治疗性肽治疗和预防癌症的用途
阅读：574发布：2020-05-14
专利汇可以提供治疗性肽治疗和预防癌症的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且MUCl(DF3、CD227、上皮唾液蛋白、PEM)是＞300kDa的重度O-糖基化的异二聚体 蛋白质 ，通常大量表达于腺上皮的顶端表面。全身 给药 后，MUCl模拟肽选择性地保留在乳腺 肿瘤 、结肠和 皮肤 中。而且，MUCl模拟肽减少肿瘤的开始。此外，MUCl模拟肽能与其它抗-EGFR 治疗 结合用于辅助的情况中，即手术后。，下面是治疗性肽治疗和预防癌症的用途专利的具体信息内容。
1.治疗具有鉴定的高癌症危险的人的方法，包括：
将具有A-B-C或C-B-A结构的融合肽给予具有鉴定的高癌症危险的人，借此癌症开始的概率被减小，
其中A是增强附着的大分子跨细胞膜转运的蛋白转导结构域；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ IDNO：1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或其中所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
2.权利要求1所述的方法，其中所述鉴定的高危险归咎于遗传素因。
3.权利要求1所述的方法，其中所述鉴定的高危险归咎于环境暴露。
4.权利要求1所述的方法，其中所述鉴定的高危险归咎于职业暴露。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的人具有归咎于乳腺癌遗传素因的高危险。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的人具有归咎于结肠癌遗传素因的高危险。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的人具有归咎于皮肤癌遗传素因的高危险。
8.权利要求1所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的一个至三个之间被保守地替换。
9.权利要求1所述的方法，其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：
2)。
10.权利要求1所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸。
11.权利要求1所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
12.治疗切除肿瘤的人的方法，包括：
将具有A-B-C或C-B-A结构的融合肽和EGFR抑制剂给予切除肿瘤的人，借此所述肿瘤复发或转移的概率被减小，
其中A是增强附着的大分子跨细胞膜转运的蛋白转导结构域；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ IDNO：1)的全部或部分；其中C的部分包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或其中所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
13.权利要求12所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的一个至三个之间被保守地替换。
14.权利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是帕尼单抗。
15.权利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗。
16.权利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是吉非替尼。
17.权利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是埃罗替尼。
18.权利要求12所述的方法，其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：
2)。
19.权利要求12所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸。
20.权利要求12所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
21.治疗具有结肠癌或皮肤癌的患者的方法，包括：
将具有A-B-C或C-B-A结构的融合肽给予结肠癌或皮肤癌患者，借此所述癌症的侵袭力被减小或延缓，
其中A是增强附着的大分子跨过细胞膜转运的蛋白转导结构域；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ IDNO：1)的全部或部分，并且其中C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或其中所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
22.权利要求21所述的方法，其中所述患者患有结肠癌。
23.权利要求21所述的方法，其中所述患者患有皮肤癌。
24.权利要求21所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的一个至三个之间被保守地替换。
25.权利要求21所述的方法，其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：
2)。
26.权利要求21所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸。
27.权利要求21所述的方法，其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
治疗性肽治疗和预防癌症的用途
[0002] 发明的技术领域
[0003] 本发明涉及癌症治疗法和预防法领域。特别地，本发明涉及抑制、延缓和减低癌症开始、生长和侵袭的危险的方法。
[0004] 发明背景
[0005] MUCl(DF3、CD227、上皮唾液蛋白、PEM)是＞300kDa的重度O-糖基化异二聚体蛋白质，通常大量表达于腺上皮的顶端表面。在大于90％的人乳腺癌和转移中，顶点的定位消失，MUCl过表达(大于10倍)并糖基化不足(underglycosylated)(1、2)。除了在白血病、骨髓瘤和淋巴瘤中高表达，MUCl的失调表达被发现在许多其它类型的腺癌以及癌症中，包括肺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌(3-5)。在遗传小鼠模型和细胞系模型中的研究都已证明MUCl是癌基因。迫使MUCl(人类)在小鼠乳腺过表达的转基因小鼠模型(MMTV-MUCl)导致乳腺癌的发展并伴随乳腺通过凋亡进行完全的哺乳后复原的失败(6)。将MUCl转染到3Y1成纤维细胞引起它们的转化，将MUCl转染到结肠癌细胞表明MUCl过表达抑制药物诱导的凋亡(7)。
[0006] MUCl的胞质域含有多种蛋白质相互作用位点，尽管这些相互作用在正常乳腺的极化上皮细胞中大量地未成形，因为MUCl的结合配偶体被典型地发现在基底外侧膜上((8)和(9、10)中评论的)。在癌症的演进过程中，当细胞极化丧失时，MUCl过表达并与src、GSK3β、表皮生长因子受体(EGFR)和β-联蛋白等功能性相互作用(9、11、12)。MUCl和这些蛋白之间相互作用的位点已被作图以获得MUCl的72个氨基酸胞浆尾内的独特结构域(11、13-15)。EGFR和src能在YEKV基序上磷酸化MUCl，并且这种磷酸化导致通过SAGNGGSSLS结构域MUCl与β-联蛋白的结合增加(11)。最近的证据表明MUCl与EGFR之间的相互作用能显著地调节EGFR生物学并影响EGFR依赖的转化{Pochampalli，2007#537；Pochampalli，2007#527}。
