本发明提供用于治疗微血管病症、黄斑变性、呼吸病症及脊髓损 伤或疾病的新颖方法及组合物。
在一实施方式中，提供抑制RTP801且可用以治疗各种疾病及适应 症的新颖分子。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于治疗罹患微血管病症、 黄斑变性或呼吸病症的患者的方法，该方法包括将包含RTP801抑制剂 的药物组合物给药于患者。
本发明的另一实施例涉及一种用于治疗罹患COPD的患者的方法， 该方法包括将包含治疗有效量的RTP801抑制剂的药物组合物给药于患 者。在一实施方式中，抑制剂为siRNA分子、反义分子、抗体(诸如中 和抗体)、显性阴性肽或核糖核酸酶。
本发明的另一实施例涉及一种用于治疗罹患黄斑变性的患者的方 法，该方法包括将包含治疗有效量的RTP801抑制剂的药物组合物给药 于患者。在一实施方式中，抑制剂为siRNA分子、反义分子、抗体(诸 如中和抗体)、显性阴性肽或核糖核酸酶。
本发明的另一实施例涉及一种用于治疗罹患微血管病症的患者的 方法，该方法包括将包含治疗有效量的RTP801抑制剂的药物组合物给 药于患者。在一实施方式中，抑制剂为siRNA分子、反义分子、抗体(诸 如中和抗体)、显性阴性肽或核糖核酸酶。
本发明的另一实施例提供治疗有效量的RTP801抑制剂用于制备用 于促进罹患呼吸病症的患者恢复的药剂的用途。在一实施方式中，呼 吸病症为COPD且抑制剂优选为siRNA。
本发明的另一实施例提供治疗有效剂量的RTP801抑制剂用于制备 用于促进罹患黄斑变性的患者恢复的药剂的用途。在一实施方式中， 黄斑变性为AMD且抑制剂优选为siRNA。
本发明的另一实施例提供治疗有效量的RTP801抑制剂用于制备用 于促进罹患微血管病症的患者恢复的药剂的用途。在一实施方式中， 微血管病症为糖尿病性视网膜病且抑制剂优选为siRNA。
本发明一般涉及用于治疗或预防听力障碍(或平衡障碍)、尤其与 内耳毛细胞的细胞死亡相关的听力障碍的发生率或严重程度的方法及 组合物。该方法及组合物包括将预防或治疗有效量的一种或多种下调 RTP801基因表达的化合物、尤其新颖小干扰RNA(siRNA)给药于需要该 治疗的哺乳动物。
更具体地说，本发明提供用于治疗罹患听力障碍或与内耳毛细胞 的细胞死亡相关的其它耳病理的患者的方法及组合物。该耳病理可为 声创伤、机械外伤或耳毒素诱发的听力损失的结果。本发明的方法包 括将一或多种下调RTP801基因表达的化合物、尤其抑制RTP801的siRNA 通常作为药物组合物以治疗有效剂量给药于患者以藉此治疗患者。
在一实施方式中，本发明提供用于治疗的经改良组合物及方法， 其需要给药具有耳毒性、听力障碍副作用的药物，该药物与治疗有效 量的一种或多种抑制RTP801的siRNA分子组合以治疗或预防由该药物 诱发的耳毒性。本发明的组合物可在诱发内耳细胞凋亡组织损伤的耳 毒性、听力损害性药物给药之前、之后以适当间隔给药或大体上同时 给药。类似地，此治疗可有效作为在引起声创伤的病状前或与其结合 的预防性治疗。
因此，本发明之一目标是提供含有与耳毒性、听力损害性药物组 合的治疗有效量的一种或多种抑制RTP801的siRNA分子的经改良组合 物以将其给药于哺乳动物。该组合药物可分开给药；在全身性给药耳 毒性、听力损害性药物时可局部给药抑制RTP801的siRNA分子。siRNA 分子可在耳毒性药物之前、同时或之后给药。该组合组合物可另外含 有可药用载体。该药物组合物应具有比单独耳毒性药物低的耳毒性， 且优选应具有比通常使用的剂量高的耳毒性药物剂量。该经改良组合 物的实例包括与治疗有效量的一种或多种抑制RTP801的siRNA分子组 合的顺铂或其它耳毒性赘生性药剂或氨基糖苷抗生素。
此外，本发明亦涉及本发明的组合物在需要利尿剂的情形下的用 途。本发明提供长期寻求可治疗与某些利尿剂普遍相关且尤其与更普 遍及通用的髓袢利尿剂相关的耳毒作用而不牺牲利尿剂的利尿效能的 疗法及药剂的本领域的解决方法。
此外，本发明亦涉及本发明的组合物在需要奎宁或类奎宁化合物 的情形下的用途。本发明提供长期寻求可治疗与某些奎宁相关的耳毒 作用而不牺牲奎宁的效能的疗法及药剂的本领域的解决方法。
本发明另外涉及用于治疗或预防褥疮的发生率或严重程度的方法 及组合物。该方法及组合物包括将预防或治疗有效量的一种或多种下 调RTP801基因表达的化合物、尤其新颖小干扰RNA(siRNA)给药于需要 该治疗的哺乳动物。
此外，本发明亦涉及用于治疗如本文所述的任何缺血或缺血-再灌 注损伤或病状的方法及组合物。该方法及组合物包括将预防或治疗有 效量的一种或多种下调RTP801基因表达的化合物、尤其新颖小干扰 RNA(siRNA)给药于需要该治疗的哺乳动物。
本发明的详细描述
在本发明的某些实施例中，本发明涉及RTP801基因或多肽的抑制 以治疗眼病、呼吸病症、微血管病症、听力障碍及缺血性病状。如本 文所述，本发明所用的优选抑制剂为生物分子。
不受理论限制，本发明的发明者发现RTP801涉及多种疾病病况， 包括微血管病症、眼病、呼吸病症、听力障碍、褥疮、缺血性病状及 脊髓损伤及疾病，且应有益地抑制RTP801以治疗该疾病或病症中的任 一个。本文详细讨论抑制RTP801的方法、分子及组合物，且在治疗罹 患该病状中的任一个的患者中可有益地使用该分子和/或组合物中的 任一个。
本发明提供用于抑制RTP801基因活体内表达的方法及组合物。一 般而言，该方法包括以足以藉由RNA干扰机制下调靶向基因表达的量给 药寡核糖核苷酸(诸如靶向特定mRNA且与其杂交的小干扰RNA(亦即 siRNA))或可在细胞中产生siRNA的核酸物质。具体说，该方法可用以 抑制RTP801基因的表达以治疗呼吸病症、微血管病症、眼病及听力障 碍。
因此，在一实施方式中，本发明提供一种用于治疗罹患选自微血 管病症、眼病、呼吸病症、听力障碍、褥疮或脊髓损伤或其它创伤的 病状的患者的方法，该方法包括将包含RTP801抑制剂的药物组合物以 治疗有效量给药于患者以藉此治疗患者。本发明另外提供用于治疗罹 患微血管病症、眼病、呼吸病症、听力障碍、褥疮或脊髓损伤或其它 创伤的患者的方法，该方法包括将包含RTP801抑制剂的药物组合物以 足以促进恢复的剂量及历经足以促进恢复的时间给药于患者。眼病可 为黄斑变性，尤其诸如年龄相关的黄斑变性(AMD)。微血管病症可尤其 为糖尿病性视网膜病或急性肾衰竭。呼吸病症可尤其为慢性阻塞性肺 病(COPD)、气肿、慢性支气管炎、哮喘及肺癌。听力障碍可为声创伤 或顺铂诱发的耳聋。RTP801抑制剂可选自大量分子，包括(但不限于) 诸如聚核苷酸的化合物、反义片段、靶向RTP801基因mRNA的RNA分子(诸 如核糖核酸酶或siRNA(诸如表A-D的siRNA且具体地说表A的siRNA No： 14、22、23、25、27、39、41、42、49及50或表D的siRNA No：257、 260-262及264-268))或包含其的表达载体、诸如显性阴性肽的多肽、 抗体(诸如特异性结合存在于包含连续氨基酸的多肽(多肽序列在图 2(SEQ ID NO：2)中示出)内的抗原决定簇的抗体)或在某些情形下为酶。 此外，RTP801抑制剂可为诸如小分子(例如，具有低分子量(例如低于 2000道尔顿的分子量)的化学分子)的化学抑制剂。特异性RTP801抑制 剂在下文中给出。
本发明另外提供一种用于治疗罹患黄斑变性、COPD、糖尿病性视 网膜病或声创伤诱发的耳聋的患者的方法，该方法包括将包含治疗有 效量的包含聚核苷酸(其特异性杂交自RTP801基因转录的mRNA且下调 RTP801基因表达以藉此治疗患者)的RTP801抑制剂的药物组合物给药 于患者。聚核苷酸可为包含具有与表A-D中所陈述的任一序列(SEQ ID NO：3-536)一致的序列的连续核苷酸的siRNA且具体地说表A的siRNA No：14、22、23、25、27、39、41、42、49及50或表D的siRNA No：257、 260-262及264-268。
此外，本发明的另一实施例涉及一种用于治疗罹患微血管病症、 眼病、呼吸病症、听力障碍、褥疮或脊髓损伤或其它创伤的患者的方 法，该方法包括将包含治疗有效量的包含siRNA分子(任选为详述于表 A-D的任一个中的siRNA分子)的RTP801抑制剂的药物组合物以一定剂 量及历经一段时间给药于患者以藉此治疗患者。
提供另一种用于治疗罹患微血管病症、眼病、呼吸病症、听力障 碍、褥疮或脊髓损伤或其它创伤的患者的方法，该方法包括将包含治 疗有效剂量的靶向RTP801基因mRNA的RNA分子的药物组合物以一定剂 量及历经一段时间给药于患者以藉此治疗患者。RNA分子可为siRNA分 子(诸如表A-D中详述的siRNA分子且具体地说表A的siRNA No：14、22、 23、25、27、39、41、42、49及50或表D的siRNA No：257、260-262 及264-268)或核糖核酸酶。
本发明另外提供一种用于治疗罹患微血管病症、眼病、呼吸病症、 听力障碍、褥疮或脊髓损伤或其它创伤或本文所揭示的任一病状的患 者的方法，该方法包括将包含治疗有效剂量的靶向RTP801基因mRNA的 siRNA分子(任选为表A-D的任一个中所详述的siRNA分子)的药物组合 物以一定剂量及历经一段时间给药于患者以藉此治疗患者。此外，眼 病可为黄斑变性，诸如年龄相关的黄斑变性(AMD)；微血管病症可为糖 尿病性视网膜病或急性肾衰竭；呼吸病症可为COPD且所治疗COPD的方 面可包含(但不限于)气肿、慢性支气管炎或两者；且听力障碍可为声 创伤诱发的耳聋。
此外，本发明亦涉及本文所揭示的新颖siRNA在治疗其中抑制 RTP801表达有益的听力障碍中的用途。在一实施方式中，本发明构成 一种用于治疗患有或倾向于患有听力(或平衡)障碍的哺乳动物或预防 性治疗患有其中抑制RTP801表达有益的病状的哺乳动物的方法。本发 明的此实施例的方法应预防或减少源自尤其由声创伤或耳毒性药剂引 起的内耳细胞损伤、损失或退化的听力(平衡)障碍的发生率或严重程 度。在此实施例中，本发明的方法包括给药治疗有效量的一种或多种 下调RTP801基因表达的化合物、尤其本发明的新颖siRNA。
在一实施方式中，本发明的目标是提供一种用于治疗哺乳动物以 预防、减少或治疗听力障碍、病症或不平衡、优选声创伤或耳毒素诱 发的听力病状的方法，该方法藉由将本发明的组合物给药于需要该治 疗的哺乳动物来进行。一实施例是一种用于治疗其中声创伤源自曾经 暴露于极大声音或连续暴露于经长时间可引起耳聋的噪声环境的听力 障碍的方法。听力障碍亦可藉由耳的物理创伤引起。另一实施例是一 种用于治疗其中耳毒性源自治疗有效量的耳毒性药物的给药的听力障 碍的方法。典型耳毒性药物为化学治疗剂，例如抗赘生剂及抗生素。 其它可能候选者包括髓袢利尿剂、奎宁或类奎宁化合物及水杨酸盐及 类水杨酸盐化合物。当耳毒性化合物为抗生素、优选氨基糖苷抗生素 时，这类方法尤其有效。耳毒性氨基糖苷抗生素包括(但不限于)新霉 素、巴龙霉素、核糖霉素、利维霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉 素、紫霉素、庆大霉素、西索米星、奈替米星、链霉素、地贝卡星、 复提霉素及双氢链霉素或其组合。特定抗生素包括新霉素B、卡那霉素 A、卡那霉素B、庆大霉素C1、庆大霉素C1a及庆大霉素C2。当耳毒性化 合物为赘生性药剂(诸如长春新碱、长春碱、顺铂及类顺铂化合物及紫 杉醇及类紫杉醇化合物)时，本发明的方法亦有效。
在以治疗或预防听力障碍为目标的某些实施例中，本发明的组合 物应与耳毒素共给药。举例而言，提供一种藉由给药氨基糖苷抗生素 来治疗哺乳动物感染的经改良方法，其改良之处包含将治疗有效量的 一种或多种下调RTP801基因表达的化合物、尤其新颖siRNA给药于需要 该治疗的患者以减少或预防与抗生素相关的耳毒素诱发的听力障碍。 减少或预防耳毒素诱发的听力障碍的化合物、尤其新颖siRNA优选应局 部给药于内耳中，任选经鼓膜给药。
在另一实施方式中，提供一种藉由给药化学治疗化合物来治疗哺 乳动物癌症的经改良方法，其改良之处包含将治疗有效量的本发明组 合物给药于需要该治疗的患者以减少或预防与化学治疗药物相关的耳 毒素诱发的听力障碍。在另一实施方式中，该治疗方法应用于源自化 学治疗剂给药的听力障碍以治疗其耳毒性副作用。应用于本发明方法 的耳毒性化学治疗剂包括(但不限于)抗赘生剂，包括顺铂或类顺铂化 合物、紫杉醇或类紫杉醇化合物及相信引起耳毒素诱发的听力障碍的 其它化学治疗剂(例如长春新碱，一种用以治疗恶性血液病及肉瘤的抗 赘生性药物)。类顺铂化合物包括卡铂()、四氯环己铂、 奥沙利铂、阿柔铂(aroplatin)及反式铂(transplatin)。在另一实施 方式中，本发明的方法应用于源自通常用以治疗疟疾的奎宁及其合成 替代物的给药的听力障碍以治疗其耳毒性副作用。在另一实施方式中， 本发明的方法应用于源自利尿剂给药的听力障碍。利尿剂、尤其＂髓袢 ＂利尿剂(亦即主要在亨利(Henle)髓袢中起作用的利尿剂)为候选耳毒 素。例示性实例(不限于本发明的方法)包括呋塞米(furosemide)、利 尿酸(ethacrylic acid)及汞剂(mercurial)。利尿剂通常用以预防或 消除水肿。利尿剂亦用于非水肿性情形中，例如高血压、高钙血症、 特发性高钙尿症及肾性尿崩症。
在另一实施方式中，本发明的方法应用于治疗或预防褥疮的发生 率或严重程度。该方法及组合物包括将预防或治疗有效量的一种或多 种下调RTP801基因表达的化合物、尤其新颖小干扰RNA(siRNA)给药于 需要该治疗的哺乳动物。治疗或预防褥疮发生率或严重程度的化合物、 尤其新颖siRNA优选应在受损区域内局部给药。当持续压力(通常来自 床或轮椅)切断身体的脆弱部分的循环时，本发明的方法及组合物有效 治疗且预防所发展的褥疮。该方法及组合物有效用于感觉减少或缺乏 的患者或虚弱、消瘦、瘫痪或长期卧床不起的患者。使用本发明的组 合物，该组合物亦有效地改善褥疮的治愈。组合物可在治愈过程中的 任何特定阶段使用，包括任何治愈起始前的阶段或甚至特定疮形成前 的阶段(预防性治疗)。
本发明的其它种类的待治疗创伤亦包括i)一般创伤，诸如外科伤 口、外伤、感染创伤、缺血创伤、热创伤、化学创伤及大泡性创伤； ii)口腔特异性创伤，诸如拔牙后创伤、尤其与包囊及脓肿治疗有关的 牙髓创伤、细菌、病毒或自体免疫器官的溃疡及损害、机械创伤、化 学创伤、热创伤、感染创伤及苔癣样创伤、疱疹溃疡、阿夫他性口腔 炎(stomatitis aphthosa)、急性坏死溃疡性牙龈炎及口腔灼烧综合 征；及iii)皮肤上的创伤，诸如赘瘤、灼伤(例如化学、热)、损害(细 菌、病毒、自体免疫)、咬伤及外科手术切口。
本发明的方法及组合物亦有效治疗且预防包括褥疮、静脉溃疡及 糖尿病性溃疡的任何慢性创伤。在所有这类慢性创伤类型中，潜在加 速事件为缺血时期、继而再灌注时期。这类缺血-再灌注事件常重复， 此意谓缺血-再灌注的不利影响加强且最终足以引起溃疡。对褥疮及糖 尿病性足部溃疡而言，缺血事件为足以防止组织灌注的压力延长的结 果，且当压力最终解除时，再灌注损伤发生。本发明的组合物有效抑 制由慢性创伤中的缺血-再灌注引起的损害。
本发明的组合物亦有效用于与缺血-再灌注相关的其它病状，诸如 (但不限于)器官移植、小肠及结肠吻合术、大血管手术、缝合分离肢 体、气囊血管成形术或任何心脏外科手术、中风或脑外伤、肢体移植、 肺循环血压过高、血氧不足及非心脏性肺水肿、急性肾衰竭、急性青 光眼、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、视网膜血管阻塞、耳 蜗缺血、微血管外科手术及硬皮病中的缺血损害。
本发明的方法及组合物亦有效治疗声创伤或机械外伤，优选地有 效治疗导致内耳毛细胞损失的声创伤或机械外伤。本发明中待治疗的 声创伤可藉由单一暴露于极大声音或在长期每日暴露于85分贝以上的 大声音之后而引起。本发明中待治疗的机械内耳外伤为(例如)将电子 装置插入内耳的手术后的内耳外伤。本发明的组合物预防或最小化与 手术相关的对内耳毛细胞造成的损害。减少或预防耳毒素诱发的听力 障碍的化合物、尤其新颖siRNA优选应局部给药于内耳中。
此外，本发明的化合物亦可用以治疗其中涉及缺血、任选缺血-再 灌注的任何病状。该病状包括源自下列情形的缺血或缺血-再灌注：血 管成形术、心脏外科手术或溶栓、器官移植、由于整形手术、严重间 室综合征期间、分离肢体的再连接期间、由于多器官衰竭综合征、脑 中由于中风或脑外伤、与慢性创伤(诸如褥疮、静脉溃疡及糖尿病性溃 疡)有关、骨骼肌缺血或肢体移植期间、由于肠系膜缺血或急性缺血性 肠病、由于下躯体缺血造成的呼吸衰竭(导致肺循环血压过高、血氧不 足及非心脏性气肿)、肾移植、大外科手术、外伤及脓毒性休克以及失 血性休克后观测到的急性肾衰竭、脓毒病、由于急性血管阻塞而发生 的视网膜缺血(在大量眼病(诸如急性青光眼、糖尿病性视网膜病、高 血压性视网膜病及视网膜血管阻塞)中导致视力损失)、耳蜗缺血、针 对头部及颈部缺陷的微血管外科手术中的瓣衰竭、硬皮病中的雷诺现 象及相关数字缺血损害、脊髓损伤、血管外科手术、外伤横纹肌溶解(挤 压综合征)及肌红蛋白尿。此外，缺血/再灌注可涉及下列病状：高血 压、高血压性脑血管疾病、动脉瘤破裂、血管收缩或阻塞-如在血栓或 栓子、血管瘤、血质不调、任何形式的受损心脏功能(包括心跳骤停或 衰竭、全身性低血压、心跳骤停、心脏性休克、败血性休克、脊髓外 伤、头外伤、癫痫发作、出血)及诸如中风、帕金森氏病、癫痫症、抑 郁、ALS、阿兹海默氏病、亨廷顿氏舞蹈病及任何疾病诱发的痴呆(诸 如HIV诱发的痴呆)的疾病的情形下发生。此外，缺血事件可由对中枢 神经系统的机械损伤引起，诸如源自对头或脊骨的重击。外伤可包括 诸如擦伤、切口、挫伤、刺破、压伤等组织损害，诸如可源于外部对 象与头、颈或脊柱的任一部位或其从属物的外伤性接触。外伤的其它 形式可源于藉由体液不当累积(例如正常脑脊髓或玻璃体液产生的阻 塞或功能障碍、翻转或体积调节或硬膜下或硬膜内血肿或水肿)而造成 的CNS组织的收缩或压缩。类似地，外伤收缩或压缩可源于大量异常组 织(诸如转移性或原发性肿瘤)的存在。
＂治疗疾病＂是指给药有效改善与疾病相关的症状的治疗物质以减 轻严重程度或治愈疾病或预防疾病发生。＂治疗＂是指治疗性治疗及预 防性方法，其中目标是预防或减缓(减轻)疾病或病症。
＂治疗有效量＂是指有效获得患者或其生理系统的改良的医药化合 物或组合物的量，其改良之处包括(但不限于)改善存活率、更快恢复 或改善或消除症状及由本领域技术人员选择的适当测定方法的其它指 示。
治疗本文所揭示的疾病且包括于本发明中的方法可包括给药 RTP801抑制剂，结合另一RTP801抑制剂(一种改良如下详述的活性成份 的药理性质的物质)或已知有效治疗待治疗疾病(诸如黄斑变性、COPD、 ARF、DR、顺铂或声创伤诱发的耳聋)的另一化合物。＂结合......＂意谓 之前、同时或之后。关于例示性结合疗法的进一步详述在下文中给出。
在另一实施方式中，本发明提供治疗有效剂量的RTP801抑制剂用 于制备用于促进罹患如上文详述的黄斑变性、COPD、ARF、DR、顺铂或 声创伤诱发的耳聋或任何其它眼病、微血管或呼吸病状或听力障碍的 患者恢复的药剂的用途，及治疗有效量的RTP801抑制剂用于制备用于 治疗该疾病及病状的药剂的用途。在此实施例中，RTP801抑制剂可包 含聚核苷酸，该聚核苷酸包含具有包含图1中所陈述的序列(SEQ ID NO：1)的反义序列的序列的连续核苷酸。此外，RTP801抑制剂可为包含 具有作为图1中所陈述的序列(SEQ ID NO：1)的反义序列的序列的聚核 苷酸的表达载体。根据该用途，RTP801抑制剂亦可为抗体，诸如特异 性结合存在于包含连续氨基酸的多肽(其序列显示于图2中(SEQ ID No：2))中的抗原决定簇的中和抗体。此外，RTP801抑制剂可为靶向 RTP801基因mRNA的RNA分子(任选为siRNA，任选为包含具有与表A-D中 所陈述的任何序列(SEQ ID NO：3-536)一致的序列的连续核苷酸的 siRNA且具体地说表A的siRNA No：14、22、23、25、27、39、41、42、 49及50或表D的siRNA No：257、260-262及264-268)或核糖核酸酶。
因此，根据本文所揭示的信息，本文所揭示的任一方法、本文所 揭示的任一用途及本文所揭示的任一药物组合物中待使用的RTP801抑 制剂均可选自由下列各物组成的组：siRNA、包含siRNA的载体、表达 siRNA的载体及内源性加工成siRNA中的任一分子。如本文详述，该 siRNA优选为包含具有与表A-D中所陈述的任一序列(SEQ ID NO：3-536) 一致的序列的连续核苷酸的siRNA且具体地说表A的siRNA No：14、22、 23、25、27、39、41、42、49及50或表D的siRNA No：257、260-262 及264-268。
＂呼吸病症＂是指呼吸系统的病状、疾病或综合征，包括(但不限于) 所有类型的肺部病症，尤其包括慢性阻塞性肺病(COPD)、气肿、慢性 支气管炎、哮喘及肺癌。气肿及慢性支气管炎可作为COPD的部分发生 或独立发生。
＂微血管病症＂是指任何影响微毛细管及微淋巴管的病状，尤其血 管痉挛性疾病、脉管炎疾病及淋巴阻塞性疾病。微血管病症的实例尤 其包括：眼病，诸如阵发性黑蒙(栓塞或继发于SLE)、抗磷脂抗体综合 征、Prot CS及ATIII不足、因使用IV药物而引起的微血管病理、异常 蛋白血症、颞动脉炎、前部缺血性视神经病、视神经炎(原发或继发于 自体免疫疾病)、青光眼、逢希柏林道综合征(von hippel lindau syndrome)、角膜病、角膜移植排斥反应白内障、伊尔斯病(Eales′ disease)、霜样树枝状视网膜脉管炎、环扎术、包括睫状体平坦部炎 (pars planitis)的葡萄膜炎、脉络膜黑素瘤、脉络膜血管瘤、视神经 发育不全、视网膜病状(诸如视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、早产 儿视网膜病、HIV视网膜病、外伤性视网膜病、全身性脉管炎及自体免 疫疾病的视网膜病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、放射性 视网膜病、树枝状视网膜动脉或静脉阻塞、特发性视网膜脉管炎、动 脉瘤、视神经网膜炎、视网膜栓塞、急性视网膜坏死、乌枪弹样视网 膜脉络膜病变、长期视网膜脱离)；全身性病状，诸如糖尿病、糖尿病 性视网膜病(DR)、糖尿病相关的微血管病理(如本文详述)、高血黏稠 度综合征(hyperviscosity syndrome)、主动脉弓综合征及眼部缺血综 合征、颈动脉海绵状瘘管、多发性硬化症、全身性红斑性狼疮症、SS-A 自体抗体的小动脉炎、急性多发性出血性脉管炎、源自感染的脉管炎、 源自白塞病(Behcet′s disease)的脉管炎、肉状瘤病、凝血病、神经 病、肾病、肾微血管病及缺血性微血管病状。
微血管病症可包含新生血管性元素。术语＂新生血管性病症＂是指 其中血管形成(新血管生成)对患者有害的那些病状。眼部新血管生成 的实例包括：视网膜病(糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、慢性 青光眼、视网膜脱离及镰状细胞性视网膜病)、虹膜红变、增生性玻璃 体视网膜病、炎症性疾病、慢性葡萄膜炎、赘瘤(眼癌、假神经胶质瘤 及黑素瘤)、富克斯异色性虹膜睫状体炎(Fuchs′heterochromic iridocyclitis)、新生血管性青光眼、角膜新血管生成(炎症、移植及 虹膜发育不全)、组合的玻璃体切除术及晶状体切除术后的新血管生 成、血管疾病(视网膜缺血、脉络膜血管不足、脉络膜血栓及颈动脉缺 血)、视神经新血管生成及归因于眼睛穿透或撞伤性眼部损伤的新血管 生成。使用本发明的化合物及药物组合物可治疗所有这类新生血管性 病状。
＂眼病＂是指眼部病状、疾病或综合征，包括(但不限于)包含脉络 膜新生血管(CNV)、湿式及干式AMD、眼部组织浆菌病综合征、血管样 条纹、布鲁赫氏膜破裂、近视性变性、眼部肿瘤、视网膜退化疾病及 视网膜静脉阻塞(RVO)的任何病状。在本文所陈述的定义下，本发明方 法可治疗的本文所揭示的某些病状(诸如DR)已视作微血管病症及眼病 或两者。
与本发明相关的听力障碍可归因于涉及内耳毛细胞的末梢器官损 害，例如声创伤、病毒性内淋巴迷路炎、美尼尔氏病(Meniere′s disease)。听力障碍包括耳鸣，耳鸣是在声刺激缺乏下声音的感知且 可为间歇或连续的，其中诊断出感觉神经损失。听力损失可归因于细 菌或病毒感染，诸如耳带状疱疹、源于急性中耳炎的化脓性迷路炎、 化脓性脑膜炎、慢性中耳炎、特发性耳聋(包括病毒来源的特发性耳聋， 例如由病毒引起的病毒性内淋巴迷路炎，包括腮腺炎、麻疹、流行性 感冒、水痘、单核细胞增多症及腺病毒)中。听力损伤可为先天的，诸 如由风疹、出生期间缺氧、血液渗至内耳(归因于分娩期间的外伤)、 给药于母亲的耳毒性药物、胎儿红血球母细胞增多症及遗传性病状(包 括瓦登伯格氏综合征(Waardenburg′s syndrome)及贺勒氏症 (Hurler′s syndrome))引起的听力损失。听力损失可由噪声诱发，一 般归因于大于约85分贝(db)的破坏内耳的噪声。听力损失优选应由影 响内耳的听力部分(尤其内耳毛细胞)的声创伤或耳毒性药物引起。The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第14版，(1982)，Merck Sharp & Dome Research Laboratories，N.J.的196、197、198及199 章及最近第16版的相应章节(包括207及210章)涉及听力及平衡障碍的 描述及诊断，其以引用的方式并入本文。
不受理论限制，本发明内容中待治疗或预防的听力障碍(或平衡障 碍)优选为耳毒素或外伤诱发的对内耳毛细胞造成的细胞凋亡损害。需 治疗的患者包括已经历听力障碍的人、倾向于患有障碍的人及待预防 障碍的人。不受理论限制，听力障碍可归因于细胞凋亡性内耳毛细胞 损害或损失，其中由感染、机械损伤、大的声音、年老或化学药品诱 发的耳毒性引起损害或损失。耳毒素包括治疗药物，包括抗赘生剂、 水杨酸盐、奎宁及氨基糖苷抗生素、食品或药物污染物及环境或工业 污染物。通常应实施治疗以预防或减少尤其源自或期望源自治疗药物 的给药或暴露于包括诱发声创伤的环境的耳毒性或声创伤。治疗有效 组合物优选应在暴露后立即给予以预防或减少耳毒作用或外伤作用。 更优选应藉由在给药耳毒性药物或暴露于耳毒素或诱发声创伤的环境 之前或同时给药组合物来预防治疗。
听力障碍可由化学疗法诱发。具体说，听力障碍可由诸如依托泊 苷、5-FU(5-氟尿嘧啶)、顺铂、阿霉素、长春花属生物碱、长春新碱、 长春碱、长春瑞宾、紫杉醇、环磷酸胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、 白消安、氮芥、丝裂霉素、达卡巴嗪、卡铂、塞替派、柔红霉素、伊 达比星、米托蒽醌、博来霉素、埃斯波霉素Al、放线菌素D、普卡霉素、 卡莫司汀、洛莫司汀、牛磺莫司汀、链佐星、美法仑、放线菌素D、丙 卡巴肼、地塞米松、泼尼松、2-氯脱氧腺苷、阿糖胞苷、多烯紫杉醇、 氟达拉滨、吉西他滨、赫赛汀、羟基尿、伊立替康、甲胺喋呤、奥沙 利铂、瑞土星(rituxin)、司莫司汀、表柔比星、依托泊苷、雷替曲塞 及拓朴替康的化学治疗剂或这类化学治疗剂之一的化学类似物引起。 最可能引起听力障碍的化学治疗剂为顺铂及类顺铂化合物。
