靶向MDM2锌指结构域的小分子药物及其抗肿瘤用途
阅读：371发布：2020-05-14
专利汇可以提供靶向MDM2锌指结构域的小分子药物及其抗肿瘤用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及靶向MDM2锌指结构域的小分子药物及其抗 肿瘤 用途。RPL11与MDM2中心结构域的C4锌指区结合，在p53激活和核糖体应激传感中发挥着最重要的作用。 申请 人 发现了靶向MDM2锌指结构域的关键位点，以此筛选出小分子化合物S9，体内外实验均显示S9具有明显的抑制肿瘤 细胞增殖 的作用，显示其具有良好的临床应用前景。，下面是靶向MDM2锌指结构域的小分子药物及其抗肿瘤用途专利的具体信息内容。
1.靶向MDM2锌指结构域的小分子药物，所述小分子药物与MDM2的侧链Asp294和/或Asp301和Arg326形成氢键，进而抑制MDM2与RPL11结合。
2.根据权利要求1所述的小分子药物，其特征在于，靶向MDM2锌指结构域的小分子药物与MDM2残基Ile297、Tyr302、Pro313、Pro314、Leu315和Trp329发生疏水相互作用。
3.根据权利要求1所述的小分子药物，其特征在于，小分子药物为S9，化学分子式如图1所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的靶向MDM2锌指结构域的小分子药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，靶向MDM2锌指结构域的小分子药物抑制肿瘤细胞增殖或引起肿瘤细胞凋亡。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，肿瘤包括下列中的一种或几种：乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、白血病、喉癌、肾癌、骨肉瘤、结直肠管、食管癌或宫颈癌。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S9使用浓度为50μM-800μM；优选的，S9使用浓度为100μM-400μM。
8.权利要求1-3任意一项所述的靶向MDM2锌指结构域的小分子药物在制备诱导细胞周期阻滞或肿瘤细胞凋亡试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，细胞周期阻滞在G2M相。
10.一种抗肿瘤药物组合物，包括通过P53介导肿瘤细胞凋亡的药物和不依赖P53诱导肿瘤细胞凋亡的药物，其特征在于，通过P53介导肿瘤细胞凋亡的药物包括S9和/或下列药物中的一种或几种：CP-31398、P53R3、NSC319726、PK7088、Chetomin、PEITC、RITA、COTI-2、PRIMA-1。
靶向MDM2锌指结构域的小分子药物及其抗肿瘤用途
技术领域
[0001] 本申请涉及肿瘤药物领域，具体涉及靶向MDM2锌指结构域的小分子药物及其抗肿瘤用途。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤最重要的特征是细胞增殖失控，p53是最重要的抑癌基因之一。p53在50％以上的人类癌症中发生突变或缺失，在多数未发生p53突变的癌症中，p53下游信号通路往往失活。因此，在肿瘤中恢复p53的活性一直以来是针对p53通路药物开发的重要方向。
MDM2既是p53的靶基因之一，同时也是细胞内p53最为重要的的主要负调控因子。MDM2包括三个结构域：N端结构域、C端环指结构域和中心结构域。MDM2通过N末端区域与p53广泛相互作用并介导其泛素化降解，从而失活p53。
MDM2既是p53的靶基因之一，同时也是细胞内p53最为重要的的主要负调控因子。MDM2包括三个结构域：N端结构域、C端环指结构域和中心结构域。MDM2通过N末端区域与p53广泛相互作用并介导其泛素化降解，从而失活p53。
[0003] MDM2在多种肿瘤中高表达。因此，抑制MDM2或阻断MDM2-p53相互作用从而稳定并活化p53，是开发基于p53抗肿瘤药物的一个重要方向。近年来研究发现，包括RPL11、RPL23和RPL5在内的共有16个核糖体蛋白(RP)通过直接结合MDM2从而抑制MDM2介导的p53蛋白酶体降解，并活化p53，形成RP-MDM2-p53信号通路，该通路失活导致多种肿瘤发生。其中，RPL11与MDM2中心结构域的C4锌指区结合，在p53激活和核糖体应激传感中发挥着最重要的作用。因此，申请人尝试针对MDM2上与RPL11结合区的三维空间构象筛选小分子化合物以期模拟RPL11与MDM2相互作用，并活化p53抑癌通路。
