[0001] 本发明涉及一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法。

[0002] 遗传性视网膜劈裂症是一种X 染色体遗传病，故又称为X连锁视网膜劈裂症（X-linked retinoschisis, XLRS）。该病在白人、黑人和黄种人群中均有发生，其发病率为1:5000-1:25000。XLRS主要为男性发病，女性发病较为少见，遗传性者多见于儿童及青年人，是青少年致盲的主要遗传病之一。XLRS 临床症状多为黄斑部视网膜劈裂，斜视，眼球震颤，视力差甚至全盲，ERG呈现异常，b波幅度明显减小，OCT扫描显示明显的“窝轮状”囊腔劈裂，严重的表现为视网膜各层厚度和总厚度变薄。时至今日，遗传性视网膜劈裂症还无行之有效的治疗办法。

[0003] RS1基因的突变被认为是先天性视网膜劈裂症致病的遗传机制，RS1 基因定位于Xp22.2，由六个外显子构成，编码224个氨基酸。目前，已经有230 多个RS1基因突变位点的报道，这些基因的突变被认为是先天性视网膜劈裂症致病的遗传机制，而这些RS1基因突变的位点引起视网膜RS1蛋白的缺失或RS1蛋白功能的丧失，被认为是XLRS发病的关键因素，这些单基因突变的位点也成为了基因治疗过程中的重要锚定靶点。

[0004] 正是基于对X 连锁视网膜劈裂症遗传机制的明确，人们利用RS1基因进行了相关疾病模型的构建。目前，全世界有3种RS1 基因敲除小鼠模型（RS1-KO）在最近十年中相继用于XLRS的研究。第一种是在RS1 的第3个外显子上插入LacZ/Neor形成空载小鼠模型。第二种是在RS1的第1个外显子上插入一个新霉素基因导致了RS1 蛋白不表达的小鼠模型。第三种是用亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosurea，ENU)处理得到随机突变的小鼠模型，主要得到的是在第2个外显子上的点突变和26个碱基缺失的小鼠模型。迄今为止，这些RS1-KO小鼠均是内源性小鼠疾病模型，其突变位点与病人基因的突变并不一样，所以这对后期临床的评价可能会有所偏差。研究也证实这些RS1敲除小鼠部分表现为XLRS患者的特征，包括b波幅度显著降低、视网膜出现劈裂、光感受器退化以及神经节细胞层和内核层变薄，但视网膜神经细胞层和内核层变薄，内网层出现劈裂等表征与人的视网膜劈裂临床症状存在着差异。有关人源性小鼠模型国际国内都未见报道，人源性突变的RS1基因转入小鼠形成的XLRS疾病模型是否具有与临床病患相类似或相同的表征也未见报道。开展人源性RS1h-KI疾病模型的研究，这能够更好更准确的模拟人类疾病发病过程，为研究XLRS提供更为精准和丰富的实验动物对象。

[0005] 本发明针对以上问题，提供一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法。

[0006] 发明目的通过以下方案实现：一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，以人源性RS1基因为基础，筛选人类致病基因通过基因编辑手段敲入到小鼠中，得到具有和病人临床表征一样的RS1h-KI 小鼠疾病模型。

[0007] 进一步的，运用TALENs的技术，根据XLRS病患筛选得到RS1基因的突变位点，设计与XLRS病患相同的Oligo序列，构建好的载体，转入细胞中，筛选得到具有RS1基因突变的稳定细胞系,体外表达，分离得到mRNA，并进行受精卵显微注射及胚胎移植到F0代的孕鼠子宫中，繁殖得到稳定表型的F1代RS1h-KI 疾病模型小鼠。

[0008] 进一步的，Oligo序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA。

[0009] 进一步的，突变型RS1基因翻译的蛋白质序列：MPHKIEGFFLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQVGANALWSAGATSLDCIPECP。

[0010] 进一步的，用TALEN构建基因敲入小鼠，设计针对RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，利用TALEN的两个手架让TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成FokI二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，细胞通过非同源性末端接合机制修复DNA，达到基因敲入到小鼠的基因中，TALEN的两个手架：TALEN_Left引物为：TGACTCGAAACCCAGGGG；TALEN_Right引物为：TGCCCATATCACAAG；Spacer区域为：TGCCCATATCACAAG。

[0011] 进一步的，针对RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，设计基因敲入的Oligo序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA。

[0012] 进一步的，在RS1基因的215bp处设置一个Bpu10I酶切位点。

[0013] 进一步的，设计构建好的人源性RS1基因Oligo 序列，将其进行体外转录，采用显微注射的方式将体外转录的mRNA序列注射入C57BL/6J成熟卵细胞中，注射成功的受精卵可体外培养过夜或立即转入代孕母鼠子宫中受孕培养。

[0014] 进一步的，代孕母鼠产仔后，取F1代小鼠的尾巴和脚趾，提取全基因组，进行PCR扩增，Bpu10I酶切酶切验证，测序鉴定。基因鉴定结果表明我们成功构建了RS1h-KI小鼠疾病模型。