[0007] 酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族在癌症中经常失调，并通常在侵袭性癌中被扩增和/或过表达[(16)所评述的]。该家族由4个同源的1型酪氨酸激酶受体(包括EGFR、her2/neu/erbB2、erbB3和erbB4)和多个相关的配体[包括表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)等]构成。配体诱导的受体同源或异源二聚化导致酪氨酸激酶活化和胞质域中的酪氨酸残基的转磷酸作用。这引起许多种效应物蛋白——包括Src、PI 3-激酶、Shc、PLCγ、STATs、Grb2和cbl——的募集，导致增殖、迁移、凋亡的抑制、分化或内吞受体的降解(17-20)。
[0008] 在过表达MUCl的人乳腺癌细胞系和转基因小鼠(MMTV-MUCl)中已经确定，MUCl和EGFR生物化学地相互作用，从而导致在哺乳过程中EGF依赖的p42/44ERK活化的增强(11、21)。最近，我们的实验室已证明MUCl表达抑制EGFR的配体介导的泛素化和降解同时增强其内化和再循环(Pochampalli et al 2007)。为了评价Mucl在转化中的作用，我们进一步在Mucl无效的背景上产生了WAP-TGFα小鼠，其揭示了Mucl表达对乳腺的TGFα依赖的转化、促进开始和进展具有主导的影响(Pochampalli et al 2007b)。
[0009] 尽管现在已确定EGFR被MUCl表达有效地调节，在EGFR和MUCl信号传导中，转基因小鼠模型也已牵涉细胞粘着蛋白β-联蛋白。在WAP-TGFα转基因模型的研究中，Wnt1和Wnt3被发现在大多数侵袭性乳腺肿瘤中被选择性地活化(22)。Wnt是分泌的糖蛋白，它结合跨膜卷曲受体，导致信号级联放大，这使β-联蛋白降解的机制失活并导致转化(23-28)。此外，在MMTV-Wnt1转基因小鼠中，EGFR被发现以肿瘤特异性方式与β-联蛋白相互作用并将之磷酸化(Schroeder et al 2002)。这些研究证明β-联蛋白和EGFR能影响它们各自的通路来促进转化。最后，MUCl在β-联蛋白依赖的转化中也被牵涉，表明这三种蛋白具有协同促进癌症进展的能力。在杂交到Mucl无效背景上的MMTV-Wnt-1转基因小鼠中，Mucl的丢失对应肿瘤进展的显著减少(Schroeder et al，2003)。此外，MUCl和β-联蛋白之间的相互作用被发现在来自人转移性乳腺肿瘤的样品中高度地增加，表明这些相互作用是临床上相关的(Schroeder et al，2003)。
[0010] 这些研究共同证明MUCl、EGFR和β-联蛋白在转化过程中相互影响的强大潜力，包括在转化和转移过程中它们显著的共同上调。MUCl能抑制EGFR的下调并促进EGFR和β-联蛋白的转化能力，并且遗传上衍生的小鼠模型在EGFR和β-联蛋白依赖的转化和转移中牵涉MUCl。有趣的是，MUCl上EGFR和β-联蛋白的相互作用位点串联地位于MUCl胞质域上。
[0011] 对于发展在预防和治疗癌症中有效的治疗，本领域存在持续的需求。发明概要
[0012] 根据一方面，具有A-B-C或C-B-A结构的融合肽被给予具有鉴定的高癌症危险的人。癌症开始的概率因此被减小。A是增强附着的大分子跨细胞膜转运的蛋白转导结构域。B是0-5个氨基酸残基的间隔区。C是6-15个氨基酸残基的多肽。C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分。C的部分包含GGSSLS(SEQ IDNO：2)。可选地，所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
[0013] 根据另一个方面，具有A-B-C或C-B-A结构的融合肽和EGFR抑制剂被给予已切除肿瘤的人。肿瘤复发或转移的概率因此被减小。A是增强附着的大分子跨细胞膜转运的蛋白转导结构域。B是0-5个氨基酸残基的间隔区。C是6-15个氨基酸残基的多肽。C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分。C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：2)。可选地，所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
[0014] 根据另一个方面，具有A-B-C或C-B-A结构的融合肽被给予结肠或皮肤癌患者。癌症的侵袭力或生长因此被减小或延缓。A是增强附着的大分子跨细胞膜转运的蛋白转导结构域。B是0-5个氨基酸残基的间隔区。C是6-15个氨基酸残基的多肽。C包含
PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分。C的部分包含GGSSLS(SEQID NO：2)。可选地，所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分。C的部分包含GGSSLS(SEQID NO：2)。可选地，所述6-15个氨基酸残基的至少一个被保守地替换，这样无电荷极性氨基酸置换无电荷极性氨基酸，或非极性氨基酸置换非极性氨基酸残基，或酸性氨基酸置换酸性氨基酸，或其中所述6-15个氨基酸残基的一个用A残基替换。
[0017] 图1A-1F。MUCl模拟肽(PMIP)能有效地进入细胞，促进EGFR降解并抑制MUCl和β-联蛋白的相互作用。图1A)人MUCl的胞质氨基酸序列(MUClCT；SEQ ID NO：15)，其包含EGFR/src磷酸化位点(下划线：SEQ ID NO：15，残基46-49)和β-联蛋白结合位点(双下划线：SEQ ID NO：15，残基50-59)。PTD4蛋白转导结构域(SEQ IDNO：16)允许细胞摄取PMIP模拟肽(人PMIP(hPMIP；SEQ ID NO：17)和小鼠PMIP(msPMIP；SEQ ID NO：18)。绿盒子突出MUCl模拟的氨基酸序列。图1B)用10μM生物素-hPMIP处理BT-20乳腺癌细胞4小时显示hPMIP有效的细胞摄取和保留(绿色＝生物素-PMIP，蓝色＝DAPI(细胞核)，400×和630×)。图1C)BT-20乳腺癌细胞用hPMIP(10μM)或PTD4(10μM)处理18小时。细胞用EGF(30′EGF，10ng/ml)处理或不处理(-S，无血清)，产生蛋白裂解物并在SDS-PAGE上分离。对裂解物就EGFR(1005)和β-肌动蛋白(AC-15)进行免疫印迹(IB)。图1D-F MDA-MB-468细胞用EGF(10ng/ml)以及或者(图1D)hPMIP(10μM)、(图1E)PTD4(10μM)或者(图1F)PBS处理过夜。细胞被固定，探测MUCl(Texas Red)和β-联蛋白(FITC)，并在共聚焦显微镜上检查(400×)。使用Image Pro Plus进行共定位(箭头)分析，并用白色像素指定。
[0018] 图2A-2C。PMIP抑制体外乳腺癌细胞的细胞增殖和侵袭。图2A)BT20细胞在964
孔盘中(10 细胞/孔)培养并用在RPMI 1640/1％FBS中的hPMIP(10μM)或PTD4(10μM)***
每天处理，持续6天。处理完成之后，进行MTT测定法来定量细胞数( ，p＜0.0001)。误差条代表标准误差。图2B)MDA-MB-231和图2C)BT20细胞系用hPMIP(50μM)、PTD4(50μM)或PBS处理过夜，用Calcein AM标记，允许通过Transwell(8.0μM)插入物侵入到I型胶* **
原凝胶，被侵入的细胞通过荧光测量。(ANOVA，p＜0.0001，p＜0.0001，#p＝0.007，##p＝0.007)。误差条代表标准偏差。
