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发明概述
在此根据本发明的一种实施方案，提供通式(I)的化合物，

其中，
C是指环A和含有a、b、d和e的环所共享的螺环碳原子(spiro carbon)；
A选自：

和
其中R选自H、C1-C8直链烷基或支链烷基，或-CH2-P(＝O)(OH)2；
a为-O-或-S-；
b为-CR1R2或-C(R1)＝；
d选自＝N-、-C(＝O)-、-C(＝S)-和＝N(R3)＝O；
e选自-CH2-、-CHR4-、-NH-、-NR5-、-N(SO2R6)-和-N(C(＝O)R6)-；
R，R1，R2，R3，R4中的每一个独立地选自H，任选地被一个、两 个或三个苯基所取代的C1-6烷基，C1-6烷氧基，C2-6羟基烷基，C2-6烯 基和C2-6炔基；
R5独立地选自H，任选地被一个、两个或三个苯基所取代的C1-6 烷基，C1-6烷氧基，C2-6羟基烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，取代的苯基和 杂芳基；以及
R6选自其中的每一个都任选地被1-6个卤素原子取代的C1-6烷基、 C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C2-6羟基烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和C3-7环 烷基，羟基-C1-6-烷基，被卤素、硝基、氨基、羟基或CF3基团所取代 的芳基，以及被一个、两个或三个芳基所取代的C1-6烷基，C1-6烷基吲 哚，异吲哚基，3-吡啶基，3-哌啶基，苯并咪唑基，噻吩基，异噻唑基， 咪唑基，吡嗪基，苯并呋喃基，喹啉基，异喹啉基，苯并噻吩基，异 苯并呋喃基，吡唑基，吲哚基，异吲哚基，苯并咪唑基，嘌呤基，咔 唑基，噁唑基，噻唑基，异噻唑基，1，2，5-噻二唑基，异噁唑基，吡咯 基，吡唑基，喹唑啉基，哒嗪基，吡嗪基，噌啉基，酞嗪基，喹喔啉 基，黄嘌呤基，次黄嘌呤基和蝶啶基；
或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物(racemate)，互变异 构体，几何异构体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐，
条件是当A为

