技术领域
[0001] 本
发明涉及
土壤提取物纯化技术领域，具体涉及一种土壤中球囊霉素的提纯方法。
背景技术
[0002] 球囊霉素是目前为止发现的唯一一种丛枝菌根
真菌分泌到土壤中的一类糖白质，能够和单克隆
抗体(MAb32B11)发生免疫性
荧光反应，且非常稳定，难溶于
水，只有用偏
碱性的
柠檬酸钠溶液才能提取得到。球囊霉素由N连接而成，分子量约为355KD，由3％～5％N、36％～59％C、4％～6％H、33％～49％O和0.03％～0.1％P组成，有些还含有0.8％～8.8％Fe。球囊霉素还属于一种热激蛋白，其蛋白序列与一种线粒体基质热激蛋白HSp 60的序列高度同源(>80％)。
[0003] 最初的球囊霉素的提取方法为考
马斯亮蓝法，其原理是：除球囊霉素蛋白以外的所有非热稳态蛋白在浸提过程中都能够被破坏。根据这一原理球囊霉素被分为总球囊霉素(TG)、易提取球囊霉素(EEG)、免疫
反应性总球囊霉素(IRTG)和免疫反应性易提取球囊霉素(IREEG)。最近，GRSP被分成3种：易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EE-GRSP)、难提取球囊霉素相关土壤蛋白(DE-GRSP)和总球囊霉素相关土壤蛋白(T-GRSP＝EE-GRSP+DE-GRSP)。大量的研究已经证实，球囊霉素能够提高水稳性团聚体的含量和土壤团聚体的
稳定性，改善土壤理化性状，在保护、恢复和重建
生态系统中发挥重要作用。球囊霉素也够能固定土壤中的
碳和氮，是土壤有机碳库的重要组分。球囊霉素还具有非常重要的胶结功能，它能够与重金属元素结合，并通过
吸附、隔离作用，过滤重金属或者降低重金属的
生物可利用性。此外，球囊霉素还可以提高
植物的抗旱性。
[0004] 球囊霉素的定量研究涉及提取和定量测定两个方面，一般提取球囊霉素通常采用Wright和Upadhyaya描述的方法，通过不同的提取条件可分别获得易提取球囊霉素和总提取球囊霉素；球囊霉素的定量测定则采用考马斯亮蓝G-2500
染色或者酶联免疫法(ELISA)对提取液中的球囊霉素含量进行定量。整个方法的关键步骤就是从土壤中获得球囊霉素提取液，因为其球囊霉素的含量及特异性直接影响后续的研究。然而，一系列研究指出，应用Wright和Upadhyaya的方法提取的球囊霉素并非AM真菌的专性分泌物，不能确定为真正意义上的球囊霉素。之后也有不少研究者对球囊霉素的提取方法进行改进，但仍是无法从土壤中获得纯度较高的相关蛋白，这严重限制了人们研究其在土壤中的分布及环境功能。因此，本发明提供一种土壤中球囊霉素的提纯方法。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明针对从土壤中提取球囊霉素的传统方法并不是专性的方法，不能去除球囊霉素以外的所有非热稳态土壤蛋白，从而无法得到高纯度球囊霉素的问题，提供了一种土壤中球囊霉素的提纯方法，该方法能去除球囊霉素以外的所有非热稳态土壤蛋白，得到高纯度的球囊霉素。
[0006] 本发明提供的一种球囊霉素的提纯方法，步骤包括：
[0007] S1、采集土壤表面0-20cm的黄壤，混匀
风干，过孔径4mm的网筛去除土壤中杂质；
[0008] S2、取步骤S1所得土壤，加入20mmol/L，pH为7的柠檬酸钠溶液，振荡30～60s，后于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，分别收集上清液及沉淀；
[0009] S3、将步骤S2所得上清液于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的
颜色不再是红棕色，即得液态的易提取球囊霉素；
[0010] S4、取步骤S2所得沉淀，加入50mmol/L，pH为8的柠檬酸钠溶液，振荡至沉淀均匀散开，再于100-105kpa，120-125℃条件下提取55-65min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的难提取球囊霉素；
[0011] S5、取步骤S1所得土壤，加入50mmol/L，pH为8的柠檬酸钠溶液，振荡30～60s，后于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的总提取球囊霉素；
[0012] S6、分别将步骤S3所得液态的易提取球囊霉素、步骤S4所得液态的难提取球囊霉素、步骤S5所得液态的总提取球囊霉素的pH调节至2.5后，在4℃，4000～8000g/s下离心15～20min，弃去上清液收集下层沉淀；溶解沉淀后装入
透析袋，置于去离子水下透析60～72h，收集提取液，提取液在
冷冻干燥机上冷冻干燥12～24h，得到固态的纯化易提取球囊霉素、难提取球囊霉素和总提取球囊霉素。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] (1)本发明使用柑橘园特定深度的土壤进行提取，原料易得，预处理要求简单对环境无污染；
[0015] (2)本发明与传统的提取方法相比，安全高效，能去除球囊霉素以外的所有非热稳态土壤蛋白，得到高纯度的球囊霉素；
[0016] (3)本发明提取的高纯度的球囊霉素为固态，方便对其具体组成、基团分布、空间构型、结构特征的研究，认识其“真实面貌”，并揭示其迁移转化的机理。
具体实施方式
[0017] 本发明提供了一种球囊霉素的提纯方法，步骤包括：