孔盘中(10 细胞/孔)培养并用在RPMI 1640/1％FBS中的hPMIP(10μM)或PTD4(10μM)***
每天处理，持续6天。处理完成之后，进行MTT测定法来定量细胞数( ，p＜0.0001)。误差条代表标准误差。图2B)MDA-MB-231和图2C)BT20细胞系用hPMIP(50μM)、PTD4(50μM)或PBS处理过夜，用Calcein AM标记，允许通过Transwell(8.0μM)插入物侵入到I型胶* **
原凝胶，被侵入的细胞通过荧光测量。(ANOVA，p＜0.0001，p＜0.0001，#p＝0.007，##p＝0.007)。误差条代表标准偏差。
[0019] 图3A-3E。PMIP显著地抑制体内肿瘤生长和复发。图3A)基质胶(Matrigel)中3
的MDA-MB-231细胞被注射进scid小鼠的乳腺脂肪垫中，当肿瘤达到100mm 时，每天的肽治疗(hPMIP或PTD4，50μg/g体重)开始(PTD4和hPMIP n＝8)，并且评价原发肿瘤生长* 3 **
(，p＝0.028)。图3B)治疗结束之后，测量肿瘤发展到1000mm 需要的时间量(ANOVA，，p＝0.03)。图3C切除之后，观察小鼠在原发位点或继发乳腺的肿瘤再生长(PTD4n＝8和hPMIP n＝7)。图3D)基质胶中的MDA-MB-231细胞被注射进scid小鼠的乳腺脂肪垫中，
3
当肿瘤达到500mm 时，每天的肽治疗(hPMIP或PTD4，50μg/g)开始(PTD4n＝4和hPMIP *
n＝6)，并且评价原发肿瘤生长(，p＝0.028)。图3E)治疗21天之后肿瘤被立即切除，监测在原发位点的肿瘤再生长和传播到继发乳腺(PTD4n＝4和hPMIP n＝4)。误差条代表标准误差。
的MDA-MB-231细胞被注射进scid小鼠的乳腺脂肪垫中，当肿瘤达到100mm 时，每天的肽治疗(hPMIP或PTD4，50μg/g体重)开始(PTD4和hPMIP n＝8)，并且评价原发肿瘤生长* 3 **
(，p＝0.028)。图3B)治疗结束之后，测量肿瘤发展到1000mm 需要的时间量(ANOVA，，p＝0.03)。图3C切除之后，观察小鼠在原发位点或继发乳腺的肿瘤再生长(PTD4n＝8和hPMIP n＝7)。图3D)基质胶中的MDA-MB-231细胞被注射进scid小鼠的乳腺脂肪垫中，
3
当肿瘤达到500mm 时，每天的肽治疗(hPMIP或PTD4，50μg/g)开始(PTD4n＝4和hPMIP *
n＝6)，并且评价原发肿瘤生长(，p＝0.028)。图3E)治疗21天之后肿瘤被立即切除，监测在原发位点的肿瘤再生长和传播到继发乳腺(PTD4n＝4和hPMIP n＝4)。误差条代表标准误差。
[0020] 图4A-4D。PMIP显著地减慢MMTV-pyV mT诱导的乳腺肿瘤的进展。图4A)MMTV-pyV mT转基因小鼠被注射以FITC-msPMIP(50μg/g体重)，四小时之后被处死，使用荧光显微镜显现各种组织。FITC-msPMIP在小鼠乳腺肿瘤中的定位被显示(2.5×和8×)。图4B)允许乳腺肿瘤(直径＞0.5cm)发展，小鼠每天注射msPMIP(7只小鼠)或PTD4(6只小鼠)(50μg/g体重，21天治疗，腹膜内(i.p.)注射，1×每天)。在治疗结束时，动物被处死，肿瘤制成的蛋白裂解物用于后来的分析。在治疗期间，msPMIP处理小鼠所有肿瘤位点(msPMIP n＝70，PTD4n＝60)的肿瘤总生长显著低于PTD4小鼠(193.8％±77.7％对589.5％*
±283.6％，ANOVA p＝0.039)。图4C)msPMIP处理小鼠的乳腺肿瘤以较PTD4处理肿瘤显著低的速率生长(ANOVA p＝0.0076)。图4D)msPMIP或PTD4处理转基因小鼠的肿瘤大小分布显示，与27％(70个可能肿瘤位点中的19个)的msPMIP处理肿瘤相比，47％(60个可
3
能肿瘤位点中的28个)的PTD4处理肿瘤大于100mm。上面数据的数目是满足超过总潜在肿瘤位点的大小标准的肿瘤数目。
±283.6％，ANOVA p＝0.039)。图4C)msPMIP处理小鼠的乳腺肿瘤以较PTD4处理肿瘤显著低的速率生长(ANOVA p＝0.0076)。图4D)msPMIP或PTD4处理转基因小鼠的肿瘤大小分布显示，与27％(70个可能肿瘤位点中的19个)的msPMIP处理肿瘤相比，47％(60个可
3
能肿瘤位点中的28个)的PTD4处理肿瘤大于100mm。上面数据的数目是满足超过总潜在肿瘤位点的大小标准的肿瘤数目。
[0021] 图5A-5B。MMTV-pyV mT肿瘤对msPMIP具有差示反应。图5A)来自图3中描述的动物的每个肿瘤位点的单独的生长(每一条是来自一只小鼠的乳腺脂肪垫/肿瘤位点)每天用msPMIP(深灰色)或PTD4(浅灰色)以50μg/g体重处理，持续21天。在21天的治疗过程中，每3天观察肿瘤进展(PTD4，n＝60，PMIP，n＝70)。在4个实例中(*)，msPMIP处理肿瘤完全消退，然而对照(PTD4)处理肿瘤没有一个消退。MFP＝乳腺脂肪垫。图5B)来自msPMIP(1，左2图)和PTD4(2，右2图)处理小鼠的肿瘤被切除(3μm)，接下来被用于苏木素-伊红染色和分裂的caspase-3免疫组织化学术(200×)。
[0022] 图6A-6B。PMIP与减少的Mucl表达相关联。图6A)代表性的MMTV-pyVmTmsPMIP(P)处理小鼠和PTD4小鼠(C)在处死前30分钟每只被注射表皮生长因子
(1μg/g体重)和肽。处死之后，肿瘤被收集，产生蛋白裂解物。对于磷酸酪氨酸(PY99)、EGFR(1005)、Mucl(CT2)和β-肌动蛋白(AC-15)的表达，蛋白(50μg)通过SDS-PAGE分离、转移和免疫印迹。图6B)来自MDA-MD-231异种移植物肿瘤(未用EGF处理；图2中描述的)的裂解物被相似地分析以确定EGFR和MUCl蛋白表达的水平。Mucl的相对蛋白水平*
通过光密度测定法测量并绘图(Mucl/β-肌动蛋白，ANOVA，p＝0.014)。分子量被显示在右侧。IB＝免疫印迹。通过印迹的白线表示相同的凝胶和暴露，但是不连续的。
(1μg/g体重)和肽。处死之后，肿瘤被收集，产生蛋白裂解物。对于磷酸酪氨酸(PY99)、EGFR(1005)、Mucl(CT2)和β-肌动蛋白(AC-15)的表达，蛋白(50μg)通过SDS-PAGE分离、转移和免疫印迹。图6B)来自MDA-MD-231异种移植物肿瘤(未用EGF处理；图2中描述的)的裂解物被相似地分析以确定EGFR和MUCl蛋白表达的水平。Mucl的相对蛋白水平*
通过光密度测定法测量并绘图(Mucl/β-肌动蛋白，ANOVA，p＝0.014)。分子量被显示在右侧。IB＝免疫印迹。通过印迹的白线表示相同的凝胶和暴露，但是不连续的。
[0023] 发明详述
[0024] 支持本发明的发现是MUCl模拟肽在系统给药后选择性地保留在乳腺肿瘤、结肠和皮肤中。而且，MUCl模拟肽减少肿瘤开始。此外，MUCl模拟肽能与其它抗EGFR治疗结合用于在辅助的环境中，即手术后。
[0025] 任何蛋白转导结构域(PTD)能被用在融合蛋白中。这些包括先前已被鉴定并用于蛋白转导的任何结构域。参见例如Dietz and Bahr，Molecular and Cellular Neuroscience，27(2004)85-131的广泛表1，该文献被清楚地并入本文。某些这样的结构域被显示在SEQ ID NO：3、4、5和6中，但是熟练的技术人员不受限于这些使用。可以使用包括合成的PTDs在内的其它PTDs。这些结构域促进细胞摄取附着肽。
[0026] 融合蛋白中使用的间隔区是附加的氨基酸残基，它们被用在融合蛋白中典型地促进制造或合成。这些可以是相当无害的，并典型地是0至5个残基长度。连接体可以是单一的或混合的残基。残基可以是随机的或从其它蛋白获得的序列或为特定的性质而设计，例如物理的、化学的或生物的性质。