[0004] 本研究中，我们通过计算机辅助设计筛选发现小分子化合物S9可以模拟RPL11-MDM2相互作用。在这里，我们首次评估了化合物S9在体外和体内抗肿瘤的疗效。此外，我们还研究了这一抗癌过程中的分子机制。我们的研究结果首次表明，S9通过作用于MDM2，从而抑制p53降解，并活化p53信号通路，在体外和体内均具有明显的抑制肿瘤细胞增殖并引起肿瘤细胞凋亡的作用。研究结果表明，RPL11和MDM2相互作用的位点是一种潜在的新型癌症治疗靶点，具有非常好的临床应用前景。发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供靶向MDM2锌指结构域的小分子药物，所述小分子药物与MDM2的侧链Asp294和/或Asp301和Arg326形成氢键，进而抑制MDM2与RPL11结合。
[0006] MDM2锌指结构域是指MDM2的Glu293-Lys334区域。
[0007] 进一步，靶向MDM2锌指结构域的小分子药物与MDM2残基Ile297、Tyr302、Pro313、Pro314、Leu315和Trp329发生疏水相互作用。
[0008] 优选的，小分子药物为S9，化学分子式如图1所示。
[0009] 靶向MDM2锌指结构域的小分子药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0010] 优选的，靶向MDM2锌指结构域的小分子药物为S9。
[0011] 优选的，S9使用浓度为50μM-800μM；更优选的，S9使用浓度为100μM-400μM。
[0012] 进一步，靶向MDM2锌指结构域的小分子药物抑制肿瘤细胞增殖。
[0013] 进一步，靶向MDM2锌指结构域的小分子药物引起肿瘤细胞凋亡。
[0015] 刘廷等证实了MDM2的高表达与乳腺癌的转移密切相关，即靶向MDM2的小分子药物可用于抑制乳腺癌的发生和转移；关于MDM2与非小细胞肺癌的研究报道屡见不鲜，张红蕊等对56例非小细胞肺癌手术标本检测，发现MDM2在癌组织中高表达，即靶向MDM2的小分子药物可用于抑制肺癌的发生和转移；吴穷等人应用免疫组化的EliVision法检测70例肝细胞癌组织和40例癌旁组织中的MDM2的表达情况，结果发现，MDM2在肝细胞癌中的表达阳性率明显高于其癌旁组织的表达率，即靶向MDM2的小分子药物可用于抑制肝癌的发生和转移；李大伟等通过免疫组化方法检测喉癌中MDM2蛋白的表达水平，研究结果表明，MDM2在喉癌组织中高表达，同时经分析得出分化程度越低，其阳性表达率越高，即靶向MDM2的小分子药物可用于抑制喉癌的发生和转移；Hong等发现食管鳞癌中的MDM2的表达水平明显高于正常和非典型增生的组织中的表达水平，其阳性率可达50％以上，同时还发现MDM2的过表达更多见于淋巴结转移和低分化的患者，说明MDM2的异常表达与食管鳞癌的形成有关，即靶向MDM2的小分子药物可用于抑制食管鳞癌的发生和转移；杨生兰等利用免疫组化的方法检测宫颈鳞癌和正常组织中MDM2蛋白的表达水平，最终显示MDM2蛋白在宫颈鳞癌中的阳性率为57.14％明显高于正常组织中的表达率，二者的差异具有统计学意义，表明其高表达与与宫颈癌的发生有关，即靶向MDM2的小分子药物可用于抑制宫颈癌的发生和转移。
[0016] 靶向MDM2锌指结构域的小分子药物在制备诱导细胞周期阻滞或肿瘤细胞凋亡试剂中的应用。
[0017] 优选的，细胞周期阻滞在G2M相。
[0018] 进一步，所述肿瘤包括下列中的一种或几种：乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、白血病、喉癌、肾癌、骨肉瘤、结直肠管、食管癌或宫颈癌
[0019] 一种抗肿瘤药物组合物，包括通过P53介导肿瘤细胞凋亡的药物和不依赖P53诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
[0020] p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，细胞中抑制癌变的基因p53会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复；若DNA变异较大，p53就诱导细胞凋亡，称之为P53介导肿瘤细胞凋亡，根据此原理研发的药物称之为通过P53介导肿瘤细胞凋亡的药物。此外，进一步研究发现，在诱导肿瘤细胞凋亡的途径中，还存在P53非依赖途径，在P53转录活性缺失或者蛋白翻译受抑制的情况下，依然可以诱导细胞凋亡。P53介导肿瘤细胞凋亡和不依赖P53诱导肿瘤细胞凋亡，二者相辅相成，共同发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用。