R为-CH3-，a为S，b为-C(CH2CH3)-以及d为-C(＝O)-时，则e不为 -NH-(AF267或其对映异构体)，
以及进一步的条件是当A为
R为-CH3-，a为S，b为-C(CH3)＝以及d为＝N-时，则e不为-CH2-(AF150(S))。
在本发明的一种实施方案中，R5为杂芳基，选自：吲哚，吡咯烷 基，哌啶基，哌嗪基，呋喃基，吡啶基，嘧啶基，噻吩基，异噻唑基， 咪唑基，吡嗪基，苯并呋喃基，喹啉基，异喹啉基，苯并噻吩基，异 苯并呋喃基，吡唑基，吲哚基，异吲哚基，苯并咪唑基，嘌呤基，咔 唑基，噁唑基，噻唑基，异噻唑基，1，2，5-噻二唑基，异噁唑基，吡咯 基，吡唑基，喹唑啉基，哒嗪基，吡嗪基，噌啉基，酞嗪基，喹喔啉 基，黄嘌呤基，次黄嘌呤基，蝶啶基，5-氮杂胞(嘧啶核)苷基，5- 氮(杂)尿嘧啶基，三唑并吡啶基(triazolopyridinyl)，咪唑并吡啶基 (imidazolopyridinyl)，吡咯并嘧啶基，以及吡唑并嘧啶基。
在本发明的一种实施方案中，化合物为通式I化合物的二聚体，或 其对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代谢物或药 学上可接受的盐，其中e为-NR5-且两个通式1部分共享一个选自于 -(CH2)n-和-(CH2O)n-的共同基团R5，其中n为1至6。
在本发明的一种实施方案中，化合物选自：N-[(2，8-二甲基-1-氧杂 -8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-胺]-N-氧化物 (N-[(2，8-Dimethyl-1-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3ylidene)-amine]-N-oxide )；N-[(2-乙基-8-甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-胺]N-氧化物； N-[(2-甲基-8-苯基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-胺]N-氧化物；硫 杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮；4-(2，4-二甲氧基-苄基)-8-甲基-1-硫杂 -4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF286)；8-甲基-4-吡咯烷-1-基甲基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF287)；2-(1-羟基-乙基)-8-甲基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF298)；(S)-2-乙基-8-甲基-8-氧-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF299)；4-(2，4-二甲氧基-苄基)-2- 乙基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF288)；(S)-2-乙基 -8-甲基-1-氧-1λ4-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF300)；2-乙基-8- 甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-[4.5]-癸-3-硫酮(AF510)；(S)-2-乙基-4-(4-氟 -苯磺酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF700)；2-乙 基-4-[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3- 酮(AF703)；2-乙基-4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8- 二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF704)；(S)-乙基-4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰 基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF704B)；(R)-乙基 -4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮 (AF704A)；以及2-甲基-8-甲基-d3-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3- 烯(AF402)，
或这些化合物的对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体， 几何异构体，代谢物或药学上可接受的盐。
在本发明的一种实施方案中，化合物为AF292或其药学上可接受 的盐。
在本发明的一种实施方案中，在化合物中，A为
R为H，a为-S-，b为-CH(CH2CH3)-，d为-(C＝O)-，以及e为-NH-，即 2-乙基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF504)，或其对映异构体， 非对映异构体，几何异构体，外消旋物，互变异构体，二聚体，代谢 物或药学上可接受的盐。
在本发明的一种实施方案中，化合物为(S)-2-乙基-1-硫杂-4，8-二氮 杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)或其HCl盐。
在本发明的一种实施方案中，化合物为(R)-2-乙基-1-硫杂-4，8-二氮 杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF291)。
在本发明的一种实施方案中，在化合物中，A为
R为-CH3，a为-O-，d为＝N(R3)＝O，或其对映异构体，非对映异构体， 外消旋物，互变异构体，几何异构体，二聚体，代谢物或药学上可接 受的盐。在本发明的一种实施方案中，b为-CH(CH3)-，R3为-CH3，即 N-[(2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-甲基-胺]-N-氧化物 (AF600)。在本发明的一种实施方案中，b为-CH(CH3)-，R3为苄基，即 N-[(2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-苄基-胺]-N-氧化物 (AF604)。在本发明的一种实施方案中，b为-CH(CH3)-，R3为异丙基， 即N-[(2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-异丙基-胺]-N-氧化 物(AF605)。在本发明的一种实施方案中，b为-CH(CH2CH3)-，R3为-CH3， 即N-[(2-乙基-8-甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-甲基-胺]-N-氧 化物(AF601)。在本发明的一种实施方案中，b为-CH(CH3)-，R3为苯基， 即N-[(2-甲基-8-苯基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯基)-甲基-胺]-N-氧 化物(AF602)。
在本发明的一种实施方案中，在化合物为中，A为
R为-CH3，a为-O-，d为＝N(R3)＝O，或其对映异构体，非对映异构体， 外消旋物，互变异构体，几何异构体，二聚体，代谢物或药学上可接 受的盐。在本发明的一种实施方案中，b为-CH(CH3)-，R3为甲基，即 二氢-5’-甲基螺[1-氮杂二环[2.2.2]辛烯-3，5’-(4’H)-3’-基-甲基胺]-N-氧化 物(AF603)。
在本发明的一种实施方案中，在化合物为中，A为
R为甲基，a为-S-，b为-CH(CH2CH3)-，d为-(C＝O)-，e为-NR5-，其中 R5选自-(CH2)3-吲哚基和-(C＝O)-(CH2)3-吲哚基，即2-乙基-4-[2-(1H-吲 哚-3-基)-乙基]-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF703)或 2-乙基-4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]- 癸-3-酮(AF704)，或其对映异构体，非对映异构体，几何异构体， 外消旋物，互变异构体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐。在本 发明的一种实施方案中，化合物为(S)-乙基-4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰 基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF704B)。
参考本发明的实施方案还提供了在制备药物组合物中采用通式(I) 的化合物，或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体， 几何异构体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐。在本发明的一种 实施方案中，化合物为AF292或AF292的前体药物(prodrug)，或是 其药学上可接受的盐。在本发明的一种实施方案中，前体药物为 AF267B或其药学上可接受的盐。
参考本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，其包括至少一 种通式(I)的化合物，或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互 变异构体，几何异构体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐；以及 其药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂(excipient)。在本发明的一 种实施方案中，化合物为AF292或AF292的前体药物，或其药学上可 接受的盐。在本发明的一种实施方案中，前体药物为AF267B或其药 学上可接受的盐。
参考本发明的一种实施方案，也提供了刺激M1蝇蕈碱受体 (muscarinic receptor)的方法，包括向需要这种治疗的病人施用有效 量的化合物，选自：通式(I)的化合物，AF267和AF150(S)，或其对映 异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，几何异构体，二聚 体，代谢物或药学上可接受的盐。在本发明的一种实施方案中，化合 物为AF292或AF292的前体药物，或其药学上可接受的盐。在本发明 的一种实施方案中，前体药物为AF267B或其药学上可接受的盐。
参考本发明的一种实施方案，也提供了分子式(I)的化合物在制 备既刺激M1蝇蕈碱受体又对所述M1蝇蕈碱受体附近处的氧化起到延 迟作用的药物组合物中的应用，其中A为 R为-CH3， a为-O-，d为＝N(R3)＝O，或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物， 互变异构体，几何异构体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐。
参考本发明的一种实施方案，还提供了药物组合物，包括对M1 蝇蕈碱受体主动有效量(agonistic efficacious amount)的通式(I)化合物 或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，几何异构 体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐；以及至少一种药学上可接 受的载体，稀释剂或赋形剂，其中A为 R为-CH3，a 为-O-，d为＝N(R3)＝O。
参考本发明的一种实施方案，也提供了刺激M1蝇蕈碱受体的方 法，包括向需要此治疗的病人给予有效量的通式(I)化合物或其对映异 构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，几何异构体，二聚体， 代谢物或药学上可接受的盐，其中A为 R为-CH3， a为-O-，d为＝N(R3)＝O。
参考本发明的一种实施方案，也提供了化合物(S)-2-乙基-4-(4-氟- 苯磺酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF700)。
根据本发明的一种实施方案，也提供了化合物AF700或其对映异 构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代谢物或药学上可接 受的盐在制备既刺激M1蝇蕈碱受体，又活化α-分泌酶(secretase)的药 物组合物中的应用。
参考本发明的一种实施方案，也提供了药物组合物，包括对刺激 M1蝇蕈碱受体和活化α-分泌酶为有效量的化合物AF700或其对映异 构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代谢物或药学上可接 受的盐；以及至少一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案，也提供了刺激M1蝇蕈碱受体和活 化α-分泌酶的方法，包括向需要此治疗的病人施用有效量的化合物 AF700或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代 谢物或药学上可接受的盐。
根据本发明的一种方式也提供了使用AF700或其对映异构体，非 对映异构体，外消旋物，互变异构体，代谢物或药学上可接受的盐在 制备既刺激M1蝇蕈碱受体，又拮抗β-分泌酶的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括对M1蝇 蕈碱受体起到激动(agonistic)作用和对β-分泌酶起到拮抗作用的有效 量化合物AF700或其对映异构体，非对映异构体，几何异构体，外消 旋物，互变异构体，二聚体，代谢物或药学上可接受的盐；以及至少 一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了刺激M1蝇蕈碱受体和拮抗 β-分泌酶的方法，包括向需要治疗的病人施用有效量AF700或其对映 异构体，非对映异构体，几何异构体，外消旋物，互变异构体，二聚 体，代谢物或药学上可接受的盐。
根据本发明的一种方式也提供了使用化合物AF700或其对映异构 体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代谢物或药学上可接受 的盐在制备既刺激M1蝇蕈碱受体，又拮抗γ-分泌酶的药物组合物中 的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括对M1蝇 蕈碱受体起到激动作用和对γ-分泌酶起到拮抗作用的有效量化合物 AF700或其对映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代 谢物或药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体，稀释 剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了刺激M1蝇蕈碱受体和拮抗 γ-分泌酶的方法，包括向需要此治疗的病人施用有效量AF700或其对 映异构体，非对映异构体，外消旋物，互变异构体，代谢物或药学上 可接受的盐。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用化合物(S)-2-乙基-1-硫 杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)或其代谢物或药学上可接受的 盐在制备既刺激M1蝇蕈碱受体，又拮抗M3蝇蕈碱受体的药物组合物 中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括对M1蝇 蕈碱受体起到激动作用而对M3蝇蕈碱受体起到拮抗作用的有效量化 合物(S)-2-乙基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)或其代谢 物或药学上可接受的盐；以及至少一种药学上可接受的载体，稀释剂 或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了包括有化合物(S)-2-乙基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)或其代谢物或药学上可接受 的盐的人类或动物的血液。在本发明的一种实施方案中，此血液位于 人类或动物体内。在本发明的一种实施方案中，此血液不位于人类或 动物的体内。
根据本发明的一种实施方案也提供了包括有化合物(S)-2-乙基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)或其代谢物或药学上可接受 的盐的人类或动物的血浆。在本发明的一种实施方案中，此血浆位于 人类或动物体内。在本发明的一种实施方案中，此血浆不位于人类或 动物的体内。
根据本发明的一种实施方案也提供了无论什么时候位于人类或动 物体内的，根据权利要求1的化合物(S)-2-乙基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺 [4.5]-癸-3-酮(AF292)或其代谢物或药学上可接受的盐。
根据本发明的一种实施方案也提供了化合物(S)-2-乙基-8-甲基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF267B)，其用作化合物(S)-2-乙基 -1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)的前体药物。
根据本发明的一种实施方案也提供了化合物(S)-2-乙基-8-甲基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF267B)作为化合物(S)-2-乙基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)的前体药物的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用化合物(S)-2-乙基-8-甲 基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF267B)和化合物(S)-2-乙基-1- 硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)的组合在制备刺激M1蝇蕈 碱受体而拮抗M3蝇蕈碱受体的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括对M1蝇 蕈碱受体起到激动作用而对M3蝇蕈碱受体起到拮抗作用的有效量化 合物AF267B和AF292的组合；以及至少一种药学上可接受的载体， 稀释剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了在病人体内刺激M1蝇蕈碱 受体和拮抗M3蝇蕈碱受体的方法，包括向病人施用有效量的化合物 AF267B和AF292的组合。
在本发明的一个实施方案中，AF267B和AF292一起施用。在本 发明的一种实施方案中，AF267B和AF292分开给药。在本发明的一 种实施方案中，AF267B和AF292以不同次数给药。在本发明的一种 方式中，AF267B和AF292以相同次数给药。
根据本发明的一种实施方案也提供了联合采用第一种化合物(S)-2- 乙基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)和选自通式(I)的化合 物，AF267B和AF150(S)的第二种化合物，包括它们的外消旋物，对映 异构体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药学上可接受的 盐在制备刺激M1蝇蕈碱受体的同时最小化由于刺激其它mAChR亚型 而带来的有害副作用的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括其量对M1 蝇蕈碱受体起到激动作用的第一种化合物AF292和选自通式(I)的化合 物，AF267B和AF150(S)的第二种化合物的组合，包括它们的外消旋物， 对映异构体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药学上可接 受的盐；以及至少一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了刺激M1蝇蕈碱受体的同时 使由于刺激病人体内的其它mAChR亚型而带来的不利副作用最小化 的方法，包括施用给病人有效量的第一化合物AF292和选自通式(I)的 化合物，AF267B和AF150(S)的第二种化合物的组合，包括它们的外 消旋物，对映异构体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药 学上可接受的盐。在本发明的一种实施方案中，第一化合物和第二化 合物一起给药。在本发明的一种实施方案中，第一化合物和第二化合 物分开给药。在本发明的一种实施方案中，第一化合物和第二化合物 以不同次数给药。在本发明的一种方式中，第一和第二化合物以相同 的次数给药。
根据本发明的一种实施方案也提供了同时以AF267B和AF292刺 激病人的M1蝇蕈碱受体的方法，包括以有效量的AF267B向病人给药， 此有效量的AF267B能在体内形成对刺激M1蝇蕈碱受体为有效量的 AF267B和AF292的混合物。
根据本发明的一种实施方案也提供了外消旋体形式的2-乙基 -4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮 (AF704)或其S-对映体(AF704B)作为AF267B，AF292和吲哚-3- 丙酸中至少一个的前体药物的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用外消旋体形式的2-乙基 -4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮 (AF704)或其S-对映体(AF704B)在制备刺激M1蝇蕈碱受体，延 迟M1蝇蕈碱受体附近发生氧化并提供神经防护活性(neroprotectant activity)的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括对刺激M1 蝇蕈碱受体，延迟氧化和神经防护活性为有效量的化合物：外消旋体 形式的2-乙基-4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺 [4.5]-癸-3-酮(AF704)或其S-对映体(AF704B)，以及药学上可接受 的载体，稀释剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了制备2-乙基-8-甲基-1-硫杂 -4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF267)的方法，包括使用4-乙基哌啶酮 和2-巯基丁酸(2-mercaptobutyric acid)和氨进行反应。在本发明的一 种实施方案中，此方法包括进一步通过手性分离得到对映体 AF267A(R-对映体)和AF267B(S-对映体)。
根据本发明的一种实施方案也提供了制备AF267B的方法，包括 使AF267A发生外消旋化，并从外消旋混合物中分离出AF267B。在本 发明的实施方案中，分离包括从外消旋混合物中通过手性分离分离出 AF267B。
根据本发明的一种实施方案提供了合成AF267B的方法，包括使 (R)-2-巯基丁酸和乙酸铵以及1-甲基-4-哌啶酮相接触。在本发明的一种 实施方案中，(R)-2-巯基丁酸的获得是通过使用(R)-2-苯甲酰基硫代丁 酸和氢氧化铵相接触而得到。在本发明的一种实施方案中，(R)-2-苯甲 酰基硫代丁酸由使(R)-2-溴丁酸与硫代苯甲酸铯相接触而获得。在本发 明的一种实施方案中，(R)-2-溴丁酸由使具有R构型的2-氨基丁酸与亚 硝酸钠，溴化钾和氢溴酸相接触而获得。
根据本发明的一种实施方案也提供了制备14C标记的AF267B的方 法，包括使用AF287和14C标记的溴乙烷进行反应，对AF287的4-位 氮原子进行去保护(deprotecting)，并通过手性色谱法分离出14C标记 的AF267B。
根据本发明的一种实施方案也提供了制备(S)-2-乙基-1-硫杂-4，8- 二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF292)和(R)-2-乙基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺 [4.5]-癸-3-酮(AF291)的混合物的方法，包括使AF267和去甲基化试 剂进行反应。
根据本发明的一种实施方案也提供了以下列数据表征的(S)-2-乙 基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(A267B)的晶体形式： P212121(No 16)a＝10.394((10)(α＝90°))，b＝20.133(2)(β＝90°)，c＝5.856 (4)(γ＝90°)，，T＝110K。在本发明的一种实施方案中，晶体形式进一步 由以下数据表征：体积＝1224.2(9)3，Z＝4，Fw＝202.32，计算密度， Dc＝1.092Mg/m3，吸收系数，μ＝0.232mm-1。
根据本发明的一种实施方案也提供了具有实施例2中结构1所显 示的构形的晶体形式(AF267B)。
根据本发明的一种实施方案也提供了制备2，8-二甲基-1-硫杂-3，8- 二氮杂-螺[4.5]-癸-2-烯[AF150(S)]的方法，包括使1-甲基-4-N-硫代乙酰 氨基-1，2，3，6-四-氢化吡啶进行环化。在本发明的一种实施方案中，环化 在磷酸的存在下进行。在本发明的一种实施方案中，1-甲基-4-N-硫代 乙酰氨基-1，2，3，6-四氢化吡啶是由采用硼氢化钠还原1-甲基-4-N-硫代 乙酰氨甲基吡啶的还原反应而获得。在本发明的一种实施方案中，1- 甲基-4-N-硫代乙酰氨甲基吡啶由碘化4-(乙酰氨甲基)-1-甲基-吡啶盐与 Lawsson’s试剂反应制得。
根据本发明的一种实施方案也提供了包括存在于石蜡油中的 AF150(S)的药物制剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于抑制释放或合成哺乳动 物细胞，组织或器官内的β-淀粉状肽(Aβ)的方法，包括以对抑制细胞 释放或合成Aβ为有效量的，选自通式(I)的化合物，AF267B和 AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体，非对映异 构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混合物向病 人给药。
根据本发明的一种实施方案也提供了选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)的，或它们外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物在制备抑制释放和合成哺乳动物细胞，组织或器官内的β-淀粉状 肽(Aβ)的药物组合物中的应用。
参考本发明的一种实施方案也提供了提高哺乳动物细胞，组织或 器官内的被分泌形式的非-淀粉样基因的(non-amyloidogenic)淀粉样前 体蛋白质(α-APPs)的水平的方法，包括以对提高被分泌形式的非- 淀粉样基因的淀粉样前体蛋白质(α-APPs)的水平的为有效量的，选 自通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映 异构体，几何异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的 盐的化合物或化合物混合物施用给哺乳动物细胞，组织和器官。
根据本发明的一种实施方案也提供了选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物在制备提高哺乳动物细胞、组织或器官内的被分泌形式的非-淀粉 样基因的淀粉样前体蛋白质(α-APPs)的水平的药物组合物中的应用。
参考本发明的一种实施方案也提供了降低脑部Aβ水平升高的哺 乳动物脑部中Aβ水平的方法，包括向脑部Aβ水平升高的哺乳动物 施用对降低所述哺乳动物脑部的Aβ肽水平为有效量的，选自通式(I) 的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体， 几何异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合 物或化合物混合物。在本发明的一种实施方案中，脑部Aβ水平升高 是高胆固醇血症(hypercholesterolemia)的结果。在本发明的一种实施 方案中，脑部Aβ水平升高是胆碱能作用减退(cholinergic hypofunction) 的结果。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物在制备用于降低脑部Aβ水平升高的哺乳动物脑部中Aβ肽水平 的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于抑制哺乳动物细胞、组 织或器官内的阿朴脂蛋白(ApoE)的合成或释放的方法，包括向哺乳 动物细胞、组织或器官施用对抑制释放或合成所述哺乳动物细胞、组 织或器官内的阿朴脂蛋白(ApoE)为有效量的，选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物在制备用于抑制哺乳动物细胞、组织或器官内的阿朴脂蛋白 (ApoE)的合成或释放的药物组合物中的应用。在本发明的一种实施 方案中，ApoE为ApoE4。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于降低哺乳动物细胞、组 织或器官内的阿朴脂蛋白(ApoE)含量的方法，包括向哺乳动物细胞、 组织或器官施用对降低所述哺乳动物细胞、组织或器官内阿朴脂蛋白 (ApoE)水平为有效量的，选自通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)， 或它们的外消旋物，几何异构体，对映异构体，非对映异构体，互变 异构体，和药学上可接受的盐的化合物或化合物混合物。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物在制备用于降低哺乳动物细胞、组织或器官内的阿朴脂蛋白 (ApoE)水平的药物组合物中的应用。在本发明的一种实施方案中， ApoE为ApoE4。
本发明的一种实施方案也提供了用于降低哺乳动物细胞、组织或 器官内τ-超磷酸化作用(tau hyperphosphorylation)的方法，包括向哺 乳动物细胞、组织或器官施用对抑制τ-超磷酸化作用为有效量的，选 自通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映 异构体，几何异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的 盐的化合物或化合物混合物。在本发明的一种实施方案中，τ-超磷酸 化作用为Aβ诱导的τ-超磷酸化作用。
参考本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物在制备用于降低哺乳动物细胞，组织或器官内的τ-超磷酸化作用 的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于减少哺乳动物细胞、组 织或器官内双螺旋构形(paired helical formation)的方法，包括向哺乳 动物细胞，组织或器官施用对抑制τ-超磷酸化作用为有效量的，选自 通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异 构体，几何异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐 的化合物或化合物混合物。
参考本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，非对映异构 体，互变异构体，几何异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物 混合物在制备用于减少哺乳动物细胞内双螺旋结构的药物组合物中的 应用。
参考本发明的一种实施方案也提供了用于激活哺乳动物细胞、组 织或器官内的Wnt信号路径(Wnt signaling pathway)的方法，包括向 哺乳动物细胞、组织或器官施用对抑制Wnt异常为有效量的，选自通 式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构 体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药学上可接受的盐的 化合物或化合物混合物。
参考本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，非对映异构 体，互变异构体，几何异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物 混合物在制备用于激活哺乳动物细胞、组织或器官内Wnt信号路径的 药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于抑制哺乳动物细胞、组 织或器官内的GSK3β介导作用(GSK3β-mediated effect)的方法，包 括向哺乳动物细胞、组织或器官施用抑制GSK3β介导作用为有效量 的，选自通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物， 对映异构体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药学上可接 受的盐的化合物或化合物混合物。在本发明的一种实施方案中，GSK3 β介导作用选自τ-超磷酸化作用，细胞凋亡(apoptosis)，β-连环蛋 白降解(β-catenin degradation)，以及Wnt靶基因的减少。
