一种检测苯醚甲环唑残留的ELISA检测试剂盒及检测方法
专利汇可以提供一种检测苯醚甲环唑残留的ELISA检测试剂盒及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种检测苯醚甲环唑残留的ELISA检测 试剂 盒 及检测方法，利用氯乙烷将苯醚甲环唑分子结构中苯环上3位氢 原子 取代为乙基，并将其 氧 化为羧基，随后，利用混合酸酐法将半 抗原 连接至载体上形成人工 抗体 ，载体为 牛 血清蛋白，利用苯醚甲环唑人工抗原免疫新西兰大白兔制备抗体，并与苯醚甲环唑标准品、浓缩洗涤液、底物显色液、反应终止液等相关试剂组成ELISA检测试剂盒。检测主要步骤包括：样品前处理、试剂盒检测、检测结果分析。与目前的几种应用较为广泛的常规检测方法相比，本发明涉及的酶联免疫检测方法具有成本低、检测灵敏度高等优点，为苯醚甲环唑的残留检测提供了有效的方法。，下面是一种检测苯醚甲环唑残留的ELISA检测试剂盒及检测方法专利的具体信息内容。
1.一种苯醚甲环唑多克隆抗体的制备方法，其特征是：
（1）苯醚甲环唑半抗原制备：
无水氯化铝与20 % 硝基苯放置于反应容器内，并将反应温度控制在10 ℃，加入氯乙烷，之后滴加苯醚甲环唑悬浮剂，滴完后匀速搅拌，并于10 ℃放置至反应完全；将反应物置于液体氟化氢溶液中，使其完全反应，室温放置2h，使氟化氢蒸发完全，反应结束后纯化产物；
取高锰酸钾溶于反应液中，升温，取上述纯化产物加入反应容器内，升温并搅拌直至紫色消失；对苯醚甲环唑半抗原产物进行重结晶，得到纯净物质，即苯醚甲环唑半抗原；
（2）苯醚甲环唑人工抗原制备：
将苯醚甲环唑半抗原，溶于DMF中，均匀搅拌，加入三正丁胺，冰浴，加氯甲酸异丁酯，搅拌；取BSA，溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液中；将半抗原、DMF混合溶液逐滴加入BSA溶液中，
4 ℃下搅拌离心后，弃掉沉淀，上清液透析72 h，期间更换透析液，干燥后得到苯醚甲环唑人工抗原；
（3）将苯醚甲环唑人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的多克隆抗体即为苯醚甲环唑多克隆抗体。
2.一种检测苯醚甲环唑的ELISA检测试剂盒，其特征是：检测试剂盒内包括包被有苯醚甲环唑包被抗原的酶标板、苯醚甲环唑标准品、苯醚甲环唑抗体、浓缩洗涤液、酶标物、底物显色液和反应终止液。
3.根据权利要求2所述的检测苯醚甲环唑的ELISA检测试剂盒，其特征是：酶标物为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体。
4.根据权利要求2所述的检测苯醚甲环唑的ELISA检测试剂盒，其特征是：洗涤液：
Na2HPO4·12H2O 68.8 g，NaH2PO4 6.9 g，NaCl 45 g；
底物显色液：底物液A：无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg；底物液B：100 mg TMB，10 mL DMSO；
反应终止液：1.25 mol/L的H2SO4。
5.一种利用权利要求2或3或4所述ELISA检测试剂盒进行ELISA检测方法，其特征是步骤如下：
（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品；
（2）在包被有苯醚甲环唑抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的苯醚甲环唑抗体及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（3）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置
5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（4）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化；
（5）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应；
（6）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。
一种检测苯醚甲环唑残留的ELISA检测试剂盒及检测方法
技术领域
发明内容
无水氯化铝与20 % 硝基苯放置于反应容器内，并将反应温度控制在10 ℃，加入氯乙烷，之后滴加苯醚甲环唑悬浮剂，滴完后匀速搅拌，并于10 ℃放置至反应完全；将反应物置于液体氟化氢溶液中，使其完全反应，室温放置2h，使氟化氢蒸发完全，反应结束后纯化产物；
取高锰酸钾溶于反应液中，升温，取上述纯化产物加入反应容器内，升温并搅拌直至紫色消失；对苯醚甲环唑半抗原产物进行重结晶，得到纯净物质，即苯醚甲环唑半抗原；
