抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY及其分离方法
专利汇可以提供抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY及其分离方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY及其分离方法，分离方法是：(1)动物免疫；(2)分离纯化分离出鸡卵黄，用去离子 水 稀释，调节pH，加 氯化钠 放5～6小时，离心分离，弃去沉淀，向上清液中加入 硫酸 钠进行第一次盐析，离心分离出 蛋白质 沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，用凝胶柱过滤，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监测，吸收 波长 为280nm，收集第一条谱带，经反 透析 浓缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，本发明的分离方法，工艺简单，成本低廉，所得样品 质量 较好。，下面是抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY及其分离方法专利的具体信息内容。
1.一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，其特征是用下述方法分离制成：
(1)动物免疫用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收 集鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1MHCl调节 pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25 分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析， 在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸 钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子 水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之 前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋 白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓 缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
2.一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的分离方法，其特征是由下述步骤组成：
(1)动物免疫用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收集 鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1MHCl调节 pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25 分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析， 在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸 钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子 水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之 前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋 白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓 缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
技术领域
本发明涉及一种特异性抗体及其分离方法，特别是涉及一种抗乙肝病毒的免疫球蛋白 及其分离方法。
背景技术
制备抗乙肝病毒表面抗原HbsAg的鸡卵黄免疫球蛋白IgY未见报道。有关鸡卵黄免疫 球蛋白IgY的制备纯化技术，国内外先后有几篇专利报道，如US6207807、US6217926、 CN1201693A等。其中所述的方法较为复杂，均与我们的有所不同.。
发明内容
本发明的第二个目的是提供一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的分离方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，用下述方法分离制成：
(1)动物免疫 用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收 集鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节 pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25 分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析， 在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸 钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子 水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之 前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋 白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓 缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的分离方法，由下述步骤组成：
(1)动物免疫 用乙肝病毒表面抗原HbsAg作为免疫原，对产蛋鸡进行免疫，收集 鸡蛋于4℃储存；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用6～9倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节 pH为4.5～5.5，加入氯化钠至0.1～0.2M，4℃放置5～6小时，在3500转/分下离心分离20～25 分钟，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18～20％，进行第一次盐析， 在3500转/分，离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸 钠至质量百分浓度为14～16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子 水至沉淀完全溶解为止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之 前，凝胶柱用25mM pH＝8的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋 白质流分用紫外光度计监测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓 缩，再透析除盐，得到一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