[0021] 进一步，通过P53介导肿瘤细胞凋亡的药物包括S9和/或下列药物中的一种或几种：CP-31398、P53R3、NSC319726、PK7088、Chetomin、PEITC、RITA、COTI-2、PRIMA-1。
[0022] CP-31398，苯乙烯基喹唑啉类化合物，能够显著增加野生型p53的表达水平，并进一步引发肿瘤细胞的凋亡。
[0023] PK7088可以在肿瘤细胞中诱导产生p53Y220C分子依赖性的G2/M细胞周期阻滞，细胞凋亡及生长抑制。
[0024] Chetomin，中文名毛壳菌素。可恢复p53的转录激活活性进而抗肿瘤。
[0025] PEITC通过激活经典的p53下游靶基因，使得肿瘤细胞出现S期及G2/M期细胞周期停滞，并诱导细胞凋亡过程的发生。
[0026] RITA可以在肿瘤细胞中诱导凋亡基因如NOXA，p21及GADD45等的表达而重新恢复突变的p53的功能。
[0028] 图1是小分子化合物S9的化学分子式；
[0029] 图2是S9与MDM2相结合的模拟图；
[0030] 图3是免疫印迹图；左图：用pcDNA3-Flag-MDM2和pcDNA3-MYC-L11共转染U2OS细胞，再用不同浓度S9处理24h后，用抗Flag抗体进行免疫沉淀，用抗MDM2、抗p53、抗Myc和抗L11抗体进行免疫印迹；右图：用不同浓度的S9处理U2OS细胞24h，用自制抗MDM2抗体进行免疫沉淀，然后用抗MDM2、抗p53和抗L11抗体进行免疫印迹
[0031] 图4是S9抑制多种肿瘤细胞增殖图；
[0032] 图5是S9引起G2/M期细胞周期停滞和凋亡图；a用所述浓度的S9处理U2OS细胞24h，用PI染色，流式细胞仪分析。b用所述浓度的S9处理U2OS细胞24小时，用EdU和DAPI染色。红色表示EdU阳性核。c用所述浓度的S9处理U2OS细胞24h，流式细胞术定量检测凋亡细胞。d用所述浓度的S9加或不加泛胱天蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh(10μM)处理U2OS细胞24h，蛋白质印迹分析PARP分割带；
[0033] 图6是S9诱导HCT116细胞周期停滞和凋亡图；a用PI染色，流式细胞仪分析细胞周期；b用蛋白印迹检测PARP分割带；
[0034] 图7是S9增强p53的表达、稳定和转录活性图；a用所述浓度的S9处理U2OS和HCT116细胞24h，用蛋白质印迹法检测MDM2、p53和p21蛋白水平。b用50μM S9在不同时间节点处理U2OS和HCT116细胞，用蛋白质印迹法检测MDM2、p53和p21蛋白水平。c使用或不使用25μMS9处理U2OS和HCT116细胞24小时，随后再使用放线菌酮(CHX，50μg/ml)处理细胞，并在指定时间点收细胞。蛋白质印迹法检测p53和内参蛋白(actin)水平。通过灰度分析定量内参蛋白标准化的p53表达。d用所述浓度的S9处理U2OS细胞24h，用Q-PCR方法分析MDM2、p21、Puma和Bax的mRNA水平；
[0035] 图8是RT-PCR检测S9对p53转录水平的影响；
[0036] 图9是S9诱导U2OS细胞周期停滞、凋亡依赖于MDM2图；a用MDM2 siRNA转染U2OS细胞，然后用所述浓度的S9处理24h，用PI染色，流式细胞仪分析。b蛋白印迹分析检测MDM2、PARP分割带和p53蛋白水平；
[0037] 图10是S9诱导HCT116细胞周期停滞、凋亡依赖于MDM2图；a用MDM2 siRNA转染HCT116细胞，转染48小时后用蛋白印迹检测MDM2蛋白水平。b用MDM2 siRNA转染HCT116细胞，然后用所述浓度的S9处理24h，用PI染色，流式细胞仪分析细胞周期；c用蛋白印迹分析PARP和p53蛋白水平；d用PI染色，流式细胞仪分析细胞周期；
[0038] 图11是S9诱导细胞凋亡依赖于p53图；a.用所述浓度的S9处理U2OS细胞和H1299细胞24h。然后用蛋白印迹法检测p53和PARP蛋白水平。b-d.用所述浓度的S9处理野生型和p53敲除U2OS细胞24h。(b)然后用蛋白印迹检测PARP和p53蛋白水平。(c)用PI染色，流式细胞仪分析细胞周期。
[0039] 图12是S9在体内实验抗肿瘤活性图；a体重与时间的相对变化。b肿瘤体积与时间的相对变化。
具体实施方式
[0040] 实施例1小分子化合物S9的筛选