在本发明内容中，＂耳毒素＂意谓经由化学作用而损伤、损害或抑 制与听力相关的神经系统的声音接受器，继而损害听力(和/或平衡) 的活性的物质。在本发明的内容中，耳毒性包括对内耳毛细胞的不利 影响。引起听力障碍的耳毒性药剂包括(但不限于)赘生性药剂(诸如长 春新碱、长春碱、顺铂及类顺铂化合物、紫杉醇及类紫杉醇化合物、 双脱氧化合物(例如双脱氧肌苷))、醇类、金属、涉及工作或环境暴露 的工业毒素、食品或药物污染物及过多剂量的维生素或治疗药物(例如 抗生素，诸如盘尼西林或氯霉素)及大剂量的维生素A、D或B6、水杨酸 盐、奎宁及髓袢利尿剂。＂暴露于耳毒性药剂＂意谓耳毒性药剂可为哺 乳动物所得或接触哺乳动物。暴露于耳毒性药剂可藉由直接给药而发 生，例如藉由摄取或给药食品、药物或治疗剂(例如化学治疗剂)、藉 由意外污染或藉由环境暴露(例如空气或水暴露)而发生。
＂RTP801基因＂是指编码如图1中所示的序列开放阅读框架(SEQ ID NO：1)或优选具有至少70％同一性、更优选80％同一性、甚至更优选90％ 或95％同一性的其任一同源序列的RTP801。此包含衍生自SEQ ID NO：1 的任何序列，该序列已经历如本文所述的突变、变化或修饰。因此， 在一优选实施例中，RTP801藉由根据SEQ ID NO：1的核酸序列编码。亦 在本发明内，本发明的核酸仅互补且分别与编码RTP801的核酸部分一 致，因为第一链段及第一链通常优选应短于本发明的核酸。亦应了解 基于RTP801的氨基酸序列，编码该氨基酸序列的任何核酸序列均可藉 由本领域技术人员基于遗传密码来了解。然而，归因于本发明核酸的 假定作用模式，编码RTP801的核酸、优选地其mRNA最佳应为分别存在 于有机体、组织和/或细胞中者，其中RTP801的表达将减少。
＂RTP801多肽＂是指RTP801基因的多肽，且应了解为获得本发明的 目的，其包括术语＂RTP779＂、＂REDD1＂、＂Ddit4＂、＂FLJ20500＂、＂Dig2＂ 及＂PRF1＂，其衍生自任一有机体(任选为人)、保持生物活性的剪接变 异体及其片段及优选具有至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少 90％或95％同源性的其同源物。此外，应了解此术语包含源自RTP801编 码序列的较小改变的多肽，诸如可引起所得多肽与天然产生的RTP801 之间的若干氨基酸不同的点突变、取代、缺失及插入。此术语亦包含 藉由在高严格杂交条件下结合RTP801编码序列或基因组序列的核苷酸 序列编码的多肽，该多肽已为本领域技术人员所熟知(例如Ausubel等 人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons， Baltimore，Maryland(1988)，1995及1998修正)。只要保留生物活 性，则经化学修饰的RTP801或经化学修饰的RTP801片段亦包括在此术 语中。RTP801优选应具有或包含根据SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。 应了解，在有机体的不同组织中及一种物种的不同有机体中或在本发 明的多个实施例中可应用本发明核酸的不同物种中，氨基酸序列可能 存在差异。然而，当设计本发明的任何核酸时，基于本文所提供的技 术教导，因此可考虑个别序列。RTP801的特定片段包括图2中所示的氨 基酸1-50、51-100、101-150、151-200及201-232序列。RTP801的其 它特定片段包括图2中所示的氨基酸25-74、75-124、125-174、175-224 及225-232序列。如本文所用的RTP801为WO 99/09046中所述的蛋白。 亦称为RTP801的RTP801已由ShoshaniT等人描述为HIF-1α的转录目 标(Shoshani等人，2002，Mol Cell Biol，22，2283-93)。此外，Ellisen 等人的研究(Ellisen等人，Mol Cell，10，995-1005)已鉴别出RTP801 为p53依赖性DNA损害回应基因且为涉及上皮细胞分化的p63依赖性基 因。又，RTP801反映了组织特异性类型的p53家族成员p63，有效类似 于TP63或除TP63外亦为活体外分化的抑制剂，且涉及活性氧的调节。 此外，RTP801响应低氧反应转录因子低氧诱发因子1(HIF-1)且通常在 缺血性中风的动物模型中于活体外及活体内低氧期间经上调。RTP801 似乎在活性氧(ROS)的调节中起作用，且ROS含量及减少的对氧化应力 的敏感性均随着异常表达RTP801而增加(前述的Ellisen等人，2002； 前述的Soshani等人，2002)。RTP801优选为生物活性RTP801蛋白，其 优选显示那些特征中的至少之一，优选两种或两种以上且最佳每一个 及这类特征中的任一个。
不受理论限制，应力诱发蛋白RTP801(回应低氧、氧化应力、热应 力、ER应力)是在细胞回应能量不平衡的微调中起作用的因子。同样， 目标为适于治疗应从归因于应力条件的细胞凋亡救出细胞的任何疾病 (例如伴随正常细胞死亡的疾病)或适应归因于RTP801表达的改变的应 力条件的细胞(例如癌细胞)应被杀死的任何疾病。在后一情形下， RTP801可视作癌细胞的存活因子，且其抑制剂可作为单独疗法或作为 与化学疗法或放射疗法组合的敏化药物来治疗癌症。
术语＂聚核苷酸＂是指包含DNA核苷酸、RNA核苷酸或两种类型的组 合的任何分子，亦即包含碱基胍、胞嘧啶、胸苷、腺嘌呤、尿嘧啶或 肌苷中的两者或两者以上的分子。聚核苷酸可包括天然核苷酸、经化 学修饰的核苷酸及合成核苷酸或其化学类似物。术语包括＂寡核苷酸＂ 且包含＂核酸＂。
术语＂氨基酸＂是指由20个天然产生的氨基酸、经化学修饰的氨基 酸(参见下文)或合成氨基酸的任一个组成的分子。
术语＂多肽＂是指包含两个或两个以上氨基酸残基的分子。该术语 包括肽、多肽、蛋白及肽模拟物。
＂肽模拟物＂为含有非肽结构元素的化合物，其能够模拟天然亲本 肽的生物作用。某些经典肽特征(诸如酶裂解肽键)通常并不存在于肽 模拟物中。
术语＂显性阴性肽＂意谓藉由编码一部分蛋白的cDNA片段编码的多 肽(参见Herskowitz I.：Functional inactivation of genes by dominant negative mutations.Nature.1987年9月17-23； 329(6136)：219-22.Review；Roninson IB等人，Genetic suppressor elements：new tools for molecular oncology--thirteenth Cornelius P.Rhoads Memorial Award Lecture.Cancer Res.1995 年9月15日；55(18)：4023)。此肽可具有不同于衍生其的蛋白的功能。 其可与完整蛋白相互作用且抑制蛋白活性，或其可与其它蛋白相互作 用且抑制蛋白活性以响应全长(亲本)蛋白。显性阴性意谓肽能对抗天 然亲本蛋白且抑制其活性以给予细胞不同特征，诸如对死亡或所关注 的任何细胞表型的对抗或敏化。针对治疗介入，肽自身可作为药物组 合物的活性成份来传递，或可利用已知方法将cDNA传递至细胞。
肽及多肽的制备
多肽可经由若干方法而产生，例如：
1)合成：
合成多肽可使用市售机器使用RTP801或其部分的已知序列来制 成。
2)重组方法：
制成RTP801多肽或其片段的优选方法是将包含RTP801基因的cDNA 的聚核苷酸克隆至表达载体中且培养具有该载体的细胞以表达经编码 的多肽，且接着纯化所得多肽，其中所有步骤均使用本领域已知的方 法执行，举例而言，如Marshak等人，＂Strategies for Protein Purification and Characterization.A laboratory course manual. ＂CSHL Press(1996)(另外参见Bibl Haematol.1965；23：1165-74 Appl Microbiol.1967年7月；15(4)：851-6；Can J Biochem.1968 年5月；46(5)：441-4；Biochemistry.1968年7月；7(7)：2574-80；Arch Biochem Biophys.1968年9月10日；126(3)：746-72；Biochem Biophys Res Commun.1970年2月20日；38(4)：825-30)中所述的方法。
表达载体可包括用于控制异源物质转录的启动子，且可为构成或 诱发启动子以允许选择性转录。任选可包括可要求用以获得必要转录 程度的增强子。表达载体(expression vehicle)亦可包括选择基因。
载体可藉由本领域已知的多种方法中的任一种而引入细胞或组织 中。可发现该方法一般描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York (1989，1992)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Vega 等人，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)，Vectors： A Surveyo f Molecular Cloning Vectors and Their Uses， Butterworths，Boston MA(1988)及Gilboa等人(1986)中。
3)自天然来源纯化：
RTP801多肽或其天然产生片段可使用本领域技术人员已知的多种 方法自天然来源(诸如组织)纯化，该方法诸如：用抗RTP801抗体免疫 沉淀或用已知结合RTP801的任一分子进行基质结合的亲和层析。
如本领域已知来实施蛋白纯化，举例而言，如Marshak等人， ＂Strategies for Protein Purification and Characterization.A laboratory course manual.＂CSHL Press(1996)所述。
＂RTP801的生物效应＂或＂RTP801生物活性＂意谓RTP801在呼吸病症 中的作用，该作用可为直接或间接的，且不受理论限制，其包括RTP801 对由低氧或高氧条件诱发的肺泡细胞的细胞凋亡的作用。间接作用包 括(但不限于)RTP801结合涉及导致细胞凋亡的信号传递级联的若干分 子之一或作用于其。
＂细胞凋亡＂是指生理学类型的细胞死亡，其源自某些细胞机制的 活化，亦即藉由细胞机构控制的死亡。细胞凋亡可为(例如)藉由导致 细胞死亡之外部触发(例如细胞因子或抗FAS抗体)或藉由内部信号活 化细胞机构的结果。术语＂渐进式细胞死亡＂亦可与＂细胞凋亡＂交替使 用。
＂细胞凋亡相关的疾病＂是指病源学与细胞凋亡过程完全或部分相 关的疾病。该疾病可由细胞凋亡过程的功能障碍(诸如在癌症或自体免 疫疾病中)或由细胞凋亡过程的过度活性引起(诸如在某些神经退化疾 病中)。RTP801涉及的多种疾病为细胞凋亡相关的疾病。举例而言，细 胞凋亡为干式AMD的重要机制，主要在视网膜的中心(黄斑)区域中的感 光体及色素上皮细胞发生缓慢萎缩。神经视网膜细胞凋亡亦为糖尿病 性视网膜病的重要机制。
＂抑制剂＂为一种能够抑制基因或该基因产物的活性至足以获得所 需生物或生理作用程度的化合物。＂RTP801抑制剂＂为一种能够抑制 RTP801基因或RTP801基因产物、尤其人类RTP801基因或基因产物活性 的化合物。该抑制剂包括影响基因转录或转译的物质以及影响基因产 物活性的物质。RTP801抑制剂亦可为RTP801启动子的抑制剂。该抑制 剂的实例可包括聚核苷酸(诸如AS片段、siRNA或包含其的载体)、多肽 (诸如显性阴性肽、抗体及酶)、催化性RNAs(诸如核糖核酸酶)及低分 子量(例如低于2000道尔顿的分子量)的化学分子。特异性RTP801抑制 剂述于下文。
＂表达载体＂是指能够并入且表达外来细胞中的异源DNA片段的载 体。多种原核及真核表达载体为已知和/或可购得。适当表达载体的 选择是在本领域技术人员的知识内。
术语＂抗体＂尤其是指IgG、IgM、IgD、IgA及IgE抗体。该定义包括 多克隆抗体或单克隆抗体。此术语是指全抗体或包含抗原结合域的抗 体片段(例如无Fc部分的抗体、单链抗体、微小抗体、基本上仅由抗体 的可变抗原结合域组成的片段等)。术语＂抗体＂亦可指对抗cDNA疫苗 接种所获得的聚核苷酸序列的抗体。该术语亦包含保留选择性结合抗 原或受体的能力的抗体片段，例示如下：
(1)Fab，含有可藉由用木瓜蛋白酶消化全抗体以产生轻链及一部 分重链而产生的抗体分子的单价抗原结合片段的片段；
(2)(Fab′)2，可藉由用胃蛋白酶处理全抗体而无后续还原所获得 的抗体片段；F(ab′2)为藉由两个双硫键固持于一起的两个Fab片段的 二聚体；
(3)Fv，定义为含有表达为两条链的轻链可变区及重链可变区的 基因工程片段；及
(4)单链抗体(SCA)，定义为含有藉由适合多肽连接体键联的轻链 可变区及重链可变区的作为基因融合单链分子的基因工程分子。
微型抗体及微体亦包括于此术语中。微体为具有假节结构的极小 (通常约28-45个氨基酸)蛋白，该微体具有高度选择性且稳定。因此， 本文所揭示的包括抗体的任一应用及新颖化合物均可包括微型抗体或 微体以替代作为分子的抗体部分。
如本发明所用的术语＂抗原决定簇＂意谓抗体结合的抗原上的抗原 决定子。抗原决定性决定子常由化学活性表面分子的组(诸如氨基酸或 糖侧链)组成且常具有特异性三维结构特征以及特定电荷特征。
抗RTP801抗体的制备
结合RTP801的抗体或衍生自其的片段可使用完整多肽或含有更小 多肽作为免疫抗原的片段来制备。举例而言，可需要产生特异性结合N 末端或C末端或RTP801的任何其它适合域的抗体。用以免疫动物的多肽 可衍生自经转译的cDNA或化学合成，且必要时可结合载体蛋白。该与 多肽化学偶联的通用载体包括钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋 白、牛血清白蛋白(BSA)及破伤风类毒素。接着，将经偶联的多肽用于 免疫动物。
举例而言，必要时可藉由结合到基质并从基质洗脱来进一步纯化 多克隆或单克隆抗体，所述基质上结合有产生所述抗体的多肽或肽。 本领域技术人员应了解用于纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗 体的免疫学中常见的各种技术(Coligan等人，第9单元，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1994)。
用于产生所有类型的抗体(包括片段)的方法在本领域已知(例如， 参见Harlow及Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988))。包括在适合佐剂中制备免 疫原、确定抗体结合、分离抗体、用于获得单克隆抗体的方法及人源 化单克隆抗体的所有必要步骤的免疫方法均为熟练技工所知。
抗体可为人源化抗体或人类抗体。可使用本领域已知的多种技术 来人源化抗体，包括CDR-移植(EP239,400：PCT公开案WO.91/09967； 美国专利第5,225,539、5,530,101及5,585,089号)、镶饰(veneering) 或重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等人，PNAS 91：之内-973 (1994))及链改组(美国专利第5,565,332号)。
所定义的单克隆抗体包括衍生自一种物种(诸如鼠科动物、兔、山 羊、大鼠、人类等)的抗体以及衍生自两种(或两种以上)物种的抗体， 诸如嵌合及人源化抗体。
具体地说，完全人类抗体来治疗人类患者是特别理想的。人类抗 体可藉由本领域已知的多种方法而产生，该方法包括使用衍生自人类 免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示技术。亦参见美国专利第 4,444,887号及第4,716,111号及PCT公开案WO 98/46645、WO98/50433、 WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741， 其各自均以全文引用的方式并入本文。
关于所有类型抗体(包括人源化抗体、人类抗体及抗体片段)的额 外信息可见于WO 01/05998，其以全文引用的方式并入本文。
中和抗体可藉由上文所讨论的方法来制备，可能存在藉由(例如) 存活检定来筛检中和活性的额外步骤。
术语＂化合物＂、＂小分子＂、＂化学分子＂、＂小化学分子＂及＂小化合 物＂在本文中可交替使用，且应了解其是指可合成产生或自天然来源获 得且通常具有少于2000道尔顿、少于1000道尔顿或甚至少于600道尔顿 的分子量的任何特定类型的化学部分。
本发明亦涉及包含双链结构的功能核酸、其用于制造药剂的用途、 包含该功能核酸的药物组合物及用于治疗患者的方法。
低氧已被视为大量疾病的病理机制的关键元素，诸如与次佳氧可 用性及响应低氧条件的组织损伤相关的中风、气肿及梗塞。在包括肿 瘤的快速生长组织中，次佳氧可用性藉由不良新血管生成补偿。因此， 至少在癌症的情形下，并不需要脉管结构的生长。
因此，血管生成及血管生长的抑制分别经受密集型研究。目前， 已可获得某些抑制不良血管生成及血管生长的化合物。某些更显著的 化合物是抑制VEGF及VEGF受体的化合物。在两种情形下，VEGF的作用 应藉由阻断VEGF(例如藉由使用对抗诸如由Genentech的阿伐司汀 (AVASTIN，特异性针对VEGF的单株AB)购买的VEGF的抗体)(Ferrara N； Endocr Rev.2004年8月；25(4)：581-611)或藉由阻断相应受体(亦即 VEGF受体)(Traxler P，Cancer Res.2004年7月15日；64(14)：4931-41 或Stadler WM等人，Clin Cancer Res.2004年5月15日； 10(10)：3365-70)来避免。
然而，因为血管生成及脉管结构生长为任何动物及人类中极其基 本且重要的过程，所以必须关注此种化合物在实际上并不需要血管生 成及血管生长的特定位点的作用，此给予适当的目标靶向或传递(与此 种治疗方法相关的关键性问题)。
因此，本发明的目标是提供用于治疗分别涉及不良脉管结构生长 及血管生成的疾病的其它方法。
＂小干扰RNA＂(siRNA)意谓一种RNA分子，其减少其内源性细胞对应 物的基因/mRNA表达或使其沉默(预防)。应了解该术语包含＂RNA干扰 ＂(RNAi)。RNA干扰(RNAi)是指藉由小干扰RNA(siRNA)介导的哺乳动物 中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，1998，Nature391. 806)。植物中的相应过程通常称为特异性转录后基因沉默或RNA沉默， 且亦称为压制真菌。RNA干扰反应可表征含有siRNA的核酸内切酶复合 物，该复合物通常称为RNA诱发的沉默复合物(RISC)，其介导具有siRNA 双链体反义链的互补序列的单链RNA的裂解。靶向RNA的裂解可发生在 siRNA双链体反义链的互补区域的中部(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，15，188)。关于这类术语及所陈述的机制的近期信息，参见 Bernstein E.，Denli AM.，Hannon GJ：The rest is silence.RNA. 2001年11月；7(11)：1509-21及Nishikura K.：A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst.Cell. 2001年11月16日；107(4)：415-8。可用于本发明的siRNA分子的实例在 表A-D中给出。
近年间，RNAi已呈现为用于基因失活的最有效方法之一(Nature Reviews，2002，第3卷，第737-47页；Nature，2002，第418页，第 244-51页)。作为一种方法，RNAi是基于dsRNA物质进入特定蛋白复合 物的能力，其在该蛋白复合物中继而靶向互补细胞RNA且特异性使其降 解。具体说，藉由III型RNAse(DICER、Drosha等)将dsRNA消化成短 (17-29bp)的抑制性RNA(siRNA)(Nature，2001，409卷，第363-6页； Nature，2003，425卷，第415-9页)。这类片段及互补mRNA应藉由特 定RISC蛋白复合物来识别。整个过程是藉由靶向mRNA的核酸内切酶裂 解来结束(Nature Reviews，2002，第3卷，第737-47页；Curr Opin Mol Ther.2003年6月；5(3)：217-24)。
关于如何设计及制备已知基因的siRNA的揭示内容，参见(例 如)Pei & Tuschl On the Art of Identifying Effective and Specific siRNAs Nature Methods 3 No.9，2006年9月；Chalk AM，Wahlestedt C，Sonnhammer EL.Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem.Biophys.Res.Commun.2004年6月18日； 319(1)：264-74；Sioud M，Leirdal M.，Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs，Methods Mol Biol.2004；252：457-69；Levenkova N，Gu Q，Rux JJ.：Gene specific siRNA selector Bioinformatics.2004年2月12日；20(3)：430-2；及 Ui-Tei K，Naito Y，Takahashi F，Haraguchi T，Ohki-Hamazaki H， Juni A，Ueda R，Saigo K.，Guidelines for the se l ection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res.2004年2月9日；32(3)：936-48。 亦参见Liu Y，Braasch DA，Nulf CJ，Corey DR.Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids Biochemistry，2004年2月24日；43(7)： 1921-7。亦参见用于产生经修饰/更稳定siRNA的PCT公开案WO 2004/015107(Atugen)及WO02/44321(Tuschl等人)以及Chiu YL，Rana TM.siRNA function in RNAi：a chemical modification analysis， RNA2003年9月；9(9)：1034-48及美国专利第5898031号及第6107094 号(Crooke)。
已发展能够在细胞内产生siRNA的以DNA为主的载体。该方法一般 包括转录经有效加工以在细胞内形成siRNA的短的发夹型RNA。 Paddison等人，PNAS2002，99：1443-1448；Paddison等人，Genes & Dev 2002，16：948-958；Sui等人，PNAS 2002，8：5515-5520及 Brummelkamp等人，Science 2002，296：550-553。这类报导描述了产 生能够特异性靶向经内源性及外源性表达的基因的siRNA的方法。
关于siRNA的传递，参见(例如)Shen等人(FEBS letters 539： 111-114(2003))；Xia等人，Nature Biotechnology 20：1006-1010 (2002)；Reich等人，Molecular Vision 9：210-216(2003)；Sorensen 等人(J.Mol.Biol.327：761-766(2003))；Lewis等人，Nature Genetics 32：107-108(2002)；及Simeoni等人，Nucleic Acids Research 31，11：2717-2724(2003)。近来，siRNA已成功用于灵长 类动物中的抑制作用；进一步详述参见Tolentino等人，Retina 24(1)， 2004年2月，第132-138页。
本发明的siRNA
本发明siRNA的总体说明
一般而言，本发明所用的siRNA包含核糖核酸，该核糖核酸包含双 链结构，其中双链结构包含第一链及第二链，其中第一链包含第一连 续核苷酸链段且其中该第一链段至少部分互补于靶向核酸，且第二链 包含第二连续核苷酸链段且其中该第二链段至少部分与靶向核酸一 致，其中该第一链和/或该第二链包含复数个经修饰核苷酸的组，该核 苷酸在2′位上具有修饰，其中在该链内各组经修饰的核苷酸通过核苷 酸的侧翼基团侧接于核苷酸的一或两侧，其中形成该组侧接核苷酸的 侧接核苷酸为未经修饰的核苷酸或具有不同于经修饰核苷酸的修饰的 核苷酸。此外，该第一链和/或该第二链可包含该复数个经修饰核苷酸 且可包含该复数个组的经修饰核苷酸群。
经修饰核苷酸的组和/或侧接核苷酸的组可包含大量核苷酸，其中 数目是选自包含1个核苷酸至10个核苷酸的组。结合本文所说明的任何 范围，应了解各范围揭示在用以界定包括界定该范围的该两个数字的 范围的个别数字之间的任一个别整数。因此，在本发明情形下，该组 包含一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸、五个核苷 酸、六个核苷酸、七个核苷酸、八个核苷酸、九个核苷酸及十个核苷 酸。
该第一链的经修饰核苷酸类型可与该第二链的经修饰核苷酸类型 相同，且可与该第二链的类型对准。此外，该第一链的类型可藉由相 对于第二链类型的一种或多种核苷酸而改变。
上文所讨论的修饰可选自包含胺基、氟基、甲氧基、烷氧基及烷 基的组。
可使一侧或两侧的siRNA双链结构末端平整。更明确言之，可使由 第一链的5′末端及第二链的3′末端界定的双链结构侧的双链结构末端 平整，或可使由第一链的3′末端及第二链的5′末端界定的双链结构侧 的双链结构末端平整。
此外，两条链中的至少之一可在5′末端具有至少一个核苷酸的悬 垂物；该悬垂物可由至少一个脱氧核糖核苷酸组成。该链中的至少之 一亦可任选在3′末端具有至少一个核苷酸的悬垂物。
siRNA双链结构的长度通常为约17至21个碱基且更优选为18或19 个碱基。此外，该第一链的长度和/或该第二链的长度可彼此独立地选 自包含约15至约23个碱基、17至21个碱基及18或19个碱基的范围的组。
此外，极佳地可在该第一链与靶向核酸之间形成互补，或形成于 第一链与靶向核酸之间的双链体可包含至少15个核苷酸，其中形成该 双链结构的该第一链与靶向核酸之间存在一个错配或两个错配。
