用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物
阅读：627发布：2021-03-20
专利汇可以提供用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 主要涉及用于 治疗 肺 部病症的方法和化合物，并且更具体地涉及hIL－4突变蛋白的吸入施用和应用以治疗哮喘。，下面是用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物专利的具体信息内容。
1. 一种治疗哮喘的方法，包括向需要其的个体施用含治疗有效量的人IL-4突变蛋白的药物组合物，所述人IL-4突变蛋白包含具有修饰的野生型hIL-4的氨基酸序列，其中第一修饰是发生在野生型hIL-4蛋白第121、124或125位的一个或多个氨基酸与另一天然氨基酸的置换，并且所述人IL-4突变蛋白进一步任选地包含N-末端甲硫氨酸。
2. 权利要求1所述的方法，其进一步包括选自下列内容的第二修饰：i) 其中C-末端的修饰；ii) 其中潜在的糖基化位点的删除；iii) 蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联，以及其任意组合。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述第一修饰包括按照野生型 hIL-4编号的R121D和Y124D取代。
4. 权利要求l所述的方法，其中所述施用是全身的或局部的。
5. 权利要求l所述的方法，其中所述施用是通过吸入。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述组合物通过吸入被施用给个 体的肺并且进入所述个体的体循环。
7. 权利要求5所述的方法，其中所述组合物在施用之前被气溶胶化。
8. 权利要求1所述的方法，其中所述组合物在施用之前被雾化为 液体或气溶胶化为干粉。
9. 权利要求l所述的方法，其中所述施用每天发生一次。
10. 权利要求l所述的方法，其中所述施用每星期发生三次。
11. 权利要求10所述的方法，其中所述IL-4的量为大约0.7 mg。
12. 权利要求10所述的方法，其中所述IL-4的量为大约7.0mg。
13. 权利要求10所述的方法，其中所述IL-4的量为大约20mg。
14. 权利要求9所述的方法，其中所述IL-4的量为大约30mg。
15. 权利要求5所述的方法，其中所述施用每天发生一次。
16. 权利要求5所述的方法，其中所述IL-4的量为大约0.3mg。
17. 权利要求5所述的方法，其中所述IL-4的量为大约3.0mg。
18. 权利要求5所述的方法，其中所述IL-4的量为大约30mg。
19. 权利要求5所述的方法，其中所述IL-4的量为大约60mg。
20. 权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含药学上可 接受的载体。
21. 权利要求20所述的方法，其中所述载体选自乳酸盐、柠檬酸盐 以及蔗糖缓冲液。
22. 权利要求1所述的方法，其中所述IL-4蛋白与非蛋白质聚合物 共轭。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述聚合物是亲水的。
24. 权利要求23所述的方法，其中所述聚合物是聚乙烯吡咯烷酮。
25. 权利要求22所述的方法，其中所述聚合物是疏水的。
26. 权利要求25所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇。
27. 权利要求4所述的方法，其中所述施用是皮下施用。
28. 权利要求27所述的方法，其中所述施用每天发生两次。
29. 权利要求28所述的方法，其中所述IL-4的量为大约30 mg。
30. 权利要求27所述的方法，其中所述IL-4的量为大约25 mg。
31. 权利要求1所述的方法，其中所述IL-4的量为大约0.1至1 mg/kg。
32. 监测用于治疗患有哮喘的个体的治疗用药法的方法，其包括确 定治疗过程中肺功能和炎症的变化，其中肺功能的增强或炎性细胞的 减少可表示积极治疗效果。
33. 权利要求32所述的方法，其中肺功能的增强是由改善的即时哮 喘反应、改善的后期哮喘反应或气道高反应性的减少决定。
34. 权利要求32所述的方法，其进一步包括确定治疗过程中BAL 噬酸性粒细胞浓度的变化，其中BAL噬酸性粒细胞浓度的降低可表示 积极治疗效果。
35. 权利要求32所述的方法，其进一步包括确定与治疗前呼出的一 氧化氮相比较，治疗过程中呼出的一氧化氮的变化，其中一氧化氮浓 度的减少可表示积极治疗效果。
36. 权利要求32所述的方法，其中所述治疗包括权利要求1所述的 治疗。
37. 包含治疗有效量的突变人IL-4蛋白和药学上可接受的载体的治 疗组合物，所述突变人IL-4蛋白包括具有修饰的野生型hlL-4的氨基 酸序列，其中第一修饰是发生在野生型hlL-4蛋白第121、 124或125 位的一种或多种氨基酸与另一天然氨基酸的置换，并且所述突变人 IL-4蛋白进一步任选地包括N-末端甲硫氨酸，其中所述组合物是气溶 胶化的。
38. 权利要求37所述的组合物，其中所述蛋白质进一步包括选自下 列内容的第二修饰：i) 其中C-末端的修饰；ii) 其中潜在的糖基化位点的删除；iii) 蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联，以及其任意组合。
