技术领域
[0001] 本
发明涉及一种用于伤口愈合精华液的制备方法，特别涉及一种脐带间充质干细胞伤口愈合因子精华液的制备方法。
背景技术
[0002] 伤口愈合是一个涉及多种类型细胞的复杂过程，正常情况下伤口的修复过程包括三个阶段，
炎症期、肉芽组织形成期、组织改造塑型期，在这一过程中有一系列已知的细胞因子和
生物化学反应发生，大量研究表明细胞因子在伤口愈合的各个阶段均发挥着重要的作用，他们通过介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，参与组织修复、更新和再生，已有研究指出通过添加外源性细胞因子，可以有效改善伤口愈合状况，具有重要的临床意义。
[0003] 研究表明表皮生长因子（EGF）能够促进，
加速核酸代谢，加快细胞从G-GI期转化，促进细胞的有丝分裂，促进表皮
细胞增殖，从而促进伤口愈合。
[0004] 转化生长因子β1能促进表皮细胞移动，趋化巨噬细胞和
纤维母细胞，促进细胞外基质合成和塑形，与疤痕形成有重要关系。
[0005] 白介素6可促进
角质细胞迁移和瘢痕组织形成，白介素8有加速角质细胞增殖和上皮组织再生的能
力，在炎症反应中均发挥重要作用。
[0006] 很多精细的化工产品多含有
乙醇、
着色剂、铅汞等对人体肌肤有还得物质，消费者在使用过程中对身体是有害的，严重可能造成皮炎及感染问题，并且都不具有生物活性，不能从根本上改善
皮肤的新陈代谢和生存环境,更不能达到伤口快速愈合的目的。
[0007] 干细胞分泌因子中含有各种生理作用极强的生长因子，其作用备受瞩目，由于其在伤口愈合过程中发挥着重要作用，其有望在皮肤、
角膜、消化道伤口的愈合中发挥重要作用，并且可以用于美容业中纹眉、美瞳线后的的皮肤修复，市场前景广阔。
发明内容
[0008] 本发明提供了一种分离间充质干细胞分泌因子的方法，它包括如下步骤。
[0009] （1）脐带组织选取：选取1个健康产妇正常分娩或者剖腹产脐带组织，为孕妇自愿的前提下选取，2℃～8℃条件下保存，24小时内进行处理。
[0010] （2）分离并培养脐带间充质干细胞：根据步骤（1）中取得的脐带组织，在24小时内进行间充质干细胞的分离和培养，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，将脐带组织剪成小段，并将脐带内血管以及脐带表面羊膜组织去除，剩余的部分用
镊子和手术刀分离开，将组织
块转移到T175的培养瓶中，加入脐带间充质干细胞专用培养基，37℃、5%CO2
培养箱中进行培养。
[0011] （3）获取P2代细胞：经过对步骤（2）中的组织进行培养，观察脐带间充质干细胞的生长状态，发现每块组织都有细胞爬出时将培养瓶中的组织块取出，继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰蛋白酶消化，获取P1代细胞；P1代细胞转移到T175的培养瓶中继续培养，当回合度达到90%左右时胰蛋白酶消化，获得P2代细胞。
[0012] （4）收集干细胞上清原液：每个脐带组织在步骤（3）中获得的P2代细胞以1×104/cm2接种
密度分别接种到5个T175的培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养48小时，当P2代细胞生长汇合度达到85%-90%的时候，收取P2代细胞的培养上清原液，用3mL的EP管取2mL的待检样品，剩余样本保存在-20℃备用。
[0013] （5）过滤浓缩收集精华液过程：将步骤（4）中获得的上清原液，平衡至室温，转入离心管中，在3000rmp条件下离心10分钟，留上清，弃沉淀；将离心得到的140mL左右的上清液转入装好的
超滤杯中，旋好杯盖，按下卡扣，接通氮气，缓慢调整氮气压力，先开罐体