[0027] MUCl胞质域肽诸如SEQ ID NO：14增加乳腺癌细胞的侵袭。Schroeder，2003。令人惊奇的地，这样的肽的较短部分实际上具有相反的作用。这些肽包括选自SEQ IDNO：1的6至15个连续的氨基酸残基并包括SEQ IDNO：2显示的氨基酸序列。来自精确序列的微小差异可被用于优化活性，诸如通过一个、两个或三个残基的替换来进行保守改变或通过用丙氨酸替换。保守改变互相替换相似的残基，诸如无电荷极性的替换无电荷极性的、或非极性的替换非极性的、或酸性的替换酸性的残基。因此G或S残基能用G、S、T、C、Y、N和Q替换。L残基能用A、V、I、P、F、W和M替换。A、V和P残基能用A、V、L、I、P、F、W和M残基替换。Y或N残基能用G、S、T、C、Y、N和Q残基替换。E残基能用D残基替换。K残基能用R或H残基替换。任何残基能用丙氨酸残基替换，除非这样的替换被发现破坏侵袭和转移抑制活性。这样替换的肽能被容易地测试，例如使用侵袭测定法、肿瘤生长测定法、肿瘤开始测定法等。
[0028] 癌细胞，体外或体内，能与本发明的融合肽接触或供给本发明的融合肽。它们能够作为肽被直接提供，或它们能够通过提供给细胞在细胞中表达并产生融合肽的核酸载体而被内源性地产生。对于体内给予，能使用任何本领域已知的递送技术，包括但并不限于直接的肿瘤内注射、肌肉内注射、血管内注射、皮下注射、腹膜内注射等。体外递送能，例如，简单地通过向培养基补给融合肽而完成。
[0029] 可被治疗的癌症和癌细胞包括乳腺、皮肤、结肠、卵巢、前列腺、子宫颈、结肠直肠、肺、脑、头和颈、胰腺、肾脏和肝脏癌症和癌细胞。给予后观察的作用是开始、生长、侵袭和转移的减少的程度或延缓的速度。测量这些过程的合适的测定法在实施例中被描述。本领域已知的其它测定法同样能被使用。
[0030] 融合肽能被配制或修饰，如本领域已知的。这可包括共价修饰，诸如加帽、PEG化或与胶束或脂质体结合。这样的修饰和配制可增加在身体内的稳定性，因此允许较高百分比的输入剂量到达靶癌症。融合蛋白还能与其它的治疗结合使用，包括但并不限于EGFR抑制剂。治疗可被同时或连续地给予。治疗癌症的其它合适的治疗包括化学治疗药给药或输注、抗肿瘤抗体、抗受体抗体、辐照治疗、放射性标记的药物和手术。以不同方式起作用的两种形式的使用可向患者提供增加的益处。合适的EGFR抑制剂可以是抗体或激酶抑制剂，诸如帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗、吉非替尼和厄洛替尼。
[0031] 对MUCl与β-联蛋白结合的相似抑制作用能通过将抗体递送到细胞或癌症患者而被获得。抗体可以是任何类型，单克隆的或多克隆的、单链或多链抗体。抗体可以在宿主哺乳动物中、在细胞培养物中或在重组的细胞中制备。抗体结合SEQ ID NO：1中含有的表位。使用根据SEQ ID NO：1的肽作为免疫原，例如，或使用根据发明的融合蛋白作为免疫原或使用其它融合蛋白作为免疫原，能产生抗体。
[0032] 递送编码本发明融合蛋白的核酸的载体可以是任何本领域已知的载体。腺病毒载体和腺相关载体是已知的和广泛使用的。非病毒载体也能被使用，诸如纳米颗粒、脂质体和胶束。在一些实施方式中可以使用逆转录病毒载体。本领域的技术人员能选择适合其目的的载体。相似地，为了培养物中重组制造本发明的融合蛋白，本领域的技术人员能选择载体和宿主细胞系统。
[0033] 被鉴定为具有与癌症相关的遗传基因的人处于增加的发展癌症的危险中。这样的人能被治疗以减小他们癌症开始的危险。相似地，那些已被暴露于环境危险——诸如原子弹放射性尘埃、核燃料废物和其它的污染物——中的人，处于增加的发展癌症的危险中。可被突变的基因和它们引起的常染色体显性疾病包括但并不限于BRCA1：乳腺癌，BRCA2：
乳腺癌，APC：结肠癌HNPCC：结肠癌，CDKN2：黑色素瘤。其它的常染色体显性遗传癌症危险包括基底细胞痣综合征、神经纤维瘤病2型、卡奈综合征、骨软骨瘤病、多发的、脊索瘤、家族的、副神经节瘤、家族的、考登综合征、普-杰二氏综合征、具有胼胝形成的食管癌、前列腺癌、胃癌、家族的、肾癌、家族的、李弗劳明综合征、视网膜母细胞瘤、多发性内分泌瘤病1型、结节性硬化症、多发性内分泌瘤病2型、希-林二氏病、神经纤维瘤病1型和肾母细胞瘤。易患癌症的常染色体隐性疾病包括运动失调性毛细血管扩张症、Bloom综合征着色性干皮病、维纳综合征和Fanconi′s贫血。
乳腺癌，APC：结肠癌HNPCC：结肠癌，CDKN2：黑色素瘤。其它的常染色体显性遗传癌症危险包括基底细胞痣综合征、神经纤维瘤病2型、卡奈综合征、骨软骨瘤病、多发的、脊索瘤、家族的、副神经节瘤、家族的、考登综合征、普-杰二氏综合征、具有胼胝形成的食管癌、前列腺癌、胃癌、家族的、肾癌、家族的、李弗劳明综合征、视网膜母细胞瘤、多发性内分泌瘤病1型、结节性硬化症、多发性内分泌瘤病2型、希-林二氏病、神经纤维瘤病1型和肾母细胞瘤。易患癌症的常染色体隐性疾病包括运动失调性毛细血管扩张症、Bloom综合征着色性干皮病、维纳综合征和Fanconi′s贫血。
[0034] 与蛋白转导结构域(PTD)连接的MUCl模拟肽(MIP)能自由地进入转化的细胞并抑制它们的体外侵袭。这些相同的肽能抑制原发的肿瘤生长、肿瘤传播和切除后肿瘤的复发，例如，在同位植入的乳腺癌模型中。PMIP模拟肽，诸如SEQ ID NO：17和18，能以组织特异性保留在循环中幸存并没有可检测到的毒性。重要地是，PMIP能显著地抑制肿瘤生长，例如，在模拟人乳腺癌的自发小鼠模型中。在机制上，这种肿瘤抑制作用与EGFR和MUCl表达的降低密切相关。这些数据共同证明，这些基于肽的细胞内药物显示作为癌症非毒性治疗的强效性。
[0035] 人MUCl在小鼠乳腺中的过表达促进转化，在多个转基因模型中MUCl的丧失能显著地延迟肿瘤开始(6、10、12)。这可归因于致癌性配偶体MUCl的数目已被证明与，即β-联蛋白、src和EGFR相互作用[(8)中评论的]。这个模拟肽被设计以阻断MUCl、β-联蛋白和EGFR之间的相互作用，并且我们已证明PMIP处理确实阻断MUCl与这些蛋白之间的相互作用。此外，我们观察到在某些情况下对PMIP处理的反应是MUCl表达丧失，这可能是EGFR下调的结果。吸引人的是推测在PMIP存在时，MUCl和EGFR被可选地运输(trafficked)并进入溶酶体降解途径，导致它们增强的降解。在CMV启动子下过表达MUCl的MDA-MB-231细胞在培养物中只3小时的PMIP处理诱导MUCl过表达的丧失，表明这种作用不是转录调节的(未显示数据)。
[0036] 一个重要的观察结果是与PMIP处理相关的毒性的缺乏(没有重量减轻、痛苦的迹象或器官衰竭)。尽管这不是使用内源肽的意外不到的结果，但它指出在患者中潜在的低水平的毒性。我们还检查了PMIP在免疫缺陷的MMTV-pyV mT转基因动物中已激活免疫反应的概率。使用作为标记物的CD45的蛋白水平检查白细胞浸润，我们发现与对照比较，在那些用PMIP处理的肿瘤中没有增加((37)；未显示数据)。此外，通过分组调查蛋白转导结构域潜在辅助活性的研究已发现TAT蛋白转导结构域不是免疫原性的(38)。
[0037] 我们最近已证明MUCl抑制配体依赖的EGFR降解，导致增强的受体稳定性(9)。此外，我们已证明这种相互作用促进EGFR的致癌性质(10)。这些实验中使用的小鼠模型先前也都没有显示是依赖EGFR进展的，然而，PMIP在每个模型中是显著有效的。这表明PMIP对过表达MUCl的肿瘤可具有宽广的应用，这包括大多数上皮瘤形成(39)。此外，PMIP可充当与抗EGFR治疗的重要辅助治疗[(40)中评论的，该文献被清楚地并入用于此目的]。我们的数据表明MUCl诱导内化、改变的运输和增强的EGFR信号传导(9)。因此，如果PMIP阻断这些相互作用，依赖EGFR表面定位的抗EGFR治疗能通过PMIP共递送被增强。
[0038] 我们已证明癌症，特别是乳腺癌中PTD连接肽基药物的有效性和MUCl定向靶标的价值。重要地是，这些数据表明PMIP是在肿瘤进展的所有阶段有活性的强效药：抑制开始、抑制生长、诱导消退和抑制转移性传播。
