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含有多聚乙酰的提取物,分馏物和混合物及它们的应用

阅读:711发布:2021-05-18

专利汇可以提供含有多聚乙酰的提取物,分馏物和混合物及它们的应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及多聚乙酰,由番荔枝衍生的标准化为具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团的多聚乙酰的提取物/ 分馏 物或它们的混合物,其用于 预防 、 治疗 、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它 生物 标记介导的 炎症 和/或免疫相关的 疾病 。本发明还涉及用于预防、治疗、抑制或控制 代谢性疾病 /障碍的番荔枝衍生的多聚乙酰,提取物/分馏物或它们的混合物。,下面是含有多聚乙酰的提取物,分馏物和混合物及它们的应用专利的具体信息内容。

1.一种由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物/分馏物,所述的多聚乙酰具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团,其特征在于所述的提取物/分馏物用于预防治疗、抑制或控制一种或多种由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病
2.一种中草药混合物,其含有至少一种组分,该组分选自由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物,所述的多聚乙酰具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团;
其还含有至少另一种组分,该组分选自植物/动物/微生物衍生的生物活性组分;药用或食用活性组分,维生素,基酸,矿产品;药用或食用赋形剂,载色剂,载体和稀释剂或它们的混合物,该中草药混合物用于预防、治疗、抑制或控制一种或多种由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
3.如权利要求1或2所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的炎症疾病包括关节炎,哮喘,动脉粥样硬化,血管内皮功能障碍,过敏性鼻炎,皮炎,皮癣,囊肿性纤维化,炎性肠道疾病,间质性膀胱炎,偏头痛,疼痛,心绞痛,慢性前列腺炎,阳光灼伤,牙周疾病,多发性硬化症,系统性红斑狼疮,葡萄膜炎,后血管成形术再狭窄,肾小球肾炎,胃肠道过敏,肾炎,结膜炎,慢性阻塞性疾病,职业性哮喘,湿疹,支气管炎,花粉症,荨麻疹,过敏性疾病,如气喘、呼吸困难,非排痰性咳嗽,胸闷,颈部肌肉紧张,胸痛,关节痛及其它各种动物体相关的疾病。
4.如权利要求3所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的关节炎包括类湿(如软组织风湿病和非关节性风湿病,肌痛,纤维织炎,肌肉风湿,肌筋膜痛,肱骨外上髁炎,肩周炎,泰齐氏综合征,筋膜炎,肌炎,腱鞘炎,滑囊炎),幼年型慢性关节炎,关节紊乱,强直性脊柱炎(强直性脊柱炎),骨关节炎,高尿酸血症和急性痛风,慢性痛风,系统性红斑狼疮相关的关节炎和退行性关节炎。
5.如权利要求1所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或者如权利要求2所述的混合物,其特征在于其用于调节一种或多种细胞因子/趋化因子或生物标记的表达/产物,所述的细胞因子/趋化因子或生物标记与炎症或免疫紊乱相关。
6.如权利要求5所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的与炎症或免疫紊乱相关的细胞因子/趋化因子包括TNFα, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-13, MCP-1, 调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子,嗜酸粒细胞亲合素, ICAM和VCAM。
7.如权利要求5所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的与炎症或免疫紊乱相关的生物标记包括aP2, FLAP, CRP, CD36, 5-脂合酶和MMPs。
8.一种由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物/分馏物,所述的多聚乙酰具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团,其特征在于所述的提取物/分馏物用于预防、治疗、抑制或控制一种或多种代谢疾病/紊乱。
9.一种中草药混合物,其含有至少一种组分,该组分选自由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物,所述的多聚乙酰具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团;
其还含有至少另一种组分,该组分选自植物/动物/微生物衍生的生物活性组分;药用或食用活性组分,维生素,氨基酸,矿产品;药用或食用赋形剂,载色剂,载体和稀释剂或它们的混合物,该中草药混合物用于预防、治疗、抑制或控制一种或多种代谢疾病/紊乱。
10.如权利要求8所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或者如权利要求9所
述的混合物,其特征在于所述的代谢疾病/紊乱包括肥胖,超重,糖尿病,动脉粥样硬化,动脉硬化,心血管疾病高血压,高胆固醇血症,高脂血症,高甘油三酯血症,代谢综合症,血管内皮功能障碍,胰岛素阻抗,胰岛素敏感性增强,高胰岛素血症,高血脂,低高密度脂蛋白胆固醇,脂蛋白异常,甘油三酯降低,尿酸平升高,脂肪肝,非酒精性脂肪肝疾病,多囊卵巢综合征,血色病(超载),黑棘皮病(皮肤上的暗斑),糖耐量减低(IGT)和空腹血糖受损(IFG)。
11.如权利要求8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于其用于调节一种或多种与代谢疾病或紊乱相关的生物标记的表达/产物。
12.如权利要求11所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的与代谢疾病或紊乱相关的生物标记包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),脂肪分化相关蛋白(ADRP),CCAAT /增强子结合蛋白α(CEBPα),CCAAT /增强子结合蛋白β(CEBPβ ),脂肪细胞CD36,巨噬细胞CD36,单核细胞趋化蛋白(MCP-1),氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL),脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白(aP2/FABP4/A-FABP),β-3肾上腺素受体(β3AR),围脂滴蛋白,脂联素,蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)。
13.如权利要求1、2、8或9所述的具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团的多
聚乙酰,其特征在于包括多鳞番荔枝辛 C (1)、异多鳞番荔枝辛(LI12132; 2)、戴俄婆萨德林 (LI12109; 4)、多鳞番荔枝斯坦定 D (LI12106; 5)、多鳞番荔枝辛 L (LI12107; 6)、多鳞番荔枝辛 J (LI12111; 7)、多鳞番荔枝辛 G (LI12105; 10)和10-氢氧巴婆(双呋)内酯 (LI12110; 11);被分离并充分描述的化合物包括化合物LI12104 (3), 化合物LI12114 (8), 化合物LI12115 (9),化合物LI12112, 化合物LI12113, 化合物LI12116和化合物LI12117。
14.如权利要求1、2、8或9所述的由番荔枝衍生的提取物和分馏物,其特征在于具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团的多聚乙酰的质量浓度为0.01%-30%。
15.如权利要求1、2、8或9所述的由番荔枝衍生的提取物和分馏物,其特征在于具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团的多聚乙酰的质量浓度为0.1%-10%。
16.如权利要求2或9所述的混合物,其特征在于番荔枝衍生的组分在混合物中所占的质量百分比为0.01%-99.9%。
17.如权利要求2或9所述的混合物,其特征在于番荔枝衍生的组分在混合物中所占的质量百分比为0.1%-50%。
18.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物和分馏物,其特征在于其是由番荔枝的植物部分衍生的,所述的植物部分选自叶,果实,种,花,茎,树皮,根,硬木或它们的混合物,优选叶。
19.如权利要求1、2、8或9所述的由番荔枝衍生的提取物,其特征在于提取的媒介包括的溶剂选自正己烷,石油醚,乙醚,二氯甲烷,氯仿,乙酸乙酯,丙,乙腈,甲醇,乙醇,异丙醇,正丁醇,异丙醇,甲基异丁基酮,水或其混合物。
20.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物和分馏物,其特征在于所述的分馏物是利用至少一种分离技术获得的,所述的分离技术选自分离,沉淀,结晶,正相色谱,反相色谱,体积排阻色谱和离子交换层析或它们的组合。
21.如权利要求2或9所述的混合物,其特征在于所述的生物活性组分选自具有任意健康益处的提取物/分馏物/活性化合物或植物化学素,所述的任意健康益处选自消炎活性,抗关节炎活性,抗糖尿病活性,抗高血糖活性,降血脂活性,抗肥胖活性,抗高血压活性,抗血小板聚集活性,抗感染活性,抗动脉粥样硬化活性,抗氧化剂和生物强化活性。
22.如权利要求21所述的混合物,其特征在于所述的生物活性组分选自氨基葡萄糖,氨基葡萄糖盐,软骨素,二甲基砜(MSM),透明质酸,胶原蛋白,聚多糖,壳聚糖,未变性胶原蛋白II型,SAM- e,ω-3,NEM,槲皮素,,锰,抗坏血酸,黄酮类,生物,植物甾醇,萜烯,ω-3脂肪酸;南非醉茄, 绒毛戴星草,齿叶乳香树,姜黄,番石榴,松树皮,胡椒或荜茇衍生的提取物或分馏物。
23.如权利要求2或9所述的混合物,其特征在于所述的药用或食用赋形剂,载色剂,稀释剂和载体包括表面活性剂粘合剂,分解剂,润滑剂防腐剂,稳定剂,缓冲液,悬浮液及药物释放系统。
24.如权利要求23所述的混合物,其特征在于所述的药用或食用赋形剂,载体,载色剂和稀释剂包括葡萄糖,果糖,蔗糖,麦芽糖,乳糖,黄糊精,白糊精,二氧化,微晶纤维素粉末,硬脂酸钙,硬脂酸镁,山梨糖醇,甜菊糖甙,玉米糖浆,柠檬酸酒石酸,苹果酸,琥珀酸,乳酸, L-抗坏血酸,DL-a-生育酚,甘油,丙二醇,甘油脂肪酸酯,聚甘油脂肪酸酯,蔗糖脂肪酸酯,失水山梨醇脂肪酸酯,丙二醇脂肪酸酯,洋槐,卡拉胶,酪蛋白,明胶,果胶,琼脂,烟酰胺,泛酸钙,钙盐,色素,香料,防腐剂,蒸馏水,生理盐水,葡萄糖水溶液,乙醇,丙二醇,聚乙二醇,各种动物和植物油,白软石蜡,石蜡和蜡。
25.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物被制成口服制剂,如片剂,软胶囊,硬胶囊,软胶囊剂,丸剂,颗粒剂 ,粉剂,乳剂,悬浮剂,糖浆,颗粒,食品,饮料,浓缩丸,滴丸等;及肠胃外制剂,如注射剂,静脉滴注剂等;栓剂;和透皮制剂,如膏药,外用药膏和凝胶;眼科制剂;鼻剂;和食品或饮料。
26.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物是口服,局部,肠胃外注入,眼用到或吸入到需要的人体或哺乳动物体或温血动物体中。
27.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物和分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物是每天给药一次或多次。
28.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物是以控释片的形式给药,利用包括纳米技术,微胶囊,胶体载体系统和其他药物释放系统的技术来使用控释聚合物底物涂层。
29.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物和分馏物或它们的混合物,其特征在于所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物是形成或添加到现有或新的食品和饮料中作为温血动物的一种健康食品。
30.一种预防,治疗,抑制或控制一种或多种炎症和/或免疫相关疾病/紊乱的方法,所述的炎症和/或免疫相关疾病/紊乱包括类风湿(如软组织风湿病和非关节性风湿病,肌痛,纤维织炎,肌肉风湿,肌筋膜痛,肱骨外上髁炎,肩周炎,泰齐氏综合征,筋膜炎,肌腱炎,腱鞘炎,滑囊炎),幼年型慢性关节炎,关节紊乱,强直性脊柱炎(强直性脊柱炎),骨关节炎,高尿酸血症和急性痛风,慢性痛风,系统性红斑狼疮相关的关节炎和退行性关节炎,哮喘,动脉粥样硬化,血管内皮功能障碍,过敏性鼻炎,皮炎,牛皮癣,囊肿性纤维化,炎性肠道疾病,间质性膀胱炎,偏头痛,疼痛,心绞痛,慢性前列腺炎,阳光灼伤,牙周疾病,多发性硬化症,系统性红斑狼疮,葡萄膜炎,后血管成形术后再狭窄,肾小球肾炎,胃肠道过敏,肾炎,结膜炎,慢性阻塞性肺疾病,职业性哮喘,湿疹,支气管炎,花粉症,荨麻疹,过敏性疾病,如气喘、呼吸困难,非排痰性咳嗽,胸闷,颈部肌肉紧张,心跳过速,胸痛,关节痛及其它各种哺乳动物或温血动物相关的疾病,其特征在于所述的方法包括向所述的哺乳动物体或温血动物体中以一个有效剂量补充如权利要求1或2所述的标准化为多聚乙酰的一种提取物或分馏物或它们的混合物。