在某些情形下，第一链及第二链各包含至少一组经修饰核苷酸及 至少一组侧接核苷酸，其中各组经修饰核苷酸包含至少一个核苷酸且 其中各组侧接核苷酸包含至少一个核苷酸，其中第一链的各组经修饰 核苷酸与第二链的侧接核苷酸的组对准，其中第一链的最末端5′核苷 酸为经修饰核苷酸的组的核苷酸，且第二链的最末端3′核苷酸为侧接 核苷酸的组的核苷酸。各组经修饰核苷酸可由单个核苷酸组成和/或各 侧接核苷酸的组可由单个核苷酸组成。
此外，在第一链上形成侧接核苷酸的组的核苷酸可能为相对于形 成经修饰核苷酸的组的核苷酸排列在3′方向的未经修饰核苷酸，且在 第二链上形成经修饰核苷酸的组的核苷酸可能为相对于形成侧接核苷 酸的组的核苷酸排列在5′方向的经修饰核苷酸。
此外，siRNA的第一链可包含8至12个、优选9至11个组的经修饰核 苷酸，且第二链可包含7至11个、优选8至10个经修饰核苷酸的组。
第一链与第二链可藉由可包含非核酸聚合物(诸如聚乙二醇)的环 结构键联。或者，环结构可包含核酸。
此外，siRNA第一链的5′末端可键联至第二链的3′末端，或第一链 的3′末端可键联至第二链的5′末端，该键联是经由长度在10-2000个核 碱基(nucleobase)之间的核酸连接体。
本发明siRNA的特定说明
本发明提供具有以下结构(结构A)的化合物：
5′(N)x-Z3′(反义链)
3′Z′-(N′)y5′(有义链)
其中各N及N′为糖残基中可经修饰或未经修饰的核糖核苷酸，且 (N)x及(N′)y为各连续N或N′藉由共价键接合另一N或N′的寡聚物；
其中x及y的每一个均为19与40之间的整数；
其中Z及Z′的每一个均可存在或不存在，但若存在，则可为dTdT且 共价连接在其所存在的链的3′末端；
且其中(N)x序列包含RTP801基因的cDNA的互补序列。
具体说，本发明提供上文化合物，其中(N)x序列包含一或多种存在 于表A、B、C及D、尤其表D中的反义序列。
具体说，本发明提供上文化合物，其中共价键为磷酸二酯键，其 中x＝y，优选地其中x＝y＝19，其中Z及Z′均缺乏，其中至少一种核糖核 苷酸在其糖残基中的2′位上经修饰，其中2′位上的部分为甲氧基 (2′-O-甲基)，其中交替核糖核苷酸在反义链及有义链中均经修饰，且 其中反义链的5′及3′末端上的核糖核苷酸在其糖残基中经修饰，且有 义链的5′及3′末端上的核糖核苷酸在其糖残基中未经修饰。
具体说，用于本发明的siRNA为寡核糖核苷酸，其中一条链包含具 有SEQ ID NO：3-52或SEQ ID NO：103-174或SEQ ID NO：247-295或 SEQ ID NO：345-440(有义链)中所陈述的5′至3′序列的连续核苷酸(其 中复数个碱基可优选藉由2-O-甲基修饰来修饰)或其同系物，其中在多 达2个核苷酸中各末端区域中的碱基均改变。
此外，本发明提供一种用于治疗罹患呼吸病症、眼病、微血管病 症、听力障碍、褥疮或其它卧床不起相关的皮肉伤或脊髓损伤或疾病 的患者的方法，该方法包括将治疗有效量的包含上文结构(A)的化合物 (具有上文提及的任一特性)的药物组合物给药于患者以藉此治疗患 者。此外，本发明亦提供治疗有效量的上文结构(A)(具有上文提及的 任一特性)用于制备用于促进罹患呼吸病症、眼病、微血管病症、听力 障碍、褥疮或其它卧床不起相关的皮肉伤或脊髓损伤或疾病的患者恢 复的药剂的用途。
本发明的另一方面提供包含上文结构(A)的化合物的药物组合物， 其用于治疗本文所提及的任何疾病及病状。
此外，此方面亦提供包含两种或两种以上上文结构(A)的化合物的 药物组合物以治疗本文所提及的任何疾病及病状，其中在药物组合物 中该两种化合物可以产生相同或有益活性的量以物理方式混合于一 起，或可藉由长度介于2-100、优选2-50或2-30个核苷酸之间的核酸连 接体共价或非共价结合或接合于一起。因此，该siRNA分子包含如本文 所述的双链核酸结构，其中选自表A-D且优选选自表A ID No：14、22、 23、25、27、39、41、42、49及50或表D的siRNA No：257、260-262 及264-268的两个siRNA序列是藉由连接体共价或非共价结合或接合以 形成串联siRNA分子。该包含两个siRNA序列的串联siRNA分子通常具有 38-150个核苷酸的长度，更优选具有38或40-60个核苷酸的长度，且若 串联分子中包括两个以上siRNA序列，则因此长度更长。包含两个或两 个以上编码经由内部细胞加工而产生的siRNA的较长序列的较长串联 分子(例如，长dsRNA)亦被视作编码两个或两个以上shRNA的串联分子。 该串联分子亦被视为本发明的部分，且关于其的其它信息在下文中给 出。
该经组合或串联的结构具有各siRNA的毒性和/或脱靶效应最小化 而效率增加的优势。
具体地说，用于实例中的siRNA已经修饰，使得2′-O-Me基团存在 于反义链的第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十 五、第十七及第十九核苷酸上，其中存在极类似修饰，亦即2′-O-Me 基团存在于有义链的第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十 四、第十六及第十八核苷酸上。此外，应注意在本发明的这类特定核 酸情形下，第一链段与第一链一致且第二链段与第二链一致，且这类 核酸亦经末端平整化。虽然所用的siRNA已经磷酸化，但观察到未经磷 酸化的形式可更易于大规模制备且发现CNV模型中该未经磷酸化的 REDD14(称为REDD-14NP)与REDD-14具有相同生物活性(参见实施例 6)。用于实施例6-8的实验中的此siRNA序列为REDD14的序列，亦即具 有内部参考号14的序列(参见表A)。实施例14的实验中所用的siRNA称 为801_1及801_4；801_1在表D中具有内部参考号257(SEQ ID NO：429 [有义]及525[反义])且801_4在表D中具有内部参考号260(SEQ ID NO：432[有义]及528[反义])(参见表D)。
该sRNA亦可经磷酸化或未经磷酸化。
寡核苷酸的末端区域是指19-mer序列中的碱基1-4和/或16-19(下 文表A、B及D)及21-mer序列中的碱基1-4和/或18-21(下文表C)。
此外，本发明所使用的siRNA为寡核糖核苷酸，其中一条链包含具 有SEQ ID NO：53-102或SEQ ID NO：175-246或SEQ ID NO：296-344 或SEQ ID NO：441-536(反义链)中所陈述的5′至3′序列的连续核苷酸或 其同系物，其中在多达2个核苷酸中各末端区域中的碱基均改变。
因此，在特定方面中，寡核苷酸包含双链结构，其中该双链结构 包含第一链及第二链，其中第一链包含第一连续核苷酸链段且第二链 包含第二连续核苷酸链段，其中第一链段与编码基因RTP801的核酸序 列互补或一致且其中第二链段与编码RTP801的核酸序列一致或互补。 该第一链段包含至少14个核苷酸、优选至少18个核苷酸且甚至更优选 19个核苷酸或甚至至少21个核苷酸。在一实施方式中，第一链段包含 约14至40个核苷酸，优选约18至30个核苷酸，更优选约19至27个核苷 酸且最佳约19至23个核苷酸。在一实施方式中，第二链段包含约14至 40个核苷酸，优选约18至30个核苷酸，更优选约19至27个核苷酸且最 佳约19至23个核苷酸或甚至约19至21个核苷酸。在一实施方式中，第 一链段的第一核苷酸对应于编码RTP801的核酸序列的核苷酸，其中第 一链段的最终一个核苷酸对应于编码RTP801的核酸序列的核苷酸。在 一实施方式中，第一链段包含寡核苷酸的至少14个连续核苷酸序列， 其中该寡核苷酸是选自包含SEQ.ID.No：3-536的组，优选选自包含 具有表A中序号14、22、23、25、27、39、41、42、49及50或表D中序 号260-262及264-268中的任一个的序列的寡核苷酸的组。此外，本发 明所用的siRNA分子的说明可提供寡核糖核苷酸，其中二核苷酸dTdT 共价连接至3′末端，和/或在至少一个核苷酸中糖残基可能经包含 2′-O-甲基修饰的修饰来修饰。此外，2′OH基团可经选自包含-H-OCH3、 -OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-NH2及F的组的基团或部分置换。此外，如上 文所揭示的本发明的优选化合物可经磷酸化或未经磷酸化。
此外，本发明所用的siRNA可为寡核糖核苷酸，其中在交替核苷酸 中经修饰的糖定位于两条链中。具体地说，寡核糖核苷酸可包含一条 有义链，其中末端5′及3′核苷酸中糖未经修饰；或一条反义链，其中 末端5′及3′核苷酸中糖经修饰。
此外，本发明欲用的其它核酸包含SEQ.ID.NO：3至536的任一个 的至少14个连续核苷酸，且更优选包含在包含如上文所述的第一链段 及第二链段的双链结构的任一末端处的14个连续核苷酸碱基对。本领 域技术人员应了解，给定本发明核酸及尤其形成本发明的该核酸的个 别链段的潜在长度，对各侧面而言有可能存在相对于如SEQ IDNO：1 中详述的RTP801基因的编码序列的某些转变，其中在两个方向上该转 变可多达1、2、3、4、5及6个核苷酸，且其中因此产生的双链核酸分 子亦应在本发明内。
本发明的另一方面涉及包含双链结构的功能核酸，其中该双链结 构包含第一链及第二链，其中第一链包含第一连续核苷酸链段且第二 链包含第二连续核苷酸链段，其中第一链段与编码RTP801的核酸序列 互补或一致且其中第二链段与编码RTP801的核酸序列一致或互补。
在一实施方式中，核酸下调RTP801，其中RTP801的下调是选自包 含RTP801功能下调、RTP801蛋白下调及RTP801 mRNA表达下调的组。
在一实施方式中，第一链段包含至少14个核苷酸、优选至少18个 核苷酸且甚至更优选19个核苷酸。
在一实施方式中，第一链段包含约14至40个核苷酸，优选约18至 30个核苷酸，更优选约19至27个核苷酸且最佳约19至23个核苷酸。
在一实施方式中，第二链段包含约14至40个核苷酸，优选约18至 30个核苷酸，更优选约19至27个核苷酸且最佳约19至23个核苷酸。
在一实施方式中，第一链段的第一核苷酸对应于编码RTP801的核 酸序列的核苷酸，其中第一链段的最终一个核苷酸对应于编码RTP801 的核酸序列的核苷酸。
在一实施方式中，一条链段包含核酸序列的至少14个连续核苷酸 的序列，其中该核酸序列是选自表A-D中所揭示的序列，优选选自包含 SEQ.ID.NO：53、66、67、72、73、74、75、76、77、91、92、93、 94、96、101、102、525、528、529、530、532、533、534、535及536 的组，更优选选自包含SEQ.ID.No：66、75、79、91、94、101、102、 525及528的组，且最佳选自包含SEQ.ID.No：66、74、75、79、525 及528的组。
在一实施方式中，另一链段包含核酸序列的至少14个连续核苷酸 的序列，其中该核酸序列是选自表A-D中所揭示的序列，优选选自包含 SEQ.ID.NO：3、16、22、23、24、25、26、27、29、41、42、43、 44、45、46、51、52、429、432、433、434、436、437、438、439及 440的组，更优选选自包含SEQ.ID.No：16、24、25、29、41、44、 51及52的组，且最佳选自包含SEQ.ID.No：16、24、25及29的组。
在一实施方式中
第一链段具有SEQ.ID.NO.53的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 3的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.66的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 16的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.67的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 17的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.72的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 22的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.73的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 23的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.74的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 24的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.75的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 25的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.76的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 26的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.77的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 27的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.79的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 29的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.91的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 41的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.92的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 42的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.93的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 43的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.94的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 44的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.95的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 45的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.96的序列且第二链段具有SEQ.ID.NO. 46的序列；
第一链段具有SEQ.ID.NO.101的序列且第二链段具有SEQ.ID. NO.51的序列；且
第一链段具有SEQ.ID.NO.102的序列且第二链段具有SEQ.ID. NO.52的序列。
在一实施方式中，第一链段具有选自包含SEQ.ID.NO.53、66、 72、73、74、75、76、77、79、91、92、93、94、95、96、101、102、 525、528、529、530、532、533、534、535及536的组的核酸序列。
应了解虽然术语＂第一＂及＂第二＂链段结合本发明的核酸使用，但 其仅为获得便利性而使用，且描述为具有序列X的第一链段及序列Y的 第二链段的本发明的任何核酸分子亦可同等描述为具有序列Y的第一 链段及序列X的第二链段，只要了解一条链段包含于必须反义于RTP801 基因之一部分编码序列的反义链中，且另一链包含于必须与反义链互 补(虽然非100％互补)的有义链中，所有均根据本文所陈述的定义及说 明。
在一实施方式中，第一和/或第二链包含在3′末端处与编码RTP801 的核酸序列的相应核苷酸互补或一致的至少一个悬垂物核苷酸。
在一实施方式中，第一和/或第二链包含3′末端处的1至15个悬垂 物核苷酸，优选地第一和/或第二链包含3′末端处的1至10个悬垂物核 苷酸，更优选地第一和/或第二链包含3′末端处的1至5个悬垂物核苷 酸，且最佳地第一和/或第二链包含3′末端处的1至2个悬垂物核苷酸。
在一实施方式中，第一链和/或第二链包含不同于编码RTP801的核 酸序列的相应核苷酸的至少一个悬垂物核苷酸。
在一实施方式中，第一链包含不同于编码RTP801的核酸序列的相 应核苷酸的两个悬垂物核苷酸。
在一实施方式中，第一链仅由第一链段组成。
在一实施方式中，第二链仅由第二链段组成。
在一实施方式中，第一链段和/或第一链包含核糖核苷酸。
在一实施方式中，第二链段和/或第二链包含核糖核苷酸。
在一实施方式中，第一链段和/或第二链由核糖核苷酸组成。
在一实施方式中，某些或所有核苷酸经修饰。
在一优选实施例中，该修饰涉及核苷酸的核碱基部分、核苷酸的 糖部分和/或核苷酸的磷酸酯部分。
在一更优选实施例中，修饰为糖部分的修饰且修饰为2′位上的修 饰，其中2′OH基团藉由选自包含-H-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-NH2 及-F的组的基团或部分置换。
在一实施方式中，修饰为核碱基部分的修饰且修饰或经修饰的核 碱基是选自包含下列各物的组：肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-胺基腺 嘌呤、6-甲基、2-丙基及其它烷基腺嘌呤、5-卤基尿嘧啶、5-卤基胞 嘧啶、5-卤基胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、 4-硫尿嘧啶、8-卤基腺嘌呤、8-胺基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫代 烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤及其它8-取代腺嘌呤、8-卤基鸟嘌呤、8- 胺基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤及其 它经取代的鸟嘌呤、其它氮杂及脱氮腺嘌呤、其它氮杂及脱氮鸟嘌呤、 5-三氟甲基尿嘧啶及5-三氟胞嘧啶。
在一实施方式中，修饰为磷酸酯部分的修饰，其中经修饰的磷酸 酯部分是选自包含硫代磷酸酯的组。
在一实施方式中，第一链段和/或第二链段包含复数个在2′位上具 有修饰的经修饰核苷酸的组，其中在链段内各组经修饰核苷酸通过核 苷酸的侧接基团侧接于一或两侧，其中形成核苷酸的侧接基团的侧接 核苷酸为未经修饰的核苷酸或具有不同于经修饰核苷酸的修饰的核苷 酸。
在一优选实施例中，第一链段和/或第二链段由核糖核苷酸组成。
在一更优选实施例中，第一链段及第二链段包含复数个组的经修 饰核苷酸。
在一实施方式中，第一链段包含该复数个组的经修饰核苷酸。
在一实施方式中，第二链段包含该复数个组的经修饰核苷酸。
在一实施方式中，各组经修饰核苷酸和/或各组侧接核苷酸包含大 量核苷酸，其中数目是选自包含1个核苷酸至10个核苷酸的组。
在一实施方式中，第一链段包含第一类型的经修饰核苷酸，且第 二链段包含第二类型的经修饰核苷酸。
在一实施方式中，第一类型与第二类型为相同类型。
在另一实施方式中，第一类型与第二类型对准。
在一优选实施例中，第一类型相对于第二类型存在一或多个核苷 酸改变。
在一实施方式中，各组经修饰核苷酸由一经修饰核苷酸组成且各 组侧接核苷酸由一未经修饰的核苷酸或具有不同于经修饰核苷酸的修 饰的核苷酸组成。
在一优选实施例中，经修饰的核苷酸在2′位上具有-OMe基团。
在一优选实施例中，侧接核苷酸为具有2′OH基团的核糖核苷酸。
在一实施方式中，第一链段起始于5′末端的经修饰核苷酸，且该 链段的所有其它核苷酸亦为经修饰的核苷酸，而起始于5′末端的第二 核苷酸及所有其它核苷酸为未经修饰的核苷酸或具有不同于经修饰核 苷酸的修饰的核苷酸。
在一实施方式中，第一链段是在编码RTP801的核酸序列的反义方 位。
本发明的另一方面涉及包含本发明的第一方面的核酸和/或本发 明的第二方面的载体及优选可药用载体的药物组合物；该组合物任选 用于全身或局部给药。
在一实施方式中，该组合物用于治疗疾病，其中疾病是选自包含 肿瘤疾病的组。
在另一方面中，本发明的潜在问题是由一种用于预防和/或治疗需 该预防和/或治疗的患者的方法来解决，该方法包括给药本发明核苷酸 和/或本发明载体和/或本发明的药物组合物。
在另一实施方式中，本发明的核酸和/或本发明的载体用于制造药 剂。药剂可用于预防和/或治疗疾病，其中该疾病是选自包含肿瘤疾病 的组。肿瘤疾病可选自包含实体肿瘤、转移性肿瘤(包括PTEN阴性肿 瘤)、具有药物抗性的肿瘤及其中RTP801抑制可用于敏化的肿瘤。此外， 肿瘤疾病可为晚期肿瘤疾病或可涉及肿瘤抑制剂阴性细胞；该肿瘤抑 制剂可为PTEN。
本发明的另一方面是由用于设计或筛检适于下调RTP801的核酸的 方法来解决，该方法包括下列步骤：
a)设计或筛检适于下调RTP801的核酸；
b)评估本发明的任一上述方面的核酸的缺陷；及
c)比较步骤a)中核酸的作用与步骤b)中核酸的作用。
在一实施方式中，作用为下调RTP801。
本发明的另一方面为本发明的核酸用作敏化剂、尤其用作治疗疾 病的敏化剂的用途，其中该疾病优选是选自包含肿瘤且更具体地说对 使用化学疗法和/或放射疗法的治疗具有抗性的肿瘤的组。本发明的核 酸可充当敏化剂的额外疾病揭示于本文中。
此申请案揭示，包含对RTP801具有特异性的双链结构的核酸为适 于抑制血管生成/脉管结构生长及血管渗漏(均来自现有脉管结构及正 在生长的脉管结构)的工具。此外，此申请案揭示(不受理论限制)应力 诱发蛋白RTP801(藉由低氧、氧化应力、热应力、ER应力诱发)是在回 应能量不平衡的细胞微调中起作用的因子。因此，藉由该双链核酸来 抑制RTP801可适于治疗应自归因于应力条件的细胞凋亡救出细胞的任 何疾病(例如伴随正常细胞死亡的疾病)或归因于RTP801表达的改变而 适应应力条件的细胞(例如肿瘤细胞)应被杀死的任何疾病。因此，在 后一情形下，在藉由该双链核酸抑制RTP801后，此具有低氧细胞、更 具体地说低氧癌细胞中的抗细胞凋亡功能的存活因子不能使缺乏 RTP801介导的保护的细胞发生细胞凋亡。此外，当其它细胞凋亡促进 因子存在时，此亦可发生。该其它细胞凋亡促进因子包括化学疗法及 放射疗法。换言之，本发明的双链核酸可单独地有效治疗癌症(单一疗 法)且亦可有效用作补充疗法。
该双链结构包含第一链及第二链，其中第一链包含第一连续核苷 酸链段且第二链包含第二连续核苷酸链段，其中第一链段与编码 RTP801的核酸序列互补或一致且其中第二链段与编码RTP801的核酸序 列一致或互补。尤其藉由将RTP801用作该种双链核酸的目标，因此亦 可能立即分别处理涉及脉管结构生长及发育及血管生成的级联中及因 此与由VEGF抑制剂(诸如VEGF抗体)使用的路径相比不同的途径中的目 标。不愿受任何理论限制，本发明的发明者假定本发明的核酸可在提 供涉及任何疾病(其中发生不良、尤其低氧诱发的血管生成和/或脉管 结构生长或发育)或结合其所观测到的背景的那些细胞中发挥其功能。 此理解藉由下列发现支持：在非低氧条件下，RTP801基因剔除小鼠不 会显示不同于野生型小鼠的任一表型。仅在如患病病状(诸如肿瘤生 长)中观测的低氧诱发后，RTP801相关基因剔除会导致类似于在经受此 种疾病的人类中所观测到的病理的病理。
应了解本发明的核酸优选为功能核酸。如本文所用的术语功能核 酸优选应意谓功能不同于在细胞中用作任一hnRNA、mRNA或任何其它转 录产物的转录模板的核酸，其中该hnRNA、mRNA或任何其它转录产物或 本发明的核酸分别经受转译过程，优选经受细胞转译过程，从而导致 生物活性RTP801蛋白。应了解，如本文优选使用的功能核酸能够减少 靶向核酸的表达。更优选地，该减少是基于靶向核酸的转录后基因沉 默过程。甚至更优选地，该减少是基于RNA干扰。功能核酸的最佳形式 为siRNA分子或具有与siRNA分子作用相同的作用的任何其它分子。该 另一分子是选自包含siRNA、合成siRNA、shRNA及合成shRNA的组。如 本文所用的siRNA可额外包含表达载体衍生的siRNA，其中在一优选实 施例中表达载体为病毒，诸如腺病毒、腺病毒相关的病毒、疱疹病毒 及豆状病毒。如本文所用的shRNA优选应意谓短的发夹型RNA。该shRNA 可合成制成或可使用载体编码表达系统、优选使用RNA聚合酶III启动 子而产生。因此，应了解本发明的功能核酸是针对RTP801，RTP801在 本文中亦优选称为靶向且编码该靶向的核酸是称为靶向核酸。
如本文优选使用，本发明核酸的双链结构包含任一双链结构，其 中该双链结构优选藉由具有基础设计的核酸提供的第一链段及第二链 段产生。双链结构可包含一或多个错配。该双链结构藉由Watson-Crick 碱基配对和/或Hoogsteen碱基配对和/或类似碱基配对机制形成。基于 本发明核酸的基础设计，一条链段最好在相对于编码RTP801的核酸序 列或其部分的反义方位上，而另一链段最好在相对于编码RTP801的核 酸序列或其部分的有义方位上。因此，一条链段与编码RTP801的核酸 序列或其部分互补，且另一链段与编码RTP801的核酸序列或其部分一 致。因此，应了解术语一致当然亦意谓部分一致，其中同一性(表示为 同源性)为至少80％、优选90％、更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％。 类似于同一性的定义，互补性可根据同源性来定义，其中若互补链根 据Watson-Crick碱基配对原则转译成类似链，则该同源性与同一性范 围相同。在一替代实施例中，一条链段与编码RTP801的核酸序列或其 部分一致，且另一链段与编码RTP801的核酸序列或其部分互补。
在一优选实施例中，本发明的核酸下调RTP801功能。RTP801功能 的下调优选藉由蛋白水平和/或mRNA水平上的表达水平减少而发生，其 中与在本发明的核酸未给药或不具有功能活性的条件下的表达相比， 优选在蛋白水平上减少的该表达水平可少至5％且可高达100％。该条件 优选为表达系统、优选RTP801的表达系统的条件或存在于其中的条件。 该表达系统优选为可为活体外转译系统的转译系统，更优选为细胞、 器官和/或有机体。更优选地，有机体为多细胞有机体，更优选为哺乳 动物，其中该哺乳动物优选是选自包含人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、 兔、猫、狗、绵羊、母牛、马、牛及猪的组。结合下调，应了解该下 调可随时间变化，亦即下调作用无需在给药或功能活化本发明的核酸 后立即观测到，而可延长时间以及空间(亦即在多种细胞、组织和/或 器官中)。该延迟可介于5％-100％、优选10％至50％之间。本领域技术人 员应了解，较长时间的5％减少可与较短时间的100％减少同样有效。本 领域技术人员亦应了解，该延长强烈地取决于实际上所用的特定功能 核酸以及靶向细胞群体，且因此最终取决于待根据本申请案的技术教 导而治疗和/或预防的疾病。在此范围内，较长时间的5％减少可与较短 时间的100％减少同样有效。本领域技术人员亦应了解，该延长可以如 上文所概述的任何程度而发生，亦即功能延长(其中该功能为RTP801 显示的任一功能)、蛋白表达的延长或mRNA表达水平的延长。