39. 权利要求37所述的组合物，其中所述蛋白质的所述第一修 饰包括按照所述野生型WL-4编号的R121D和Y124D取代。
40. 权利要求35所述的组合物，其中所述载体选自乳酸盐、拧 檬酸盐或蔗糖缓冲液。
41. 权利要求37所述的组合物，其中所述IL-4蛋白与非蛋白质 聚合物共轭。
42. 权利要求4】所述的组合物，其中所述聚合物是亲水的。
43. 权利要求42所述的组合物，其中所述聚合物是聚乙烯吡咯 烷酮。
44. 权利要求41所述的组合物，其中所述聚合物是疏水的。
45. 权利要求44所述的组合物，其中所述聚合物是聚乙二醇。
46. 包含治疗有效量的突变人IL-4蛋白和药学上可接受的载体 的治疗性气溶胶化的组合物，所述突变人IL-4蛋白包括具有修饰的野 生型hlL-4的氨基酸序列，其中第一修饰是发生在野生型hlL-4蛋白第 121、 124或125位的一种或多种氨基酸与另一天然氨基酸的置换，并 且所述突变人IL-4蛋白进一步任选地包括N-末端甲硫氨酸，其中所述 IL-4蛋白与非蛋白质聚合物共轭。
47. 权利要求46所述的组合物，其中所述蛋白质进一步包括选 自下列内容的第二修饰：i) 其中C-末端的修饰；ii) 其中潜在的糖基化位点的删除；iii) 所述蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联，以及其任意组合。
48. 权利要求46所述的组合物，其中所述蛋白质的所述第一修 饰包括按照所述野生型ML-4编号的R121D和Y124D取代。
用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物
发明背景 技术领域
[0001]本发明主要涉及用于治疗肺部病症的方法和化合物，并且 更具体地涉及治疗哮喘的hlL-4突变蛋白的使用。
背景技术
[0002]白细胞介素-4 (Interleukin-4 (IL-4))和白细胞介素-13 (Interleukin-13 (IL-13))是在几种靶细胞上具有广谱生物学效应的多 效细胞因子，其在遗传性过敏和哮喘的发病机理中很重要。IL-4越来 越多地被认为是启动"Th2型"炎症反应，形成遗传性过敏和哮喘发展所 必须的潜在环境的关键细胞因子。IL-4的效应包括T细胞和B细胞的 激活、增殖和分化。在B-淋巴细胞增殖过程中，IL-4通过调节从IgG 到IgE的类别转换因而促进过敏反应的发展而作为分化因子起作用。 而IL-13现在被认为更可能是下游效应细胞因子。IL-13在包括气道高应答性（airways hyperresponsiveness(AHR))和杯状细胞增生-两者
是哮喘的两个主要特征的诱导的效应中起主要作用。然而，在这两种 细胞因子的效应中有相当多的冗余。
是哮喘的两个主要特征的诱导的效应中起主要作用。然而，在这两种 细胞因子的效应中有相当多的冗余。
[0003]与这两种细胞因子的结合和信号有关的效应中的冗余可以 通过它们共享共同的受体来解释。IL-4受体a链（IL-4Ra)具有两个 能与其结合并传出信号的结合伙伴（binding partner) 。 IL-4Ra多肽与 细胞因子共同受体Y链"c)结合形成1型IL-4R异二聚体。IL-4Ra 多肽也可以与IL-13受体al链结合形成异二聚体，以产生2型IL-4R (akalL-13R) 。 IL-4激活1型和2型受体，而IL-13只激活2型受体 异二聚体。两种受体，在被激活时，通过信号转导及转录激活因子6 (signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6))的转录因子传出信号。虽然IL-4可以唯一地启动T-辅助细胞（Th2)通路，因为 只有1型受体定位于T-淋巴细胞，所以IL-13可能更多并且更有效。 因此在由这两种细胞因子的产生所调节和控制的疾病状态中，抑制这 两种细胞因子是重要的。
[0004]最近，在人IL-4 (hlL-4)突变蛋白中已经观测到某些拮抗 和部分拮抗的性质，其中天然存在于野生型的位置120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127或128的一个或多个上的氨基酸（一种或多种） 己经被一种或多种天然的氨基酸置换。因此，这些hlL-4突变蛋白被描 述为有价值的治疗剂，在治疗超射（overshooting)或不当调节的免疫 反应以及自身免疫病中用作药剂。发明概述
[0005]本发明基于，部分地，基于这样的发现——突变IL-4蛋白 在治疗患有哮喘的个体中是有用的。本发明部分地基于这样的发现， 具有R121D和Y124D取代的突变IL-4蛋白能够以药物组合物被施用 以拮抗野生型hlL-4和野生型hIL-13与受体的结合。
[0006]因此，在一个实施方式中，本发明提供通过施用突变IL-4 蛋白治疗哮喘的方法。在一个实施方式中，用于治疗哮喘的方法包括 向需要其的个体施用含有治疗有效量的IL-4突变蛋白的药物组合物， 该IL-4突变蛋白包含具有按照野生型hlL-4编号的R121D和Y124D 取代的野生型ML-4的氨基酸序列。在一个方面，在施用之前组合物被 气溶胶化，并且，因而可以通过吸入法被施用，每天施用一次或两次。 每剂量突变IL-4蛋白的典型的量为大于或等于0.5 mg喷雾器中的标称 剂量。个体可以是哺乳动物，如人类。
