胞系用作表达G115或克隆5链的Vγ9Vδ2TCR+T细胞的靶标。0表示未识别；1表示显著识别。对于所表明的SNP计算了假阴性和真阳性识别。
[0306] 这些数据表明RhoB是工程设计以表达限定的γδTCR的T细胞(即“TEG细胞”)对肿瘤细胞识别的重要调节因子，并且γ9δ2TCR亲合力的提高可以部分克服这种机制。另外，胁迫如辐射既不引起所述机制(RhoB向细胞膜附近的重新定位)，也不引起识别(参见图12)。
[0307] 表2.对于肿瘤细胞对工程设计以表达限定的TCR的T细胞的敏感性的预测取决于肿瘤的SNP基因型以及γ9δ2TCR的亲合力。
[0308]
[0309] 实施例8.位于Rho-GTP酶外部的SNP可以影响Rho-GTP酶
[0310] 在一些情况下，位于所关心的基因内的限定的SNP将直接影响通过所述基因编码的蛋白的表达或功能。然而，在一些情况下，所识别的SNP可能不直接位于这些区域内，并且可能不检测剪接变体。
[0311] 一种假设为位于Rho-GTP酶外部的SNP可以影响Rho-GTP酶的活性。用于SAPPHIRE策略的数据库可以不是完整的，并因此可以不覆盖所有SNP。为了进一步识别与标志物SNP的基因型相关的遗传变异，将进行主要针对Rho-GTP酶的启动子区的扩大的基因组测序。
Rho-GTP酶的启动子区在小鼠和人之间是不同的，尽管Rho-GTP酶本身的序列是相同的。该观察结果可以潜在解释为何在小鼠中未观察到γδ2 T细胞。另外，将使用最近发布的下一代SAPPHIRE数据库，其将允许进行更深入的SNP分析以检测位于Rho-GTP酶的基因组区内的SNP。将通过包括代理SNP(即高LD中的SNP，具有SNP命中数，www.broadinstitute.org/mpg/snap/ldsearch.php)以及预测(代理)SNP的功能性(例如，错义、启动子、调控区等，例如http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/)来开发改善的2.0-版SAPPHIRE。另外，SNP将与使用表达数量性状基因座(eQTL)分析(http://www.sanger.ac.uk/resources/software/
genevar/)的差异基因表达相关，并且将通过NCBI基因本体(GO)项来推导候选基因中的常规细胞过程或途径。具体地，将靶向编码Rho调控蛋白的基因，包括属于GEF(鸟苷酸交换因子)、GAP(GTP酶激活蛋白)和GDI(鸟苷酸交换抑制因子)分子家族的一些130个基因。照此，基因通常位于与Rho-GTP酶相同的染色体区，并因此也接近于标志物SNP。将靶向这些基因以用于进一步的计算和序列分析。
Rho-GTP酶的启动子区在小鼠和人之间是不同的，尽管Rho-GTP酶本身的序列是相同的。该观察结果可以潜在解释为何在小鼠中未观察到γδ2 T细胞。另外，将使用最近发布的下一代SAPPHIRE数据库，其将允许进行更深入的SNP分析以检测位于Rho-GTP酶的基因组区内的SNP。将通过包括代理SNP(即高LD中的SNP，具有SNP命中数，www.broadinstitute.org/mpg/snap/ldsearch.php)以及预测(代理)SNP的功能性(例如，错义、启动子、调控区等，例如http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/)来开发改善的2.0-版SAPPHIRE。另外，SNP将与使用表达数量性状基因座(eQTL)分析(http://www.sanger.ac.uk/resources/software/
genevar/)的差异基因表达相关，并且将通过NCBI基因本体(GO)项来推导候选基因中的常规细胞过程或途径。具体地，将靶向编码Rho调控蛋白的基因，包括属于GEF(鸟苷酸交换因子)、GAP(GTP酶激活蛋白)和GDI(鸟苷酸交换抑制因子)分子家族的一些130个基因。照此，基因通常位于与Rho-GTP酶相同的染色体区，并因此也接近于标志物SNP。将靶向这些基因以用于进一步的计算和序列分析。
[0312] 预测结果：可以识别(例如)连接至标志物SNP的Rho-GTP酶的启动子区或调控基因内的SNP。跟踪研究可以包括启动子研究以提供有关通过限定SNP对Rho-GTP酶的差异调控的功能数据，或者过表达或抑制Rho-GTP酶的调控蛋白的研究。
[0313] 实施例9.实验程序
[0314] 细胞和试剂
[0315] 细胞和试剂CEPH EBV-LCL系(CEU群体组)是由Tuna Mutis(UMC Utrecht,The Netherlands)友情赠送的。Daudi、K562、SW480、HEK 293、HEK 293FT和Phoenix-Ampho细胞系得自ATCC。LCL-TM(分离自CEPH组的EBV-LCL系)由Phil Greenberg(Seattle,U.S.A.)友情提供。MZ1851RC由Barbara Seliger(University of Halle,Germany)友情提供。将Hek
293、Phoenix-Ampho、SW480、MZ1851RC细胞在补充有1％Pen/Strep(Invitrogen)和10％FCS(Bodinco)的DMEM中培养，所有其他细胞系在补充有1％pen/strep和10％FCS的RPMI中培
养。通过Ficoll-Paque(GE Healthcare)，从Sanquin血库(Amsterdam,The Netherlands)所提供的血沉棕黄层分离原代新鲜的PBMC。冷冻的原代急性髓细胞性白血病(AML)样品由
Matthias Theobald(Mainz,Germany)友情提供并且按照GCP and Helsinki条例采集。
293、Phoenix-Ampho、SW480、MZ1851RC细胞在补充有1％Pen/Strep(Invitrogen)和10％FCS(Bodinco)的DMEM中培养，所有其他细胞系在补充有1％pen/strep和10％FCS的RPMI中培
养。通过Ficoll-Paque(GE Healthcare)，从Sanquin血库(Amsterdam,The Netherlands)所提供的血沉棕黄层分离原代新鲜的PBMC。冷冻的原代急性髓细胞性白血病(AML)样品由
Matthias Theobald(Mainz,Germany)友情提供并且按照GCP and Helsinki条例采集。
[0316] 使用了以下试剂：帕米膦酸(Calbiochem)、一水合唑来膦酸(zolidronate,Sigma-Aldrich)、异戊烯焦磷酸酯(IPP)(Sigma-Aldrich)、calpeptin(Rho激活剂II CN03，Cytoskeleton Inc)、C3转移酶(Rho抑制剂I CT04，Cytoskeleton Inc)、法呢基转移酶抑制剂(FTI)(Sigma-Aldrich)和异戊二烯基转移酶抑制剂(GGTI)(Sigma-Aldrich)。
[0317] 流式细胞术
[0318] 用于流式细胞术的抗体包括：泛-γδTCR-PE(克隆IMMU510，Beckman Coulter)、CD4-FITC(eBioscience)、CD8-APC(BD)、非缀合的兔多克隆RhoB(AbCam)、山羊-抗兔Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch)。小鼠a-CD277 mAb(克隆#20.1和103.2)由D.Oliver(INSERM U891,Marseille,France)友情提供。用FACSCalibur和FACSCanto-II流式细胞仪(BD)处理样品并用FACSDiva软件(BD)分析。根据如前所述的表型标志物对原代白血病干细胞和健康祖细胞进行分选(Terwijn等人,2014)。
[0319] 使用FACS Aria SORP(具有红色、蓝色和紫色固体激光器；BD Biosciences)分选细胞。整个程序期间，将细胞保持在冰上。用AntiCD45RA Alexa Fluor 700、抗CD38APC、抗CD34 Horizon BV421、抗CD45 Horizon V500(均来自BD Biosciences,San Jose,CA,USA)标记细胞。基于CD45RA表达分选CD34+CD38-干细胞：CD45RA阳性细胞是肿瘤造血干细胞，CD45RA阴性细胞是正常造血干细胞。基于上文，对CD34+CD38+祖细胞进行分选。