在一优选实施例中，第一链段包含至少14个核苷酸、优选14个连 续核苷酸。本领域技术人员亦应了解第一链段应具有适于允许特定处 理编码RTP801的核酸序列且更特定处理编码存在于RTP801表达应减少 的转译系统中的RTP801的核酸的长度。亦不愿受理论或本发明核酸的 任何作用模式限制，似乎本发明核酸与编码RTP801的核酸序列之间优 选在转录程度上(亦即自编码RTP801的各自核酸序列产生mRNA后)存在 相互作用。归因于本发明核酸的任一序列与转译系统的基因组或转录 组所含的序列一致或互补的可能性，因此第一链段的长度应长至确保 下列情形：假定编码RTP801的核酸与本发明核酸之一条链之间的某种 碱基配对实际上存在，则仅基因组或转录组(transcriptome)的编码 RTP801的序列而非其它编码序列、当然亦非其它基本编码序列针对或 藉由该碱基配对来处理。根据此长度，脱靶效应的发生可减少且优选 消除。为增加此种特定处理RTP801及编码其的核酸序列的严格性，第 一链段优选具有至少18或19个核苷酸的长度。第一链段长度的上限优 选少于50个核苷酸，然而，该长度可显著更大且可包含100、200或甚 至500个核苷酸或其间任一长度。除此之外，尤其若本发明的核酸为化 学合成的，则本领域技术人员将青睐相对较短的第一链段，序列愈短， 其合成时间及消耗的物质愈少，且不当核苷酸插入各自序列中的比率 愈低。确定第一链段长度所考虑的另一因素是在长度超过50个或50个 以上核苷酸时，通常可观测到非特异性干扰素反应。对此种非特异性 干扰素反应是否耐受将取决于待治疗的特定病状。举例而言，若干扰 素反应和/或干扰素基因表达可限于病理细胞，则干扰素反应可耐受。
鉴于此，第一链段的更优选长度为约14至40个核苷酸、18至30个 核苷酸、19至27个核苷酸、21至25个核苷酸及19至23个核苷酸。
与上文关于第一链段所概述的因素相同的因素可应用于第二链 段，因此第二链段可包含如本文所述与第一链段相关的任一长度。亦 在本发明内，第一链段的长度不同于第二链段的长度，然而，两条链 段优选具有相同长度。
根据核酸的基本设计，第一链段及第二链段分别为本发明核酸的 第一链及第二链的部分。应了解在每一末端(亦即在5′末端以及3′末 端)，第一链和/或第二链可包含任何组合之一或多个核苷酸，优选额 外核苷酸。
因此，应了解超出对应于各自链的链段的末端的个别链的那些核 苷酸可用以分别进一步促进链段的互补性及同一性，且因此有助于特 定处理编码RTP801的核酸序列。
应了解基本上基于本文所提供的技术教导，本发明的核酸可处理 编码RTP801、尤其编码RTP801表达应减少的转译系统中的RTP801的核 酸序列的任一部分。在此范围内，本发明包含具有如本文所定义的特 征的任何核酸，其中本发明核酸的互补及一致链及链段可基本上起始 于编码RTP801的核酸序列的任何核苷酸。因此，在本发明核酸的第一 链段互补于编码RTP801的核酸序列(亦即为其反义链或在其反义方位 上)的限制条件下，该链段的第一核苷酸(亦即在最5′末端的核苷酸) 对应于(亦即对准)3′末端的编码RTP801的序列的最终一个核苷酸。在 另一实施方式中，该最5′末端的核苷酸对应于编码RTP801的核酸的倒 数第二个核苷酸，及其类似情形，直至到达最终一个位置，此在给定 反义链长度下仍允许本发明核酸的反义链互补于编码RTP801的核酸序 列。在此范围内，本发明的任何核酸均在本发明内，此可藉由扫描起 始于其最5′末端核苷酸且覆盖本发明核酸的基础设计的编码RTP801的 核酸序列且了解本发明的该核酸的特征而产生。相同考虑可应用于本 文所揭示的实施例，其中本发明核酸的互补性及同一性不仅分别由第 一链段及第二链段提供，该互补性及同一性亦分别包含除第一链段及 第二链段以外之一或多个核苷酸，接着分别成为第一链及第二链的部 分。
在如本文所揭示的本发明的各种核酸中，具有内部参考号14、22、 23、25、27、39、41、42、49及50(参见表A)及257、260-262及264-268(参 见表D)的核酸尤其优选。因此，应注意可用于人类及动物模型(诸如大 鼠和/或小鼠)的本发明的那些核酸尤其适用。本发明的这类特定核酸 的惊人优势在于其在人类及动物模型中均有效，此意谓在动物模型中 获得的测试结果可立即自动物模型转移至人类且更具体地说无需对人 类序列作任何改变，而在设计本发明核酸(诸如)以包含在物种、更具 体地说用于动物模型测试的物种与作为最终优选有机体或患者的人之 间存在不同的序列的情形下有必要作出改变。另外优选地，这类核酸 具有亦如实施例所述的修饰类型。
然而，亦在本发明内，根据SEQ.ID.NO.3、16-17、22-27、29、 41-46、51-53、66-67、72-77、79、91-96、101-102、525、528-530、 532-536及导致具有内部参考号14、22、23、25、27、39、41、42、49 及50(表A)及257、260-262及264-268(表D)的本发明核酸分子的各自组 合的任一序列仅部分含于本发明的另一核酸中。本发明的其它核苷酸 优选包含SEQ.ID.NO.3、16-17、22-27、29、41-46、51-53、66-67、 72-77、79、91-96、101-102、525、528-530、532-536的至少14个连 续核苷酸，且更优选包含在包含上表所概述的第一链段及第二链段的 双链结构的任一末端的14个连续核苷酸碱基对。本领域技术人员应了 解，给定本发明核酸及尤其形成本发明的该核酸的个别链段的潜在长 度，对各侧面而言有可能存在相对于RTP801的编码序列的某些转变， 其中在两个方向上该转变可多达1、2、3、4、5及6个核苷酸，且其中 因此产生的双链核酸分子亦应在本发明内。
在本发明之一优选实施例中，第一链段及第一链具有相同长度。 类似地，第二链与第二链段最好具有相同长度，而第一链段与第二链 段亦最好具有相同长度。在一更优选实施例中，第一链仅包含第一链 段且第二链仅包含第二链段。在一甚至更优选实施例中，第一链段及 因此第一链不含有悬垂物，而第二链段及因此第二链亦不包含悬垂物。 换言之，亦在本发明内，优选在本发明核酸的双链结构的各末端处， 本发明的双链核酸末端平整。结合本发明核酸的任何其它实施例、尤 其其中本发明核酸具有修饰类型、更优选如本文所述的修饰类型的那 些实施例，可了解该末端平整结构。
因此，在另一方面中，本发明的核酸具有在本发明核酸的双链结 构的两个末端处提供平整末端的基础设计。然而，在本发明内亦存在 悬垂物，亦即自双链结构突出之一或多个核苷酸的链段。原则上，悬 垂物可在反义链的5′末端、反义链的3′末端、有义链的5′末端和/或有 义链的3′末端。应注意了解该选择中的任一单个选择以及其任何组合 均在本发明内。更优选为其中悬垂物位于反义链的3′末端及有义链的 3′末端的组合。亦在本发明内，悬垂物位于反义链的5′末端及有义链 的5′末端。此外，在本发明内，悬垂物仅位于双链结构的反义链上， 更优选位于双链结构的反义链的3′末端。
结合悬垂物，应注意悬垂物加上链段优选形成链，且本文中所提 供的链段长度亦应用于这类实施例。与位置无关，个别悬垂物可由至 少一个核苷酸组成。然而，个别悬垂物亦可包含多达10个核苷酸且优 选为2个核苷酸长。在本发明内，在第一链互补于该编码RTP801的核酸 序列且悬垂物在反义链的3′末端或5′末端的情形下形成悬垂物的各自 核苷酸亦互补于该编码RTP801的核酸序列，或在第一链与编码RTP801 的核酸序列一致的情形下悬垂物与编码RTP801的核酸序列一致。同样 应用于位于本发明核酸的基础设计的第二链段的任何悬垂物，其中应 了解第二链段上的悬垂物设计可独立于第一链段的悬垂物设计。
亦在本发明内，形成悬垂物的核苷酸与编码RTP801的核酸序列的 相应核苷酸既不互补，亦不一致。如本文所用且优选在此实施例中的＂ 相应＂意谓跟随在具有编码RTP801的核酸上的核苷酸对应物的链段的 5′末端和/或3′末端上的各自核苷酸。
第一链优选在其3′末端包含两个核苷酸，优选脱氧核苷酸，且更 优选两个TT，和/或此种核苷酸亦在第二链的3′末端，其中第一链段及 第二链段的长度更优选为19个核苷酸。因此，链包含链段及悬垂物。 在此实施例中，双链结构由19个碱基对及在个别链段的3′末端的各末 端的两个核苷酸悬垂物组成。
在一优选实施例中，第一链段和/或第一链包含核糖核苷酸，其中 尤其优选地，第一链段全部由核糖核苷酸组成。同样分别应用于第二 链段及第二链。与此结合，然而，在一优选实施例中第一链段及第二 链段的每一及任一核苷酸分别经修饰。同样分别应用于第一链及第二 链。与末端核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸无关，末端核苷酸 尤其可具有同样可经修饰的OH基。该OH基可源自核苷酸的糖部分，更 优选在5′OH基的情形下源自5′位和/或在3′OH基的情形下源自3′位，或 源自连接于各自末端核苷酸的糖部分的磷酸酯基。原则上，磷酸酯基 可连接至核苷酸的糖部分的任何OH基。磷酸酯基优选在游离5′OH基的 情形下连接至糖部分的5′OH基，和/或在游离3′OH基的情形下连接至糖 部分的3′OH基，仍假定5′OH基或3′OH基在本文中称为游离5′或3′OH 基。
在设计RNAi的任何策略或本文所揭示的RNAi的任何实施例下，如 本文所用的术语＂末端修饰＂意谓添加至第一和/或第二链的最5′或3′ 核苷酸的化学实体。该末端修饰的实施例包括(但不限于)3′或5′磷酸 酯、经转化的(脱氧)非碱基、胺基、氟基、氯基、溴基、CN、CF、甲 氧基、咪唑、羧酸酯、硫代酯、C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、 烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基、O-、S-或N-烯基、SOCH3、 SO2CH3、ONO2、NO2、N3、杂环烷基、杂环烷芳基、胺基烷胺基、聚烷胺 基或经取代的硅烷基，如欧洲专利EP 0 586 520 B1或EP 0 618 925 B1 中所述。
如本文所用，烷基或包含＂烷基＂的任何术语优选意谓包含1至12 个、优选1至6个且更优选1至2个碳原子的任何碳原子链。
另一末端修饰为生物素基团。该生物素基团优选可连接至第一和/ 或第二链的最5′或最3′核苷酸或两个末端。在一更优选实施例中，生 物素基团与多肽或蛋白偶联。亦在本发明的范畴内，多肽或蛋白经由 任何其它上述末端修饰来连接。多肽或蛋白可给予本发明的核酸分子 其它特征。其中，多肽或蛋白可充当另一分子的配体。若该另一分子 为受体，则受体功能及活性可藉由结合配体来活化。受体可显示使结 合本发明核酸分子的配体有效转染的内在化活性。本发明的核酸分子 所偶联的配体的实施例为VEGF且相应受体为VEGF受体。
具有不同种类末端修饰的本发明RNAi的各种可能实施例呈现于下 表1中。
表1：本发明的干扰核糖核酸的各种实施例


如本文所揭示的各种末端修饰均优选位于本发明核酸的核苷酸的 核糖部分。更具体地说，末端修饰可连接或置换核糖部分的任何OH基， 包括(但不限于)2′OH、3′OH及5′OH位，其限制条件在于因此经修饰的 核苷酸为末端核苷酸。经转化的非碱基为核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸)，其不具有核碱基部分。此种化合物描述于Sternberger， M.，Schmiedeknecht，A.，Kretschmer，A.，Gebhardt，F.，Leenders， F.，Czauderna，F.，Von Carlowitz，I.，Engle，M.，Giese，K.， Beigelman，L.& Klippel，A.(2002).Antisense Nucleic Acid Drug Dev，12，131-43中。
任何上述末端修饰均可与表1中所述的各种RNAi实施例结合使用； 应注意上文所提及的5′末端修饰通常仅存在于siRNA分子的有义链中。
其它修饰可关于个别核苷酸的核碱基部分、糖部分或磷酸酯部分。
核碱基部分的该修饰可使腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸苷及尿嘧 啶的衍生物分别经修饰。尤其优选经修饰的核碱基是选自包含下列各 物的组：肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基 及其它烷基腺嘌呤、5-卤基尿嘧啶、5-卤胞嘧啶、5-卤基胞嘧啶、6- 氮杂胞嘧啶、6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤基腺嘌 呤、8-胺基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌 呤及其它8-取代腺嘌呤、8-卤基鸟嘌呤、8-胺基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌 呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤及其它经取代的鸟嘌呤、其它 氮杂及脱氮腺嘌呤、其它氮杂及脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶及5- 三氟胞嘧啶。
在另一优选实施例中，核苷酸的糖部分经修饰，其中该修饰优选 地分别在核苷酸的核糖及脱氧核糖部分的2′位。2′OH基更优选由选自 包含胺基、氟基、烷氧基及烷基的组的基团或部分来置换。烷氧基优 选为甲氧基或乙氧基。烷基亦优选意谓甲基、乙基、丙基、异丁基、 丁基及异丁基。甚至更优选地，不考虑修饰类型，核苷酸优选为核糖 核苷酸。
磷酸酯部分的修饰优选是选自包含硫代磷酸酯的组。
本领域技术人员应了解，由大量核苷酸组成的本发明核酸因此可 由经由磷酸二酯键或经由硫代磷酸酯键或两者的组合分别沿个别链及 链段的核苷酸序列长度键联的核苷酸形成。
所用核苷酸的另一形式实际上可为描述于国际专利申请案WO 03/070918中的siRNA。
分别形成本发明核酸的第一链段及第一链的核苷酸可包含一或多 个经修饰的核苷酸，其中个别经修饰的核苷酸具有的修饰优选为如本 文所揭示的修饰。除特定修饰外，修饰亦可为或可包含某种标记，其 中标记是选自化学发光标记、荧光标记及放射标记的组。这类标记种 类为本领域技术人员所知且(例如)描述于Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore， Maryland，1998中。因此经标记的本发明核酸亦可用于获得诊断目的 或用于监控作用位点以及用于进行优选关于本文所揭示的任何疾病的 任何治疗。
在一优选实施例中，本发明的核酸经修饰，使得有义链段或链中 的嘧啶核苷酸为2′O-甲基嘧啶核苷酸；且另外或其它，有义链段或链 中的嘌呤核苷酸为2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一实施方式中，存在于有 义链段或有义链中的嘧啶核苷酸为2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。
在一替代实施例中，修饰并非基于核苷酸的化学性质(亦即修饰取 决于待修饰的核苷酸为嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸)，而主要基于本发明 核酸的基础设计的总双链结构中个别核苷酸的空间排列。
更具体地说，第一链及第一链段或第二链及第二链分别显示分别 形成该链段及链的核苷酸的空间修饰类型。
首先关注第一链段，存在一种类型的经修饰核苷酸的组及未经修 饰核苷酸的组。这类未经修饰核苷酸的组在本文中亦称为核苷酸的侧 接基团的组。更优选地，该类型由经修饰核苷酸的组及未经修饰核苷 酸的组组成。该类型甚至更优选为规则类型且甚至更优选为沿本发明 核酸的第一链段的长度的交替类型。经修饰核苷酸的组可由一或多个 经修饰且优选在2′位上经修饰(亦即在糖部分上修饰)的核苷酸组成。 此修饰更优选为2′-O-Me修饰。
未经修饰核苷酸的组可由一或多个未经修饰的核苷酸组成，其中 未经修饰的核苷酸优选为核糖核苷酸或未修饰核苷酸为经修饰的核苷 酸，其中该修饰不同于形成经修饰核苷酸的组的核苷酸所显示的修饰。 未修饰核苷酸甚至更优选为核糖核苷酸。应注意若未相反说明，则术 语未修饰核苷酸及未经修饰的核苷酸可交替使用。本发明核酸的第一 链段可起始于经修饰核苷酸的组或起始于如本文所定义的未经修饰核 苷酸的组。然而，第一链段优选起始于经修饰核苷酸的组。经修饰核 苷酸的组最佳由单一核苷酸组成。结合此实施例，第一链段优选在编 码RTP801的核酸的反义方位上。亦在本发明内，如形成经修饰核苷酸 的组的核苷酸所显示的修饰与所有存在于第一链段中的经修饰核苷酸 的组相同。然而，亦在本发明之外，某一组经修饰核苷酸的修饰不同 于存在于第一链段上之一或多组经修饰核苷酸的修饰。
在本发明核酸的第二链上，亦可了解如关于第一链段所述的类型。 在一实施方式中，亦可在第二链段上了解与结合第一链段所述特征相 同的特征，其中在第二链在相对于编码RTP801的核酸序列的有义方位 上的限制条件下，本发明核酸的第二链最好起始于未经修饰核苷酸的 组。
包含双链结构的本发明核酸可包含具有如本文所述的修饰类型的 第一链段。或者，本发明的双链核酸可包含具有如上文所概述的修饰 类型的第二链段。然而，本发明的双链核酸最佳由第一链段及第二链 段组成，其中第一链段及第二链段均具有如本文所述的空间修饰类型。
在本发明内，就经修饰核苷酸的组及未经修饰核苷酸的组的大小 及实际上所用的修饰种类而言，两条链段上的空间修饰类型的特征相 同。优选地，改变第一链段上的空间修饰类型以使得第一链段上的经 修饰核苷酸的组与第二链段上未经修饰核苷酸的组相对，反之亦然。 然而，亦在本发明内使该类型精确对准，亦即第一链段上的经修饰核 苷酸的组与第二链段上未经修饰核苷酸的组相对，且第一链段上的未 经修饰核苷酸的组与第二链段上未经修饰核苷酸的组相对。亦在本发 明内，第一链段及第二链段上的空间修饰类型相对于彼此改变以使得 一条链段上之一组经修饰核苷酸的第一部分与另一链段上之一组未经 修饰核苷酸的一部分相对，而该组经修饰核苷酸的第二部分与另一组 经修饰核苷酸相对。在本发明内，本文所提供的关于本发明核酸的链 段的空间修饰类型的揭示内容亦应用于本发明核酸的链。然而，核酸 的链段优选包含该空间修饰类型且链包含该链段及一或多个如本文所 揭示的悬垂物。悬垂物尤其优选为在反义链或有义链或两种链的3′末 端上的磷酸酯基，其中磷酸酯基更优选在反义链及有义链的3′末端。 在甚至更优选的实施例中，磷酸酯基为如本文所定义的磷酸酯基。
亦在本发明内，本发明的核酸可显示连接第一链及第二链的连接 体。该连接体优选为聚合物。聚合物可为任何合成或天然聚合物。可 能性合成连接体为PEG或聚核苷酸。该连接体优选经设计以(诸如)使第 一链段部分或完全向后折迭至第二链段上，反之亦然。
最终，在本发明内，本发明的核酸为合成核酸、化学合成核酸、 经分离的核酸或衍生自任何天然来源的核酸，诸如藉助于重组技术制 备的核酸。如本领域技术人员所知，结合本发明的任何核酸的制备， 如本文所揭示的任何修饰均可在制备本发明的各自核酸之前、期间或 之后引入。
本发明的载体包含本发明的核酸。此外，载体可包括以本领域已 知的细胞选择方式来控制该核酸的靶向、表达及转录的元素。质粒可 包括用于控制异源物质(亦即本发明的核酸)转录的启动子，且可为允 许选择性转录的构成或诱发性启动子。任选可包括获得必要转录程度 可需的增强子。增强子一般为连续对编码序列起作用、继而改变藉由 启动子指示的基础转录程度的任何未经转译的DNA序列。该构筑体的表 达为本领域技术人员所知且可(例如)藉由提供各自串联构筑体或藉由 具有分别转录本发明核酸的第一及第二链及第一及第二链段的不同启 动子来进行。
当本发明的核酸经制造或表达、优选在活体内表达、更优选在需 要本发明核酸的患者中表达时，该制造或表达优选使用表达载体，优 选为哺乳动物表达载体。表达载体在本领域为已知的且优选包含质粒、 粘粒、病毒表达系统。优选病毒表达系统包括(但不限于)腺病毒、反 转录病毒及豆状病毒。
将载体引入细胞或组织中的方法在本领域为已知的。一般可发现 该方法描述于下列文献中：Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbour Laboratory，New York (1983，1992)；或Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland，1998。
适合方法包括转染、脂质体转染、电穿孔及用重组病毒载体感染。 结合本发明，在一实施方式中，载体的另一特征为表达限制特征，诸 如启动子及调节组件，两者分别对所需细胞类型具有特异性，因此仅 在提供允许所需表达的背景后使得本发明的核酸序列表达。
在另一方面中，本发明涉及包含本发明核酸和/或本发明载体及任 选可药用载体、稀释剂或佐剂或其它媒剂的药物组合物。该载体、稀 释剂、佐剂及媒剂优选为惰性且无毒的。在药物组合物的各种实施例 中，使药物组合物适于各种给药方式。该给药包含全身及局部给药以 及经口、皮下、胃肠外、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内及 背内(intrategral)给药。
本领域技术人员应了解，药物组合物及各自核酸及载体的量分别 视个别患者的临床病状、给药的位点及方法、给药时程、患者年龄、 性别、体重及医师已知的其它因素而定。因此，用于获得预防和/或治 疗目的的医药学有效量应藉由医药技术中已知的该考虑来确定。该量 优选地有效获得改善，包括(但不限于)改善患病病状或提供更快速恢 复、改善或消除症状及由医药技术领域技术人员选为适合测量方法的 其它指示。
在一优选实施例中，本发明的药物组合物可包含其它医药学活性 化合物。该其它医药学活性化合物优选是选自包含下列化合物的组： 允许吸收细胞内细胞传递的化合物、允许内体小泡释放的化合物、允 许较长循环时间的化合物及允许靶向内皮细胞或致病细胞的化合物。 用于内体小泡释放的优选化合物为氯喹及ATP依赖性H+泵的抑制剂。
药物组合物的调配优选应得以提供单剂量给药或多剂量给药。
应了解本发明的药物组合物可用于涉及不良脉管结构发育或生长 (包括血管生成)的任何疾病以及本文所述的任何疾病及病状。这类疾 病优选为肿瘤疾病。在肿瘤疾病中，下列肿瘤最佳：子宫内膜癌、结 肠直肠癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、腺癌、子宫内膜增生、考登综 合征(Cowden′s syndrome)、遗传性非息肉病性结肠直肠癌、 Li-Fraumene综合征、乳癌-卵巢癌、前列腺癌(Ali，I.U.，Journal of the National Cancer Institute，92卷，11期，2000年6月7日， 第861-863页)、Bannayan-Zonana综合征、LDD(Lhermitte-Duklos综 合征)(上文Macleod，K.)、错构瘤-巨头畸形病(包括考病(Cow disease，CD)及Bannayan-Ruvalcaba-Rily综合征(BRR))、黏膜与皮 肤损害(例如trichilemmonmas)、巨头畸形、智力迟钝、肠胃错构瘤、 脂肪瘤、甲状腺瘤、乳房纤维囊性病、小脑发育不良性神经节细胞瘤 及乳房及甲状腺恶性肿瘤(上文Vazquez，F.，Sellers，W.R.)。
应了解待用本发明的药物组合物治疗的任何肿瘤疾病均优选为晚 期肿瘤疾病。在另一实施方式中，肿瘤疾病涉及肿瘤抑制剂阴性细胞， 其中肿瘤抑制剂更优选为PTEN。
本发明的药物组合物亦可用于用以预防和/或治疗如本文所揭示 的疾病的方法中，其中该方法包括关于本文所述的任何疾病给药本发 明核酸、本发明载体或本发明的药物组合物或药剂。
在另一方面中，本发明涉及一种用于设计或筛检适于下调RTP801、 更具体地说适于下调RTP801功能的核酸的方法。此方法包括使用如本 文所揭示的核酸序列且在适合检定中分析该核酸。该检定在本领域为 已知的，且(例如)描述于本申请案的实施例部分。在另一步骤中，优 选根据如本文指定的设计原则来设计适于下调RTP801的双链核酸，优 选结合转录后基因沉默机制(诸如RNA干扰)。因此获得(亦即设计或筛 检)的核酸亦在各自检定中经分析且比较结果，亦即本发明核酸及新设 计或筛检的核酸在该检定中的作用。若经设计或筛检的核酸更稳定或 更有效，优选两者兼有，则其更适合。应了解若将本发明的任何核酸 用作起始点，则该方法尤其有效。因此，在本发明内，新颖核酸分子 将基于本文所揭示的原则来设计，其中RTP801 mRNA上的靶向序列相对 于本发明的相应核酸的RTP801 mRNA上的靶向序列略微改变。新核酸优 选将在编码RTP801的mRNA的5′或3′方向上相对于靶向mRNA上的链段改 变至少一或多个核苷酸。然而，在本发明内，改变同时发生在两个方 向上，亦即新核酸并有用作起始点的本发明核酸。亦在本发明内，根 据本发明且用作起始点的核酸的延长偏向3′末端或5′末端。在诸如偏 向的情形下，新核酸的3′末端或5′末端更长，亦即比另一末端延伸更 长。当新核酸分子藉由延伸反义链和/或有义链的3′末端或5′末端而产 生时，通常应用下列步骤次序。若关于RTP801的mRNA的5′末端发生改 变，则反义链的3′末端必须延伸RTP801的mRNA的5′末端所改变的核苷 酸数量。因此，待添加至新颖核酸的反义链的3′末端的核苷酸与跟随 在用作起始点的本发明核酸分子所用的RTP801 mRNA上的靶向序列的 5′末端的那些核苷酸互补。有义链的情形亦必须相同。然而，待添加 至有义链的核苷酸必须对应(亦即互补)于新添加至反义链的3′末端的 核苷酸，亦即其必须添加至有义链的5′末端。然而，有义链上之后一 步骤必须仅进行至除反义链外有义链亦应改变的程度，此为本发明的 优选实施例中的情形。虽然此改变可进行至本领域技术人员所界定的 程度，但优选应进行改变以使得新核酸亦仍含有如本文所揭示的任何 核酸分子所显示的至少14个核苷酸、优选14个连续核苷酸的链段。