[0007]含有本发明的突变IL-4蛋白的药物组合物典型地包含药学 上可接受的载体，如盐水。在其它实施方式中，突变IL-4蛋白与非-蛋白聚合物共轭。在本发明中有用的非-蛋白聚合物包括，但不限于， 亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮，以及疏水聚合物，如聚乙二醇。
[0008]本发明进一步涉及监测用于治疗患有哮喘个体的治疗用药 法（therapeutic regimen)的方法。在一个实施方式中，监测用于治疗 患有哮喘个体的治疗用药法的方法包括确定肺功能的变化，其包括即时和后期哮喘反应、气道高反应性以及在支气管肺泡灌洗(brochoalveolar lavage (BAL))、血清或呼气中发现的炎症标记物。通 过检测个体的气道或血液中的炎性细胞和介质的流量上的变化完成监 测。在另一实施方式中，监测用于治疗患有哮喘的个体的治疗用药法 的方法包括：确定治疗过程中支气管肺泡灌洗（BAL)的嗜酸性粒细 胞浓度的变化。治疗过程中支气管肺泡灌洗（BAL)的嗜酸性粒细胞 浓度的减少，可表示积极的治疗效果。在进一步的实施方式中，监测 方法包括：确定相比于治疗之前呼出的一氧化氮在治疗过程中呼出的 一氧化氮的浓度。治疗过程中或治疗后呼出的一氧化氮的浓度的降低， 可表示积极的治疗效果。
附图简述
附图简述
[0010]图1是显示灵长类哮喘模型治疗干涉方案的图示。
[0011]图2A和2B是显示在非-人类灵长类中，用皮下输送IL-4RA对过敏原-诱导的气道高应答性和气道嗜曙红细胞过多进行治疗干涉的 结果的图示。
[0013]图4是一幅图示，显示每日皮下施用的IL-4RA作用于哮喘患 者中需要P激动剂的不良事件（AEs)的结果。
[0014]图5是一幅图示，显示IL-4RA (乳酸盐制剂）在Aerogen Aeroneb喷雾器中雾化之前和雾化之后的TF-l/IL-4增殖活性分析的生 物活性评价。
[0015]图6是一幅图示，显示每日两次输送（BID)的吸入的IL-4RA 对非人类灵长类中抗原-诱导的气道高应答性的影响。
[0016]图7是一幅图示，显示每日两次输送（BID)的吸入的IL-4RA 对非人类灵长类中抗原-诱导的气道（BAL)嗜曙红细胞过多的影响。[0017] 图8A和8B是显示IL-4RA (乳酸盐制剂）在Pari LC Plus喷 雾器中雾化之前和雾化之后的TF-l/IL-4增殖活性分析的生物活性评价 的图示。
[0018]图9是一幅图示，显示每日两次吸入的IL-4RA对哮喘患者治 疗之前（筛选）和治疗结束时（第27天）的抗原攻击反应的影响。
[0019]图10是一幅图示，显示一氧化氮浓度的对数与在哮喘患者的 筛选第2天及第27天的药物治疗。
[0020]图11是显示局部输送吸入的IL-4RA获得的血浆浓度低于在皮 下施用IL-4RA的临床试验中获得的血浆浓度的图示。
[0021]图12是一幅图示，显示与在非人类灵长类中的皮下输送相比， 在通过吸入输送时，IL-4RA在较低的血浆浓度下更有效。
[0022]图13A和13B分别显示野生型IL-4和突变IL-4的核酸和氨基 酸序列。发明详述
[0023]本发明是基于这样的发现——WL-4突变蛋白对于治疗哮喘是 有用的。因此，本发明公开了用治疗有效量的突变IL-4蛋白治疗哮喘 的方法和组合物以及含有该突变蛋白的药物组合物。
[0024]本发明不限于此处描述的具体的方法、步骤、细胞系、载体、 试剂等，因为这些可能会发生变化。也应理解此处使用的术语只被用 于描述具体的实施方式的目的，并不意图限制本发明的范围。如此处 和在所附的权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指明，单数形 式"一 （a) " 、 "一 （a)"和"该（the)"包括复数涵义。
[0025]术语"哮喘"此处被用于一般描述慢性呼吸疾病，其常常由过 敏引起，以呼吸困难（labored breathing)、胸部收缩以及咳嗽的突然 复发为特征。在典型的哮喘反应中，IgE抗体主要地附着到位于与细支 气管和小支气管紧密连接的肺间质组织中的肥大细胞上。进入气道的9抗原将因此与肥大细胞-抗体复合物反应，引起几种物质释放，所述物 质包括但不限于，白细胞介素细胞因子、趋化因子以及花生四烯酸来 源的介质，导致支气管收縮、气道高反应性、过量粘液分泌和气道炎 症。因此，在本发明的某些实施方式中，哮喘的治疗可以包括气道高 反应性的治疗和/或肺部炎症的治疗。
[0026]此处所用的术语"抗原"指在进入到体内时剌激抗体产生的任 何物质。抗原包括昆虫、动物和植物蛋白、毒素、细菌、外源血细胞 以及移植器官的细胞。"过敏原"指在个体中引起过敏性免疫反应的 任何物质。典型地，过敏原来自食物、植物、昆虫或动物，其使气道 发炎并且引起粘液产生以及支气管收縮。
[0027]此处所用的术语"个体"指所述方法实施的任何个体或患者。 一般地，所述个体是人，虽然如本领域技术人员将理解的，所述个体 可以是动物。因此，其它的动物，包括哺乳动物如啮齿动物（包括小 鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠）、猫、狗、兔，农场动物包括奶牛、马、山 羊、绵羊、猪等，以及非人类灵长类（包括猴子、黑猩猩、猩猩和大 猩猩）被包括在个体的定义内。