根据本发明的一种实施方案也提供了使用选自通式(I)的化合物， AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，非对映异构 体，互变异构体，几何异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物 混合物在制备用于抑制哺乳动物中GSK3β介导作用的药物组合物中 的应用。在本发明的一种实施方案中，此方法用于响应，由Aβ肽或 者氧化应激(oxidative stress)引起的对Wnt信号、细胞凋亡或者细胞 存活力(cell viability)的损割(insults)。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于提高细胞内的内生性生 长因子(endogenous growth factors)，即神经营养蛋白(neutrophins) 活性的方法，包括向哺乳动物细胞、组织或器官施用可单独有效地作 为神经营养性试剂，并可与所述神经营养蛋白协同作用的，一定量的 选自通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对 映异构体，几何异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受 的盐的化合物或化合物混合物。
参考本发明的一种实施方案也提供了可单独有效地作为神经营养 性试剂，并可与所述神经营养蛋白(neutrophins)协同作用的，选自通 式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构 体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药学上可接受的盐的 化合物或化合物混合物在制备用于提高神经营养蛋白活性的药物组合 物中的应用。
参考本发明的一种实施方案也提供了用于抑制β-淀粉状肽(Aβ) 释放或合成，用于提高被分泌形式的非-淀粉样基因的淀粉样前体蛋白 质(α-APPs)的含量，用于降低脑部Aβ含量升高的哺乳动物脑部中 Aβ肽含量，用于抑制释放或合成ApoE，降低τ-超磷酸化作用，减少 双螺旋结构，激活Wnt信号路径，增加β-连环蛋白，抑制GSK3β介 导作用或增加神经营养蛋白活性的药物组合物，包括选自通式(I)的化 合物，AF267B和AF150(S)，或它们的外消旋物，对映异构体，几何 异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或 化合物混合物；以及至少一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
本发明的一种实施方案也提供了一种药物组合物，包括选自于通 式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或其外消旋物，对映异构体， 几何异构体，非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的至少 一种化合物；以及选自以下的至少另一种药学活性化合物，包括：胆 碱脂酶抑制剂，烟碱激动剂，胆碱能药物的前体和胆碱能药物的增强 剂，促智药(nootropics)，周围抗蕈毒碱药物，M2蕈毒碱拮抗剂，M4 拮抗剂，苯并二嗪反激动剂(benzodiapine inverse agonists)，抗抑郁 药，用于治疗帕金森病(PD)或抑郁症的三环抗抑郁药或抗蕈毒碱药 物，抗精神病和抗精神分裂症的药剂，谷氨酸酯拮抗剂和调谐剂， NMDA拮抗剂，AMPA激动剂，乙酰基-L-肉毒碱，MAO-B抑制剂， 肽和生长因子，降低胆固醇的药剂，抗氧化剂，GSK-3β抑制剂，Wnt- 配体，β-或γ-分泌酶抑制剂，β-淀粉状蛋白降解剂，β-淀粉状蛋白 抗聚集剂，鳌合剂，抗β-淀粉状蛋白的免疫治疗化合物，结合到淀粉 状蛋白的化合物，环氧合酶(COX)-2抑制剂，非甾族的抗炎药，雌 激素药剂，雌激素受体调谐剂，甾族神经保护药，以及旋转捕集药剂 (spin trapping pharmaceuticals)。
在本发明的一种实施方案中，化合物是AF292或AF292的前体药 物或其药学上可接受的盐。
参考本发明的一种实施方案也提供了用于治疗或减少脑部淀粉样 血管病(cerebral amyloid angiopathy)的方法，包括向需要的病人施用 (a)选自AF267B，AF292和AF704B，其药学上可接受的盐，或这些化 合物或盐的混合物的有效量化合物，以及(b)选自抗β-淀粉状蛋白的 免疫治疗化合物和结合β-淀粉状蛋白的化合物的有效量化合物。
根据本发明的一种实施方案也提供了药物组合物，包括：(a)选自 AF267B，AF292和AF704B药学上可接受的盐或此类化合物或盐的混 合物的有效量化合物，(b)选自抗β-淀粉状蛋白的免疫治疗化合物和 结合β-淀粉状蛋白的化合物的有效量化合物；以及药学上可接受的载 体，稀释剂或赋形剂。
参考本发明的一种实施方案也提供了(a)选自AF267B，AF292和 AF704B，其药学上可接受的盐，或这些化合物或盐的混合物的有效量 化合物，以及(b)选自抗β-淀粉状蛋白的免疫治疗化合物和结合β-淀 粉状蛋白的化合物的有效量化合物的组合在制备治疗或减少脑部淀粉 样血管病的药物组合物中的应用。
参考本发明的一种实施方案也提供了治疗与胆碱能作用受到损害 有关的哺乳动物疾病，或胆碱能作用不平衡的疾病，或乙酰胆碱受体 活性受到损害的疾病的方法，其中的疾病来自：阿尔茨海默氏类型的 老年痴呆症；阿尔茨海默氏症(AD)；路易体痴呆症；混合的阿尔茨 海默氏和帕金森症；多发性硬化性痴呆(multiifract dementia)(MID)； 额-枕叶痴呆症；溢血性痴呆症；中风/局部缺血；与中风/局部缺血/颅 脑损伤有关的MID；MID和AD的结合病症；人体颅脑损伤；年龄相 关性记忆力损伤；轻度认知损伤(MCI)；导致AD的MCI；认知功 能障碍(包括健忘，急性意识错乱疾病，注意力缺失症，注意力异常 和集中力异常(focus and concentration disorder))；妄想-偏执状态； 情绪和注意力失调；睡眠失调；手术后谵妄(delirium)；三环抗抑郁 剂的副作用；用于治疗精神分裂症和帕金森病的某些药的副作用；口 干症；称名不能症；记忆力丧失和/或意识错乱；精神病；精神分裂症； 与AD相关的精神分裂症；后发作的精神分裂症；妄想痴呆症；精神 分裂症样的疾病；焦虑症；躁狂抑郁病；躁狂症；情绪稳定状态；移 除某些神经胶质瘤之后的认知损伤；迟发性运动障碍；氧疗中的氧化 应激；失语症；脑炎后的遗忘综合症；AIDS痴呆症；包括狼疮、多发 性硬化、Sjogren氏综合症、慢性疲劳综合症和纤维肌痛等自身免疫性 疾病中的记忆力损伤；在非典型性抑郁症和精神分裂症中的记忆力损 伤；疼痛、风湿病、关节炎和绝症；眼球干燥症；阴道干燥；皮肤干 燥；免疫功能障碍；神经性激素失调和包括易饿病和厌食症的摄食失 调；肥胖症；先天性鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏；橄榄体脑桥小脑萎缩 (ollivopontocerebral atrophy)；酒精禁断症状；包括禁断症状和替代 治疗的药品滥用；Huntington氏舞蹈症；进行性核上性麻痹；Pick氏疾 病；Friedrick氏共济失调；Gilles de la Tourette疾病；Down氏疾病； 青光眼；老花眼；自发的疾病(autonomic disorders)，包括肠胃动力 功能障碍和例如炎症性肠病、肠易激综合症、腹泻、便秘、胃酸分泌 物和溃疡的功能性疾病；急迫性尿失禁，哮喘，COPD，此方法包括向 需要此类治疗的哺乳动物施用对治疗一种所述疾病为有效量的，选自 通式(I)化合物，AF267B和AF150(S)，或其外消旋物，对映异构体， 非对映异构体，互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混 合物。在本发明的一种实施方案中，化合物为AF292或AF292的前体 药物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种实施方案也提供了一种预防或治疗由于下列一 种或多种的功能障碍造成的中枢或周围神经系统病状的方法：脑，神 经系统，心血管系统，免疫系统，神经性激素系统，肠胃系统，或内 分泌和外分泌系统，眼睛，角膜，肺，前列腺，或其它胆碱能作用由 蕈毒碱受体亚型介导的器官，所述的功能障碍包括：脑部淀粉状蛋白 介导的疾病；糖原合酶激酶(GSK3β)介导的疾病；τ-蛋白超磷酸化 作用介导的损伤，功能障碍和疾病；CNS和PNS高胆固醇血症和/或高 脂血症介导的损伤，功能障碍和疾病；Wnt介导的信号异常；神经重 构(neuroplasticity)受损；高血糖症；糖尿病；内生性生长因子介导的疾 病；或其它致病因素的组合；或涉及阿朴脂蛋白E的病状；或其中已 经牵连胆碱能作用的紊乱，包括：阿尔茨海默氏型老年痴呆症，阿尔 茨海默氏症(AD)，延迟有发展为AD危险的病人的AD症状发病， 路易斯体痴呆症，脑部淀粉样血管病(CAA)，脑部淀粉样变性病，额- 枕叶痴呆症，溢血性痴呆症，高脂血症，高胆固醇血症，多发梗塞性 痴呆(MID)，中风局部缺血，与中风/局部缺血/颅脑损伤结合的MID， MID和阿尔茨海默氏症的结合病症，人体颅脑损伤，年龄相关性记忆 力损伤，轻度认知损伤(MCI)，导致AD的MCI，躁狂抑郁病，躁 狂症，精神分裂症，非情绪性精神分裂症(sychozophrenia)，妄想痴 呆症，免疫性功能障碍，神经性激素失调和包括易饿病和厌食症的摄 食失调，重量控制，肥胖症，炎症；该方法包括向需要此类治疗的哺 乳动物施用对治疗至少一种所述疾病为有效量的，选自通式(I)化合物， AF267B和AF150(S)，或其外消旋物，对映异构体，非对映异构体， 互变异构体和药学上可接受的盐的化合物或化合物混合物。
根据本发明的一种实施方案也提供了治疗患有AD，MCI，路易体 痴呆症，额-枕叶痴呆症，溢血性痴呆症，颅脑损伤中的记忆损伤，AIDS 痴呆症的病人，以抑制所述病人情况进一步恶化的方法，包括向所述 病人施用选自于通式(I)的化合物，AF267B和AF150(S)，或其外消旋 物，对映异构体，非对映异构体，互变异构体，几何异构体和药学上 可接受的盐的有效量化合物或化合物混合物。
在本发明的一种实施方案中，化合物包括AF292或AF292的前体 药物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种实施方案也提供了治疗精神分裂症的方法，包 括向需要的病人施用选自以下的有效量化合物：AF267B，AF292，其 药学上可接受的盐，以及AF267B，AF292的混合物或其药学上可接受 的盐。选自于AF267B，AF292，其药学上可接受的盐，以及AF267B， AF292的混合物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种实施方案也提供了AF267B，AF292，其药学上 可接受的盐，以及AF267B，AF292的混合物或其药学上可接受的盐在 制备治疗精神分裂症的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于治疗精神分裂症的药物 组合物，包括AF267B，AF292，其药学上可接受的盐，或者AF267B， AF292的混合物或其药学上可接受的盐；以及至少一种药学上可接受 的载体，稀释剂或赋形剂。
根据本发明的一种实施方案也提供了一种改善精神分裂症症状的 方法，包括向需要的病人施用选自以下的有效量化合物：AF267B， AF292，其药学上可接受的盐，以及AF267B，AF292的混合物或其药 学上可接受的盐。
根据本发明的一种实施方案也提供了AF267B，AF292，其药学上 可接受的盐，以及AF267B，AF292的混合物或其药学上可接受的盐在 制备改善精神分裂症症状的药物组合物中的应用。
根据本发明的一种实施方案也提供了用于改善精神分裂症症状的 药物组合物，包括AF267B，AF292，其药学上可接受的盐，或者AF267B， AF292的混合物或其药学上可接受的盐；以及至少一种药学上可接受 的载体，稀释剂或赋形剂。
在本专利申请中，
“烷基”是指具有1-8个碳原子的直链或支链的烷基，如甲基，乙 基，丙基，异丙基等。
“烷氧基”是指-O-烷基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基 等。
“烯基”是指具有2-8个碳原子，且链中具有至少一个C-C双键 的直链或支链。
“炔基”是指具有2-8个碳原子，且链中具有至少一个C-C叁键 的直链或支链。
“烷硫基”是指-S-烷基，如甲硫基，乙硫基，丙硫基，异丙硫基 等。
“环烷基”是指含有3-12个碳原子的单环或双环结构的环烷基。 环烷基的例子有环丙基，环丁基，环戊基，环己基，萘烷基和降冰片 基。
“芳基”是指含有5-12个碳原子的单环或双环结构的芳基。芳基 的例子有苯基，萘基和苄基。
“杂环基”是指含有4-12个碳原子和至少一个氮，氧或硫原子的 单环或双环结构的杂环基。
“杂芳基”是指含有4-12个碳原子和至少一个氮，氧或硫原子的 单环或双环结构的杂芳基。杂环基和杂芳基的例子有吲哚基，异吲哚 基，3-吡啶基，3-哌啶基，苯并咪唑基，噻吩基，异噻唑基，咪唑基， 吡嗪基，苯并呋喃基，喹啉基，异喹啉基，苯并噻吩基，异苯并呋喃 基，吡唑基，吲哚基，异吲哚基，苯并咪唑基，嘌呤基，咔唑基，噁唑 基，噻唑基，异噻唑基，1，2.5-噻二唑基，异噁唑基，吡咯基，吡唑基， 喹唑啉基，哒嗪基，吡嗪基，噌啉基，酞嗪基，喹喔啉基，黄嘌呤基， 次黄嘌呤基，和蝶啶基，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，呋喃基，吡啶 基，嘧啶基，5-氮胞苷基，5-氮(杂)尿嘧啶基，三唑并吡啶基，咪唑 并吡啶基，吡咯并嘧啶基，以及吡唑并嘧啶。
“卤素原子”可为氟，氯，溴和碘之中的一个。
除非有另外的指明，否则就采用以下的缩写：
Aβ                                                   β-淀粉状蛋白
AA                         花生四烯酸
AAMI                       年龄相关性记忆损坏
ACh                        乙酰胆碱
AchE-Is                    乙酰胆碱脂酶抑制剂
AD                         阿尔茨海默氏症
AGP                        人类α-糖蛋白
AGP                        α-糖蛋白
ApoE                       阿朴脂蛋白
APP                        淀粉样前体蛋白
AUC                        曲线下的面积
BDNF                       脑衍生神经生长因子
bFGF                       基本纤维原细胞生长因子
CAA                        脑部淀粉样血管病
CCh                        氨甲酰胆碱
CDX                        甲基-β-环糊精
CE                         碰撞能量
CHI                        闭合性颅脑损伤
CNS                        中枢神经系统
CSF                        脑脊髓液
DAPI                       4，6-二脒基(diamidino)-2-苯基吲
                           哚
DCC                        二环己基碳化二亚胺
DDW                        重蒸馏水
DMF                        N，N-二甲基甲酰胺
DMAP                       4-甲基氨基吡啶
DMPU                       N，N’-二甲基-N，N’-亚丙基脲
ECG                        心电图
EGF                        表皮生长因子
FACS                       荧光活化细胞分检器
FCS                        胎牛血清
GC                         气相色谱
GSK3β                                            糖原合酶激酶
HERG                       人类ether-a-go-go相关基因
HPLC                       高效液相色谱
HS                         马血清
HAS                        人类血清白蛋白
i.c.v.，icv                侧脑室内
i.p.，ip                   腹膜内
i.V.，iv                   静脉内
LBD                        路易体疾病
LC                         液相色谱
LDA                        二-异丙基胺
Li                         锂
M1 mAChR                   1蕈毒碱受体
mAChR                        蕈毒碱受体
mCPBA                        间-氯过苯甲酸
MCI                          最小的认知性损伤
MID                          多发梗塞性痴呆
MRSA                         蕈毒碱受体选择性激动剂和有效
                             的抗氧化剂
MS                           质谱
MTBE                         甲基-t-丁基醚
MTT                          溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-
                             二苯基-四唑
MWM                          Morris水混乱
nbm                          基底巨细胞核(nucleus basalis
                             magnocellularis)
NFT                          神经纤维缠结
NGF                          神经生长因子
NMDA                         N-甲基-D-天冬氨酸酯
NMR                          核磁共振
NOAEL                        无副作用含量
NSS                          神经学严重性得分
OXO-M                        氧化震颤素-M
PA                           被动回避
PBS                          磷酸盐缓冲盐水
PD                           帕金森病
PHF                          双螺旋丝
PI                           磷酸肌醇
PKC                          蛋白质激酶C
PMSF                         苯甲基磺酰氟
PNS                          周围神经系统
po                           经口，口服
PS-1                         早老素-1
PZ                           哌仑西平
QNB                            二苯羟乙酸奎宁环酯
REL                            逃避潜伏期比率
RID                            调查时间比
ROS                            活性氧种类
RPL                            路径长度比
RSA                            受体选择性抗氧化剂
s.c.，sc                       向皮下地
SDAT                           阿尔茨海默氏型老年性痴呆症
SDS-PAGE                       十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
                               胶电泳
SMB                            模拟移动床
TBI                            创伤性脑损伤
Tg                             基因转录的
THF                            四氢呋喃
TUNEL                          末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)
                               调节的dUTP切口末端标记
A1(人类)；A2A(人类)；A3(人类)  腺苷受体亚型
AT1(人类重组体)                血管紧张素
BZD(中心的)                    苯并二氮杂草
B2(人类重组体)                 缓激肽
CCKA(人类重组体)(CCK1)         肠促胰酶肽
D1(人类重组体)；D2S(人类重组   多巴胺受体亚型
体)
ETA(人类重组体)                内皮缩血管肽
GABA(非选择性的)               γ-氨基丁酸
GAL2(h)                        甘丙肽(galanin)
IL-8B(人类重组体)(CXCR2)       趋化因子受体亚型
CCR1(人类重组体)               趋化因子受体亚型
H1(中心的)；H2                 组胺受体亚型
MC4(人类重组体)                黑皮质素
ML1                            褪黑激素
NK2(人类重组体)；NK3(人类重组   速激肽
体)
Y1(人类)；神经肽，Y2(人类)      神经肽
NT1(人类重组体)(NTS1)           神经加压素
δ2(人类重组体)；(DOP)；        鸦片剂受体亚型
kapp(KOP)；鸦片剂，μ(人类重
组体)(MOP)
ORL1(人类重组体)(NOP)           孤啡肽(Orphanin)
5-HT1A(人类重组体)；5-HT1B；  5-羟色胺亚型
5-HT2A(人类重组体)；5-HT3(人
类重组体)；5-HT5A(人类重组体)
(5-ht5A)；5-HT6(人类重组体)；
5-HT7(人类)
sst(非选择性的)                 促生长素抑制素
VIP1(人类)(VPAC1)               血管活性肠肽
V1a(人类重组体)                 后叶加压素
NE转运体(人类)                  降肾上腺素
术语“几何异构体”是指双键上的异构现象，如顺式/反式异构现 象和E/Z异构现象，以及构型异构体，例如顺/反异构现象。
术语“药学上可接受的加成盐”是指本领域公知的在制药实践中 可接受的盐，例如酸加成盐，如盐酸盐，马来酸盐和柠檬酸盐。药学 上可接受的酸加成盐包括从无机酸衍生的盐，无机酸例如有盐酸，硝 酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，亚磷酸等；以及从有机酸衍生的 盐，有机酸例如脂肪族单羧酸或二羧酸，苯基取代的链烷酸，羟基链 烷酸，链烷二羧酸，芳香族酸，脂肪族和芳香族的磺酸等。因此此类 的盐包括硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，亚硫酸氢盐，硝 酸盐，磷酸盐，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，氯 化物，溴化物，碘化物，乙酸盐，丙酸盐，辛酸盐，异丁酸盐，草酸 盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，辛二酸盐，癸二酸盐，延胡索酸盐，马来 酸盐，扁桃酸盐，甲苯酸盐，氯代苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基 苯甲酸盐，酞酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，苯乙酸盐，柠檬酸盐， 乳酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，甲基磺酸盐，等等。也可考虑氨基酸 盐，如精氨酸盐(arginate)，葡糖酸盐，半乳糖醛酸盐等等，例如参 见Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.of Pharmaceutical Science，1977； 66：1-19。
通过以常规的方式使游离碱形式和足量的所需酸相接触而产生 盐，从而制备得到碱性化合物的酸加成盐。可以常规的方式通过使盐 形式与碱相接触并分离出游离碱，从而可再生游离碱形式。与各自的 盐形式相比，游离碱形式在某些物理性质有所不同，如在极性溶剂中 的溶解性，但是，对于本发明的目的来讲，盐与它们各自的游离碱是 等效的。
采用金属或胺类形成药学上可接受的碱加成盐，如碱金属和碱土 金属的金属氢氧化物，或有机胺类。用作阳离子的金属的例子有钠， 钾，镁，钙等。合适的胺类的例子有N，N’-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因， 胆碱，二乙醇胺，乙二胺，N-甲基葡糖胺，以及普鲁卡因，例如参见 Berge等，上述，1977。
通过以常规的方式使游离酸形式和足量的所需碱相接触而产生 盐，从而制备得到酸性化合物的碱加成盐。可以常规的方式通过使盐 形式与酸相接触并分离出游离酸，从而可再生游离酸形式。与各种盐 形式相比，游离酸形式在某些物理性质如在极性溶剂中的溶解性有所 不同，但是，对于本发明的目的来讲，盐与它们各自的游离酸是等效 的。
术语“代谢物”是指，通过身体对化合物给药形式的作用而在人 或动物体内获得的化合物的形式，如具有甲基基团的化合物的去甲基 化类似物，该脱甲基化类似物是在甲基化化合物给药后，通过身体对 甲基化化合物的作用而在体内获得。代谢物本身可具有生物活性。
术语“前体药物”是指这样的化合物形式，当被给药至人或动物 体之后，前体药物通过化学或生物化学作用在体内转化为具有生物活 性的不同化合物。化合物的前体药物形式本身可以具有生物活性。
本发明实施方案中的新化合物，以及参考本发明的实施方案可以 被使用的化合物可具有至少一个手性中心，并可因此以对映异构体或 对映异构体的混合物(如外消旋混合物)存在。在化合物具有两个或 两个以上手性中心的情况下，它们还可以因此存在为非对映异构体。
在本发明的一些实施方案中，提供了药物组合物和某些化合物在 制备药物组合物中的应用。此类组合物可以下列形式存在：适于口服 给药(如为胶囊，片剂，颗粒，粉末或小球形式)，直肠给药，肠胃 外给药，静脉内给药，真皮内给药，皮下给药，经皮给药或局部给药， 或通过吹入给药，或鼻喷入法给药，离子透入法给药，口腔含化给药 (bucal)或舌下给药。此类组合物可为单位剂型。通式(I)的化合物， 或其中可采用AF267B或AF150(S)的实施例中，可以约0.5到约100mg 的单位剂量存在。在本发明的一种实施方案中，化合物的存在量为约5 到约100mg。在本发明的一种实施方案中，化合物的存在量为约10 到约100mg。在本发明的一种实施方案中，化合物的存在量为约10 到约50mg。这些量可为单次剂量或每天给药2到4次，共为2-4次的 单剂量。在本发明的一种实施方案中，药物组合物为缓释形式。
本发明的一些实施方案中的某些化合物可以非溶剂化或包括水合 形式的溶剂化形式存在。通常，包括水合形式的溶剂化形式与非溶剂 化的形式等效，且意味着包括于本发明的范围内。
化合物AF150(S)和AF267B在U.S.5852029中有所描述。
在本发明的一些实施方案中，化合物具有抗氧化活性。此类抗氧 化活性可能是由为N-氧化物的那类化合物所造成的，如AF600，或是 由在4-位碳上连接有抗氧化部分的那类化合物所带来的。
技术人员会理解，对临床治疗的应用，许多因素影响用于临床治 疗的各种化合物的选择，如对计划目的的有效性，安全性，可能的副 作用和治疗指数(therapeutic index)。当在本说明书和权利要求书中 采用从具有叔氮原子的本发明化合物进行结构衍生而得到的“药学上 可接受的季化合物”这一术语时，技术人员将因此理解怎样解释该术 语。
用于本发明实施方案中的化合物可以各种各样的口服或肠胃外剂 型来制备和给药。因此，化合物可通过注射，即静脉内，肌肉内，皮 内，皮下，鼻内或腹膜内的方式进行给药。化合物也可通过如鼻内吸 入来进行给药。此外，化合物还可通过经皮给药。本领域的技术人员 应该理解以下的剂型可包括作为活性成分的通式(I)化合物或通式(I)化 合物相应的药学上可接受的盐，以及根据本发明的实施方案而任选存 在的AF267B或AF150(S)。
为从通式(I)化合物制备也任选包括AF267B或AF150(S)的药物组 合物，药学上可接受的载体可为固体或为液体。固态制剂包括粉末， 片剂，药丸，胶囊，扁囊剂，栓剂，和分散颗粒。固体载体可为可用 作稀释剂，调味剂，粘结剂，防腐剂，药片崩解剂，或封装材料的一 种或多种物质。
在粉末中，载体为细碎的固体，存在于与细碎的活性成分相混合 的混合物中。在片剂中，活性成分与具有必须的粘结性能的合适比例 载体相混合并压制成为所需的形状和大小。
在本发明的一种实施方案中，粉末和片剂包括从5或10到约70 百分比的活性化合物。合适的载体包括碳酸镁，硬脂酸镁，滑石粉， 蔗糖，乳糖，果胶，糊精，淀粉，白明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羧 甲基纤维素钠，低熔点的腊，可可脂，等等。术语“制剂”包括活性 成分和作为载体的封装材料的制剂，提供了这样的胶囊：胶囊中与其 它载体一起存在的或不与其它载体一起存在的活性成分被载体所包 围，从而使载体与活性成分结合起来。类似地，制剂包括了扁囊剂和 锭剂(lozenges)。片剂，粉末，胶囊，丸剂，扁囊剂和锭剂也用作适 于口服给药的固体剂型。
为制备栓剂，首先将低熔点腊如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物 发生熔化，通过搅拌使活性成分在其中均匀分散。然后将熔融的均匀 混合物倾入合适大小的模具中，冷却并因此固化。
液体形式的制剂包括溶液，悬浮液和乳液，如水或丙二醇水溶液。 用于肠道外注射的液体的制备可在丙二醇水溶液中进行。
通过将活性成分溶解在水并加入所需的合适着色剂，调味剂，稳 定和增稠剂，可制备得到适于口服用的水溶液。
通过将细碎的活性成分与粘性材料，如天然或合成的胶，树脂， 甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和其它公知的悬浮剂一起分散于水中， 可制备得到适于口服用的水悬浮液。
还可包括的是这样的固体形式制剂：其在使用前很短的时间内能 被转变为用于口服给药的液体形式。这样的液体形式包括溶液，悬浮 液和乳液。除了活性化合物之外，这些制剂可包括着色剂，调味剂， 稳定剂，缓冲剂，人工或天然的甜味剂，分散剂，增稠剂，增溶剂， 等等。
在本发明的一种实施方案中，药物制剂为单位剂型。在此形式下， 制剂被细分为含有合适量的活性成分的单位剂量。单位剂型可为包装 的制剂，此包装含有个别量的制剂，如成包的片剂，胶囊和小瓶或安 培中的粉末。此外，单位剂型可为胶囊，片剂，扁囊剂或锭剂本身， 或者可为合适数量的，以包装形式存在的任何这些剂型。
根据特定的应用和活性成分的效能，可改变或调节如上所述的单 位剂量制剂中活性成分的量。如果需要，组合物也可包括其它相容的 治疗剂。
在治疗应用中，根据本发明的实施方案采用的化合物可以每天为 约0.01mg到约100mg/kg的起始剂量进行给药。在本发明的一种实施 方案中，采用的日剂量范围为从约0.01mg到约10mg/kg。在本发明的 另外一种实施方案中，采用的日剂量范围为从约10mg到约50mg/kg。 然而，可根据病人的要求，被治疗的疾病的严重程度，以及所采用的 化合物而采用不同的剂量。为特定情况确定合适剂量在本领域技术人 员的能力范围之内。通常，以低于化合物最佳剂量的较小剂量开始治 疗。此后，小幅度增加剂量直到在此情况下达到最佳效果。为方便的 缘故，在需要的情况下可将总的日剂量按比例分割和给药。
用于制备本发明化合物的方法包括用于形成5元环，进行环取代， 改变环的饱和/不饱和度，实现盐和碱的互变，形成季盐等有机化学工 作者基本上公知的方法。在这些合成方法中，原料可包含手性中心， 在采用外消旋原料时，得到的产物为R，S对映异构体的混合物。或者， 可使用原料的手性异构体，如果所采用的反应路线未使原料发生外消 旋化，则获得手性产物。此类反应路线可涉及在合成过程发生手性中 心反转。对通式(I)化合物进行选择可使多种立体异构形式得以存在， 包括如E和Z(硝酮内)的几何异构体和对映异构体。本发明包括这些立 体异构形式中的每一种及其混合物(包括外消旋物)。不同的立体异 构形式可通过常规的方法彼此分离，或任何特定的异构体可通过立体 定向合成或非对称合成而得到。应该理解的是，尽管将对制备本发明 的某些化合物的示例性方法进行描述，正如技术人员所公知的，也可 采用其它的方法制备这些化合物。
当5元环为噻唑烷-3’-酮环时，可通过例如使相应的N-杂环酮与 2-巯基羧酸[R1CH(SH)CO2H]和氨一起反应形成环而制备得到化合物， 产物中的4-N原子可以已知方式取代。这些反应可如以下反应路线1 中所述，其中N-杂环酮的示例性地为1-甲基哌啶-4-酮。