本文所述的任何核酸的合成均在本领域技术人员的技能内。该合 成描述于下列文献中：Beaucage S.L.及Iyer R.P.，Tetrahedron 1992；48：2223-2311；Beaucage S.L.及Iyer R.P.，Tetrahedron 1993；49：6123-6194；及Caruthers M.H.等人，Methods Enzymol. 1987；154：287-313，硫代酯的合成描述于Eckstein F.，Annu.Rev. Biochem.1985；54：367-402中，RNA分子的合成描述于Sproat B， 由Herdewijn P.编辑的Humana Press 2005；Kap.2：17-31，且各自 下游过程描述于Pingoud A.等人，由Oliver R.W.A.编辑的IRL Press 1989；Kap.7：183-208及Sproat B，由Herdewijn P.编辑的Humana Press 2005；Kap.2：17-31(上文)中。
RTP801的siRNA可使用如上所述的本领域已知的方法基于已知 RTP801序列(SEQ ID NO：1)而制成且可藉由如上所述的各种修饰使的 更稳定。其它信息参见实施例9。
此外，相对于如本文所述的本发明方法，额外RNA分子可用于该方 法，例如本发明的抑制性RNA分子包括优选包含存在于表A-D中所详述 的序列中的至少7-10个连续核苷酸链段的单链寡核糖核苷酸，该寡核 糖核苷酸能够形成(和/或包含)呈藉由细胞内复合物识别的特定构型 的双链区域，从而导致该寡核糖核苷酸降解成能够抑制相应内源性基 因的较小RNA分子及编码该RNA分子的DNA分子。相应内源性基因优选为 801基因且另外可为VEGF基因和/或VEGF-R1基因。本发明亦提供一种组 合物，其包含载体、优选可药用载体中的以上单链寡核糖核苷酸。
此外，本发明提供用于本文所揭示的所有病状且尤其涉及脉络膜 新血管生成的病状的组合疗法。在该组合疗法中，RTP801及VEGFR基因 均受到抑制以改善所治疗疾病的症状。这类基因可用一或多种siRNA 或抗体或适体的组合来抑制。因此，本发明亦提供包含RTP801抑制剂 及VEGF或VEGF-1抑制剂的新颖药物组合物，RTP801抑制剂优选为 siRNA，更优选为表A-D中详述的siRNA分子，且具体地说表A的siRNA No：14、22、23、25、27、39、41、42、49及50或表D的siRNA No：257、 260-262及264-268，且VEGF/VEGFR-1抑制剂任选为抗体或适体。该化 合物(亦即RTP801 siRNA及VEGF抗体或本文所揭示的任何其它组合实 施例)在药剂制备中的组合使用亦为本发明的部分。
因此，RTP801 siRNA(诸如表A-D中所详述的siRNA分子且具体地说 表A的siRNA No：14、22、23、25、27、39、41、42、49及50或表D的 siRNA No：257、260-262及264-268)可与靶向VEGF或VEGF受体 1(VEGFR1)的药剂一起给药。该药剂目前存在于市场上或在不同机构的 不同阶段批准及证实中。抗体及抗体片段(诸如兰尼单抗 (ranibizumab，Lucentis，Genentech))连接至经释放的VEGF以抑制 VEGF结合至活性受体。可充当配体/抗体的适体(麦可净(Macugen)， Eyetech/Pfizer，其针对湿式AMD，最近由FDA批准)亦为可能的。麦 可净在细胞外结合VEGF以阻断其活性。这类药物藉由玻璃体内注射来 局部给药。以抗VEGF siRNA为主的化合物(诸如Acuity的Cand5 VEGF 抑制剂或VEGFR-1的SIRNA 027抑制剂)亦可得。此外，据报导全身性给 药的小分子胺基甾醇鲨胺(Squalamine，Genaera)会干扰血管生成过程 的多个方面，包括在内皮细胞中抑制VEGF及其它生长因子信号传输。
RTP801抑制剂、优选siRNA与任何以上VEGF/VEGFR-1抑制剂的组合 给药均可产生协同效应，其中无论单一疗法选项的剂量，该组合治疗 均比藉由这类个别组合物的任一个进行的治疗有效。此协同效应亦由 如实施例6中详述的初步结果支持。
RTP801i具有不同作用机制且与VEGF-VEGFR抑制剂潜在协作。 RTP801 KO小鼠中的研究表明，尽管眼中的VEGF mRNA表达与在WT小鼠 中同样高，但KO小鼠中的保护性表型亦持续。我们的额外初步数据表 明在视网膜病理的治疗中，RTP801的抑制可与VEGF-VEGFR调节轴的抑 制协作。本发明的发明者已发现在适当实验中，在AMD模型中给药对抗 RTP801的siRNA(参见下文实例6)不仅导致RTP801自身下调，亦因此导 致抗血管生成及神经保护因子PEDF上调以及MCP1(巨噬细胞趋化蛋白) 的表达下调。因此，RTP801的抑制同时给予抗血管生成、神经保护及 消炎作用。
如本文所揭示的适体亦可结合本文所揭示的新颖siRNA用于本发 明中。举例而言，适体可与本文所揭示的任何siRNA一起用于治疗本文 所揭示的任何病状的组合疗法中。该组合疗法所用的新颖药物组合物 亦为本发明的部分，其可包含共价或非共价连接至适体的本发明 siRNA。适体为RNA或DNA单链或双链寡核酸，该寡核酸结合靶向蛋白且 一般不显示非特异性作用。根据本文所揭示和/或本领域技术人员所知 的任何核酸修饰，适体可经修饰以获得稳定性或其它所需品质。适体 的修饰可引入分子中的任何位置(诸如5′或3′末端)或任何内部定义的 修饰位点。举例而言，RNA适体可用经2′-氟基或2′-胺基修饰的嘧啶稳 定。适体亦可连接至报导分子或连接体化学分子且若需要，则可连接 至珠粒或其它固体载体(例如5′或3′胺基、硫醇酯或生物素基团)。硫 代适体为在特定核苷酸间磷酰基位点含有硫修饰的适体，且可具有增 强的稳定性、抗核酸酶性、靶亲和性和/或选择性。硫代适体的实例包 括单硫代磷酸酯(S-ODN)及二硫代磷酸酯(S2-ODN)寡脱氧硫代适体。关 于适体及硫代适体的其它信息参见美国专利第5,218,088及6,423,493 号。
应了解在本发明的内容中，藉由内源性细胞复合物(诸如DICER-参 见上文)加工以形成本文所揭示的siRNA分子或包含本文所揭示的 siRNA分子的分子的本文所揭示的任何siRNA分子或任何长度双链RNA 分子(通常25-500个核苷酸长)均可用于治疗本文所揭示的疾病或病 症。
可藉由本发明的分子及组合物治疗的额外病症包括所有类型的脉 络膜新血管生成(CNV)，CNV不仅发生在湿式AMD中，亦发生在其它眼部 病理中，诸如眼部组织浆菌病综合征、血管样条纹、布鲁赫氏膜破裂、 近视性变性、眼部肿瘤及某些视网膜退化疾病。
本发明的另一方面提供用于治疗细胞凋亡相关的疾病的方法。提 供用于治疗与不受控病理细胞生长相关的疾病或病症(例如癌症、牛皮 癣、自体免疫疾病)的方法及用于治疗与缺血及缺乏适当血流量相关的 疾病(例如心肌梗塞(MI)及中风)的方法。＂癌症＂或＂肿瘤＂是指不受控 制的异常细胞生长块。这类术语包括可为良性或恶性的原发性肿瘤以 及继发性肿瘤或已扩散至身体内其它位点的转移。癌症型疾病的实例 包括癌(例如乳房、结肠及肺)、白血病(诸如B细胞白血病)、淋巴瘤(诸 如B细胞淋巴瘤)、胚细胞瘤(诸如神经母细胞瘤及黑素瘤)。
本发明亦提供一种组合物，其包含在载体、优选可药用载体中的 一或多种本发明的化合物。此组合物可包含不同基因的两种或两种以 上siRNA或相同基因的不同RNA的混合物。预计包含RTP801基因的siRNA 及VEGF基因和/或VEGF-R1基因的siRNA的组合物。
本发明的另一化合物包含共价或非共价结合本发明之一或多个化 合物(结构A)的以上本发明化合物(结构A)。此化合物可在载体、优选 可药用载体中传递，且可藉由内源性细胞复合物在细胞内加工以产生 一或多个本发明的siRNA。本发明的另一化合物包含共价或非共价结合 另一基因、尤其VEGF基因和/或VEGF-R1基因的siRNA的以上本发明化合 物(结构A)。
本发明亦包含新颖化学实体RTP801抑制剂，优选为siRNA，其共价 或非共价地化学结合至以上VEGF/VEGFR-1抑制剂的任一个。所预计的 特定化学实体为共价结合VEGF或VEGF受体-1的抗体的siRNA RTP801抑 制剂。所预计的另一化学实体为靶向共价结合本文所揭示的RTP801 siRNA的VEGF受体-1的经修饰或未经修饰DNA适体。不受理论限制，该 药物组合物的适体部分应结合VEGF受体-1且内在化至细胞中，因此分 子的siRNA部分将抑制细胞中的RTP801表达。因此，该药物将具有选择 性及靶向增加的益处以及如本文所揭示的组合疗法的额外益处。产生 该新颖化学实体的方法为本领域技术人员所知。
本发明亦包含一种串联双链结构，该串联双链结构包含两种或两 种以上siRNA序列，其在细胞内经加工以形成两种或两种以上不同 siRNA，在相关方面中一种抑制801且第二种抑制VEGF/VEGFR-1；本发 明亦包含一种串联双链结构，该串联双链结构包含两种或两种以上 siRNA序列，其在细胞内降解以形成两种或两种以上均抑制801的不同 siRNA。
具体说，预计包含一或多个茎及环结构(其中茎区域包含本发明的 寡核苷酸的序列)的长寡核苷酸(通常长约80-500个核苷酸)可在载体、 优选可药用载体中传递，且可藉由内源性细胞复合物(例如，如上文所 述的DROSHA及DICER)在细胞内加工以产生作为本发明的寡核苷酸的一 或多个较小双链寡核苷酸(siRNA)。此寡核苷酸可称为串联shRNA构筑 体。预计此长寡核苷酸为包含一或多个茎及环结构的单链寡核苷酸， 其中各茎区域包含801基因的有义及相应反义siRNA序列。具体说，预 计此寡核苷酸包含如表A-D的任一个中所述的有义及反义siRNA序列。 或者，串联shRNA构筑体可包含801基因的有义及相应反义siRNA序列及 另外不同基因(诸如VEGF或VEGF-R1)的有义及相应反义siRNA序列。
如本文所提及，对抗RTP801的siRNA可为药物组合物中的主要活性 组份，或可为含有两种或两种以上siRNA(或编码或内源性产生两种或 两种以上siRNA的分子，编码两种或两种以上siRNA的分子混合物或一 或多个串联分子)的药物组合物的一种活性组份，该药物组合物进一步 包含一或多种靶向一或多种其它基因的其它siRNA分子。RTP801及该 (等)其它基因的同时抑制可能具有添加或协同效应以治疗本文所揭示 的疾病，根据下列情形：
急性肾衰竭(ARF)及其它微血管病症以及听力障碍及褥疮：用于治 疗ARF的药物组合物可包含下列化合物组合：1)RTP801 siRNA与p53 siRNA的二聚体，2)RTP801与Fas siRNA的二聚体，3)RTP801与Bax siRNA的二聚体，4)RTP801与Fas siRNA的二聚体，5)RTP801与Bax siRNA的二聚体，6)RTP801与Noxa siRNA的二聚体，7)RTP801与Puma siRNA的二聚体，8)RTP801(REDD1)与RTP801L(REDD2)siRNA的二聚 体，9)RTP801 siRNA、Fas siRNA与RTP801L siRNA p53 siRNA、Bax siRNA、Noxa siRNA或Puma siRNA的任一个以形成三聚体或多聚体(亦 即，编码三种或三种以上siRNA的串联分子)。
此外，用于组合治疗ARF、听力障碍、褥疮及本文所揭示的任何其 它疾病或病状的其它药物组合物亦可包含两种siRNA，其中第一种 siRNA为优选选自表A-D的RTP801 siRNA，且第二种siRNA可共价或非共 价地结合第一种siRNA或与第一种siRNA混合，该siRNA为靶向选自以下 群的基因的siRNA：肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)、富含亮氨酸的 重复序列及死亡域(含LRDD)、细胞色素b-245、α多肽(CYBA)、活化转 录因子3(ATF3)、卡斯蛋白酶2、细胞凋亡相关的半胱氨酸肽酶(经神经 前体细胞表达、发育性下调2)(CASP2)、NADPH氧化酶3(NOX3)、 harakiri、BCL2相互作用蛋白(HRK)、互补组份1、q亚组份结合蛋白 (C1QBP)、BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)、分裂素 活化的蛋白激酶8(MAPK8)、分裂素活化的蛋白激酶14(MAPK14)、ras 相关的C3肉毒杆菌毒素基质1(rho家族，小GTP结合蛋白Rac1)、肝糖 合成酶激酶3β(GSK3B)、嘌呤型受体P2X配体门控性离子通道7 (P2RX7)、瞬时受体电位阳离子通道子族M成员2(TRPM2)、聚(ADP-核糖) 糖苷水解酶(PARG)、CD38分子(CD38)、STEAP家族成员4(STEAP4)、骨 形态发生蛋白2-BMP2、缝隙连接蛋白α1(43kDa)(connexin 43)(GJA1)、TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)、结缔组织生长因 子(CTGF)、分泌磷蛋白1(骨质素(osteopontin)、骨唾液酸蛋白I、早 期T淋巴细胞活化1)(SPP1)、网霉素4受体(RTN4R)、连接素A2(annexin A2，ANXA2)、ras同源基因家族成员A(RHOA)及双氧化酶1(DUOX1)。溶 质载体家族5(钠/葡萄糖共转运蛋白)、膜1(SLC5A1)、溶质载体家族 2(易化的葡萄糖转运蛋白)、膜2(SLC2A2)、aldo-keto还原酶家族1、 膜B1(醛糖还原酶)(AKR1B1)、山梨醇脱氢酶(SORD)、溶质载体家族2 (易化的葡萄糖转运蛋白)、膜1(SLC2A1)和膜金属-内肽酶(中性内 肽酶、脑啡肽酶)(MME)。
黄斑变性(MD)、糖尿病性视网膜病(DR)、脊髓损伤：用于治疗MD、 DR及脊髓损伤的药物组合物可包含下列化合物组合：1)与VEGFsiRNA、 VEGF-R1 siRNA、VEGF R2 siRNA、PKCbeta siRNA、MCP1 siRNA、eNOS siRNA、KLF2 siRNA、RTP801L siRNA中任一个组合的RTP801 siRNA(以 物理方式混合或在串联分子中)；2)与以上清单的两种或两种以上 siRNA组合的RTP801 siRNA(以物理方式混合或在编码三种siRNA的串 联分子中或其组合)。
COPD及呼吸病症：用于治疗呼吸病症的药物组合物可包含下列化 合物组合：与对抗一或多种以下基因的siRNA组合的RTP801：弹性蛋白 酶、基质金属蛋白酶、磷脂酶、卡斯蛋白酶、神经鞘磷脂酶及神经酰 胺合酶。
此外，RTP801 siRNA或包含或编码RTP801 siRNA的任何核酸分子 可连接(共价或非共价)抗体或适体以获得增强的靶向作用，从而治疗 本文所揭示的疾病，根据下列情形：
ARF：抗Fas抗体(优选为中和抗体)。
黄斑变性、糖尿病性视网膜病、脊髓损伤：抗Fas抗体或适体、抗 MCP1抗体或适体、抗VEGFR1及抗VEGFR2抗体或适体。抗体优选应为中 和抗体。
包含本文所揭示的siRNA序列(具有适当核酸修饰)的任何分子(诸 如反义DNA分子)尤其理想，且可以与其相应siRNA相同的能力用于本文 所揭示的所有用途及方法。
本发明亦包含治疗罹患诸如本文所述病症的患者的方法，该方法 包括将治疗有效量的以上组合物或化合物给药于患者以藉此治疗患 者。
术语＂反义＂(AS)或＂反义片段＂意谓具有抑制反义活性的聚核苷酸 片度(包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或两者的混合物)，该活性使 相应基因(在此情形下为RTP801)的内源性基因复本的表达减少。 RTP801AS聚核苷酸是包含具有足够长度且与存在于SEQ ID NO：1所陈 述的RTP801基因序列中的序列同源的序列的连续核苷酸的聚核苷酸以 使AS与基因杂交。设计AS的序列以互补所关注的靶向mRNA且形成 RNA：AS双链体。此双链体形成可预防相关mRNA的加工、剪接、转运或 转译。此外，某些AS核苷酸序列在与其靶向mRNA杂交时可引发细胞核 糖核酸酶H活性，导致mRNA降解(Calabretta等人，1996：Antisense strategies in the treatment of leukemias.Semin Oncol. 23(1)：78-87)。在该情形下，核糖核酸酶H将裂解双链体的RNA组份且 可潜在释放AS以进一步与靶向RNA的其它分子杂交。另一作用模式源自 AS与基因组DNA的相互作用以形成可经转录失活的三螺旋结构。特定AS 片段为编码本文所述RTP801的特定片段的DNA的AS。
多篇评论已报导了反义(AS)技术及其治疗潜力的主要方面 (Wright & Anazodo，1995.Antisense Molecules and Their Potential For The Treatment Of Cancer and AIDS.Cancer J. 8：185-189)。存在对此技术的化学(Crooke，1995.Progress in antisense therapeutics，Hematol.Pathol.2：59；Uhlmann及 Peyman，1990.Antisense Oligonucleotides：A New Therapeutic Principle.Chem Rev 90(4)：543-584)、细胞(Wagner，1994.Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides.Nature 372：333)及治疗(Hanania等人1995.Recent advances in the application of gene therapy to human disease.Am.J.Med. 99：537；Scanlon等人，1995.Oligonucleotides-mediated modulation of mammalian gene expression.FASEB J.9：1288； Gewirtz，1993.Oligodeoxynucleotide-based therapeutics for human leukemias，Stem Cells Dayt.11：96)方面的评论。
反义干扰特异性基因的表达可藉由使用合成AS寡核苷酸序列来获 得(Lefebvre-d′Hellencourt等人，1995.Immunomodulation by cytokine antisense oligonucleotides.Eur.Cytokine Netw.6：7； Agrawal，1996.Antisense oligonucleotides：towards clinical trials，TIBTECH，14：376；Lev-Lehman等人，1997.Antisense Oligomers in vitro and in vivo.In Antisense Therapeutics，A. Cohen及S.Smicek编(Plenum Press，New York))。设计AS寡核苷酸 序列以互补所关注的靶向mRNA且形成RNA：AS双链体。此双链体形成可 预防相关mRNA的加工、剪接、转运或转译。此外，某些AS核苷酸序列 在与其靶向mRNA杂交时可引发细胞核糖核酸酶H活性，导致mRNA降解 (Calabretta等人，1996：Antisense strategies in the treatment ofleukemias.Semin.Oncol.23：78)。在该情形下，核糖核酸酶H将 裂解双链体的RNA组份且可潜在释放AS以进一步与靶向RNA的其它分子 杂交。另一作用模式源自AS与基因组DNA的相互作用以形成可经转录失 活的三螺旋结构。
选择反义寡核苷酸的序列靶向片段以使得序列显示关于寡核苷酸 与其互补模板形成双链体的重要的适合能量相关特征，且显示自体二 聚或自体互补的低潜能(Anazodo等人，1996)。举例而言，计算机程序 OLIGO(Primer Analysis Software，3.4版本)可用以确定反义序列熔 融温度、自由能性质且评估潜在自体二聚体形成及自体互补性质。该 程序确定此两个参数(潜在自体二聚体形成及自体互补)的定性评估且 提供＂无潜能＂或＂某些潜能＂或＂基本上完全潜能＂的指示。使用此程序， 一般选择评估在这类参数上无潜能的靶向片段。然而，可使用具有该 类别之一的＂某些潜能＂的片段。
如本领域所知，在选择中使用该参数的平衡。此外，亦在有需要 时选择寡核苷酸以使类似取代大体上不影响功能。
在有效且在动物中显示足够药物动力学半衰期的浓度下，硫代磷 酸酯反义寡核苷酸通常不显示显著毒性(Agrawal，1996.Antisense oligonucleotides：towards clinical trials，TIBTECH，14：376) 及耐核酸酶性。细胞发育相关的反义诱发的功能损失表型已关于胶质 纤维酸性蛋白(GFAP)显示以建立鸡中的顶盖板形成(Galileo等人， 1991.J.Cell.Biol.，112：1285)，且关于N-myc蛋白(负责维持神 经外胚培养物中的细胞异质)(上皮细胞与成神经细胞相比，两者不同 在于其菌落形成能力、致瘤性及黏附特性)显示(Rosolen等人，1990. Cancer Res.50：6316；Whitesell等人，1991.Episome-generated N-myc antisense RNA restricts the differentiation potential of primitive neuroectodermal cell lines.Mol.Cell.Biol. 11：1360)。基本成纤维细胞生长因子(bFgF)(具有致有丝分裂及血管生 成性质)的反义寡核苷酸抑制以可饱和且特定的方式抑制神经胶质瘤 细胞的80％生长(Morrison，1991.Suppression of basic fibroblast growth factor expression by antisense oligonucleotides inhibits the growth of transformed human astrocytes.J.Biol. Chem.266：728)。疏水性反义寡核苷酸与磷脂膜充分地相互作用 (Akhter等人，1991.Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes (liposomes)Nuc.Res.19：5551-5559)。在反义寡核苷酸与细胞质 膜相互作用后，其以经预测涉及特异性受体的可饱和机制(Yakubov等 人，1989.PNAS USA 86：6454)主动(或被动)转运至活细胞中(Loke等 人，1989.Characterization of oligonucleotide transport into living cells.PNAS USA 86：3474)。
＂核糖核酸酶＂为具有RNA催化能力(参见Cech评论)且裂解靶向RNA 中的特定位点的RNA分子。
根据本发明，裂解RTP801 mRNA的核糖核酸酶可用作RTP801抑制剂。 在反向疗法受到化学计量考虑限制的情形下，此可为必需的(Sarver 等人，1990，Gene Regulation and Aids，第305-325页)。
接着可使用将靶向RTP801序列的核糖核酸酶。藉由核糖核酸酶裂 解的RNA分子的数目大于藉由化学计量学预测的数目(Hampel及Tritz， 1989；Uhlenbeck，1987)。
核糖核酸酶催化RNA的磷酸二酯键裂解。已鉴别出若干核糖核酸酶 结构家族，包括最初衍生自烟草环斑病毒卫星RNA(sTRSV)负链的I族内 含子、核糖核酸酶P、肝炎δ病毒核糖核苷酸、锤头型核糖核酸酶及发 夹型核糖核酸酶(Sullivan，1994；美国专利第5,225,347号，第4-5 行)。后两个家族衍生自类病毒及拟病毒，其中据信核糖核酸酶自在滚 环复制期间产生的寡聚体分离出单体(Symons，1989及1992)。对基因 疗法而言，锤头型及发夹型核糖核酸酶主结构最常适于mRNA的逆裂解 (Sullivan，1994)。如本领域已知，选择用于本发明的核糖核酸酶类 型。发夹型核糖核酸酶现在临床试验中且为优选类型。核糖核酸酶一 般长为30-100个核苷酸。核糖核酸酶的传递类似于AS片段和/或siRNA 分子的传递。
应注意用于本发明的所有聚核苷酸均可经历修饰以具有改善的治 疗性质。可引入核苷酸的修饰或类似物以改善聚核苷酸的治疗性质。 改善的性质包括增加的抗核酸酶性和/或增加的渗透细胞膜能力。若需 要，则抗核酸酶性应藉由本领域已知的任何方法来提供，该方法不干 扰使用且传递该方法所需的AS聚核苷酸siRNA、cDNA和/或核糖核酸酶 的生物活性(Iyer等人，1990；Eckstein，1985；Spitzer及Eckstein， 1988；Woolf等人，1990；Shaw等人，1991)。可对寡核苷酸进行修饰 以增强抗核酸酶性，该修饰包括修饰磷酸酯主链中的磷或氧杂原子。 这类修饰包括制备膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及吗啉寡聚 物。在一实施方式中，提供键联在4至6个3′末端核苷酸碱基之间的硫 代磷酸酯键。或者，硫代磷酸酯键会连接所有核苷酸碱基。
本领域已知的其它修饰可用于保持生物活性但大体上增加核酸酶 稳定性的情况。
聚核苷酸的所有类似物或修饰均可用于本发明，其限制条件为该 类似物或修饰大体上不影响聚核苷酸的功能。核苷酸可选自天然产生 或合成的经修饰碱基。天然产生的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、 胸腺嘧啶及尿嘧啶。经修饰的核苷酸碱基包括下列各物：肌苷、黄嘌 呤、次黄嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基及其它烷基腺嘌呤、 5-卤基尿嘧啶、5-卤基胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶及6-氮杂胸腺嘧啶、假 尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤基腺嘌呤、8-胺基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、 8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤及其它8-取代腺嘌呤、8-卤基鸟嘌 呤、8-胺基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌 呤及其它经取代的鸟嘌呤、其它氮杂及脱氮腺嘌呤、其它氮杂及脱氮 鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶及5-三氟胞嘧啶。
此外，可制备聚核苷酸的类似物，其中核苷酸的结构基本上改变 且该聚核苷酸类似物更适用作治疗或实验试剂。核苷酸类似物的实例 为肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链已用 类似于肽中所发现的主链的聚酰胺主链置换。PNA类似物已显示出对抗 酶降解性且具有活体内及活体外的延长寿命。此外，PNA已显示出比DNA 分子更强地结合互补DNA序列。此观测归因于PNA链与DNA链之间电荷排 斥的缺乏。可对寡核苷酸进行的其他修饰包括聚合物主链、环状主链 或非环状主链。