本发明分离制成的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY具有高活性、高产量、高 纯度的特点，可用于免疫检测。本发明的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的稳定 性远大于传统IgG，因而便于商业运输，贮存等流通环节的操作，可以延长试剂的使用期。 另外，较低的生产成本使IgY抗体做为诊断试剂推广应用。
本发明的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY分离方法，工艺简单，成本低廉， 所得样品质量较好。
本发明选择六月龄产蛋母鸡，隔离饲养，经肌肉免疫注射乙肝病毒表面抗原，以后进 行适当的几次加强免疫，卵黄中产生高滴度(40000～80000)的特异性抗体，效价维持9 月以上。本发明的特点在于摸索出的水稀释脱脂--两步盐析--凝胶过滤的分离方法，简 单经济，分离效果好，平均一个鸡卵黄中得到65mg电泳纯的IgY。
附图说明
图1为不同抗原浓度测定的IgY竞争ELISA曲线。
图2为本发明的一种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY分离技术工艺路线。
具体实施方式
实施例1
(1)动物免疫 六月龄产蛋鸡在免疫和产蛋期间隔离状态饲养，60μg/ml乙肝病毒 表面抗原HbsAg与等体积的佐剂混合作为免疫原。取1ml这种免疫原溶液，分四个位点对 每只鸡肌肉免疫注射。初次免疫，抗原与完全佐剂混合，两周后加强免疫注射一次，以后每 隔一个月加强免疫注射一次，加强免疫时，抗原与不完全佐剂混合.免疫期间，每天收集 鸡蛋于4℃储存待分离；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用8倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH 为5，加入氯化钠至0.15M，4℃放置5.5小时，在3500转/分下离心分离23分钟，弃去 沉淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为19％，进行第一次盐析，在3500转/分， 离心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓 度为15％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为 止，将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8 的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监 测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一 种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
(3)竞争ELISA实验
96孔微量板用10mg/L HbsAg按50μL/孔4℃包被过夜，10g/L BSA 37℃封闭1小时， 2mg/mL IgY溶液与不同浓度的HbsAg溶液等体积混合，室温下作用30分钟，然后每孔50 μL加入包被板中37℃反应1小时，用洗涤液洗三次，加入相应的HRP酶标二抗，37℃反 应30min，用洗涤液洗三次，每孔加50μL显色剂0.4mmol/L TMB，含3X10-3％H2O2，37℃显 色反应30min，每孔加25μL2mol/L H2SO4终止反应并测定A450值。
实施例2
(1)动物免疫 六月龄产蛋鸡在免疫和产蛋期间隔离状态饲养，60μg/ml乙肝病毒 表面抗原HbsAg与等体积的佐剂混合作为免疫原。取1ml这种免疫原溶液，分四个位点对 每只鸡肌肉免疫注射。初次免疫，抗原与完全佐剂混合，两周后加强免疫注射一次，以后每 隔一个月加强免疫注射一次，加强免疫时，抗原与不完全佐剂混合.免疫期间，每天收集 鸡蛋于4℃储存待分离；；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用6倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH 为5.5，加入氯化钠至0.2M，4℃放置5小时，在3500转/分下离心分离20分钟，弃去沉 淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为20％，进行第一次盐析，在3500转/分，离 心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度 为14％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止， 将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8 的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监 测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一 种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
实施例3
(1)动物免疫 六月龄产蛋鸡在免疫和产蛋期间隔离状态饲养，60μg/ml乙肝病毒 表面抗原HbsAg与等体积的佐剂混合作为免疫原。取1ml这种免疫原溶液，分四个位点对 每只鸡肌肉免疫注射。初次免疫，抗原与完全佐剂混合，两周后加强免疫注射一次，以后每 隔一个月加强免疫注射一次，加强免疫时，抗原与不完全佐剂混合.免疫期间，每天收集 鸡蛋于4℃储存待分离；
(2)分离纯化 分离出鸡卵黄，用9倍体积的去离子水稀释，用0.1M HCl调节pH 为4.5，加入氯化钠至0.1M，4℃放置6小时，在3500转/分下离心分离25分钟，弃去沉 淀，向上清液中加入硫酸钠至质量百分浓度为18％，进行第一次盐析，在3500转/分，离 心分离出蛋白质沉淀，沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止，加入硫酸钠至质量百分浓度 为16％，进行第二次盐析，离心分离，获得的蛋白质沉淀加去离子水至沉淀完全溶解为止， 将此溶液用2.5×100cm Sephadex G-150凝胶柱过滤，过滤之前，凝胶柱用25mM pH＝8 的磷酸盐缓冲液预平衡，洗脱液流速200ml/小时，洗脱出的蛋白质流分用紫外光度计监 测，吸收波长为280nm，收集第一条谱带，用聚乙二醇反透析浓缩，再透析除盐，得到一 种抗乙肝病毒的鸡卵黄免疫球蛋白IgY。
产蛋母鸡被免疫10天左右，即产生相应的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，且很快达到高峰， 产生较长时间的免疫应答，效价可维持数月至一年。IgY来源丰富、产量高，在相同的免 疫时间内由一只鸡所产生的鸡蛋中提取的抗体远比一只兔血清制备的抗体多，收集应答时 期所产鸡蛋可分离得到大量的特异性IgY，这一方法革新了传统应用兔、羊等动物制备抗 体的方法。母鸡易于饲养，费用不高，收集鸡蛋方便，无需宰杀动物，符合现代动物保护 规则。
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