阀门，然后调节分压阀门，在10psi条件下使离心上清透过100KD超滤膜。待杯内液体下降到7mL左右时，停止过滤，先关掉分压阀门，然后关掉罐体阀门，留取过滤液；清洗超滤杯，将100KD透过液转入装好3KD超滤膜的超滤杯中，在氮气压力55psi的条件下超滤，待杯内液体达到14mL时停止加压，将3KD截留液也用3mLEP管留取2mL，用于伤口愈合因子检测，其余样品放入-20℃
冰箱中暂存。
[0014] (6)伤口愈合因子浓度检测：此步骤中所用的检测
试剂盒均为R&D System品牌，在检测之前先用试剂盒中的标准品测出各检测项目标准品的OD值，并制作标准曲线备用；对步骤（4）收集到的细胞因子上清原液和步骤（5）收集到的细胞因子上清浓缩液统一从冰箱中取出，恢复到室温，分别进行白细胞介素 8（IL8），白细胞介素 6（IL6），转化生长因子 1（TGF-β1），单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1），血管内皮生长因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 总共7个指标的检测；每个样品的每项检测指标均严格按照使用说明进行实验操作，将计算出的OD值根据各标准曲线换算成对应的浓度，结果见下表1。
[0015]对浓缩液进行除菌分装：将浓缩好的干细胞因子上清液，先经过0.22um的滤器进行除菌过滤，除菌后以5ml/瓶分装到安瓿瓶中，4℃保存备用。
[0016] 通过对浓缩前后的伤口愈合因子进行检测，发现间充质干细胞培养上清液确实存在大量的伤口愈合因子，其中TIMP-1和MCP-1分泌量最多，经过10倍浓缩后，虽然大部分都有40%以上的损失量，但是仍然能够收集到50%-60%的伤口愈合因子，证明此方法获取高浓度的细胞因子还是非常有效果的。
[0017] 根据本发明所述方法制备的脐带间充质干细胞，按照2006年国际细胞
治疗协会（ISCT）制定的标准进行生物学鉴定，其中表面
抗原阳性指标CD73，CD90，CD105表达率≥95%，阴性指标CD34，CD45，CD19，CD11b，HLA-DR的表达率≤2%。
[0018] 安全性检测：①细菌/
真菌培养；②病毒检测，包括
艾滋病病毒，乙型
肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋体，人巨细胞病毒；③内毒素检测；④原癌基因检测，包括不同代次c-myc、Bmi1、H-ras三个基因的表达
水平；⑤支原体检测等。所有安全性指标符合要求后，才能作为合格安全的产品使用。
[0019] 此发明优势有以下几点。
[0020] 在细胞培养过程中，使用的试剂种类少，相对来说培养基的配置简单，操作方便，并且培养效果非常好，大大缩短了培养的时间。
[0021] 本发明所使用的培养基是干细胞临床级专用培养基（LONZA-UItraCULTURE Serum-free Medium和life-UItoser
混合液），用此方法获得高浓度的伤口愈合因子精华液，具有生物活性，并且无动物来源的添加剂，也减少了支原体、真菌、和病毒等
微生物的危险，对人类来说，使用起来更加安全有效。
[0022] 本发明根据各个细胞因子的分子量不同，分别为：白细胞介素 8（IL8）分子量为69-79KD；白细胞介素6（IL6）分子量为21-30KD；转化生长因子 1（TGF-β1）分子量为44.3KD；
单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）分子量为8-10KD；血管内皮生长因子（VEGF）分子量为34-
45KD；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分子量为18-22KD；基质金属蛋白酶
抑制剂1（TIMP-1）分子量为25.21KD，选择适合的滤膜区间3KD-100KD，保障了所有要收集的伤口愈合因子都在此区间范围内，为获得高纯度的浓缩液提供了理论
基础。
[0023] 本发明获得了高浓度的细胞因子精华液，并且对间充质干细胞进行了表型鉴定，终产品进行了安全性检测，保障了产品的整个生产工艺的安全性，是值得信赖的产品。