[0028] 如此处所用的，术语"突变的人IL-4蛋白（mutanthumanIL-4 protein)"、"修饰的人IL-4受体拮抗剂"、"mhlL-4" 、 "IL-4突 变蛋白"、"IL-4拮抗剂"、和其等价物可互换使用，并在发明的范 围之内。这些多肽和其功能片段是指其中已经对成熟人IL-4蛋白进行 特定氨基酸取代的多肽。这些多肽包括本发明的mlL-4组合物，其被 施用给需要治疗哮喘的个体。尤其是，本发明的mhlL-4至少包括 R121D/Y124D取代对（"IL-4RA，，）（图13B)。
[0029]如此处所用的，"功能片段"是具有IL-4拮抗活性的多肽， 包括更小的肽。具有hlL-4修饰的mhlL-4的这些和其他方面在美国专 利编号第6,335,426; 6,313,272;和6，028,176，号中被描述，其全部内容 通过引用于此。[0030]如此处所用的，"野生型IL-4 (wildtype IL-4)"或"wtlL-4"和其等价物可互换使用，意即人白细胞介素-4——天然的或重组的，具 有129个通常出现的天然人IL-4氨基酸序列，如在美国专利第 5,017,691号中所公开的，在此通过引用并入。进一步，此处描述的被 修饰的人IL-4受体拮抗剂可以具有各种插入和/或删除和/或与非蛋白 质聚合物偶联，并且按照wtlL-4进行编号，意即所选择的具体氨基酸 是在wtlL-4中通常存在的相同氨基酸。因此，本领域普通技术人员将 会理解，在位点，例如第121位（精氨酸）、第124位（酪氨酸）和/ 或第125位（丝氨酸）上通常出现的氨基酸，可以在突变蛋白中被移 动。因而，半胱氨酸残基在氨基酸位点如第38位、第102位和/或第 104位上的插入可以在突变蛋白上移动。然而，被移动的丝氨酸（S)、 精氨酸（R)、酪氨酸（Y)或插入的半胱氨酸（C)的位置可以通过 检査和关联这些侧翼氨基酸与wtlL-4中那些在丝氨酸、精氨酸、酪氨 酸或半胱氨酸侧翼的氨基酸确定。
[0031]进一步，编码人IL-4的DNA序列可以包括或不包括编码信号 序列的DNA序列。这种信号序列，如果存在，应该是被选择用于表达 IL-4突变蛋白的细胞所识别的信号序列。其可以是原核的、真核的或 是两者组合。其也可以是天然IL-4的信号序列。信号序列的包含取决 于是否期望从制备IL-4突变蛋白的重组细胞中分泌出IL-4突变蛋白。 如果所选择的细胞是原核的， 一般优选不编码信号序列但包括N-末端 甲硫氨酸的DNA序列以指导表达。如果所选的细胞是真核的， 一般优 选编码的信号序列，并且最优选被使用的是野生型IL-4信号序列，如 在美国专利第6,028,176号中所公开的，在此通过引用并入。在一个说 明性的例子中，本发明的突变人IL-4蛋白包括具有修饰的野生型hlL-4 的氨基酸序列，其中第一修饰是：在野生型的人白细胞介素-4蛋白的 第121位、第124位或第125位发生的氨基酸中的一个或多个与另一 天然氨基酸的置换，并且本发明的突变人IL-4蛋白进一步任选地包含 N-末端甲硫氨酸。在另一个例子中，突变蛋白进一步包括选自下列的 第二修饰：i) 其中C-末端的修饰；ii) 其中潜在糖基化位点的删除；
m) 该蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联，以及其任意组合。
在另一个例子中，突变蛋白包括含有按照野生型hlL-4编号的R121D 和Y124D取代的蛋白质的第一修饰。
m) 该蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联，以及其任意组合。
在另一个例子中，突变蛋白包括含有按照野生型hlL-4编号的R121D 和Y124D取代的蛋白质的第一修饰。
[0032]如此处所用的，"突变蛋白（mutein)"指作为天然突变或由 本领域技术人员创造的对任何蛋白质进行定点氨基酸取代的结果而出 现的任何蛋白质。"糖基化（glycosylation)"指将糖基添加到蛋白质， 以形成糖蛋白。如此，该术语包括天然存在的糖基化和合成的糖基化， 如碳水化合物骨架与天冬酰胺残基的侧链的连接（N-糖基化）或糖一 —优选的N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖与丝氨酸、苏氨酸、4-羟基 脯氨酸或5-羟基赖氨酸的偶联（O-糖基化）。
[0033]因此，本发明涉及包含一种或多种hlL-4突变蛋白的组合物， 其是人白细胞介素-4和/或人白细胞介素-13的拮抗剂，干扰这两种白 细胞介素与1型和2型IL-4R的结合。这种组合物对于治疗患有哮喘 或哮喘相关的症状的个体有用。hlL-4突变蛋白可以进一步包括除了第 121、 124或125位的替换（一种或多种）之外的修饰。为了提高hlL-4 突变蛋白的稳定性、为了延长生物半衰期或为了方便制备和纯化过程， 进行这些修饰。如此处所使用的，术语"激动剂（agonist)"指可有 效结合到受体，并且模拟其生物学活性的物质或类似物。术语"拮抗 剂（antagonist)"指可结合到受体但不引起正常的生物学反应，并且 阻断或部分阻断激动剂的活性的物质。
[0034]已经在文献中报道了 IL-4的拮抗剂。作为拮抗剂起作用的 IL-4的突变体包括IL-4拮抗剂突变蛋白IL-4/Y124D (Kruse, N.， Tony, H. P.， Sebald， W., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement,五m方o