[0015] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型，RS1h-KI小鼠基因测序序列:CATTATCTCTGTTGAGTTCTGGGATAGGAGGGGTTCATTCCTTCTTTTGTATTTTGGGATGAGGTCTCAATACTTTCTCCGGACAGCCCAGAGAAGCTGGGACTCCACACTGTGAACATATGCTACCACTCTGCCTGGAGATTTGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCTTAGCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCAGATCACTTGCTCCAACCCAGAGCAGTATGTGGGCGGTATTCCTCCA。

[0016] 本发明的有益效果在于：视觉功能和视网膜结构检测都可以说明RS1h-KI小鼠视网膜视网膜中主要是由于感光细胞与双极细胞之间的突触链接受损致使RS1h-KI小鼠视觉功能异常，这正是RS1h-KI小鼠发生在视网膜外丛状层的劈裂所造成的，这与临床病人表征相同；能够更好更准确的模拟人类疾病发病过程，为研究XLRS 提供更为精准和丰富的实验动物对象。附图说明

[0017] 图1为本发明构建图。

[0018] 图2为人源性RS1h-KI小鼠鉴定结果图。

[0019] 图3为人源性RS1h-KI小鼠视网膜结构鉴定结果图一。

[0020] 图4为人源性RS1h-KI小鼠视网膜结构鉴定结果图二。

[0021] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：结合附图1-4，实施例1，本发明的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，以人源性RS1基因为基础，筛选人类致病基因通过基因编辑手段敲入到小鼠中，得到具有和病人临床表征一样的RS1h-KI 小鼠疾病模型。

[0022] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，运用TALENs的技术，根据XLRS病患筛选得到RS1基因的突变位点，设计与XLRS病患相同的Oligo序列，构建好的载体，转入细胞中，筛选得到具有RS1基因突变的稳定细胞系。体外表达，分离得到mRNA，并进行受精卵显微注射及胚胎移植到F0代的子宫中，繁殖得到稳定表型的F1代RS1h-KI 疾病模型小鼠。

[0023] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，Oligo序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA。

[0024] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，突变型RS1基因翻译的蛋白质序列：MPHKIEGFFLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQVGANALWSAGATSLDCIPECP。

[0025] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，所述手架指代识别序列。

[0026] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，用TALEN(transcription activator-like （TAL) effector nucleases，转录激活因子样效应物核酸酶技术）构建基因敲入小鼠（RS1h-KI），设计针对RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，利用TALEN的两个手架让TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成FokI二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂（DSB，Double-Strand Breaks），从而诱发DNA损伤修复机制，细胞通过非同源性末端接合机制（NHEJ, Non-homologous End Joining）修复DNA，达到基因敲入到小鼠的基因中。

[0027] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，针对RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，设计基因敲入的Oligo 序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA（翻译的蛋白质序列：MPHKIEGFFLLLLFGYEATLGLSSTEDEGE DPWYQKACKC DCQVGANALW SAGATSLDCI PECP）。

[0028] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，在RS1基因的215bp处设置一个Bpu10I酶切位点。

[0029] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，设计构建好的人源性RS1基因Oligo 序列，将其进行体外转录，采用显微注射的方式将体外转录的mRNA序列注射入C57BL/6J成熟卵细胞中，注射成功的受精卵可体外培养过夜或立即转入代孕母鼠子宫中受孕培养。

[0030] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，代孕母鼠产仔后，取F1代小鼠的尾巴和脚趾，提取全基因组，进行PCR扩增，Bpu10I酶切酶切验证，测序鉴定。基因鉴定结果表明我们成功构建了RS1h-KI小鼠疾病模型。

[0031] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型，RS1h-KI小鼠基因测序序列:CATTATCTCTGTTGAGTTCTGGGATAGGAGGGGTTCATTCCTTCTTTTGTATTTTGGGATGAGGTCTCAATACTTTCTCCGGACAGCCCAGAGAAGCTGGGACTCCACACTGTGAACATATGCTACCACTCTGCCTGGAGATTTGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCTTAGCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCAGATCACTTGCTCCAACCCAGAGCAGTATGTGGGCGGTATTCCTCCA。

[0032] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，A、RS1h-KI疾病模型小鼠。B、RS1h-KI疾病模型小鼠酶切鉴定结果。1表示RS1h-KI疾病模型小鼠无酶切时RS1h基因为
309bp，2表示用Bpu10I酶切后明显的两条带：215bp和94bp；Control组中在有酶切条件（第4泳道）和无酶切（第3泳道）条件下均未见酶切条带。C、Control小鼠和RS1h-KI疾病模型小鼠基因测序结果。在RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，说明成功构建RS1h-KI疾病模型小鼠。