[0320] TCR的反转录病毒转导
[0321] TCR的反转录病毒转导如所述的，将Vγ9Vδ2-TCR克隆G115(Allison等人,2001)和HLA-A*0201限制的WT1126-134特异性αβTCR(Kuball等人,2007)转导到αβT细胞中(Marcu-Malina等人,2011；Stanislawski等人,2001)。简要地，使用Fugene6(Promega)，用含有TCRγ/β-链-IRES-新霉素或者TCRδ/α-链-IRES-嘌罗霉素的gag-pol(pHIT60)、env(pCOLT-GALV)和pBullet反转录病毒构建体转染Phoenix-Ampho包装细胞。在存在50U/ml IL-2和4μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich)的情况下，在48小时内，用病毒上清液转导用αCD3(30ng/ml)(克隆OKT3,Janssen-Cilag)和IL-2(50U/ml)预激活的PBMC两次。通过用αCD3/CD28 6 6
Dynabeads(0.5×10个珠/10个细胞)(Invitrogen)和IL-2(50U/ml)刺激来扩增转导的T细
胞，并且使用800μg/ml遗传霉素(Gibco)和5μg/ml嘌罗霉素(Sigma-Aldrich)选择1周。使用CD4-微珠(Miltenyi Biotec)，通过MACS-分选分离CD4+TCR转导的T细胞。
Dynabeads(0.5×10个珠/10个细胞)(Invitrogen)和IL-2(50U/ml)刺激来扩增转导的T细
胞，并且使用800μg/ml遗传霉素(Gibco)和5μg/ml嘌罗霉素(Sigma-Aldrich)选择1周。使用CD4-微珠(Miltenyi Biotec)，通过MACS-分选分离CD4+TCR转导的T细胞。
[0322] 转导后，使用1μg/ml PHA-L(Sigma-Aldrich)、50U/ml IL-2(Novartis Pharma)、5ng/ml IL-15(R&D Systems)和辐照的同种异体的PBMC、Daudi和LCL-TM细胞每两周刺激转导的T细胞。每周添加两次新鲜的IL-2。通过流式细胞术常规评价转基因TCR表达和CD4+群体的纯度。
[0323] 功能T细胞测定
[0324] 如前所述，进行IFNγELISPOT(Scheper等人,2013,Marcu-Malina等人,2011)。简要地，将15,000个Vγ9Vδ2 TCR转导的或空转导的T细胞和50,000个靶细胞(比例0.3:1)在用抗IFNγ抗体(克隆1-D1K)(Mabtech)预涂覆的硝化纤维素底的96孔板(Millipore)中共培养24小时。清洗板，并与第二生物素化的抗IFNγ抗体(克隆7-B6-1)(Mabtech)一起培育，然后与抗生蛋白链菌素-HRP(Mabtech)一起培育。使用TMB底物(Sanquin)使IFNγ斑点显
象，并且使用ELISPOT分析软件(Aelvis)定量斑点数目。
象，并且使用ELISPOT分析软件(Aelvis)定量斑点数目。
[0325] 可替代地，将如上所述的Vγ9Vδ2 TCR转导的T细胞和靶细胞在96孔圆底板中共培养，并通过ELISA测量上清液中IFNγ的水平。当指明时，在共培育之前，用帕米膦酸(100μM)、IPP(15μM)、FTI(10μM)、GGTI(50μM)、calpeptin(2μg/ml)或者C3转移酶(20μg/ml)预处理靶细胞。为了测试WT1αβTCR转导的T细胞的刺激，用10μM WT1126-134肽脉冲HLA-A2+细胞系EBV-LCL 48和MZ1851RC。
[0326] 合子型/SNP相关性分析
[0327] 通过ELISPOT确定Vγ9Vδ2 TCR转导的CD4+T细胞对CEPH EBV-LCL系(用媒介物、帕米膦酸(100μM)或者IPP(15μM)预处理)的识别。作为效应因子对照包括空转导的T细胞，并且在分析中不包括任何通过空转导的T细胞引起IFNγ产生的EBV-LCL系。将单一测定中Vγ9Vδ2 TCR+T细胞对EBV-LCL系的识别定义为不管是否进行EBV-LCL预处理(即媒介物、帕米膦酸或IPP)，与起反应的健康对照靶细胞中所产生的那些相比，至少提高两倍。当在5个独立实验中的至少三个中识别时，将EBV-LCL系定义为激活。使用CEPH家族谱系内的经典孟德尔遗传模式来推导候选基因座的假想合子型，其中候选等位基因对Vγ9Vδ2 TCR介导的识别的影响假定是主要的。随后如前所述，使用软件工具ssSNPer计算了预测合子型与CEPH个体的Hapmap SNP基因型的相关性(Spaapen等人,2008)。使用r2＝0.8作为连锁不平衡的阈值，通过查询SNP注释和代理搜索(SNAP)工具(Johnson等人,2008)，收集ssSNPer所产生的
500kb的SNP内的代理SNP。使用Genevar(基因表达变化)(GENe Expression VARiation)工具来进行ssSNPer SNP以及它们的代理的eQTL分析(Yang等人,2010)。
500kb的SNP内的代理SNP。使用Genevar(基因表达变化)(GENe Expression VARiation)工具来进行ssSNPer SNP以及它们的代理的eQTL分析(Yang等人,2010)。
[0328] shRNA和CRISPR/Cas基因组编辑
[0329] 使用Fugene 6(Promega)，针对所关心的候选基因，用含有shRNA的慢病毒构建体(Sigma-Aldrich)以及慢病毒辅助构建体VSVG和pspax2转染HEK 293FT细胞。在功能T细胞测定之前，用病毒上清液转导EBV-LCL 48细胞4天。使用实时Q-PCR，或者就RhoB来说，通过流式细胞术确认靶标基因的敲低。
[0330] 我们使用CRISPR/Cas9系统(van de Weijer等人，2014)从MZ1851RC细胞中敲除了RHOA、RHOB或RHOC。为此，我们使用了共表达化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9、PuroR和驱动抗RHOA向导RNA(gRNA)的表达的人U6启动子的慢病毒CRISPR/Cas9载体(Ref Weijer等人)。通过来自Zhang实验室(http://crispr.mit.edu/)的CRISPR设计工具设计gRNA序列的基因特异性区域，并且它们的序列为GAACTATGTGGCAGATATCG(RHOA)(SEQ ID NO:2)、
GTGGTGGGCGACGGCGCGTG(RHOB)(SEQ ID NO:3)和GAAAGAAGCTGGTGATCGT(RHOC)(SEQ ID NO:
4)。作为对照gRNA，我们用GTGAACCGCATCGAGCTGAA(SEQ ID NO:5)靶向eGFP基因。
GTGGTGGGCGACGGCGCGTG(RHOB)(SEQ ID NO:3)和GAAAGAAGCTGGTGATCGT(RHOC)(SEQ ID NO:
4)。作为对照gRNA，我们用GTGAACCGCATCGAGCTGAA(SEQ ID NO:5)靶向eGFP基因。
[0331] 使用标准第3代包装载体在293T细胞中产生慢病毒。用所指明的CRISPR/Cas9慢病毒转导MZ1851RC细胞，并且用2μg ml-1嘌罗霉素选择细胞。使用流式细胞术评价RhoB敲除效率。
[0332] 免疫印迹分析
[0333] 用帕米膦酸处理EBV-LCL系22、48、91和93过夜，并通过含有NP-40的裂解缓冲液进行裂解。将裂解液离以除去细胞碎片并通过SDS-PAGE分离上清液。将蛋白质内容物转移到PVDF膜(Millipore)上，在封闭缓冲液(5％牛奶)中封闭1小时并与抗RhoB(LifeSpan Biosciences)或抗β-微管蛋白(clone DM1A)(Sigma)的兔多克隆抗体培育过夜。随后，将印迹与HRP缀合的第二抗体培育，并使用Pierce ECL底物(Thermpo Scientific)使条带显象。
[0334] 共聚焦显微镜检查和数据分析