[0018] S1、采集土壤表面0-20cm的黄壤，混匀风干，过孔径4mm的网筛去除土壤中杂质；
[0019] S2、取步骤S1所得土壤，加入20mmol/L，pH为7的柠檬酸钠溶液，振荡30～60s，后于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，分别收集上清液及沉淀；
[0020] S3、将步骤S2所得上清液于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的易提取球囊霉素；
[0021] S4、取步骤S2所得沉淀，加入50mmol/L，pH为8的柠檬酸钠溶液，振荡至沉淀均匀散开，再于100-105kpa，120-125℃条件下提取55-65min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的难提取球囊霉素；
[0022] S5、取步骤S1所得土壤，加入50mmol/L，pH为8的柠檬酸钠溶液，振荡30～60s，后于100-105kpa，120-125℃条件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下离心5～10min，收集上清液，重复提取、离心、收集上清液的过程多次至上清液的颜色不再是红棕色，即得液态的总提取球囊霉素；
[0023] S6、分别将步骤S3所得液态的易提取球囊霉素、步骤S4所得液态的难提取球囊霉素、步骤S5所得液态的总提取球囊霉素的pH调节至2.5后，在4℃，4000～8000g/s下离心15～20min，弃去上清液收集下层沉淀；溶解沉淀后装入透析袋，置于去离子水下透析60h，收集提取液，提取液在
冷冻干燥机上冷冻干燥12～24h，得到固态的纯化易提取球囊霉素、难提取球囊霉素和总提取球囊霉素。
[0024] 选用的0-20cm黄壤为球囊霉素含量最丰富的土壤层，利于后续球囊霉素提取。提取过程后的特定的转速及时间，有利于球囊霉素与杂质的分离，并提出以上清液颜色来判断提纯进行程度，更加直观方便、判断准确，易于提纯步骤的控制。进一步的，实现了球囊霉素液态到固态的转化，通
过冷冻干燥的方式得到的固态纯化球囊霉素，更加利于后续对其具体组成、基团分布、空间构型、结构特征的研究。
[0025] 优选的，步骤S2所述柠檬酸钠溶液配制方法包括如下步骤：
[0026] a、配制A液：取0.42～4.2g C 6H8O7·H2O溶于100～1000mL蒸馏水中配制得0.02mol/L柠檬
酸溶液；
[0027] b、配制B液：取0.5365～5.365g N a2HPO4·7H2O或0.716～7.16g Na2HPO4·12H2O在蒸馏水中溶至100～1000mL配制得0.02mol/L
磷酸氢二钠溶液；
[0028] c、把A液和B液以13:87的比例充分混匀得20mmol/L、pH＝7.0的柠檬酸钠缓冲液。
[0029] 优选的，步骤S4所述柠檬酸钠溶液配制方法包括如下步骤：称取1.4705～14.705g柠檬酸钠定溶至100～1000ml蒸馏水中使柠檬酸钠溶液浓度为50mmol/L，定容过程采用1～4moL氢
氧化钠溶液调整pH为8.0。
[0030] 优选的，步骤S2所述土壤取量为1.0～5.0g，柠檬酸钠溶液用量为4～40mL，步骤S4所述柠檬酸钠溶液用量为8～40mL。
[0031] 优选的，步骤S5所述土壤取量为1.0～5.0g，柠檬酸钠溶液用量为4～40mL。
[0032] 优选的，步骤S6所述冷冻干燥步骤前进行预冻，所述预冻
温度为-40℃，预冻时间为2-5h。
[0033] 更加优选的，步骤S6所述冷冻干燥为隔板温度-60℃～-55℃，
冷凝器温度低于-65℃～-60℃，极限
真空度0.8～1mbar的条件下冷冻干燥处理20～24h。
[0034] 优选的，步骤S1所述土壤为橘园土壤。
[0035] 下面将结合具体
实施例对本发明提供的一种球囊霉素的提纯方法予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0037] 实施例一
[0038] 在橘园采集10～20cm黄壤，混合均匀，风干，过孔4mm的筛子，去除土壤中的根系、垃圾以及石
块。
[0039] 配制20mmol/L(pH＝7.0)柠檬酸钠浸提液：(1)A液：0.02mol/L柠檬酸溶液(取0.42g C6H8O7·H2O溶于100mL蒸馏水)；(2)B液：0.02mol/L磷酸氢二钠溶液(取0.5365g Na2HPO4·7H2O或0.716g Na2HPO4·12H2O溶至100mL)；(3)分别量取A液和B液13mL、87mL，充分混匀得到100mL 20mmol/L、pH＝7.0的柠檬酸钠缓冲液。配置50m mol/L(pH＝8.0)柠檬酸钠浸提液：称取1.4705g柠檬酸钠定溶至100ml蒸馏水中，定容过程中用1moL氢氧化钠溶液调整pH为8.0。
[0040] 称取中采集的土壤1g放入离心管10mL中，加入8mL 20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提液，然后在
振荡器上振荡30s，接着在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，在4℃，10000g/s下离心5min，用10mL离心管分别收集上清液和残余土。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，在4℃，10000g/s下离心5min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化易提取球囊霉素。