附图说明
[0024] 图1根据本发明的实例二中的A方法，大部分组织块周围都有间充质干细胞细胞爬出时的状态。
[0025] 图2根据本发明的实例二中的A方法，此时间充质干细胞的汇合度达到85%左右，可以进行传代培养时候的状态。
[0026] 图3根据本发明的实例二中的B方法，在有组织块的情况下，间充质干细胞密度达到85%左右，可以将组织取出传代培养时候的状态。
[0027] 图4根据本发明的实例四中，P2代间充质干细胞继续扩大培养，汇合度达到85%左右时候的状态。
[0028] 图5间充质干细胞流式表型鉴定结果。
[0029] 图6梅毒、丙肝、HIV的检测结果。
[0030] 图7 HBV病毒检测结果。
[0031] 图8内毒素检测结果。
[0032] 图9原癌基因检测结果。
具体实施方式
[0033] 下面结合
实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。
[0034] 一、分离脐带组织。
[0035] 将获取的脐带组织，在24小时内处理采集的脐带组织，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，一般要冲洗2-3遍，后将脐带组织剪成小段，每段大约长2cm，之后去掉脐带内的2条动脉血管和1条静脉以及脐带表面羊膜组织，将剩余部分用镊子和手术刀分离开，得到需要培养的组织块。
[0036] 二、培养获取的组织块，分成两个组分别进行。
[0037] A.将分离出的组织块放在150mm的培养皿中，将组织块用手术刀继续切割，大小在3
1mm 左右，将切好的组织块，转移到T175的培养瓶中，加入间充质干细胞专用培养基（LONZA-UItraCULTURE Serum-free Medium和life-UItoser混合液），放在37℃，5%CO（2 v/v）培养箱中静置培养，第3天换液，之后每2天换一次液，观察大部分组织块都有细胞爬出后，见图1，去掉组织块，换液，在细胞的汇合度达到80%-90%之间见图2，进行传代扩增。
[0038] B.将分离出的组织块放在150mm的培养皿中，将组织块用手术刀继续切割成大小为1mm3左右的小块，将切好的组织块转移到T175的培养瓶中，加入间充质干细胞专用培养基（LONZA-UItraCULTURE Serum-free Medium和life-UItoser混合液），放在37℃，5%CO2（v/v）培养箱中静置培养，第3天换液，之后每3天换一次液，组织块一直跟细胞一起进行培养，观察当细胞的汇合度达到80-90%的时候见图3，将组织块取出，进行传代扩增。
[0039] 经过两组对比试验发现，在培养获取的组织块中，组织块从中间取出，或者最后取出，对于间充质干细胞P0代细胞的整体培养扩增效果并没有很大影响，两种方法都可以成功获得健康充足的间充质干细胞。
[0040] 三、获取P2代间充质干细胞。
[0041] 将T175的培养瓶，放在百级超净台中，用10ml移液器将培养瓶中的培养上清液转移到离心管中备用；再用PBS清洗两遍，然后再将T175的培养瓶中加入5ml胰蛋白酶，在
显微镜下观察消化情况，当细胞都处于悬浮并呈圆形状态时，用培养基上清液终止反应，并300g离心5min收集细胞，弃上清；收集细胞用PBS重悬吹打清洗细胞，300g离心5min弃上清；将P1代细胞用间充质干细胞专用培养基重悬细胞，加入到T175的培养瓶中继续培养，当汇合度达到90%左右时，加入5mL胰蛋白酶，在显微镜下观察消化情况，当细胞都处于悬浮并呈圆形状态时，用培养基上清液终止反应，并300g离心5min收集细胞，弃上清，获得P2代细胞，并用间充质干细胞专用培养基重悬细胞。
[0042] 四、P2代细胞的扩大培养。
[0043] 将重悬好的间充质干细胞以1×104个细胞/cm2的密度接种到5个T175的培养瓶中继续培养，37℃、5%CO2培养箱中培养48小时，当P2代细胞生长汇合度达到85%-90%的时候，见图4，收取P2代细胞的培养上清原液，用3mL的EP管分别取2mL的上清原液待检样品，进行伤口愈合因子的原液检测，将待检样品和剩余样本保存在-20℃备用。