[(A)如AF267：R1＝Et；R5＝H；AF277：R1＝H；R5＝H；
(B)如AF700：R1＝Et；R5＝4-氟苯磺酰基；AF703：R1＝Et；R5＝2-(1H- 吲哚-3-基)-乙基]
                         反应路线1
“R5-(离去基)”中的离去基可例如为溴或氯。用于获得结构(B)的 取代反应可在必要的已知条件下进行，如使(A)在如二异丙基氨基锂 (LDA)的碱的存在下进行反应，并采用例如四氢呋喃(THF)的溶剂。
化合物结构(A)或化合物结构(B)可采用手性HPLC，分离为两种对 映异构体，如手性制备液相色谱(LC)分离AF267(R1＝Et，R5＝H)得 到AF267A[R1＝(R)Et，R5＝H)和活性的对映体AF267B[R1＝(S)Et， R5＝H)。利用大规模成本合算的方法，可获得最大50％的产率的每一种 对映异构体(每一种对映异构体的产率＞97％，ee＞99％，HPLC纯度 ＞99％)。
对本领域的技术人员来讲，采用Mazzoti等(Proceedings of the Chiral Europe 96 Symp，Spring Innovations，Stockport UK，p103，1996) 所定义的，用于手性分离的模拟移动床(SMB)技术可进一步地将该方法 扩展为更实际的分离法。
AF267B也可以通过化学方式的AF267A外消旋化来制备，例如， 碱催化、或者通过酶催化然后手性HPLC分离或者SMB分离。
可通过使相应的N-杂环酮和2-巯基酸[R1CH(SH)CO2H]和伯胺一 起反应，制备得到结构(B)。这些反应可如以下路线2中所述，其中N- 杂环酮的示例性地为1-甲基哌啶-4-酮。

[如AF282：R1＝H，R5＝苄基；AF286：R1＝H，R5＝2，4-二甲氧基苄 基；AF288：R1＝Et，R5＝2，4-二甲氧基苄基；AF285：R1＝Et，R5＝苄基]
                       反应路线2
也可通过在如下述反应路线3中所描述的获得酰胺键的条件下使 (A)进行反应而获得结构(B)，其中参加反应的酸示例性地为3-吲哚丙 酸：

例如AF267 R1＝Et                 R5-(离去基团)＝                          AF704 R1＝Et
                                    3-吲哚丙酸                            R5＝3-1H-吲哚-3-基-丙酰基
                                     反应路线3
通过使2-未取代的化合物(A)或(B)与卤代烷或烷基醛在实现2-位 取代的标准条件下进行反应，可获得结构(A)或结构(B)中的R1基团。 这些反应可在如下的反应路线4中所述：

                                         例如AF298 R1＝CH(OH)CH3，R5-H
         AF277 R5＝H
                                             AF285 R1＝Et，R5＝苄基
                               反应路线4
该方法可用于AF267的14C-标记。采用14C-标记的溴化乙烷使易 得到的N-保护的AF277(AF287)进行烷基化，引入乙基部分，然后脱去 保护基，得到14C-标记的AF267。可用于类似地制备富含13C的AF267 的合成路径如以下反应式5中所述：

                      反应路线5
通过与间-氯代过苯甲酸(m-chloroperbenzoic acid)/FeCl2或与去 甲基试剂如苯基氯甲酸酯进行反应，可从结构(A)和结构(B)中脱去1- 甲基，如反应路线6所示：

     例如AF504 R1＝Et，R5＝H；AF292＝[(S)-AF504]
                      反应路线6
通过使相应的N-杂环酮与2-巯基羧酸[R1CH(SH)CO2H]和伯胺一 起反应，也可制备得到AF504或AF292。反应可如下列反应路线7中 所述，其中N-杂环酮为N-BOC-哌啶-4-酮(BOC＝叔-丁氧羰基)。

                      反应路线7
通过使相应的N-杂环酮与合适的2-巯基酸酸进行反应，可实现结 构(A)或(B)的立体定向合成(stereospecific synthesis)，例如，当1-甲 基哌啶-4-酮与(S)-2-巯基丁酸和NH3反应时，获得了AF267B，如反应 路线8所示[(S)构型基于对AF267B的x射线晶体学]：

                         反应路线8
(S)-2-巯基丁酸是商业上可得到的，或者可从(R)-溴丁酸制备得到。 该反应可如以下反应路线9中所述：

(a)NaNO3，KBr，HBr  (b)PhCO-SCs+  (c)NH4OH
                         反应路线9
当化合物(A)与氧化剂如过氧化氢或间-氯代过苯甲酸一起反应时， 可获得如反应路线10中所示的结构(D)或结构(E)：

[例如，AF299 R1＝(S)-Et]                          [例如，AF300 R1＝(S)-Et]
                         反应路线10
通过使结构(A)中相应的噻唑烷酮环与Lawesson’s试剂一起反应， 通常可获得结构(A)或(B)的硫代类似物，如反应路线11所示：

                如AF510，R1＝Et，R5＝H
                         反应路线11
在前述获得化合物结构(B)的相同条件下，通过使相应的化合物结 构(A)和间隔基(spacer)一起反应，可得到在同一个分子内基本含有 两个配位基的二价化合物。间隔基-(离去基团)示例性地为二卤代烷烃， 烷二醇，烷二酸，聚(乙二醇)。此反应可如下列的反应路线12中所述：

例如，间隔基＝(CH2)n，(CH2CH2O)n，n＝1-12，离去基团＝Br，C(O)Cl， C(O)OH
                         反应路线12
N-膦酰氧甲基前体药在Krise等，J Med.Chem.42：3094-3100(1999) 中报道过。N-膦酰氧甲基的这些部分也可用于合成前体药(H)，该前体 药用于改善如下所示的含叔胺化合物(B)的水溶性。化合物结构(B)中的 叔胺与磷酸二-叔-丁基氯甲基酯进行亲核反应，形成了磷酸季铵盐保护 的前体药。如反应路线13所示，在除去叔丁基之后可获得前体药的游 离酸形式：

                         反应路线13
通过使螺环酮与烷基羟基胺或芳基羟基胺一起反应，可制备硝酮， (I)型或(J)型的化合物。这些反应可如以下的反应路线14A和14B所述：

(如AF600：A＝O，R1＝Me，R5＝Me；AF601：A＝O，R1＝Et，R5＝Me；AF602： A＝O，R1＝Ph，R5＝Me；AF604：A＝O，R1＝Me，R5＝苄基；AF605：A＝O， R1＝Me，R5＝iPr)
                         反应路线14A

           (如AF603：A＝O，R1＝Me，R5＝Me)
                     反应路线14B
或者，通过使5元环羰基与烷基羟基胺或芳基羟基胺一起反应， 可制备结构(I)。得到的硝酮被环化来形成螺环结构。
被称为AF105(S)的分子式为 的 化合物在美国专利U.S.5,407,938中有所描述。然而，此化合物的合成 现已被改进。改进的合成如下面的反应路线15所述：

                     反应路线15
通过使4-吡啶甲基胺与乙酸酐/碘代甲烷进行反应，然后与 Lawesson氏试剂进行反应，获得AF150(S)。获得的碘化硫代吡啶盐被 还原为硫代乙酰胺基-四氢吡啶，其被环化形成AF150(S)。
当被制备成游离碱时，AF150(S)为无色液体。该游离碱可作为松 散材料在干燥真空下于暗的储藏库中进行冷藏(-20-0℃)。AF150(S) 也可作为盐而得到。在本发明的一种实施方案中，采用柠檬酸制造最 终用于大规模生产的稳定盐。通过使AF150(S)游离碱与柠檬酸在2-丙 醇和四氢呋喃溶液中相混合，制备得到AF150(S)的白色结晶柠檬酸盐。 与游离碱相比，盐具有以下性质：(a)即使在高温下也不会发生颜色变 化(增加稳定性测试)；(b)如果松散材料保持在无水条件下，即使在 高温下也表现出高稳定性(增加稳定性测试)。
在本发明的另一种实施方案中，AF150(S)被提供于药学上可接受 的石蜡油中。在40℃下于空气氛或氮气氛中并在存在或缺乏生育酚的 条件下，检测石蜡油中10％w/w AF150(S)的稳定性。0.1％以上未检测 到降解产物。在不存在生育酚的情况下，在样品中观察到有浅黄色， 但在含有0.5％w/w AF150(S)的情况下，样品的颜色未发生变化。
可注意到通过与间-氯代过苯甲酸/FeCl2进行如反应路线16所示 的反应，可从AF150(S)中除去N-甲基。

                      反应路线16
当AF150(S)与氧化试剂如间-氯代过苯甲酸进行反应时，获得了 AF406。

根据AF105(S)的合成反应路线，在合成的第一步中采用d3-碘甲烷 代替碘甲烷，获得了对AF105(S)进行14C-标记的冷模拟(cold simulation)，AF402。AF402的合成在以下的反应路线17中描述：

                      反应路线17
应该理解尽管在前面的说明书中，本发明的示例化合物已经列举 了哌啶和奎宁环，但适合于与所描述的螺5元环形成螺环结构的任何 其它含氮杂环都可被为此而取代。采用相应的酮制备此类化合物，正 如采用3-或4-哌啶酮制备上述化合物一样。对仅仅是示例性而非限定 性的实际实施例应用相似的评论。
本发明现在将以下面非限定性的实施例展开说明。
实施例1
(S)-2-乙基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮的合成