[0041] 上述残余土壤中加入8mL 50mmol/L(pH＝8.0)柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡，直到黏附在离心管底部的土壤完全散开，然后在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，10000g/s下离心10min，收集上清液。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，在4℃，10000g/s下离心10min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化难提取球囊霉素。
[0042] 再称取采集的土壤1.0g加入8mL 20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡30s，接着在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，10000g/s下离心10min，收集上清液。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，10000g/s下离心10min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化总提取球囊霉素。
[0043] 用1M
盐酸滴定纯化的易提取、难题取和总提取球囊霉素溶液调节其pH为2.5，然后在4℃，4000g/s下离心20min，弃去上清液，收集下层沉淀。用0.1M氢氧化钠溶解收集的下层沉淀，再用透析袋装入已溶解的沉淀，袋中留三分之一至一半的空间，加样端用夹子夹紧袋口，使透析袋处于悬浮状态，透析袋在去离子水下透析60h，期间要加快透析速度可多次更换
透析液，或使用磁
力搅拌器，透析完后用离心管收集提取液。然后把装有提取液的离心管放在超低温
冰箱中预冻，-40℃下冷冻2小时以上，得到冻牢冻透的提取液。将预冻好提取液从超低温冰箱中取出，快速擦干离心管外壁的水分，去掉离心管的
盖子，再将装有提取液的离心管放入冷冻干燥机中，在隔板温度低于-55℃，冷凝器温度低于-60℃，极限真空度低于1mbar的条件下冷冻干燥处理20h。即可得到固态的纯化易提取、难提取和总提取球囊霉素。
[0044] 本发明方法独特，检测上述所制得的固态的纯化易提取、难提取和总提取球囊霉素纯度分别为99.3％，98.5％，97.6％。
[0045] 实施例二
[0046] 在橘园采集0～20cm黄壤，混合均匀，风干，过孔4mm的筛子，去除土壤中的根系、垃圾以及石块。
[0047] 配制20mmol/L(pH＝7.0)柠檬酸钠浸提液：(1)A液：0.02mol/L柠檬酸溶液(取4.2g C6H8O7·H2O溶于1000mL蒸馏水)；(2)B液：0.02mol/L磷酸氢二钠溶液(取5.365g Na2HPO4·7H2O或7.16g Na2HPO4·12H2O溶至1000mL)；(3)分别量取A液和B液130mL、870mL，充分混匀得到1000mL 20mmol/L、pH＝7.0的柠檬酸钠缓冲液。配置50m mol/L(pH＝8.0)柠檬酸钠浸提液：称取7.3525g柠檬酸钠定溶至500ml蒸馏水中，定容过程中用2moL氢氧化钠溶液调整pH为8.0。
[0048] 称取中采集的土壤4g放入离心管50mL中，加入32mL 20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡60s，接着在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，在4℃，12000g/s下离心8min，用50mL离心管分别收集上清液和残余土。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，在4℃，12000g/s下离心8min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化易提取球囊霉素。
[0049] 上述残余土壤中加入32mL 50mmol/L(pH＝8.0)柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡，直到黏附在离心管底部的土壤完全散开，然后在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，12000g/s下离心8min，收集上清液。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，在4℃，12000g/s下离心8min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化难提取球囊霉素。
[0050] 再称取采集的土壤4.0g加入32mL 20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡60s，接着在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，12000g/s下离心8min，收集上清液。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，12000g/s下离心8min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化总提取球囊霉素。