[0335] 对于RhoB的胞内免疫荧光染色，用帕米膦酸处理细胞过夜(当指明时)并使其连接至用聚赖氨酸(Sigma-Aldrich)预涂覆的盖玻片上。随后，用透性化溶液2(BD)使细胞透性化，用封闭血清(50％混合正常人血清在PBS中的溶液)封闭，并用兔多克隆抗RhoB抗体(AbCam)，然后用第二山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488缀合的抗体(Jackson
ImmunoResearch)染色。用封闭血清清洗细胞，用4％多聚甲醛固定，用DAPI染色(当指明时)，并使用Mowiol封固到显微镜载玻片上。使用Zeiss共聚焦激光扫描显微镜LSM 700采集图片。使用Volocity软件(PerkinElmer)或者Image J软件确定RhoB的核和核外信号之间的比，其中当可用时，使用DAPI染色来标记核。
ImmunoResearch)染色。用封闭血清清洗细胞，用4％多聚甲醛固定，用DAPI染色(当指明时)，并使用Mowiol封固到显微镜载玻片上。使用Zeiss共聚焦激光扫描显微镜LSM 700采集图片。使用Volocity软件(PerkinElmer)或者Image J软件确定RhoB的核和核外信号之间的比，其中当可用时，使用DAPI染色来标记核。
[0336] 为了确定BTN3分子和肌动蛋白细胞骨架之间的共定位，使HEK 293细胞在聚-L-细胞溶素涂覆的盖玻片上生长并在用帕米膦酸处理样品之前，用calpeptin(2μg/ml)或者C3转移酶(20μg/ml)预处理。将细胞固定，透性化，并分别用DyLight 680缀合的BTN3抗体(克隆BT3.1,Novus Biologicals)和荧光素-偶联的鬼笔环肽(Sigma)对BTN3和F-肌动蛋白进行染色。作为使用Volocity软件的共定位的量度，确定BTN3和F-肌动蛋白信号之间的相关系数。
[0337] FRAP显微镜检查
[0338] 如前所述，进行FRAP分析(Harly等人,2012,Sandstrom等人,2014)。简要地，将表达EmGFP-融合的CD277的HEK293FT细胞涂抹在m-载玻片上(Ibidi)并使用Nikon A1 RS共聚焦显微镜(60×NA 1.40油浸物镜)分析。通过使用全功率激光强度(>90％的荧光损失)，使所选的矩形区域光致漂白500ms。在使用低激光强度漂白之前(30s)和之后(120s)，每5s采集图像。使用Metamorph 7.5(Molecular Devices,Universal Imaging)和NIS(Nikon)成像软件分析图像。使用单指数方程拟合所得曲线。
[0339] 流式细胞术FRET
[0340] 为了研究RhoB和BTN3分子的结合，通过使用透性化溶液2(BD)使细胞透性化，然后用含有50％人血清的PBS封闭，并使用兔多克隆抗RhoB抗体(AbCam)标记。用PBS清洗后，分别用Alexa594缀合的山羊抗兔IgG(受体)(Jackson ImmunoResearch)和CD277-PE(供体)(BT3.1,Biollegend)标记样品。使用FACS Canto-II流式细胞仪(BD)测量供体荧光，其中将双重标记的样品的供体荧光与仅用供体抗体标记的样品相比较。在存在受体的情况下，根据供体荧光的部分降低计算FRET效率。
[0341] 为了确定CD277分子的均二聚化，使用等量PE缀合的抗CD277(供体)和Dyligth680缀合的抗CD277(受体)对细胞共染色，并使用FACS Canto-II流式细胞仪(BD)测量样品。根据Sebestyen和同事(Sebestyen等人,2002)的方程计算FRET效率，其中以488nm激发并且以576±26nm检测供体荧光，以635nm激发并且以780±60nm检测受体荧光，然而以488nm激发
并且以780±60nm检测FRET强度。从对未标记和单一标记的细胞所测量的数据获得不同荧
光通道之间的光谱重叠的修正因子。
并且以780±60nm检测FRET强度。从对未标记和单一标记的细胞所测量的数据获得不同荧
光通道之间的光谱重叠的修正因子。
[0342] 如文献所述，类似地确定BTN3分子的构象变化(Gaspar等人,2001)。用5ug/ml BODIPY-FL DPHE(供体)(Life Technologies)在冰上标记细胞10分钟，然后在37℃标记10分钟，然后用冰冷的PBS彻底清洗。随后，用小鼠抗CD277 mAb(克隆#20.1或者#103.2)和Alexa594缀合的山羊抗小鼠Fab片段(Jackson ImmunoResearch)标记细胞。清洗后，将细胞在冰冷的PBS中再悬浮并立即使用FACS Canto-II流式细胞仪(BD)测量。在存在受体的情况下，根据供体荧光的部分降低计算FRET效率。
[0343] 邻位连接测定
[0344] 使HEK 293FT细胞在聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上生长，并在固定并用透性化缓冲液2(BD)透性化15分钟之前，用100uM帕米膦酸预处理过夜。随后，用PBS清洗细胞三次，并在22℃，在含有50％人血清的PBS中封闭30分钟。封闭后，将细胞在22℃与兔抗RhoB(AbCam)和小鼠抗CD277(Novus Biologicals)在含有50％人血清的PBS中培育60min。用PBST(0.05％吐温)清洗细胞三次，并在37℃，与第二小鼠加和兔减抗体避光培育1.5小时。在使用原位PLA检测试剂盒(Abnova)探针检测之前，在PBST中清洗细胞三次。使用63×物镜，在Zeiss LSM 710荧光显微镜上分析细胞。
[0345] 体外蛋白表达和纯化
[0346] 使用限制性内切酶位点Ndel和XhoI(5'引物：CGCCATATGATGGCCGCCATCCG(SEQ ID NO:7)；3'引物CGCCTCGAGTTAGCAGCAGTTGATGCAGC(SEQ ID NO:8))，将全长RhoB蛋白克隆至具有C末端6-HIS标签(SEQ ID NO:6)，然后是凝血酶切割位点的pET 28a载体中。使RhoB的C末端CKVL(SEQ ID NO:9)基序缺失以防止大肠杆菌(Escherichia coli)中不正确的异戊烯化。在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21株中表达所述构建体。将细胞在37℃特级肉汤(TB)培养基中生长至OD600＝0.6，然后转移至室温(25℃)。回收15min之后，用1ml 1M异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)/升培养物诱导细胞12-16小时。收获蛋白，并使用Ni-NTA(Qiagen)IMAC色谱，在20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，20mM咪唑，5mM MgCl2和4mM 2-巯基乙醇(BME)中纯化，首先用在上述缓冲液中添加的1mM ATP清洗以将可能的侣伴蛋白与
RhoB解离，然后用无ATP的缓冲液清洗，并且最终用20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，250mM咪唑，5mM MgCl2和4mM BME洗脱。使用Econo-Pac 10DG柱(Biorad)，使洗脱部分脱盐为10mM Hepes 7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，5mM MgCl2和4mM BME。在Superdex 200柱(GE Healthcare)上，在10mM Hepes pH7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，5mM MgCl2和4mM BME中，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白。通过BCA测试和使用理论消光系数，使用ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Inc.)测量A280信号两者来测量蛋白浓度。如前所述，表达并纯化BTN3A1 B30.2域(Sandstrom等人,2014)。使用限制性内切酶位点NcoI和XhoI(5'引物：GCGCCATGGGGCAACAGCAGGAGGAAAAA(SEQ ID NO:10)；3'引物：CGCTCGAGGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGACCACCAGACGCTG GACAAATAGTC(SEQ ID NO:11))，将BTN3A1全长胞内域克隆到具有3C蛋白酶位点，然后是羧基末端6-HIS标签(SEQ ID NO:6)的pET28a中。在大肠杆菌