步骤1：合成2-巯基丁酸
将2-溴丁酸(3.2kg，19.16mol)放入冷的(冰水浴)烧瓶内。进 行搅拌并逐步加入(0.5h)氢氧化钾水溶液(18.2mol)，同时温度保持 在30-40℃。停止冷却并分次加入(0.5h)O-乙基二硫代碳酸钾(3.48kg， 21.7mol)，以使温度不超过50℃。在50℃下搅拌1小时，然后冷却 到15-20℃(冰水浴)。当温度保持在45-55℃时(外部冷却)，在20 分钟内加入乙二胺(2.6升(l)，～39mol)。得到的悬浮液在50℃下搅拌 2小时，冷却到20℃，过滤后用2×1.5升温水(40-50℃)洗涤固体。 合并滤液水溶液和洗涤液，冷却到20℃以下(冰水浴)，在温度保持 在45-55℃时缓慢加入硫酸水溶液[5.2l，50％(w/w)](0.5小时，至 pH为2)。将溶液冷却到30℃并转移到配备有机械搅拌器的25升容 器中。加入甲基-叔-丁基醚(MTBE，3升)，搅拌混合物在室温下过 夜。分离出上层的油相，在减压下过滤下层的水相，除去形成的沉淀。 用MTBE萃取水相，合并萃取物并除去MTBE。将油状残留物溶解在 环己烷(5升)中并保持在冰箱中过夜。形成了下层的相。分离出下层 的相并用环己烷进行萃取。将环己烷萃取物与上层的相合并，除去环 己烷，在真空中(54℃/2mmHg)干燥2-巯基丁酸(粗产物)，获得 了2-巯基丁酸(2.18kg，18.16mol)。
步骤2：合成AF267(外消旋物)
向烧瓶内引入2-巯基丁酸(705g，5.88摩尔)以及环己烷/叔-丁 基醇(1∶3.5(w/w)，4.3升)的混合物。所得溶液被搅拌并被加热 到40-60℃。向溶液内鼓入氨气气泡，直到全部或大部分的2-巯基丁基 酸被转化为其铵盐。停止鼓入氨气气泡，加热回流反应混合物，并加 入溶解于环己烷/叔丁醇混合物中的1-甲基-4-哌啶酮(496g，4.39mol) 溶液(500ml)。1小时后，溶液变清澈，重新鼓入氨气气泡，13小时 后(加入哌啶酮然后经过的反应时间)冷却反应混合物并在室温下过 夜。加入用水(两体积)的稀释浓酸水溶液(1体积)制备得到的盐酸 溶液(960ml)并搅拌混合物1小时。将得到的溶液(pH～2-3)冷却 到25℃，分离出下层的水相并用氢氧化钾转变为碱性(pH～8.5-9)， 然后保持在室温下过夜。过滤出沉淀的产物并用冷水(100ml)洗涤， 得到湿粉末。将滤液碱化至pH 9，并保持在5℃下过夜，过滤后用50ml 冷水洗涤得到72g粉末。重复相同的步骤以合成第二批AF267(乘以因 子1.2)。合并产物，得到1.6Kg的湿产物。将合并的粗产物溶解于4.5 升热水(95℃)中，过滤，使清澈的溶液在室温下保持10小时，过滤 并干燥24小时(50℃，1mmHg)，得到AF267(1.048kg，产率为50.7 ％)。浓缩滤液，在5℃下冷却过夜，过滤，洗涤(100ml冷水)并干 燥得到AF267(215g，产率为10.4％)。AF267的总产率为61％。沸点： 142-144℃；1H NMR(CDCl3)δ1.02(t，j＝7.3Hz，CH3CH2)，1.7-1.8(m， CH3CHH)，1.96-2.07(m)，2.30(s，NCH3)，2.3-2.36(m，2H)，2.6-2.7(bs， 2H)，3.80(dd，j＝8.7，3.9Hz，1H，SCH)ppm.MS m/e 214(M+)，181( M+-SH)；分析为(C10O18N2OS)计算值：C 56.04，H 8.47，N 13.07，S 14.96； 实际值：C 55.92，H 8.44，N 13.23，S 14.81。
步骤3：AF267B和AF267A的手性分离
Prochom LC 110高效制备液相色谱仪
柱：CHIRALPAKASV(批号JG 001)
泵流速：500ml/min
压力：12.7bar
柱温26℃
流动相：乙腈/EtOH 85∶15
浓度：37gr/l(克/升)
UV检测：240/230nm
洗脱之后，洗脱液被蒸发至干燥。
第一洗脱对映异构体(AF267A)：ee：99.7(687.1gr；纯度99.3％；产 率：97％)
第二洗脱对映异构体(AF267B)：ee：99.8(694.9gr；99.9％；产率： 98％)
进一步加入乙醇并蒸发至干燥，除去残留的溶剂(如乙腈)。
通过相似的合成方法，可以制备AF292和其他相关化合物。
实施例2
(S)-2-乙基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮(AF267B)的X-射 线单晶结构分析
晶体数据：C10H19NOS+H2O(一水合物)，透明，浅黄色，棱柱体，晶 体尺寸0.2×0.2×0.4mm3；晶系，斜方晶系，空间群：P212121(No 16) a＝10.394(10)(α＝90°)，b＝20.133(2)(β＝90°)，c＝5.856(4)(γ＝90°)，， 从25反射，T＝110K，体积＝1224.2(9)3，Z＝4，Fw＝202.32，计算密度， Dc＝1.092Mg/m3，吸收系数，μ＝0.232mm-1。
数据收集和处理：Rigaku AFC5R四圆衍射仪，MoKα，石墨单色器 (λ＝0.71073)，收集11461个反射，用于数据收集的θ范围： 2.82°≤θ≤27.53°；指数范围：-13≤h≤13，-26≤k≤26，0≤1≤7，ω扫描方法， 扫描宽度＝1.2°，扫描速度2°/分钟，典型的半高峰宽＝0.45°，所收集的3 个标准每个62次，而且强度改变3％；收集的反射：6272次测定，2833 个独立反射[R(int)＝0.0604，Bijvoet反射被保持分离]。
解析和精修：结构用直接法解析(AHELXS-97)。用基于F2的全矩阵 最小二乘法精修(SHELXL-97)。置入理想氢气，并在曲线运动模式 (riding mode)下精修，从差分傅立叶映射得到水氢值，148个参数；最 终的R指数：对于I＞2∑(I)wR2＝0.1484的数据，R1＝0.0671(基于F2)， 对所有数据R1＝0.0747，wR2＝0.1553，对F2＝1.13的拟合优度，S原子 周围的最大电子密度＝0.745e/-3。
绝对构型：采用Flack’s参数方法和对对映体的双生组分的交替精修， 以确定分子的绝对构型。两种方法明确表明了本同等物属于正确的绝 对构型(S对映体)。从甲苯/石油醚/甲醇中进行结晶，制备得到此化 合物的晶体。

             结构1：C10H19NOS+H2O的ORTEP结构
实施例3
(R)-2-乙基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮，AF267A的手性 合成

为了模式化S对映异构体的合成，采用在合成AF267中的任意活 性的2-巯基丁酸进行AF267A的不对称合成。从具有S构型的L-(+)-2- 氨基丁酸(I)开始，制备任意活性的2-巯基丁酸。用亚硝酸钠、溴化钾 和氢溴酸进行处理，使氨基酸转化为构型保持的(S)-2-溴丁酸(II)。用在 (R)-(+)-N-苄基-α-甲基-苄基胺存在下进行测量的氢谱NMR检测得到 的溴化物的对映体纯度，并与在相同条件下测定的外消旋溴化物的谱 图比较。通过该方法观测到只有一种对映体存在。用存在于DMF中的 硫代苯甲酸铯进行处理，使溴化物转化为(R)-2-苄氧基硫代丁酸(III)(伴 随构型翻转)。通过氨解作用(1N室温下的氢氧化铵)，在不发生外 消旋化的情况下完成了(III)的去苯甲酰基。
通过蒸馏提纯所得到的(R)-2-巯基丁酸，然后与乙酸铵和1-甲基-4- 哌啶酮在沸腾的环己烷中进行反应。通过采用手性柱的GC分析粗反 应混合物，发现AF267A中伴随有少量的(2-3％)AF267B。
实施例4
手性合成(S)-2-乙基-8-甲基-1-硫-4，8-二氮-螺[4.5]-癸-3-酮AF267B
除采用的原料为(R)-2-溴丁酸之外，按照实施例3制备得到该化合 物。
实施例5
合成(S)-2-乙基-1-硫-4，8-二氮-螺[4.5]-癸-3-酮，AF292

用超过15分钟的时间将间-氯代过苯甲酸(mCPBA)(70％，总 共为7.02gr，0.028mol)以多个小份加入到溶于二氯甲烷(60ml)中 的AF267B(6.1gr，0.028mol)的冷却(冰盐浴)搅拌的溶液中。搅拌混 合物达1小时，然后加入氯化亚铁(II)(2.14ml浓度为1M的水溶液)。 搅拌和冷却(-10℃)继续1小时，然后在室温下继续搅拌2小时。加 入乙二胺(1.9ml，0.285mol)、氢氧化钠(30.5ml，浓度为2N的水 溶液)和40-60℃的石油醚(60ml)。剧烈搅拌后分离各层，用1∶1 的二氯甲烷/石油醚(600ml)的混合物萃取水相，然后用二氯甲烷(第 一次600ml，然后是300ml)萃取水相。干燥合并的萃取物(Na2SO4)， 过滤，在减压下除去溶剂。残留物在快速制备色谱法(flash chromatography)(硅胶60，230-400目，Merck 1.09385，用甲醇/ 氯仿/氢氧化铵10∶89∶1 v/v洗脱)后，得到AF292。1H NMR(CDCl3) δ1.02(t，j＝7Hz，3H)，1.76 1.92和2.07(3xm，6H)，2.84(m，2H)，3.04(m， 2H)，3.83(dd，j＝8.8，4Hz，1H)，7.66(NH)ppm；13C NMR(CDCl3)δ 11.50，27.24，42.87，43.95，44.10，48.80，64.22，175.22ppm：MS m/e 200 (M+)。通过HPLC，GC得到的化合物纯度＞99.9％。
加入盐酸(在甲醇中，浓度为4M)形成了AF292的盐酸盐，然 后用甲醇-二乙醚剂进行重结晶，得到白色的沉淀，对沉淀进行过滤和 干燥。1H NMR(D2O)δ0.78(t，j＝7.3Hz，3H)，1.58(m，1H)，1.76(m，1H)， 2.05(m，4H)，3.07(m，2H)，3.30(m，2H)，3.92(dd，j＝7.9，4.0Hz，1H) ppm。
实施例6
制备[ 14 C]-2-乙基-8-甲基-1-硫-4，8-二氮-螺[4.5]-癸-3-酮；R和S异构体的 反应

用注射器向装配有磁力棒和氮气入口，且罩有隔膜的干燥烧瓶(10 ML)中加入溶于干THF(1.4ml)中的二异丙胺(0.078ml，0.56mmol)溶液， 并冷却到0℃。加入n-BuLi(溶于己烷，浓度为0.9M，0.62ml，0.56 mmol)，反应混合物在0℃下搅拌20分钟，然后冷却至-78℃。将溶于 干燥THF(0.4ml)和干燥的N，N’-二甲基-N，N’-亚丙基脲(DMPU)(0.6ml) 的AF287(0.1375gr，0.51mmol)的溶液滴加到到反应混合物中(30分 钟)，并使反应混合物在-78℃下搅拌20分钟。一次加入1-位碳被14C 标记的溴乙烷(0.043ml，0.56mmol)，升温至室温，反应混合物继续搅拌 4小时。在减压下除去溶剂，第一次减压是在25℃下用水泵抽20分钟， 然后在在～60℃下采用油泵(～4mmHg)抽～30分钟(采用引入空气流 的针更快地除去溶剂)。对残留物的快速制备色谱处理得到了外消旋的 AF267(95mg，产率～86％)。可采用制备手性HPLC(preparative chiral HPLC)分离对映异构体。采用未标记的溴乙烷按照以上的步骤进行， 对在快速制备色谱之后所得到的60mg外消旋物进行制备HPLC，产生 未同位素标记的AF267B(17.6mg)。
实施例7
合成(S)-2-乙基8-甲基8-氧代-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮， AF299

向冷却(0℃)和搅拌的，溶于二氯甲烷(40ml)的AF267B(2.07gr， 9.67mmol)溶液中加入溶于二氯甲烷(40ml)的mCPBA(70％，2.62gr， 10.64mmol)溶液。移去冷却浴，反应混合物在室温下搅拌2小时，然 后在减压下除去溶剂。对残留物进行快速制备色谱(甲醇/氯仿/氢氧化 铵10∶89∶1 v/v)处理，并从甲醇-乙腈中得到固体产物沉淀，而得到N- 氧化物，AF299；1H NMR(CDCl3)δ0.99(t，j＝7.3Hz，CH3CH2)，1.74 和2.09(2m，CH3CH2)，1.82(m，2H)，3.9(m，2H)，3.36(s，CH3N+)，3.33-3. 45(m，4H)，3.78(br NH)，3.83(dd，j＝3.74，8.84Hz，CH3CH2CH)ppm； MS m/e 230(M+)。
实施例8
合成(S)-2-乙基-8-甲基-1-氧代-1λ 4 -硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮， AF300

冷却溶于水(2.5ml)的AF267B(1.72gr，0.008mol)的溶液(冰水浴)， 并加入三氟乙酸(3.5ml)。向所得到的冷却的经搅拌的混合物中加入过 氧化氢(30％，0.57ml，0.008mol)，移去冷却浴并在室温下搅拌反应混合 物过夜。加入亚硫酸钠，用碳酸钠的饱和溶液调节溶液的pH至9。采 用二氯甲烷(2×100ml)萃取水相，然后再用乙酸乙酯(1×50ml)萃取水相。 合并得到的有机萃取物，干燥(MgSO4)，蒸发除去溶剂。快速制备色谱 (硅胶60，230-400目，Merck 1.09385，用甲醇/氯仿/氢氧化铵10∶89∶1 v/v洗脱)处理后得到AF300。1H NMR(CDCl3)δ1.19(t，j＝7.3Hz，3H， CH3)，1.85-2.0(m，5H)，2.17(m，1H)，2.27(m，1H)，2.34(s，3H，NCH3)， 2.6(m，2H)，3.30(dd，j＝3.56，11.13 Hz，CH3CH2CH)，6.37(br NH)ppm； MS(EI)m/e 230(M+)。
实施例9
合成2-(1-羟基-乙基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮 (AF298)

在氩气氛下，向溶于干THF(12ml)的二异丙胺(0.28ml，0.002mol) 的冷(0℃)溶液中加入正丁基锂(溶于己烷中，浓度为1.4M，1.4ml， 0.002mol)的溶液，搅拌混合物20分钟后冷却到-78℃。滴加溶于THF (3ml)的AF287(0.41g，0.0015mol)的溶液(10分钟)后，继续在-78℃ 下搅拌所得到的混合物10分钟。一次性加入乙醛(0.85ml，0.015mol)， 10分钟后在-78℃下一次性加入乙酸(0.11ml，0.002mol)，升温至室温。 将反应混合物加入氯仿中(200ml)，用水(2×20ml)洗涤有机相，分离 并干燥。蒸发除去溶剂，用快速制备色谱(二氧化硅， CHCl3/MeOH/NH4OH 80/20/1)处理残留物，得到AF298(0.132g)。 1H-NMR(CDCl3)δ1.24(d，j＝6.05Hz，3H，CH3)，1.7-2.2(m，CH2)，2.31 (s，3H，NCH3)，2.60-2.80(m，CH2)，3.71(d，j＝9.41Hz，1H，SCH)，3.94-4. 04(m，1H，CHO)，4.75-4.9(br OH)，7.1-7.2(br NH)ppm.MS m/e 230(M+ )。
实施例10
合成(S)2-乙基-4-(4-氟-苯磺酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸 -3-酮，AF700

在氩气气氛下，用超过15分钟的时间将AF267B(1.5g，0.007mol) 分成小份加入六甲基二硅氮烷锂(8ml，1M，溶于THF中)的冷溶液(0℃， 冰水浴)中。移去冷却浴，反应混合物在室温下搅拌40分钟。加入4- 氟苄基磺酰基氯(1.37g，0.007mol)(在添加过程中，温度保持在20℃ 以下，冷却浴)，反应混合物在氩气气氛中保持在室温下过夜。加入 二氯甲烷(100ml)。用水(20ml)洗涤反应混合物，分离出有机相，干燥 (MgSO4)并蒸发。用快速制备色谱(二氧化硅，乙酸乙酯/甲醇/氨水溶液 10/2/0.1)处理得到AF700(0.46gr，0.0015mol)。1H-NMR(CDCl3，300 MHz)δ0.94(t，j＝7.14Hz，3H，CH3)，1.64-1.77(m，3H，CHH+CH2)， 1.88-2.00(m，3H，CHH+CH2)，2.15-2.29(br，2H，CH2)，2.29(s，3H， NCH3)，2.51-2.60(br，2H，CH2)，4.24(dd，j＝7.99，3.72Hz，1H，SCH)， 7.21(app.t，j＝8.53Hz，2H，Ar)，8.07-8.12(m，2H，Ar)。
实施例11
合成8-甲基-4-吡咯烷-1-基甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5-癸-3-酮， AF287

使溶于乙醇(2.3ml)的8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮 (AF277 5.13g，0.0275mol)，甲醛(37％溶液，2.75ml)和吡咯烷(2.3ml， 0.0275mol)的溶液回流4小时，然后保持在室温下过夜。加入甲苯 (10ml)，蒸发掉溶剂。向残留物中加入沸腾的戊烷(100ml)，倾出溶液。 重复4次用热戊烷进行的捣碎(trituration)，合并戊烷层，冷却到0℃ 并收集沉淀，沉淀被鉴定为是AF287(4.6gr，产率为63％)。1H-NMR (CDCl3)δ1.69-1.77(m，5H)，2.20-2.29(s和m，5H，CH3和CH2)， 2.43-2.58(m，6H)，2.82-2.86(m，2H)，3.50(s，2H，SCH2)，4.14(s，2H， NCH2N)ppm.MS(EI)m/e 269(M+)；198；84；70。
实施例12
合成2-乙基-4-(3-1H-吲哚-3-基-丙酰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺 [4.5]-癸-3-酮，AF704

溶于二氯甲烷(120ml)中的AF267(1.2gr，0.0056mol)，3-吲哚丙酸 (1.37gr，0.0072mol)，二环己基碳二亚胺(DCC)(1.57gr，0.0076mol)和4- 二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.93gr，0.0076mol)在室温下搅拌3天。用水 (2×40ml)洗涤反应混合物，干燥有机相并进行蒸发。用快速制备色谱(二 氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理得到标题化合物，用丙酮捣 碎此化合物。过滤溶液以除去杂质，然后蒸发掉丙酮，在乙醚中捣碎 获得的稠油。得到的固体(AF704)，400mg，被过滤并干燥。Mp. 122.5-124.5℃；1H-NMR(CDCl3)δ1.01(t，j＝7.4Hz，3H，CH3CH2)，1.50 (m，1H)，1.59(m，1H)，1.61-1.73(m，1H，CH2CHH)，2.1-2.15(m，1H， CH3CHH)，2.18(dt，j＝12.4，2.4Hz，1H)，2.29(s，3H，NCH3)，2.33(m，1H)， 2.83(m，2H)，2.99(dt，j＝12.55，4.39Hz，1H)，3.01(t，j＝7.42Hz，2H， CH2)，3.16(dt，j＝12.7，4.39Hz，1H)，3.28(m，2H)，3.67(dd，j＝8.9， 4.18Hz，1H，SCH)，7.04(br s，C＝CH)，7.11(t，j＝7.8Hz，ArH)，7.18(t，j＝ 7.1Hz，ArH)，7.34(d，j＝8.08Hz，ArH)，7.64(d，j＝7.58Hz，ArH)，8.01(br NH)ppm；MS(EI)m/e 385(M+)，214，181，171，143，130(100％)。
当原料为AF267B时，得到的是对映异构物AF704B。
实施例13
合成2-乙基-4-[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺 [4.5]-癸-3-酮，AF703

在配备有磁力搅拌器、迪安-斯达克榻分水器(Dean-Stark)和滴液漏 斗的三口烧瓶内，溶解于正丁醇/环己烷(30/104 gr/gr，86ml)的混合物中 的2-巯基丁酸(7.38gr，0.065mol)被加热到40℃。分4份加入色胺(10.8gr， 0.068mol)(20分钟)，反应混合物继续搅拌45分钟，然后加热至回流。 在40分钟内滴加入溶于正丁醇/环己烷(30/104 gr/gr，10ml)中的1-甲基 -4-哌啶酮(6.18ml，0.049mol)，继续回流5小时(收集到1ml水)。加入 HCl/水的混合物(2∶2 v/v)直到pH 2-3，分离出水相，用氢氧化钾溶液碱 化到pH 10，然后用二氯甲烷萃取。分离出有机相，干燥并蒸发掉溶剂。 用快速制备色谱(二氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理残留物 得到标题化合物。从沸腾的己烷中进行重结晶，得到纯的AF703。 1H-NMR(CDCl3)δ1.04(t，j＝7.35Hz，3H，CH3)，1.65-1.68(m，2H)， 1.71-1.80(m，1H，CH3CHH)，2.13-2.34(m，5H)，2.31(s，3H，NCH)，2.86 (m，2H)，3.05-3.10(m，2H)，3.41-3.49(m，1H)，3.51-3.65(m，1H)，3.80 (dd，j＝8.8，3.9Hz，1H，SCH)，7.02(d，j＝2.32Hz，1H，ArH)，7.14(ddd，j＝ 7.35，7.35，1.17Hz，1H，ArH)，7.20(ddd，j＝7.45，7.45，1.39Hz，1H，ArH)， 7.35(d，j＝7.4Hz，1H，ArH)，7.77(d，j＝7.42Hz，1H，ArH)，8.03(br NH) ppm。
实施例14
合成2，8-二甲基-1-硫杂-3，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-2-烯AF150(S)

步骤1：合成碘化4-(乙酰氨基甲基)-1-甲基-吡啶鎓
向溶于甲醇(3升)的吡啶甲基胺(1070gr，9.9mol)的冷(冰水浴)溶液 中滴加入乙酸酐(1400gr，13.7mol)。在加料过程中，反应温度保持在 10到30℃之间。当试剂加入完成时，使反应混合物保持在室温下过夜。 在氮气氛下将碘甲烷(800ml，24.8mol)加入到用水浴冷却的反应混合 物中。加料过程中，反应温度保持低于25℃。当加料完成时，反应混 合物避光保护并保持在室温下过夜。蒸发掉过量的碘甲烷，促使结晶， 使反应混合物冷却(冰浴)并加入异丙醇(1.5升)。反应混合物保持在 -30℃下过夜，过滤出沉淀，用异丙醇洗涤并干燥。得到碘化4-(乙酰 氨基甲基)-1-甲基-吡啶鎓的黄色粉末状(2043gr，7mol)(产率为71％)。 1H-NMR(D2O)δ2.10(s，CH3CO)，4.32(s，CH3N+)，4.63(s，CH2NHCO)， 7.89(d，j＝6.6Hz，2H)，8.67(d，j＝6.6Hz，2H)ppm。
步骤2：合成碘化1-甲基4-N-硫代乙酰氨基甲基吡啶鎓
将溶于乙腈(6升)的碘化4-(乙酰氨基甲基)-1-甲基-吡啶鎓A (1.92kg，6.5mol)和Lawesson′s试剂(1.87kg，4.6mol)的搅拌后溶液加热 到80℃达17小时。然后将反应混合物冷却到室温并继续搅拌4小时。 过滤出粗硫代酰胺，用乙腈(2.8升)洗涤。向得到的硫代酰胺中加入乙 酸乙酯(10升)，悬浮液回流1小时。在72-73℃下生成了有害气体，用 NaOH溶液捕获该有害气体。将悬浮液冷却到60℃。过滤出硫代酰胺， 用乙酸乙酯(2升)洗涤并干燥(45℃)。得到2kg硫代酰胺。
步骤3：合成1-甲基4-N-硫代乙酰氨基-1，2，3，6-四氢吡啶
在25升的烧瓶中，制备存在于水(6.2升)中的碘化1-甲基4-N-硫 代乙酰氨基甲基吡啶鎓的悬浮液，并在室温下进行搅拌。用超过3.5 小时的时间滴加入溶于水(1.2升)的硼氢化钠(383gr，10.1mol)的溶液， 使温度保持低于32℃。反应混合物在室温下搅拌2小时，加入乙醇 (600ml)，并继续搅拌30分钟。加入碳酸钠(780g)，反应物搅拌过夜。 加入二氯甲烷(4升)，继续搅拌45分钟。过滤溶液以去除固体，用氯 仿(1升)和水(0.5升)洗涤固体。倾出滤液，用氯仿(2.5升)萃取水相。 合并有机相并用10％硫代硫酸钠溶液(2.2升)洗涤。用氯仿(1升)萃取水 相，合并有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。加入丙酮(1.5升)，在 室温下搅拌悬浮液30分钟，然后在0℃下搅拌45分钟。过滤出硫代 乙酰胺，用丙酮(1.5升)洗涤并干燥(50℃)。得到860gr硫代乙酰胺。 mp.140℃；1H NMR(CDCl3)δ2.21(m，2H)，2.36(s，CH3N)，2.56(s， CH3CS)，2.57(t，2H)，2.95(m，2H)，4.23(d，CH2NH)，5.65(m，CH＝C)， 7.41(bs，NH)ppm.MS m/e 184(M+)，151，150，149，141，140，126， 114，109(100％)，109，96，94，82，70。
步骤4：合成2，8-二甲基-1-硫杂-3，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-2-烯AF150(S)
在配备有机械搅拌器的三口圆底烧瓶(5升)中搅拌多磷酸(2.1kg) 并加热到100℃。将硫代乙酰胺(840gr)分成小份加入。加料完成时将温 度升高至170℃，并该温度保持2-3小时。将热反应混合物缓慢地倾入 搅拌下的碳酸钠的冷水溶液中(25％，10升)。加入氢氧化钠水溶液(50％， 350ml)以提高碱性。用氯仿(2×3升)萃取反应混合物，合并有机相，干 燥(Na2SO4)并蒸发。将残留物溶解于石油醚(3.5升)中，得到溶液和少 量不溶的物质。蒸发石油醚溶液，得到粗AF150(S)。重复所述的步骤， 用活性碳处理合并后的各批的粗AF150(S)，然后在减压下蒸馏两次(0. 5mmHg，61℃)，得到AF150(S)(＞1.2Kg，总产率为40％)。1H NMR (CDCl3)δ1.8-2.0(m，4H)，2.18(t，3H，CH3C)，2.28(s，3H，CH3N)，3.9 (m，2H，CH2)ppm；IR(C＝O)1636cm-1；MS.M/e 184(M+)。
实施例15
合成2，8-二甲基-1-硫杂-3，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-2-烯-8-氧化物AF406