用于本发明的多肽亦可经修饰，任选经化学修饰以改善其治疗活 性。当涉及多肽时，＂经化学修饰＂意谓多肽的至少一个氨基酸残基藉 由天然方法(诸如加工或其它转译后修饰)或藉由本领域熟知的化学修 饰技术来修饰。在大量已知的修饰中，典型但非唯一的实例包括乙酰 化、酰化、酰胺化、ADP核糖基化、糖基化、GPI锚形成、脂质或脂质 衍生物的共价连接、甲基化、肉豆蔻酰化、聚乙二醇化、异戊二烯基 化、磷酸化、泛素化或任何类似方法。
其它可能性多肽修饰(诸如源自核酸序列改变的修饰)包括下列修 饰：
＂保守性取代＂是指一种氨基酸藉由相同种类氨基酸取代，其中一 种类别藉由通用物理化学氨基酸侧链性质及天然发现的同源多肽中的 高取代频率(例如藉由标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵测定) 来定义。已分成6种一般氨基酸侧链且其包括：I类(Cys)、II类(Ser、 Thr、Pro、Ala、Gly)、III类(Asn、Asp、Gin、Glu)、IV类(His、Arg、 Lys、)、V类(Ile、Leu、Val、Met)及VI类(Phe、Tyr、Trp)。举例而 言，用另一III类残基(诸如Asn、Gln或Glu)取代Asp为保守性取代。＂ 非保守性取代＂是指用一类氨基酸取代另一类氨基酸；举例而言，用III 类残基(诸如Asp、Asn、Glu或Gln)取代II类残基Ala。
＂缺失＂-核苷酸或氨基酸序列的改变，其中一或多个核苷酸或氨基 酸残基分别缺乏。
＂插入＂或＂添加＂-核苷酸或氨基酸序列的变化，其导致分别与天然 产生的序列相比，添加一或多个核苷酸或氨基酸残基。
＂取代＂-藉由不同核苷酸或氨基酸分别置换一或多个核苷酸或氨 基酸。关于氨基酸序列，取代可为保守性或非保守性的。
在本发明的另一实施方式中，RTP801多肽或聚核苷酸可用以诊断 或检测受检者的黄斑变性。检测方法通常应包含在得自受检者的样品 中检定RTP801mRNA或RTP801多肽。
＂检测＂-是指检测疾病的方法。此术语可指疾病诱因的检测或疾病 严重程度的检测。
如本发明所用的＂同源/同源性＂意谓至少约70％、优选至少约75％同 源、有利地至少约80％同源、更有利地至少约90％同源、甚至更有利地 至少约95％(例如至少约97％、约98％、约99％或甚至约100％)同源。本发 明亦包含这类聚核苷酸及多肽可以与本文或上述聚核苷酸及多肽相同 的方式使用。
其它或另外，序列的＂同源性＂可指一致核苷酸或氨基酸残基的位 置数除以两个序列中的较短序列的核苷酸或氨基酸残基数，其中两个 序列的对准可根据Wilbur and Lipman算法((1983)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80：726)来测定；例如使用20个核苷酸的窗口尺寸、4个核苷 酸的字长及4个空隙处罚，使用市售程序可便利地实施序列数据的计算 机辅助分析及解释(包括对准)(例如Intelligenetics Suite， Intelligenetics Inc.，CA)。当RNA序列据说类似或与DNA序列在一 定程度上具有序列同一性或同源性时，认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T) 与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。本发明范畴内的RNA序列可藉由用尿嘧 啶(U)取代DNA序列中的胸腺嘧啶(T)而衍生自DNA序列或其互补序列。
另外或其它，可(例如)使用BlastP程序(Altschul等人，Nucl. Acids Res.25：3389-3402，可在NCBI获得)来测定氨基酸序列的类似 性或同源性。下列文献提供用于比较两种多肽的氨基酸残基的相对同 一性或同源性的算法，且另外或其它，关于前述内容，这类文献中的 教导可用于测定同源性百分比：Smith等人，(1981)Adv.Appl.Math. 2：482-489；Smith等人，(1983)Nucl.Acids Res.11：2205-2220； Devereux等人，(1984)Nucl.Acids Res.12：387-395；Feng等人， (1987)J.Molec.Evol.25：351-360；Higgins等人，(1989)CABIOS 5：151-153；及Thompson等人，(1994)Nucl.Acids Res. 22：4673-4680。
＂具有至少X％同源性＂-关于两个氨基酸或核苷酸序列，是指当两个 序列最适对准时，两个序列中相同残基的百分比。因此，90％氨基酸序 列一致意谓二或多个最适对准的多肽序列中90％氨基酸相同。
本发明的另一实施例涉及一种包含治疗有效量的RTP801抑制剂作 为活性成份及可药用载体的药物组合物。抑制剂可为生物抑制剂、有 机分子、化学分子等。该药物组合物可包含一种RTP801抑制剂为一个 聚核苷酸，其包含的连续核苷酸具有一个序列为图1所陈述序列(SEQ ID NO：1)的反义序列。此外，RTP801抑制剂可为一种包含这类聚核苷 酸的载体。此外，RTP801抑制剂可为一种单克隆抗体，其特异性结合 于一个包含图2所陈述的4-25个氨基酸(SEQ ID No：2)的抗原决定簇， 或为一种RNA分子，其靶向RTP801基因mRNA，诸如siRNA分子(任选描述 于表A-D中，特别是表A的siRNA Nos：22、23、25、27、39、41、42、 49及50或表D的siRNA Nos：257、260-262及264-268)或一种核糖核酸 酶。
药物组合物的活性成份可包括具有实施本发明所需的核酸酶抗性 的寡核苷酸或其显示具有相同靶向适当序列和/或核糖核酸酶作用的 片段。可使用如本发明所揭示的活性成份的组合物，包括反义序列的 组合物。
本发明的另一实施例提供治疗有效量的RTP801抑制剂用于制备一 种用于促进罹患脊髓疾病或损伤的患者恢复的药剂的用途。在一实施 方式中，抑制剂优选为siRNA。在另一实施方式中，抑制剂优选为本文 所述的结构A。
本发明已以例示性方式来描述，且应了解意欲所使用的术语具有 描述词语的性质而非限制性。
根据上文教导，显然可能存在本发明的多种修改及变化。因此， 应了解在随附申请专利范围的范畴内，本发明的实施可与特定描述不 同。
在整个本申请案中，各种公开案(包括美国专利)均由作者引用且 年份及专利藉由数字来引用。这类公开案及专利及专利申请案的揭示 内容均以全文引用的方式并入本申请案中，以更全面描述本发明所属 的当前技术。
附图简述
图1详述RTP801基因的编码序列(SEQ ID NO：1)；
图2详述RTP801多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；
图3为描述具有人类特异性或人类、小鼠及大鼠平行特异性的各种 核酸分子的外显子、CDS、人类SNP及位置的图；
图4A-H描述对第一人类细胞株应用本发明的多种双链核酸所获得 的西方墨点分析结果的面板，其中实验实施两次，称为实验1及实验2， 且其中p110a及p85的表达水平表示负载对照组且RTP801带的强度(密 度)是测量所用特定双链核酸的抑制活性的方法；
图5A-F描述对第二人类细胞株应用本发明的多种双链核酸所获得 的西方墨点分析结果的面板，其中实验实施两次，称为实验1及实验2， 且其中p110a及p85的表达水平表示负载对照组且RTP801带的密度是测 量所用特定双链核酸的抑制活性的方法；
图6A-C描述对不同浓度(亦即10nM(5A)、5nM(5B)及1nM(5C))的 第一人类细胞株应用本发明的多种双链核酸所获得的西方墨点分析结 果的面板，其中实验实施两次，称为实验1及实验2，且其中p110a及p85 的表达水平表示负载对照组且RTP801带的密度是测量所用特定双链核 酸的抑制活性的方法；
图7描述对小鼠细胞株应用本发明的多种双链核酸所获得的西方 墨点分析结果的面板，其中实验实施两次，称为实验1及实验2，且其 中p110a及p85的表达水平表示负载对照组且RTP801带的密度是测量所 用特定双链核酸的抑制活性的方法；
图8显示在小鼠AMD模型系统中的实验结果；
图9显示在小鼠AMD模型系统中的其它实验结果；
图10显示在非人类灵长类动物AMD模型系统中的实验结果；
图11A-B显示在非人类灵长类动物AMD模型系统中的其它实验结 果；
图12A-B显示在非人类灵长类动物AMD模型系统中的其它实验结 果；
图13A-B表示在非人类灵长类动物AMD模型中所获得的实验结果的 分析；
图14表示在非人类灵长类动物AMD模型中所获得的实验结果的另 一分析；
图15A-C显示包括气管内滴注表达质粒的RTP801至小鼠中的实验 的结果；
图16A-C显示在RTP801 KO及WT小鼠中的短期(7天)吸烟模型的结 果；
图17A-C显示在用活性抗RTP801(REDD14)及对照(REDD8)siRNA滴 注的WT小鼠中的短期吸烟模型的结果；
图18显示长期CS模型中的RTP801 KO小鼠的实验结果；
图19显示在小鼠ARF模型系统中的实验结果；
图20显示在小鼠糖尿病性视网膜病模型系统中的实验结果；
图21显示在小鼠糖尿病性视网膜病模型系统中的其它实验结果；
图22显示在小鼠糖尿病性视网膜病模型系统中的其它实验结果；
图23显示在小鼠CNV模型系统中的组合RTP801/VEGF抑制实验的结 果；
图24显示在小鼠CNV模型系统中的其它组合RTP801/VEGF抑制实验 的结果；
图25显示研究RTP801 siRNA对RPE及神经视网膜中的基因表达的影 响的实验的结果；
图26A-B显示研究RTP801 siRNA对RPE及神经视网膜中的基因表达 的影响的实验的其它结果；及
图27显示证实RT801NP与RTP801具有同样活性的实验结果；
图28显示与801_1(SEQ ID No 430及527)及801_4(SEQ ID No 433 及530)相关的功效结果；
图29显示与801_1(SEQ ID No 430及527)及801_4(SEQ ID No 433 及530)相关的功效结果；
图30显示与801_1(SEQ ID No 430及527)及801_4(SEQ ID No 433 及530)相关的其它功效结果。

无进一步详细说明，相信本领域技术人员使用前述描述可最大程 度利用本发明。因此，下列优选的特定实施例可解释为仅具例示性且 不以任何方式限制本发明。
本文未特定描述的本领域已知的标准分子生物学方案一般基本上 根据下列文献：Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New-York(1989，1992)； 及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1988)。
本文未特定描述的本领域已知的标准有机合成方案一般基本上根 据下列文献：Organic syntheses：1-79卷，编辑不同，J.Wiley，New York，(1941-2003)；Gewert等人，Organic synthesis workbook， Wiley-VCH，Weinheim(2000)；Smith及March，Advanced Organic Chemistry，Wiley-Interscience；第5版(2001)。
本文未特定描述的本领域已知的标准医药化学方法一般基本上根 据多名作者及编辑的由Pergamon Press公开的＂Comprehensive Medicinal Chemistry＂系列。
揭示于说明书、申请专利范围和/或图式中的本发明特征可单独及 以其任何组合用于了解本发明的各种形式。
实施例1
通用物质及方法
若未相反说明，则下列物质及方法用于实施例1-5中：
细胞培养：
如下培养第一人类细胞株，亦即海拉细胞(HeLa cell)(American Type Culture Collection)：海拉细胞(American Type Culture Collection)如Czauderna F等人(Czauderna，F.，Fechtner，M， Aygun，H.，Arnold，W.，Klippel，A.，Giese，K.& Kaufmann，J. (2003).Nucleic Acids Res，31，670-82)中所述来培养。
第二人类细胞株为如下培育的人类角质细胞细胞株：
在含有10％FCS的杜尔贝科改性伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)中，于37℃下培养人类角质细胞。
小鼠细胞株为在含有10％FCS的杜尔贝科改性伊格尔培养基(DMEM) 中于37℃下培养的B16V(American Type Culture Collection)。培养 条件描述于Methods Find Exp Clin Pharmacol.1997年5月；19(4)： 231-9中。
在各情形下，在每孔约50,000个细胞的密度下使细胞经受如本文 所述的实验，且本发明的双链核酸以20nM来添加，其中使用1μg/ml 的专有脂质来复合双链核酸。
类缺氧条件的诱发
如下将细胞用CoCl2处理以诱发类缺氧条件：如(Czauderna等人， 2003；Kretschmer等人，2003)所述，在10cm培养盘(30-50％融合)中 实施siRNA转染。简言之，藉由将GB及脂质于无血清培养基中的预形成 10x浓复合物添加至完全培养基中的细胞中来转染siRNA。总转染体积 为10ml。最终脂质浓度为1.0μg/ml；除非另外说明，否则最终siRNA 浓度为20nM。低氧反应的诱发藉由在溶解前24h直接添加CoCl2(100 μM)至组织培养基中来实施。
细胞萃取物及免疫印迹的制备
细胞萃取物的制备及免疫墨点分析基本上均如Klippel等人 (Klippel，A.，Escobedo，M.A.，Wachowicz，M.S.，Apell，G.， Brown，T.W.，Giedlin，M.A.，Kavanaugh，W.M.& Williams，L.T. (1998).Mol Cell Biol，18，5699-711；Klippel，A.，Reinhard，C， Kavanaugh，W.M.，Apell，G.，Escobedo，M.A.& Williams，L.T. (1996).Mol Cell Biol，16，4117-27)所述来实施。对抗全长RTP801 的多克隆抗体藉由用自pET19-b表达载体产生细菌的重组RTP801蛋白 免疫兔而产生(Merck Biosciences GmbH，Schwalbach，Germany)。 鼠科动物单株抗p110a及抗p85抗体已由Klippel等人(前述)描述。
实施例2
第一人类细胞株中RTP801表达的减少
制备多种双链核酸。其相对于mRNA及CDS以及人类SNP在编码人类 RTP801的核酸中的位置(数据库寄存编号NM_019058)描述于图3中。将 第一人类细胞株与如实施例1中所述的该双链核酸接触。在类低氧条件 诱发且用该双链核酸处理后，细胞溶解且细胞溶解产物经受免疫印迹。 将PI3激酶的催化单元p110a以及p85用作负载对照组。如使用RTP801 多克隆抗体可视化的RTP801带强度是根据RTP801表达水平的减少来测 量个别双链核酸活性的方法。
每一及任一双链核酸均已经修饰，使得2′O-Me基团存在于反义链 的第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十 七及第十九核苷酸上，其中存在极类似修饰，亦即2′O-Me基团存在于 有义链的第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六 及第十八核苷酸上。此外，应注意在本发明的这类特定核酸情形下， 第一链段与第一链一致且第二链段与第二链一致且这类核酸亦经末端 平整化。
将实验实施两次且个别结果显示于图4A至H中，其中该实验分别命 名为实验1及实验2。
图4A至H中的表示h、hr及hmr表明设计各自双链核酸以(例如)处理 具有人类RTP801 mRNA(h)特异性的RTP801 mRNA区，处理具有人类及大 鼠RTP801 mRNA(hr)特异性的RTP801 mRNA区，且处理具有人类、小鼠 及大鼠RTP801 mRNA(hmr)特异性的RTP801 mRNA区。将称为no.40.1 的双链核酸用作正性对照且将未经处理的细胞(UT+)用作负性对照。
根据结果，证实下列双链核酸尤其适用于下调RTP801的表达：no. 14、no.15、no.20、no.21、no.22、no.23、no.24、no.25、 no.27、no.39、no.40、no.41、no.42、no.43、no.44、no.49 及no.50(参见表A)。
实施例3
第二人类细胞株中RTP801表达的减少
使用如实施例1中所指定的第二人类细胞株重复如实施例2所述的 实验，且结果描述于图5A至F中。
如可自这类图中推断，使用此第二人类细胞株证实如实施例2中所 述的实验所得的结果。
实施例4
RTP801特异性双链核酸的剂量作用
在此实验中，研究RTP801特异性双链核酸的剂量作用。
为获得此目的，使海拉细胞如实施例2及3经处理，其中培养肉汤 中双链核酸的浓度为10nM、5nM及1nM。将no.40.1的双链核酸用作 正性对照，将未经处理的细胞(UT+)用作负性对照。读出与实施例2及3 中所述相同。所用特定双链核酸为具有内部参考号14、22、23及27的 双链核酸(针对人类、小鼠及大鼠共享的RTP801 mRNA上的链段)及具有 内部参考号39及42的双链核酸(针对具有人类RTP801特异性的RTP801 mRNA的链段)。
结果显示于图6A至C中。根据该图，可得出对RTP801具有特异性的 双链核苷酸的作用明显视浓度而定，其中具有内部参考号1、15、20、 21、24、40、41、43、44、22、23、27、39、42、40.1、44.1及14、 优选22、23、27、39、42、40.1及44.1且更优选14、23及27的核酸分 子且优选具有如在本文实验部分所述的特定修饰类型的该核酸分子的 每一个尤其有效。
实施例5
RTP801特异性双链核酸的物种特异性
已设计对抗各种物种中的相同或不同RTP801 mRNA链段的本发明的 双链核酸。为测试RTP801特异性双链核酸的物种特异性是否存在，根 据使用如实施例1及2中所指定的相同方法及读出下调RTP801来比较具 有内部参考号14、22、23及27的处理人类、小鼠及大鼠RTP801 mRNA 中的保守RTP801 mRNA链段的双链核酸与具有内部参考号39及42的处 理人类RTP801 mRNA的特异性RTP801 mRNA链段(亦即处理不存在于小鼠 或大鼠中的链段)的双链核酸。
虽然所用的所有双链核酸原则上活性对抗人类mRNA，且如前述实 施例中所示，其亦适于下调RTP801的表达，但在使用小鼠细胞株后， 仅亦特异性针对小鼠RTP801 mRNA的那些双链核酸(亦即双链核酸 no.14、22、23及27)有效减少RTP801表达。
根据此结果，可得出可能设计处理特异性针对一或多种物种的双 链核酸的RTP801。此允许使用在动物模型及人中极类似的分子。
实施例6
与黄斑变性相关的实验模型、方法及结果
在以下脉络膜新血管生成(CNV)的动物模型中测试本发明的化合 物。湿式AMD的此特征藉由激光处理在模型动物中诱发。
A)小鼠模型
脉络膜新血管生成(CNV)诱发
脉络膜新血管生成(CNV)为湿式AMD的特征，其藉由在第0天藉由并 不知晓药物组分配的单独个体在各小鼠的双眼上实施激光凝固(532 nm，200mW，100ms，75μm)(OcuLight GL，Iridex，Mountain View， CA)来引发。在视神经周围以标准化方式施加激光光斑，其中使用裂缝 灯传递系统及盖玻片作为隐形眼镜。
治疗组
在下列各组小鼠(6-8周大的雄性小鼠)中诱发CNV：
(1)12只WT小鼠；
(2)12只RTP801基因剔除小鼠；
(3)在0天及7天，在一只眼睛中用0.25μg合成稳定活性抗 RTP801 siRNA(REDD14)注射及在另一只眼睛中用失活抗RTP801 siRNA(REDD8-负性对照)注射的12只WT小鼠；
(4)在0天及7天，在一只眼睛中用0.25μg合成稳定活性抗 RTP801 siRNA(REDD14)注射及在另一只眼睛中用失活抗GFP siRNA(负 性对照)注射的12只WT小鼠；
(5)在0天及7天，在一只眼睛中用0.1μg合成稳定活性抗 RTP801 siRNA(REDD14)注射及在另一只眼睛中用PBS(负性对照)注射 的12只WT小鼠；
(6)在0天及7天，在一只眼睛中用0.05μg合成稳定活性抗 RTP801 siRNA(REDD14)注射及在另一只眼睛中用PBS(负性对照)注射 的12只WT小鼠。
各小鼠的双睛均经激光处理。所注射的体积为2μl。
评估
1.在第14天终止实验。为进行评估，将眼睛摘出且用4％聚甲醛在 4℃下固定30min。将感觉神经视网膜分离且自视神经切断。将残余 RPE-脉络膜-巩膜复合物平坦封固于Immu-Mount(Vectashield封固培 养基、载体)中且盖片。将平坦封固件用扫描激光共聚焦显微镜(TCS SP，Leica，Germany)下检查。藉由用蓝色氩激光激发来可视化脉管。 自RPE-脉络膜-巩膜复合物的表面获得水平眼区(1μm级距)。判断出 其中连接损害的周围脉络膜血管网可经鉴别的最深焦平面为损害层。 在经激光处理的区域中且在此参考平面表面的任何血管经判断为CNV。 各区的影像经数字储存。CNV相关的荧光区藉由计算机化影像分析使用 Leica TCS SP软件来测量。整个荧光区在各水平区中的总数用作CNV 体积的指数。
2.对自RPE/脉络膜或自神经视网膜萃取的RNA使用实时PCR，将单 独WT小鼠(每组5只眼睛)用于评估CNV中的RTP801 mRNA表达(以及相关 于AMD的其它基因的表达)(未经治疗及经siRNA治疗)。
结果
1.在CNV诱发后，RTP801 KO小鼠显示与WT小鼠相比30％减少的血 管渗漏。
2.对抗RTP801的合成稳定siRNA(REDD14)引起CNV体积的剂量依 赖性减少。在每只眼睛0.25μg剂量的REDD14(表A中序列号14，SEQ ID No.16(有义)及66(反义))下，获得与注射PBS的眼睛相比约70％抑制的 最大值。在相同剂量下，两个负性对照siRNA(REDD8及抗GFP siRNA) 分别显示仅27％及33％的CNV体积减少，此支持REDD14的较高功效以及其 作用的特异性。
B)非人类灵长类动物模型
CNV诱发
将八只2-6岁大的雄性石蟹猕猴(食蟹猴)用于研究。脉络膜新血管 生成(CNV)藉由在剂量给药前双眼的黄斑周围激光处理来诱发。用激光 (具有IRIS 便携式裂缝灯转接器的OcuLight GL(532nm)激光 凝固器)在黄斑中造成九处损害，且右眼中的激光光斑反映左眼中的位 置。近似激光参数如下：光斑尺寸：50-100μm直径；激光功率：300-700 毫瓦；曝露时间：0.1秒。
治疗
在激光治疗后，使所有动物的双眼立即经受单一玻璃体内注射。 给予左眼最终体积为50μl的350μg抗RTP801的合成稳定siRNA(与 用于小鼠研究中者相同)，而对侧眼接收50μl PBS(媒剂)。
评估
1.使所有动物经受食物消耗及体重测量的每日检查。
2.CNV诱发后，在第6天对2只猴实施安乐死。摘出其眼且使后极 变平。接着切割凹区且将其分成脉络膜及神经视网膜，将脉络膜及神 经视网膜(每只动物)单独冷冻于液氮中以随后用于RNA萃取及RTP801 表达的实时PCR评估。
3.在研究前及在CNV诱发后1、2及3周结束时实施荧光素血管造 影。使用眼底摄影机(TRC-50EX视网膜摄影机)拍摄照片。使用TOPCON IMAGEnetTM系统捕获影像。经由血管进口注射荧光素染料(10％荧光素 钠，约0.1mL/kg)。在染料注射后若干时间点拍摄照片以包括动脉阶 段、早期动静脉阶段及若干晚期动静脉阶段，以评估新血管生成且监 控与CNV损害相关的荧光素渗漏。荧光素血管造影的解释及分析独立由 两名眼科医师进行。
在早期血管造影中分析新血管生成(NV)且根据下列方案对每一光 斑分级：
0           -无NV标记
0.5         -可疑光斑
1           -＂热＂光斑
2           -激光灼伤中的NV
3           -明显NV
根据下列方案分析渗漏：
0           -无渗漏
0.5         -可疑光斑
1           -明显小光斑渗漏
2           -随时间生长的渗漏
3           -比先前边界大(明显)的渗漏
此外，使用形态测量法在早期血管造影与晚期血管造影之间比较 每一光斑尺寸，且计算源自渗漏的光斑尺寸增加。
4.在研究前及在3周结束时，根据Sierra′s SOP及研究特异性SOP， 使用Epic 2000视网膜电流描记器来记录视网膜电流图(ERG)，包括使 用Ganzfield设备。藉由兽医眼科医师来评估制成表的ERG数据。
在CNV诱发后21天终止研究。在包括眼睛的器官及组织上实施总体 尸体解剖及组织检查。
结果
1.对抗RTP801的siRNA减少经激光治疗的动物的RPE/脉络膜中 RTP801表达，如藉由实时PCR在CNV诱发后第6天所测量(参见图10)。
2.在各猴的同侧眼之间比较渗漏及新血管生成的光斑等级，揭示 与对照组相比此两个病理特征在用RTP801 siRNA注射的眼中减少(渗 漏结果，参见图11；新血管生成结果，参见图12)。
3.与所有注射PBS的眼睛相比，在所有注射siRNA的眼睛中对具有 渗漏或新血管生成的更高临床相关等级(2及3)的光斑的总数进行计 算，再次揭示注射siRNA的眼睛更少受影响(参见图13，a+b)。
4.对光斑渗漏及新血管生成的总体等级数据进行统计学评估。 siRNA与对照治疗之间差异的存在是藉由计算对照右(R)眼与注射 siRNA的左(L)眼的平均光斑等级之间的δ(δ＝R-L)来分析。使用无参 数统计学方法威尔卡逊秩和测试(Wilcoxon signed ranks test，单 尾测试)来计算差异的显著性。每周(1、2及3)分别分析不同阶段的血 管造影(早期动脉、动脉静脉及晚期静脉)。
表2显示各组不同于0的渗漏等级的显著性(单尾测试)(小于0.05 的p值加下划线)。在晚期血管造影中2周及3周，相对于右眼(经安慰剂 治疗)，在左眼(经siRNA治疗)中发现显著渗漏等级减少。
表2


注意晚期血管造影常用于评估渗漏参数。
表3显示各组中不同于0的新血管生成(NV)等级的显著性(单尾测 试)(小于0.05的p值加下划线)。
表3

相对于2周及3周的右眼，在2周的早期及动静脉时期于左眼中发现 显著NV等级减少。
注意早期血管造影常用于评估新血管生成参数。
5.对归因于渗漏而出现在早期(动脉阶段)及晚期(静脉阶段)血 管造影之间的光斑的面积增加进行量化形态测量评估，揭示与对照组 (右眼，OD)相比在注射siRNA的眼(左眼，OS)内激光光斑中此参数显著 减少。两个实施例显示于图14中。该图证实动物3315及3300号的左眼 及右眼中每一光斑面积的相对增加(以％计)。
此外，注意在以上所有研究中，抗RTP801 siRNA对视网膜电流图 (ERG)、眼睛组织学或其它器官及系统的结构及功能并无不利影响。
概述以上实验及结果：