[0051] 用2M盐酸滴定纯化的易提取、难题取和总提取球囊霉素溶液调节其pH为2.5，然后在4℃，6000g/s下离心20min，弃去上清液，收集下层沉淀。用2M氢氧化钠溶解收集的下层沉淀，再用透析袋装入已溶解的沉淀，袋中留三分之一至一半的空间，用细绳绑紧透析袋两端，使透析袋处于悬浮状态，透析袋在去离子水下透析72h，期间要加快透析速度可多次更换透析液，或使用磁力搅拌器，透析完后用离心管收集提取液。然后把装有提取液的离心管放在超低温冰箱中预冻，-40℃下冷冻2小时以上，得到冻牢冻透的提取液。将预冻好提取液从超低温冰箱中取出，快速擦干离心管外壁的水分，去掉离心管的盖子，再将装有提取液的离心管放入冷冻干燥机中，在隔板温度低于-55℃，冷凝器温度低于-60℃，极限真空度低于1mbar的条件下冷冻干燥处理24h。即可得到固态的纯化易提取、难提取和总提取球囊霉素。
[0052] 本发明方法独特，检测上述所制得的固态的纯化易提取、难提取和总提取球囊霉素纯度分别为97.8％，96.1％，96.4％。
[0053] 实施例三
[0054] 在橘园采集10～15cm黄壤，混合均匀，风干，过孔4mm的筛子，去除土壤中的根系、垃圾以及石块。
[0055] 配制20mmol/L(pH＝7.0)柠檬酸钠浸提液：(1)A液：0.02mol/L柠檬酸溶液(取4.2g C 6H8O7·H2O溶于1000mL蒸馏水)；(2)B液：0.02mol/L磷酸氢二钠溶液(取5.365g Na2HPO4·7H2O或7.16g Na2HPO4·12H2O溶至1000mL)；(3)分别量取A液和B液130mL、870mL，充分混匀得到1000mL20mmol/L、pH＝7.0的柠檬酸钠缓冲液。配置50m mol/L(pH＝8.0)柠檬酸钠浸提液：称取14.705g柠檬酸钠定溶至1000ml蒸馏水中，定容过程中用4moL氢氧化钠溶液调整pH为8.0。
[0056] 称取中采集的土壤5g放入50mL离心管中，加入32mL 20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡60s，接着在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，12000g/s下离心10min，收集上清液和残余土。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅
103kpa，121℃条件下提取30min，12000g/s下离心10min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化易提取球囊霉素。
[0057] 上述残余土壤中加入40mL 50mmol/L(pH＝8.0)柠檬酸钠浸提液，然后在然后在振荡器上振荡，直到黏附在离心管底部的土壤完全散开，然后在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，12000g/s下离心10min，收集上清液。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取30min，12000g/s下离心10min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液体的纯化难提取球囊霉素。
[0058] 再称取采集的土壤5.0g加入40mL20mmol/L(pH＝7.0)的柠檬酸钠浸提液，然后在振荡器上振荡30s，接着在高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，10000g/s下离心10min，收集上清液。重复数次把收集的上清液再放入高温灭菌锅103kpa，121℃条件下提取60min，在4℃，10000g/s下离心10min，直到离心管中上层液的颜色不再是红棕色，得到液态的纯化总提取球囊霉素。
[0059] 用2M盐酸滴定纯化的易提取、难题取和总提取球囊霉素溶液调节其pH为2.5，然后在4℃，8000g/s下离心15min，弃去上清液，收集下层沉淀。用0.5M氢氧化钠溶解收集的下层沉淀，再用透析袋装入已溶解的沉淀，袋中留三分之一至一半的空间，加样端用夹子夹紧袋口，使透析袋处于悬浮状态，透析袋在去离子水下透析60h，期间要加快透析速度可多次更换透析液，或使用磁力搅拌器，透析完后用离心管收集提取液。然后把装有提取液的离心管放在超低温冰箱中预冻，-40℃下冷冻2小时以上，得到冻牢冻透的提取液。将预冻好提取液从超低温冰箱中取出，快速擦干离心管外壁的水分，去掉离心管的盖子，再将装有提取液的离心管放入冷冻干燥机中，在隔板温度低于-55℃，冷凝器温度低于-60℃，极限真空度低于1mbar的条件下冷冻干燥处理24h。即可得到固态的纯化易提取、难提取和总提取球囊霉素。
[0060] 本发明方法独特，检测上述所制得的固态的纯化易提取、难提取和总提取球囊霉素纯度分别为97.4％，95.6％，95.8％。
[0061] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
