细胞增殖涉及很多生物功能。其对于保持健康的皮肤很重要，并 且在伤口愈合中起重要作用。成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞 在皮肤伤口修复中是必不可少的。所有这三类细胞都在伤口愈合的初 期起关键作用。在损伤后约24小时内，成纤维细胞迁移到伤口位点内。 在愈合的后期(通常约4-21天)，成纤维细胞被激活，并经历爆发式 增殖与合成活动。它们产生大量纤连蛋白，并合成细胞外基质的其它 蛋白组分，包括胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖。已知成纤维细胞还有助 于伤口收缩(Cherry，G.W.，Hughes，M.A.，Ferguson，M.W.J.和 Leaper D.J.，Wound Healing.In Oxford Textbook of Surgery.P.J. Morris，和W.C.Wood，(eds.)，pp.131-159，Vol.1，Oxford University Press，New York，2001，ISBN：0192628844)。因此， 据表明，成纤维细胞增殖剂能够提高伤口愈合过程。参见例如 S.Casadio等人.On the Healing Properties of Esters of D- panthenol with Terpene Acids，with Particular Reference to D-pantothenyl Trifarnesylacetate.Arzneimittelforschung.， 17，1122-1125，(1967)；M.Aprahamian等人，Effects of Supplemental Pantothenic Acid on Wound Healing：Experimental Study in Rabbit，American Journal of Clinical Nutrition 41， 578-589(1985)，B.J.Weimann等人，Studies on Wound Healing： Effects of Calcium D-Pantothenate on the Migration， Proliferation and Protein Synthesis of Human Dermal Fibroblasts in Culture，International Journal of Vitamin Nutrition Res.，69，113-119，(1999)。
身体产生很多通常称为生长因子的物质，例如血小板衍生生长因 子(PDGF)、血小板衍生血管生成因子(PDAF)、血管内皮生长因子 (VEGF)、血小板衍生表皮生长因子(PDEGF)、血小板因子4(PF4)、 转化生长因子β(TGF-B)、转化生长因子α(TGF-A)、胰岛素样生长 因子1和2(IGF-1和IGF-2)、β血小板球蛋白相关蛋白(BTG)、血 小板反应蛋白(TSP)、纤连蛋白、von Wallinbrand因子(vWF)、 血管生成素、角质形成细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)等。每一种物质所共有的一个重要特征是， 已知或据信每一种这样的物质都能提高细胞或组织生长。其它细胞增 殖剂也有报道，例如在EP 0953354、JP 09-227413、JP 53-062815 A2 和EP 0560845A1中描述的那些。然而，一直需要另外的和/或改进的 细胞增殖剂和化合物。
皮肤的状况总是受到一些因素例如湿度、紫外线、化妆品组合物、 衰老、疾病、紧张状态和饮食习惯的影响。结果可出现各种皮肤问题。 就象形成皱纹所表明的那样，随着年龄的增长，皮肤也变得具有较差 弹性。衰老通常与皮肤的变薄和一般降解有关。随着皮肤的自然衰老， 供给皮肤的细胞和血管的数目会减少。还发生真皮-表皮接合处的变 扁，导致该接合处的机械抵抗力变弱。结果在机械创伤或病变时，老 年人更容易形成水疱(Oikarinen，A.，The Aging of Skin： Chronoaging Versus Photoaging，Photodermatal.Photoimmunol. Photomed.，7，3-4，1990)。
皮肤还包含用以保持其弹性特征的精细的弹性蛋白纤维网络。在 过度暴露于日光时，该弹性纤维系统会变得增生、结构破坏和最终破 裂。该过程称为光化性弹性组织变性，并且它是身体暴露区域皮肤起 皱纹、变色和松弛的主要原因。随着形成新的成纤维细胞、内皮细胞 和角质形成细胞，皮肤可自我修复。然而，在衰老时，皮肤自我修复 的能力变弱。因此，需要可促进早老皮肤生长和修复的试剂。