[0039] 上面的公开内容概括地描述本发明。本文公开的所有参考文献被清楚地并入作为参考。通过参考下面的具体实施例，能获得更完全的理解，本文提供的这些具体实施例只是为了举例说明的目的，而并不是要限制本发明的范围。
[0040] 实施例1-方法：
[0041] 细胞培养。转移性乳腺癌细胞系MDA-MD-231和BT20从美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)获得。这些细胞系用10％胎牛血清(Cellgro，Herndon，VA)、1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Invitrogen，Eugene，OR)和RPMI
1640(Cellgro)培养基在37℃、5％CO2的增湿培养箱中培养。
1640(Cellgro)培养基在37℃、5％CO2的增湿培养箱中培养。
[0042] 侵袭测定。胶原基质(0.9mg/ml I型大鼠尾胶原(BD Biosciences，Billerica，MA)、83.0％(v/v)M-199培养基(Life Technologies)和0.18％NaHCO3(Fisher，Hampton，NH))被倒入24孔板。在胶原聚合之前，0.8μm孔的transwell插入物(Corning Inc.，Corning，NY)被放在基质顶部。使用化学吸引剂(具有100ng/mL EGF的20％FBS/RPMI 1640)，将聚合的胶原再水化。用在无血清的RPMI 1640培养基中的50μM肽
处理MDA-MB-231细胞17小时。将细胞加载到transwell插入物上之前，它们用
Calcein-AM(Invitrogen)荧光标记30分钟，然后用PBS洗涤。细胞然后在50μM肽/RPMI
1640无血清培养基中被再悬浮，并被加载到每孔中的插入物上(266,000细胞/孔)。细胞在37℃、5％CO2的增湿培养箱中被允许侵入到基质中12小时。12小时之后，用40％FBS/PBS中的0.25％胶原酶处理胶原基质，并且移去插入物(Calbiochem，San Diego，CA)。使用Molecular Devices分光光度计(Ex：485，Em：538，截止：530)测量已侵入到胶原中的荧光标记细胞的数目。
处理MDA-MB-231细胞17小时。将细胞加载到transwell插入物上之前，它们用
Calcein-AM(Invitrogen)荧光标记30分钟，然后用PBS洗涤。细胞然后在50μM肽/RPMI
1640无血清培养基中被再悬浮，并被加载到每孔中的插入物上(266,000细胞/孔)。细胞在37℃、5％CO2的增湿培养箱中被允许侵入到基质中12小时。12小时之后，用40％FBS/PBS中的0.25％胶原酶处理胶原基质，并且移去插入物(Calbiochem，San Diego，CA)。使用Molecular Devices分光光度计(Ex：485，Em：538，截止：530)测量已侵入到胶原中的荧光标记细胞的数目。
[0043] 免疫沉淀和免疫印迹。蛋白如(9)所描述进行处理。
[0044] 光密度测定法。如(9)所描述进行免疫印迹分析。
[0045] 抗体和生长因子。CT2(抗-MUCl胞质尾)从Neomarkers Inc.(Fremont，CA)购买。 抗磷酸 化酪 氨酸抗 体(PY99)和EGFR/erbBl(1005)都 从Santa Cruz Biotechnologies(Santa Cruz，CA)购买。β-肌动蛋白抗体来自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。与HRP结合的二抗从Molecular Probes(Invitrogen)获得，抗仓鼠HRP结合的抗体从Jackson Labs(West Grover，PA)购买。表皮生长因子(EGF)以100ng/μl的浓度储存在-20℃(Invitrogen)。
[0046] 免疫荧光。BT20细胞用200μM FITC标记的hPMIP处理2小时，并在4％多聚甲醛/PBS中固定。固定的细胞用0.02％NaN3/PBS洗3次，并与具有DAPI的SlowfadeGold抗衰退试剂(Invitrogen)温育。用荧光DMLB Leica复式显微镜使细胞可视化。
[0047] 肽 合 成。hPMIP(SEQ ID NO：17)、FITC-hPMIP、msPMIP(SEQ ID NO：18)、FITC-msPMIP和PTD4多肽(SEQ ID NO：16)通过GenScript(Scotch Plains，NJ)合成并被冻干递送。这些肽以500μM的浓度在PBS中再悬浮并以一次性使用的等分试样储存在-80℃。
[0048] 人乳腺肿瘤异种移植物。测试免疫减弱的(scid)小鼠(Taconic，Rockville，MD)血清IgG的存在并发现＜20μg/ml IgG。将包埋在Matri-gel(BD Biosciences)中的7 3 3
1×10 细胞注射到雌性小鼠(4至6周龄)的乳腺脂肪垫中并允许生长到100mm 或500mm，
2
基于公式a×b/2，其中a是较小的直径，而b是较大的直径。小鼠腹膜内注射(i.p.)50μg/g体重的PMIP或PTD4对照肽，持续21天，并用测径器每两天测量。在21天结束时或肿
3
瘤已达到800mm 之后，通过在切除之前至少一小时给小鼠注射丁丙诺啡(2.5mg/kg体重，Infusion Solutions，Totowa，NJ)和用异氟醚(Abbott，Abbott Park，II)麻醉小鼠，切除肿瘤。手术之后，小鼠在术后8和16小时用丁丙诺啡(2.5mg/kg体重)处理。然后跟踪动物10天以检测在原发肿瘤位点或继发的乳腺处的再生长，然后被处死。
1×10 细胞注射到雌性小鼠(4至6周龄)的乳腺脂肪垫中并允许生长到100mm 或500mm，
2
基于公式a×b/2，其中a是较小的直径，而b是较大的直径。小鼠腹膜内注射(i.p.)50μg/g体重的PMIP或PTD4对照肽，持续21天，并用测径器每两天测量。在21天结束时或肿
3
瘤已达到800mm 之后，通过在切除之前至少一小时给小鼠注射丁丙诺啡(2.5mg/kg体重，Infusion Solutions，Totowa，NJ)和用异氟醚(Abbott，Abbott Park，II)麻醉小鼠，切除肿瘤。手术之后，小鼠在术后8和16小时用丁丙诺啡(2.5mg/kg体重)处理。然后跟踪动物10天以检测在原发肿瘤位点或继发的乳腺处的再生长，然后被处死。
[0049] 转基因小鼠。MMTV-pyV mT小鼠(33)，从Jackson实验室获得)进入肿瘤发展的研究，肿瘤被测量至少一个直径＞0.5cm。只有大于七周龄的小鼠被包括在本研究中，并排除发生液体囊肿的小鼠。动物被腹膜内注射50μg/g体重的msPMIP或PTD4，每天一次，持2
续21天。使用测径器每两天测量十个乳腺中的每一个，测量结果被用于基于公式a×b/2确定肿瘤体积，a是较小的直径，b是较大的直径。处理21天之后，小鼠通过CO2吸入被处死，组织被切除。在处死之前一至四小时，给几个msPMIP处理小鼠注射FITC-msPMIP(50μg/g体重)，用荧光MZFLIII Leica解剖显微镜使未受损的组织可视化。
续21天。使用测径器每两天测量十个乳腺中的每一个，测量结果被用于基于公式a×b/2确定肿瘤体积，a是较小的直径，b是较大的直径。处理21天之后，小鼠通过CO2吸入被处死，组织被切除。在处死之前一至四小时，给几个msPMIP处理小鼠注射FITC-msPMIP(50μg/g体重)，用荧光MZFLIII Leica解剖显微镜使未受损的组织可视化。
[0050] 异种移植物和转基因小鼠研究都在亚利桑那大学的Institutional Animal Care andUse Committee批准的规程下通过Experimental Mouse Shared Services(University ofArizona，Tucson)进行。