31.一种在一人体或哺乳动物体或温血动物体中调节至少一种细胞因子/趋化因子
或一种生物标记的表达或产物的方法,所述的细胞因子/趋化因子或生物标记包括TNFα, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-13, MCP-1, aP2,调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子,嗜酸粒细胞亲合素, FLAP, ICAM, VCAM 和MMPs,其特征在于所述的方法包括向所述的人体或哺乳动物体或温血动物体中以一个有效剂量补充如权利要求1或2所述的一种标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物。
32.一种预防,控制和/或治疗所需哺乳动物或温血动物中一种或多种代谢疾病或紊乱的方法,所述的代谢疾病或紊乱选自肥胖,超重,糖尿病,动脉粥样硬化,动脉硬化,心血管疾病,高血压,高胆固醇血症,高脂血症,高甘油三酯血症,代谢综合症,血管内皮功能障碍,胰岛素阻抗,胰岛素敏感性增强,高胰岛素血症,高血脂,低高密度脂蛋白胆固醇,脂蛋白异常,甘油三酯降低,尿酸水平升高,脂肪肝,非酒精性脂肪肝疾病,多囊卵巢综合征,血色病(铁超载),黑棘皮病(皮肤上的暗斑),糖耐量减低(IGT)和空腹血糖受损(IFG),其特征在于所述的方法包括向所述的哺乳动物体或温血动物体中以一个有效剂量补充如权利要求8或9所述的标准化为多聚乙酰的一种提取物或分馏物或它们的混合物。
33.一种在一人体或哺乳动物体或温血动物体中调节至少一种生物标记的表达或产物的方法,所述的生物标记选自PPAR-γ, C-反应蛋白(CRP), 脂肪分化相关蛋白(ADRP),CCAAT /增强子结合蛋白α(CEBPα),CCAAT /增强子结合蛋白β(CEBPβ ),脂肪细胞CD36,巨噬细胞CD36,单核细胞趋化蛋白(MCP-1),氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL),脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白(aP2/FABP4/A-FABP),β-3肾上腺素受体(β3AR),围脂滴蛋白,脂联素,蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13),其特征在于所述的方法包括向所述的人体或哺乳动物体或温血动物体中以一个有效剂量补充如权利要求8或9所述的标准化为多聚乙酰的一种提取物或分馏物或它们的混合物。
34.一种在哺乳动物体中抑制脂肪生成和/或加速脂解的方法,其特征在于所述的方法包括向所述的哺乳动物体中以一个有效剂量补充如权利要求8或9所述的标准化为多聚乙酰的一种提取物或分馏物或它们的混合物。
35.如权利要求1、2、8或9所述的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,其特征在于将其用作一种药品/膳食补充剂/食品配料。
36.如权利要求1所述的标准化为具有末端a,b-不饱和-g-甲基-g-内酯基团的多聚
乙酰的提取物或分馏物或者如权利要求2所述的混合物,其特征在于所述的多聚乙酰还包括至少一种功能基团,该功能基团选自四氢呋喃基,环氧基,羟氢氧基,烯键(双键)基团。

说明书全文

含有多聚乙酰的提取物,分馏物和混合物及它们的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及多聚乙酰,由番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物/分馏物,其用于预防治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它诊断/生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。本发明还涉及用于预防、治疗、抑制或控制代谢性疾病/障碍的多聚乙酰标准化提取物/分馏物。

背景技术

[0002] 番荔枝,也称为释迦,糖苹果或蕃荔枝,属于番荔枝科,原产热带美洲。番荔枝是一种灌木或小乔木,高达6米。释迦是一种有白浆的食用果,其含有许多黑色有光泽的种子。它通常被发现在落叶阔叶林,并且也正在印度的许多地方培养。其果肉可以鲜吃,也可以转换成果汁或奶昔。水果通常是生吃。由于广泛种植,因此其确切的原生地未知,但被认为是在加勒比地区;其物种被描述为来自牙买加。
[0003] 有些番荔枝的植物化学如下。从水蒸汽蒸馏法获得的精油可以鉴定番荔枝科树皮中的挥发性成分。GC/MS研究确定了六种主要的组分,分别是1H-环丙烯甘菊环(3.46%),吉玛烯D(11.44%),红没药烯(4.48%),石竹烯化物(29.38%),环氧红没药烯(3.64%)和考尔-16-烯(19.13%)。
[0004] 番荔枝种乙醇提取物中11种番荔枝科多聚乙酰化合物被分离和鉴定为多鳞番荔枝策林,安那特莫英-2(annotemoyin-2),瑞替卡雷腾-2(reticulatain-2),多鳞番荔枝辛-I,多鳞番荔枝辛-B,多鳞番荔枝辛,莫垂林,多鳞番荔枝斯坦定-D,多鳞番荔枝斯坦定-E,毛叶番荔枝素-1和毛叶番荔枝素-2。
[0005] 番荔枝多聚乙酰是一种属于有效类的天然化合物,它是从番荔枝科的植物中分离出来的。四氢呋喃多聚乙酰是其中突出的一种[Feras,Q.A.,et.al.,J.Nat.Prod.,1999,62:504-540]。据报道,这类化合物中的许多都表现出显著的生物活性。多聚乙酰是C35-C39化合物,通常包含两个长烃链,其中一个连接一个末端2,4-二取代-γ-多聚乙酰和数量不定的四氢呋喃(THF)环。所述的烃链包括一些含氧基,可以是羟基,乙酰氧基和/或。最近报道了含有双键的单环多聚乙酰,没有THF环的环氧化合物和没有环氧和THF环的化合物。这些化合物支持番荔枝多聚乙酰是聚酮化合物源的学说。
[0006] 番荔枝叶片被发现有蚊虫杀虫剂属性,并用于治疗昏睡病。粉碎后的种子被发现对果蝇和虱有杀虫特性。果肉含维生素C,对牙齿,骨骼,皮肤和肌肉有益。花已被用于治疗眼睛发炎。种子糊粉用于治疗头虱,并在癌症治疗中使用。树皮提取物用于治疗皮肤疾病,控制肠道蠕虫。根提取物用于治疗癌肿瘤。[A.C.de Q.Pinto,Field Manual for extension workers and farmers,Practical manual no.5,2006]
[0007] 番荔枝的一些药理学活性总结如下:
[0008] 从番荔枝种子中分离出的环多鳞番荔枝辛D显示出消炎活性,它能抑制前炎症细胞因子,脂多糖和Pam3Cys-激化的J774A.1巨噬细胞的产物。[Yang,Y.L.,et al.,J Agric Food Chem.2008,56:386-92.]。
[0009] 番荔枝种中分离出来的一些活性化合物显示出抗头虱效果。[JunyaIntaranongpai et al.,Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health,2006,37:pages]。
番荔枝根公知可以用于控制便秘。还有报道称番荔枝具有保肝活性[Mohamed Saleem TS et al.,International Journal of Applied Research in Natural Products,2008,1:
1-7.]。
[0010] 嗜中性粒细胞产生的活性氧粒子(ROS)和颗粒蛋白酶是炎症性疾病的发病机理。从番荔枝茎中分离出的一种对映-贝壳杉烷化合物16-β,17-二羟-对映-贝壳杉烷-19-酸表现出强效的白细胞的免疫调节作用和消炎活性,它能抑制超氧阴离子自由基的生成,ROS的形成,甲酸-L-甲二磺酰基-L-亮酰-L-苯丙氨酸(FMLP)-激活的人体中性粒细胞中弹性蛋白酶的释放。
[0011] 在另一个研究中,番荔枝中分离出来的石竹烯氧化物在12.5和25mg/kg体重的剂量下表现出显著的中心及边缘止痛活性,以及消炎活性。[Chavan,M.J.,et al.,Phytomedicine.2009]。
[0012] 之前的印度专利申请2756/DEL/2006已经报道了番荔枝的消炎活性。该申请公开了一种方法来制备一种番荔枝提取物,包括16-十八羟-9(Z or E),12(Z or E),14(Z or E)-三亚乙基四胺酸和13-羟-9Z-11E-15E-十八三亚乙基四胺酸,以及将其用于治疗癌症,糖尿病及相关并发症,包括炎症性疾病,如滋病,哮喘,关节炎,支气管炎,慢性阻塞性疾病(COPD),屑病,过敏性鼻炎,休克,过敏性皮炎,克罗恩病,成人呼吸窘迫综合症(ARDS),嗜酸性肉芽肿,过敏性结膜炎,关节炎或溃疡性结肠炎。三亚乙基四胺酸化合物被认为是形成这种活性的原因。
[0013] 中国专利申请CN1477102涉及具有抗糖尿病活性的糖苹果植物提取物,应用及制备方法。番荔枝植物的枝,叶,树干,树皮,根,种子和果皮中可以提取原料。多聚乙酰化合物可制成各种治疗糖尿病的剂型,其制备方法可以采用溶剂萃取法,树脂吸附法,超临界二氧化萃取工艺和常规干燥过程中的一种或多种。美国专利US6242483涉及分离出三种源自番荔枝皮的新型单四氢呋喃环多聚乙酰。这些化合物都在C-9位置上有一个羰基,并且都在四氢呋喃环的侧翼上有两个羟基。这些化合物对某些特定的人肿瘤细胞表现出选择性的杀伤活性。

发明内容

[0014] 本发明一个主要方面是提供了由番荔枝衍生的含有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰标准化提取物或分馏物,其用于预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0015] 本发明另一个主要方面是提供了番荔枝衍生的含有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰标准化提取物或分馏物中选出的至少一种组分与植物/动物/微生物衍生的生物活性组分;药用或食用活性组分,维生素,氨基酸,矿产品;药用或食用赋形剂,载色剂,载体和稀释剂或它们的混合物中选出的至少一种组分来预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它诊断/生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0016] 本发明另一方面提供了含有多聚乙酰化合物或混合物的番荔枝叶衍生的多聚乙酰化合物,提取物或分馏物用于预防、抑制或控制所需目标罹患的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0017] 本发明另一方面提供了含有多聚乙酰化合物或混合物的番荔枝叶衍生的多聚乙酰化合物,提取物或分馏物用于预防、抑制或控制所需目标罹患的代谢性障碍。
[0018] 本发明另一个主要方面中,含有多聚乙酰化合物或其混合物的番荔枝叶衍生的多聚乙酰化合物,提取物或分馏物可以用于调节/调整一个或多个细胞因子/趋化因子/生物标记的表达或产物,其中所述的细胞因子/趋化因子/生物标记选自TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、MCP-1、调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(Rantes)、嗜酸粒细胞亲合素(Eotaxin)、ICAM、VCAM、aP2、FLAP、CRP、CD36、5-脂氧合酶和MMPs。附图说明
[0019] 图I:图显示了导向分馏的生物鉴定来识别大多数活性化合物和活性片段的概述。
[0020] 图II:图中显示了番荔枝叶提取物中分离获得的多聚乙酰的化学结构。
[0021] 图III:图中显示了番荔枝叶中的乙酸乙酯提取物(LI12101,100mg/kg)和脱氢皮质醇(10mg/kg)对SD大鼠进行弗氏完全佐剂诱导爪子水肿后爪体积的柱形图。柱a、b和c分别表示经对照,LI12101和脱氢皮质醇处理后的组中的爪体积。每个柱是指平均±SD,**N=6. p<0.005(与对照对比)。
[0022] 图IV:图中显示了不同组中动物的血清TNFα浓度的柱形图。FCA检验14天后,用酶免疫检测试剂盒(R&D Systems,USA)定量地检测血清TNFα。柱a、b和c分别表示补充了对照、LI12101(100mg/kg)和脱氢皮质醇(10mg/kg)的组中细胞因子的水平。每个柱* **表示平均±SD,N=6.p<0.05和 p<0.005(与对照对比)。
[0023] 图V:图中显示了番荔枝叶中的甲醇提取物(LI12101,50mg/kg或100mg/kg体重)和脱氢皮质醇(10mg/kg)对SD大鼠进行弗氏完全佐剂诱导爪子水肿后爪子体积的柱形图。柱分别表示对照组,分别经50mg/kg体重的LI12101,100mg/kg体重的LI12101和脱氢皮质醇处理组中的爪子体积。每个柱表示平均±SD,N=6。
[0024] 图VI:图中显示了不同组中动物的血清TNFα浓度的柱形图。FCA检验14天后,用酶免疫检测试剂盒(R&D Systems,USA)定量地检测血清TNFα。柱分别表示补充了对照、LI12101(50mg/kg)、LI12101(100mg/kg)和脱氢皮质醇(10mg/kg)的组中细胞因子的水平。每个柱表示平均±SD,N=6.