组织和/或器官经常发生损害或损伤。身体经常能够隔离受损区 域，然后通过除去和替换受损组织来自我修复。组织和器官损伤可由 多种起源引起，例如创伤、UV降解、中毒和/或病原性降解、热降解(例 如过热或过冷)等。虽然身体具有大量限制组织损害和促进修复的反 应机制，但是人们在不断寻找能提高修复速度和程度的方法。在这方 面，提高损伤愈合速度和/或程度是有益的，因为它(i)减轻了通常 与伤口和伤口愈合过程有关的疼痛和不适；(ii)减少了在组织或器 官防卫疾病的能力降低时发展成感染或其它疾患的机会；和(iii)降 低了治疗这样的病症相关的健康成本。
在这方面，例如，皮肤是人体中的最大器官，并且毫不意外，皮 肤经常发生创伤和损伤。皮肤中的伤口愈合通常分3个阶段，包括(1) 发炎、迁移和增殖；(2)修复，包括形成胶原和其它化合物；(3) 伤口闭合。最初，炎性细胞和其它细胞迁移到受损区域并充满受损区 域。之后在修复阶段，由纤连蛋白形成新的结缔组织，这又导致生成 胶原原纤维和最终较大的胶原纤维。之后伤口收缩导致伤口闭合，而 伤口收缩是部分由于伤口中以及伤口周围存在的变性的成纤维细胞所 致。
植物生长因子在植物的生长和发育中起整体作用。植物激素是主 要的植物生长因子。它们是天然存在的以小浓度有效的有机分子。植 物激素分为5个主要类别：植物生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯 和脱落酸(Janick，J.，Horticultural Science，pp.95-121， W.H.Freeman and Company，San Francisco，1979，ISBN： 0716710315；Biology of Plants，P.H.Raven，R.F.Evert和H.Curtis (Eds.)，pp.483-496，Worth Publishers Inc.，New York，1976， ISBN：0879010541；Biology，B.S.Guttman和J.W.Hopkins(Eds.)， pp.822-841，McGraw-Hill，New York，1998，ISBN：0697223663)。 植物生长素在芽尖、胚胎、幼叶、花、果实和花粉中刺激细胞伸长。 赤霉素刺激细胞分裂和伸长。细胞分裂素在发育活跃的植物部分中刺 激有丝分裂。它们刺激细胞分裂。乙烯是一种气态植物激素，其加快 成熟速度。脱落酸抑制其它激素的生长诱导作用。
据报道，激动素—一种细胞分裂素延迟人成纤维细胞的老化特征 开始(S.I.Rattan，Biochem Biophys Res.Comm.，201，665- 672，1994)。赤霉酸是一种赤霉素，还称为赤霉素A3。玉米素是一种 细胞分裂素。茉莉酮酸是一种天然存在的植物生长因子。
没有关于植物生长因子，包括赤霉酸、激动素、玉米素和茉莉酮 酸的人成纤维细胞增殖作用的现有技术。
于2001年1月16日授予Song等人的美国专利6,174,541描述了 与植物激素吲哚-3-乙酸(一种植物生长素)有关的改善的伤口愈合效 果，该专利引入本文以供参考。如本文所述，除了该参考文献，没有 任何其它关于植物生长激素应用与伤口愈合的关系的人细胞研究报 道。
发明概述
已经发现，一些植物生长因子显著提高细胞增殖，因此可用于治 疗其中提高细胞生长将对其有益的病症或疾病。在一个方面，本发明 提供了细胞增殖组合物，其中包含治疗有效量的选自下列的植物生长 因子：赤霉酸、激动素、玉米素和茉莉酮酸及其衍生物。在一个实施 方案中，植物生长因子以约0.0001％-约90％(重量)的量存在于组合 物中。在另一个实施方案中，植物生长因子以约0.01％-5％(重量)的 量存在于组合物中。在另一个实施方案中，细胞增殖组合物可包含一 种或多种可药用载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗伤口的组合物，其 中包含(i)有效量的选自下列的植物生长因子：赤霉酸、激动素、玉 米素和茉莉酮酸及其衍生物；和(ii)可药用载体。在一个方面，植 物生长因子以约0.0001％-约90％(重量)的量存在于组合物中。在另 一个实施方案中，植物生长因子以约0.01％-5％(重量)的量存在于组 合物中。在另一个方面，植物生长因子以足以将成纤维细胞生长提高 至少2％的量存在。在一个实施方案中，药物载体选自软膏剂载体、乳 膏剂载体、凝胶剂载体、泡沫剂载体、喷雾剂载体、油膏剂载体、膜 剂载体和织物。在另一个实施方案中，组合物是半固体材料，并包括 选自下列的基质：烃类基质、吸收基质、水可除去的基质和水溶性基 质。在另一个实施方案中，组合物可包含一种或多种选自下列的活性 剂：软化剂、抗感染剂、防腐剂、pH调节剂、机械保护剂、化学保护 剂、吸附剂和湿润剂。