向溶于二氯甲烷(10ml)中的AF150(S)(1.45gr，7.88mmol)溶液中逐 渐加入溶于二氯甲烷(30ml)的间-全氯代过苯甲酸，mCPBA，(1.40gr， 8.11mmol)的溶液。反应在室温下搅拌过夜。采用天然氧化铝柱(Merck) 的色谱(甲醇∶氯仿1/49)处理反应混合物，得到AF406的晶体固体 (0.75gr)。样品在从乙酸乙酯中结晶。得到了吸湿性很强的固体。mp. 130-132℃(145-159℃dec.)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.89(m，2H)， 2.2(t，j＝1.5Hz，CH3C＝N)，2.82(m，2H)，3.24(m，2H)，3.25(s，CH3N+O-)， 3.35(m，2H)，4.03(q，j＝1.5Hz，CH2N＝C)ppm；IR(CHCl3)2947，1636， 1448，1153，931，664 cm-1；MS(EI)200(M+)，184，182，149，141，140，126， 110，109，108，96，82，70。
实施例16
合成2-甲基-1-硫杂-3，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-2-烯，AF400

在冰盐浴中使溶于氯仿(10ml)中的AF406(2gr，0.01mol)溶液冷却 到-10℃--5℃。加入FeCl2的溶液(1M，0.7ml)，搅拌两相反应混合物达 4.5小时。反应混合物的颜色随着时间从深绿色变到深橙棕色。向冷却 的反应混合物中小心地加入石油醚(10ml)，乙二胺(亚乙基二酰胺， 600mg，0.01mol)和2N氢氧化钠(10ml，0.02mol)的混合物。水相的pH 为13。分离出有机相，水相用氯仿萃取，用5N HCl酸化至pH为9， 然后再用氯仿萃取。合并所有的有机部分，用碳酸钾干燥，过滤并蒸 发。采用色谱[硅胶(RIEDEL DE Haen 31607)，CHCl3∶MeOH∶NH4OH90/9/1]处理残留物，得到AF400。mp.40℃；1H NMR(CDCl3)δ1.74 (m，2H)，1.92(m，2H)，2.19(t，j＝1.8Hz，3H)，2.71(m，2H)，3.05(m，2H)， 3.92(q，j＝1.8Hz，2H)ppm；MS m/e 171(M++1)，170(M+)。
实施例17
合成2-甲基-8-甲基-d 3 -1-硫杂-3，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-烯，AF402

向溶于甲醇(200ml)的4-吡啶甲基胺(50g，0.462mol)的搅拌冷(冰 水浴)溶液中缓慢加入乙酸酐(75g，0.735mol)(1小时)。加料过程中温 度保持为10-15℃。反应混合物保持在室温下过夜。TLC[二氧化硅，氯 仿/甲醇/氨水(33％)90∶10∶1(v/v)]在Rf～0.4出现一个点。产物N-吡啶 -4-基甲基-乙酰胺不分离，进行下一步反应。
蒸发掉部分反应混合物(43ml)。得到了黄色油状的乙酰胺盐 (14.5g)。将部分油(1.9g，≤0.06mol)溶解于甲醇中(40ml)，在氮气氛中 搅拌并避光保护。加入碘甲烷-d3(10g，0.07mol)，使反应混合物保持在 15-25℃的温度下。反应混合物保持在室温下过夜，然有用乙醚 (2×200ml)捣碎两次。得到黄色固体碘化4-(乙酰胺-甲基)-1-甲基-d3-吡 啶鎓，TLC[二氧化硅，氯仿/甲醇/氨水(33％)90∶10∶1(v/v)]在Rf～ 0.05处出现一个点，  无需进一步纯化，产物即可在下一步骤中发生还 原。
在氮气气氛下，向溶于甲醇(40ml)的碘化吡啶鎓的冷溶液(冰水浴) 中逐步加入硼氢化钠(3.9gr，0.2mol)(2hr)，使温度保持在15-30℃，反 应混合物在室温下继续搅拌2小时，然后在不搅拌的情况下过夜。蒸 发除去溶剂。得到N-(1-甲基-d3-1，2，3，6，-四氢吡啶-4-基甲基)-乙酸胺， 其为粘性的微黄色油(8.5g)。1H-NMR(CDCl3)δ1.98(s，3H，CH3CN)， 2.12(m，2H)，2.52(t，2H)，2.91(m，2H)，3.76(d，CH2NHCO)，5.52(m， CH＝C)，6.66(br.s，NH)ppm.MS m/e 172(M+)。
在配备有加液漏斗和顶上带有氯化钙管的冷凝器的三口圆底烧瓶 (250ML)中，加入溶于干的乙腈(70ml)中的四氢吡啶乙酰胺(8.5gr)溶 液。向搅拌的溶液中加入五硫化磷(6.7gr，0.03mol)，然后在10-15分 钟内从加液漏斗加入三乙胺(12gr，0.12mol)。将得到的溶液加热回流5 小时，然后在15℃保持3天。溶液蒸发后，用10％碳酸钾水溶液碱化， 然后用氯仿萃取。干燥有机相并进行蒸发。得到黑色的粗N-(1-甲基 -d3-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基甲基)-硫代乙酰胺(6.62gr，0.036mol)。 1H-NMR(CDCl3)δ2.21(m，2H)，2.56(s，CH3CS)，2.58(t，j＝4.4Hz，2H)， 2.97(m，2H)，4.23(d，j＝4.4Hz，CH2NH)，5.65(m，CH＝C)，7.41(br s，NH) ppm.MS m/e 187(M+)。
在烧瓶中(150ml)，将多磷酸(30g)加入到粗硫代乙酰胺(6.5gr)中。 搅拌反应物并加热到170℃下，保持3.5小时。将热的反应混合物缓慢 倾入搅拌后的25％碳酸钠水溶液中(150ml)。向反应烧瓶内的残留物中 加入25％碳酸钠水溶液(50ml)，合并两种溶液。加入50％氢氧化钠 水溶液(6ml)使碱性升高，并用氯仿萃取反应混合物。分离有机相，使 其干燥并进行蒸发。将残留物溶解于石油醚(100ml)中，12小时后在-20 ℃得到溶液和少量的不溶物。蒸发石油醚溶液，在减压下(b.p.50-53℃， 0.2mmHg)蒸馏所获得的油(5g)，得到AF402(2.15g，0.012mol)。1H-NMR (CDCl3)δ1.87(m，2H)，1.94(m，2H)，2.1(m，2H)，2.2(t，j＝1.7Hz，3H)， 2.76(m，2H)，3.92(m，2H)ppm.MS m/e 187(M+)。
实施例18
合成N-[(2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-亚癸-3-基)-甲基-胺]-N-氧化 物，AF600

向溶于乙醇(13.5ml)中的盐酸N-甲基羟基胺(0.85gr，0.01mol)溶液 中加入乙酸钠(0.84gr，0.01mol)，得到白色沉淀。加入溶于乙醇(7ml)的 2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-3-酮(1.62gr，0.0088mol)溶液，在 室温下搅拌混合物达4.5小时。蒸发除去溶剂，加入二氯甲烷(675ml)， 用20％碳酸钠水溶液洗涤所得到的溶液。干燥有机相，蒸发除去溶剂 后，用快速制备色谱法(二氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理得 到AF600(1.5gr)，其为两种异构体的混合物[较少的极性异构体(A)/ 较多的极性异构体(B)1∶4]。1H-NMR(CDCl3)δ1.45[d，j＝6.37Hz，CH3(A)]，1.54[d，j＝6.48Hz，CH3(B)]，1.7-1.9(m)，2.29[s，NCH3(A)]，2.31 [s，NCH3(B)]，2.32-2.5(m，3H)，2.62(s，CH2)，3.63[s，CH3NO(A)]，3.68 [s，CH3NO(B)]，4.78[br CH(A)]，4.85[br CH(B)]ppm.MS m/e 212(M+ )，196，169，126，110，96，70。
实施例19
合成N-[(2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-亚癸-3-基)-苄基-胺]-N-氧化 物，AF604

向溶于乙醇(6ml)中的盐酸N-苄基羟基胺(1.27gr，0.008mol)溶液中 加入乙酸钠(0.65gr，0.008mol)，得到白色沉淀。加入溶于乙醇(3.5ml)的 2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-3-酮(1.3gr，0.0072mol)溶液，在室 温下搅拌混合物达4小时。蒸发除去溶剂，加入二氯甲烷(450ml)，用 20％碳酸钠水溶液洗涤所得到的溶液。干燥有机相，蒸发除去溶剂后， 用快速制备色谱法(二氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理得到 AF604(1.81gr)，其为两种异构体的混合物[较少的极性异构体(A)/较 多的极性异构体(B)1∶8]。1H-NMR(CDCl3)δ1.42[d，j＝6.35Hz，CH3(A)]，1.53[d，j＝6.45Hz，CH3(B)]，1.7-1.9(m)，2.29(s，NCH3)，2.32-2.55 (m)，2.62(m，CH2)，4.85(br CH)，4.91[s，CH3NO(A)]，4.97[s，CH3NO(B)]ppm.MS m/e 288(M+)，272，254，197，153，91(100％)。
实施例20
合成N-[(2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-亚癸-3-基)-异丙基-胺]-N-氧 化物，AF605

向溶于乙醇(7ml)中的盐酸正异丙基羟基胺(1.84gr，0.01mol)溶液中 加入乙酸钠(0.91gr，0.011mol)，得到白色沉淀。加入溶于乙醇(4ml)的 2，8-二甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-3-酮(1.84gr，0.01mol)溶液，在室 温下搅拌混合物达4.5小时。蒸发除去溶剂，加入二氯甲烷(500ml)， 用20％碳酸钠水溶液洗涤得到的溶液。干燥有机相，蒸发除去溶剂后， 用快速制备色谱法(二氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理得到 AF605(1.5gr)，其为两种异构体的混合物[较少的极性异构体(A)/较多 的极性异构体(B)1∶4]。1H-NMR(CDCl3)δ1.40(d，j＝6.6Hz，CH3CH2)， 1.42[d，j＝6.2Hz，CH3(A)]，1.6-1.8(m)，2.29[S，CH3(A)]，2.31[s，CH3(B)]，2.35-2.57(m，3H)，2.63-2.71(m，2H，CH2)，4.05[m，CHNO(A)]， 4.18[m，CHNO(B)]，4.83(m，1H，OCH)ppm.
实施例21
合成N-[(2-乙基-8-甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-亚癸-3-基)-甲基-胺]-N- 氧化物，AF601

向溶于乙醇(14.3ml)中的盐酸N-甲基羟基胺(0.95gr，0.011mol)溶液 中加入乙酸钠(0.94gr，0.011mol)，得到白色沉淀。加入溶于乙醇(7.4ml) 的2-乙基-8-甲基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-3-酮(2.1gr，0.01mol)溶液， 在室温下搅拌混合物达5.5小时。蒸发除去溶剂，加入二氯甲烷(770ml)， 用20％碳酸钠水溶液洗涤得到的溶液。干燥有机相，蒸发除去溶剂后， 用快速制备色谱法(二氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理得到 AF601(2.4gr)，其为两种异构体的混合物[较少的极性异构体(A)和较 多的极性异构体(B)]。1H-NMR(CDCl3)δ0.94[t，j＝7.4Hz，CH3CH2(B)]，0.99[t，j＝7.4Hz，CH3CH2(A)]，1.59(m，1H)，1.74-1.86(m)， 1.98-2.05(m，2H)，2.29[s，NCH3(A)]，2.30[s，NCH3(B)]，2.45-2.60(m， 5H)，3.63[s，CH2(A)]，3.69[s，CH2(B)]，4.66[br OCH(A)]，4.78[br OCH(B)]ppm.Ms m/e 226(M+)，209，197，181，169，152，138，126，110， 96，70。
实施例22
合成N-[(2-甲基-8-苯基-1-氧杂-8-氮杂-螺[4.5]-亚癸-3-基)-甲基-胺]-N- 氧化物，AF602

向溶于乙醇(5.4ml)中的盐酸N-甲基羟基胺(0.33gr，0.004mol)溶液 中加入乙酸钠(0.32gr，0.004mol)，得到白色沉淀。加入溶于乙醇(3ml) 的8-甲基-2-苯基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]癸-3-酮(0.85gr，0.004mol)溶 液，在室温下搅拌混合物达4.5小时。蒸发除去溶剂，加入二氯甲烷 (250ml)，用20％碳酸钠水溶液洗涤所得到的溶液。干燥有机相，蒸 发除去溶剂后，用快速制备色谱法(二氧化硅，CHCl3/MeOH/NH4OH90/10/1)处理得到AF602(130mg)，其为两种异构体的混合物[较少的 极性异构体(A)/较多的极性异构体(B)1∶3]。1H-NMR(CDCl3)δ1.24(m， CH2)，1.7-1.97(m)，2.29[s，NCH3(A)]，2.31[s，NCH3(B)]，2.32-2.5(m)， 2.72(m，CH2)，3.30(m)，3.67[s，CH3NO(B)]，3.71[s，CH3NO(A)]，5.49 [br CH(A)]，4.74[br CH(B)]，7.28-7.56(m，ArH)ppm.MS m/e 274(M+)， 257(100％)，245，168，112，96，70。
实施例23
合成二氢-5’-甲基螺[1-氮杂二环[2.2.2]辛烷-3，5’-(4’H)-3’-基-甲基胺]-N- 氧化物，AF603

向溶于乙醇(15ml)中的盐酸N-甲基羟基胺(1.17gr，0.014mol)溶液 中加入乙酸钠(1.15gr，0.014mol)，得到白色沉淀。加入溶于乙醇(7.4ml) 的二氢-5’-甲基螺-[1-氮杂二环[2.2.2]辛烷-3，5’-(4’H)-3’-酮(2.1gr， 0.01mol)溶液，在室温下搅拌混合物达4.5小时。蒸发除去溶剂，加入 二氯甲烷(770ml)，用20％碳酸钠水溶液洗涤所得到的溶液。干燥有机 相，蒸发除去溶剂后，用快速制备色谱法(二氧化硅， CHCl3/MeOH/NH4OH 90/10/1)处理得到AF601(0.45gr)，其为两种异构 体的混合物[较少的极性异构体(A)和较多的极性异构体(B)]。 1H-NMR(CDCl3)δ1.22[t，j＝7.09Hz，CH(B)]，1.46[t，j＝7.0Hz， CH(A)]，1.35[d，j＝6.5Hz，(CH3)2CH]，1.41-1.58(m)，1.57-1.9(m)，2.59(m)， 2.67-3.01(m)，3.01-3.26(m)，3.47[s，N(O)CH3(A)]，3.49(m)，3.52[s， N(O)CH3(B)]ppm.MS m/e 224(M+)，207，195，178，138，124，96，83 (100％]。
实施例24
合成2-乙基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-硫酮，AF510

在回流条件下加热溶于乙腈(5ml)的AF267(214mg，1mmol)和路 易斯试剂(Lawesson′s试剂)(280mg，0.692mmol)达17小时。除去溶 剂，将残留物溶解于碳酸钠的浓缩水溶液中(0.5ml)，然后用乙酸乙酯 萃取。干燥萃取物，蒸发除去溶剂。首先在甲苯中重结晶残留物 (250mg)，然后再在乙腈中重结晶，得到纯化的AF510。1H-NMR(CDCl3) δ1.03(t，CH3CH2)，1.83(m)，1.93-2.44(m)，2.30(s，CH3N)，2.80(m，2H)， 4.21(dd，SCH)，8.66(br，NH)ppm.MS m/e 230(M+)，197(M+-SH)，156， 128，96(100％)。
实施例25
合成4-苄基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮，AF282

在配备有磁力搅拌器和迪安-斯达克榻分水器(Dean-Stark)以及两 个滴液漏斗的三口烧瓶内，将溶于苯(75ml)的巯基乙酸(8ml，0.242mol) 的溶液加热至回流。同时滴加入苄基溴(13ml，0.242mol)和1-甲基-4- 哌啶酮(9.3ml，0.08mol)(45min)，反应混合物继续回流1.5小时(收集到 2ml水)。将反应混合物冷却到室温，加入水(30ml)，分离出水相，干 燥后蒸发除去溶剂。用快速制备色谱法(二氧化硅，溶于氯仿的甲醇， 浓度10％)处理残留物得到AF282(3.8g)。1H-NMR(CDCl3)δ1.65(m， 2H)，2.19(m，4H)，2.27(s，3H，NCH3)，2.78(m，2H)，3.64(s，2H，SCH2)， 4.78(s，2H，NCH2)，7.25(5H，Ar)ppm.
实施例26
合成4-(2，4-二甲氧基苄基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮， AF286

在配备有磁力搅拌器和迪安-斯达克榻分水器(Dean-Stark)的三口 烧瓶内，使溶于苯(5ml)的1-甲基-4-哌啶(0.27ml，2.4mmol)，盐酸2，4- 二甲氧基苄基胺盐(0.72gr，3.5mmol)和巯基乙酸(0.24ml，3.5mmol)的 溶液回流3小时。将反应混合物冷却到室温，加入水(10ml)，分离出水 相。用2.5N的氢氧化钠水溶液调节水相的pH至10，然后用氯仿萃取 水相。合并有机相，干燥后蒸发除去溶剂。用快速制备色谱法(二氧化 硅，溶于氯仿的甲醇，浓度10％)处理残留物得到AF286(140mg，产 率为15％)。1H-NMR(CDCl3)δ1.66(m，2H)，2.21(m，4H)，2.27(s，3H， NCH3)，2.77(m，2H)，3.64(s，2H，SCH2)，3.78(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H， OCH3)，4.52(s，2H，NCH2)。
实施例27
合成4-(叔-丁氧基羰基)-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]-癸-3-酮， AF284