[0033] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，首先用光学相干断层成像技术扫描了野生型小鼠（wide type,WT）和RS1h-KI小鼠视网膜E，我们发现RS1h-KI小鼠视网膜出现明显的劈裂腔（蓝色圈标记处），外核层和感光细胞层变薄。进一步做免疫组织化学检测，F是HE染色结果，与WT小鼠相比，RS1h-KI小鼠视网膜结构变化异常，其外从状层（蓝色箭头）出现明显的空腔，细胞之间联系变少。RS1h-KI小鼠视网膜的外核层（黄色箭头处）和感光细胞外段层（青色箭头）变薄，统计分析显示（G、H），差异极其显著（n=24,  P<0.0001）。

[0034] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，OCT扫描结果，WT小鼠视网膜结构清晰，RS1h-KI小鼠在视网膜的外网层明显的劈裂腔。免疫组织化学方法比较野生型小鼠和RS1h-KI小鼠的视网膜结构差异，与WT小鼠相比，RS1h-KI小鼠视网膜的外网层出现非常明显的劈裂腔，细胞之间的联系变少。RS1h-KI小鼠视网膜外核层、感光细胞外段层厚度统计分析结果，与WT小鼠相比，RS1h-KI小鼠视网膜的外网层和感光细胞层厚度均变薄，差异显著。

[0035] 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，RS1h-KI小鼠在组织结构上呈现的明显差异，在其生理功能上也表现出与病人相似的临床表征。我们对RS1h-KI小鼠进行了视网膜电图检测视网膜电图是光刺激视网膜时从角膜或相应部位记录到的视网膜总电反应，主要反映视网膜第一、二级神经元的功能。正常的野生型小鼠闪光FERG(fash-ERG)依次有一个负相较小的a波和一个较大的正相b波（J、M、P）。而RS1h-KI小鼠的FERG明显异常：在暗适应视网膜电图检测视杆细胞反应时（K、O），与WT相比，b波明显减小（n=12, P<0.0001），a波变化不明显，无差异（n=12, P>0.5）；在暗适应混合反应（N）时，与WT相比，a波（L）和b波（O）明显减小，差异显著（n=12, P<0.0001）；在检查视锥细胞闪烁反应时（Q），与WT相比，a波（n=12, P<0.001）几乎消失，b波明显减小（n=12, P<0.01）。统计分析a/b比率发现（R），暗适应的视杆细胞在野生型小鼠和RS1h-KI小鼠之间变化较大，差异显著；而视锥细胞和视杆细胞的复合反应的a/b却没有变化；但视锥细胞的差异却是明显的（n=12, P<0.05）。
总之，RS1h-KI小鼠视网膜电图检测表明，RS1h-KI小鼠视网膜视觉功能受损，即是视网膜第一、二级神经元的功能异常。最重要的是RS1h-KI小鼠视网膜结构检测结果发现RS1h-KI小鼠视网膜的外丛状层出现明显的劈裂腔，这正是感光细胞细胞与视网膜双极细胞之间的突触链接变化异常，这可能是RS1h-KI小鼠视网膜b波异常的重要原因。其次，RS1h-KI小鼠在结构上表现为感光细胞层变薄，但a波在暗适应下无变化，说明RS1h-KI小鼠视网膜光感细胞中视杆细胞的视觉功能影响不大。虽然在视锥细胞表现出b波减小，但小鼠中视锥细胞数量较少，故对小鼠视锥细胞的视觉功能影响不明显。因此，视觉功能和视网膜结构检测都可以说明RS1h-KI小鼠视网膜视网膜中主要是由于感光细胞与双极细胞之间的突触链接受损致使RS1h-KI小鼠视觉功能异常，这正是RS1h-KI小鼠发生在视网膜外丛状层的劈裂所造成的，这与临床病人表征相同，说明我们构建得到了人源性的RS1h-KI小鼠疾病模型。

[0036] 虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了描述，但是，本领域普通技术人员应当了解，可以不限于上述实施例的描述，在权利要求书的范围内，可作出形式和细节上的各种变化。

[0037]序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法
<160> 2
<210> 1
<211> 5855bp
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 1
aacaatacct ccccagactg cttgttgagg caggggacta tgtggcttaa ttggatgggg 60
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5855<210> 2
<211> 279bp
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 2
CATTATCTCT GTTGAGTTCT GGGATAGGAG GGGTTCATTC CTTCTTTTGT ATTTTGGGAT 60
GAGGTCTCAA TACTTTCTCC GGACAGCCCA GAGAAGCTGG GACTCCACAC TGTGAACATA 120TGCTACCACT CTGCCTGGAG ATTTGGGTGT TTGAGTGTGT GCTGTTTTTC CTCCCCAGAA 180TGCCCTTAGC ACAAGCCCCT GGGTTTCGAG TCAGGGGAGG TCACGCCAGA TCAGATCACT 240TGCTCCAACC CAGAGCAGTA TGTGGGCGGT ATTCCTCCA                        279