在另一个方面，本发明提供了治疗伤口、提高细胞增殖和促进健 康皮肤发育的方法，包括给包含成纤维细胞的组织施加一种本文所描 述的药物组合物和/或用一种本文所描述的药物组合物治疗包含成纤 维细胞的组织的步骤。
附图简述
附图1是表明赤霉酸对细胞增殖影响的条形图。
附图2是表明激动素对细胞增殖影响的条形图。
附图3是表明玉米素对细胞增殖影响的条形图。
附图4是表明茉莉酮酸对细胞增殖影响的条形图。
发明详述
下面详细描述本发明的实施方案，在本文中将讨论其各个具体实 施例。提供每个实施方案都是为了解释本发明，而不是限制本发明。 例如，作为一个实施方案的一部分举例说明或描述的特征可以与另一 实施方案一起使用以产生另外的实施方案。本发明包括在本发明实质 内的这些和其它变型和改变。此外，在公开内容中提供了涉及本发明 的多个理论或机理。然而，本发明人不希望限制于这些理论或机理， 提供这些理论或机理仅是为了更好地理解本发明，而不是为了限制权 利要求的有效范围。此外，本文所用术语“包含”是包括式或开放式 的，并不排除另外的未述及的成分、组分或方法步骤。因此，术语“包 含”包括限制性更强的术语“基本上由……组成”和“由……组成”。
如上所述，已发现一些植物生长因子对于哺乳动物细胞有细胞增 殖作用，特别是对结缔组织细胞例如成纤维细胞的增殖有促进作用。 理想地，欲用本发明治疗组合物和方法治疗的细胞和病症是哺乳动物 的细胞和病症。哺乳动物包括各个种类和科的动物，包括但不限于灵 长类动物、牛类动物、犬类动物、马类动物、猫类动物等。哺乳动物 的具体实例包括人、一些农业动物(例如牛、马、猪等)、一些实验 室动物(例如小鼠、大鼠、兔子等)、多种宠物和动物园动物(例如 狗、猫、猴子等)。
相信本文所描述的组合物和方法通常适于治疗需要细胞增殖的病 症。作为非限制性实例，在伤口的治疗中，提高成纤维细胞增殖将非 常有益。作为另一实例，在皮肤的治疗中，提高成纤维细胞增殖将通 过改善细胞外基质，并由此使皮肤绷紧和/或增强而非常有益。更特别 是，已知胶原—主要基质皮肤蛋白赋予皮肤抗拉强度。据表明，胶原 随着年龄的增长和UV暴露而显著减少。这些蛋白结构的降解或破坏降 低皮肤的抗拉强度，从而引起皱纹和松弛。涉及人被试者的很多研究 表明，I型胶原随着光损害严重程度的增加而减少。参见例如 A.Kligman，Early Destructive Effect Of Sunlight On Human Skin，JAMA，210，2377-2380(1969)；R.Lavker，Structural Alterations In Exposed And Unexposed Aged Skin，Journal of Inv.Derm.73，59-66(1979)；J.Smith等人，Journal of Investigative Dermatology，39，347-350(1962)；和S.Shuster 等人，The Influence of Age And Sex On Skin Thickness，Skin Collagen And Density，British Journal of Dermatology， 93，639-643(1975)。此外，已有人报道了在皱纹组织学与暴露于日 光的皮肤中的胶原水平下降之间的某种程度联系。参见例如S.Chen等 人，Effects of all-Trans Retinoic Acid on UVB-Irradiated and Non-Irradiated Hairless Mouse Skin，Journal of Investigative Dermatology 98，248-254(1992)。还有人报道了通过局部治疗来恢 复光损害的人皮肤中的I型胶原。参见例如C.Griffiths，等人， Restoration of Collagen Formation in Photodamaged Human Skin by Tretinoin(Retinoic Acid).The New England Journal of Medicine，329，530-535(1993)。因此，由于能够增加成纤维细胞 的数目，相信本发明细胞增殖组合物和方法还将有益于修复和/或预防 与暴露于要素以及由于时间自身的衰老有关的皮肤组织损害。