1.遗传(RTP801-/-)及治疗siRNA抑制RTP801在患有湿式年龄相 关的黄斑变性(湿式AMD)的激光诱发的CNV模型中的表达，导致CNV体积 显著减少。
2.在小鼠及非人类灵长类动物模型中获得正性结果。
3.猴中病理及ERG检查并未揭示眼睛或任何其它器官或系统中任 何siRNA介导的毒性。
C)RTP801 siRNA(REDD14)及抗VEGF抗体的组合疗法的功效
在以上小鼠CNV模型中测试RTP801 siRNA(REDD14)及抗VEGF抗体的 组合疗法在治疗CNV发生的疾病中的功效。
A)CNV体积研究
藉由如先前所述的共焦荧光显微镜法(Sakurai等人，IOVS 2003； 44：3578-85；及Sakurai等人，IOVS 2003；44：2743-2749)来计算 激光损伤后3周脉络膜新血管生成(CNV)的体积。
在先前研究中，发现抗VEGF-A抗体(Ab)以剂量依赖方式使CNV体积 减少。针对REDD14+VEGF-A Ab组合研究，选择1ng VEGF-A Ab的剂量， 因为此剂量具有中间抑制作用：VEGF-A Ab(1ng)会使CNV尺寸减少 26±6％。
REDD14+VEGF-A抗体(Ab)研究的主要发现为：
与单独VEGF-A Ab相比，添加低于0.05μg剂量的REDD14会使CNV 尺寸减少27±4％。
与单独VEGF-A Ab相比，添加高于0.25μg剂量的REDD14会使CNV 尺寸减少55±3％。
B)CNV渗漏研究
实验1
设计此实验以鉴别在患有激光诱发的脉络膜新血管生成的小鼠模 型中抑制VEGF及RTP801的潜在添加或协同治疗效应。
物质：
·REDD14(RTP801 siRNA)
·REDD8(负性对照)
·抗VEGF抗体
·非特异性IgG(负性对照)
如上所述在第0天诱发CNV；在第0天及第7天，将测试物质注射至 受检者中。
藉由1、2、3周荧光血管造影及藉由第3周CNV体积测量来评估结果。 每一测试组均由10只眼睛构成。
实验组：
·每只眼睛VEGF Ab 0.5ng
·每只眼睛VEGF Ab 1ng
·每只眼睛VEGF Ab 2ng
·每只眼睛VEGF Ab 4ng
·每只眼睛REDD14 0.05μg
·每只眼睛REDD14 0.1μg
·每只眼睛REDD14 0.25μg
·每只眼睛REDD14 0.05μg+每只眼睛VEGF Ab 1ng
·每只眼睛REDD14 0.1μg+每只眼睛VEGF Ab 1ng
·每只眼睛REDD14 0.25μg+每只眼睛VEGF Ab 1ng
对照组
·PBS
·每只眼睛非特异性IgG 2ng
·每只眼睛REDD8 0.1μg
·每只眼睛REDD8 0.1μg+每只眼睛VEGF Ab 1ng
结果
以上实验结果呈现于图23-24中。这类结果显示VEGF Ab及REDD14 的同时玻璃体内给药会导致增加性及剂量依赖性脉络膜新血管生成及 脉络膜血管渗漏抑制，如等级4光斑的减少发生率及等级1光斑的增加 发生率所示。使用对先前公开的半量化等级(1-4)方案的修改(Sakurai 等人，IOVS 2003；44：2743-2749)将血管造影分级。将等级1损害视 为未形成，亦即等于完全预防。将等级4损害视为病理上显著的，亦即 等于在患者中需要治疗的损害。VEGF-A Ab(1ng)会使每只眼睛等级4 损害的发生率减少38±8％且使每只眼睛等级1损害的发生率增加66± 43％。REDD14+VEGF-A Ab组合渗漏研究的主要发现为：
·与单独VEGF-A Ab相比，添加低于0.05μg剂量的REDD14会使 等级4损害的发生率减少66±12％。
·与单独VEGF-A Ab相比，添加高于0.25μg剂量的REDD14会使 等级4损害的发生率减少60±12％。
·与单独VEGF-A Ab相比，添加高于0.25μg剂量的REDD14使等 级1损害的发生率加倍(100±34％)。
实验2
设计此实验以研究REDD14对RPE及神经视网膜中的基因表达的影 响。
实验设计
组：
·PBS
·REDD14 0.25mg
组大小为5只眼睛。在第0天，藉由如上所述的激光处理来诱发CNV； 在第0天亦注射测试物质，且在第0天及第5天藉由qPCR分析RPE及神经 视网膜中的基因表达来评估影响。
结果
以上实验的结果呈现于图25中。这类结果显示给药REDD14会引起：
·RPE及神经视网膜中低于基线的RTP801表达的约40％下调(亦参 见图26)；
·神经视网膜中超过基线的PEDF表达的约70％上调(注意：在注射 PBS的眼睛中，低于基线的PEDF表达下调40％)；
·RPE中低于基线的VEGF164表达的约40％下调(注意：在注射PBS 眼睛中，VEGF164的表达下调20％)；
·在RPE/脉络膜中MCP1表达减少约50％(图26)。
根据两个实验获得的总体结论：
·RTP801及VEGF的同时抑制会增强对脉络膜新血管生成及新血 管渗漏的抑制作用。
·藉由REDD14抑制RTP801表达不仅预防CNV模型中的PEDF下调， 与基线相比亦增强其表达。
·RTP801表达的抑制会导致伴随的应具有消炎作用的MCP1下调。
·不受理论限制，藉由REDD14增加PEDF表达可构成所观测到的 VEGF及RTP801同时抑制的合作效应的基础。(PEDF为熟知的抗血管生成 及神经保护因子)。
·不受理论限制，藉由REDD14减少MCP1表达亦可构成所观测到的 VEGF及RTP801同时抑制的合作效应的基础。(MCP1为涉及AMD发病机理 的已知促炎症趋化细胞素)。
可用以测试本发明方法的额外AMD模型：
·Ccl-2或Ccr-2缺乏的动物-这类蛋白的每一个的缺乏均会引起 AMD的某些主要特征发展。这类蛋白缺乏的动物可用以测试本发明的方 法。
关于AMD动物模型的其它信息参见：Chader，Vision research 42 (2002)393-399；Ambati等人，Nature Medicine 9(11)(2003) 1390-1397；Tolentino等人，Retina 24(2004)132-138。
D)在激光诱发的CNV模型中比较各链上具有3′磷酸酯基的REDD14 抗RTP801 siRNA与缺乏3′磷酸酯基的相同分子(REDD14NP)的活性
一般，如上所述实施且评估实验。将各小鼠(每组12只)之一只眼 睛用0.25μg REDD14 siRNA注射，而将另一只眼睛用REDD14NP siRNA 注射。
结果
两种siRNA同等有效地减小CNV体积(图27)。
实施例7
关于COPD及气肿的模型及结果
在以下动物模型中测试本发明的化合物：
*吸烟诱发的气肿模型：在若干动物(诸如小鼠、豚鼠)中，长期 暴露于烟会引起气肿。
*作为气肿引发物的肺蛋白酶活性。
*气肿的VEGFR抑制模型。
*在啮齿动物中用人类嗜中性粒细胞/胰腺弹性酶滴注支气管。
*MMP(基质金属蛋白酶)诱发的气肿。
*炎症诱发的气肿。
此外，气肿模型可经由遗传方式(例如携带TSK突变的小鼠)产生， 且气肿性动物可藉由已知对气肿敏感的改性剂而产生，诸如肺损伤、 肺泡发育不全、氧过多、糖皮质激素治疗及营养。
A.缺乏RTP801对患有气肿的小鼠模型中疾病发展的影响的评估 (使用RTP801基因剔除小鼠)
(1)吸烟(CS)诱发的炎症及细胞凋亡起始于5只RTP KO及5只对 照野生型雄性小鼠(4个月大)。使小鼠经受强烈CS(如Rangasamy等人中 所述，参见上文)历经7天。来自以上VEGFR抑制实验的未经KO及WT处理 小鼠亦可用作此实验的未经治疗对照组。随后使肺经琼脂糖膨胀，固 定且将其埋入石蜡中，且藉由以下步骤来分析KO小鼠中的发育氧化应 力：
a)对肺切片中的8-氧代-dG进行免疫组织化学定位及量化；
b)使用特异性抗体对肺切片中的活性卡斯蛋白酶3进行免疫组织 化学定位及量化，或对TUNEL阳性细胞数目进行量化评估；
c)测量肺萃取物中的神经酰胺浓度；
d)测量肺萃取物中的卡斯蛋白酶活性。
(2)长期吸烟的KO小鼠
在6个月时期内，使6只KO及6只年龄相符的WT雌性小鼠经受强烈吸 烟(一天5小时)。接着杀死小鼠，且使用形态测量方法评估平均隔间直 径(气肿发育的参数)。
B.藉由使用肺内传递RTP801失活siRNA抑制内源性RTP801来评估 缺乏RTP801对患有气肿的小鼠模型中疾病进程的影响
在2组C57BL6小鼠(每组10只小鼠)中，藉由7天吸烟来诱发CS诱发 的炎症。组1：CS+对照siRNA(REDD8)siRNA的传递；组2：CS+RTP801 siRNA(REDD14)。将小鼠的对照组用每一类型的siRNA滴注但保持于室 内空气条件下。如同以上用基因剔除小鼠进行的实验，评估动物。
方法
暴露于吸烟(CS)
藉由燃烧2R4F参考烟(每只烟2.45mg烟碱；购自Tobacco Research Institute，University of Kentucky，Lexington，KY，USA)，使用 吸烟机(模型TE-10，Teague Enterprises，Davis，CA，USA)来实施 暴露(每天7h，每周7天)。以1.05L/min的流动速率吹开各闷烧的烟 历经2s，每分钟总共八团烟，以提供35cm3的标准烟团。调节吸烟机 以藉由同时燃烧5只烟来产生侧流烟(89％)及主流烟(11％)的混合物。监 控腔室气氛以使总悬浮颗粒及一氧化碳浓度分别为90mg/m3及350 ppm。
形态学及形态测量分析
在使小鼠暴露于CS或滴注表达质粒的RTP801后，用氟烷麻醉小鼠 且如先前所述6在25cm的恒定压力下用0.5％低熔点琼脂糖使肺膨胀。 将膨胀的肺固定于10％经缓冲的福尔马林中且埋入石蜡中。将切片(5 μm)用苏木精及曙红染色。平均肺泡直径、肺泡长度及平均直线截距 藉由具有Image Pro Plus软件(Media Cybernetics，Silver Spring， MD，USA)的计算机辅助形态测量来测定。编码各组的肺切片且由并不 知晓载玻片身份的研究者用Nikon E800显微镜(20X透镜)获得代表性 影像(每个肺切片15个影像)。
支气管肺泡灌洗(BAL)及表型
在暴露于CS或滴注表达质粒的RTP801后，将小鼠用戊巴比妥钠 (sodium pentobarbital)麻醉。将自小鼠的肺收集的BAL液离心(4℃ 下，500′g)且将细胞小球再悬浮于磷酸盐缓冲的生理食盐水中。测定 灌洗液中的细胞总数，且2×104个细胞经细胞离心(Shandon Southern Products，Pittsburgh，PA，USA)至玻璃载片上且用Wright-Giemsa 染料染色。根据标准细胞学技术，在300个细胞上执行分化细胞计数。
鉴别肺中的肺泡细胞凋亡细胞群体
为鉴别肺中经历细胞凋亡的不同肺泡细胞类型，在来自暴露于室 内空气(RA)以及CS的小鼠的肺切片中实施活性卡斯蛋白酶3的免疫组 织化学染色。为鉴别肺中细胞凋亡II型上皮细胞，在活性卡斯蛋白酶3 标记后，将肺切片首先用抗小鼠表面蛋白C(SpC)抗体培育，且接着用 抗兔德州红(Texas red)抗体培育。藉由首先用抗小鼠CD 31抗体且接 着用生物素结合的兔抗小鼠二次抗体培育来鉴别细胞凋亡内皮细胞。 在PBS中冲洗肺切片且接着用抗生蛋白链菌素-德州红结合的复合物来 培育。藉由首先用大鼠抗小鼠Mac-3抗体培育切片且接着用抗大鼠德州 红抗体培育来鉴别肺中的细胞凋亡巨噬细胞。最终，将DAPI应用于所 有肺切片，培育5分钟，洗涤且用Vectashield HardSet封固培养基封 固。分别在330-380nm及465-495nm下可视化DAPI及荧光素。用Nikon E800显微镜(40X透镜)获得肺切片的影像。
活性卡斯蛋白酶3的免疫组织化学定位
使用抗活性卡斯蛋白酶3抗体来实施活性卡斯蛋白酶3检定的免疫 组织化学染色，且用宏指令使用Image Pro Plus程序来计数活性卡斯 蛋白酶3阳性细胞。藉由肺泡分布总数(本文称为肺泡长度且以μm表 示)来标准化该计数。肺泡长度与平均直线截距反向相关，亦即当肺泡 隔受到破坏时，平均直线截距随总肺泡长度(亦即总肺泡隔长度)减少 而增加。
卡斯蛋白酶3活性检定
在肺组织萃取物中，使用荧光测定检定根据制造商说明书来测量 卡斯蛋白酶3/7活性。将快速冷冻的肺组织(每组n＝3)用检定缓冲液均 质化，接着超音波处理且在800×g下离心。移除细胞核及细胞碎片后， 接着用前荧光基质在室温下培育上清液(300μg蛋白)1h且利用 Typhoon影像分析仪(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ， USA)测量荧光强度。结果表示为特异性卡斯蛋白酶3基质分解的速度， 以卡斯蛋白酶3酶活性的单位表示，藉由总蛋白浓度标准化。将活性重 组卡斯蛋白酶3用作检定标准(0-4U)。将无基质的组织溶解产物、单 独检定缓冲液及具有卡斯蛋白酶3抑制剂的溶解产物用作负性对照。
8-氧代-dG的免疫组织化学定位
为获得8-氧代-dG的免疫组织化学定位及量化，将来自暴露于CS或 用表达质粒的RTP801滴注的小鼠肺切片用抗8-氧代-dG抗体培育，且使 用小鼠抗体使用InnoGenexTM Iso-IHC DAB试剂盒来染色。用宏指令(使 用Image Pro Plus)计数8-氧代-dG阳性细胞，且藉由所述的肺泡长度 来标准化该计数。
将质粒DNA滴注至小鼠肺中
使用无内毒素的DNA分离试剂盒来制备RTP801表达的质粒DNA及对 照载体。针对气管内滴注，在80μl无菌全氟化碳中传递50μg质粒 DNA。全氟化碳的携氧性使得其在这类体积下良好耐受，而当气管内滴 注时其物理化学性质允许极有效的末端肺传递。藉由短暂吸入性氟烷 暴露使小鼠麻醉，用镊子轻轻地将舌头向前拉，且经由钝的血管导管 在舌头底部施加用全氟化碳溶液的基础上滴注气管。
将siRNA滴注至小鼠肺中
藉由腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪(Xylazine)(115/22mg/kg)使小 鼠麻醉。藉由连续五次10μl传递，经鼻内滴注50μl体积的0.9％ NaCl中的50μg siRNA。在鼻内滴注的末期，使小鼠头部直立向上1 分钟以确保所有经滴注的溶液流入内部。
其它信息参见Rangasamy T，Cho CY，Thimmulappa，RK，ZhenL， Srisuma SS，Kensler TW，Yamamoto M，Petrache I，Tuder RM，Biswal S.Geneticabl ation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-iduced emphysema in mice.Submitted to Journal of Clinincal Investigation；Yasunori Kasahara，Rubin M.Tuder， Carlyne D.Cool，David A.Lynch，Sonia C.Flores及Norbert F. Voelkel.Endothelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema.Am J Respir Crit Care Med，163卷，第737-744页，2001；Yasunori Kasahara，Rubin M. Tuder，Laimute Taraseviciene-Stewart，Timothy D.Le Cras， Steven Abman，Peter K.Hirth，Johannes Waltenberger及Norbert F.Voelkel.Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema.J.Clin.Invest.106：1311-1319(2000)； 及关于主题的评论：Robin M.Tuder，Sharon McGrath及Enid Neptune，The pathological mechanisms of emphysema models：what do they have in common？，Pulmonary Pharmacology & Therpaeutics 2002。
结果
1.滴注表达质粒的RTP801会导致小鼠肺中类气肿表型，类气肿表 型藉由(1)支气管肺泡灌洗细胞数的增加(图15a)、(2)肺隔细胞的细胞 凋亡(图15b)及肺泡直径的增加(图15c)来证实。
2.滴注RTP801 siRNA(REDD14)会导致肺中RTP801表达减少(图 17b)。
3.吸烟6个月后RTP801 KO小鼠免于气肿发展，如肺泡直径扩大的 缺乏所证实(图18)。
4.RTP801 KO小鼠免于吸烟诱发的炎症，如藉由炎症支气管肺泡细 胞在1周吸烟后的数目减少(图16a-b)所证实。
5.RTP801 KO小鼠免于吸烟诱发的肺隔细胞细胞凋亡，如藉由关于 活化卡斯蛋白酶染色的肺切片所证实(图16c)。
6.滴注REDD14的小鼠部分地免于吸烟诱发的炎症，如藉由炎症支 气管肺泡细胞在1周吸烟后的数目减少(图17a)所证实。
7.滴注REDD14的小鼠部分地免于吸烟诱发的肺隔细胞细胞凋亡， 如藉由关于活化卡斯蛋白酶染色的肺切片及用抗活化卡斯蛋白酶3抗 体获得的肺萃取物的免疫印迹所证实(图17c)。
实施例8
微血管病症相关的模型及结果
在如下所述的各种微血管病症的动物模型中测试本发明的化合 物。
1.糖尿病性视网膜病
RTP801在活体外促进神经元细胞凋亡及活性氧产生。本发明的发 明者亦发现在经受早产儿视网膜病(ROP)模型的RTP801基因剔除(KO) 小鼠中，在缺氧条件下尽管VEGF升高但病理新血管生成NV仍减少，而 此基因的缺乏并不影响生理上新生儿视网膜NV。此外，在此模型中， 缺乏RTP801亦具保护性以对抗缺氧神经元细胞凋亡及高氧血管阻塞。
实验1
藉由腹膜内注射STZ在8周大的RTP801 KO及C57/129sv野生型(WT) 同窝出生的小鼠中诱发糖尿病。4周后，在1小时黑暗适应期后自左眼 获得ERG(单一白色闪光，1.4 x 10^4ftc，5ms)。使用伊文思蓝 (Evans-blue)白蛋白渗透技术，根据双眼分析RVP。
结果
血糖在糖尿病性(DM)WT与DM KO之间并非不同(495±109与513±76 mg/dl)，在非糖尿病性(NDM)WT与KO之间亦并非不同(分别130±10与 135±31mg/dl)。与NDM WT(21.5±18.8μL/g/hr，n＝9，p＝0.055) 相比，DM WT组中RVP增加138％(51.2±37.9μL/g/hr，n＝8)。相比 之下，与DM WT小鼠相比，DM KO中RVP减少80％(9.5±8.5μL/g/hr， n＝6，p＝0.023)，从而导致糖尿病诱发的RVP减少140％。在DM WT小鼠中， 与NDM WT相比，OP2(11％)、OP3(12％) & OP4(14％)及B波(23％)的振荡潜 在内隐时间延长(p<0.05)。A波并无显著变化。与NDM KO相比，DM KO 小鼠中OP3及OP4的这类变化标准化为约100％且B波为65％。
结论：RTP801的基因剔除会改善小鼠中糖尿病诱发的RVP及ERG异 常，此表明此缺氧诱发基因可在早期糖尿病性视网膜病的发病机理中 起重要作用。
实验2
在RTP801基因剔除小鼠及具有匹配基因背景的对照野生型小鼠中 诱发糖尿病。此外，在C57B16小鼠中诱发糖尿病，随后将该C57B16小 鼠用于玻璃体内注射抗RTP801及对照siRNA。关于糖尿病诱发，将小鼠 用链菌素注射(隔夜禁食后，STZ 90mg/kg/d2天)。在整个研究期间， 关于血糖、体重及血球比容的变化来监控动物生理学。将经媒剂注射 的小鼠用作对照物。藉由玻璃体内注射1μg REDD14抗RTP801 siRNA 或1μg抗GFP对照siRNA来处理适当动物。在研究过程中注射siRNA两 次-在第0天(当实施第一次注射STZ时)及注射STZ后第14天。
在糖尿病的4周持续时间后，使用伊文思蓝(EB)染料技术来测量动 物的视网膜血管渗漏。在伊文思蓝(EB)测量前24小时，将导管植入小 鼠右颈静脉中。在各动物的双眼中，视网膜渗透性测量是根据标准伊 文思蓝方案来进行的。
结果
1.与野生型糖尿病小鼠相比，RTP801 KO糖尿病小鼠中视网膜血 管渗漏减少70％(参见图20)。
2.RTP801的基因剔除使小鼠中的ERG异常正常化：在DM WT小鼠中， 与NDM WT相比，OP2(11％)、OP3(12％)及OP4(14％)及B波(23％)的振荡潜 在内隐时间延长(p<0.05)。A波无显著变化。与NDM RTP801 KO相比， DM RTP801 KO小鼠的OP3及OP4的这类变化标准化为约100％且B波为 65％(参见图21)。
3.类似于KO小鼠中的结果，与经玻璃体内注射抗GFP的对照siRNA 的糖尿病小鼠相比，经玻璃体内注射抗RTP801的REDD14 siRNA糖尿病 小鼠中视网膜血管渗漏减少50％(参见图22)。
2.早产儿视网膜病
藉由将测试动物暴露于缺氧及高氧条件来诱发早产儿视网膜病， 且继而测试对视网膜的影响。结果表明RTP801 KO小鼠免于早产儿视网 膜病，藉此证实RTP801抑制的保护作用。
3.心肌梗塞
藉由小鼠中短期及长期左前降支动脉结扎(Left Anterior Descending artery ligation)来诱发心肌梗塞。结果：在RTP801KO 小鼠中，梗塞后24小时TnT及CPK-MB分数含量减少，且梗塞后28天超声 心动图(射血分数体积)更优选。
4.微血管缺血病状
用于分析缺血病状的动物模型包括：
1.闭锁性头部损伤(CHI)-实验性TBI产生一系列促进神经及神经 代谢级联的事件，该事件与行为不足的程度及范围相关。在麻醉下诱 发CHI，而允许重量自预先指定的高度自由下落(Chen等人，J. Neurotrauma 13，557，1996)至覆盖头颅中部平面中的左半球的暴露 头骨上。
2.暂时性大脑中央动脉阻塞(MCAO)-在成年、雄性Sprague Dawley 大鼠(300-370gr)中实施90至120分钟的暂时性病灶性缺血。所用的方 法为腔内缝合MCAO(Longa等人，Stroke，30，84，1989；及Dogan等 人，J.Neurochem.72，765，1999)。简言之，在氟烷麻醉下，将涂 布聚L-赖氨酸的3-0-尼龙缝合物质经由颈外动脉中的洞插入右侧颈内 动脉(ICA)中。将尼龙线推至ICA中至右侧MCA源点(20-23mm)。90-120 分钟后，将线断开，缝合动物且使其恢复。
3.永久性大脑中央动脉阻塞(MCAO)-阻塞为永久性的，藉由MCA的 电凝法单方面诱发。两种方法均导致大脑皮质同侧的病灶性脑缺血， 而对侧完整(对照)。经由暂时部分颅骨切除术暴露左侧MCA，如Tamura A.等人，J Cereb Blood Flow Metab.1981；1：53-60关于大鼠所述。 MCA及其豆纹状枝在接近嗅束的中间边界处闭合，伴随微双极凝结。缝 合伤口，且使动物返回在26℃至28℃下加温的室中的笼中。在自动调 温器下一直保持动物温度。
5.急性肾衰竭(ARF)
测试用于治疗ARF的活性siRNA可使用脓毒症诱发的ARF或缺血-再 灌注诱发的ARF来进行。
1.脓毒症诱发的ARF
脓毒症诱发的ARF的两种预测性动物模型藉由Miyaji T，Hu X， Yuen PS，Muramatsu Y，Iyer S，Hewitt SM，Star RA，2003，Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damagein aged mice，KidneyInt.Nov；64(5)： 1620-31描述。
此两种模型为小鼠、优选年老小鼠中的脂多醣给药及盲肠结扎穿 孔术。
2.缺血-再灌注诱发的ARF
此预测性动物模型藉由Kelly KJ，Plotkin Z，Vulgamott SL， Dagher PC，2003年1月.P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion：protective role of a p53 inhibitor，J Am Soc Nephrol；14(1)：128-38描述。
在45分钟两侧肾动脉钳夹及随后释放夹以进行24小时再灌注后， 在大鼠中诱发缺血-再灌注损伤。在钳夹前2小时及钳夹后30分钟，将 250μg REDD14或GFP siRNA(负性对照)注射至颈静脉中。另外250μ gsiRNA在钳夹后4及8小时经由尾静脉给予。将对抗GFP的siRNA用作负 性对照。藉由在外科手术之前及之后24小时测量血清肌酸酐含量来监 控ARF进程。在实验结束时，经由留置股节线用温PBS、接着用4％聚甲 醛灌注大鼠。将左肾移除且储存于4％聚甲醛中以进行随后组织分析。 急性肾衰竭常定义为血清肌酸酐含量自基线急性增加。至少0.5mg/dL 或44.2μmol/L的血清肌酸酐增加被视为急性肾衰竭的指示。在外科 手术前零时及在ARF外科手术后24小时，测量血清肌酸酐。
为研究siRNA在大鼠肾中的分布，经静脉内给药糖残基中具有改变 的O-甲基修饰的Cy3-标记的19-mer末端平整siRNA分子(2mg/kg)，历 时3-5min，此后使用双质子共焦显微镜法进行活体内成像。共焦显微 镜法分析揭示肾中大部分siRNA集中在近端肾小管细胞之内体小泡区 室中。内体小泡及细胞质siRNA荧光在传递后起始2小时期间相对稳定， 且在24小时之时消失。
如图19所证实，在45min肾双侧动脉钳夹治疗(PBS治疗)后血清肌 酸酐的含量增加10倍。4次注射801 siRNA(REDD14，SEQ In No.16及 66)(钳夹前2小时及钳夹后30min、4h及8h)会使血清中的肌酸酐含 量显著减少40％(P<0.02)。这类结果表明801 siRNA可保护肾组织免 于缺血-再灌注损伤的影响且因此减少ARF严重程度。
实施例9
siRNA的制备
使用专有算法及已知的基因RTP801序列(SEQ ID NO：1)，产生多种 潜在siRNA的序列。以上说明书的siRNA分子基本上如本文所述来制备。
本发明的siRNA可藉由本领域熟知的任何用于合成核糖核酸(或脱 氧核糖核酸)寡核苷酸的方法来合成。举例而言，可使用市售机器(购 自Applied Biosystems)；根据本文所揭示的序列制备寡核苷酸。可使 用本领域熟知的方法来结扎重迭对的化学合成片段(例如，参见美国专 利第6,121,426号)。单独合成各链且接着使其在管中彼此退火。接着， 藉由HPLC将双链siRNA自未退火的单链寡核苷酸(例如，因为其中之一 者过量)中分离。关于本发明的siRNA或siRNA片段，两个或两个以上该 序列可合成且连接在一起以用于本发明中。
本发明的siRNA分子可藉由本领域已知的程序(例如描述于Usman 等人，1987，J.Am.Chem.Soc，109，7845；Scaringe等人，1990， Nucleic Acids Res.，18，5433；Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684及Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74， 59中的程序)合成且可利用常见核酸保护及偶联基团，诸如5′末端的二 甲氧基三苯甲基及3′末端的胺基磷酸酯。必要时并入经修饰(例如 2′-O-甲基化)的核苷酸及未经修饰的核苷酸。