[0025] 图VII:图中显示了番荔枝叶中的甲醇提取物(LI12100)对3T3-L1脂肪细胞中脂代谢标记和脂解过程进行的调节。所示的代表如PPARγ,ADRP,CEBPα,CEBPβ,aP2,CD36和围脂滴蛋白等各种标记蛋白的免疫印迹描绘下调。3T3-L1小鼠前成脂肪细胞有不同地不含有或含有10μg/ml或25μg/ml LI12100。空白对照培养基仅接受相似浓度的DMSO。在每一个印迹上评估肌动蛋白的表达作为内部对照。每个蛋白的表达进行光密度测量并利用肌动蛋白的表达进行规范化。任意单位中表达水平的对比如柱形图所示(侧面)。柱a、b和c分别表示用空白对照、10μg/mlLI12100和25μg/ml LI12100处理后的细胞产生的表达

具体实施方式

[0026] 炎症是血管组织对刺激,如病原体,受损细胞或过敏药物进入人体后产生的一种反应。它是人体的一种保护机制,用于清除有害的病原体或试剂,保护组织。促炎性细胞因子,如TNFα、IL-1β、IL-6、GM-CSF和CD4+、Th2集衍生的IL-4、IL-5和IL-13淋巴因子被认为是炎症疾病的免疫发病机理的关键因素。5-脂氧合酶在炎症过程中的关键一步,即白三烯合成花生四烯酸中是一种关键的酶。白三烯是炎症疾病的关键中介。
[0027] 5-脂氧合酶(5-LOX)的激活和基因表达反应了病情。5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)是一种18kDa整合膜蛋白,它通过与花生四烯酸进行特异性结合,将其转移给酶来激活5-脂氧合酶。因此FLAP负责产生白三烯。因此,阻断或下调5-LOX和FLAP是一种适用于治疗和/或控制炎症状态的有效治疗方法。
[0028] 肿瘤坏死因子-α(TNF)是一种重要的多效性炎性细胞因子。它提供多种功能,其表达和产物对大多数人体的器官具有效果。它主要由巨噬细胞产生。TNFα是一种急性期蛋白和趋化因子,它启动细胞因子的级联并增加血管通透性,从而将巨噬细胞和中性粒细胞吸引到感染位点。TNFα既有生长刺激特性又有生长抑制过程,它还显示出自我调节特性。TNFα的有益功能包括其用于对细菌、某些真菌、病毒和寄生虫的入侵进行免疫反应,并用于特定肿瘤的坏死。但是高水平的TNFα会有不利影响,它导致许多疾病条件的形成。高水平的TNFα会增加死亡的险。因此TNFα是一个重要的目标以开发新的对广泛炎症性疾病的治疗。
[0029] 动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,其特点是会于几十年期间内在内皮细胞功能障碍点上形成血管病变。炎症在动脉粥样硬化斑发展的许多阶段起着重要的作用。因此,确定具有新型消炎性能的化合物是针对动脉粥样硬化的一种最好策略。
[0030] 基质金属蛋白酶(MMPs)是锌依赖性内肽酶,它能打破所有种类的外细胞基质蛋白质,如胶原蛋白,这通常会在组织细胞之间的空隙中发现。MMPs主要分为三个主要群体,胶原酶形成的纤维细胞胶原酶-1(MMP-1),包括明胶酶A的明胶酶(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9),而基质降解酶包括基质降解酶-1(MMP-3)和基质溶解因子(MMP-7)。过量的基质金属蛋白酶会使生物分子,如胶原蛋白、蛋白多糖和明胶等发生降解,它会对表皮产生致命的后果,还会形成软骨病,炎症等疾病。
[0031] 这不断地增加各种炎症性疾病和代谢紊乱的患病率。这就与控制炎症性疾病和代谢性疾病的迫切需要相结合,世界各地的许多科学家已经优选关注这些领域的研究活动。这就形成了特殊的兴趣来寻找替代方案,尤其是那些基于植物源性的产品。植物衍生产品与合成来源的商业药物相比,被认为是天然而安全的。发明人已就此进行了详细的调查,涉及对几种植物提取物,分馏物及纯化合物进行几个在体外和体内实验,意外地发现番荔枝提取物(S)或活性分馏物或活性化合物或它们的混合物根据研究以一种有效治疗量向细胞给药,能在炎症和/或代谢/免疫功能紊乱的表达中有效地改善某些细胞因子/趋化因子/生物标记的水平。
[0032] 在说明书权利要求书中用于描述实施例的番荔枝提取物/分馏物的各种代码如下:
[0033] LI12100-番荔枝叶的甲醇提取物
[0034] LI12100A-番荔枝叶进行循序提取获得的己烷提取物
[0035] LI12100B-番荔枝叶进行循序提取获得的甲醇提取物
[0036] LI12100C-番荔枝叶的乙酸乙酯提取物
[0037] LI12100D-番荔枝叶的乙醇提取物
[0038] LI12100E-番荔枝叶的水醇提取物
[0039] LI12100F-分层法获得的番荔枝叶的乙酸乙酯提取物
[0040] LI12100G-番荔枝种的己烷提取物
[0041] LI12100H-番荔枝种的乙酸乙酯提取物
[0042] LI12100I-番荔枝叶甲醇提取物和水提取物的混合物
[0043] LI12100J-番荔枝叶和番荔枝种的甲醇提取物混合物
[0044] LI12101-分割番荔枝叶获得的乙酸乙酯提取物
[0045] LI189/159G+H-色谱分析番荔枝叶的甲醇提取物获得的一种活性分馏物(LI12100)。
[0046] 各种植物提取物通过在THP-1人单核细胞中对促炎性细胞因子TNFα的抑制潜进行了筛选。番荔枝提取物在提取物测试中令人意外地显示出最强效的TNFα抑制。番荔枝叶衍生的甲醇提取物(LI12100)在20.06ng/mL的半抑制浓度(IC50)时有效地抑制了TNFα。对番荔枝叶进行选择性处理获得的乙酸乙酯提取物(LI12101)也在8.34ng/mL的IC50)时显示出最强效的TNFα抑制。番荔枝叶的其它提取物(LI12100A to LI12100J)也显示出强效的TNFα抑制,如表1所示。
[0047] 番荔枝的甲醇提取物(LI12100)经过导向分离的生物鉴定,以确定该化合物是否引起TNFα抑制并产生活性改进的分馏物。LI12100经二氧化快速柱色谱分析,其中使用乙酸乙酯/正己烷混合物作为洗提液。用60%和80%乙酸乙酯/正己烷混合物和乙酸乙酯洗提后的分馏物显示出强效的活性。但是用乙酸乙酯洗提后的分馏物(LI189/159G+H)显示具有卓越的TNFα抑制(IC50 0.82ng/mL)。该活性分馏物再次经二氧化硅快速柱,使用丙酮/氯仿混合物进行进一步的纯化,然后将该活性分馏物经菲罗月神柱(Phenomenex Luna柱)(10μ,C18,250mm x 21.2),首先使用95∶5乙腈/水混合物,最后用90∶10乙腈/水混合物进行预HPLC纯化,获得一种纯化合物(LI12103),其IC50值为24.9pg/mL。1 13
通过其 H NMR,C NMR和质谱相关数据的决定性分析并将获得的值与文献中报道的值进行比较,出人意料地发现它的化学结构是一个多聚乙酰化合物,即多鳞番荔枝辛C(LI12103;
1)。一种小化合物在100pg/mL时具有63%TNFα抑制,其是从相同的分馏物中分离出来,其结构被识别为异多鳞番荔枝辛(LI12132;2)。所述的导向分离的生物鉴定如图I所示。
[0048] 通过选择性方法获得的叶的乙酸乙酯提取物(LI12101)也经过更详细的导向分离的生物鉴定和/或纯化分离,以确定其它多聚乙酰化合物是否形成抗TNFα活性,重复地使用快速柱色谱分析,过二氧化硅凝胶,使用有机溶剂混合物进行预HPLC纯化。这繁琐而费力的纯化过程产生近15种多聚乙酰化合物,包括末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团,其在烷链上至少具有一个功能团,该功能团选自一个或多个四氢呋喃基,一个或多个环氧基,一个或多个羟氢氧基,以及一个或多个烯键(双键)。所述的化合物包括多鳞番荔枝辛C(1)、异多鳞番荔枝辛(LI12132;2)、戴俄婆萨德林(dieposabadelin)(LI12109;4)、多鳞番荔枝斯坦定D(LI12106;5)、多鳞番荔枝辛L(LI12107;6)、多鳞番荔枝辛J(LI12111;7)、多鳞番荔枝辛G(LI12105;10)和10-氢氧巴婆(双呋)内酯(LI12110;11)。化合物LI12104(3)、化合物LI12114(8)、化合物LI12115(9)的结构暂定。那些公知化合物的结构和那些暂定的结构如图II所示。
[0049] 剩下的化合物,化合物LI12112、化合物LI12113、化合物LI12116和化合物LI12117在实施例13的实验部分公开的每个光谱信息证实是具有特有的末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯的番茄枝多聚乙酰,LI12112是一种具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯并在烷链上具有一个四氢呋喃基、三个羟氢氧基和一个双取代双键的多聚乙酰。其分子量(MW)为606质量单位。这种化合物的光谱信息总结如下:
[0050] LI12112:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.2Hz),5.36(2H,m),4.99(1H,qd,J=1.6,6.8Hz),3.87(4H,m),3.41(2H,m),2.36-2.24(4H,m),2.06-1.90(5H,m),1.68-1.50(8H,m),1.41(3H,d,J=6.8Hz),1.25(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);LCMS:
+
629(M+Na)+ve离子模式。
[0051] LI12113是一种多聚乙酰,其分子量(MW)为588质量单位,具有特有的末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯并在烷链上具有三个环氧基。这种化合物的光谱信息总结如下:
[0052] LI12113:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J=1.6Hz),4.99(1H,qd,J=1.6,6.8Hz),3.03-2.92(6H,m),2.26(2H,t,J=7.6Hz),2.04-1.95(2H,m),1.84(2H,m),
1.78(2H,m),1.66-1.47(10H,m),1.40(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);
13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.7,148.7,138.4,57.3,56.8,56.6,31.9,29.7,29.5,29.5,+
29.3,29.2,27.8,27.4,26.6,25.3,25.2,25.2,22.6,19.2,14.1;LCMS:611(M+Na)+ve离子模式。
[0053] LI12116(MW 604)是一种具有特有的末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯并在烷链上具有二个环氧基和一个羟氢氧基的多聚乙酰。这种化合物的光谱信息总结如下:
[0054] LI12116:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,s),4.99(1H,qd,J=6.4,1.6Hz),4.29(1H,m)2.98(4H,m),2.27(2H,t,J=8.0Hz),2.07(2H,m),1.77(6H,m),1.55(10H,m),+
1.41(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);LCMS:627(M+Na)+ve离子模式。
[0055] LI12117是一种具有特有的末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯并在烷链上具有二个四氢呋喃基和三个羟氢氧基的多聚乙酰。这种化合物的光谱信息总结如下:
[0056] LI12117:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.2Hz),5.35(2H,m)4.98(1H,qd,J=6.8,1.6Hz),4.16(1H,m),3.93-3.82(4H,m),3.56(1H,m),3.40(1H,m),2.29(3H,m),2.06(4H,m),1.67-1.50(16H,m),1.40(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,+
t,J=6.8Hz);LCMS:643(M+Na)+ve离子模式。
[0057] 本发明所述的具有生物活性的多聚乙酰化合物具有特有的结构特征,其中每种所述的多聚乙酰具有一个末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团(a)。此外所述的多聚乙酰在烷链上具有如下所示的一个或多个四氢呋喃(b)基或一个或多个环氧(c)基,还选择性地具有一个或多个羟氢氧基和/或一个或多个烯键(双键)。
[0058]
[0059] 一些多聚乙酰化合物在纳摩尔和亚纳摩尔级浓度时显示出非常强效的50%抑制浓度(IC50)的TNFα抑制。表1总结的信息清晰地说明所述的多聚乙酰混合物使番荔枝叶衍生的提取物和分馏物具有活性。
[0060] 然后番荔枝叶提取物可以标准化为多鳞番荔枝辛C。上述甲醇提取物(LI12100)含有0.4%多鳞番荔枝辛C、0.07%多鳞番荔枝辛G和0.08%多鳞番荔枝辛L。上述乙酸乙酯提取物提取物含有含有多鳞番荔枝辛C。单一多聚乙酰的浓度和总浓度是由提取时使用的原料特性决定的。但是同0.1%多鳞番荔枝辛C一样低的提取物仍显示出强效的体外TNFα抑制和体外消炎活性。据发现,上述“具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰化合物”的总浓度为0.2%-5%。
[0061] 利用白细胞介素-1β诱导人类肺肿瘤细胞株A549来评估番荔枝乙酸乙酯提取物(LI12101)及其它含有新型多聚乙酰混合物的提取物对基质金属蛋白酶-3(MMP-3)产物的抑制。这些提取物强效地抑制了MMP-3产物,说明这些含有新型多聚乙酰混合物的提取物和分馏物可以用于预防软骨退化并改善关节健康。