[0051] 统计学分析。所有统计数字都在Excel(Microsoft)中进行。
[0052] 实施例2-
[0053] PMIP被保留在细胞中，减少EGFR磷酸化并抑制MUCl和β-联蛋白相互作用。MUCl胞质域由72个氨基酸组成，这里面存在含有EGFR磷酸化位点(人＝YEKV，小鼠＝YEEV)和β-联蛋白结合位点(人＝SAGNGGS SLS(SEQ ID NO：9)，小鼠＝SAGNGSSSLS(SEQ ID NO：19)，图1A)的15个氨基酸的结构域(11、29)。我们合成了15个氨基酸的肽以测定是否它能以显性负性方式起作用，阻断MUCl和EGFR/β-联蛋白/src之间的相互作用。为了允许这个肽进入细胞，我们将它与蛋白转导结构域[PTD4，图1A(30)，(31)所评论的]串联合成。
在体外与结合到MIP肽的FITC标记PTD4(FITC-hPMIP)脉冲的细胞被发现含有荧光肽，并且该肽随着时间推移被保留(图1B)。
在体外与结合到MIP肽的FITC标记PTD4(FITC-hPMIP)脉冲的细胞被发现含有荧光肽，并且该肽随着时间推移被保留(图1B)。
[0054] 因为MUCl和β-联蛋白的相互作用在转移进展过程中增加，我们接下来检测了在BT20细胞系中hPMIP处理对这些相互作用的体外影响(12、32)。
[0055] 实施例3-
[0056] PMIP抑制侵袭。当这些细胞分别代表高和低MUCl表达模型时，它们被选出(数据未显示)。我们发现当与用对照肽(PTD4)或PBS处理的细胞相比，PMIP处理显著地抑制细胞通过8.0μM滤器侵入到I型胶原基质中的能力(图1C和D)。为了确定是否hPMIP还能影响增殖和/或凋亡，我们对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行了Annexin V和细胞数目定量。当细胞在塑料上生长时，hPMIP处理被发现对凋亡或细胞生长没有可检测到的影响(数据未显示)。
[0057] 实施例4-
[0058] PMIP在异体移植物乳腺癌模型中抑制肿瘤生长并抑制复发。由于hPMIP在体外强烈地抑制细胞侵入，我们接下来评价了hPMIP在体内抑制肿瘤复发和转移的能力。我们检测了是否hPMIP能改变被植入到严重的组合免疫缺陷(scid)小鼠乳腺脂肪垫中的MDA-MB-231乳腺癌细胞的转移潜力。我们发现用hPMIP处理在对原发肿瘤切除后肿瘤再生长和播散到继发性乳腺产生了基本抑制(图2B和2E)。此外，我们发现hPMIP处理还减慢了原发肿瘤的生长(图2C)。
[0059] 在第一个实验(图2A和2B)中，细胞被允许建立大的肿瘤团块(500mm3)，小鼠用hPMIP或对照肽(PTD4)注射(i.p.)21天(图2A)。在处理结束时，原发乳腺肿瘤被切除，并跟踪动物以检测肿瘤再生长和/或转移到继发乳腺的速度。尽管再生长和继发乳腺肿瘤3
被发现对于两处理组数目相同，但对照处理动物的肿瘤体积平均为760mm，而PMIP处理动
3
物平均只有73mm(图2B)。注意，小鼠在接下来再生长的10天过程中没有用药物处理。我们还注意到与对照相比，在hPMIP处理动物中肿瘤大小减少，并接下来设计将允许我们测定是否hPMIP在这个模型中影响肿瘤生长速度的实验。
被发现对于两处理组数目相同，但对照处理动物的肿瘤体积平均为760mm，而PMIP处理动
3
物平均只有73mm(图2B)。注意，小鼠在接下来再生长的10天过程中没有用药物处理。我们还注意到与对照相比，在hPMIP处理动物中肿瘤大小减少，并接下来设计将允许我们测定是否hPMIP在这个模型中影响肿瘤生长速度的实验。
[0060] 为了测定hPMIP对原发性肿瘤生长的潜在的影响，我们重复了MDA-MB-231异种移3
植实验(药物处理21天)，但在较小肿瘤体积(100mm)时开始治疗。我们允许21天药物
3
处理之后肿瘤继续生长并当它们到达800mm 的体积时进行原发性肿瘤的手术切除，这允许我们也评价在这个实验中肿瘤的扩散(图2D)。用hPMIP处理导致与对照处理动物相比肿
3
瘤大小的显著减少(图2C，p＝0.028)。这对应于hPMIP处理小鼠达到800mm 的切除大小需要的时间长度的显著的增加(图2D，p＝0.03)。尽管处理在切除之前大约20天结束，但是我们发现hPMIP处理基本上减少了切除之后10天肿瘤再生长和扩散的量(图2E)。这些数据共同证明了在高度转移性乳腺癌模型中，hPMIP处理能抑制肿瘤生长、扩散和复发。
植实验(药物处理21天)，但在较小肿瘤体积(100mm)时开始治疗。我们允许21天药物
3
处理之后肿瘤继续生长并当它们到达800mm 的体积时进行原发性肿瘤的手术切除，这允许我们也评价在这个实验中肿瘤的扩散(图2D)。用hPMIP处理导致与对照处理动物相比肿
3
瘤大小的显著减少(图2C，p＝0.028)。这对应于hPMIP处理小鼠达到800mm 的切除大小需要的时间长度的显著的增加(图2D，p＝0.03)。尽管处理在切除之前大约20天结束，但是我们发现hPMIP处理基本上减少了切除之后10天肿瘤再生长和扩散的量(图2E)。这些数据共同证明了在高度转移性乳腺癌模型中，hPMIP处理能抑制肿瘤生长、扩散和复发。
[0061] 实施例5
[0062] PMIP在自发性乳腺癌中抑制肿瘤生长并诱导消退。尽管异种移植模型已经证明了hPMIP处理对建立的细胞系的生长和进展的影响，我们想要测定在更好地重演人乳腺癌的小鼠模型中msPMIP如何影响肿瘤开始和进展。乳腺癌的MMTV-py V mT转基因小鼠模型与人乳腺癌非常相似，都活化多种信号传导通路，包括AKT、src和shc(33、34)。研究已经证明产生的乳腺癌在病理上和分子上模拟在人类疾病中观察到的增生、原位导管癌和腺癌的全部进展(35、36)。为了测定是否肽能被递送到这些动物的乳腺和肿瘤，我们注射FITC标记的msPMIP并分析肽的保留(图3A)。在注射后一个小时时，FITC被检测到遍及动物体腔，包括所有的器官(数据未显示)。四个小时之后，FITC-msPMIP被发现选择性地保留在乳腺肿瘤中以及结肠和皮肤中(图3A，数据未显示)。
[0063] 为了测定msPMIP对自发性乳腺癌进展的影响，负荷有直径≥0.5cm的乳腺肿瘤的MMTV-py V mT小鼠用msPMIP或PTD4对照肽处理21天。处理对肿瘤生长具有显著的影响，通过21天的处理，msPMIP将总肿瘤生长从～590％显著地减缓至～194％(p＝0.038；3
图3B)。此外，与在对照(PTD4)处理肿瘤中的60mm/天相比，msPMIP处理将肿瘤生长速度
3
显著地减小到只有25mm/天(p＝0.007；图3C)。注意到用hPMIP(与msPMIP相反)对
MMTV-py V mT小鼠的处理对肿瘤生长没有影响，这强调PMIP的氨基酸特异性。
图3B)。此外，与在对照(PTD4)处理肿瘤中的60mm/天相比，msPMIP处理将肿瘤生长速度
3
显著地减小到只有25mm/天(p＝0.007；图3C)。注意到用hPMIP(与msPMIP相反)对
MMTV-py V mT小鼠的处理对肿瘤生长没有影响，这强调PMIP的氨基酸特异性。
[0064] 我们接下来分析出现在本研究中各处的肿瘤的总尺寸。这个分析显示对照(PTD4)3
组中13％的肿瘤在研究结束时生长大于500mm，在msPMIP处理组中只有1％的肿瘤达到这个尺寸(图3D)。由于这个转基因模型具有多瘤居中T转基因的连续表达，该多瘤居中转基因在整个本研究驱动肿瘤发生，我们接下来检测药物处理对新肿瘤形成的影响。尽管在处
3
理开始时msPMIP和对照(PTD4)组具有相似数目的、尺寸100-300mm 的肿瘤，但是这个数目在处理结束时在对照组中增加一倍，而在msPMIP组中保持相同(图3D)。这些数据表明msPMIP处理在这个模型中抑制肿瘤开始。为了进一步分析肿瘤开始，我们评价了在药物处
3 3