如上所述，本发明还提供了用于治疗伤口的方法和治疗有效组合 物。伤口可以是外部伤口或内部伤口，并且本文所用术语“伤口”包 括被切开、撕裂、穿孔、擦破、烧伤或降解的组织。较大的伤口种类 有急性伤口、慢性伤口、小切伤和烧伤。本文所用术语“急性伤口” 是指，皮肤作为创伤性擦伤、撕裂或浅层损害的结果而被损伤，并且 通过伤口愈合的标准阶段(止血、发炎、增殖和重建)自动愈合而没 有并发症。
本文所用术语“慢性伤口”是指，由于经历病理过程例如血管机 能不全而使得身体的自然愈合过程被延迟。与急性伤口不同，在慢性 伤口中没有形成血块，并且它们通常在愈合能力较差的受伤害患者中 发生。
作为具体实例，本发明治疗组合物和方法可用于促进皮肤和/或皮 下组织中的伤口愈合，以及在损害的器官中让组织再生。表皮、真皮 和下面的皮下组织以及器官经受多种伤口，可使用本发明治疗组合物 和方法来提高在任一或所有这些组织中的愈合。此外，可使用本发明 治疗组合物和方法来促进健康皮肤发育。
增强的成纤维细胞、内皮细胞和/或角质形成细胞的增殖将提高生 成胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖所必需的纤连蛋白以及其它蛋白组分的 可用性。此外，应当注意，不仅在皮肤中，而且在其它组织例如肺、 骨、滑膜、眼睛、腱、软骨和龈中，胶原是结缔组织基质的主要组分。 在这方面，在成纤维细胞增殖与组织愈合之间高度相关。
因此，虽然通常是在伤口愈合和/或皮肤和皮下组织的一般加强方 面描述本发明，但是可以预计，在其它细胞和组织，特别是含有成纤 维细胞和/或胶原的细胞和组织中也可获得相当的细胞增殖有益效 果。所以相信本发明治疗组合物和方法可用于治疗任何创伤或降解的 身体组织，其中提高成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞或类似细 胞生长将有益于或改善组织愈合和/或保持。
植物生长因子
如上所述，本发明涉及使用包含一些植物生长因子的治疗有效组 合物和方法来提高细胞增殖和由此治疗和/或预防多种病症。植物产生 通常称为生长因子的多种物质，例如激素、茉莉酮酸酯、油菜素类固 醇、水杨酸盐、系统素和多胺。
有5种主要的植物激素类型：植物生长素、赤霉素、细胞分裂素、 乙烯和脱落酸。上文已描述过每一这些植物激素在植物生长中的作 用。与本发明有关的3种植物激素是赤霉酸(一种赤霉素)、激动素 (一种细胞分裂素)和玉米素(一种细胞分裂素)。其它植物生长因 子类型包括茉莉酮酸酯、油菜素类固醇、水杨酸盐、系统素和多胺。
赤霉酸具有以下分子式：C19H22O6。激动素具有以下分子式： C10H9N5O。玉米素具有以下分子式：C10H13N5O。如上所述，茉莉酮酸是一 种天然植物生长因子，其具有以下分子式：C12H18O3。茉莉酮酸参与植 物伤口反应和防御机制。
已经发现，一些植物生长因子可用于提高哺乳动物细胞增殖。在 一个具体实施方案中，以治疗有效量使用植物生长因子来改善组织例 如皮肤组织、其它组织中的愈合，和改善皮肤。本文所用的“有效量” 或“治疗有效量”是指足以提高细胞增殖的量。在这方面，提高的细 胞增殖是相对于类似组织，即在年龄、性质或损害程度等方面类似的 组织的正常细胞生长速度而言的。在一个具体实施方案中，用其量足 以将细胞生长速度提高1％以上的一种或多种上述植物生长因子治疗所 需组织和/或细胞。在一个具体实施方案中，用一种或多种上述植物生 长因子治疗皮肤、皮下和/或其它组织，其中植物生长因子的量足以将 成纤维细胞生长速度提高至少2％，更可取地，植物生长因子的量足以 将成纤维细胞生长速度提高至少约5％，甚至更可取地，植物生长因子 的量足以将成纤维细胞生长速度提高至少约10％。
药物制剂和组合物
可通过多种方法施用本发明治疗有效组合物，包括全身给药、口 服给药、局部给药、静脉内给药、肌内给药、经皮给药、经鼻给药、 经粘膜给药、直肠给药和/或局部给药。可将本发明治疗有效组合物贮 存以备以后使用，或者在可药用载体内以有效量配制以制备多种药物 组合物。可药用载体的实例有药物用具、局部给药用运载体(非口服 和口服)、可摄取的运载体等。此外，可用本领域技术人员熟知的生 产技术和方法制备本发明药物组合物。
药物用具的实例有缝线、医用钉、纱布、绷带、烧伤敷料、人造 皮肤、脂质体或微团制剂、微囊、用于浸渍纱布敷料的含水制品等。 此外，可摄取组合物预期可采用可摄取或可部分摄取的运载体例如糖 填充剂，包括硬和软的运载体例如片剂、悬浮液、咀嚼糖果或口香糖、 锭剂等。