(Escherichia coli)BL21株中表达所述构建体。使细胞在溶菌肉汤(LB)培养基中，在37℃生长至OD600＝0.6，并在室温下用1ml 1M IPTG/升培养物诱导4小时。收获蛋白，并使用Ni-NTA(Qiagen)IMAC色谱，在20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，20mM咪唑，4mM BME中纯化，并用
20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，250mM咪唑，4mM BME洗脱，并使用Econo-Pac 10DG柱
(Biorad)脱盐为10mM Hepes pH7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，4mM BME。使用3C蛋白酶，在4℃切割蛋白过夜。如上所述测量蛋白浓度(图S4A和S4B)。
RhoB解离，然后用无ATP的缓冲液清洗，并且最终用20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，250mM咪唑，5mM MgCl2和4mM BME洗脱。使用Econo-Pac 10DG柱(Biorad)，使洗脱部分脱盐为10mM Hepes 7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，5mM MgCl2和4mM BME。在Superdex 200柱(GE Healthcare)上，在10mM Hepes pH7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，5mM MgCl2和4mM BME中，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白。通过BCA测试和使用理论消光系数，使用ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Inc.)测量A280信号两者来测量蛋白浓度。如前所述，表达并纯化BTN3A1 B30.2域(Sandstrom等人,2014)。使用限制性内切酶位点NcoI和XhoI(5'引物：GCGCCATGGGGCAACAGCAGGAGGAAAAA(SEQ ID NO:10)；3'引物：CGCTCGAGGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGACCACCAGACGCTG GACAAATAGTC(SEQ ID NO:11))，将BTN3A1全长胞内域克隆到具有3C蛋白酶位点，然后是羧基末端6-HIS标签(SEQ ID NO:6)的pET28a中。在大肠杆菌
(Escherichia coli)BL21株中表达所述构建体。使细胞在溶菌肉汤(LB)培养基中，在37℃生长至OD600＝0.6，并在室温下用1ml 1M IPTG/升培养物诱导4小时。收获蛋白，并使用Ni-NTA(Qiagen)IMAC色谱，在20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，20mM咪唑，4mM BME中纯化，并用
20mM Tris pH8.0，400mM NaCl，250mM咪唑，4mM BME洗脱，并使用Econo-Pac 10DG柱
(Biorad)脱盐为10mM Hepes pH7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，4mM BME。使用3C蛋白酶，在4℃切割蛋白过夜。如上所述测量蛋白浓度(图S4A和S4B)。
[0347] 生物膜干涉测量法(BLI)
[0348] 使用生物膜干涉测量法(BLItz,FortéBio)测量RhoB和BTN3A1全长胞内域(BFI)或者BTN3A1 B30.2域之间的相互作用。用10mM Hepes pH7.2，150mM NaCl，0.02％叠氮化物，
5mM MgCl2，4mM BME制备基线平衡和解离步骤中使用的BLI缓冲液。使用以下参数：基线
30s，结合300s和解离300s，使用基础动力学方法，将RhoB以2mg/ml的浓度固定在BLI缓冲液水合的Ni-NTA生物传感器上。然后，通过1mg/ml BSA封闭RhoB-封固的生物传感器，并使用类似的方法，通过以下参数：基线30s，结合120s和解离120s，使用BLI缓冲液平衡。将缓冲液实验用作后续实验的参比。使用如上所述的相同方法测量了RhoB和不同浓度的BFI(6.25、
12.5、25、50和100uM)或者B30.2域(12.5、25、50、100和200uM)之间的相互作用。还使用如上所述的相同方法测量了在存在(2E)-1-羟基-2-甲基戊-2-烯基-焦磷酸酯(cHDAMPP)的情况下RhoB和不同浓度的BFI(3.75、7.5、15、30和60uM)或者B30.2域(3.75、7.5、15、30和60uM)之间的相互作用。对于这些测量，将cHDMAPP和BFI或B30.2域之间的比例保持在1:1通过
Biaevulation(Biacore Life Sciences)分析结合相互作用的速率和亲合常数。将数据截止至180s，并且通过漂移基线模型，使用1:1结合同时拟合ka和kd。
5mM MgCl2，4mM BME制备基线平衡和解离步骤中使用的BLI缓冲液。使用以下参数：基线
30s，结合300s和解离300s，使用基础动力学方法，将RhoB以2mg/ml的浓度固定在BLI缓冲液水合的Ni-NTA生物传感器上。然后，通过1mg/ml BSA封闭RhoB-封固的生物传感器，并使用类似的方法，通过以下参数：基线30s，结合120s和解离120s，使用BLI缓冲液平衡。将缓冲液实验用作后续实验的参比。使用如上所述的相同方法测量了RhoB和不同浓度的BFI(6.25、
12.5、25、50和100uM)或者B30.2域(12.5、25、50、100和200uM)之间的相互作用。还使用如上所述的相同方法测量了在存在(2E)-1-羟基-2-甲基戊-2-烯基-焦磷酸酯(cHDAMPP)的情况下RhoB和不同浓度的BFI(3.75、7.5、15、30和60uM)或者B30.2域(3.75、7.5、15、30和60uM)之间的相互作用。对于这些测量，将cHDMAPP和BFI或B30.2域之间的比例保持在1:1通过
Biaevulation(Biacore Life Sciences)分析结合相互作用的速率和亲合常数。将数据截止至180s，并且通过漂移基线模型，使用1:1结合同时拟合ka和kd。
[0349] G-Lisa分析
[0350] 根据生产商的说明，使用G-Lisa RhoA激活测定生物化学试剂盒(产品目录号no.BK124；Cytoskeleton,Inc.,Denver,CO,USA)测定RhoA活性。简要地，使用蛋白酶-抑制剂混合物在冰冷的裂解缓冲液中裂解细胞，然后以10000×g，在4℃离心1min。收获上清液，使用Precision Red Advanced蛋白测定试剂测量蛋白浓度，并最终用冰冷的裂解缓冲液调整至1.0mg/ml。将调整的蛋白提取物转移至Rho-GTP结合蛋白预涂覆的板上。将板置于4℃，
0.72×g的微板轨道振荡器上30min，然后与单克隆小鼠抗人抗RhoA第一抗体(产品目录号
no.GL01A；1:250；Cytoskeleton,Inc.)，接着与多克隆山羊抗小鼠辣根缀合第二抗体(产品目录号no.GL02；1:62.5；Cytoskeleton,Inc.)在0.72×g的微板轨道振荡器(SSM1；Bibby Scientific Limited Group)上在室温下分别培育45min。然后，将板与HRP检测试剂在37℃培育15min。在添加HRP终止缓冲液之后，使用酶标仪在490nm读取吸光值。
0.72×g的微板轨道振荡器上30min，然后与单克隆小鼠抗人抗RhoA第一抗体(产品目录号