[0041] 首先从PDB(全称)蛋白质结构数据库获取RPL11(或简称为L11)和MDM2的晶体结构(PDB ID:4XXB)。然后从小分子数据库筛选符合条件的小分子化合物。用作筛选库的小分子数据库是中国上海陶素生化科技有限公司化合物数据库。考虑到MDM2通过一个酸性区域和两个锌指结构与RPL11相互作用，其中MDM2的Glu293-Lys334区域被认为是小分子抑制剂结合的活性位点。在分子对接计算中，加入MDM2受体的氢原子，去除所有水分子。通过分子对接计算筛选化合物并采用对接评分法评价抑制剂的结合亲和力。对接评分法是一种改进的评分函数。为了加速虚拟筛选而采用高通量筛选。然后，使用默认的对接参数把前1％以内的高对接分数的小分子筛选出。经过两轮虚拟筛选，通过对接评分和聚类分析选择符合条件的小分子化合物。
[0042] 化合物S9(图1)因其较高的对接分数(7.78)和有效的MDM2抑制活性而脱颖而出。为了描述蛋白质MDM2与化合物S9之间的相互结合作用，从基于分子对接的虚拟筛选中获得了MDM2/S9复合物的构象图，如图2所示。化合物S9与MDM2的侧链Asp294形成两个氢键，而侧链Asp294是MDM2酸性结构域中通过盐桥作用结合RPL11的关键残基之一。此外，化合物S9的酰胺基还与Asp301和Arg326形成三个氢键。这两个残基也被认为是MDM2与RPL11结合的关键残基。化合物S9可能与MDM2发生了保守的氢键相互作用。此外，化合物S9与残基Ile297、Tyr302、Pro313、Pro314、Leu315和Trp329也发生了很强的疏水相互作用。
[0043] 实施例2免疫沉淀
[0044] 2.1实验材料：
[0045] 细胞株
[0046] 人骨肉瘤U2OS和结肠癌HCT116细胞株由北卡罗莱纳大学教堂山分校提供。人肺泡上皮癌A549、人肾透明细胞癌786-O、人肾腺癌细胞ACHN和人肝细胞癌HEPG2细胞株均购自于上海生物化学与细胞生物学研究所。
[0047] 载体构建
[0048] 合成包含N端FLAG标签及人源MDM2编码序列的核酸并通过酶切连接插入pcDNA3.1(Thermo-fisher V79020)表达载体，获得pcDNA3-FLAG-MDM2；合成包含N端Myc标签及人源RPL11编码序列的核酸并通过酶切连接插入pcDNA3.1(Thermo-fisher V79020)表达载体,获得pcDNA3-MYC-L11载体的构建。细胞转染
[0049] 转染质粒DNA
[0050] (1)细胞密度约50％可进行细胞转染质粒。准备1.5ml EP管，EP管中加入100ul EC buffer。下面把0.8ug的质粒加入EP管中，涡旋3次。EP管中加入3.2ul enhance，涡旋3次，室温放置2分钟。2分钟后向EP管中加入8ul effectence，涡旋3次，室温放置10分钟；
[0051] (2)移除细胞培养皿中培液，加入新的培养基1.5ml。向EP管中加入400ul新培养基，上下颠倒轻摇8次。混匀后用移液枪均匀地滴进6孔板中；
[0052] (3)放置细胞培养箱中24-48h，然后进行免疫共沉淀实验。
[0053] Western blot
[0054] 提取总蛋白(以6孔板为例)
[0055] (1)细胞培养、铺板方法同前。待细胞贴壁后，使用S9分别以终浓度0、25、50、100μM处理细胞24或48小时；
[0056] (2)配制含有工作浓度为1mM DTT和1mM PMSF的0.5％NP 40裂解液，置于冰上；
[0057] (3)取出细胞培养皿，置于冰上，弃培液，每孔加入1mL预冷的PBS漂洗2次，用吸引器将PBS尽量吸干；
[0058] (4)每孔加入100μL NP40裂解液，用细胞刮将细胞刮下，用移液枪把细胞裂解液移入预冷的1.5mL EP管中，置4℃冷房旋转摇匀30min；
[0059] (5)细胞充分裂解后，将细胞裂解液移至4℃离心机，15000rpm离心10min；
[0060] (6)将上清蛋白液转移至新的预冷的1.5mL离心管中，置于冰上。
[0062] (1)取400μL G250与2μL蛋白液置于1.5mL EP管中充分混合后，取200μL混悬液加入到96孔板，同时设立空白对照孔；
[0063] (2)酶标仪检测595nm波长OD值，按公式：蛋白浓度(μg/μL)＝(蛋白孔OD值-对照孔OD值)×10得出蛋白浓度。
[0064] 免疫沉淀(IP)
[0065] (1)细胞培养、铺板，待细胞贴壁后，使用S9分别以终浓度0、25、50、100μM处理细胞24小时；
[0066] (2)取出细胞培养皿，放置冰上。弃培液，冷PBS洗一遍，用吸引器尽量吸尽PBS。加入0.1％NP-40(含有DDT、PMSF)。刮细胞收至预冷的1.5mLEP管中，4℃冷房旋转30min；