理过程中开始的肿瘤百分比(开始等于肿瘤从0mm 转变至100mm 的百分比)。这个分析显示在msPMIP组中，研究过程中肿瘤开始显著地减少(p＝0.0045；图3E)。
组中13％的肿瘤在研究结束时生长大于500mm，在msPMIP处理组中只有1％的肿瘤达到这个尺寸(图3D)。由于这个转基因模型具有多瘤居中T转基因的连续表达，该多瘤居中转基因在整个本研究驱动肿瘤发生，我们接下来检测药物处理对新肿瘤形成的影响。尽管在处
3
理开始时msPMIP和对照(PTD4)组具有相似数目的、尺寸100-300mm 的肿瘤，但是这个数目在处理结束时在对照组中增加一倍，而在msPMIP组中保持相同(图3D)。这些数据表明msPMIP处理在这个模型中抑制肿瘤开始。为了进一步分析肿瘤开始，我们评价了在药物处
3 3
理过程中开始的肿瘤百分比(开始等于肿瘤从0mm 转变至100mm 的百分比)。这个分析显示在msPMIP组中，研究过程中肿瘤开始显著地减少(p＝0.0045；图3E)。
[0065] 尽管从用msPMIP对荷瘤MMTV-pyV mT小鼠的处理中观察到肿瘤形成和生长非常显著的降低，但是本研究中不是所有的肿瘤对处理都有反应(图4)。每个乳腺的分析显示，尽管响应于msPMIP的大多数肿瘤生长速度明显减慢，但许多肿瘤继续生长，表明在这个模型中有随机的通路活化。重要的是，用msPMIP处理的建立的肿瘤亚组(四个肿瘤)在治疗*下完全消退，尽管对照处理的肿瘤没有一个完全消退(图4，)。
[0066] 实施例6-
[0067] msPMIP处理导致EGFR和Mucl水平降低。先前地，我们观察到MUCl表达抑制配体依赖的EGFR降解，而其它的人显示SAGNGGSSLS序列促进MUCl/β-联蛋白相互作用(9、11)。为了测定是否msPMIP影响EGF依赖的EGFR降解，我们产生了来自MMTV-pyV mT动物的肿瘤的蛋白裂解物，在动物处死前30分钟，给动物注射EGF和肽(标准的21天药物处理之后)。我们观察到与对照处理的动物相比，在msPMIP处理的小鼠中EGFR的表达和相应的磷酸酪氨酸显著减少(图5A)。注意在这个小鼠中，21天msPMIP处理之后没有剩余的空白
3
肿瘤，而我们从对照处理的动物中获得了6个大于400mm 的肿瘤。
3
肿瘤，而我们从对照处理的动物中获得了6个大于400mm 的肿瘤。
[0068] 为了测定是否msPMIP阻断Mucl和β-联蛋白之间的相互作用，我们通过在肿瘤裂解物中建立Mucl蛋白表达的水平开始。有趣的是，我们发现msPMIP处理诱导MMTV-pyV mT模型(图5A和5B)中和MDA-MB-231异种移植物模型(图5C和5D)中Mucl蛋白表达的丧失。虽然这种丧失的机制尚未知，但它将一定导致Mucl依赖的致癌信号传导的丧失。
[0069] 参考文献
[0070] 引用的每篇参考文献的公开内容被清楚地并入本文。
[0071] 1.Hilkens，J.，Vos，H.L.，Wesseling，J.，Boer，M.，Storm，J.，van der VaIk，S.，Calafat，J.，and Patriarca，C.1995.Is episialin/MUCl involved in breast cancer progression？Cancer Lett 90：27-33.
[0072] 2.Zotter，S.，Hageman，P.C，Lossnitzer，A.，Mooi，W.J.，and Hilgers，J.1988.Tissue and tumor distribution of human polymorphic epithelial mucin.Cancer Reviews 11-12：55-101.
[0073] 3.Brossart，P.，Schneider，A.，Dill，P.，Schammann，T.，Grunebach，F.，Wirths，S.，Kanz，L.，Buhring，H.J.，and Bragger，W.2001.The epithelial tumor antigen MUCl is expressed inhematological malignancies and is recognized by MUCl -specific cytotoxic T-lymphocytes.Cancer Res 61：6846-6850.
[0074] 4.Takahashi，T.，Makiguchi，Y.，Hinoda，Y.，Kakiuchi，H.，Nakagawa，N.，Imai，K.，and Yachi，A.1994.Expression of MUCl on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUCl from a multiple myeloma patient.J Immunol153：2102-2109.
[0075] 5.Teruya-Feldstein，J.，Donnelly，G.B.，Goy，A.，Hegde，A.，Nanjangud，G.，Qin，J.，Thaler，H.，Gilles，F.，Dyomin，V.G.，Lloyd，K.O.，et al.2003.MUC-I mucin protein expression in B-cell lymphomas.ApplImmunohistochem MoI Morphol 11：28-32.[0076] 6.Schroeder，J.A.，Masri，A.A.，Adriance，M.C.，Tessier，J.C.，Kotlarczyk，K.L.，Thompson，M.C.，and Gendler，S.J.2004.MUCl overexpression results in mammary gland tumorigenesis and prolonged alveolar differentiation.Oncogene 23：5739-5747.
[0077] 7.Ren，J.，Agata，N.，Chen，D.，Li，Y.，Yu，W.H.，Huang，L.，Raina，D.，Chen，W.，Kharbanda，S.，and Kufe，D.2004.Human MUCl carcinoma-associated protein confers resistance to genotoxic anticancer agents.Cancer Cell 5：163-175.
[0078] 8.Hollingsworth，M.A.，and Swanson，BJ.2004.Mucins in cancer：protection and control of the cell surface.Nat Rev Cancer 4：45-60.
[0079] 9.Pochampalli，M.R.，el Bejjani，R.M.，and Schroeder，J.A.2007.MUCl is a novel regulator of ErbBl receptor trafficking.Oncogene 26：1693-1701.
[0080] 10.Pochampalli，M.R.，Bitler，B.G.，and Schroeder，J.A.2007.Transforming Growth Factor alpha-Dependent Cancer Progression is Modulated by Mucl Cancer Research 67.
[0081] 11.Li，Y.，Ren，J.，Yu，W.，Li，Q.，Kuwahara，H.，Yin，L.，Carraway，K.L.，3rd，and Kufe，D.2001.The epidermal growth factor receptor regulates interaction of the human DF3/MUCl carcinoma antigen with c-Src and beta-catenin.J Biol Chem 276：35239-35242.