no.GL01A；1:250；Cytoskeleton,Inc.)，接着与多克隆山羊抗小鼠辣根缀合第二抗体(产品目录号no.GL02；1:62.5；Cytoskeleton,Inc.)在0.72×g的微板轨道振荡器(SSM1；Bibby Scientific Limited Group)上在室温下分别培育45min。然后，将板与HRP检测试剂在37℃培育15min。在添加HRP终止缓冲液之后，使用酶标仪在490nm读取吸光值。
[0351] 统计分析
[0352] 除非另外说明，否则所有实验独立重复至少三次。将所有数据显示为平均值±SEM。通过曼-惠特尼或者克鲁斯凯-沃利斯检验和邓恩多次对比检验分析统计显著性。
[0353] 尽管本文已显示和描述了本发明公开的优选实施方式，但是对于本领域技术人员显而易见的是仅通过举例说明来提供这些实施方式。在不背离本发明公开的情况下，本领域技术人员现将能够想到多种变化、改变和替换。应理解可以在本发明公开的实践中使用本文所描述的实施方式的多种替代或者本文所描述的这些实施方式或方面中的一种或多种的组合。意图是以下权利要求限定本发明公开的范围并且由此覆盖这些权利要求及其等价形式的范围内的方法和结构。
[0354] 实施例10：实施方法
[0355] 细胞系
[0356] 将细胞系Daudi、LCL-TM、ML-1、JurMA和Jurkat-76培养在补充有10％FCS和1％pen/strep(Gibco)的RPMI(Gibco)中。在补充有10％FCS和1％pen/strep的DMEM(Gibco)中培养HEK293FT细胞系。将人原代T细胞克隆在补充有10％混合人血清和1％pen/strep的
RPMI中培养。将用于反转录病毒转导的大量人原代T细胞在补充有2.5％混合人血清和1％pen/strep的RPMI中培养。在2周快速扩增规程(REP，包括辐照的饲养细胞(Daudi、LCL-TM和同种异体PBMC)+PHA+IL-15+IL-2)之后，培养全部人原代T细胞。
RPMI中培养。将用于反转录病毒转导的大量人原代T细胞在补充有2.5％混合人血清和1％pen/strep的RPMI中培养。在2周快速扩增规程(REP，包括辐照的饲养细胞(Daudi、LCL-TM和同种异体PBMC)+PHA+IL-15+IL-2)之后，培养全部人原代T细胞。
[0357] γ9δ2 T细胞克隆的产生、扩增和功能测试
[0358] 用Vδ2的单克隆抗体(mAb)(Vδ2-FITC克隆B6)对PBMC染色。将mAb-阳性部份大量分选，通过REP扩增并在此之后通过有限稀释克隆(供体A)，或者使用FACS分选进行单细胞-分选，从而在96孔板中收集单细胞(供体B、C)。在ARIAII(BD)上进行所有FACS分选。在功能测试之前，通过REP进行8-12轮扩增。一旦细胞扩增至足够的数目，则进行功能测试：将5×10^4个T细胞与靶细胞以1:1的E:T比在补充有10％FCS和1％pen/strep的DMEM中，在不存在或存在100uM帕米膦酸二钠盐(Calbiochem Cat#506600)情况下一起培育，次日收获上清液，并且使用ELISA(eBioscience Ready-Set-Go！ELISA试剂盒，Invitrogen Cat#88731688)测量IFNy浓度。
[0359] TCR测序和载体产生
[0360] 按照生产商的说明，使用Qiagen RNeasy Minikit，从原代T细胞克隆分离RNA。使用3'恒定区的特异性引物(TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12))，通过II反转录酶(Thermofisher)合成cDNA。使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-
UP(Machery-Nagel)纯化cDNA。使用恒定区的相同反向引物(TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12))和特异性Vδ2正向引物(TRDV2Fw TCTCTTCTGGGCAGGAGTC(SEQ ID NO:
13))，使用 高保真度DNA聚合酶(New England Biolabs)，在T100热循环仪(Biorad)上
并且使用以下循环参数，在PCR扩增中扩增cDNA：
UP(Machery-Nagel)纯化cDNA。使用恒定区的相同反向引物(TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12))和特异性Vδ2正向引物(TRDV2Fw TCTCTTCTGGGCAGGAGTC(SEQ ID NO:
13))，使用 高保真度DNA聚合酶(New England Biolabs)，在T100热循环仪(Biorad)上
并且使用以下循环参数，在PCR扩增中扩增cDNA：
[0361] 使用对于可变和恒定基因节段特异的引物(TRDV2Fw TCTCTTCTGGGCAGGAGTC(SEQ ID NO:13)、TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12)、TRGV9Fw
TCCTTGGGGCTCTGTGTGT(SEQ ID NO:14)、TRGCRev GGGGAAACATCTGCATCA(SEQ ID NO:15))，对TCRγ和δ链测序。在Macrogen进行Sanger测序。
TCCTTGGGGCTCTGTGTGT(SEQ ID NO:14)、TRGCRev GGGGAAACATCTGCATCA(SEQ ID NO:15))，对TCRγ和δ链测序。在Macrogen进行Sanger测序。
[0362] 使用引入新的CDR3序列的重叠延伸PCR，在反转录病毒表达载体中重建所识别的γδT细胞克隆选择的TCRδ和TCRγ链。简要地，基于侧接编码G115的γ或δ链的密码子优化的构建体的CDR3区的恒定序列，产生了一组引物，并且通过克隆特异性核苷酸使所述引物延伸。在悬突内设计了15-20个bp的延伸以对其引物对反向互补(参见表3)：
[0363] 表3：TCRγ和δ序列
[0364]
[0365]
[0366] 在PCR“R1”中，使用结合至克隆到反转录病毒pBullet载体中的模板链δ和γTCRG115并且包括限制性位点(G115δFwd：CTGCCATGGAGCGGATCAGC(SEQ ID NO:70)、G115γFwd：GCCATGGTGTCCCTGCTG(SEQ ID NO:71)，斜体表示NcoI限制性位点)的正向引物和克隆特异性反向引物Rev R1(表3)扩增V-(D)-J部分(CDR3区的可变域和部分)。类似地，在PCR“R2”中，使用恒定反向引物(G115δRev：ATGCGGATCCTCACAGG(SEQ ID NO:72)、G115γRev：
TAGTGGATCCTCAGCTCTTCTC(SEQ ID NO:73)，斜体表示BamHI限制性位点)和克隆特异性正向引物Fwd R2扩增TCR链的(D)-J-C部分。在基于凝胶的尺寸选择和使用NucleoSpin凝胶以及PCR Clean-UP试剂盒(Machery-Nagel)纯化之后，使用G115δFwd/G115δRev和G115γFwd/G115γRev引物对，在PCR“R3”中融合和扩增PCR产物中的两种(R1和R2)以获得具有克隆特异性CDR3区的TCR链。使用Phusion高保真度DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)，在T100热循环仪(Biorad)上，并且对于R1-R2按照以下参数：98℃，120s；98℃，20s，59℃，20s和72℃，25s，循环30次；然后，72℃，600s；对于R3按照以下参数：98℃，120s；98℃，20s，56℃，20s和72℃，40s，循环30次；然后，72℃，600s，进行所有反应。