[0062] 然后在体内系统中利用弗氏完全佐剂诱导的SD大鼠关节炎模型来检测番荔枝叶乙酸乙酯提取物(LI12101;标准化为0.2%多鳞番荔枝辛C)所示的强效的体外消炎效果。利用弗氏完全佐剂诱导的SD大鼠关节炎模型来检测LI12101(100mg/kg体重每天)的消炎效果,并将其效果与补充了10mg/kg体重脱氢皮质醇(10mg/kg)的阳性对照组进行比较。治疗组大鼠每天补充LI12101或脱氢皮质醇。14天后,在每个动物的左后肢足底皮下注射弗氏完全佐剂(FCA)。该试验在第28天结束。在FCA注射的当天以及FCA注射13天后的那天每隔一定间隔收集每个动物的血液样本并用体积描记法设备测量爪体积。爪水肿体积的差异即显示了炎症反应。计算出与补充了CMC的对照组相比,抑制爪水肿的百分率即可评估出LI12101和脱氢皮质醇的体内消炎反应。
[0063] 补充了LI12101的治疗组与对照组相比,显示对爪体积有65%的减小。如图III所总结地,补充了脱氢皮质醇的阳性对照组在10mg/kg剂量级上显示了71%的抑制。此外还评估了治疗组和对照组的血清中生物标记、肿瘤坏死因子-α(TNFα)的水平。如图IV所示,补充了LI12101的治疗组与补充了0.5%CMC的对照组相比,显著地减少了血清生物标记TNFα。
[0064] 为了进一步证实体内消炎活性,研究剂量依赖效应,利用弗氏完全佐剂诱导的SD大鼠关节炎模型来检测番荔枝叶的甲醇提取物(LI12100;标准化为0.24%多鳞番荔枝辛C)。FCA诱导的SD大鼠关节炎模型评估出LI12100(50mg/kg和100mg/kg体重每天)的消炎效果,并将这个效果与补充了10mg/kg体重脱氢皮质醇(10mg/kg)的阳性对照组进行比较。研究如上所述地进行,并评估爪水肿抑制。
[0065] 与对照组相比,补充了LI12100的治疗组显示出剂量依赖,并在50mg/kg和100mg/kg体重补充时分别显示对爪体积有49.5%和64.5%的减小。如图V所示,阳性对照脱氢皮质醇(10mg/kg体重)显示对爪体积有69.2%(10mg/kg体重)的减小。并评估了治疗组和对照组的血清中生物标记、肿瘤坏死因子-α(TNFα)的水平。如图IV所示,补充了LI12100的治疗组与补充了0.5%CMC的对照组相比,在两种剂量时都显著地减少了血清生物标记TNFα。
[0066] 此外根据供应商(Millipore Corporation,Billerica,MA,USA)提供的说明使用多重分析(RCYTOMAG 80K)来评估补充了LI12100的治疗组和对照组中,大量细胞因子的生物标记水平。与对照组中细胞因子的表达水平相比,补充了LI12100的治疗组显著地调节了血清中许多细胞因子的表达。被LI12100调节的细胞因子包括TNFα,IFNγ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-13,MCP-1、趋化因子(Rantes)、嗜酸粒细胞亲合素(Eotaxin)。这出人意料的结果说明番荔枝提取物可以用于预防、治疗、抑制或控制由这些细胞因子/趋化因子和/或生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0067] 前面的讨论清晰地说明具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰,由番荔枝衍生的含有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物及它们的混合物是细胞因子/趋化因子/生物标记,如TNFα,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-13,MCP-1,趋化因子(Rantes)、嗜酸粒细胞亲合素(Eotaxin)ICAM,VCAM,aP2,FLAP,CRP,CD36,5-脂氧合酶和MMPs等的强效调节器或调整器,并同样可以用于预防、治疗、抑制或控制炎症和与炎症或免疫紊乱相关的疾病。
[0068] 含有多聚乙酰混合物的番荔枝叶衍生的乙酸乙酯提取物(LI12101)和甲醇提取物(LI12100)在本发明中使用,并显示出体外和体内效果。但是多聚乙酰化合物或其它番荔枝衍生的提取物和/或分馏物标准化的具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰与烷链中至少一个选自四氢呋喃基,环氧基,羟氢氧基或烯键结合,显示出强效的抗TNFα活性(表1)。
[0069] 番荔枝种的己烷提取物(LI12100G)和乙酸乙酯提取物乙酸乙酯提取物也显示出强效的抗TNFα活性,它们的IC50值分别为3.1ng/mL和2.3ng/mL(表1)。
[0070] 各种新混合物(混合物-1A/1B至混合物-10A/10B)含有一种组分并具有至少一种选自植物/动物/微生物衍生的生物活性组分的,所述的组分至少选自由番荔枝衍生的提取物或分馏物进行标准化获得的,至少具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯并在烷链上具有一个四氢呋喃基、三个羟氢氧基和一个双取代双键的多聚乙酰中的一种,所述的新混合物;药用或食用活性组分,维生素被制备用于进行生物评估,并用于预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0071] 提取番荔枝植物部分时使用的溶剂非限制性地包括己烷、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、丙酮、甲基异丁基酮(MIBK)、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、液体二氧化碳、水或其混合物。
[0072] 番荔枝果实,种,花,茎,树皮,根,硬木和其他气生植物部分衍生的提取物也可以使用。
[0073] 肥胖研究的重点发展之一已被普遍认为是肥胖是一种慢性低水平炎症。若在肥胖人体中增加一些炎症标志物,包括细胞因子(TNFα,IL-6)和像C-反应蛋白(CRP)等急性时相蛋白的血清水平,肥胖与炎症之间的联系就会明显。近年来也推测出慢性低水平的组织发炎与肥胖产生的主要是2型糖尿病引起的胰岛素阻抗有关。
[0074] 根据对3T3-L1小鼠脂肪细胞的脂质堆积的可能抑制来筛选这些含有多聚乙酰的番荔枝提取物。番荔枝提取物出人意料地在3T3-L1细胞的体外分析中显示出强效的细胞中抗脂肪细胞分化和预分解脂肪的活性。乙酸乙酯提取物(LI12101)在10μg/mL的浓度下对脂质堆积具有46.6%的抑制。如表4所总结地,其它提取物也显示出强效的抗脂肪细胞分化的活性。
[0075] 这时发明人使用免疫印迹分析评估了番荔枝甲醇提取物(LI12100)对生物标记代谢的调节,其中所述的生物标记主要在脂肪细胞分化过程,2型糖尿病引起的胰岛素阻抗,肥胖,代谢综合征或其他代谢紊中作用的。
[0076] 据发现,番荔枝的甲醇提取物(LI12100)呈剂量依赖性地强效调整各种脂肪细胞的分化标记物,如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),ADRP,CEBPα,CEBPβ,CD36,脂肪酸结合蛋白4(aP2/FABP4)和细胞内脂滴表面蛋白(围脂滴蛋白)(图VII)。LI12100治疗的脂肪中这些标记物蛋白的下调表明,番荔枝的甲醇提取物在控制脂肪细胞分化过程中具有多种有益作用;通过(1)抑制细胞分化来下调PPARγ,这是一种核受体蛋白,其作为转录因子来调节细胞分化、生长和代谢,(2)通过抑制CD36来限制胆固醇酯的摄取,CD36在脂质摄取中属于B类清道剂,(3)减少FABP4/aP2水平来减少细胞内多脂和细胞内脂质运输,FABP4/aP2的作用是为长链脂肪酸运输蛋白和(4)抑制脂肪分化相关蛋白(ADRP),它会在脂肪细胞内形成或稳定脂滴并在脂肪组织中提高长链不饱和脂肪酸的摄取。
[0077] 此外,LI12100治疗的脂肪细胞中围脂滴蛋白的下调明显表明减少了细胞质中存储的脂肪。围脂滴蛋白是一种在脂肪细胞中消耗脂滴的蛋白质。它提供保护,来防止激素敏感脂肪酶的作用,以免其在代谢或脂解中将甘油三酯分解成甘油和游离脂肪酸。因此它表明番荔枝的甲醇提取物提供了这样一种状态,其中将包裹脂质囊泡四周的围脂滴蛋白变薄使所存储的脂肪更容易被酶分解成甘油和游离脂肪酸。此外LI12100还强效地下调了脂肪细胞分化标记物CEBPα和CEBPβ。CEBPα和CEBPβ分别是CCAAT/增强子结合蛋白α和β。它们是参与到不同细胞反应,如控制细胞增殖,生长,分化和代谢中的蛋白。CEBPβ在脂肪细胞分化的早期被短暂地诱导,而CEBPα在脂肪细胞分化的末期被控制。CEBPα要求脂肪细胞分化,且正常的脂肪细胞功能。因此CEBPα和CEBPβ是PPARγ-可诱导基因产物,与脂肪细胞分化过程相关,它们在控制代谢紊乱中是重要的目标。LI12100使它们发生下调表明番荔枝提取物可作为潜在的试剂来预防,治疗,抑制或控制代谢性疾病/紊乱。
[0078] 同样利用Western免疫印迹分析来评估LI12100在3T3-L1脂肪细胞中对脂联素蛋白的调整。细胞培养,治疗方案和免疫印迹分析方法均是按标准法进行。提取物LI12100也表明在3T3-L1成熟脂肪细胞中脂联素蛋白表达的有力上调。LI12100在5μg/mL和10μg/mL时分别显示了对血清脂联素浓度的38%和64%改进。脂联素是由脂肪细胞分泌的一种激素。它利用强胰岛素信号来降低细胞内甘油三酯的含量,上调葡萄糖的摄取,从而提供保护避免脂肪原性,并避免患上胰岛素阻抗糖尿病或2型糖尿病。因此,我们的发现表明番荔枝的提取物提供保护来避免患上肥胖,肥胖或2型糖尿病,还有助于抑制血管内皮功能障碍疾病。因此,这些提取物可以用于预防,治疗和控制上述代谢紊乱。
[0079] 上述表明番荔枝提取物可用于调节一种或多种代谢生物标记来预防,治疗,抑制或控制代谢疾病/紊乱。这些标记物包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),脂肪分化相关蛋白(ADRP),CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα),CCAAT/增强子结合蛋白β(CEBPβ),脂肪细胞CD36,巨噬细胞CD36,单核细胞趋化蛋白(MCP-1),氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL),脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白(aP2/FABP4/A-FABP),β-3肾上腺素受体(β3AR),围脂滴蛋白,脂联素,蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)。
[0080] 这出人意料的结果显示多聚乙酰,含有多聚乙酰的提取物和分馏物也可以用于预防,控制和治疗代谢综合征,肥胖,糖尿病,动脉粥样硬化和血管内皮功能障碍以及其他代谢性疾病。
[0081] 如本发明目的所述,本发明说明书和权利要求书中广泛使用的短语“提取物/分馏物被标准化为含有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰”是指“番荔枝衍生的提取物/分馏物被标准化为至少含有一种具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰化合物,其中所述的α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团位于烷链的一端,所述的多聚乙酰还含有一种或多种选自四氢呋喃基/基组,环氧基/基组,羟氢氧基,烯键的功能基团。
[0082] 如本发明目的所述,除非另有说明,本发明说明书和权利要求书中广泛使用的词“组分”均是指至少一种番荔枝衍生的具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰化合物或者番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物或者是它们的混合物。
[0083] 本发明说明书和权利要求书中使用的词“基团”或“组”可以相互替换,均是指功能组或功能基团。
[0084] 本发明说明书和权利要求书中使用的词“混合物”是指一种或多种由番荔枝衍生的具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰相混合或一种或多种番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物相混合或是前者与后者相混合;或者是它们的混合物与一种或多种其它生物活性组分,载色剂,载体和稀释剂等相混合。
[0085] 词组“生物活性组分”或“生物活性成分”是指植物,动物和/或微生物衍生的提取物或分馏物或化合物。
[0086] 本发明的不同实施例概述如下:
[0087] 在一个优选的实施例中,本发明提供了标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物,其用于预防,治疗,抑制或控制一种或多种由细胞因子/趋化因子或其它生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0088] 在另一个优选的实施例中,本发明提供了中草药混合物,其含有至少一种组分,该组分选自标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物,并含有至少另一种组分,该组分选自植物/动物/微生物衍生的生物活性组分;药用或食用活性组分,维生素,氨基酸,矿产品;药用或食用赋形剂,载色剂,载体和稀释剂或它们的混合物来用于预防、治疗、抑制或控制由细胞因子/趋化因子或其它诊断/生物标记介导的炎症和/或免疫相关的疾病。
[0089] 在另一个优选的实施例中,本发明还提供了所述的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物,来用于预防、治疗和/或控制炎症和/或免疫相关的疾病,其中所述的炎症和/或免疫相关的疾病非限制性地包括关节炎,哮喘,动脉粥样硬化,血管内皮功能障碍,过敏性鼻炎,皮炎,皮癣,囊肿性纤维化,炎性肠道疾病,间质性膀胱炎,偏头痛,疼痛,心绞痛,慢性前列腺炎,阳光灼伤,牙周疾病,多发性硬化症,系统性红斑狼疮,葡萄膜炎,后血管成形术再狭窄,肾小球肾炎,胃肠道过敏,肾炎,结膜炎,慢性阻塞性肺疾病,职业性哮喘,湿疹,支气管炎,花粉症,荨麻疹,过敏性疾病,如气喘、呼吸困难,非排痰性咳嗽,胸闷,颈部肌肉紧张,胸痛,关节痛及其它各种动物体相关的疾病。