[0082] 12.Schroeder，J.A.，Adriance，M.C.，Thompson，M.C.，Camenisch，T.D.，and Gendler，SJ.2003.MUCl alters β-catenin-dependent tumor formation and promotes cellular invasion.Oncogene 22：1324-1332.
[0083] 13.Yamamoto，M.，Bharti，A.，Li，Y.，and Kufe，D.1997.Interaction of the DF3/MUClbreast carcinoma-associated antigen and beta-catenin in cell adhesion.J Biol Chem 272：12492-12494.
[0084] 14.Li，Y.，Bharti，A.，Chen，D.，Gong，J.，and Kufe，D.1998.Interaction of glycogen synthase kinase 3beta with the DF3/MUCl carcinoma-associated antigen and beta-catenin.MoI Cell Biol 18：7216-7224.
[0085] 15.Li，Y.，Kuwahara，H.，Ren，J.，Wen，G.，and Kufe，D.2001.The c-Src tyrosine kinase regulates signaling of the human DF3/MUCl carcinoma-associated antigen with GSK3beta and beta-catenin.J Biol Chem 276：6061-6064.
[0086] 16.Schroeder，J.A.，and Lee，D.C.1997.Transgenic mice reveal roles for TGFalpha and EGF receptor in mammary gland development and neoplasia.J Mammary Gland Biol Neoplasia 2：119-129.
[0087] 17.Alroy，L，and Yarden，Y.1997.The ErbB signaling network inembryogenesis and oncogenesis：signal diversification through combinatorial ligand-receptor interactions.FEBS Lett 410：83-86.
[0088] 18.Olayioye，M.A.，Graus-Porta，D.，Beerli，R.R.，Rohrer，J.，Gay，B.，and Hynes，N.E.1998.ErbB-1 and ErbB-2 acquire distinct signaling properties dependent upon their dimerization partner.MoI Cell Biol 18：5042-5051.
[0089] 19.Olayioye，M.A.，Beuvink，L，Horsch，K.，Daly，J.M.，and Hynes，N.E.1999.ErbB receptor-induced activation of stat transcription factors is mediated by Src tyrosine kinases.J Biol Chem 274：17209-17218.
[0090] 20.Carpenter，G.2000.The EGF receptor：a nexusfor trafficking and signaling.Bioessays 22：697-707.
[0091] 21.Schroeder，J.A.，Thompson，M.C.，Gardner，M.M.，and Gendler，SJ.2001.Transgenic MUCl intefacts with epidermal growth factor receptor and correlates with mitogen-activated protein kinase activation in the mouse mammary gland.J Biol Chem 276：13057-13064.
[0092] 22.Schroeder，J.A.，Troyer，K.L.，and Lee，D.C.2000.Cooperative induction of mammary tumorigenesis by TGFalpha and Wnts.Oncogene 19：3193-3199.
[0093] 23.Polakis，P.2000.Wnt signaling and cancer.Genes Dev 14：1837-1851.[0094] 24.He，T.C.，Sparks，A.B.，Rago，C，Hermeking，H.，Zawel，L.，da Costa，L.T.，Morin，P.J.，Vogelstein，B.，and Kinzler，K.W.1998.Identification of c-MYC as a target of the APCpathway.Science 281：1509-1512.
[0095] 25.Shtutman，M.，Zhurinsky，J.，Simcha，L，Albanese，C，D′Amico，M.，Pestell，R.，and Ben-Ze′ev，A.1999.The cyclin Dl gene is a target of the beta-catenin/LEF-1pathway.Proc Natl Acad Sci USA 96：5522-5527.
[0096] 26.Tetsu，O.，and McCormick，F.1999.Beta-catenin regulates expression of cyclin Dl in colon carcinoma cells.Nature 398：422-426.
[0097] 27.Tsukamoto，A.S.，Grosschedl，R.，Guzman，R.C.，Parslow，T.，and Varmus，H.E.1988.Expression of the int-1gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice.Cell 55：619-625.
[0098] 28.Michaelson，J.S.，and Leder，P.2001.beta-catenin is a downstream effector of Wnt-mediated tumorigenesis in the mammary gland.Oncogene 20：5093-5099.
[0099] 29.Spicer，A.P.，Duhig，T.，Chilton，B.S.，and Gendler，S.J.1995.Analysis of mammalian MUCl genes reveals potential functionally important domains.Mamm Genome 6：885-888.
[0100] 30.Ho，A.，Schwarze，S.R.，Mermelstein，S.J.，Waksman，G.，and Dowdy，S.F.2001.Synthetic protein transduction domains：enhanced transduction potential in vitro and in vivo.Cancer Res 61α1 A-AIl.
[0101] 31.Wadia，J.S.，and Dowdy，S.F.2005.Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by TAT-mediated transduction in the treatment of cancer.Adv Drug Deliv Rev 57：579-596.
[0102] 32.Schroeder，J.A.，Adriance，M.C.，McConnell，E.J.，Thompson，M.C.，Pockaj，B.A.，and Gendler，SJ.2002.ErbB/beta-catenin complexes are associated with human infiltrating ductal breast and MMT V-Wnt-1and MMTV-c-neu transgenic carcinomas.J Biol Chem 277：22692-22698.
[0103] 33.Guy，C.T.，Cardiff，R.D.，and Muller，WJ.1992.Induction of mammary tumors by expression of polvomavirus middle T oncogene：a transgenic mouse modelfor metastatic disease.MoI Cell Biol 12：954-961.
[0104] 34.Webster，M.A.，Hutchinson，J.N.，Rauh，MJ.，Muthuswamy，S.K.，Anton，M.，Tortorice，C.G.，Cardiff，R.D.，Graham，F.L.，Hassell，J.A.，and Muller，WJ.1998.Requirement for both She and phosphatidylinositol 3′kinase signaling pathways in polyomavirus middle T-mediated mammary tumorigenesis.MoI Cell Biol 18：2344-2359.
[0105] 35.Maglione，J.E.，Moghanaki，D.，Young，L.J.，Manner，C.K.，Ellies，L.G.，Joseph，S.O.，Nicholson，B.，Cardiff，R.D.，and MacLeod，C L.2001.Transgenic Polyoma middle-T mice model premalignant mammary disease.Cancer Res 61：8298-8305.[0106] 36.Lin，E.Y.，Jones，J.G.，Li，P.，Zhu，L.，Whitney，K.D.，Muller，W.J.，and Pollard，J.W.2003.Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.Am J Pathol 163：2113-2126.
[0107] 37.Trivedi，P.，Cuomo，L.，Christensson，B.，Hu，L.F.，Morrone，S.，Frati，L.，Faggioni，A.，Winberg，G.，and Klein，G.2000.Augmentation of leukocyte infiltration in murine tumors expressing B-cell derived but not nasopharyngeal carcinoma derived EBV membrane protein LMPl.J Med Virol 60：417-424.
[0108] 38.Kittiworakarn，J.，Lecoq，A.，Moine，G.，Thai，R.，Lajeunesse，E.，Drevet，P.，Vidaud，C，Menez，A.，and Leonetti，M.2005.HIV-I Tat Raises an Adjuvant-free Humoral Immune Response Controlled by its Core Region and its Ability to Form Cysteine-mediated Oligomers.The Journal of Biological Chemistry 281：3105-3115.[0109] 39.Packer，L.M.，Williams，S.J.，Callaghan，S.，Gotley，D.C.，and McGuckin，M.A.2004.Expression of the cell surface mucin gene family in adenocarcinomas.Int J Oncol 25：1119-1126.
[0110] 40.Dassonville，O.，Bozec，A.，Fischel，J.L.，and Milano，G.2007.EGFR targeting therapies：monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors.Similarities and differences.Crit Rev Oncol Hematol 62：53-61.
[0111] 41.Schroeder，J.et al.，U.S.Patent Application US-2006-0293234-A1.
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
治疗热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