TAGTGGATCCTCAGCTCTTCTC(SEQ ID NO:73)，斜体表示BamHI限制性位点)和克隆特异性正向引物Fwd R2扩增TCR链的(D)-J-C部分。在基于凝胶的尺寸选择和使用NucleoSpin凝胶以及PCR Clean-UP试剂盒(Machery-Nagel)纯化之后，使用G115δFwd/G115δRev和G115γFwd/G115γRev引物对，在PCR“R3”中融合和扩增PCR产物中的两种(R1和R2)以获得具有克隆特异性CDR3区的TCR链。使用Phusion高保真度DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)，在T100热循环仪(Biorad)上，并且对于R1-R2按照以下参数：98℃，120s；98℃，20s，59℃，20s和72℃，25s，循环30次；然后，72℃，600s；对于R3按照以下参数：98℃，120s；98℃，20s，56℃，20s和72℃，40s，循环30次；然后，72℃，600s，进行所有反应。
[0367] 在再次基于凝胶的尺寸选择步骤之后，将新合成的TCR链纯化并使用NcoI和BamHI克隆位点克隆至反转录病毒pBullet载体中。将TCRδ基因克隆至pBullet-IRES-嘌罗霉素中，并将TCRγ基因克隆至pBullet-IRES-neo中。使用Sanger测序(Macrogen)确认序列同一性。
[0368] 质粒的反转录病毒转导
[0369] 将具有所关心的TCR链的载体对转导至原代人T细胞。以与原代克隆的功能测试相同的方式进行TEG形式的TCR的功能测试。
[0370] TCRδ链的高通量测序
[0371] 按照生产商的说明，使用Qiagen RNeasy Microkit分离RNA。使用3'恒定区的特异性引物(TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12))，通过 II反转录酶(Thermofisher)合成cDNA。使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-UP(Machery-Nagel)纯化
cDNA。使用恒定区的相同反向引物(TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12))和特异性Vδ2正向引物(TRDV2Fw TCTCTTCTGGGCAGGAGTC(SEQ ID NO:13))，使用 高保真度DNA
聚合酶(New England Biolabs)，在T100热循环仪(Biorad)上并且使用以下循环参数：92℃，300s；92℃，30s，63℃，30s和72℃，45s，循环30次；然后是72℃，420s，在PCR扩增中扩增cDNA。在使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-UP纯化后，使用如生产商建议的来自Gendx的HTSgo-IndX指标，通过HTSgo-LibrX试剂盒完成对HTS的文库制备。使用来自GC Biotech的HighPrep PCR珠进行样品的净化。在Illumina MiSeq系统500(2x250bp)(Illumina)上进行高通量测序。使用MiXCR(v2.1.1版)程序进行TCR序列对比、组装和克隆型提取。将内部R脚本用于TCRδ组库分析，以1个读序/克隆型的频率过滤数据以排除克隆型。
cDNA。使用恒定区的相同反向引物(TRDCRev TTCACCAGACAAGCGACA(SEQ ID NO:12))和特异性Vδ2正向引物(TRDV2Fw TCTCTTCTGGGCAGGAGTC(SEQ ID NO:13))，使用 高保真度DNA
聚合酶(New England Biolabs)，在T100热循环仪(Biorad)上并且使用以下循环参数：92℃，300s；92℃，30s，63℃，30s和72℃，45s，循环30次；然后是72℃，420s，在PCR扩增中扩增cDNA。在使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-UP纯化后，使用如生产商建议的来自Gendx的HTSgo-IndX指标，通过HTSgo-LibrX试剂盒完成对HTS的文库制备。使用来自GC Biotech的HighPrep PCR珠进行样品的净化。在Illumina MiSeq系统500(2x250bp)(Illumina)上进行高通量测序。使用MiXCR(v2.1.1版)程序进行TCR序列对比、组装和克隆型提取。将内部R脚本用于TCRδ组库分析，以1个读序/克隆型的频率过滤数据以排除克隆型。
[0372] 可溶性TCR的克隆、表达和纯化
[0373] 从编码全长TCR的合成DNA扩增TCR链的胞外域。Vγ9Vδ2 TCR G115的域边界基于先前所发表的内容。将TCRδ链连接至在构建体的5'端含有μ-磷酸酶信号肽并且在3'端含有fos拉链的修饰的pBullet载体。在5'端含有μ-磷酸酶信号肽，3'端含有jun拉链，然后含有生物素受体肽和多聚组氨酸标签的修饰的pBullet载体中连接TCRγ链。还在含有信号肽的pBullet载体中连接编码细菌生物素连接酶BirA的合成DNA。在Freestyle 293-F细胞(ThermoFisher)中完成可溶性γδTCR的表达。简言之，将含有TCRδ、TCRγ和BirA的质粒以
45:45:10的比例混合，与聚亚乙基亚胺(PEI)以2:3的比例合并，并在室温下培育15'。将DNA:PEI的混合物以1-1.5μg质粒/10^6个细胞的浓度加入至细胞，并且6h后，向培养基中补充Pen/Strep(Gibco)和100μM生物素。转染后5天，收获培养基，补充最终浓度分别为20和
300mM的磷酸盐缓冲液pH 7.5和NaCl，并加载至1ml HisTrap Excel柱(GE Healthcare)。将咪唑浓度逐渐升高的多步梯度用于从所述柱上清洗和洗脱可溶性TCR。将洗脱的可溶性TCR在20mM Tris pH 8.2和20mM NaCl中加载至1ml HiTrapQ柱(GE healthcare)。使用线性梯度洗脱可溶性TCR。将含有可溶性TCR的部份混合并浓缩。制备四聚体和葡聚糖体
(dextramers)。简要地，通过将1当量的SA-PE(1μM)在20分钟内分四步加入至6当量sTCR(6μM)中，从单体制备四聚体。通过将SA-PE和sTCR以1:3的摩尔比预培育15min，然后用生物素化的葡聚糖(MW 500kDa,NanoCS)以1:8的摩尔比(葡聚糖:SA-PE)掺杂所形成的三聚体来制备葡聚糖体。对于珠的制备，将过量的生物素化的可溶性TCR与抗生蛋白链菌素缀合的荧光黄-绿微球(6μm；Polysciences,Inc.)混合以确保完全涂覆珠，从而达到10μg sTCR/mg微球体。
45:45:10的比例混合，与聚亚乙基亚胺(PEI)以2:3的比例合并，并在室温下培育15'。将DNA:PEI的混合物以1-1.5μg质粒/10^6个细胞的浓度加入至细胞，并且6h后，向培养基中补充Pen/Strep(Gibco)和100μM生物素。转染后5天，收获培养基，补充最终浓度分别为20和
300mM的磷酸盐缓冲液pH 7.5和NaCl，并加载至1ml HisTrap Excel柱(GE Healthcare)。将咪唑浓度逐渐升高的多步梯度用于从所述柱上清洗和洗脱可溶性TCR。将洗脱的可溶性TCR在20mM Tris pH 8.2和20mM NaCl中加载至1ml HiTrapQ柱(GE healthcare)。使用线性梯度洗脱可溶性TCR。将含有可溶性TCR的部份混合并浓缩。制备四聚体和葡聚糖体
(dextramers)。简要地，通过将1当量的SA-PE(1μM)在20分钟内分四步加入至6当量sTCR(6μM)中，从单体制备四聚体。通过将SA-PE和sTCR以1:3的摩尔比预培育15min，然后用生物素化的葡聚糖(MW 500kDa,NanoCS)以1:8的摩尔比(葡聚糖:SA-PE)掺杂所形成的三聚体来制备葡聚糖体。对于珠的制备，将过量的生物素化的可溶性TCR与抗生蛋白链菌素缀合的荧光黄-绿微球(6μm；Polysciences,Inc.)混合以确保完全涂覆珠，从而达到10μg sTCR/mg微球体。
[0374] sTCR多聚体-细胞缀合测定
[0375] 对于四聚体和葡聚糖体染色，将1.0*10^5个细胞与30ul四聚体或葡聚糖体溶液4
(相对于SA-PE，100nM)在R.T.培育30分钟。对于珠染色，将7.5*10 个细胞与20μl sTCR-YG珠(0.33mg珠/ml)培育30min。随后，用可固着活力染料eFluor780(eBiosciences)对细胞另外染色30'。对于使用20.1或103.2抗CD277抗体(Daniel Olive,Marseille,France友情赠送)的抑制测定，在添加sTCR-YG珠之前，将Daudi细胞与抗体在R.T.预培育15'。通过添加40μl 2％的甲醛，将混合物固定15'。用1％甲醛清洗样品1次，并在BD FACSCanto II(BD)上进行分析。