[0044] 五、上清液过滤浓缩。
[0045] 将上清原液，平衡至室温，转入离心管中，在3000rmp条件下离心10分钟，留上清，弃沉淀；将离心得到的140mL左右的上清液转入装好的超滤杯中，旋好杯盖，按下卡扣，接通氮气，缓慢调整氮气压力，先开罐体阀门，然后调节分压阀门，在10psi条件下使离心上清透过100KD超滤膜。待滤出液体积达到133ml时，停止过滤，先关掉分压阀门，然后关掉罐体阀门，留取过滤液；清洗超滤杯，将100KD透过液转入装好3KD超滤膜的超滤杯中，在氮气压力55psi的条件下超滤，待杯内液体达到14ml时停止加压，将3KD截留液也用3mLEP管留取2ml待检样品，其余样品放入-80℃冰箱中暂存。
[0046] 六、ELISA检测伤口愈合因子。
[0047] 所用的检测试剂盒均为R&D System品牌的，在检测之前先用试剂盒中的标准品测出各检测项目标准品的OD值，并制作标准曲线备用；对干细胞培养上清原液和干细胞培养上清浓缩液统一从冰箱中取出，恢复到室温，分别进行白细胞介素 8（IL8），白细胞介素 6（IL6），转化生长因子 1（TGF-β1），单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1），血管内皮生长因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 总共7个指标的检测；每个样品的每项检测指标均严格按照使用说明进行实验操作，将计算出的OD值根据各标准曲线换算成对应的浓度。
[0048] 七、间充质干细胞免疫表型鉴定。
[0049] 取第2代细胞，流式细胞术检测间充质干细胞免疫表型，待细胞汇合度达90%左右6
时，消化收集细胞，计数后按1×10 个细胞/管，分装5管；PBS清洗后，1000rpm离心5分钟，弃上清，残留200μl，吹打混匀细胞；分别加入PE标记的CD34，CD73，CD105，CD11b
抗体以及FITC标记的CD19，CD45，CD90和HLA-DR抗体，并设计阴性对照；在4℃下，避光反应30分钟，PBS清洗后，1000rpm离心5分钟，弃上清，用 200μl 的PBS吹打混匀细胞后直接上样检测；也可用
200μl的1%多聚甲
醛固定，置4℃冰箱于3日内上样检测。流式免疫表型检测结果符合间充质干细胞的特征，如图5所示。
[0050] 八、产品安全性检测。
[0051] 对收集到的细胞培养上清液进行细菌/真菌培养，结果显示为阴性；用Elisa方法进行病毒检测，包括艾滋病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋体，人巨细胞病毒，检测结果见图6和图7；用鲎试剂方法检测内毒素含量，显示为阴性；④支原体检测检测结果如图8，其中图6、7和8中的检测样品编号都命名为CSC2017101001。
[0052] 原癌基因检测:原癌基因（proto-oncogene）是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持
机体正常生命活动所必需的，在进化上高度保守。当原癌基因的机构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，细胞增殖与分裂失去控制，从而形成
肿瘤。检测体外传代培养的间充质干细胞是否表达原癌基因，可预警发生恶性转化的间充质干细胞，对保证间充质干细胞产品的安全性起到重要作用。
[0053] 本发明采用real-time PCR方法，测定P1、P6、P11和P16共四个代次的间充质细胞原癌基因c-myc、Bmi1、H-ras的表达情况。本发明的检测结果表明，四个代次表达水平都比较低，没有显著高水平表达的代次，如图9所示，表明本方法提取的脐带间充质干细胞没有发生恶性转化的迹象。