[0035]在一个实施方式中，突变蛋白在各种氨基酸残基位置，特别是 在第28、 36、 37、 38、 102、 104、 105或106位上偶联到非蛋白聚合 物上。氨基酸位置按照野生型IL-4(即人白细胞介素-4)氨基酸序列（见 美国专利第5,017,691，在此通过引用并入）进行编号。非-蛋白聚合物 包括，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，如在美国专利第4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4，791，192或4,179,337中所公开的，其 全部内容通过引用并入于此。
[0036]因此，利用熟知技术，本领域技术人员将能够确定如此处列 出的多肽和其功能片段的合适突变体。同样地，熟练的技术人员可以 确定（1)可以通过定向于被认为是对活性不重要的区域而可以改变 的多肽合适区域，而不破坏活性（见Kreitman等，（1994)Biochemistry 33:11637-11644，通过引用并入在此）；（2)在相似的多肽中保守的多 肽残基和部分；和（3)对于生物学活性或对于结构可能是重要的区 域，其可能更容易被保守氨基酸取代而不破坏生物学活性或没有不利 地影响多肽结构。
[0037]此外，本领域普通技术人员能回顾结构-功能研究，识别类似 多肽中对活性或结构重要的残基。鉴于这样的比较，普通技术人员能 够预测蛋白中相对应于类似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残 基之氨基酸残基的重要性。对于这种预测的重要氨基酸残基，本领域 普通技术人员能选择出（opt for)化学上相似的氨基酸取代。
[0038]本领域普通技术人员也能分析相似多肽中的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。根据这样的信息，本领域普通技术人员能预 测与其三维结构相关的多肽的氨基酸残基排列。在某些实施方式中，
本领域普通技术人员可选择不要对预测将处于蛋白表面上的氨基酸残
13基进行基团变化，因为这样的残基可能参与和其它分子的重要相互作
用。而且，本领域普通技术人员可制备出在每个被需要的氨基酸残基
上含有单个氨基酸取代的待测变异体。然后，应用本领域已知的活性
分析方法筛选变异体。这样的变异体能被用于收集关于合适的变异体
的信息。举例，如果某人发现一个特定的氨基酸的改变导致受到破坏
的、被不期望降低的、或不适合的活性，那么具有这种改变的变异体
将被避免。换言之，基于从这类常规实验中收集的信息，本领域普通
技术人员能容易地确定这样的氨基酸，在那里进一步的取代应被避免， 或者是在单独情况下或与其它突变一起组合起来时被避免。
本领域普通技术人员可选择不要对预测将处于蛋白表面上的氨基酸残
13基进行基团变化，因为这样的残基可能参与和其它分子的重要相互作
用。而且，本领域普通技术人员可制备出在每个被需要的氨基酸残基
上含有单个氨基酸取代的待测变异体。然后，应用本领域已知的活性
分析方法筛选变异体。这样的变异体能被用于收集关于合适的变异体
的信息。举例，如果某人发现一个特定的氨基酸的改变导致受到破坏
的、被不期望降低的、或不适合的活性，那么具有这种改变的变异体
将被避免。换言之，基于从这类常规实验中收集的信息，本领域普通
技术人员能容易地确定这样的氨基酸，在那里进一步的取代应被避免， 或者是在单独情况下或与其它突变一起组合起来时被避免。
[0039]大量的科学出版物致力于二级结构的预测。见Moult，1996， C虹（9;?. i/?肠tecA 7:422-427; Chou等，1974，肠c/?e/z^/y 13:222-245; Chou et al, 1974，肠c/?,."2y 113:211-222; Chou 等，1978，f"^z/?o7 7?e〗at. Areas 历'o7 47:45—148; Chou等， 1979， ^7/?. 7?er.万j'oc/?e瓜47:251—276;禾卩Chou等，1979， A.o/?力j^. / 26:367-384。而且，目前，计算机软件可用于辅助预测二级结构。 一种预测二级结构的方法是基于同源性模型。举例，序列同一性在约 30°/。以上或者序列相似性在40%以上的两个多肽或蛋白质，常常具有相 似的结构拓扑学。最近增大的蛋白质结构数据库增强了二级结构的预 测能力，包括处于多肽的或蛋白质的结构内的潜在折叠数目。见Holm 等，1999， 7V"c丄力cjV. /Pes. 27:244-247。据认为（Brenner等，1997， O/rr. 5"tract. 7:369-376)， 一个给定的多肽或蛋白质具有有限数目的折叠，并且一旦解析了临界数——5个结构，结构预测将 会变得显著地更为精确。
[0040]在一个实施方式中，本发明提供了可用作哮喘治疗方案一部分 的方法。所述方法包括施用含治疗有效量的本发明的突变蛋白的药物 组合物，其中氨基酸121 (精氨酸）和氨基酸124 (酪氨酸）被天冬氨 酸取代（IL-4RA，见图2)。如此处提供的，突变蛋白的进一步修饰 可以包括下列的一种或多种：分子的N末端和/或C末端被修饰、 一个 或多个聚乙二醇分子被共价键合到所述分子，所述分子中存在的糖基 化位点被部分地或全部地删除。[0041]术语"施用（administration)"或"进行施用（administering)" 被定义为包括给需要治疗的个体提供本发明的化合物或药物组合物的 行为。术语"治疗有效量(therapeutically effective amount)"或"有 效量（effective amount)"表示将引起组织、系统、动物或人类的生物 学或医学反应的化合物或药物组合物的量，该反应是研究者、兽医、 医生或其他的临床医生所追求的。