[0090] 在另一个优选的实施例中,上述关节炎的非限制性实例包括类风湿(如软组织风湿病和非关节性风湿病,肌痛,纤维织炎,肌肉风湿,肌筋膜痛,肱骨外上髁炎,肩周炎,泰齐氏综合征,筋膜炎,肌炎,腱鞘炎,滑囊炎),幼年型慢性关节炎,关节紊乱,强直性脊柱炎(强直性脊柱炎),骨关节炎,高尿酸血症和急性痛风,慢性痛风,系统性红斑狼疮相关的关节炎和退行性关节炎。
[0091] 在另一个优选的实施例中,本发明提供了所述的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物来用于调节一种或多种与炎症,免疫和其它相关/有关疾病相关的细胞因子/趋化因子或生物标记/某些氧化还原敏感的亲炎基因,其中所述的生物分子/生物标记包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、MCP-1、调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(Rantes)、嗜酸粒细胞亲合素(Eotaxin)、ICAM、VCAM、aP2、FLAP、CRP、CD36、5-脂氧合酶和MMPs。
[0092] 在另一个优选的实施例中,本发明提供了所述的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物来用于预防、治疗、抑制或控制代谢疾病/紊乱。
[0093] 在其它优选的实施例中,本发明提供了中草药混合物,其含有至少一种组分,该组分选自由番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物,并含有至少另一种组分,该组分生物选自植物/动物/微生物衍生的生物活性组分;药用或食用活性组分,维生素,氨基酸,矿产品;药用或食用赋形剂,载色剂,载体和稀释剂或它们的混合物来用于预防、治疗、抑制或控制一种或多种代谢疾病/紊乱。
[0094] 在另一个优选的实施例中,本发明提供了由番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物及它们的混合物,其中所述的多聚乙酰还含有至少一种选自四氢呋喃基/基组,环氧基/基组,羟氢氧基,烯键的功能基团。
[0095] 在其它实施例中,本发明所述的由番荔枝衍生的提取物或分馏物或它们的组合物预防,治疗,抑制或控制的代谢紊乱可以选自肥胖,超重,糖尿病,动脉粥样硬化,动脉硬化,心血管疾病高血压,高胆固醇血症,高脂血症,高甘油三酯血症,代谢综合症,血管内皮功能障碍,胰岛素阻抗,胰岛素敏感性增强,高胰岛素血症,高血脂,低高密度脂蛋白胆固醇,脂蛋白异常,甘油三酯降低,尿酸水平升高,脂肪肝,非酒精性脂肪肝疾病,多囊卵巢综合征,血色病(超载),黑棘皮病(皮肤上的暗斑),糖耐量减低(IGT),空腹血糖受损(IFG),心血管疾病和其他代谢紊乱。
[0096] 在其它实施例中,本发明提供了多聚乙酰,番荔枝衍生的含有多聚乙酰化合物的提取物和分馏物及它们的混合物,来用于调节/调整一种或多种代谢紊乱及其它相关,有关的疾病中的细胞因子,趋化因子或生物标记的表达或产物,包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),脂肪分化相关蛋白(ADRP),CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα),CCAAT/增强子结合蛋白β(CEBPβ),脂肪细胞CD36,巨噬细胞CD36,单核细胞趋化蛋白(MCP-1),氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL),脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白(aP2/FABP4/A-FABP),β-3肾上腺素受体(β3AR),围脂滴蛋白,脂联素,蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)。
[0097] 在另一个实施例中,本发明还提供了通过注入由番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物及它们的混合物来治疗人体或动物体中如本发明所述的炎症,免疫相关疾病/紊乱的方法。
[0098] 在另一个实施例中,本发明提供了通过注入多聚乙酰化合物,由番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物或分馏物及它们的混合物来治疗人体或动物体中如本发明所述的代谢紊乱的方法。
[0099] 在另一个实施例中,本发明涉及使用多聚乙酰化合物或它们的混合物来制备各种药品,食品补充剂,食品配料和饮料。
[0100] 在另一个实施例中,本发明提供了由番荔枝衍生的标准化为具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的提取物和分馏物,具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰非限制性地包括多鳞番荔枝辛C(LI12103;1),异多鳞番荔枝辛(LI12132;2),戴俄婆萨德林(dieposabadelin)(LI12109;4),多鳞番荔枝斯坦定D(LI12106;5),多鳞番荔枝辛L(LI12107;6),多鳞番荔枝辛J(LI12111;7),多鳞番荔枝辛G(LI12105;10)和10-氢氧巴婆(双呋)内酯(LI12110;11);以及被分离并充分描述的化合物,包括化合物LI12104(3),compound LI12114(8),化合物LI12115(9);以及被分离但结构说明仍在进行中的,包括化合物LI12112,化合物LI12113,化合物LI12116和化合物LI12117。
[0101] 在另一个实施例中,本发明还提供了衍生了提取物和分馏物的番荔枝,其中具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰质量浓度为0.01%-50%。
[0102] 在另一个实施例中,本发明还提供了衍生了提取物和分馏物的番荔枝,其中具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰质量浓度为0.01%-30%。
[0103] 在另一个实施例中,本发明还提供了衍生了提取物和分馏物的番荔枝,其中具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰质量浓度为0.01%-10%。
[0104] 在另一个实施例中,本发明还提供了含有番荔枝衍生的提取物和分馏物的混合物,其中番荔枝衍生的组分在混合物中所占的质量百分比为0.01%-99.9%。
[0105] 在另一个实施例中,本发明还提供了含有番荔枝衍生的提取物和分馏物的混合物,其中番荔枝衍生的组分在混合物中所占的质量百分比为0.01%-70%。
[0106] 在另一个实施例中,本发明还提供了含有番荔枝衍生的提取物和分馏物的混合物,其中番荔枝衍生的组分在混合物中所占的质量百分比为0.01%-50%。
[0107] 在另一个实施例中,本发明还提供了含有番荔枝衍生的提取物和分馏物的混合物,其中番荔枝衍生的组分在混合物中所占的质量百分比为0.01%-30%。
[0108] 在另一个实施例中,本发明提供了由番荔枝植物部分衍生的标准化为多聚乙酰的提取物和分馏物,其中所述的植物选自果实,叶,花,茎,树皮,根,硬木或它们的混合物,优选叶。
[0109] 在其它实施例中,本发明提供了标准化为多聚乙酰的提取物和分馏物,其中用于提取植物部分的媒介选自正己烷,石油醚,乙醚,二氯甲烷,氯仿,乙酸乙酯,丙酮,乙腈,甲醇,乙醇,异丙醇,正丁醇,异丙醇,甲基异丁基酮和水或其混合物。
[0110] 在其它重要的实施例中,本发明提供一种方法来制备新型的源自植物番荔枝的提取物,包括用一种有机溶剂或水性有机溶剂在25-80℃的温度下提取叶,然后用水在25-100℃的温度下提取叶渣,然后将所述的提取物混合在一起就获得了含有多聚乙酰的强效提取物。
[0111] 在其它重要的实施例中,本发明提供一种方法来制备源自植物番荔枝的提取物,包括用一种有机溶剂或水性有机溶剂在25-80℃的温度下提取叶,然后用一种有机溶剂或水性有机溶剂单独提取种子,然后以9∶1-2∶8的治疗有效比来混合叶提取物和种提取物水就获得了一种含有多聚乙酰的新型提取物,或者所述的叶和所述的种子可以以所需的比例混合在一起,再用一种有机溶剂或水或它们的混合物来提取。
[0112] 在其它重要的实施例中,本发明提供了如上所述,由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的分馏物,用于预防,控制和/或治疗炎症,免疫或代谢疾病/紊乱,其中所述的多聚乙酰是至少使用一种分离技术获得的,所述的分离技术选自分离,沉淀,结晶,正相色谱,反相色谱,体积排阻色谱和离子交换层析或它们的组合。
[0113] 在本发明的另一个实施例中,用于制备混合物的生物活性成分是选自具有任意健康益处的提取物/分馏物/活性化合物或植物化学素,所述的任意健康益处选自消炎活性,抗关节炎活性,抗糖尿病活性,抗高血糖活性,降血脂活性,抗肥胖活性,抗高血压活性,抗血小板聚集活性,抗感染活性,抗动脉粥样硬化活性,抗氧化剂和生物强化活性。
[0114] 在优选的实施例中,一些生物活性组分可以选自氨基葡萄糖,氨基葡萄糖盐,软骨素,二甲基砜(MSM),透明质酸,胶原蛋白,聚多糖,壳聚糖,未变性胶原蛋白II型,SAM-e,ω-3,NEM,槲皮素,,锰,抗坏血酸,黄酮类,生物,植物甾醇,萜烯,ω-3脂肪酸;南非醉茄,绒毛戴星草,齿叶乳香树,姜黄,番石榴,松树皮,胡椒,荜茇植物部分衍生的提取物或分馏物,其中所述的植物选自果实,叶,花,茎,树皮,根,硬木或其混合物,采用传统技术使用正己烷,石油醚,乙醚,二氯甲烷,氯仿,乙酸乙酯,丙酮,乙腈,甲醇,乙醇,异丙醇,正丁醇,异丙醇,甲基异丁基酮,水或其混合物获得。
[0115] 在另一个实施例中,预计将含有具有α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团的多聚乙酰的混合物,提取物或分馏物与生物活性成分或功能成分混合显示协同作用。
[0116] 在另一个实施例中,药用或食用赋形剂,载色剂,稀释剂和载体包括表面活性剂粘合剂,分解剂,润滑剂防腐剂,稳定剂,缓冲液,悬浮液及药物释放系统,它们使混合物含有表面活性剂,粘合剂,稀释剂,分解剂,润滑剂,防腐剂,稳定剂,缓冲液,悬浮液及药物释放系统,其中所述的药用或食用赋形剂,载体和稀释剂包括葡萄糖,果糖,蔗糖,麦芽糖,黄糊精,白糊精,气相二氧化硅,微晶纤维素硬脂酸钙,硬脂酸镁,山梨糖醇,甜菊糖甙,玉米糖浆,乳糖,柠檬酸酒石酸,苹果酸,琥珀酸,乳酸,L-抗坏血酸,DL-α-生育酚,甘油,丙二醇,甘油脂肪酸酯,聚甘油脂肪酸酯,蔗糖脂肪酸酯,失水山梨醇脂肪酸酯,丙二醇脂肪酸酯,洋槐,卡拉胶,酪蛋白,明胶,果胶,琼脂,维生素B群,烟酰胺,泛酸钙,氨基酸,钙盐,色素,香料,防腐剂,蒸馏水,生理盐水,葡萄糖水溶液,酒精,丙二醇,聚乙二醇,各种动物和植物油,白软石蜡,石蜡和蜡。
[0117] 在本发明的其它实施例中,由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物被制成口服制剂,如片剂,软胶囊,硬胶囊,软胶囊剂,丸剂,颗粒剂,粉剂,乳剂,悬浮剂,糖浆,颗粒,食品,饮料,浓缩丸,滴丸等;肠胃外制剂,如注射剂,静脉滴注剂等;栓剂;和透皮制剂,如膏药,外用药膏和凝胶;眼科制剂;鼻剂;和食品或饮料。
[0118] 在其它实施例中,番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物可以口服,局部,肠胃外注入到或吸入到需要的人体或哺乳动物体或温血动物体中。
[0119] 在其它实施例中,番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物可以口服,局部,肠胃外注入到或吸入到需要的人体或哺乳动物体或温血动物体中,其中所述的成分或混合物每天给药一次或多次,或者由内科医生/医生规定给药次数。
[0120] 在其它实施例中,番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物以控释片的形式给药,利用包括纳米技术,微胶囊,胶体载体系统和其他药物释放系统等技术来使用控释聚合物基涂层。
[0121] 在本发明的其它实施例中,番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物形成或添加到现有或新的食品和饮料中作为温血动物的一种健康食品。
[0122] 在另一个实施例中,本发明涉及使用番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物来制备各种药剂,膳食补充剂,食品配料和饮料。
[0123] 在其它重要实施例中,本发明提供了一种方法来调节所需人体或哺乳动物或温血动物体中至少一种生物标记的表达或产物,其中生物标记选自(PPARγ),C-反应蛋白(CRP),脂肪分化相关蛋白(ADRP),CEBPα,CEBPβ,脂肪细胞CD36,巨噬细胞CD36,单核细胞趋化蛋白(MCP-1),氧化低密度脂蛋白,脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白(aP2/FABP4/A-FABP),β-3肾上腺素受体(β3AR),脂联素,围脂滴蛋白,蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B),基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13),其中所枕席的方法包括向所述人体或温血动物或哺乳动物体中补充番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰或其混合物的一种提取物或分馏物或它们的混合物的一个有效剂量。
[0124] 在其它重要实施例中,本发明提供了一种方法来抑制哺乳动物体中脂肪的生成和/或加速脂解,其中所述的方法包括向所述哺乳动物体中补充番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰或其混合物的一种提取物或分馏物或它们的混合物的一个有效剂量。