[0067] (3)将细胞裂解液放在4℃离心机13000rpm离心5min，上清蛋白液移至新的1.5mLEP管中，置冰上；
[0068] (4)向EP管中加入50uL琼脂糖凝胶CL4B，4℃冷房旋转30min；
[0069] (5)将EP管放入4℃离心机3000rpm离心2min，上清移至新的1.5mL EP管中；
[0070] (6)按前述考马斯亮蓝方法测蛋白浓度；
[0071] (7)测好浓度后先进行Input置样，每个Input样所需蛋白量50-100μg，计算好上清蛋白体积后用5×蛋白上样缓冲液(按前述置蛋白样方法)置样并放在-20℃保存；
[0072] (8)每个IP样所需蛋白量为1mg，根据蛋白浓度计算好上清蛋白体积后移至1.5mL EP管中然后根据实验设计向IP蛋白样品中加入相应抗体，1μg抗体对应1mg蛋白。将蛋白IP样品置于4℃冷房旋转过夜；
[0073] (9)次日向IP样品中分别加入7.5μL protein A和protein G磁珠，4℃冷房旋转2h；
[0074] (10)2h后将IP蛋白样品放置在磁力架上静置几分钟，可见磁珠吸附在管壁一侧，液体变成无色透明这时可吸尽上清。用0.1％NP-40(含有PMSF)1ml洗涤三遍，吸尽上清(注意勿把磁珠吸掉)。向IP样品中加入30μL 1×蛋白上样缓冲液，95℃煮沸5分钟；
[0075] (11)将Input和IP蛋白样品进行western-blot检测
[0076] 实验结果
[0077] 我们在U2OS细胞中共表达pcDNA3-Flag-MDM2和pcDNA3-MYC-L11，然后用0、25、50和100μM浓度的S9处理细胞24h。结果显示，尽管随S9处理浓度上升Flag抗体结合的MDM2蛋白显著增加，但是免疫共沉淀的MYC-L11水平基本保持不变，归一量化结果显示S9处理导致单位FLag-MDM2结合的MYC-L11显著减少。(图3左)。换言之，S9与L11竞争结合MDM2。同时，在内源性免疫沉淀实验中也观察到了类似的结果(图3右)。这些结果表明，S9具有与L11竞争结合MDM2的能力，也进一步证实我们筛选得到的S9可以成功的靶向到MDM2上。
[0078] 实施例3S9抑制多种肿瘤细胞增殖
[0079] 3.1实验方法
[0080] CCK-8细胞增殖检测
[0081] (1)人肾癌786-O和ACHN、肺泡上皮癌A549、骨肉瘤U2OS、结肠癌HCT116和肝癌HEPG2细胞培养，铺板至96孔板。96孔板每孔铺10000个细胞，每组做5个复孔，周围加上PBS防止液体蒸发，细胞培养箱培育12-24h；
[0082] (2)细胞密度约50-60％时，分别给予每种细胞0、1、10、50、100、200、400、800μM的S9处理，并继续培育24h；
[0083] (3)弃培液，每孔加入110uL的CCK-8和DMEM(含10％胎牛血清)的混匀液(CCK-8溶液10μl+培养基100μl)，此步注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD值的读数。
[0084] (4)将96孔板放在细胞培养箱内孵育1-4h，用酶标仪测定2h时的450nm处吸光度值。
[0085] (5)活力计算：细胞活力％＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100[0086] A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0087] A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0088] A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0089] 3.2实验结果
[0090] 为了评价S9对肿瘤细胞增殖的影响，我们对人肾癌786-O和ACHN、肺泡上皮癌A549、骨肉瘤U2OS、结肠癌HCT116和肝癌HEPG2等6种不同的肿瘤细胞系进行了CCK-8细胞增殖测定。如图4所示，在5个肿瘤细胞系中，S9处理浓度为50μM时已经对肿瘤细胞的增殖产生明显抑制，S9处理浓度为100μM(IC50值为100μM)可获得非常显著的生长抑制作用。随着S9浓度的不断增加，其抑制作用也逐渐增强。然而，与其他5种细胞系相比，HEPG2细胞的生长抑制作用较弱，这可能是由于HEPG2对S9的敏感性不同所致。正如在临床治疗肿瘤时中某一化疗药物对一部分恶性肿瘤疗效突出而对另一些恶性肿瘤的效果就没那么理想。结果表明S9对肾癌、肺癌、骨肉瘤、结肠癌等肿瘤具有明显的抑制作用，具有很好的临床应用价值。
[0091] 实施例4S9引起G2/M期细胞周期停滞和凋亡