[0042]在一个实施方式中，药物组合物包括具有在+2氨基酸位置上 插入氨基酸的N-末端修饰的突变蛋白。在另一实施方式中，突变蛋白 具有C-末端的修饰，其是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个 和至少5个氨基酸的删除。然而，从C-末端删除5个以上氨基酸可能 影响突变蛋白的活性。来自上面和本文提到的任何修饰的突变蛋白的 活性，可用相关申请和/或专利中以前描述的任何方法和本文描述的 方法（如，在美国申请第10/820,559号中描述的生物分子相互作用分 析(Biomolecular Interaction Analysis, BIA)禾卩增殖分析）来确定；在此通 过引用引入其全部内容。
[0043]在本发明的方法中有用的突变蛋白可以进一步包括糖基化变 异体，其中糖基化位点的数目和/或类型与亲本多肽的氨基酸序列相比 已经发生改变。在某些实施方式中，蛋白质变异体包括比天然蛋白更 多或更少数目的N-联接糖基化位点。N-糖基化位点以序列Asn-X-Ser 或Asn-X-Thr为特征，其中指定为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸 之外的任何氨基酸残基。氨基酸残基取代产生的这种序列为添加N-联接糖链提供了一个新的潜在位点。可选地，消除此序列的取代将会去 除已经存在的N-联接糖链。也提供了N-联接糖链的重排，其中一个或
多个N-联接糖基化位点（通常它们是天然存在的）被消除，而一个或 多个新的N-联接位点产生。
多个N-联接糖基化位点（通常它们是天然存在的）被消除，而一个或 多个新的N-联接位点产生。
[0044]额外的变异体包括半胱氨酸变异体，其中，与亲本氨基酸序列 相比， 一个或多个半胱氨酸残基被加入、被删除或取代另外的氨基酸 (如丝氨酸）。当蛋白质必须重新折叠成生物活性的构象时，如不溶 性的包含体分离后，半胱氨酸变异体可能是有用的。在一个实施方式中，半胱氨酸变异体将会具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基，以及 具有偶数个半胱氨酸，以便使由未配对半胱氨酸所引起的相互作用最 小化。在另一实施方式中，半胱氨酸变异体将允许至少一个非-蛋白质聚合物，如聚乙二醇（PEG)分子，被位点-特异性地偶联到突变蛋白 上。
[0045]更进一步地，变异体包括，但不限于，突变，例如取代、添 加、剔除或其任何组合；并且，其通常根据本文描述的方法以及本领 域己知的方法（见，举例，Sambrook等，分子克隆：实验室手册 (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL),第三 版，2 0 0 1，冷泉港实验室，N.Y;以及Berger和Kimmel，酶学方 法（METHODS IN EMZYMOLOGY)， 1 5 2巻，分子克隆技术指南 (Guide to molecular Cloning Techniques), 1987， Academic Press, Inc., San Diego， CA.,通过引用在此引入），应用一种或多种诱变寡核苷酸 (一种或多种），通过定点突变产生。
[0046]本发明的氨基酸取代包括这些取代：（1 )降低对蛋白水解的 易感性，（2 )降低对氧化的易感性，（3)改变形成蛋白质复合物 的结合亲和性，（4 )改变结合亲和性，和/或（5 )对这类多肽赋予 或改变其它理化或功能性质。根据某些实施方式， 一个或多个氨基酸 取代（并且在某些情况下，保守氨基酸取代）可以在天然存在的序列 中（如在多肽的形成分子间接触的结构域(一个或多个)之外的部分中） 进行。
[0047]因此，保守氨基酸取代典型地基本上不改变核苷酸序列的结构 特征（例如，氨基酸置换将不倾向于打破核苷酸序列中出现的螺旋， 或者破坏表征核苷酸序列的其它类型的二级结构）。本领域公认的多 肽二级和四级结构的实例在蛋白质、结构和分子原理（PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRICIPLES ) ( Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman and Company, New York;蛋白质结构概论 (INTRODUCTION TO PROTEIN STUCTURE， C. Branden和J. Tooze，eds,) , 1991， Garland publishing, New York, N.Y.;以及Thornton等， 1991, A^we 354:105中进行了描述，在此通过引用引入其每一个。