[0125] 在其它实施例中,番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的一种提取物或分馏物或它们的混合物可以以任意治疗有效剂量,如0.01-250mg/kg体重/天,优选0.1-50mg/kg体重/天给药,产生益处,如症状改善,减缓疾病恶化或预防疾病。
[0126] 在一个进一步的实施例中,本发明提供了所述的方法来制备由番荔枝衍生的含有新型多聚乙酰混合物,多聚乙酰混合物及纯多聚乙酰化合物的提取物和分馏物。
[0127] 本发明的其它实施例还提供了使用由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物为粉碎的形式和/或在未经修改的形式,如颗粒剂,粉末,沉淀,萃取物,干燥提取物和/或渗出物或者将活性成分中加入一种传统的生物学或药学可接受的盐或添加剂制成一种固体,半固体或液体剂形。
[0128] 在一个进一步的实施例中,本发明提供了将由番荔枝衍生的标准化为多聚乙酰的提取物或分馏物或它们的混合物用治疗有效量以一种特定剂型,如口服,外用,透皮,肠胃外或试剂盒的形式向所需的人体或患者给药。
[0129] 如本发明所述,本发明的混合物可以设计成任意人用或动物用的膳食补充剂,食品和饮料。
[0130] 在另一个实施例中,本发明还包括将本发明这些混合物与各种组分混合,在动物饲料中使用,来治愈,预防或治疗炎症/免疫相关或有关的疾病和/或治疗代谢紊乱。
[0131] 下述实例,包括优选的实施例,将公开本发明的实际应用,它应理解为以实例的方式特别地说明本发明,是为了说明讨论本发明优选的实施例,它们不应限制本发明的保护范围。
[0132] 例1:
[0133] 制备番荔枝叶的甲醇提取物(LI12100):将干燥的植物原料番荔枝叶(1.1Kg)粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用甲醇(6.6L)在60-65℃的温度下提取2小时。将提取物过滤并用甲醇(2x5.5L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得一种深色残留物,即甲醇提取物(LI12100;150g;0.4%多鳞番荔枝辛C)。
[0134] 例2:
[0135] 制备番荔枝叶的己烷提取物(LI12100A),乙酸乙酯提取物(LI12101)和甲醇提取物(LI12101):将干燥的植物原料番荔枝叶(2Kg)粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用水(14L)在室温下提取。将提取物过滤并将滤渣置于阴凉处干燥。干燥后的滤渣继续用冷己烷(14L)在10-15℃下提取2小时,接着用乙酸乙酯(3x12L)在回流温度下提取,每次提取2小时,最后用甲醇(2x6L)在65℃下回流提取,每次提取2小时。精细过滤提取物,分别进行真空浓缩,获得己烷提取物(LI12100A;58g),乙酸乙酯提取物(LI12101;160g;0.5%多鳞番荔枝辛C)和甲醇提取物(LI12101;160g;0.5%多鳞番荔枝辛C)。
[0136] 例3:
[0137] 制备番荔枝叶的乙酸乙酯提取物(LI12100C):将干燥的植物原料番荔枝叶(1Kg)粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用乙酸乙酯(6L)在回流温度下提取2小时。将提取物过滤并用乙酸乙酯(2x6L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得一种残留物(LI12100C;99g)。
[0138] 例4:
[0139] 制备番荔枝叶的乙醇提取物(LI12100D):将干燥的植物原料番荔枝叶(1Kg)粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用乙醇(6L)在65-70℃的温度下提取2小时。将提取物过滤并用乙醇(2x5L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得一种深色残留物,即乙醇提取物(LI12100D;132g)。
[0140] 例5:
[0141] 制备番荔枝叶的水醇(60%乙醇)提取物(LI12100E):将干燥的植物原料番荔枝叶(1Kg)粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用60%的乙醇(6L)在65-70℃的温度下提取2小时。将提取物过滤并用60%的乙醇(2x5L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得一种深色残留物,即水醇提取物(LI12100E;
120g)。
[0142] 例6:
[0143] 制备番荔枝叶的乙酸乙酯分层提取物(LI12100D):将例4获得的乙醇提取物(25g)用水(200mL)和乙酸乙酯(200mL)分层。分离出有机层并用硫酸钠干燥,真空蒸发,获得一种残留物(LI12100F,19g)。
[0144] 例7:
[0145] 制备番荔枝种的己烷提取物(LI12100G):将干燥的植物原料番荔枝种(300g)粉碎成粗粉末,用己烷(1.2L)回流2小时。将提取物过滤并用己烷(2x1L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得种的己烷提取物(LI12100G;27g)。
[0146] 例8:
[0147] 制备番荔枝种的乙酸乙酯提取物(LI12100H):将干燥的植物原料番荔枝种(300g)粉碎成粗粉末,用乙酸乙酯(1.2L)回流2小时。将提取物过滤并用乙酸乙酯(2x1L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得乙酸乙酯提取物(LI12100H;27g)。
[0148] 例9:
[0149] 制备番荔枝叶的新型提取物(LI12100I):将干燥的植物原料番荔枝种(1Kg)粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用甲醇(6L)在60-65℃的温度下提取2小时。将提取物过滤并用甲醇(2x5L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得一种深色残留物,即甲醇提取物(LI12100;124g)。然后将滤渣阴干,并用水(6L)在65-70℃的温度下提取滤渣(800g)1小时。将提取物过滤并用水再提取滤渣一次以上。合并水提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得水提取物(85g)。将甲醇提取物和水提取物适当地混合,并过40目筛,获得番荔枝叶的新型提取物(LI12100I番荔枝叶的新型提取物(LI12100I))
[0150] 例10:
[0151] 制备番荔枝种和叶的新型提取物(LI12100J):将含有800g干燥番荔枝叶和200g干燥番荔枝种的原料混合物粉碎成粗粉末,倒入到一个试验萃取器中,用甲醇(6L)在60-65℃的温度下提取2小时。将提取物过滤并用甲醇(2x5L)在相同条件下再提取滤渣两次。合并提取物,并进行精细过滤,真空浓缩,获得一种深色残留物,即混合物的甲醇提取物(LI12100J;124g)。
[0152] 例11
[0153] 番荔枝衍生的混合物
[0154] 1)混合物-1A:混合物-1A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;两份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份齿叶乳香树低极性树脂提取物(BsLPRE)(1g)。
[0155] 2)混合物-1B:混合物-1B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份齿叶乳香树低极性树脂提取物(BsLPRE)(2g)。
[0156] 3)混合物-2A:混合物-2A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(1g)和两份标准化为85%总乳香酸的齿叶乳香树提取物(BSE85%)(2g)。
[0157] 4)混合物-2B:混合物-2B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(1g)和三份标准化为85%总乳香酸的齿叶乳香树提取物(BSE85%)(3g)。
[0158] 5)混合物-3A:混合物-3A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(1g)和两份番石榴叶甲醇提取物(2g)。
[0159] 6)混合物-3B:混合物-3B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;两份番荔枝提取物(LI12100)(2g)和两份番石榴叶甲醇提取物(2g)。
[0160] 7)混合物-4A:混合物-4A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份抗坏血酸钙(2g)。
[0161] 8)混合物-4B:混合物-4B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和两份抗坏血酸钙(4g)。
[0162] 9)混合物-5A:混合物-5A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份ω-3脂肪酸(2g)。
[0163] 10)混合物-5B:混合物-5B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝提取物(LI12100)(2g)和两份ω-3脂肪酸(4g)。
[0164] 11)混合物-6A:混合物-6A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份浓缩有30%的3-O-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(AKBA)的齿叶乳香树提取物(2g)。
[0165] 12)混合物-6B:混合物-6B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份浓缩有20%of 3-O-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(AKBA)的齿叶乳香树提取物(2g)。
[0166] 13)混合物-7A:混合物-7A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和两份浓缩有95%总姜黄色素的姜黄提取物(4g)。
[0167] 14)混合物-7B:混合物-7B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和四份浓缩有20%总姜黄色素的姜黄提取物(8g)。
[0168] 15)混合物-8A:混合物-8A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和三份氨基葡萄糖盐酸盐(6g)。
[0169] 16)混合物-8B:混合物-8B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和五份浓缩有20%总姜黄色素的姜黄提取物(10g)。
[0170] 17)混合物-9A:混合物-9A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g),一份齿叶乳香树提取物(>10%AKBA)(2g),两份标准化为95%总姜黄色素的姜黄提取物(4g)和一份菠罗蛋白酶(2g)。
[0171] 18)混合物-9B:混合物-9B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g),一份齿叶乳香树提取物(>10%AKBA)(2g),三份标准化为95%总姜黄色素的姜黄提取物(6g)和两份菠罗蛋白酶(4g)。
[0172] 19)混合物-10A:混合物-10A是通过混合下述组分的单位剂量制得的;一份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100)(2g)和一份番荔枝种乙酸乙酯提取物(LI12100H)(2g)。
[0173] 20)混合物-10B:混合物-10B是通过混合下述组分的单位剂量制得的;四份番荔枝叶甲醇提取物(LI12100B)(4g)和一份番荔枝种乙酸乙酯提取物(LI12100H)(1g)。
[0174] 例12
[0175] 用导向纯化的生物鉴定(anti-TNFα)来制备活性分馏物并确定活性化合物:将番荔枝叶的甲醇提取物(LI12100;150gm;IC50 20.06ng/mL)过二氧化硅快速柱色谱分析,其中使用乙酸乙酯/正己烷混合物作为洗提液。用60%和80%乙酸乙酯与正己烷混合物洗提后的分馏物(分别是5.2g和4.2)及用乙酸乙酯洗提后的分馏物(8g)显示出强效的抗TNFα活性。但是乙酸乙酯洗提后的分馏物(LI189/159G+H)显示出较强的活性(IC500.82ng/mL)。将这种分馏物的小样本(3g)再次过二氧化硅快速柱纯化,使用丙酮/氯仿混合物作为洗提液。用30%丙酮/氯仿洗提的分馏物(380mg;0.4ng时抑制率为76.6%)中具有活性化合物。将其再次用HPLC纯化,使用95∶5的乙腈/水混合物过一个预备反相二氧化硅柱(Phenomenex Luna 10μ,C18,250mm x21.2),获得一种纯化合物(LI12103,
1 13
88mg),其IC50值为24.9pg/mL。对其光谱信息(H NMR,C NMR及Mass)的详细分析确定其为多鳞番荔枝辛C(LI12103;1)。一种在100pg/mL时抑制率为63%的小化合物通过HPLC分离出来,其结果确定其为异多鳞番荔枝辛(LI12132;2,28mg)。上述导向分离的生物鉴定结果见图I。
[0176] 例13