向溶于二氯甲烷(60ml)的AF277(2.60gr，13.97mmol)溶液中，加入 三乙胺(1.95ml，13.99mmol)、二碳酸二-叔-丁基酯(3.85ml，16.76mmol) 和4-二甲基氨基吡啶(1.71gr，13.99mmol)。得到的溶液在室温下搅拌过 夜，然后蒸发除去溶剂。用快速制备色谱法(二氧化硅， CHCl3/MeOH/NH4OH 80/20/1)处理残留物得到AF284(4gr，产率 ＞95％)。1H-NMR(CDCl3)δ1.55(s，9H，OC(CH3)3)，1.70-1.82(m，2H)， 2.26(m，2H)，2.28(s，3H，NCH3)，2.83-2.87(m，4H)，3.53(s，2H，SCH2) ppm.
实施例28
石蜡油中的AF150(S)制剂+稳定性研究
在空气或氮气气氛中，在生育酚存在或不存在的条件下，于40℃ 检测存在于药学上可接受的石蜡油(Paraffin oil Eur.Ph)中的10％w/w AF150(S)的稳定性。样品经过两个月的储存之后进行分析。采用TLC， HPLC和GC检测和确定可能降解的产物的量。与处于相同条件下含 有或不含生育酚的石蜡油进行比较，从而检测颜色变化。AF150(S)在 石蜡油制剂中是稳定的。在任何被测试的样品中均未检测到0.1％以上 的，由水解AF150(S)而得到的降解产物，即硫代酰胺的衍生物 (M+202)。在不含生育酚的样品中观察到浅黄色，但在AF150(S)中 含有0.5％w/w的生育酚的样品中，颜色未发生变化。
实施例29
AF150(S)柠檬酸盐+稳定性研究
用超过45分钟的时间向溶于2-丙醇(60ml)和四氢呋喃(100ml)的 AF150(S)(30.13gr，163.8mmol)溶液中滴加入溶于2-丙醇(200ml)的 无水柠檬酸(29.51gr，153.5mmol)溶液。得到的混合物在室温下于氩气 气氛中另外搅拌2小时，然后在氩气气氛中过滤出白色沉淀，并用己 烷洗涤。将白色固体置入装有P2O5的干燥枪中，对干燥枪进行抽真空 (0.2mmHg)，然后在55-60℃下加热6小时。得到AF150(S)柠檬 酸盐(53.8g，产率为87.6％)。TLC(溶于甲醇的2％NH4OH)Rf 0.57； mp.146.5-147.5℃；1H NMR(300MHz，D2O-Na2CO3，pH 12)δ1.80(m， 4H)，2.08(s，3H，CH3C＝N)，2.17(s和m，5H，CH2+CH3N+)，2.46(ABq， j＝15.2Hz，4H，2CH2CO2H)，2.73(m，2H)，3.81(s，2H，CH2N＝C)ppm.13C NMR(300MHz，D2O-Na2CO3，pH 12)19.77，36.17，44.16，45.64，53.08， 72.71，75.03，170.91，179.19和181.86Hz.
与储存在无水条件下的参照标准物相比，对储存在各种条件下(在 60℃下储存3个月；在空气中于室温下储存3个月)的这一盐的样品进 行HPLC分析结果，表明此盐是高度稳定的。
实施例30
化合物的脑部渗透
1.AF267B的pKa：使游离碱(非离子化)形式的化合物AF267B 穿过脑血屏障(brain blood barrier)。如下列所示计算，由于AF267B的 pKa为7.8，因此在pH＝7.35的脑脊髓液(CSF)处，化合物的26.2％为 游离碱形式。因为游离碱正是穿过脑血屏障的种类，这表明AF267B 可高度渗透进入脑部。与此相比较的是，一些已知的药物学上的中枢 神经系统(CNS)活性化合物具有pKa≥9(其中叔胺为高碱性)，例如 其中碱为奎宁环基的。对于处于相应的pH 7.35下的此类化合物，仅有 2.2％的化合物是在非离子化形式。这表明与此类化合物相比，脑部对 AF267B存在较高的优先选择。计算结果基于以下：
BH+→B+H+
％B＝100-％BH+＝100-100/[1+10(pH-pKa)]
pKa(AF267B)＝7.8
pH(CSF)＝7.35
％B＝100-100/1+10-0.45]
％B＝26.2％
对于pKa＝9.0的碱B′
％B′＝100-100/1+10-1.65]
％B′＝2.2％
2)用AF267B(2mg/kg，口服)处理大鼠，用GC分析药物在血浆中 的含量与脑部中的含量的对比。结果发现与血浆相比，AF267B优先存 在于脑部：
a)在静脉注射(1mg/kg)和口服(2mg/kg)的情况下，分别比较整个脑 部(ng/gr)*hr和血浆(ng/ml)*hr中外推至时间为无穷大的曲线下面 积(AUC)，结果发现AUC脑部/AUC血浆的比例为：对雄性为1.79(静 脉注射)，2.43(口服)；对雌性为1.32(静脉注射)和1.25(口服)。 因此发现化合物存在于脑部中的量大于存在于血浆中的量；
b)比较脑部的Cmax(ng/g)/血浆中的Cmax(ng/ml)(口服)，结果发 现雄性中有25％化合物，雌性中有16％化合物存在于脑部。这一计算 结果基于脑部重量(2gr)和血浆总体积(14ml)。这也表明了化合物在脑 部中为高百分比。
3)在小鼠的脑部组织中，对AF150(S)和AF267B(100微摩尔/千 克，口服)进行体外研究(用GC分析比较AF150(S)或AF267B与标 准化合物(AF261)，这些化合物被加入到脑部组织中，或从脑部组织取 代放射活性蕈毒碱化合物如用氚示踪的氧化震颤素-M)也清楚地表明 与血浆相比，脑部渗透高(GC和结合研究)。AF150(S)：Tmax＝1-10分 钟；T1/2＝21和53分钟(两个阶段)，静脉注射；MRT(平均保留时间)＝ 50分钟，静脉注射，口服。AF150(S)的脑部渗透快(1分钟，静脉注射)； Cmax＝40.7微摩尔/千克(口服给药量中有40.7％进入脑部)；AF267B： 在定量给药后，2-240分钟时在脑中被检测到，在20-30分钟时出现 峰值，MRT＝128分钟；Cmax＝36.4微摩尔/千克(口服给药量中有36.4 ％进入脑部)。
实施例31
向猎兔犬施用AF267B之后，检测AF292
本研究的目的是检测狗血浆中AF267B和AF292(AF267B的代谢 物)的水平，根据下述方法(参见下文)，是在采用AF267B进行为 期13个星期的亚慢性每日给药之后(1.5，3和6mg/kg，向雄性和雌性 狗通过口服给药)进行检测的。
内标(AF261)：2-甲基-8-甲基-1-硫杂-4，8-二氮杂-螺[4.5]癸-3-酮； MW 200。被分析的血浆样品来源于本研究的存活部分。AF267B和 AF292的浓度由以下方式检测：
柱：Purospher STAR RP18e(4×50mm，3μm)
流动相：溶剂A：1g/l(NH4)2CO3(H2O)
        溶剂B：甲醇
环路/注射体积：50μl/10μl
电离模式：大气压化学电离化(APCI)；正离子
保护气体压力：氮气：70psi
毛细管温度：250℃
喷射电压：～3.6kV
检测模式：SRM(选择性的反应监测)
AF292：m/z：201.0[CE(CE＝碰撞能量30v)]→m/z：70.0(0.0-5.2分钟)]
AF261：m/z：201.0(CE 35V)→m/z：70.0(5.2-6.2分钟)；内标
AF267B：m/z：215.0(CE 30V)→m/z：70.0(6.2-10.0分钟)
碰撞气体(collision gas)(CID)：2.5mTorr/氩气
结果：
在重复每日定量给药的13天后，AF267B的血浆半寿期为1-2小 时，Tmax＝1.5-3小时，Cmax(ng/ml)＝162-1352(与剂量成线性依赖 关系)且AUC(0-t)(ng*h/ml)＝712-3947(与剂量成线性依赖关系)。 AF292具有长出接近10倍的血浆寿命(～9-20小时)，Tmax＝3小时， Cmax(ng/ml)＝136-555，且AUC(0-t)(ng*h/ml)＝616-2451(与剂量成线性 依赖关系)。与AF267B相比较，AF292的药物代谢动力曲线 (pharmacokinetic profile)可归纳如下：AF292在血浆中的T1/2比 AF267B长约3-5倍(例如，对于雌性，AF292的T1/2＝10.6小时，而对 于雌性，T1/2＝AF267B)。相对于AF267B的Cmax，AF292的Cmax是 50-90％。与AF267B的Cmax相比，AF292明显转移到Cmax右面(原 因是AF292在血浆中的出现落后于AF267B)。在这一检测的基础上， 应理解AF267B和AF292可一起构成药物组合，此药物组合的T1/2比 单独的任何一个化合物的T1/2更长。此类组合可照此给药。
实施例32
被测试的化合物对存在于被M1 mAChR稳定转染的细胞培养物和存在 于大鼠原代海马(rat primary hippocampal)和皮质神经元培养物中的α -APPs分泌的作用
将细胞平板接种到6孔培养板中，并在平板接种3-5天的年龄时使 用。在不含血清的培养基中两次洗涤细胞，并用AF150(S)和AF267B 或AF292在37℃下孵育1小时。将细胞培养物暴露于各种浓度的这些 测试化合物(10-6-10-3M)中达1小时，然后暴露于碳酰胆碱中(10-4M)。 以单独暴露到培养基中的细胞作为对照物。采用碳酰胆碱，利凡斯的 明(rivastigmine)和丙炔苯丙胺(deprenyl)作为参照化合物。
将细胞上清液收集到装有分层的蛋白酶抑制剂混合物(5单位/ml 抑肽酶，5mg/ml抑胃肽A，5mg/ml亮抑蛋白酶肽和10-4M苯甲磺酰氟 (PMSF，蛋白酶抑制剂)；Sigma，USA)的Eppendorff管中。用Centricon 管(Amicon，Beverly，MA，USA)浓缩收集的培养基，保持在冷冻条件下 测定α-APPs分泌。加样等量的蛋白质(50-100μg)，用10％十二烷基硫 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。随后通过蛋白质印迹 法转移到硝化纤维素膜上，用脱脂奶封闭，并用抗阿尔茨海默氏症的 前体蛋白，即A4单克隆抗体22C11(0.25μg/ml；Boehringer Mannheim， Germany)在4℃下探测24小时。洗涤硝化纤维素膜，并在室温下用过 氧化物酶-连接的羊抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch，USA)抗体孵育 2小时，然后进行大范围冲洗，并用改进的化学发光检测系统(Amersham) 染色。采用视频图像密度测定法(Gel-aid software；Galai Co.，Israel)对暴 露膜上的免疫活性带进行定量测定。APPs水平表达为对基础水平的x- 倍的增长。在被M1 mAChR稳定转染的细胞培养物中，α-APPs-诱导 的分泌也以对10-4M碳酰胆碱的最大响应百分比进行计算。
进行激动剂刺激之后，表达M1 mAChR的细胞内的α-APPs分泌 随着剂量发生依赖性增长。在10-4M的AF267B处，获得了最大增长(与 对照物相比约为6倍增长)，该最大增长与碳酰胆碱引起的最大增长相 当。蕈毒碱拮抗剂，即浓度为10-5的阿托品的加入完全抑制了由AF267B 引起的APPs分泌，这表明AF267B的作用是通过M1 mAChR介导的。 在几个试验中，比较AF267B的活性和AF150(S)的活性。结果表明 AF267B比AF150(S)更灵验也更有效(对于AF150(S)为碳酰胆碱最大响 应的50％，而对AF267B则相当于碳酰胆碱的最大响应)。此外，对于 α-APPs分泌，AF267B比其外消旋物(AF267)或AF102B(为碳酰胆 碱最大响应的50％)更为灵验也更为有效，而效力较小的对映体 AF267A则与AF102B的效力相类似。
在刺激APPs升高方面，AF292与AF267B(EC50＝3μm)和碳酰胆 碱一样有效，而利凡斯的明和丙炔苯丙胺则对升高APPs的水平不起作 用。阿托品(10μM)的加入抑制了由碳酰胆碱，AF267B和AF292 引起的APPs分泌，这表明这些激动剂的作用是通过M1 mAChR介导的。
综上所述，这些结果表明了AF267B是选择性的M1蕈毒碱激动剂， 也是AF292的“药物-前体药”，而AF292本身就是选择性的M1蕈毒 碱激动剂和微弱的M3蕈毒碱拮抗剂。AF267B和AF292一起构成了药 物组合，该药物组合比任何单独的药物具有更长的血浆半衰期和更长 的蕈毒碱活性。
采用以上的测试，也发现AF700和AF704在此制备物中对增长 APPs的水平是有效的(在100μM下，为碳酰胆碱最大作用的50％)。
采用从海马，大脑皮层(两者都主要含有M1 mAChR)和脊髓皮 层(含有M2受体)制备的大鼠原代细胞培养物跟踪各种蕈毒碱激动 剂对所分泌APPs的水平的作用。该研究中，测定碳酰胆碱(非选择性 蕈毒碱激动剂)，氧化震颤素(＞M2选择性蕈毒碱激动剂)，毒扁豆 碱(胆碱脂酶抑制剂)和AF102B，AF150(S)和AF267B(M1选择性蕈毒 碱激动剂)对APPs分泌的作用。
从斯普拉-道来氏大鼠(Sprague-Dawley大鼠)的胚胎制备得到原 代细胞培养物。按照指南″Guide for Care and Use ofLaboratory animals″， National Research Council，Washington，DC 1996”中的方法，采用海马， 大脑皮层和脊髓的培养物进行试验。
通过徒手解剖，从13-14或18-19天大的大鼠胎儿分别取出脑组 织，海马，大脑皮层和脊髓，并将其转移到含有6mg/ml葡萄糖的冷 Gey’s平衡盐溶液中(Gibco，BRL)。除去脑膜后，先采用Pasteur移液 管，然后采用胰岛素-DNA酶(tripsyn-DNAase)溶液对解剖的组织进行 机械解离，得到细胞悬浮液。将解离后的细胞转移到DMEM(Dulbeco′s 改性的Eagle’s培养基)中(Biological Ind.Beit-Haemek，Israel)，该 DMEM含有：6mg/ml葡萄糖；2mM L-谷氨酸；1000IU/ml青霉素。 将此细胞悬浮液平板接种到预覆有聚-L-赖氨酸(1mg/ml)的12孔培养组 织板上，海马和皮层细胞的密度分别为4×105和6×105个细胞/孔。 使细胞培养物在37℃的保温箱中(95％空气&5％CO2)保持2个星期。 对体外11-14天的细胞进行大范围的冲洗，然后进行以下详述的各种处 理。在不含镁的Locke-HEPES缓冲液中，使海马和皮层细胞与浓度为 100μM的测试配体一起培养1小时，该不含镁的Locke-HEPES缓冲 液包括：154mM NaCl，5.6mM KCl，3.6mM NaHCO3，1.3mM CaCl2， 5.6mM葡萄糖和10mM HEPES，pH 7.4，含有0.02％BSA。在阻断研 究中，将蕈毒碱激动剂与拮抗剂，即哌仑西平(pirenzepine)(10μM) 一起孵育。指定单独暴露于缓冲液的细胞为对照物。在孵育期的最后， 移走条件培养基，并将其转移至装有蛋白酶抑制剂的混合物(如上指 定的)的Eppendorff管中。通过采用Centricon-30浓缩器(Amicon，Inc. MA USA)的离心法(2,500Xg，在4℃进行45分钟)浓缩上清液，并 在-70℃冷冻，直到开始测定APPs的水平。
根据Bio-Rad试验，在微板中测定样品中的蛋白含量。将蛋白质 量相等的每一样品(≈40μg/道)加样于10％SDS-PAGE上。在电泳 完成时，凝胶被印迹到硝化纤维膜上，用脱脂牛奶封闭，用抗-Alzheimer 前体蛋白A4(抗-阿尔茨海默氏前体蛋白A4，单克隆的22C11， Boehringer Mannheim)和次级探针，即过氧化物酶连接的兔抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch，P)探测APPs带。在广泛地冲洗之后，以 TMB(单一溶液，Zymed Lab.，California)对APPs带进行染色，或用 Renaissance化学发光试剂(DuPont，NEN)对APPs谱带进行显影，然后 暴露于放射自显影膜(Hyperfilm-ECL，Amersham)上。用视频成像密 度仪(Gel-aid software，Galai Co.Israel)定量测定总的APPs带。得到的关 于APPs的数据表达为对对照物的成倍增长，其中的对照物单独用 Locke缓冲液孵育。
将原代的大鼠皮层和海马组织培养物暴露到非选择性的激动剂碳 酰胆碱(CCh)和氧化震颤素(＞M2选择性的)中，暴露到M1蕈毒碱 激动剂AF150(S)和AF267B中，以及暴露到胆碱脂酶抑制剂毒扁豆 碱中，所有这些试剂的浓度均为100μM。与对照细胞培养物中测定的 水平相比，M1激动剂在所采用的两种细胞系统，即海马和皮层中引起 APPs分泌发生明显增长。在皮层细胞培养物中，APPs水平的增长范围 为对照物的2.5到3.1倍，而海马细胞培养物中APPs水平的增长范围 为对照物的1.8到2.8倍。AF150(S)和AF267B比CCh更为有效(分 别为对照物的2.8倍和1.5倍)。氧化震颤素和毒扁豆碱不具有活性。由 AF150(S)和AF267B和CCh诱导的APPs诱导分泌被M1选择性拮抗 剂哌仑西平(10μM)完全阻断。这些激动剂在脊髓培养物中并不激活 APPs分泌，原因是这些神经元不含M1 mAChR。
实施例33：在缺乏或存在神经营养蛋白的条件下，针对蕈毒碱激动剂 的突起向外生长响应
使M1 mAChR细胞转染的大鼠嗜铬细胞瘤细胞按照Gurwitz等， (NeuroReport 6，485，1995)中所述的方式生长。为测定突起向外生长， 在平板接种3-5天后，使用在6孔板上平板接种的细胞。平板接种1 天后加入生长因子，在最后的24小时加入蕈毒碱激动剂。
在倒置显微镜下观察细胞。从每个孔的几百个细胞的三个随机区 域中，记录神经突比细胞直径更长的细胞的百分比。结果表示为具有 神经突的细胞的百分比。在三份重复细胞中，进行处理。在平板接种1 天后，加入NGF(神经生长因子，50ng/ml)和EGF(表皮生长因子， 100ng/ml)。在记录前的24小时内加入蕈毒碱激动剂。
测定AF102B，AF150(S)和AF267B相对于碳酰胆碱(CCh)的神 经营养性效果，以及它们与神经营养蛋白如神经生长因子(NGF)，碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的相互作用。对 CCh的最大响应为80％，而AF267B为60％，AF150(S)为30％。用 NGF对被M1 mAChR细胞转染的大鼠嗜铬细胞瘤细胞进行的预处理协 同地增加了对所有被测试配体的神经营养性响应，也增加了被测激动 剂的有效性。
一方面用M1 mAChR细胞转染的大鼠嗜铬细胞瘤细胞对NGF和 bNGF的细胞响应(诱导分化)和另一方面对表皮生长因子，EGF的 细胞响应(诱导增殖)之间存在可以观察到的区别。EGF的增殖曲线 在蕈毒碱激动剂的存在条件下发生了变化，原因是EFG与蕈毒碱激动 剂一起造成了加速分化。
总之，以上的结果表明：无论是单独的M1选择性激动剂，还是 与内生或是外生性给药的生长因子联合的M1选择性激动剂，在神经 变性的疾病如AD(轴索变性)的治疗中，都可用于引起有益的神经营 养性作用。
也发现AF292，AF700和AF704具有神经营养性，这一作用被阿 托品完全阻断，表明这一作用具有蕈毒碱的性质。
实施例34
生物体外对Aβ含量的作用
用测试化合物(AF102B，AF150或AF267B)之一分别对重组 Semliki Forest病毒(塞姆利基森林病毒)感染的原代混合大鼠皮层神 经元进行5-8小时的处理，该重组Semliki Forest病毒编码人类APP695 或APP C99或C111(Fassbeder et AL，PNAS，98：5856，2001)。在这些 细胞培养物中，用γ-和β-分泌酶分解APP以产生Aβ，而α-分泌酶 则破坏Aβ。然而，α-分泌酶并不存在于细胞内。细胞发生裂解，A β与W02(抗Aβ的抗体)一起沉淀出来。
采用C99(和C111)测定Aβ调节机理，C99(和C111)是从APP生成 的截短结构。与APP不同，C99/C111是γ-分泌酶的直接底物。采用 两种结构都可以对γ-分泌酶的活性进行直接测试，而采用APP则不可 能办到。与APP相比，两种结构对α-分泌酶是无效的底物。也可用 CDX(甲基-β-环糊精)测定协同作用，CDX是一种从质膜提取胆固醇 的试剂。CDX也抑制Aβ的产生。除了各个蕈毒碱激动剂处理之外， 对CDX处理过的细胞再处理5分钟，以减少胆固醇含量。
通过蕈毒碱激动剂处理，细胞溶解产物和系统的培养物中的Aβ 水平都发生了降低。对于降低Aβ的水平，AF267B的有效性至少比 AF150(S)高出5倍，在μM范围内有活性。观测到AF267B和普通胆固 醇降低试剂CDX(5mM)之间在将系统中Aβ水平降低到检测不到的A β水平的效力方面具有协同作用。除活化α-分泌酶的作用之外，同时 也在研究中观测到本发明的M1激动剂对γ-分泌酶的抑制作用。 AF267B降低了Aβ状片断(所有片断为3-4Kda)的释放范围约50％。 这与γ-分泌酶活性降低50％相等。与对照物相比，AF267B(1mM)处理 的细胞中的p3片断(从γ-分泌酶分解得到的APP片断)完全丧失也证 明了这一点。具有此类对不同的分泌酶(α-，β-和γ-)有联合有益性 质的其它化合物尚未见报道。结果表明M1激动剂和胆固醇降低试剂 如斯达汀(statin)的组合能减少M1激动剂的剂量，也从而降低了M1 激动剂可能带来的副作用。
实施例35
AF267B降低了高胆固醇血症兔的皮层中升高的β-淀粉状蛋白
饮食胆固醇引起了兔脑中类似于阿尔茨海默氏(Alzheimer)的A β-免疫反应性(Sparks等.Exp Neurol 1994；126：88-94；Sparks Nutr Metab Cardiovasc Dis 1997；7：255-266)。允许新西兰白色雄兔随意进食 和饮水。在10个星期的期间内，用标准的食物或补充了以重量而言2 ％的胆固醇(Purina)的食物喂食动物。向一组动物通过皮下注射0.9 ％的无菌盐水，而向用胆固醇喂食的另一组动物给药(AF267B；皮下 注射剂量为1mg/kg体重)。处理10个星期后屠宰动物，并且，在所 有切片同时染色时，测试Aβ免疫组织化学。
在食物喂食的兔的皮层和门(hilus)中观测到有限的神经元Aβ。 在以盐水注射的胆固醇喂食动物中，大量的神经元含有可识别的Aβ。 与在对照动物中随机遇到的神经元相比，此类神经元明显更小。表达Aβ 免疫反应性的神经元数目在以AF267B给药的动物中减少了25-30％， 而免疫反应性的强度降低了约50％。也注意到AF267处理后表达Aβ 免疫反应性的神经元的大小与对照组脑部表达Aβ免疫反应性的神经 元相似，因此比胆固醇喂食盐水注射的兔脑中遇到的表达Aβ免疫反应 性的神经元更大。
结果表明AF267B有效地降低了患有高胆固醇血症的兔脑中升高 的Aβ免疫反应性，并对含有这些Aβ肽的神经元起到神经保护作用。
实施例36
AF267B降低了高胆碱能兔(受损伤的兔)的皮层中升高的β-淀粉状蛋 白
业已知道，实验造成的皮层胆碱能去神经导致了皮层Aβ浓度的生 物化学升高以及导致了组织Aβ沉淀(Beach等，Neurosci Lett 283： 9-12，2000)，也已知以蕈毒碱M1选择性试剂对正常动物的给药降低了 脑脊液(CSF)Aβ的浓度{Beach等Brain Res.905：220-223，2001}。在 本实施例中，用AF267B，即一种M1选择性激动剂，处理有nbm损伤 的动物，以确定慢性的M1受体激活作用是否会防止或减少损伤引起 的CSF和皮层Aβ增长。
采用28只雌性新西兰白兔，每只约重2.5kg(年轻的成年兔)。 21只遭受胆碱能的基底巨细胞核(nbm)损伤。通过单侧侧脑室注射 免疫毒素(含有与单克隆抗体ME20.4共轭连接的核糖体毒素皂草素)形 成损伤，该单克隆抗体ME20.4指向低亲和性的神经营养蛋白受体p75。 ME20.4抗体指向猴p75，同时也辨别出兔p75。免疫毒素的剂量为 32.4μg，体积为12μl，其被传递到前囟侧面2mm处的右侧脑室。用无 菌的标准盐水对7只动物进行侧脑室注射(假损伤)。将接受免疫毒 素的动物分为3组，每组7只。一组以AF267B进行一天两次的皮下 注射，每次的剂量为1mg/kg，日总剂量为2mg/kg。另一组以溶于标 准盐水中的毒扁豆碱半水杨酸盐用皮下渗透泵进行灌注，日剂量为3 mg/kg。第三组以无菌盐水进行一天两次的皮下注射。采用装有无菌标 准盐水的皮下渗透泵对受到假损伤的动物进行灌注。在手术4个星期 后对动物实施安乐死。对于接受注射AF267B的动物，所有动物在被 屠杀前约2-3小时时进行最后一次注射。4只动物过早地死亡[(1只对 照组动物和3只用毒扁豆碱处理的动物)，1只发生手术后(post-op)出 血，1只在发生不可控制的发作之后实施了安乐死，1只由于在手术前 在肌肉内注射麻醉剂引起了下肢瘫痪而因此实施了安乐死，还有1只 的死亡在尸检时未发现死亡原因]，将它们排除在分析范围之外。在屠 杀时，从所有动物的小脑延髓池取得脑脊髓液，将脑部移出并进行冠 向切片，成为0.5cm的切片。将在下丘脑层面处的一个切片(该切片 具有海马和皮层)固定于4％低聚甲醛中，用抗Aβ的抗体进行免疫组 织化学染色处理。在干冰片上冷冻其它的切片(其它的切片为未固定 的大脑、脑干和小脑的0.5cm冠状切片)。对于4组中的2组，对脑 脊液(CSF)上的Aβ和sAPPα进行Western印迹分析，这两组分别为 具有nbm损伤和用标准盐水处理过的兔，以及用具有nbm损伤和用 AF267B处理过的兔。
代表CSF Aβ的4kDa带的量化显示了在AF267B处理的动物中 CSF Aβ与对照动物相比发生了明显下降(p＝0.05，未配对双尾t检验)。 代表sAPPα的带的强度无明显差异。来自同样的2组动物的切片，进 行免疫组织化学染色显示Aβ，表明：在所有动物中，发生了血管的Aβ 沉淀和血管周围的发散沉淀。损伤-和-处理研究表明，AF267B和毒扁 豆碱两者都减少了Aβ的组织沉淀和生物化学水平。相对于受损伤的、 未处理组，组织的Aβ沉淀减少了；对毒扁豆碱和AF267B处理组分别 而言，减少至受损伤的、未处理组的6％和12％。对方差进行分析， 发现两个处理组在Aβ沉淀上显著不同(p＝0.01)(Aβ沉淀在未处理 的受损伤动物中高，而在用AF267B处理的受损伤动物中则低)，也 发现AF267B和毒扁豆碱处理的两个组与未处理的受损伤组在Aβ沉淀 上显著不同(p＜0.05，费希尔LSD，Fisher′s LSD)(Aβ沉淀在未处理 的受损伤动物中高，而在用AF267B或毒扁豆碱处理的受损伤动物中 则低)。
这一结果表明对具有nbm损伤的动物进行AF267B处理，减少了 由损伤引起的CSFAβ和脑部Aβ沉淀的增长，并表明M1蕈毒碱激动 剂如AF267B可用于AD(轴索变性)的预防性治疗。
实施例37
防止细胞毒性和由各种损伤引起的细胞程序性死亡(细胞凋亡)(除 去生长因子或血清中生长因子，β-淀粉状蛋白，氧化应激)
采用胰蛋白酶分离M1 mAChR培养物转染的融合大鼠嗜铬细胞瘤 细胞，洗涤后平板接种到预先包被有大鼠尾部胶原的24孔，6孔，60mm 或100mm平板中(Sigma，Israel)。在不含血清的培养基中，进行几个实 验。对于溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯基-四唑盐(MTT)试验， 在存在或缺乏各种药的无血清培养基中，使细胞(1.5×104)在胶原预 包被的96-孔平板中平板接种，维持24小时。为进行分化，细胞在1％ FCS(胎牛血清)和1％HS的存在下，并在加入50ng/ml NGF(神经 生长因子)的条件下生长7天，以实现完全分化。在100-mm板(每板 有5×105个细胞；MTT，荧光激活细胞分类器(FACS)活性)，或在预先 涂覆有胶原的室-载波片(Chamber-Slides，1.5×104个细胞；TUNEL) 上，或在用聚-L-赖氨酸预处理过的13-mm玻璃盖玻片上，在24孔平 板(每孔中有7500个细胞，DAPI)中，进行细胞生长。7天之后，洗 涤细胞，将培养基替换为不含血清的培养基，或分离出细胞并使其重 新接种到不含血清的培养基中。用先“陈化过”的Aβ肽或用H2O2处 理不含血清的培养基中的细胞。在没有另行说明的情况下，测试化合 物的加入与损伤一起在指定的时间内进行。
细胞生存力检测：
将细胞接种到处于100μl培养基中的96孔平板内。经过各种处理 之后，向每个孔中加入10μl溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浓度为 5mg/ml的MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯-四唑；Sigma， Israel]。在37℃使平板孵育2小时，然后加入盐酸-异丙醇(100μl， 0.04N HCl/异丙醇)。采用ELISA读数器，在波长为570nm下对平板进 行读数。
DNA核染色：
细胞在玻璃盖玻片上进行生长和处理。处理之后，将细胞固定在 -20℃的冷甲醇中达5分钟，然后用4℃的冷丙酮处理2分钟，并在 PBS中洗涤。用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚；5mg/ml，Sigma，Israel) 在室温下对盖玻片进行荧光染色达15分钟，DAPI是一种能清楚呈现 细胞核中染色质凝集的嵌入剂。用PBS洗涤细胞3次，将细胞包埋在 含有22mM 1，4-二氮杂双环(2，2，2)辛烷(Sigma，Israel)的甘油中以防止 褪色，并采用荧光显微镜观察核染色质形态。对凋亡和存活的细胞进 行计数(每盖玻片为200个细胞，每一试验进行两次重复)。
TUNEL检测：
本方法显示各个凋亡细胞中的DNA碎片。TUNEL(末端脱氧核 苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP切口末端标记)方法采用荧光素 -dUPT(Boehringer Mannheim，Germany)对DNA片断的3’OH端(代表 DNA带断裂)进行酶促标记。简单地讲，在处理后，在室温下，用溶 于PBS，pH为7.4的低聚甲醛溶液(4％)固定生长在室载玻片(Chamber Slides)上的细胞达30分钟。用PBS洗涤细胞之后，用0.1％Triton X-100，0.1％柠檬酸钠溶液在冰(4℃)上对细胞进行透化处理达2分钟， 用PBS洗涤，然后将50μl TUNEL反应混合物加到每一样品中，在湿 润室中内，在37℃下，保持1个小时。用加入Evans Blue试剂(在 PBS中以1∶2000稀释)，保持5分钟，然后用荧光显微镜观察载玻 片。
荧光激活细胞分类术(FACS)分析：
使细胞分化7天，并用胰蛋白酶使其从平板上分离下来。将106 个细胞重新接种到50-mm胶原涂覆的平板中，是在无血清培养基中， 存在或者缺乏各种处理。制备200g离心沉淀，使其在300μl PBS中 重悬浮。向每个试验管中，加入4ml冷甲醇(-20℃)，在-20℃进行固 定15分钟。在PBS中洗涤细胞，然后使细胞在1ml PBS中进行旋转 和重悬浮。加入5微升的碘化丙啶储存溶液(Sigma；10mg/ml)和5 μl浓度为20mg/ml的RNAse A溶液，在室温下保持5-10分钟。采用 在488nm波长处激发和通过575±21nm的BP滤波器(带通滤波器) 收集的荧光激活细胞分类器(FACScan；Becton Dickinson Corp.)测定 各个细胞核的荧光性。用Cell Quest软件计算机系统分析数据。通过 该方法，我们能测定细胞的DNA含量(凋亡的细胞中DNA更少)。 细胞周期的G1阶段中的细胞处于有丝分裂之后；与G2/M阶段中的细 胞(在有丝分裂之前或处于有丝分裂中)相比，G1阶段中的细胞具有更 少的DNA含量。凋亡的细胞被鉴定为前-G1阶段。
MTT检测测定了细胞内的前早期变化，反映了电子传递链的完整 性，并提供了测定细胞内的氧化还原活性的读出器。此测试是β-淀粉 状蛋白介导的细胞死亡机理的特定早期指标，并可用于检测快速抑制 响应。M1 mAChR细胞转染的、处于饥饿状态的未分化大鼠嗜铬细胞 瘤细胞独自就降低了10-20％的细胞存活力，通过增加毒害神经的全长 β-淀粉状蛋白(β-A1-42)肽和它的片段(β-A25-35)(0.5-20μM)的浓 度，使这一作用进一步增大(达到50-60％的抑制)。当此类细胞被除 去血清并用β-淀粉状蛋白处理之后，在缺乏或存在蕈毒碱的条件下， 通过加入碳酰胆碱或AF292，AF150(S)和AF267B，24小时后由β-A25 -35 (1μM)引起的细胞死亡明显减少。