[0048]肽类似物（peptide analogs)通常作为具有类似于模板肽的性质 的非肽类药物，被用在制药工业上。这些类型的非肽化合物被称为"肽 模拟物(peptide mimetics)"或者"模拟月太(peptidomimetic)"。见 Fauchere, 1986，爿dv. ^wg7?&s.l5:29; Veber & Freidinger, 1985, p.392;和Evans等.，1987,乂 A/^/. CTzem. 30:1229，在此通过引用将其 引入。这样的化合物通常在计算机分子建模的辅助下被开发出来。与 有治疗有用的肽结构上相似的肽模拟物，可被用于产生相似的治疗或 预防效果。通常，模拟肽与范例多肽（即，具有生化性质或药理学活 性的多肽）——如人抗体——结构类似，但是具有一个或以上的肽键: 被通过本领域内熟知的方法，任选地由选自:-CH2-NH-、 -CH2-S-、 -CH2-CH2-、 -CHK:H-(顺式和反式）、-COCH2-、 -CH(OH)CH2^[] -(^11280-的键所置换。在某些实施方式中，为产生更稳定的肽，可以使 用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或者以上氨基酸 (如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸）。此外，包含有共有序列或者基本相 同的共有序列变异的受限肽（constrainedpeptide)可通过本领域内已知 的方^去制备（Rizo & Gierasch， 1992， i?ev. 61:387,在此通过引用加以引入）；例如，通过添加能形成使肽环化的分子内二硫键 桥的内部半胱氨酸残基进行制备。
[0049]在另一实施方式中，药物组合物包括具有另外的氨基酸取代的 突变蛋白（如，IL-4RA)，包括那些能使至少一种非-蛋白聚合物，如 聚丙烯乙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇（PEG)分子位点-特异性偶联到 突变蛋白的取代。PEG的位点特异性偶联，例如，使具有聚乙二醇化 (PEG化）分子的益处的修饰突变蛋白产生，即增加了血浆半衰期（例 如，至少比未被修饰的IL-4RA多2到10倍，或者10到100倍），同 时相对于非特异性聚乙二醇化策略，如N-末端和赖氨酸侧链聚乙二醇 化，保持更大的效力。提供有效聚乙二醇化的方法在美国申请第 10/820,559号中被描述，在此通过引用加以引入。IL-4突变蛋白必须被适当地纯化以使其有效的PEG化。纯化方法在美国申请第10/820,559 号中被描述（见实施例2)。
[0050]可以使用本领域内已知的任何方法分析被修饰的IL-4突变蛋 白受体拮抗剂与IL-4受体的Ki，包括美国申请第10/820,559号中描述 的实时双分子相互作用分析(Bimolecular Interaction Analysis (BIA))技 术（见实施例4)。应用美国申请第10/820,559号中描述的增殖分析方 法能够分析修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂抑制免疫细胞增殖反应的 能力。
[0051]通过上面的分析方法筛选侯选物，许多具有上述特征的被修饰 的IL-4突变蛋白受体拮抗剂在美国申请第10/820,559号中被确定。在 一种实施方式中，非蛋白聚合物（如聚乙二醇）至少连接到氨基酸残 基位置第38、 102和/或104位上。
[0052]在另一实施方式中，本发明提供选择能使多肽表达后正确折叠 的hlL-4氨基酸取代的特异性位点的方法。相对于未修饰IL-4RA与IL-4 和IL-13结合的亲和力降低，被修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂与IL-4 和IL-13结合的亲和力降低不大于100倍。相对于未修饰IL-4RA抑制 IL-4和IL-13介导的活性的效价损失，被修饰的IL-4突变蛋白受体拮 抗剂抑制IL-4和IL-13介导的活性的效价损失不超过10倍。此外，被 修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂具有比未修饰IL-4RA至少长2至10 倍的血浆半衰期。
[0053]上面的多肽变异体是举例说明在本文所要求保护的方法中所 使用的被修饰的人IL-4多肽的类型，但不是穷尽列举本发明体现的所 要求保护的发明的变异体类型。符合权利要求的标准的上述多肽的衍 生物也应该被考虑。遵从此处和实例中所教导的方法，能够根据功效 筛选所有多肽和其功能片段。
[0054]通过遗传操作，例如在大肠杆菌中，hlL-4可以作为重组蛋白 (rhlL-4)被制备。适合重组产生rhlL-4的宿主细胞是本领域普通技术 人员已知的，包括原核细胞，比如大肠杆菌CE. co//)、芽孢杆菌(^c/〃w)和假单孢杆菌属(尸化w&"w"cw)的菌株（Kung, H,F, M. Boublik， V. Manne， S. Yamazaki禾卩E.Gaarcia， Cwr. 7b/?/cs /" Ce〃. 26:531-542， 1995)或者单细胞真核细胞如酿酒酵母(&cc/7"ro"y;c^(Bemis， L. T, F. J. Geske和R. Strange, wef/zo^j CW/5/o/" 46:139-151, 1995)。用于重组产生的宿主细胞也可以来源于多细胞真核生物，包 括无脊椎动物如昆虫（草地夜蛾";?o^fo/^ra,/h^》er^) Sf9细胞）
(Altmann F., E. Staudacher, IB Wilson,禾口 L Marz, Glycoconj J., 16:109-123,1999)和脊椎动物细胞，包括许多哺乳动物细胞系，包括 小鼠成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO/-DHFR) (Urlauband Chasin，尸rocA^」ccM?5W 77:4216， 1980)、仓鼠乳鼠肾细胞系（9BHK， ATCCCCL10);由SV40转化的猴肾CV1细胞系（COS-7， ATCC CRL 1651 )和人胚肾细胞系293(Tartaglia等，/Voc Ato JcadSc/ 88:9292-9296: 1991禾口 Pennica等，J说o/. O?e附.267:21172-21178， 1992)。