或者，本发明的核酸分子可单独合成且在合成后(例如)藉由结扎 (Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，国际PCT公开 案第W0???93/23569号；Shabarova等人，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951； Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.8，204)或藉由合成和/或 去保护后杂交而接合在一起。
本发明的siRNA分子亦可经由串联合成方法来合成，如美国专利申 请公开案第US2004/0019001号(McSwiggen)所述，其中两条siRNA链合 成由可分解的连接体(其随后分解以提供杂交且使siRNA双链体纯化的 单独siRNA片段或链)分隔的单个连续寡核苷酸片段或链。连接体可为 聚核苷酸连接体或非核苷酸连接体。其它信息参见PCT公开案第WO 2004/015107号(ATUGEN)。
如上所述，构筑表A(下文)的siRNA以使得替代的糖具有2′-O-甲基 修饰，亦即因此替代核苷酸经修饰。在这类优选实施例中，在siRNA 之一条链中，经修饰的核苷酸为第1、3、5、7、9、11、13、15、17 及19号且在另一相对链中经修饰的核苷酸为第2、4、6、8、10、12、 14、16及18号。因此，这类siRNA为具有如上所述的替代2′-O-甲基修 饰的末端平整的19-mer RNA分子。表2及3(下文)的siRNA亦以此方式构 筑；表B及D的siRNA为具有替代2′-O-甲基修饰的末端平整的19-mer RNA分子；表C的siRNA为具有替代2′-O-甲基修饰的末端平整的21-mer RNA分子。
表A详述所产生且随后合成基因RTP801的各种新颖siRNA分子。最 终两行表明为检查新颖分子活性而实施的两个实验的结果。简言之， 用待测试的特异性新颖siRNA转染海拉细胞或HaCat细胞。接着，使用 对抗RTP801多肽的抗体藉由西方墨点法来测定RTP801多肽的表达。涉 及表A的右手两行，＂-＂表示失活或低活性分子(其大体上不会抑制 RTP801基因的表达)；＂+＂表示具有某些抑制活性的siRNA分子(抑制 RTP801基因表达)；＂++＂表示具有较高抑制活性的分子等。本文所揭示 的任一siRNA分子及具体地说表A中详述的活性分子均为新颖的且亦被 视为本发明的部分。
表A
  序号 ID名称 ORG 位置 POS AS(5′→3′) SS(5′→3′) 海拉B，20nM HaCat， 20nM 1 REDD1 h 5′UTR 128 UAGAAGCCGCAGCUAGCGC GCGCUAGCUGCGGCUUCUA + + 2 REDD2 hmr CDS 337 UCCGAGCUCUCCAGGCUCG CGAGCCUGGAGAGCUCGGA - - 3 REDD3 hmr CDS 360 UGCUGCUGUCCAGGGACUC GAGUCCCUGGACAGCAGCA - - 4 REDD4 hmr CDS 478 AGCAGCUGCAUCAGGUUGG CCAACCUGAUGCAGCUGCU - - 5 REDD5 h CDS 728 UGAGUCCAGGCGCAGCACG CGUGCUGCGCCUGGACUCA - - 6 Redd6 hmr 5′UTR 119 CAGCUAGCGCGGUCAGCGA UCGCUGACCGCGCUAGCUG - - 7 Redd7 hmr 5′UTR 122 CCGCAGCUAGCGCGGUCAG CUGACCGCGCUAGCUGCGG - - 8 Redd8 hmr 5′UTR 125 AAGCCGCAGCUAGCGCGGU ACCGCGCUAGCUGCGGCUU - - 9 Redd9 hmr CDS 339 AGUCCGAGCUCUCCAGGCU AGCCUGGAGAGCUCGGACU - - 10 Redd10 hmr CDS 341 GCAGUCCGAGCUCUCCAGG CCUGGAGAGCUCGGACUGC - - 11 Redd11 hmr CDS 363 UGUUGCUGCUGUCCAGGGA UCCCUGGACAGCAGCAACA - - 12 Redd12 hmr CDS 369 AGCCACUGUUGCUGCUGUC GACAGCAGCAACAGUGGCU - - 13 Redd13 hmr CDS 370 AAGCCACUGUUGCUGCUGU ACAGCAGCAACAGUGGCUU - - 14 Redd14 hmr CDS 475 AGCUGCAUCAGGUUGGCAC GUGCCAACCUGAUGCAGCU +++ +++ 15 Redd15 hmr CDS 481 UGCAGCAGCUGCAUCAGGU ACCUGAUGCAGCUGCUGCA + + 16 Redd16 hmr CDS 486 UCUCCUGCAGCAGCUGCAU AUGCAGCUGCUGCAGGAGA - - 17 Redd17 hmr CDS 610 CCCCGCAGGCCGCACGGCU AGCCGUGCGGCCUGCGGGG - - 18 Redd18 hmr CDS 750 CCUGGAUCUUGGGCCAGAG CUCUGGCCCAAGAUCCAGG - - 19 Redd19 hmr CDS 809 CAGCGUCAGGGACUGGCUG CAGCCAGUCCCUGACGCUG - - 20 Redd20 hmr 3′UTR 1097 AUGCUACAGUACUGAGGGG CCCCUCAGUACUGUAGCAU + + 21 Redd21 hmr 3′UTR 1419 GUCUGUAAGAUAGCUGCCU AGGCAGCUAUCUUACAGAC + + 22 Redd22 hmr 3′UTR 1617 UUCUAGAUGGAAGACCCAG CUGGGUCUUCCAUCUAGAA ++ ++ 23 Redd23 hmr 3′UTR 1670 UUGAACAUCAAGUGUAUUC GAAUACACUUGAUGUUCAA ++ ++ 24 Redd24 hmr 3′UTR 1693 AAAUAUUGCAUAGGUCUUA UAAGACCUAUGCAAUAUUU + + 25 Redd25 hmr 3′UTR 1695 AAAAAUAUUGCAUAGGUCU AGACCUAUGCAAUAUUUUU ++ ++ 26 Redd26 hmr CDS 349 AGGGACUCGCAGUCCGAGC GCUCGGACUGCGAGUCCCU - - 27 Redd27 hmr 3′UTR 1673 UACUUGAACAUCAAGUGUA UACACUUGAUGUUCAAGUA ++ ++ 28 Redd28 hmr 3′UTR 1717 AAACAUGUUUAUUAGAAAA UUUUCUAAUAAACAUGUUU - - 29 Redd29 h 5′UTR 99 AACUGCUAAGACAAGUGCG CGCACUUGUCUUAGCAGUU - - 30 Redd30 h CDS 213 ACGACGACGAGAAGCGGUC GACCGCUUCUCGUCGUCGU - - 31 Redd31 h CDS 393 AAGCCGUGUCUUCCUCCGG CCGGAGGAAGACACGGCUU - - 32 Redd32 h CDS 453 AGUGUUCAUCCUCAGGGUC GACCCUGAGGAUGAACACU - - 33 Redd33 h CDS 521 AGGGCGUCGAGAGCCCAGC GCUGGGCUCUCGACGCCCU - -
  34 Redd34 hr CDS 535 AUCAGCAGGCGCGCAGGGC GCCCUGCGCGCCUGCUGAU - - 35 Redd35 h CDS 571 AGUUCUUUGCCCACCUGGC GCCAGGUGGGCAAAGAACU - - 36 Redd36 h CDS 597 ACGGCUCGCUGUAGGCCAG CUGGCCUACAGCGAGCCGU - - 37 Redd37 h CDS 625 ACGUCCAGCAGCGCCCCCC GGGGGGCGCUGCUGGACGU - - 38 Redd38 h CDS 829 AUGACUCGGAAGCCAGUGC GCACUGGCUUCCGAGUCAU - - 39 Redd39 h 3′UTR 1046 AACUCAAUGAGCUUCCUGG CCAGGAAGCUCAUUGAGUU ++ ++ 40 REDD40 h 3′UTR 1539 CUCAACUCUGCAGUACACG CGUGUACUGCAGAGUUGAG + + 41 Redd41 h 3′UTR 1317 AGAUACACAAACCACCUCC GGAGGUGGUUUGUGUAUCU + + 42 Redd42 h 3′UTR 1350 ACAACAAACACACUUGGUC GACCAAGUGUGUUUGUUGU ++ ++ 43 Redd43 hmr CDS 473 CUGCAUCAGGUUGGCACAC GUGUGCCAACCUGAUGCAG + + 44 REDD44 h 3′UTR 955 UCCUGCCUCUAGUCUCCAC GUGGAGACUAGAGGCAGGA - + 4S Redd45 hmr CDS 476 CAGCUGCAUCAGGUUGGCA UGCCAACCUGAUGCAGCUG - - 46 Redd46 hmr CDS 479 CAGCAGCUGCAUCAGGUUG CAACCUGAUGCAGCUGCUG - - 47 Redd47 hmr CDS 483 CCUGCAGCAGCUGCAUCAG CUGAUGCAGCUGCUGCAGG - - 48 Redd48 hmr CDS 485 CUCCUGCAGCAGCUGCAUC GAUGCAGCUGCUGCAGGAG - - 49 REDD40.1 h 3′UTR 1536 AACUCUGCAGUACACGAUG CAUCGUGUACUGCAGAGUU ++ ++ 50 REDD44.1 h 3′UTR 954 CCUGCCUCUAGUCUCCACC GGUGGAGACUAGAGGCAGG ++ ++
注意在上表A中，siRNA 1-50的有义链分别具有SEQ ID NO：3-52且 siRNA 1-50的反义链分别具有SEQ ID NO：53-102。称为REDD14的分子 具有SEQ ID No 16(有义链)及66(反义链)。




注意在上表B中，siRNA 51-122的有义链分别具有SEQ ID NO：103-174且siRNA 51-122的反义链分别具有SEQ ID NO：175-246。










实施例10
药理学及药物传递
本发明的核苷酸序列可直接或用病毒载体或非病毒载体传递。当 直接传递时，该序列一般提供抗核酸酶性。或者，该序列可并入表达 卡闸或构筑体中，使得序列表达于如下文所讨论的细胞中。一般，构 筑体含有适合调节序列或启动子以使序列表达于靶向细胞中。
根据良好医药规范来给药及给予本发明的化合物或药物组合物， 其中应考虑个别患者的临床病状、待治疗的疾病、给药的位点及方法、 给药时程、患者年龄、性别、体重及医师所知的其它因素。
因此，获得本文目的的医药学＂有效量＂应根据本领域已知的该考 虑来确定。此量必须有效地获得改善，包括(但不限于)改善存活率或 更快恢复，或改善或消除症状及本领域技术人员选为适合测量标准的 其它指示。
治疗一般具有与疾病过程长度及药物有效性及所治疗的患者物种 相称的长度。应注意，人类一般比小鼠或本文所例示的其它实验动物 具有更长治疗。
本发明的化合物可藉由任何熟知给药途径来给药。应注意，该化 合物可作为化合物或医药学上可接受的盐给药且可单独给药或可作为 活性成份与可药用载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂及媒剂组合给 药。化合物可经口、经皮下或胃肠外(包括静脉内、动脉内、肌肉内、 腹膜内及鼻内给药以及胸内及灌注技术)给药。化合物的植入物亦适 用。可制备液体形式来进行注射，该术语包括皮下、经皮、静脉内、 肌肉内、胸内及其它胃肠外给药途径。液体组合物包括具有及不具有 有机共溶剂的水溶液、水性或油性悬浮液、具有可食用油的乳液以及 类似医药媒剂。此外，在某些环境下，用于本发明的新颖治疗的组合 物可以雾剂形成以进行鼻内及类似给药。所治疗的患者为温血动物且 尤其为包括人的哺乳动物。可药用载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐 剂及媒剂以及植入物载体一般是指不与本发明的活性成份反应的惰 性、无毒固体或液体填充剂、稀释剂或封囊物质。
当胃肠外给药本发明的化合物时，其一般以可注射单位剂型(溶 液、悬浮液、乳液)经调配。适于注射的医药配方包括无菌水溶液或分 散液及用于重建至无菌可注射溶液或分散液中的无菌粉末。载体可为 含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其 类似物)、其适合混合物及植物油的溶剂或分散介质。
举例而言，可藉由使用涂层(诸如卵磷脂)、维持分散情形下所需 粒径及使用界面活性剂来维持适当流动性。非水性媒剂亦可用作化合 物组合物的溶剂系统，诸如棉花籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉 米油、向日葵油或花生油及酯(诸如十四烷酸异丙酯)。此外，亦可添 加增强组合物稳定性、无菌性及等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐 剂、抗氧化剂、螯合剂及缓冲剂。预防微生物作用可藉由各种抗菌剂 及抗真菌剂来确保，例如对氧苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其 类似物。在多种情形下，亦可需要包括等张剂，例如糖、氯化钠及其 类似物。可注射医药形式的延长吸收可藉由使用延迟吸收的药剂(例如 单硬脂酸铝及明胶)而引起。然而，根据本发明，所用的任何媒剂、稀 释剂或添加剂均必须与化合物相容。
无菌可注射溶液可藉由将实施本发明所用的化合物并入具有各种 所需的各种其它成份的所需量的适合溶剂中来制备。
本发明的药物配方可以含有任何可相容载体(诸如各种媒剂、佐 剂、添加剂及稀释剂)的可注射配方形式给药于患者；或本发明所用的 化合物可以缓慢释放皮下植入物或靶向传递系统(诸如单克隆抗体、载 体传递、离子电渗、聚合物基质、脂质体及微球体)形式胃肠外给药于 患者。适用于本发明的传递系统实例包括美国专利第5,225,182、 5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、 4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196及4,475,196号。其 它多种这类植入物、传递系统及组件亦为本领域技术人员熟知。
本发明所用的化合物的药物配方可经口给药于患者。可使用熟知 方法，诸如以锭剂、悬浮液、溶液、乳液、胶囊、粉末、糖浆及其类 似物的形式来给药化合物。经口或经静脉内传递且保留生物活性的已 知技术为优选的。在一实施方式中，本发明的化合物最初可藉由静脉 内注射来给药以使血液含量达到适合含量。接着，虽然亦可使用其它 给药形式(视患者病状而定且如上文所示)，但患者含量可藉由口服剂 型来维持。
用于人类的活性化合物剂量一般在每日1ng/kg至约20-100mg/kg 体重、优选每日约0.01mg至约2-10mg/kg体重的范围内，给药方式为 每日一次或每日两次或三次或三次以上给药，历经1-2周或更长时间， 优选历经24至48小时，或给药方式为在1-2周或更长时期内连续灌注。
将本发明化合物给药于眼睛
本发明的化合物可局部或以注射(诸如玻璃体内注射、视网膜下注 射或双侧注射)形式给药于眼睛。关于本发明化合物的给药的其它信息 可见于下列文献：Tolentino等人，Retina 24(2004)132-138；Reich 等人，Molecular vision 9(2003)210-216。
本发明化合物的肺部给药
本发明的治疗组合物优选应藉由吸入含有这类组合物/化合物的 雾剂或藉由鼻内或气管内滴注该组合物而给药于肺中。于脂质体中调 配该组合物可利于吸收。此外，组合物亦可包括PFC液体(诸如全氟碳)， 且组合物可调配为本发明化合物与聚乙烯亚胺(PEI)的复合物。
关于药物组合物的肺部传递的其它信息参见下列文献：Weiss等 人，Human gene therapy 10：2287-2293(1999)；Densmore等人， Molecular therapy 1：180-188(1999)；Gautam等人，Molecular therapy 3：551-556(2001)；及Shahiwala及Misra，AAPS PharmSciTech 5(2004)。此外，siRNA的呼吸配方描述于Davis等人 的美国专利申请案第2004/0063654号中。
此外，在适当时(例如，在糖尿病性足部溃疡的情形下)亦可任选 以脂质/脂质体配方形式局部给药本发明的化合物。
给药本发明化合物于耳
优选的给药模式为局部传递RTP801抑制剂至耳蜗的圆窗膜上，举 例而言，如Tanaka等人(Hear Res.2003 Mar；177(1-2)：21-31)所揭 示。给药于耳的另一模式是经鼓膜注射。
虽然在褥疮或其它创伤治疗中，药物组合物优选藉由局部施加至 损害区域来给药，但组合物亦可全身给药。
用于改善本发明化合物的传递的其它配方可包括未经调配的化合 物、共价结合胆固醇的化合物及结合靶向抗体的化合物(Song等人， Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors，Nat Biotechnol.2005年6月； 23(6)：709-17)。
本文公开的所有siRNA可以以非配方形式作为裸siRNA给药，用于 治疗本文所提及的任何疾病或病状。术语“裸siRNA”指的是siRNA分 子不带有任何递送载体，所述载体用于辅助、促进或有利于进入到细 胞，其包括病毒序列、病毒质粒、脂质体配方、脂质体转然试剂、或 沉淀剂等。例如，siRNA在PBS中为“裸siRNA”。
另外，给药裸siRNA、寡核苷酸、裸siRNA的组合或裸siRNA与另外 的分子的组合的任一种来治疗本文提及的任何疾病或病状也在本发明 的范围内。
然而，如本文所述，本发明的siRNA分子也可以在脂质体配方和脂 质体转染剂配方等等中递送，和通过本领域技术人员已知的方法制备。 这类方法例如公开于US专利号5,593,972；5,589,466和5,580,859，将 这些文件以全文引入的方式加入本文。
实施例11
顺铂诱发的耳毒性的活体外模型及RTP801 siRNA的保护作用
顺铂诱发的耳毒性诱发于耳蜗及前庭器官型培养基中。将出生后 3-4天的大鼠幼崽用于制备如Zhang等人，Neuroscience 120(2003) 191-205中所详述的耳蜗及前庭器官型培养基。小心切开耳蜗且移除含 有螺旋神经节、考蒂器官及中转的耳蜗组织以制备如Zhang等人中所述 的器官型培养基。在治疗前将培养基置于CO2培育器中24h以进行调节。 在调节后，单独用1、5或10μg/ml的顺铂将培养基处理48h。为研究 RTP801 siRNA的保护作用，用10μg/ml的顺铂及具有或不具有 Lipofectamine的不同浓度的RTP801 siRNA处理耳蜗外植体(每组5个 耳蜗)48h。未经处理的对照培养基及用RTP801 siRNA处理48h的培养 基平行进行实验。实验结束时，将培养基用10％福尔马林固定且用FITC 结合的鬼笔环肽(phalloidin)染色。计数每0.25mm耳蜗长度之内毛细 胞及外毛细胞的数目且测定每次治疗的毛细胞平均数目。
实施例12
庆大霉素诱发的耳毒性的活体内模型及RTP801 siRNA的保护作用
将南美栗鼠(chinchilla)用单独硫酸庆大霉素或与RTP801 siRNA 组合的硫酸庆大霉素处理5天(125-300mg/kg，肌肉内)。在暴露于庆 大霉素之前两天及暴露于庆大霉素期间，将siRNA分子局部给药于耳蜗 的圆窗膜上。在治疗结束时，藉由使动物暴露于二氧化碳及断颈来杀 死动物。移除耳蜗且预备用FITC结合的鬼笔环肽染色，以测定耳蜗组 织中内毛细胞及外毛细胞的数目(如Ding等人，Hearing Research 164 (2002)115-126；及Wang等人，The Journal of Neuroscience 23(24)：8596-8607中所述)。
实施例13
声创伤的活体内模型及RTP801siRNA的保护作用
将经染色的豚鼠用于声创伤研究中(Wang等人，The Journal of Neuroscience 23(24)：8596-8607中所述)。经7天的时期将RTP801 siRNA分子局部给药于耳蜗的圆窗膜上。未经治疗的左耳蜗充当声创伤 引起耳毛细胞损失及听力功能损失的效力的对照。将动物暴露于声创 伤(6kHz，120dB声压级(SPL)，30min)，且双耳的听力图均得自经 由慢性圆窗膜电极自耳神经记录的复合动作电位(CAP)。每日在苏醒动 物中测量双耳的CAP听力图。声暴露后30d，将动物杀死，且准备其耳 蜗以量化评估毛细胞损失，其中使用扫描电子显微镜以计数全长耳蜗 管的所有毛细胞。
实施例14
与8011(表D中ID No.257，SEQ ID NO：527(反义链))及8014(表 D中ID No.260，SEQ ID NO：530(反义链))相关的实验结果
HEK293细胞中的活体外功效
将5、10及20nm的三种不同浓度siRNA转染至HEK293细胞中。将相 同浓度的不相关siRNA(siTG)用作负性对照，而将相同浓度的REDD14 用作正性对照。转染后72小时收集细胞；使RNA经纯化且将其用作qPCR 反应的模板以量化测定内源性RTP801转录含量。将人类亲环素 A(Cyclophilin A)用作qPCR的内部参考。使参考标准化的数据进一步 经受生物标准化：对各siRNA浓度而言，所检测的RTP801含量表示为 RTP801在相应负性对照样品中的百分比。结果显示于图28中。
BE2C细胞中的活体外功效
虽然在HEK293细胞中分析基本RTP801表达水平，但为分析siRNA减 少诱发的RTP801表达水平的能力，使用经由作为RTP801诱发剂的CoCl2 处理的BE2C细胞。设计及数据评估基本上如上所述。siRNA转染后24 小时，将BE2C细胞用10μM CoCl2另外处理24小时，且接着进行RNA 萃取。结果显示于图29中。
结果表明在活体外检定中，801_1及801_4至少如同REDD14一样有 效对抗RTP801。
小鼠CNV模型中的活体内功效
伴随下列实验组，如实施例6中所述进行实验：
表4
  组 平均CNV体积(μm3) SEM 激光光 斑数目 PBS 471698.3 26163.96 22 REDD14(0.05μg) 237326.9 24136.19 29 REDD14(0.1μg) 182997.0 29213.82 25 REDD14(0.5μg) 207235.7 20420.18 29 RTP801#1siRNA(0.05μg) 334196.8 32429.66 30 RTP801#1siRNA(0.1μg) 176091.1 37343.13 24 RTP801#1siRNA(0.5μg) 226063.0 17906.91 33 RTP801#2siRNA(0.05μg) 304325.6 30584.33 30 RTP801#2siRNA(0.1μg) 265668.5 20287.93 28 RTB801#2siRNA(0.5μg) 269164.4 24776.41 31
结果呈现于图30中，且显示在小鼠CNV的活体内模型中801_4至少 如同REDD14一样有效。
实施例15
与耳聋相关的模型及结果
例示性(p53)siRNA治疗对南美栗鼠耳蜗中声诱发的毛细胞死亡的 影响
在南美栗鼠中研究例示性siRNA(QM5-抗p53)在声创伤模型中的活 性。使一组7只动物经受声创伤。将动物暴露于集中在4kHz下的105dB 噪声的倍频带中历经3h。将暴露于噪声的南美栗鼠的左耳用约20μL 中的30μg siRNA处理；用媒剂处理右耳。在声创伤后2.5周测定自圆 窗记录的复合动作电位的平均阈值，以测定经siRNA治疗的耳中的阈值 是否低于(优于)未经治疗(媒剂)的耳中的阈值。与未经治疗的耳相比， 经siRNA治疗的耳中平均阈值较低。4kHz下的差异在统计学上显著 (p<0.033)。这类结果表明给药于耳蜗的圆窗的例示性p53siRNA能够 减少藉由声创伤引起的损害。
p53或801siRNA治疗对大鼠耳蜗中顺铂诱发的毛细胞死亡的影响
在顺铂治疗前，关于敲击信号8、16及32kHz来测试雄性Wistar大 鼠的基本听觉脑干反应阈值。在基本听觉脑干反应测试后，经30分钟 以腹膜内灌注13mg/kg来给药顺铂。经治疗的耳接收直接施加至圆窗 膜的每4毫升15μg例示性p53 siRNA(如上文)或RTP801 siRNA REDD14(表A中序列No.14，SEQ ID No.16(有义)及66(反义))。对照 的耳经非相关GFP siRNA或PBS治疗。在顺铂给药之前3-5天给药siRNA 分子以检测对耳蜗的保护作用。
在顺铂给药之后3天重复听觉脑干反应测试。比较治疗前与治疗后 的听觉脑干反应阈值且阈值的改变在表5中加以说明。顺铂治疗后阈值 的更高改变表明耳蜗中的毛细胞损失更严重。在重复听觉脑干反应测 试后，将动物杀死且将耳蜗移除且处理以用于扫描电子显微镜(SEM)， 从而量化钩状区(高频区)中的外毛细胞(OHC)损失。藉由用照片区域中 损失或严重损害的细胞数目除以外毛细胞的总数目来计算外毛细胞损 失的百分比。
表5证实自经受顺铂诱发的损害的4只动物获得且分析钩状区中外 毛细胞损失的结果。如结果所揭示，接收对抗p53或801的siRNA的动物 显示较低外毛细胞损失且关于32kHz信号显示阈值的较小改变。两个 参数均表明对抗p53或801的siRNA可具保护性以对抗耳蜗中顺铂诱发 的损害。
表5：经顺铂治疗的大鼠耳蜗中毛细胞损失与阈值改变
  治疗 外毛细胞(OHC)损 失 听觉脑干反应(32KHz下 阈值改变) QC/L P53 siRNA(QM5) QC/R PBS 50％ 100％ 10 dB 30 dB QF/L P53 siRNA(QM5) QF/R GFP 20％ 56％ 10 dB 27.5 dB QJ/R 801 siRNA(REDD14) QJ/L GFP 20％ 100％ 17.5 dB 27.5 dB QN/L 801 siRNA (REDD14) QN/R PBS 0％ 100％ 10 dB 17.5 dB
在本申请全文中，包括美国专利的各种出版物和专利申请通过引 用作者、年份和专利号来参考。这些出版物和专利的公开内容以及专 利申请通过引用并入本申请，以便更全面地描述本发明所属领域的现 有技术状态。