（2）苯醚甲环唑人工抗原制备：
将苯醚甲环唑半抗原，溶于DMF中，均匀搅拌，加入三正丁胺，冰浴，加氯甲酸异丁酯，搅拌；取BSA，溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液中；将半抗原、DMF混合溶液逐滴加入BSA溶液中，
4 ℃下搅拌离心后，弃掉沉淀，上清液透析72 h，期间更换透析液，干燥后得到苯醚甲环唑人工抗原；
（3）将苯醚甲环唑人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的多克隆抗体即为苯醚甲环唑多克隆抗体。
反应终止液：1.25 mol/L的H2SO4。
（2）在包被有苯醚甲环唑抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的苯醚甲环唑抗体及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（3）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置
5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（4）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化；
（5）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应；
（6）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。
反之，待测样品中苯醚甲环唑浓度较高时，其显色较深，酶标仪检测结果OD值较高。
具体实施方式
将350 g无水氯化铝以及249.5 mL，浓度为20 % 的硝基苯溶液放置于装有搅拌器、回流冷凝管和分液漏斗的三颈瓶中，并将反应温度控制在10 ℃，加入128.5 mL氯乙烷，之后缓慢滴入150 g 浓度为30 % 的苯醚甲环唑悬浮剂，滴加完后匀速搅拌，并于10 ℃放置至氟化氢溶液中，反应2h使其反应完全后将氟化氢蒸发完全。反应结束后分出有机层，将溶剂DMF蒸发掉以纯化产物。称取20 g高锰酸钾溶于反应液中，将温度升至50 ℃，取15 g上一步反应物加入反应容器内，全部加入后将温度升至65 ℃，搅拌直至紫色消失。对苯醚甲环唑半抗原产物进行重结晶，得到纯净物质。
称取2 g苯醚甲环唑半抗原，溶于2 mL DMF中，均匀搅拌，加入30μL三正丁胺，冰浴，加
30μL溶解于DMF的氯甲酸异丁酯，搅拌1h。称取3.2 g BSA，溶于5 mL，pH为 9.6，浓度为 0.1 mol/L的柠檬酸盐缓冲液中。将半抗原、DMF混合溶液逐滴加入BSA溶液中，4 ℃下搅拌5 h，搅拌后将反应液在5000 r/min条件下离心30 min，弃掉沉淀，留取上清液，将上清液透析三天，透析期间每隔8 h更换一次透析液，最终得到苯醚甲环唑人工抗原。
取3 mg苯醚甲环唑人工抗原溶于1 mL生理盐水中，将稀释过后的苯醚甲环唑人工抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，随后利用皮下多点注射方法将乳化后的苯醚甲环唑人工抗原注射于新西兰大白兔体内，每只大白兔一次用量为0.5 mg/kg。15天后，将同样用生理盐水稀释过的苯醚甲环唑人工抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，加强免疫，剂量为0.01 mg/kg，15天后进行第三次使用稀释过苯醚甲环唑人工抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行加强免疫，从此次加强免疫开始，免疫7天后取血，并测定其抗血清效价，直到其效价达到达一定数值，将制备好的多克隆抗体保存于-20 ℃备用。
（1）包被有苯醚甲环唑包被抗原的酶标板；
（2）苯醚甲环唑标准品；
（3）苯醚甲环唑抗体；
（4）辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体；
（5）洗涤液：Na2HPO4·12H2O 68.8 g，NaH2PO4 6.9 g，NaCl 45 g；
（6）底物液：底物液A：无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg；加双蒸水至1000 mL，调节PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min；
（7）反应终止液：1.25 mol/L的H2SO4；
（8）说明书一份。
（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品。
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