[0177] 使用导向分离的生物鉴定法从番荔枝乙酸乙酯提取物(LI12101)中分离出具有末端α,β-不饱和-γ-甲基-γ-内酯基团及四氢呋喃和/或环氧基基团的多聚乙酰:番荔枝乙酸乙酯提取物(LI12101)(300g),IC50值为8.38ng/mL,具有抗THP-1人体单核细胞中LPS诱导的TNFα活性,将其过二氧化硅柱进行生物分析导向柱色谱分析,使用正己烷和丙酮/正己烷混合物作洗提液。用5%-40%丙酮/正己烷混合物洗提获得的分馏物显示出强效的TNFα抑制。用5%丙酮/正己烷混合物洗提获得的分馏物再次过二氧化硅柱进行色谱分析,使用正己烷和丙酮/正己烷混合物作洗提液,所获得的活性分馏物再次进行色谱分析,使用乙酸乙酯和丙酮/正己烷混合物作洗提液,获得LI12104(3,250mg)。用10%丙酮/正己烷洗提后主柱洗提出的分馏物再次过二氧化硅纯化,使用丙酮/正己烷混合物作为洗提液,获得戴俄婆萨德林(dieposabadelin)(LI12109,4,150mg)。用20%和30%丙酮/正己烷混合物洗提后主柱洗提出的分馏物再次过二氧化硅纯化,使用丙酮/正己烷混合物作为洗提液,获得多鳞番荔枝斯坦定D(LI12106;5,40mg),多鳞番荔枝辛L(LI12107;6,175mg),多鳞番荔枝辛J(LI12111;7,70mg),化合物LI12112(40mg),化合物LI12113(46mg),化合物LI12114(8,30mg),化合物LI12115(9,35mg)和化合物G(LI12105;10,45mg),化合物LI12116(17mg),化合物LI12117(15mg)。用40%丙酮/正己烷混合物洗提出的分馏物再次过二氧化硅纯化,使用丙酮/正己烷和乙酸乙酯/正己烷混合物作为洗提液,获得多鳞番荔枝辛C(LI12103;1,1.4g),异多鳞番荔枝辛(LI12132;2,21mg),10-氢氧巴婆(双呋)内酯(LI12110;11,40mg)。通过与文献中报道的光谱信息进行对比,确定多鳞番荔枝辛C,多鳞番荔枝辛G,多鳞番荔枝斯坦定D,多鳞番荔枝辛L,戴俄婆萨德林(dieposabadelin),10-氢氧巴婆(双呋)内酯和多鳞番荔枝辛J的结构。化合物LI12104(3)和LI12114(8)的结构暂定,其它化合物的结构确定/证实工作还在进行中。使用下述例子中所示的实验过程来检测所述的提取物和所有色谱分析获得的分馏物。其它化合物的分离仍在进行中。
[0178] 多聚乙酰化合物的NMR和质谱相关数据如下所述:
[0179] LI12103(多 鳞 番 荔 枝 辛C;1):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J =1.5Hz),4.98(1H,m),3.94-3.80(5H,m),3.62-3.55(1H,m),3.41-3.37(1H,m),2.26(2H,t,J=7.2Hz),2.06-1.79(m),1.40(3H,d,J=6.8Hz),1.68-1.25(m),0.88(3H,t,J=6.8Hz);
13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.7,134.3,83.3,82.8,82.4,82.1,77.1,74.1,71.8,
71.6,37.5,37.3,33.8,33.4,32.6,31.9,31.8,29.7-29.2,28.9,28.4,27.4,25.6,25.2,+
24.9,22.7,22.6,22.0,19.2,14.0;LCMS:m/z 645(M+Na),+ve离子模式。
[0180] LI12132(异多鳞番荔枝辛;2):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.99(1H,s),4.99(1H,q,J = 6.4Hz),3.94-3.84(5H,m),3.58(1H,m),3.39(1H,m),2.26(2H,t,J = 7.6Hz),1.98-1.80(m),1.62-1.52(m),1.40(3H,d,J = 6.8Hz),1.68-1.25(m),0.88(3H,t,J =
13
6.8Hz);. C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.8,134.3,83.3,82.8,82.5,82.2,77.6,
74.1,71.7,71.3,37.4,37.2,33.1,32.4,31.9,31.8,29.7-29.2,28.9,27.3,25.6,25.1,+
24.7,22.6,21.9,19.2,14.0;LCMS:m/z 645(M+Na),+ve离子模式。
[0181] LI12104(3):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.6Hz),5.40(2H,m),4.99(1H,qd,J = 6.8,1.6Hz),2.97(4H,m),2.24(4H,m),2.25(2H,m),1.77(2H,m),1.69(2H,m),1.63-1.47(10H,m),1.40(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);
13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.7,134.4,131.1,128.1,57.3,56.9,56.8,56.7,
56.4,31.9,29.6,29.6,29.5,29.5,29.3,29.3,29.2,27.9,27.8,27.8,27.4,27.2,26.6,+
25.7,25.3,25.2,25.1,24.9,24.3,22.6,19.2,14.0;LCMS:595(M+Na)+ve离子模式。
[0182] LI12109( 戴 俄 婆 萨 德 林 (dieposabadelin);4):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,s),4.99(1H,qd,J = 6.4,1.6Hz),2.94(4H,s),2.27(2H,t,J = 8.0Hz),
1.77(2H,m),1.63(2H,m),1.57-1.44(10H,m),1.40(3H,d,J = 6.8Hz),1.26(s),
0.88(3H,t,J = 6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.7,148.7,134.4,57.3,56.7,
34.1,31.9,29.6,29.6,29.3,29.2,27.8,27.4,26.6,25.2,25.2,22.6,19.2,14.0;LCMS:
+
569(M+Na)+ve离子模式。
[0183] LI12106(多鳞番荔枝斯坦定D;5):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J=1.6Hz),4.99(1H,qd,J=6.8,1.6Hz),3.90-3.85(2H,m),3.83-3.78(3H,m),3.41(2H,m),
2.71(1H,s),2.26(2H,t,J=8.4Hz),2.04-1.97(4H,m),1.95-1.85(2H,m),1.73-1.68(4H,m),1.55-1.44(8H,m),1.41(3H,d,J = 6.8Hz),1.28(s),0.88(t,J = 6.8Hz);LCMS:
+
645(M+Na)+ve离子模式。
[0184] LI12107(多 鳞 番 荔 枝 辛L;6):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J =1.6Hz),4.99(1H,qd,J = 6.8,2.0Hz),3.94-3.91(2H,m),3.89-3.84(3H,m),3.39(1H,m),2.49(1H,br s),2.26(2H,t,J = 8.4Hz),2.18(1H,s),1.98(4H,m),1.94-1.79(2H,m),1.67-1.51(8H,m),1.41(3H,d,J = 6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J = 6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.8,134.4,83.2,82.8,82.4,82.2,77.2,74.1,71.5,
33.5,32.5,31.9,29.7,29.6,29.5,29.5,29.3,29.2,28.9,28.8,28.3,27.4,26.0,25.7,+
25.2,24.6,22.6,19.2,14.1;LCMS:629(M+Na)+ve离子模式。
[0185] LI12111(多 鳞 番 荔 枝 辛J;7):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J =1.6Hz),4.99(1H,qd,J = 6.8,1.6Hz),3.95-3.82(5H,m),3.39(1H,m),2.49(1H,s),
2.43(1H,s),2.26(2H,t,J = 8.4Hz),2.18(1H,s),2.01-1.96(5H,m),1.94-1.81(2H,m),1.72-1.51(8H,m),1.41(3H,d,J = 6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J = 6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.7,134.4,83.1,82.8,82.2,77.2,74.1,71.5,33.5,
32.5,31.9,29.7,29.7,29.6,29.5,29.5,29.3,29.2,28.9,28.8,28.4,27.4,26.0,25.6,+
25.2,24.6,22.619.2,14.0;LCMS:601(M+Na)+ve离子模式。
[0186] LI12114(8):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.6Hz),4.99(1H,qd,J = 6.8,1.6Hz),3.87(5H,m),3.37(1H,m),2.52(1H,br s),2.26(2H,t,J = 7.2Hz),1.98-1.93(5H,m),1.76-1.45(10H,m),1.41(3H,d,J = 6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.7,134.4,83.1,82.2,82.1,81.0,80.9,
79.8,74.3,74.1,74.1,35.8,33.6,32.1,31.8,29.7,29.6,29.4,29.3,29.2,29.1,28.7,
28.4,28.3,28.1,27.9,27.8,27.7,27.4,27.2,26.1,25.6,25.2,22.6,19.2,14.0;LCMS:
+
627(M+Na)+ve离子模式。
[0187] LI12115(9):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J=1.6Hz),4.99(1H,qd,J= 6.8,1.6Hz),3.95-3.82(4H,m),3.39(1H,m),2.26(2H,t,J = 8.4Hz),2.04-1.92(5H,m),1.67-1.60(8H,m),1.58-1.49(5H,m)1.41(3H,d,J= 6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.8,134.4,83.0,82.9,82.0,81.2,79.9,77.2,74.1,35.9,33.5,32.1,31.9,29.7,29.7,29.6,29.5,29.5,29.3,29.2,28.9,28.8,+
28.4,27.4,26.1,25.7,25.2,22.7,19.2,14.1;562(M+Na)+ve离子模式。
[0188] LI12105(多鳞番荔枝辛G;10):1H NMR(CDCl3),400MHz:δ7.18(1H,d,J=1.2Hz),5.05(1H,dq,J=1.2,6.8Hz),3.95-3.81(6H,m),3.41-3.37(1H,m),2.51(1H,td,J=1.6,14.8Hz),2.42(1H,dd,J=8.4,15.2Hz),2.24(m),2.01-1.79(m),1.66-1.61(4H,m),1.43(3H,d,J = 6.8Hz),1.25-1.49(m),0.88(3H,t,J = 6.8Hz);13C NMR(CDCl3,
100MHz):δ174.5,151.7,131.3,83.2,82.8,82.4,82.2,77.9,74.1,71.5,70.1,37.5,
33.5,33.4,32.6,31.9,29.7-28.9,28.4,26.1,25.7,25.6,24.7,22.7,19.1,14.1.LCMS:m/+
z 645(M+Na),+ve离子模式。
[0189] LI12110(10-氢氧巴婆(双呋)内酯;11):1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.6Hz),4.99(1H,qd,J = 1.6,6.8Hz),3.90-3.77(5H,m),3.60(1H,br s),3.41(2H,m),2.75(2H,dd,J = 2.8,5.6Hz),2.26(2H,tt,J = 1.6,7.6Hz),2.16(1H,br s),2.03-1.84(4H,m),1.72-1.50(13H,m),1.41(3H,d,J=6.8Hz),1.28(s),0.88(3H,t,J=7.2Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.8,148.8,134.4,83.3,82.2,81.9,79.4,77.3,
76.9,76.7,74.5,74.5,71.8,71.7,37.5,37.3,35.6,32.6,32.4,31.8,29.7,29.7,29.6,
29.5,29.4,29.3,29.3,29.1,28.6,28.4,27.4,26.2,25.6,25.5,25.2,22.6,21.9,19.2,+
14.0;LCMS:661(M+Na)+ve离子模式。