(相对于SA-PE，100nM)在R.T.培育30分钟。对于珠染色，将7.5*10 个细胞与20μl sTCR-YG珠(0.33mg珠/ml)培育30min。随后，用可固着活力染料eFluor780(eBiosciences)对细胞另外染色30'。对于使用20.1或103.2抗CD277抗体(Daniel Olive,Marseille,France友情赠送)的抑制测定，在添加sTCR-YG珠之前，将Daudi细胞与抗体在R.T.预培育15'。通过添加40μl 2％的甲醛，将混合物固定15'。用1％甲醛清洗样品1次，并在BD FACSCanto II(BD)上进行分析。
[0376] γδTCR向突触的富集和缀合物的形成
[0377] 将HEK293FT细胞接种至μ-载玻片聚-L-赖氨酸预涂覆室(Ibidi)以连接过夜。第二天，在37℃用100μM PAM处理细胞1小时。将TEG添加至HEK293FT细胞并在37℃培育30-120分钟。在共培育之后，立即将室置于冰上并用4％PFA固定30分钟。用1％BSA/FCS封闭样品，并用2μg/mL的CD3ε-Alexa Fluor 647(BD Biosciences)在室温下标记2小时，并最终用1％PFA+DAPI固定。用Zeiss LSM-710对样品成像并用Volocity软件(PerkinElmer)分析。为了定量HEK293FT和TEG细胞之间缀合物的数目，我们计算了所采集的每幅图像上CD3ε阳性对象和DAPI阳性对象之间的比例。为了分析γδTCR向免疫学突触的富集，我们计算了63×放大图像上靶标和效应细胞的接触区内部相对于接触区外部的CD3ε信号富集比。
[0378] 超分辨率成像
[0379] 将HEK293FT细胞在8孔Lab-Tek室中铺板以进行连接，并用100uM帕米膦酸处理过夜。对于超分辨率成像，用AF647-CD277在RT标记细胞。标记后，用PBS清洗细胞并用4％PFA和0.2％戊二醛固定1-2h。在超分辨率成像之前，将200μl新鲜SRB(超分辨率缓冲液：50mM Tris，10mM NaCl，10％葡萄糖，168.8U/mL葡萄糖氧化酶，1404U/mL催化酶，10mM半胱胺盐酸盐，pH 8.0)加入至孔中。使用配备有油浸物镜1.45-NA全内反射荧光物镜(U-APO 150×；
Olympus America)的倒置显微镜(IX71；Olympus America)进行dSTORM成像。将637nm二极管激光器(HL63133DG；Thorlabs)用于AF647激发。将四频分色和发射滤光器组(LF405/488/
561/635-A；Semrock)用于样品照射和发射。使用具有585nm分色(Semrock)和另外的发射滤光器(692/40nm和600/37)的定制2-通道分路器，将发射光分离至AndorIxon 897电子倍增电荷耦合器件(EM CCD)照相机(Andor Technologies,South Windsor,CT)的不同象限。将倒置显微镜(IX71；Olympus America,Center Valley,PA)的样品室安装在沿0.2nm xyz-轴具有分辨率的立体压电工作台(Nano-LPS；Mad City Labs,Madison,WI)上。使用定制的平台稳定程序，修正整个成像程序期间的样品漂移。在TIRF中，以57帧/s采集图像，并且对每个图象重构采集10,000-20,000帧。
Olympus America)的倒置显微镜(IX71；Olympus America)进行dSTORM成像。将637nm二极管激光器(HL63133DG；Thorlabs)用于AF647激发。将四频分色和发射滤光器组(LF405/488/
561/635-A；Semrock)用于样品照射和发射。使用具有585nm分色(Semrock)和另外的发射滤光器(692/40nm和600/37)的定制2-通道分路器，将发射光分离至AndorIxon 897电子倍增电荷耦合器件(EM CCD)照相机(Andor Technologies,South Windsor,CT)的不同象限。将倒置显微镜(IX71；Olympus America,Center Valley,PA)的样品室安装在沿0.2nm xyz-轴具有分辨率的立体压电工作台(Nano-LPS；Mad City Labs,Madison,WI)上。使用定制的平台稳定程序，修正整个成像程序期间的样品漂移。在TIRF中，以57帧/s采集图像，并且对每个图象重构采集10,000-20,000帧。
[0380] 超分辨率图象重构和数据分析
[0381] 如前所述，使用定制的MATLAB函数分析和重构图像(Smith等人,2010,Nat Methods；Huang等人,2011,Biomed Opt Express)。对于每一图像帧，基于局部最大强度选择子区域。然后，使用极大似然估计量，将每个子区域对像素化高斯强度分布进行拟合。基于对数似然比和使用每个参数的Cramér–Rao下边界值估计的拟合精度以及强度和背景扣除，排除拟合结果。使用作为局部聚类工具包(http://stmc.health.unm.edu)的一部分的基于密度的DBSCAN算法进行dSTORM CD277聚类数据分析。所选择的参数是ε＝50nm的相邻聚类点之间的最大距离和6个观察值的最小聚类大小。使用在凸壳和包围这些点的最小紧曲面之间的中途产生轮廓的默认方法，使用MATLAB“边界”函数产生聚类边界。然后，将这些边界内的聚类面积转化为当量面积的圆形的半径以便于更直观理解。从图像组选择尺寸为
2μm×2μm的感兴趣区(ROI)，从中对每个ROI收集当量半径的统计量。
2μm×2μm的感兴趣区(ROI)，从中对每个ROI收集当量半径的统计量。
[0382] 实施例11：γ9δ2 T细胞的功能谱
[0383] 为了在更广泛的范围内评价个体γ9δ2TCR对个体γ92δT细胞克隆的功能活性的影响，将γδT细胞克隆通过有限稀释或FACS分选进行分离。通过针对肿瘤细胞系Daudi的IFNy产生，确定了体外抗肿瘤活性。在分离自4个健康供体的γ9δ2 T细胞克隆(N＝57)中观察到明显的抗肿瘤功能异质性，其中当对于IFNy浓度的可靠测量，选择30pg/ml的截至值时，约60％的克隆对肿瘤细胞系Daudi具有反应性(图13A)。二磷酸酯如帕米膦酸(PAM)可以通过由RhoB辅助并且由γ9δ2TCR感知的CD277J的诱导来提高γ9δ2 T细胞的活性。在存在100μM PAM的情况下，所研究的γ9δ2 T细胞克隆的反应性平均提高10倍(范围0.7-37.3；中值8.1)，其中当添加PAM时，>95％的克隆显示出超过阈值的反应性(图13A)。为了评价是仅对Daudi细胞观察到活性谱还是活性谱对其他靶标也有效，将细胞系HEK293FT(其他良好鉴定的γδT细胞靶标)与分离的γδT细胞克隆共培育。在不存在PAM的情况下，HEK293FT细胞系引起了低得多的细胞因子分泌，其中仅约30％的γ9δ2 T细胞克隆分泌高于截止值的
IFNy(图13B)。然而，在存在PAM的情况下，个体克隆的反应性与它们对于Daudi的反应性相当如当对Daudi或者HEK293FT测试相同克隆时，通过IFNγ分泌的强相关性所证明的(史匹曼r＝0.893，p<0.0001(n＝54)，图13B和图13C)。
IFNy(图13B)。然而，在存在PAM的情况下，个体克隆的反应性与它们对于Daudi的反应性相当如当对Daudi或者HEK293FT测试相同克隆时，通过IFNγ分泌的强相关性所证明的(史匹曼r＝0.893，p<0.0001(n＝54)，图13B和图13C)。
[0384] 表4：CDR3克隆
[0385]
[0386]
[0387] 实施例12：γ9δ2 T细胞的克隆频率
[0388] 为了进一步研究γ9δ2TCR在个体γ9δ2 T细胞克隆的体外抗肿瘤活性中的作用，选择57个克隆中的20进行γ9δ2TCR测序，这些克隆覆盖了克隆活性的全部范围如图13A所示。发现几个克隆对(B2和B5、C4和C14、C7和C11)表达相同的TCR，其以总计17个独特的克隆型结束。在个体克隆型中，所有δ链是唯一的，然而就CDR3区序列来说，在γ链中存在一些重叠，这两者存在于个体内和个体间(图14A)。