局部给药用组合物可使用一种或多种载体或运载体，例如乳膏剂 载体、凝胶剂载体、泡沫剂载体、软膏剂载体、喷雾剂载体、油膏剂 载体、生物粘合剂、膜剂载体、织物等，它们欲施用于皮肤或体腔。 还可以调整局部给药用组合物，以使其适于用作经口施用，但是不摄 取的口服运载体，例如漱口剂、洗口剂、口腔喷雾剂、悬浮液和牙凝 胶。局部给药用软膏剂和其它半固体组合物通常采用一种或多种基质 作为药物递送运载体。基质的实例包括但不限于烃类基质(例如白凡 士林、白软膏、植物油、动物脂肪等)、吸收基质(例如亲水性凡士 林、无水羊毛脂、羊毛脂、冷乳膏等)、水可除去的基质(例如亲水 性软膏USP、乙氧基化脂肪醇醚、乙氧基化羊毛脂衍生物、脱水山梨醇 脂肪酸酯等)和水溶性基质(例如聚乙二醇软膏等)。作为其另外的 具体实例，美国专利6,046,160中描述了据信适用于本发明的局部给 药用组合物，该专利全文引入本文以供参考。
本发明药物组合物中可任选包含有效量的多种常规组分。作为非 限制性实例，药物组合物可包含一种或多种下列物质：填充剂、稀释 剂、清洁剂、缓冲剂、防腐剂、pH和毒性调节剂、机械保护剂、化学 保护剂、吸附剂、抗氧化剂、粘度调节剂、增量剂、赋形剂、收敛剂、 软化剂、缓和剂、湿润剂、乳化剂、经皮递送促进剂、控释剂、染料 或着色剂、稳定剂、润滑剂等。本领域技术人员已知的这些和其它常 规药物添加剂可根据递送运载体的性质用于本发明药物组合物中。
本领域技术人员无需过多实验即可容易地确定组合物内另外的组 分的量，并且其量将根据运载体(例如凝胶剂载体与喷雾剂载体)的 性质、所治疗的伤口、治疗频率等而变化。因此，可改变治疗伤口愈 合组合物的量以在最终的产品中获得所需结果，并且这样的改变在本 领域技术人员的能力内而无需过多实验。在一个具体实施方案中，本 发明药物组合物可包括含有一种或多种植物生长因子的药物组合物， 其中所述植物生长因子的含量为该药物组合物重量的90％以下，在另一 个实施方案中，所述植物生长因子的含量为该药物组合物重量的约20％ 以下。在另一个实施方案中，药物组合物可含有一种或多种上述植物 生长因子，其中所述植物生长因子的含量为该药物组合物重量的约 0.0001％-约90％。在另一个实施方案中，药物组合物可含有一种或多 种上述植物生长因子，其中所述植物生长因子的含量为该药物组合物 重量的约0.01％-约5％。
实施例
使用不含血清的培养基作为对照，在96-孔测定系统中测定植物生 长因子对人皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，标 准人真皮成纤维细胞，新生的，Catalog No.CC-2509)的增殖反应。
实施例1
制备赤霉酸(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri) 在水中的贮备液(0.001M)，然后用不含血清的Dulbecco改进的Eagle 培养基(DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)稀释 成10-5(“GA2”)和10-6(“GA1”)M溶液。将细胞以每100微升含 有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri) 的DMEM中3×103个细胞的浓度接种到96-孔板中。将96-孔板在湿润 的5％CO2气氛下于37℃培养24小时。培养后，抽吸出培养基，将孔用 100微升不含血清的DMEM冲洗2次。抽吸出最终的冲洗液，将100微 升10-5和10-6M各溶液加到10个孔中。此外，将100微升运载体(不 含血清的DMEM)加到10个孔中以作为对照。将所有孔在湿润的5％CO2 气氛下于37℃培养28小时。培养后，将20微升Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent(Promega，Corp.，Madison，Wisconsin) 加到所有孔中。将96-孔板轻微涡旋，在培养器中放置45分钟，读取 在490nm的分光光度吸收度。
使用单向ANOVA进行统计学分析。在对照与赤霉酸之间观察到了 统计学显著差异。根据显著统计学差异，赤霉酸显得是良好的细胞增 殖剂(附图1)。
实施例2    