[0190] LI12112:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.2Hz),5.36(2H,m),4.99(1H,qd,J=1.6,6.8Hz),3.87(4H,m),3.41(2H,m),2.36-2.24(4H,m),2.06-1.90(5H,m),1.68-1.50(8H,m),1.41(3H,d,J=6.8Hz),1.25(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);LCMS:
+
629(M+Na)+ve离子模式。
[0191] LI12113:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J=1.6Hz),4.99(1H,qd,J=1.6,6.8Hz),3.03-2.92(6H,m),2.26(2H,t,J=7.6Hz),2.04-1.95(2H,m),1.84(2H,m),
1.78(2H,m),1.66-1.47(10H,m),1.40(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);
13C NMR(CDCl3,100MHz):δ173.7,148.7,138.4,57.3,56.8,56.6,31.9,29.7,29.5,29.5,+
29.3,29.2,27.8,27.4,26.6,25.3,25.2,25.2,22.6,19.2,14.1;LCMS:611(M+Na)+ve离子模式。
[0192] LI12116:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,s),4.99(1H,qd,J=6.4,1.6Hz),4.29(1H,m)2.98(4H,m),2.27(2H,t,J=8.0Hz),2.07(2H,m),1.77(6H,m),1.55(10H,m),+
1.41(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,t,J=6.8Hz);LCMS:627(M+Na)+ve离子模式。
[0193] LI12117:1H NMR(CDCl3,400MHz):δ6.98(1H,d,J = 1.2Hz),5.35(2H,m)4.98(1H,qd,J=6.8,1.6Hz),4.16(1H,m),3.93-3.82(4H,m),3.56(1H,m),3.40(1H,m),2.29(3H,m),2.06(4H,m),1.67-1.50(16H,m),1.40(3H,d,J=6.8Hz),1.26(s),0.88(3H,+
t,J=6.8Hz);LCMS:643(M+Na)+ve离子模式。
[0194] 例14
[0195] 用番荔枝提取物,分馏物和化合物进行体内抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α):在一个细胞中对番荔枝提取物,分馏物和化合物的消炎活性进行体内分析。简单地说,冲洗THP-1人体单核细胞并用酚红再悬浮在添加了1%胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(DMEM)中。将等量的细胞加入到96孔TC板中每个孔里,用各种浓度的番荔枝提取物,分馏物和化合物(0.1-200ng/mL;培养基中制得的溶液来自一种原液,该原液含有每种待测化合物的50mg/l mL DMSO)预处理2小时。100ng/mL of LPS在37℃,5%CO2环境下感应消炎反应4小时。在培养基中空白对照培养基接收了0.1%DMSO。收集细胞培养基悬浮液,并评估所分泌的预炎症细胞因子,TNFα。用R&D Systems,USA销售的高特异敏感酶免疫分析(EIA)试剂盒定量地检测TNFα浓度。根据销售商提供的方法进行酶免疫分析。从TNFα水平对应的成分浓度图中确定TNFα的50%抑制浓度(IC50)。发现番荔枝提取物LI12101的IC50值为8.4ng/mL。表1总结了番荔枝植物部分衍生的提取物,分馏物和化合物在细胞中以体内模式产生的50%抑制浓度(IC50)。
[0196] 表1
[0197]
[0198] 例15
[0199] 用番荔枝叶衍生的提取物和分馏物抑制基质金属蛋白酶-3(MMP-3):利用白细胞介素-1β诱导人类肺肿瘤细胞株A549来评估番荔枝提取物(LI12100)对基质金属蛋白酶-3的抑制。简而言之,细胞培养在含有2mM谷氨酸盐,100U/mL盘尼西林,100μg/mL链霉素和10%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的DMEM中。在试验前一天将96孔细胞培养板(Corning,USA)中的每个孔中种入五千细胞。培养媒介代替新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM。LI12100提取物在媒介中连续地洗提,范围为0.1-10μg/mL,然后和细胞一起在5%CO2,7℃下预孵化2小时,接着用10ng/mL人体IL-1β(R&D System,Minneapolis,MN)激化24小时。所获得的上清用ELISA新型试剂盒(R&D System,Minneapolis,MN,USA)检测MMP3产物。将光学密度插入到公知浓度的MMP3标准曲线上,定量地分析出培养基上清中MMP3的浓度。表2总结了番荔枝不同的提取物在10μg/mL浓度时产生的抑制百分率。
[0200] 表2
[0201]
[0202] 例16
[0203] 含有多聚乙酰混合物的番荔枝提取物(LI12101)的体内消炎活性:利用弗氏完全佐剂诱导的SD大鼠关节炎模型来检测含有多聚乙酰混合物的番荔枝的乙酸乙酯提取物(LI12101;0.2%多鳞番荔枝辛C)的体内消炎效果。大鼠的性别任意选择,将其分成两组,每组5只。治疗组大鼠每天补充100mg/kg体重的番荔枝提取物(LI12101)或100mg/kg体重的脱氢皮质醇,补充14天。所有的补充剂均经过10mL0.5%CMC的洗提。动物的对照组补充相同体积(10mL)的0.5%CMC。补充脱氢皮质醇作为阳性对照。第14天时,在每个动物的左后肢足底皮下注射弗氏完全佐剂(FCA)。该试验在FCA注射后13天时结束。实验结束时,杀死动物,将肝脏组织样本切离并储存在-80℃下。在FCA注射的当天以及FCA注射13天后的那天每隔一定间隔收集每个动物的血液样本并测量爪体积。FCA注射的当天以及FCA注射13天后的那天测得的爪水肿体积的差异即显示了补充物对炎症的反应。计算出与补充了CMC的对照组相比,抑制爪水肿的百分率即可评估出番荔枝提取物(LI12101)和脱氢皮质醇的体内消炎反应。图III总结了这些信息。
[0204] 补充了番荔枝提取物(LI12101)的治疗组显示了对爪体积有65%的减小,相比之下,阳性对照脱氢皮质醇对爪体积有71%的减小。并评估了FCA注射13天后收集的血清中肿瘤坏死因子-α(TNFα)的水平。使用R&D systems,USA销售的酶免疫分析试剂盒检测血清中细胞因子的水平。如图IV所示,补充了LI12101和脱氢皮质醇的治疗组显著地降低了血清中细胞因子(TNFα)的水平。
[0205] 例17
[0206] 含有多聚乙酰的番荔枝甲醇提取物(LI12100)进行消炎及抗细胞因子治疗的效果:利用弗氏完全佐剂诱导的SD大鼠关节炎模型来检测番荔枝叶的甲醇提取物(LI12100;0.24%多鳞番荔枝辛C)与阳性对照脱氢皮质醇相比的体内消炎效果。大鼠的性别任意选择,将其分成四组,每组6只。治疗组大鼠每天补充50mg/kg体重或100mg/kg体重的番荔枝提取物(LI12100)或100mg/kg体重的脱氢皮质醇,补充14天。所有的补充剂均经过10mL
0.5%CMC的洗提。动物的对照组补充相同体积(10mL)的0.5%CMC。补充脱氢皮质醇作为阳性对照。第14天时,在每个动物的左后肢足底皮下注射弗氏完全佐剂(FCA)。该试验在FCA注射后13天时结束。实验结束时,杀死动物,将肝脏组织样本切离并储存在-80℃下。在FCA注射的当天以及FCA注射13天后的那天每隔一定间隔收集每个动物的血液样本并测量爪体积。FCA注射的当天以及FCA注射13天后的那天测得的爪水肿体积的差异即显示了补充物对炎症的反应。计算出与补充了CMC的对照组相比,抑制爪水肿的百分率即可评估出番荔枝提取物(LI12100)和脱氢皮质醇的体内消炎反应。图V总结了这些信息。
[0207] 与对照组相比,补充了50mg/kg体重或100mg/kg体重的番荔枝提取物(LI12100)的治疗组分别显示了对爪体积有49.5%和64.5%的减小。阳性对照脱氢皮质醇对爪体积有69.2%的减小。并评估了FCA注射14天后收集的血清中肿瘤坏死因子-α(TNFα)的水平。使用R&D systems,USA销售的酶免疫分析试剂盒检测血清中细胞因子的水平。如图VI所示,补充了LI12101和脱氢皮质醇的治疗组显著地降低了血清中细胞因子(TNFα)的水平。
[0208] 此外根据供应商(Millipore Corporation,Billerica,MA,USA)提供的说明使用多重分析(RCYTOMAG 80K)来评估治疗组和对照组的血清中大量细胞因子生物标记的水平。与对照组显示的细胞因子表达水平相比,补充了LI12100的治疗组显著地调节了血清中许多细胞因子的表达。如表3所总结地,被LI12100调节的细胞因子包括TNFα,IFNγ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-13,MCP-1、趋化因子(Rantes)、嗜酸粒细胞亲合素(Eotaxin)。
[0209] 表3:FCA诱导的SD大鼠经LI12100和脱氢皮质醇治疗后,其血清样本中与炎症相关的细胞因子/生物标记的相对表达
[0210]
[0211] 大鼠细胞因子/生物标记多孔板(Catalogue No.RCYTO-80K,MilliporeCorporation,USA)
[0212] 例18
[0213] 评估番荔枝提取物及分馏物对不同脂肪细胞中脂质堆积的抑制:将培养在含有10%胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(DMEM)中的十万个3T3-L1小鼠前脂肪细胞放入24孔板的每个孔中,37℃,5%CO2下孵化24小时。细胞被溶解在0.1%DMSO的不同浓度的番荔枝乙酸乙酯提取物(LI12101)预孵化,并在一种分化媒介中分化48小时,如含有500nM胰岛素的DMEM,1.0μM地塞米松和0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)。仅用0.1%DMSO孵化的细胞作为空白对照。因此,用不同媒介代替含有500nM胰岛素的DMEM,在不同浓度的番荔枝乙酸乙酯提取物LI12101中存在或不存在时细胞再被孵化8天。治疗期之后,细胞在室温下用10%的福尔林缓冲液固定4小时。固定后的细胞用油红O溶剂(100ml异丙醇中含有0.5g)染色10分钟,然后检测多孔中性脂质堆积。去除染色溶剂后,用异丙醇洗提细胞上的颜色,然后测550nm下的OD。将治疗细胞中脂质堆积的抑制率与治疗分化脂肪细胞模型进行比较。番荔枝提取物LI12101的消脂活性通过脂质堆积的抑制百分率来表示(表4)。
[0214] 表4总结了使用相似的方法和信息确定的番荔枝叶己烷提取物(LI12100A),甲醇提取物(LI12100B),乙酸乙酯提取物(LI12100C)和乙醇提取物(LI12100D)的脂质堆积/脂质生成的抑制百分率。
[0215] 表4
[0216] 番荔枝衍生试剂的消脂活性
[0217]
[0218] 例19
[0219] 番荔枝甲醇提取物(LI12100)对3T3-L1脂肪细胞中脂肪细胞标记PPARγ,ADRP,CD36,aP2,CEBPα,CEBPβ,围脂滴蛋白的抑制:3T3-L1小鼠前脂肪细胞培养在含有2mM谷氨酸盐,4.5g/L葡萄糖和10%胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(DMEM)中。将等量的细胞植入24孔培养板的每个孔中。先用5和10μg/mL of LI12100分别预处理细胞,然后再加入分化媒介,包括500nM胰岛素,1.0μM地塞米松,and0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理48小时。之后用含有或不含有LI12100的后分化媒介(含有100nM胰岛素的DMEM)再次孵化细胞。最后将获得的细胞用磷酸盐缓冲盐水冲洗,并用裂解液裂解。蛋白提取物在14,000g下澄清20分钟。使用考马斯蓝染料通过布拉福德法检测蛋白含量,细胞裂解物在使用前分装储存在-80℃温度下。对脂肪细胞分化标记,如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),脂肪分化相关蛋白(ADRP),CEBPα,CEBPβ,CD36,脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aP2)和细胞内脂滴表面蛋白,围脂滴蛋白的表达进行的调节可以用免疫印迹法来评估。
[0220] 使用免疫印迹法来评估在含有或不含有LI12100时对脂肪细胞中生物标记分子的蛋白表达进行的抑制。简而言之,等量的细胞裂解蛋白溶解在7.5%SDS-PAGE中;然后蛋白转移到硝化纤维薄膜上。击打非特定位点后,薄膜上孵化了抗PPARγ或抗CD36或抗aP2或抗ADRP或抗CEBPα或抗CEBPβ或抗围脂蛋白抗体。最后,用West-pico化学发光底物(Pierce Biotechnology,IL,USA)形成特定的免疫反应键,而免疫印迹图像在一个柯达成像工作站(Kodak,USA)中记录下来。键强度被高密度地计算,并用各自样本中的活性表达进行规范化。图VII总结了这些信息。
[0221] 实施例20
[0222] LI12100对脂联素的调节:用Western免疫印迹法评估LI12100在3T3-L1脂肪细胞中对脂联素蛋白的调节。细胞培养,治疗方法和免疫印迹方法与例19所述的一样。在3T3-L1成熟脂肪细胞中,LI12100剂量依赖性会增强脂联素蛋白的表达。LI12100在5μg/mL和10μg/mL时分别显示出对血清中脂联素浓度产生38%和64%的改进。
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