[0092] 4.1实验方法
[0093] 细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒)
[0094] (1)细胞培养、接种同前，待细胞贴壁后，使用S9分别以终浓度0、50、100μM处理细胞24或48小时；
[0095] (2)转移培液至15mL离心管中并置于冰上。然后加胰酶消化培养皿中的贴壁细胞，消化吹散后转移至同一离心管中。用冷PBS 5mL/次洗涤细胞二遍(4℃2000rpm离心5min)；
[0096] (3)弃上清后用1×Binding Buffer洗涤细胞一次，4℃ 2000rpm离心5min；
[0097] (4)加入500ul Binding Buffer重悬细胞，并移入流式管中；
[0098] (5)加入5ul Annexin V-FITC混匀后，再加入5μL Propidium Iodide，混匀；
[0099] (5)室温、避光、反应5-15min；
[0100] (6)在1h内进行流式细胞仪的观察和检测。
[0101] 细胞周期
[0102] (1)细胞培养、接种，待细胞贴壁后，使用S9分别以终浓度0、50、100μM处理细胞24或48小时；
[0103] (2)设立对照组并准备染色液，每样本需500ul工作液孵育。按Rnase A：PI＝1：9配制成染色工作液；
[0104] (3)取出培养皿，弃培液，胰酶消化并吹散，细胞悬液移至15mL离心管中，4℃ 2000rpm离心5min。用冷PBS洗涤细胞一次(4℃ 2000rpm离心5min)。冷PBS重悬细胞然后细胞计数。配制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，取1mL细胞悬液移至1.5mL EP管中；
[0105] (4)固定细胞：将细胞悬液慢慢滴加入到含有预冷的(-20℃)75％酒精的15mL离心管中，注意此步骤需边涡旋酒精边逐滴加入细胞。4℃固定过夜；
[0106] (5)用冷PBS洗涤细胞二次(4℃ 1000rpm离心5min)；
[0107] (6)加入提前配好的500ul PI/Rnase A染色工作液，室温避光反应30-60min；(7)上机检测，记录波长488nm处红色荧光。
[0109] (1)细胞培养、接种同前。取对数生长期细胞，96孔板每孔接种1×104个细胞，待细胞贴壁后，使用S9分别以终浓度0、50、100μM处理细胞24或48小时；
[0110] (2)EdU标记：用培养基按1000:1稀释EdU溶液，制备适量50uM EdU培养基，每孔加入100ul孵育2h，弃培液。PBS清洗细胞1次，每次5min；
[0111] (3)细胞固定：每孔加入50ul细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液。加入50ul 2mg/ml甘氨酸，摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液。加入100ulPBS，摇床清洗5min，弃PBS。加入100ul渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)摇床孵育10min，PBS清洗1次，5min；
[0112] (4)Apollo染色：每孔加入100ul 染色反应液，避光、室温、摇床孵育30min，弃反应液。加入100ul渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)摇床清洗2次，每次10min，弃渗透剂。每孔加入100ul甲醇，孵育5min。PBS清洗1次，5min；
[0113] (5)DNA染色：每孔加入100ul 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、摇床孵育30min后，弃染色反应液。每孔每次加入100ul PBS清洗2次；
[0114] (6)染色完成后立即在荧光显微镜下观察、拍照、合成图片。
[0115] 4.2实验结果
[0116] 为了研究S9介导生长抑制的机制，我们进行了Annexinv-FITC/PI染色结合流式细胞分析，以量化S9在细胞周期和凋亡中的作用；用PI单染结合流式细胞术检测细胞周期。结果表明，S9在U2OS细胞中可诱导明显的G2M相细胞周期停滞(图5a)。在HCT116细胞中也观察到类似的结果(图6a)。