(Altmann F., E. Staudacher, IB Wilson,禾口 L Marz, Glycoconj J., 16:109-123,1999)和脊椎动物细胞，包括许多哺乳动物细胞系，包括 小鼠成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO/-DHFR) (Urlauband Chasin，尸rocA^」ccM?5W 77:4216， 1980)、仓鼠乳鼠肾细胞系（9BHK， ATCCCCL10);由SV40转化的猴肾CV1细胞系（COS-7， ATCC CRL 1651 )和人胚肾细胞系293(Tartaglia等，/Voc Ato JcadSc/ 88:9292-9296: 1991禾口 Pennica等，J说o/. O?e附.267:21172-21178， 1992)。
[0055]任何合适的宿主可以被用于产生本发明的IL-4突变蛋白，所 述宿主包括细菌、真菌（包括酵母）、植物、昆虫、哺乳动物或其它 合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。同样地，这些宿 主细胞可以包括熟知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单孢杆菌属、 芽孢杆菌、霉菌的菌株，真菌、酵母、昆虫细胞如草地夜蛾（SF9)， 动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞（CHO)和小鼠细胞如NS/0，非洲绿猴 细胞如COSl、 COS7、 BSC1、 BSC40禾卩BNT10，和人类细胞，以及 组织培养的植物细胞。尽管细菌和酵母已经是许多包括rhlL-4在内的 重组多肽的标准重组宿主细胞，但是最近来自高等植物的转化细胞能 够表达人重组蛋白如抗体（Hiatt， A. T.和J. K, Ma, /脱i?ev. /仿m訪o/.， 10:139-152， 1993)和血红蛋白（Theisen， M, in Chemicals Via Higher Plant Bioengineering, F. Shahidi等，eds， Plenum Publisher, NY， P.211-220,1999)。植物生物技术为高效生产异源多肽提供了许多益 处，并且这种方法对本文描述的被修饰的人IL-4受体拮抗剂——包括 mhlL-4和它的衍生物——的产生可以是有用的（也见植物技术：新产 品禾口应用(Plant Technology: New Products and Application) ， John Hammond，等，eds., Springer, N.Y.， 1999)。[0056] IL-4或IL-13与1型或2型IL-4受体的稳定复合物的形成使得 受体信号传导和随之产生的下游事件被认为在所述个体中引起哮喘症 状。因此，在一个实施方式中，本发明提供向个体施用治疗有效量的 修饰人的IL-4受体拮抗剂——包括IL-4RA——的方法，以改善与哮喘 有关的症状。数据表明，IL-4RA以与wtlL-4相似的结合率和解离率（on and off rates)结合到IL-4受体a链，其或者抑制yc (1型）或者抑制 IL-13Ra装配成可信号转导下游事件的受体复合物（见表l)。因此，IL-4RA阻断IL-13Ral或^的募集来与IL-4受体a链形成稳定的异 二聚体复合物（A丄.Andrews等，ATS 2004)。
表1: IL-4R与固定化的IL-4受体a链的表面等离子体共振（Biacore binding)结合
table see original document page 20[0057]尽管本发明描述了各种剂量，但本领域普通技术人员将会理 解，对于任何需要治疗的特定个体，具体剂量水平和剂量频率可能会 变化，并且将取决于许多因素。这些因素包括具体多肽或其功能片段 的活性、该化合物的代谢稳定性和作用持续时间、年龄、体重、总体 健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物联合、具体 病症的严重性、以及经受治疗的主体。然而， 一般地，剂量接近对于 具体化合物的已知施用方法而言典型的的剂量。因此，IL-4RA的典型 剂量将会是大约0.1至1 mg/kg。例如，对于IL-4RA的施用，通过气 溶胶吸入的近似剂量将是大约0.3mg至60mg。近似剂量包括，但不限 于，大约0.3mg，大约0.5mg，大约l.Omg，大约3.0mg，大约20mg， 大约30mg或大约60mg，每天或每周一次或多次将这些剂量施用给个 体。在另外的说明性例子中，通过皮下注射施用IL-4RA的近似剂量包 括但不限于，大约25mg。通过施用IL-4RA的治疗可以持续几天、几 周、几年或无限期地继续下去，只要症状持续。所以，适当的剂量和治疗用药法可以由本领域普通技术人员使用本文提供的那些常规方法 确定。
表1: IL-4R与固定化的IL-4受体a链的表面等离子体共振（Biacore binding)结合
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