[0389] 对如用于单细胞分选的相同供体的全部γ9δ2TCR组库进行高通量测序(HTS)。某种克隆型在供体组库内的普及与各个克隆对Daudi或HEK293FT的功能活性不相关如通过供体C的实例所证实的：大部分普遍的克隆C6属于分离自该供体的反应性最强的γ9δ2 T细胞克隆之一，而三个其他普遍的克隆型(C2、C4、C11)显示出处于较低范围内的反应性(图14B)，尽管我们不可以排除如果与其他γ链组合，所显示的δ链显示出较高的活性。反之亦然，来自供体A的活性非常强的γ9δ2 T细胞克隆在原始供体中不普遍。因此，克隆频率与个体γ9δ2 T细胞的功能活性不相关。
[0390] 实施例13：亲代γ9δ2 T细胞的功能活性
[0391] 合成了测序的γ和δTCR基因选择，将其克隆至反转录病毒pBullet载体中并在原代αβT细胞中表达，从而使得能够在不存在其他γδT细胞共受体的情况下进行个体γδTCR的分析。首先，评价CDR3区内的变化是否影响TCR的表面表达。如图14C所显示的，所有所产生的TEG表达类似水平的γδTCR如通过TCR克隆A1至A6和在克隆13(Cl13)、G115、克隆3(Cl3)和克隆5(Cl5)中举例说明的。如图14D中所示，可以在工程设计具有弱TCR如人工设计的CTE-Cl3和强TCR如CTE-Cl5的TEG之间观察到活性的显著差异。类似地，来自天然组库的γ9δ2TCR在它们诱导TEG形式的IFNγ分泌的能力方面显著不同。然而，功能活性与亲代克隆的功能活性不相关如通过其TEG形式的TCR激活较差的高反应性克隆A4、A5和Cl13所显示的(图14D)，其表明其他因素如其他共受体或表观遗传调控有助于γ9δ2 T细胞克隆的功能反应。
[0392] 实施例14：γ9δ2TCR靶标的相互作用
[0393] 工程设计了包含γδTCR克隆5的γ9和δ2TCR链的四聚体和葡聚糖体(dextramer)以及无功能长度突变体LM1。与γ9δ2TCR与其用于感知CD277J构型的配体的低亲合力相互作用一致，γ9δ2TCR四聚体和葡聚糖体均不结合至经典的靶标Daudi(图15A和图15B)。然后，提高多聚体上γδTCR的数目以达到更高的相互作用亲和性。将无功能长度突变体LM1的胞外域以及调节TEG形式的低和高功能亲和性的γδTCR CTE-Cl3和CTE-Cl5偶联至抗生蛋白链菌素缀合的黄-绿荧光珠(在本文中称为YG珠)，其允许至少104个γδTCR连接至YG珠的表面。将表达γ9δ2TCR的YG珠用于对已知的阴性靶细胞系ML1和阳性靶细胞系Daudi染色。在任何TCR涂覆珠的情况下，未观察到YG珠与ML1细胞的缀合(图19A-图19D)，而YG珠与
Daudi细胞的缀合量取决于用于涂覆所述珠的TCR(图15C和图20)。无功能的γ9δ2TCR(LM1)显示出与Daudi细胞较少的缀合，这几乎与低功能亲和性的(TEG形式的)TCR CTE-Cl3一样。
高功能亲和性γ9δ2TCR(CTE-Cl5)显示出显著更高的与Daudi细胞的缀合，其表明γ9δ2TCR的功能亲和性的确与γ9δ2TCR-配体亲合力有关。与γδTCR克隆5缀合的珠显示出与CTE-CL5珠相同的染色模式(图19D)。有趣地，YG珠的确仅结合至一小部分的肿瘤细胞(图20)，这很可能反映了珠：细胞比的技术限制，而不是靶标群体本身内配体的不均一性。γ9δ2TCR感知CD277J构型。
Daudi细胞的缀合量取决于用于涂覆所述珠的TCR(图15C和图20)。无功能的γ9δ2TCR(LM1)显示出与Daudi细胞较少的缀合，这几乎与低功能亲和性的(TEG形式的)TCR CTE-Cl3一样。
高功能亲和性γ9δ2TCR(CTE-Cl5)显示出显著更高的与Daudi细胞的缀合，其表明γ9δ2TCR的功能亲和性的确与γ9δ2TCR-配体亲合力有关。与γδTCR克隆5缀合的珠显示出与CTE-CL5珠相同的染色模式(图19D)。有趣地，YG珠的确仅结合至一小部分的肿瘤细胞(图20)，这很可能反映了珠：细胞比的技术限制，而不是靶标群体本身内配体的不均一性。γ9δ2TCR感知CD277J构型。
[0394] CTE-Cl5 YG珠与Daudi细胞的结合使得能够评价CD277J是否直接与γ9δ2TCR相互作用。在存在两种常用的抗CD277的单克隆抗体，即20.1和103.2的情况下，将CTE-Cl5 YG珠与Daudi细胞共培育。通过两种单克隆抗体抑制CTE-Cl5 YG珠与Daudi的缀合，其表明CD277与Vγ9Vδ2 TCR直接相互作用(图15D)。还确定了静态YG珠是否也可以感知通过PAM诱导的CD277J。添加PAM不改变TCR-YG珠与Daudi细胞的缀合强度(图15C)，其表明静态TCR-YG珠可以捕获γ9δ2TCR与CD277的不同亲合力，而不是完全模拟细胞膜内表达的γ9δ2TCR的作用模式。
[0395] 实施例15：γ9δ2TCR与其对应物的动态相互作用
[0396] 为了进一步评价当以TEG形式表达时，γ9δ2TCR不同的功能亲和性是否受它们介导TEG与肿瘤细胞靶标结合的能力的调控，使用了更动态的模型。因此，将表达相当水平的多种γδTCR的Jurma细胞与HEK293FT肿瘤细胞共培育。贴壁HEK293FT细胞的使用使得能够通过清洗排除在培育后120分钟内不结合肿瘤细胞的TEG，然后使用DAPI和抗CD3抗体染色。评价肿瘤细胞-T细胞缀合物的数目。与YG珠染色相反，不仅缀合物形成与在不存在PAM的情况下所使用的γ9δ2TCR的亲合力有关，而且PAM处理还提高了缀合物的数目，具体地，就低亲合力γ9δ2TCR来说以及意外地还就无功能突变体LM1来说(图16)。该发现表明不同的γ9δ2TCR与肿瘤细胞上表达的限定的蛋白的物理结合有利于表达γ9δ2TCR的T细胞和肿瘤细胞之间连续缀合物的形成。然而，所述缀合物的形成可以独立于γ9δ2TCR的CDR3区。因此，PAM可以引起γ9δ2TCR依赖的，但是不依赖于CDR3的缀合物形成，然而，这不足以完全激活T细胞。必需包括其他步骤来诱导完全T细胞激活。
[0397] 据报道表达γ9δ2TCR的T细胞的激活作用所必需的其他步骤可以是肿瘤细胞细胞膜处的CD277J构型。为了研究CD277J是否还与T细胞侧γ9δ2TCR的团簇的提高有关以及该过程是否取决于γ9δ2TCR的CDR3区，在不同γδTCR亲合力的背景中分析了质膜中的空间变化。确定了工程设计以表达无功能TCR LM1、低亲合力CTE-Cl3和高亲合力CTE-Cl5的Jurma T细胞之间形成的晚期免疫学突触的共聚焦成像。图17A和图17B显示了相对于远离免疫学突触的T细胞膜区，肿瘤靶标和T细胞之间的接触区中积累的γδTCR的量。当对于PAM未处理的肿瘤细胞(低磷酸抗原水平)，与CTE-Cl3和LM1 TCR相比时，对于CTE-Cl5，γδTCR的突触富集显著更高(图17B)。尽管表达非活性TCR LM1的T细胞显示出显著的肿瘤细胞结合(图16)，但是即使在用PAM预处理肿瘤细胞时的高磷酸抗原水平，LM1 TCR不招募至免疫学突触(图17B)。PAM预处理也不会影响高亲合力CTE-Cl5 TCR向免疫突触的招募。然而，它使得低亲合力CTE-Cl3 TCR在突触中的积累显著增加，从而表明γ9δ2TCR的CDR3区对肿瘤细胞和T细胞之间紧密附近处的产生无影响，而它有助于支持具有较低亲合力的γ9δ2TCR向突触的招募。该发现表明γ9δ2TCR的亲合力决定了其向免疫学突触的招募，并且可以通过PAM进一步提高完整突触的形成。
[0398] 最终，为了理解突触中低亲合力CTE-Cl3 TCR的招募的提高是否是由于PAM处理所造成的CD277团簇的变化所导致的，实施了提供～20nm分辨率的基于定位的超分辨率成像技术，直接随机光学重建显微法(dSTORM)。用AF647-CD277抗体标记BTN3A分子，并且在HEK293FT细胞的基膜处采集超分辨率图像。为了定量图像，使用了基于密度的空间群聚应用(DBSCAN)。基于它们的相对局部空间密度，DBSCAN将定位分类为聚类。识别单个聚类，并在不同条件之间的聚类分布之间进行比较。用PAM处理不会显著改变定位聚类的大小、密度或数目(图17C，图17D，图17E和图17F)。当使用Getis-G或层次聚类分析法时，结果类似。将相邻聚类点之间的最大距离选择为ε＝30、40或50nm提供了类似的BTN3A纳米-聚类结果。
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