[0117] 此外，我们用EdU染色来进一步验证S9对细胞增殖的影响。用不同浓度的S9处理U2OS细胞24h后用EdU和DAPI染色。数据表明，S9处理后细胞增殖明显抑制，这一点可以通过显著减少的EdU染色来证明(图5b)。为了阐明所观察到的生长抑制是否与诱导凋亡有关，我们用0、50和100μM S9处理U2OS细胞24小时后进行了AnnexinV-FITC/PI分析并通过蛋白质印迹检测PARP切割情况以反应Caspase活化程度。从增加的Annexin V阳性细胞数(图5c)和PARP切割带(图5d)可以看出S9以剂量依赖性的方式诱导细胞凋亡。并且这种细胞凋亡可以被Caspase抑制剂Q-VD-OPh所阻断(图5e)。S9也可以在HCT116细胞中诱导细胞凋亡(图6b)。因此，这些结果证实S9具有显著的生长抑制作用，与诱导细胞周期阻滞和凋亡相关。
[0118] 实施例5 S9增强p53的表达、稳定和转录活性
[0119] 引物合成：
[0120] GAPDH-F(5’to3’):CCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCT(SEQ ID NO.1)
[0121] GAPDH-R(5’to3’):CCATGAGGTCCACCACCCTGTT(SEQ ID NO.2)
[0122] MDM2-F(5’to3’):GGTGGGAGTGATCAAAAGGA(SEQ ID NO.3)
[0123] MDM2-R(5’to3’):CCTGATCCAACCAATCACCT(SEQ ID NO.4)
[0124] p21-F(5’to3’):CCCGTGAGCGATGGAACT(SEQ ID NO.5)
[0125] p21-R(5’to3’):CGCTCCCAGGCGAAGTC(SEQ ID NO.6)
[0126] p53-F(5’to3’):CTCCCCTGCCCTCAACAGGATGTTTTGCCAACTGG(SEQ ID NO.7)[0127] p53-R(5’to3’):CCAGTTGGCAAAACATCCTGTTGAGGGCAGGGGAG(SEQ ID NO.8)[0128] PUMA-F(5’to3’):ACGACCTCAACGCACAGTACG(SEQ ID NO.9)
[0129] PUMA-R(5’to3’):GTAAGGGCAGGAGTCCCATGATG(SEQ ID NO.10)
[0130] Bax-F(5’to3’):CATGTTTTCTGACGGCAACTTC(SEQ ID NO.11)
[0131] Bax-R(5’to3’):CAGCCCATGATGGTTCTGAT(SEQ ID NO.12)
[0132] 实验结果：
[0133] 为了研究S9抑制细胞增殖的分子机制是否与p53相关，我们检测了S9对p53表达和活性的影响。实验方法参考上述实施例。根据先前得到的IC50值，我们分别尝试用不同浓度和在不同时间节点S9处理HCT116和U2OS细胞。蛋白质印迹分析显示，S9能够上调p53以及其靶基因MDM2和p21的表达，且该上调作用表现出剂量和处理时长的依赖性，说明S9确实能够活化p53。(图7a、7b)。p53表达量升高可能来源于转录上调或其稳定性升高。我们进一步研究了S9能否改变p53蛋白的半衰期，(图7c)结果表明，在HCT116和U2OS细胞中，S9处理显著延缓了p53的降解速率，提高了p53蛋白的稳定性。S9对p53的激活也通过以剂量依赖性方式诱导四个p53靶基因MDM2、p21、Puma和Bax的mRNA水平来证明(图7d)。p53表达量升高可能来源于转录上调或其稳定性升高。因此，我们通过qPCR检测不同浓度S9(0、10、25、50uM)处理U2OS细胞24h，对于p53转录本的影响，结果显示S9对p53转录水平的影响很小(图8)。综上所述，这些结果表明S9可以通过增强p53的稳定性从而上调其表达、导致p53转录活性升高。
[0134] 实施例6 S9诱导细胞周期阻滞和凋亡依赖于MDM2
[0135] 上述实施例结果表明，S9能够在物理上与L11竞争和MDM2的相互作用。为了进一步验证该该竞争性结合是否成功实现靶向抑制MDM2的作用，我们设计实验检测了S9介导的细胞凋亡和周期阻滞是否具有MDM2依赖性。
[0136] si-RNA序列
[0137] Negative control
[0138] (5’to3’):UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO.13)
[0139] MDM2-siRNA#1
[0140] (5’to3’):CGCCACAAAUCUGAUAGUATT(SEQ ID NO.14)
[0141] MDM2-siRNA#2
[0142] (5’to3’):GCCUGCUUUACAUGUGCAATT(SEQ ID NO.15)