使用该公司提供的激动素(Spectrum Chemical，CA)1mg/ml 水溶液作为贮备液。用不含血清的Dulbecco改进的Eagle培养基 (DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)将贮备液进 一步稀释成10-5(“K2”)和10-6(“K1”)M溶液。将细胞以每100 微升含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis， Missouri)的DMEM中3×103个细胞的浓度接种到96-孔板中。将96- 孔板在湿润的5％CO2气氛下于37℃培养24小时。培养后，抽吸出培养 基，将孔用100微升不含血清的DMEM冲洗2次。抽吸出最终的冲洗液， 将100微升10-5和10-6M各溶液加到10个孔中。此外，将100微升运 载体(不含血清的DMEM)加到10个孔中以作为对照。将所有孔在湿润 的5％CO2气氛下于37，培养28小时。培养后，将20微升Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent(Promega，Corp.，Madison， Wisconsin)加到所有孔中。将96-孔板轻微涡旋，在培养器中放置45 分钟，读取在490nm的分光光度吸收度。
使用单向ANOVA进行统计学分析。在对照与激动素之间观察到了 统计学显著差异。根据显著统计学差异，激动素显得是良好的细胞增 殖剂(附图2)。
实施例3
制备反式-玉米素HCl(Sigma Chemical Company，St.Louis， Missouri)在水中的贮备液(0.001M)，然后用不含血清的Dulbecco 改进的Eagle培养基(DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis， Missouri)稀释成10-4(“Z3”)、10-5(“Z2”)和10-5(“Z1”) M溶液。将细胞以每100微升含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)的DMEM中2×103个细胞的浓度接种到 96-孔板中。将96-孔板在湿润的5％CO2气氛下于37℃培养24小时。 培养后，抽吸出培养基，将孔用100微升不含血清的DMEM冲洗2次。 抽吸出最终的冲洗液，将100微升10-4-10-6M各溶液加到20个孔中。 此外，将100微升运载体(不含血清的DMEM)加到10个孔中以作为 对照。将所有孔在湿润的5％CO2气氛下于37℃培养28小时。培养后， 将20微升Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent(Promega， Corp.，Madison，Wisconsin)加到所有孔中。将96-孔板轻微涡旋， 在培养器中放置45分钟，读取在490nm的分光光度吸收度。
使用单向ANOVA进行统计学分析。在对照与反式-玉米素之间观察 到了统计学显著差异。根据显著统计学差异，玉米素显得是良好的细 胞增殖剂(附图3)。
实施例4
制备茉莉酮酸(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri) 在乙醇中的贮备液(0.238M)，然后用不含血清的Dulbecco改进的 Eagle培养基(DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri) 稀释成10-4(“JA3”)、10-5(“JA2”)和10-6(“JA1”)M溶液。 将细胞以每100微升含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.， St.Louis，Missouri)的DMEM中2×103个细胞的浓度接种到96-孔 板中。将96-孔板在湿润的5％CO2气氛下于37℃培养24小时。培养 后，抽吸出培养基，将孔用100微升不含血清的DMEM冲洗2次。抽吸 出最终的冲洗液，将100微升10-4-10-6M各溶液加到20个孔中。此外， 将100微升运载体(不含血清的DMEM)加到10个孔中以作为对照。 将所有孔在湿润的5％CO2气氛下于37℃培养28小时。培养后，将20 微升Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent(Promega， Corp.，Madison，Wisconsin)加到所有孔中。将96-孔板轻微涡旋， 在培养器中放置45分钟，读取在490nm的分光光度吸收度。
使用单向ANOVA进行统计学分析。在对照与茉莉酮酸之间观察到 了统计学显著差异。根据显著统计学差异，茉莉酮酸显得是良好的细 胞增殖剂(附图4)。
可以以类似方法测定其它细胞系的细胞生长速度。然而，本领域 技术人员应当理解，试验的各方面应当根据所评估的具体细胞系来改 变。