[0143] 通过在U2OS细胞中转染MDM2 siRNAs，再用不同浓度的S9处理细胞，进行细胞周期和PARP分割带蛋白印迹分析，我们发现MDM2沉默的细胞中，S9引起的G2/M期细胞周期停阻滞被显著抑制，同时PARP切割也显著嫌少(图9a、9b)。在HCT116细胞中也观察到类似的结果(图10)。这些结果表明S9诱导的细胞周期阻滞和凋亡依赖于MDM2。
[0144] 实施例7 S9诱导细胞凋亡亦依赖于p53
[0145] 一般认为，p53诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞是其发挥抑癌功能的主要贡献因素。为了确定S9诱导的细胞周期组滞和凋亡是否依赖p53，我们分别比较了p53野生型和p53敲除的肿瘤细胞中细胞周期与凋亡事件。结果表明，S9以剂量依赖性的方式诱导细胞凋亡(图
11a，11b)。由于U2OS和H1299来源于不同肿瘤，其遗传背景不够一致。我们进一步在U2OS细胞中通过CRISPR技术敲除p53。结果发现，虽然PARP切割表现出显著的p53依赖性，与野生型U2OS细胞相比，S9引起的G2/M相细胞周期停滞在p53敲除U2OS细胞细胞中没有显著降低(图
11c)。以上发现表明S9诱导的细胞凋亡依赖于p53，但是因为未知原因S9引发的细胞周期阻滞与p53无关。我们在野生型p53敲除的HCT116细胞中也观察到了类似的结果。
11a，11b)。由于U2OS和H1299来源于不同肿瘤，其遗传背景不够一致。我们进一步在U2OS细胞中通过CRISPR技术敲除p53。结果发现，虽然PARP切割表现出显著的p53依赖性，与野生型U2OS细胞相比，S9引起的G2/M相细胞周期停滞在p53敲除U2OS细胞细胞中没有显著降低(图
11c)。以上发现表明S9诱导的细胞凋亡依赖于p53，但是因为未知原因S9引发的细胞周期阻滞与p53无关。我们在野生型p53敲除的HCT116细胞中也观察到了类似的结果。
[0146] 前述结果显示，S9诱导的细胞周期阻滞依赖于MDM2而不依赖于p53，说明该小分子化合物S9还可能通过影响MDM2介导的p53非依赖的细胞周期阻滞而抑制肿瘤细胞增殖。
[0147] 实施例8 S9在体内实验具有抗肿瘤活性
[0148] 8.1实验材料：
[0149] 本实验研究所用实验动物采购于北京维通利华实验动物技术有限公司。为35-41天龄的BALB/c-nu雌性裸鼠(SPF级)，体重16-18g。裸鼠全部饲养在徐州医科大学实验动物中心(西校区)。严格按照动物中心动物实验规定进行饲养及动物实验。
[0150] 8.2构建肿瘤动物模型
[0151] (1)先让裸鼠适应动物中心环境，饲养1周后，排除体弱及并发其他疾病的小鼠。把体重和生长状态相近的裸鼠完全随机分成三组，每组4只；
[0152] (2)准备接种细胞：取处于对数生长期的HCT116WT细胞并用胰酶消化，将细胞吹散后移至50ml离心管，800rpm，离心3min，吸去上清，用灭菌PBS洗涤2遍；
[0153] (3)用预冷的灭菌PBS重悬细胞，进行细胞计数，用PBS稀释成浓度为10×106个/ml的细胞混悬液。根据裸鼠数量准备适量的接种细胞。按照细胞悬液和Matrigel胶等体积比6
配制成5×10个/ml细胞混悬液并转移至EP管中，置于冰上(全程在冰上操作)；
配制成5×10个/ml细胞混悬液并转移至EP管中，置于冰上(全程在冰上操作)；
[0154] (4)裸鼠皮下接种，在每只裸鼠的侧腹部皮下注射200ul含有1×106个HCT116细胞的细胞悬液。
[0155] 8.3裸鼠体内药物实验
[0156] (1)一周后肿瘤动物模型建成，对三组荷瘤小鼠分别给予S9 5mg/kg、25mg/kg以及PBS尾静脉注射。小鼠所需的小分子药物S9按荷瘤小鼠体重算好计量后均溶解于200ul灭菌PBS中。尾静脉注射PBS作为阴性对照组；
[0157] (2)给药频率采用每隔一天注射一次，共注射六次。同时在实验期间相应的隔也日一次(即小鼠给药前)监测小鼠体重和肿瘤体积变化并做好记录。肿瘤体积按公式V＝L×W2/2计算，其中L为最大直径，W为最小直径；
[0158] 8.4实验结果：
[0159] 我们采用HCT116人异种移植模型对S9的体内抗肿瘤活性进行评价。结果表明，与PBS对照组相比，S9治疗组小鼠体重变化无统计学意义(图12a)，提示S9对小鼠生长几乎没有副作用。相反，与接受PBS治疗的小鼠相比，接受S9治疗的小鼠的肿瘤体积显著减少(图12b)。这些结果表明，S9在HCT116异种移植模型中具有抗肿瘤的作用，且无明显副作用。
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