测试碳酰胆碱或AF292，AF150(S)和AF267B在保护用M1 mAChR 细胞转染的细胞，使其不受到由H2O2引起的直接氧化应激的效用。检 测到这些激动剂保护细胞不遭受H2O2引起的毒性。
令人惊奇的是，在具有与抗氧化部分相连接的蕈毒碱药效团的化 合物中，检测到了蕈毒碱激动剂。这些化合物包括有AF604，AF700和 AF704，它们的结构中包括了与抗氧化部分相连接的选择性M1激动 剂。特别地，对于抵抗β-A25-35(10&20μM)引起的细胞毒性，AF700， AF703，尤其是AF704和AF704B比碳酰胆碱更为有效。
采用DAPI，即一种能清楚呈现细胞核中染色质凝集的嵌入剂，在 Aβ或H2O2处理之后观察到细胞凋亡性细胞死亡。Aβ处理的细胞表 现出程序发生缩短和丧失的凋亡细胞的形态。DAPI染色展示了核凝聚 和表征凋亡程序的片断化染色质。发现AF150(S)和AF267B起到了 保护细胞不遭受凋亡的作用，并充分地观察到了类似于神经炎的过程。
使用M1受体转染的细胞遭受饥饿24小时后，测定到凋亡性细胞 死亡增长两倍(但不是在未转染的细胞中)。AF150(S)和AF267B明显 保护了由饥饿引起的凋亡性细胞死亡。阿托品(一种非选择性蕈毒碱 拮抗剂)和哌仑西平(一种M1选择性拮抗剂)仅仅在M1转染细胞中 逆转了蕈毒碱激动剂的保护作用。
用β-A25-35(25μM)或β-A1-42(25μM)对M1 mAChR转染的细胞 进行处理，进一步使凋亡性细胞死亡比饥饿引起的细胞死亡增加1.5-2 倍。用不引起细胞凋亡的逆向肽(β-A35-25)展示两种肽的选择性毒性 作用。AF150(S)和AF267B仅仅在M1转染细胞中阻止了Aβ引起的 细胞凋亡，而蕈毒碱激动剂则逆转了这些作用。
与饥饿相比，由H2O2(25和50μM)引起的氧化损伤分别使细胞 凋亡数增加了1.5倍到2.5倍。AF150(S)和AF267B阻止了H2O2引起 的细胞凋亡，它们的作用对M1 mAChR活化具有选择性，而阿托品逆 转了这种作用。
TUNEL方法也揭示了细胞凋亡后在各个凋亡细胞中出现的DNA 碎片。TUNEL阳性染色的细胞数目在用25μM β-淀粉状蛋白25-35 处理之后发生增长，表明发生了细胞凋亡程序，而AF150(100μM) 能阻断细胞凋亡，从而使大多数细胞被TUNEL阴性染色。细胞保持了 它们的程序，仅细胞质被染成红色。
在各种处理之后，采用FACS分析，通过测定细胞DNA含量使细 胞凋亡数目定量化。在M1转染细胞中，从除去血清的神经元培养物 中得到的DNA柱状图，揭示了随着(亚二倍体(subdiploid))DNA含 量降低，出现了凋亡细胞群(M1＝前-G1阶段)。全部细胞中约20％ 在遭受饥饿24小时后发生细胞凋亡性死亡。碳酰胆碱，AF150(S)和 AF267B保护细胞在饥饿期间不发生细胞凋亡。β-淀粉状蛋白25-35 或β-淀粉状蛋白1-42使凋亡群增加到细胞的30-35％。共同加入碳酰 胆碱，AF150(S)或AF267B明显降低了凋亡总数，此凋亡总数甚至低 于饥饿后检测到的值。蕈毒碱激动剂的作用被10μM的阿托品阻止， 表明在存活力作用方面，与M1 mAChR的活化有关。而且，在未转染 的细胞中，激动剂对饥饿和β-淀粉状蛋白引起的细胞凋亡无效。
实施例38
保护不遭受由N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)引起的细胞死亡
用机械分离法，制备来自于18-19天大的胚胎(Sprague Dawly大 鼠)大鼠脑部的原代大鼠脑细胞培养物。将脑移至含有6mg/ml葡萄 糖的冷Gey’s平衡盐溶液中(GBSS，Gibco，BRL)。分离海马和皮层 并将其转移至含有6mg/ml葡萄糖，2mM L-谷氨酸(Biological Industries，Bet-Haemek，Israel)，1000I.U/ml青霉素G钠和3％ultrosere G(Gibco，BRL)的Dulbecco′s改性Eagle培养基中(DMEM，Biological Industries，Bet-Haemek，Israel)。在细胞分离之后，采用火焰抛光的 Pasteur(巴斯德)移液管，将得到的细胞悬浮液接种到组织培养物上， 该组织培养物用溶于硼酸盐缓冲液中的、浓度为1mg/ml的聚-L-赖氨 酸(30,000-70,000MW，Sigma)预先涂覆。将细胞以80000个细胞/孔的 密度接种到96孔培养板上，或以400000个细胞/孔(海马细胞)和 600000个细胞/孔(皮层细胞)接种到12孔培养板上。细胞培养物在 37℃，5％CO2/95％O2下的生长细胞培养基中保持2个星期。通过加入 5-氟-2’-脱氧尿核苷/尿核苷/胞嘧啶阿拉伯糖苷混合物(最终浓度为5 mM)，从而在随后的3-4天中，在培养物中阻止神经胶质细胞增殖。
为评价对NMDA的暴露，将在96孔培养板中接种10天的皮层细 胞和海马细胞暴露于100或200μM NMDA(RBI，USA)中。将通式I 的化合物的神经保护效力与用20μM MK801(非竞争性的NMDA受体 拮抗剂)引起的神经保护效力进行比较。也将培养物并行地暴露到单 独的培养基中，并将其指定为对照物。为产生分布广泛的神经元损伤， 在测定神经元细胞死亡之前，所有的暴露都进行20-24小时。采用基于 {2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺酰基苯基]-2H-四唑-羧酰基苯胺(carbox anilide)内盐}的试验(Klausner，Biotechnol 5：779-786，1987；Lipman et al，Cytotechnol 8：129-176，1992)测定活细胞内线粒体活性的程度，从而 定量地测定神经毒性。
AF150(S)和AF267B对阻止细胞死亡有效。100μM的这些激动剂 对100μM NMDA引起的毒性进行抵抗的神经保护效力与由20μM MK801引起的神经保护效力相类似，但在抵抗200μM NMDA时略低。
实施例39
1.对τ-蛋白超磷酸化作用的效果
按照实施例38所述的培养原代细胞培养物。移出细胞上清液，在 加入含有0.2mM EDTA的冷磷酸缓冲液盐水pH＝4(PBS)溶液之前， 细胞先在培养基中洗涤1次。采用橡胶淀帚刮削细胞，将细胞转移到 Eppendorf管中，在4℃下进行离心。细胞沉淀在含有蛋白酶抑制剂(5单 位/ml抑蛋白酶肽(apronitin)，5mg/ml抑胃肽，5mg/ml亮抑蛋白酶肽和 0.1mM PMSF，Sigma)的溶解缓冲液(EDTA 5mM，Tris 50mM，Triton 1％，NaCl 150mM)中进行重悬浮，并在4℃下进行离心。将上清液转移 到Eppendorf管中，保持在-20℃下直到开始分析。采用Western印迹 法测定τ-1免疫反应性程度(抗体，在Ser199处识别非磷酸化τ)。
在1-100μM的剂量范围内，AF150(S)和AF267B对提高皮层和海 马细胞培养物中的τ-免疫反应性是有效的。
2.对τ-磷酸化作用的效果以及Aβ诱导的效应对τ-磷酸化作用的拮抗 作用
进行Sadot et al.，J.NEUROCHEM.66：877-880，1996的实验设计方 案，该实验设计方案包括用AT8抗体(一种在Ser199/202处识别非磷酸 化τ的抗体)进行免疫印迹，结果发现AF267B，AF292 AF704和AF704B (100μM)使这些细胞培养物中τ-蛋白的磷酸化作用达到对照水平。通过 将M1激动剂连接到抗氧化部分，可使τ-磷酸化作用降低，从而提供了 对由氧化应激和τ-超磷酸化作用的联合损害造成的各种CNS病状的治 疗策略。
实施例40
对原代1型星形胶质细胞培养物中的ApoE合成和分泌的影响
从Sprague Dawley大鼠的皮层获得1型星形胶质细胞的原代培养 物。将测试化合物溶解于培养基中，并将化合物加到细胞中，达24， 48，72和96小时。然后除去培养基，保持冷冻，直到用Poirier et al Neuroscience 55：81-90(1993)中所述的免疫印迹分析测定ApoE蛋白水 平。或者也可采用Cedazo-Minuez等所提出的方法[Neurosci 105： 651-661，2001]。在96小时时，AF102B对ApoE的代谢(合成和分泌) 无活性。化合物AF267B，以及程度更小的AF150(S)随着时间的过去， 对ApoE的产生进行抑制，在96小时时达到最大效果。测定的效果(60 -80％抑制)发生在化合物极低的浓度0.1nM处。这些结果表明化合 物抑制了ApoE的产生，包括大鼠星形胶质细胞中的ApoE4，从而可 用于要抑制ApoE产生的治疗中。
实施例41
采用作为标记探针的激动剂进行蕈毒碱受体的竞争结合试验
氧化震颤素-M(OXO-M)是以相似的亲和力与所有蕈毒碱受体亚 型进行结合的激动剂。测试化合物代替[3H]-OXO-M结合的能力提供了 一个测量尺度，用于测试化合物对受体激动剂结合位点的亲和力。与 Ki值为0.05μM的完全激动剂碳酰胆碱相比，[3H]-OXO-M与AF292 和其对映体AF291结合的竞争性的Ki值分别为0.27和6.56μM。
蕈毒碱拮抗剂哌仑西平(PZ)优先与M1受体结合，而OXO-M对 所有mAChR亚型进行非选择性的结合；PZ与OXO-M之间的Ki值比 率表明了测试化合物的选择性。比率越小，则测试化合物对M1越具 有选择性。对大鼠皮层膜的[3H]-PZ结合与AF292(Ki＝1.39μM)和其 对映体AF291(Kí＝10.7，μM)的竞争性表明AF292是活性对映体。 OXO-M/PZ比率为～0.36，表明对M1受体具有中等高度的选择性。
实施例42
蕈毒碱受体选择性
1.人类蕈毒碱受体亚型转染的细胞培养物中的功能研究
1.1按照Gurwitz等Eur.J.Pharmacol.267，21，1993中的方法，测 试AF292在激活磷酸肌醇(PI)水解方面对人类M1与M3和M5受 体的激动或拮抗性质、效能和选择性。化合物在激活PI水解中的作用 对阿脱品是敏感的，表明了它们的蕈毒碱性质。与在此范例中测定的 与PI转换有关的碳酰胆碱相比，发现AF292和AF267B在M1受体处 是部分激动剂，分别显示了～35％和～66％的活性。与采用AF267B(与 碳酰胆碱相比，在M3处活性为～30％)相比，采用AF292在M3和M5 受体处未发现活性。AF292既是在M1受体处的部分激动剂，又是在 M3受体处的弱拮抗剂(pKb＝0.66μM)，而在M2或M5 mAChR处 无激动活性。在改性的细胞培养物中，测定对M2受体的作用：表明， 用碳酰胆碱活化之后细胞内的Ca离子发生增长。尽管碳酰胆碱引起对 M2 mAChR的活性增加了8倍，AF292在所有的测试浓度(10-9-10-3M) 下作为激动剂是不具有活性的。
1.2.按照Gurwitz等Gurwitz等Eur.J.Pharmacol.267，21，1993 中的方法，测试AF292在激活花生四烯酸(AA)水解方面对人类M1， M3和M5受体的激动或拮抗性质、效力和选择性。与对PI转换的作 用(35％)相比，AF292对由M1 mAChR引起的AA释放更有效，但对 作为对M3 mAChR和M5 mAChR的激动剂(AA释放)仍然不具有活 性。因此与对PI(由磷脂酶C介导)的作用相比，AF292对M1 mAChR 介导的AA释放是一种更为有效的激动剂。总之，AF292不仅作为激 动剂对M1 mAChR具有高度的选择性，也表现出选择G-蛋白的独特活 性(如，与碳酰胆碱所不同的是，AF292并非将所有G-蛋白活化到相 同程度，而碳酰胆碱是将所有G-蛋白活化到相同程度的非选择性 mAChR激动剂)。
2.对蕈毒碱受体和其它体系的结合研究
2.1在对mAChR受体的下列配体的竞争性结合研究中，与血清素 5HT3在10-4M处抑制为5 1.3％；鸦片样物质//鸦片剂(Opiods/Opiate) 在10-4M处非选择性的抑制为52.5％相比，AF267B对以下的M1 mAChR亚型具有高度选择性：QNB[大鼠皮层(CTX)膜中的蕈毒碱拮 抗剂](Ki＝49.6±9μM)；QNB[大鼠小脑膜中的蕈毒碱拮抗剂]Ki＝ 45.2±10.8μM)；哌仑西平(CTX中M1的选择性拮抗剂)(Ki＝ 3.74±0.59μM)；氧化震颤素-M(CTX中的蕈毒碱激动剂)(Ki＝ 1.62±0.34μM)]；而AF267B根本不能结合到下列对象上：肾上腺素能 受体(A)，α1A，肾上腺素能受体；α1B，肾上腺素能受体；α2A(人类重 组体)；  肾上腺素能受体，α2B；肾上腺素能受体，α2C(人类重组体)； 肾上腺素能受体，β1；肾上腺素能受体，β2；苯并二氮杂草(BZD)，外 周的；氯氮平(Clozapine)；多巴胺，D1；多巴胺，D2(人类重组体)； 多巴胺，D3(大鼠重组体)；GABA A，激动剂位点；GABA A，苯并二 氮杂草，中枢的；谷氨酸，AMPA位点；谷氨酸，红藻氨酸(Kainate) 位点；谷氨酸，NMDA激动剂位点；谷氨酸，NMDA，甘氨酸；甘氨 酸，对马钱子碱敏感；组胺，H1；组胺，H2；组胺，H3；烟碱的，神 经节位点；烟碱的，神经元位点；血清素，5HT1A(人类重组体)；血 清素，5HT1B；血清素，5HT4；血清素，5HT6(大鼠重组体)；血清素，5HT7 (大鼠重组体)；胆碱乙酰基转移酶；谷氨酸脱羧酶；一元胺氧化物A， MAO-A；一元胺氧化物B，MAO-B。
2.2在结合研究中，发现AF292(10μM)对mAChR亚型具有高度 选择性：{M1(人类)(55％)，M2(人类)(61％)，M3(人类)(55％)}，根本 不能结合到下列对象上：腺苷A1(人类)；A2A(人类)；腺苷A3(人类)； α1肾上腺素能受体(非选择性)；α2(非选择性)；β1(人类)；血管紧张 素，AT1(人类重组体)；苯并二氮杂草(BZD)(中心的)；缓激肽，B2(人 类重组体)；胆囊收缩素(CCKA)(人类重组体)(CCK1)；多巴胺D1(人 类重组体)；D2S(人类重组体)；内皮素，ETA(人类重组体)；GABA(非 选择性)；内皮素，GAL2(人类)；趋化因子，IL-8B(人类重组体) (CXCR2)；趋化因子，CCR1(人类重组体)；  组胺，Hl(中心)；组胺， H2；黑皮质素(melanocortine)，MC4(人类重组体)；褪黑激素，ML1；速 激肽，NK2(人类重组体)；NK3(人类重组体)；神经肽，Y1(人类)；神 经肽，Y2(人类)；神经加压素，NT1(人类重组体)(NTS1)；鸦片剂，δ2 (人类重组体)(DOP)；鸦片剂，κ(KOP)；鸦片剂μ(人类重组体)(MOP)； 孤啡肽，ORL1(人类重组体)(NOP)；血清素，5-HT1A(人类重组体)；血 清素，5-HT1B；血清素，5-HT2A(人类重组体)；血清素，5-HT3(人类重组 体)；血清素，5-HT5A(人类重组体)(5-ht5A)；5-HT6(人类重组体)；5-HT7 (人类)；促生长素抑制素，sst(非选择性)；血管活性肠肽，VIPI(人类) (VPAC1)；后叶加压素Vla(人类重组体)；Ca2+通道(L，戊脉安位点)； K+V通道；SK+Ca通道；Na+通道(位点2)；Cl-通道；降肾上腺素 NE转运蛋白(人类)。
实施例43
对衰老狐猴(microcebes)的影响
衰老狐猴表现出的认知缺陷和脑损伤与在老人和AD患者中所观 察到的相类似。因此衰老狐猴是研究AD的良好动物模型，该动物模 型模拟AD中的三个主要特点(斑(Aβ)，双螺旋丝(高磷酸化和聚 集的τ)和认知障碍)。这一模型也可用于模拟有益于AD的MCI。
在该模型中，AF150(S)[长期处理18个月]：i)改善了认知和行 为损伤；ii)  降低了高磷酸化的τ蛋白和含有聚集的τ蛋白(如表征 患病的脑)的神经元数目，和双螺旋丝的数目；iii)减少星形胶质细胞 增生(astrogliosis)和炎症。这表明AF150(S)可用作治疗或改善AD作用 的药物，但AF150(S)在延长治疗后不产生耐受性。
实施例44
M1激动剂降低了大鼠受到封闭式头部创伤之后的神经行为损伤
按照Chen等，J Neurotrauma，15：231-237.1998中所述的方法使小 鼠遭受封闭式头部创伤(CHI)。采用由10个参数组成的组评定神经学 严重性得分(NSS)(10＝输出量最差，0＝正常功能)。与安慰剂处 理的动物相比，在CHI与安慰剂处理动物之后的5分钟时在腹膜内注 射测试化合物(1mg化合物/kg体重)。在1小时，对处理过的小鼠 进行评分，以确定创伤的严重性，而在24和48小时时测定恢复性。 NSS如下：1.对照组(N＝10)：7.80+/-0.25(1h)；5.30+/-0.33(24h)； 4.20+/-0.47(48h)；2.AF150(S)(N＝10)：8.00+/-0.21(1h)；4.30+/-0.26** (24h)；2.90+/-0.23b(48h)；AF267B(N＝9)：7.89+/-0.26(1h)；3.67+/-0.24* (24h)；2.89+/-0.26C(48h)[*P＝0.03；**P＝0.03；aP＝0.009；bP＝0.005； cP＝0.004].
所有的测试化合物表明对运动功能有高度的显著改善。在两个平 衡试验(梁上行走)中，用AF267B处理的动物恢复较快[在24小时 (3cm)处为22％，而对照组为80％，或在48小时(2cm)处为33％， 而对照组为80％]。
实施例45
AF150(S)，AF267B对大鼠的社交记忆力的作用
已经证明了啮齿动物的社交嗅觉认知力可用于评定短期记忆力， 且对类胆碱能药是敏感的(Dantzer et al.Psychopharmacol.91：363-368， 1987；Perio等Psychopharmacol.97：262-268.1989)。在本实施例中测试 AF150(S)和AF267B对未试验过的(naive)大鼠的研究行为的影响。
采用12只雄性Wistar大鼠，400-530gr(克)(4-5个月大)。 在测试前使大鼠独自居住14天。将幼年的Wistar大鼠40-50gr(在到 达之时)保持在含有6只的组中，作为成年大鼠的社交刺激物。将动 物保持在21℃±1下，经历相反的亮-暗周期(从下午2:00到早上2:00 为明亮期)。在红色光照下进行7小时的会话(sessions)，进入亮- 暗周期的暗部分中。
在开始社交性测试之前的1.5小时，将成年大鼠放入灯光昏暗的室 内。所有的年轻大鼠在实验开始前在笼子中隔离30分钟。在实验开始 时，将一只不熟悉的年轻大鼠放入一只成年大鼠的居住笼子中达5分 钟。记录成年大鼠为探查年轻大鼠所花费的时间。然后立即(1-2分钟) 用载体或测试化合物处理成年大鼠。两个小时后，使同一只年轻大鼠 出现在同一只成年大鼠面前另达5分钟，5分钟的时间是当刺激物年轻 大鼠正常地不再被认出的一段时间(即，成年大鼠探察年轻大鼠所花 费的时间与年轻大鼠第一次出现时所花费的时间相等)。因此在声称 提高记忆力的药物的影响下，期望花费在探查相同的年轻大鼠的时间 有所减少。两天后，使另一只年轻大鼠(不同于第一次暴露的大鼠)出现 在用药物或载体给药2小时后的成年大鼠面前。以这只不同的小鼠为 对象的社交探究的任何减少，都因此被认为是对药物的非特异性效果 的反映(即与记忆力无关)。对某个被测试的对象，同一只刺激动物 不出现两次，一只年轻小鼠在48小时的期间内使用不超过一次。
在第一次接触年轻大鼠后，立即以AF150(S)或AF267B(0.5，1和 5mg/kg，口服)或载体磷酸盐缓冲盐水(PBS)向成年大鼠给药。
测定用于社交调查刺激物年轻大鼠所花费的时间(以秒计)，然 后将每只动物的社交调查时间表示为第二次接触对第一次接触的比率 (调查时间比(RID))。使用RID的这种变换，是为了使可能的个 体以及天与天之间在基线性能方面的差异最小化(Perio等 Psychopharmacol.97：262-268.1989)。因此在第二次接触期间的调查时 间发生任何减少都会导致RID小于1，这表明该动物认出了年轻的大 鼠。通过3-路ANOVA(3-way ANOVA)对重复测试进行分析，通过 简单的主要效果对比分析进行在后(post hoc)比较。
与安慰剂组相比，AF150(S)和AF267B以剂量依赖的方式降低 了对同一只年轻大鼠的调查时间。记忆力的改善不能归因于非特异性 效果，原因是第二次接触采用不同的年轻大鼠时，未观察到记忆力改 善。因此，两种化合物都提高了未试验过的大鼠的社交记忆力。
未发现两种化合物的总RIDs之间存在显著性差异，但发现相似/ 不同年轻大鼠与两种药物的剂量之间的相互作用在统计学上是显著的 [F(3/33)＝14.9，p＜0.0001]。特别是，相对于安慰剂，两种药物都明显降 低了采用所有三种测试剂量时对同一年轻大鼠的调查时间(p＜0.001)。 此外，采用0.5mg/kg剂量的RID与采用其它两种剂量的RID之间有明 显差异(p＜0.05)；采用1和5mg/kg剂量所观测到的RID明显低于采 用0.5mg/kg剂量所观测到的RID。
应该注意的是，对于所有的三种剂量，同一年轻大鼠组和不同的 年轻大鼠组的RIDs之间明显不同(p＜0.01-p＜0.001)。
实施例46
AF267B和AF292对用胆碱毒素(cholinotoxin)(AF64A)处理的大鼠的被 动回避(PA)的影响
以下的一般性步骤在Fisher等，J.Pharmacol.Exptl.Therap.，257： 392，1991中有所描述。通过乙酰乙基胆碱芥子.HCl的碱性水解制备 AF64A(10mM)。将AF64A(3nmol/2μl/侧)或盐水(2μl)以立体定位 应用的方式注射到Equithesi麻醉(0.3ml/100g，腹膜内注射)的大鼠的 两侧侧脑室中(AP＝-0.8；距离前卤的L＝1.5mm；以及距离头骨表面 的DV＝-4.8mm)。采用CMA 100微注射泵，通过30号(gause)注射 套管，以0.25μl/分钟的恒定速度进行灌注。在注射后的4分钟使套管 保持在原位，从而使溶液扩散到脑室中。在电击(shock)之后，立即用 化合物或磷酸盐缓冲液盐水(PBS)进行一次口服给药。在训练之后72 小时时，测试记忆力。
所有注射AF64A的大鼠(29.02±3.1s)和所有注射盐水的大鼠 (20.55±1.95s)之间的初始潜伏期存在明显差异，F(1/72)＝5.13， p＜0.05。在保持潜伏期(retention latency)方面，AF64A注射和药物处理 之间存在具有统计学意义的相互作用，F(3/72)＝11.99，p＜0.001。用PBS 处理的、注射AF64A的大鼠的保持潜伏期(67.1±18.9s)明显短(记忆 力更差)于用PBS处理的、注射盐水的大鼠的保持潜伏期(455.3±55.1s) (p＜0.001，通过简单的主要效果比较分析得到)。
用AF267B，0.1mg/kg处理的、注射AF64A的大鼠的保持潜伏期 (440.7±46.4s)以及用AF292，0.1mg/kg处理的、注射AF64A的大鼠的 保持潜伏期(447±46.8s)都明显长于(记忆力优于)用PBS处理的、注 射AF64A的大鼠的保持潜伏期(p＜0.001，通过简单的主要效果比较分 析得到)。在用AF267B，0.03mg/kg处理的、AF64A-大鼠的保持潜伏 期(105.7±31.9s)以及用PBS处理的、AF64A-大鼠的保持潜伏期之间， 没有发现显著性差异)。在注射盐水组的任何一个潜伏期之间没有发 现存在明显差别。
注射AF64A的大鼠在PA任务中表现出对保持力有明显破坏。 AF292对AF64A引起的保持力丧失起到减少作用的最小有效剂量小于 0.1mg/kg，口服。在PA任务中，与用PBS处理的、注射AF64A的大 鼠相比，AF267B，0.1mg/kg和AF292，1mg/kg对改善由AF64A引起 的保持力丧失都是有效的。AF292的最小有效剂量可能小于0.1mg/kg， 口服。
实施例47
AF267B对进行MWN测试的大鼠的认知损伤(由AF64A引起)的作用
在Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)任务中对注射AF64A 或盐水的Sprague-Dawley大鼠(6个月大)进行测试。所采用的范例 以参照记忆方式评价空间学习能力，示例包括训练(第1-4天)，转移 测试(探索试验-第4天，在最后的训练试验之后的3分钟)和逆向试 验(第5天)。
在手术后4个月时，将AF64A和盐水组的大鼠随机地再分成4个 处理亚组(n＝9)：用AF267B(剂量为0.3，1和3mg/kg，口服，体 积为10ml/kg)处理第1-3亚组，而第4亚组(对照组)则用相同体积 的赋形剂磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10mM)进行处理。在开始行为测试 之前，药物和PBS施用为每天给药一次，共5天；到第5-天的实验期， 是在测试前的30分钟。
采用MANOVA分析三个尺度，即逃避潜伏期，路径长度和游泳 速度，之后进行简单的主要效果对比分析。
结果：与注射盐水的大鼠相比，注射AF64A的大鼠表现出明显更 长的逃避潜伏期，F(1/64)＝10.56，p＜0.005。在路径长度方面，与注射 盐水的大鼠相比，注射AF64A的大鼠表现出明显更慢的学习曲线，F (3/192)＝4.01，p＜0.01。AF267B对学习无明显作用，然而，用AF267B-1 mg/kg处理的、注射AF64A的大鼠仅在逃避潜伏期方面表现出改善的 趋势，而AF267B-3mg/kg倾向于破坏这些大鼠的能力。认知性尺度(逃 避潜伏期和路径长度)和非特异性的运动尺度(游泳速度)之间无关 联性。
所有注射盐水的大鼠，在探索试验中在两个参数上，都表现出空 间偏爱性，对逃避潜伏期和路径长度分别为F(3/192)＝7.86，p＜0.001， 和F(3/192)＝7.44，p＜0.001。另一方面，用PBS处理的、注射AF64A 的大鼠仅仅在此试验中表现出部分空间偏爱性。然而，用AF267B处 理的、注射AF64A的大鼠仅仅在逃避潜伏期中表现出与注射盐水的大 鼠相类似的完全空间偏爱性，F(9/192)＝2.3，p＜0.025。未发现AF267B 的不同剂量之间在对记忆力的有益作用方面存在明显差别。
在逆向试验中，进行测试的任何组之间都无明显差别。然而， AF64A注射在两个尺度上都倾向于破坏认知能力。此外，用AF267B-1 mg/kg处理的、注射AF64A的大鼠表现出改善的趋势，而用AF267B-3 mg/kg处理的、注射AF64A的大鼠在该试验中表现出破坏的趋势。
实施例48
AF150(S)，AF267B，利凡斯的明和烟碱对C57BL/1L/10SnJ小鼠和对 C57BL6J小鼠的MWM性能的作用
由于海马小以及海马锥形神经元数目减少，因此选择C57BL/10SnJ (B10)小鼠；细胞损失似乎与空间学习能力差有关。据报道，在这些动 物中所观察到的空间记忆任务方面的缺陷对胆碱能处理(东莨菪碱) 的响应(Simons等，Life Sci.，42，375-383，1988)，而AChE抑制剂 (毒扁豆碱)和蕈毒碱激动剂(AF102B，PD151832)(Simons等，1988； Vincent等Brain Res.，597，264-268，1992；Schwarz等Drug Dev.Res.， 40，133-143，1997)在采用MWM的这一模型中都已经显示了积极作 用。
随机地将每一群小鼠分为7个处理组(n＝12-14只/组)。第1-2组用 剂量为0.5和1mg/kg，腹膜内给药，体积为10ml/kg的AF150(S)进 行处理，第3-4组用相同剂量和体积的AF267B进行处理，第5-6组 分别用剂量为1mg/kg，腹膜给药的利凡斯的明和烟碱进行处理，而第 7组则用溶剂即0.9％的盐水进行处理。所有的测试化合物和盐水每天 给药一次，给药期为开始行为测试前的4天，然后是第5-天的实验期， 在测试前的30分钟给药。
训练：每只小鼠训练连续4天，每天进行四次试验(一批)，其 中平台位置保持不变，且位于水池的东南象限的中心处。在四个试验 的每一批中，每只小鼠在每个出发位置出发，但随机选择位置的次序。 一个试验包括用手将小鼠放入水中，使其处于水池边界周围的四个出 发位置：北、南、东或西处，并面向池壁。通过监测系统，记录每个 试验的逃避潜伏期(找到平台的时间)，路径长度(小鼠行进的距离)以 及速度(小鼠的游泳速率)。
将每只小鼠在4个训练日每一天中四次试验的路径长度、逃避潜 伏期和游泳速度归批(每天为一批)。用三路MANOVA(2×7×4)分 析所有三个尺度的得分，该三路MANOVA有一个重复的变量(天)， 两个不重复的变量[小鼠品系-C57BL/10SnJ或C57BL6J，以及处理- AF150(S)和AF267B每个为两种剂量，利凡斯的明和烟碱(每个为一 种剂量)和盐水]。采用简单的主要效果对比分析进行特殊比较，这种 简单的主要效果对比分析特别适用于测试重要的相互作用。
逃避潜伏期.与海马正常的大鼠相比，海马小的小鼠表现出更长的 逃避潜伏期(表明逆向运动(RM)性能更差)。AF150(S)和AF267B， 以及利凡斯的明，都对小海马的小鼠的训练性能具有积极作用，F (6/161)＝6.39，p＜0.0001。特别是，与对照组相比，每一种蕈毒碱化合物 的两种剂量都改善了海马小的小鼠的逃避潜伏期(p＜0.01-p＜0.001)； 此外，AF267B在对性能的作用上表现出响应于剂量的曲线(p＜0.02)， 而AF150(S)的两种剂量对性能产生了相同的作用。与利凡斯的明相 比，AF150(S)和AF267B对性能的作用更有效(分别为p＜0.05-p＜0. 001)。采用两种剂量的AF150(S)都增加了海马正常的小鼠的逃避潜伏 期(p＜0.05-p＜0.01)，而AF267B在训练期间并不明显地对这些小鼠的 逃避潜伏期产生作用。烟碱对海马小的小鼠所表现出的记忆力缺乏并 无改善作用，它同时还降低了海马正常的小鼠的性能(p＜0.02)。这一 结果也表明了训练具有重要的一般性作用，F(3/483)＝90.49，p＜0. 0001；所有组的逃避潜伏期在四个训练日期间呈线性降低(p＜0.0001， 根据多项对照)。
路径长度.与海马正常的小鼠相比，海马小的小鼠表现出明显更长 的路径长度，F(6，161)＝2.35，p＜0.033。AF150(S)(两种剂量)，AF267B (较高的剂量)以及利凡斯的明对海马小的小鼠产生了积极的作用 (p＜0.05-p＜0.01)。AF150(S)(仅较高剂量)明显地(p＜0.05)削弱了海马 正常的小鼠的路径长度，而AF267B或利凡斯的明都对这些小鼠的路 径长度无任何作用。烟碱对被测试的任何小鼠品系无明显的作用。这 一结果也表明了训练具有重要的一般性作用，F(3/483)＝86.98， p＜0.0001；所有组的路径长度在四个训练日期间呈线性降低(P＜0.0001， 根据多项对照)。
游泳速度.检测用盐水处理的小鼠的两个品系之间的运动活性差 异：与海马正常的小鼠相比，海马小的小鼠的游泳速度明显更低，F (6/161)＝14.32，p＜0.0001。此外，两种蕈毒碱药物都明显增加了海马小 的小鼠的游泳速度。特别是AF267B以剂量依赖方式提高了游泳速度 (p＜0.001，相对于对照物；p＜0.02，两个剂量之间)，而AF150(S)两个 剂量的提高作用相等(p＜0.001)。而且，与AF150(S)-1mg/kg相比， AF267B-1mg/kg在更大程度上地明显提高游泳能力(p＜0.001)。利凡斯 的明或烟碱对海马小的小鼠的游泳速度都无明显作用。AF150(S)明显 地(p＜0.01-p＜0.001)削弱了海马正常的小鼠的游泳速度，而AF267B 则没有这种作用。类似地，利凡斯的明(p＜0.01)和烟碱(p＜0.001)明显 地降低了这些小鼠的游泳速度。这一结果也表明了训练具有重要的一 般性作用，F(3/483)＝15.34，p＜0.0001；所有组的游泳速度在四个训练 日期间呈线性降低(P＜0.0001，根据多项对照)。
转移测试.在第17号试验期间，于第4天从池中完全移走平台(探 索试验)。在该试验中，将小鼠放入水中达有限的时间(30s)，通过 记录逃避潜伏期的相对分布和在水池四个象限上的路径长度，从而测 定小鼠的空间偏爱性。用三路MANOVA(2×7×4)分析转移试验(第 17号试验)的路径长度和逃避潜伏期，该三路MANOVA有一个重复 的变量(水池中的象限)和两个不重复的变量[小鼠品系-C57BL/10SnJ 或C57BL6J，以及处理-采用AF150(S)和AF267B(每个为两种剂 量)，利凡斯的明和烟碱(每个为一个剂量)，以及盐水]。
这种测量逃避潜伏期的三路相互作用具有统计学显著性，F (18/483)＝1.62，p＜0.05，而测量路径长度的的相互作用接近于有显著性， F(18/483)＝1.5，p＜0.08。用盐水处理的海马正常的小鼠在转移试验中表 现出完全的空间偏爱性。与水池的其它几个象限相比，它们在训练的 象限内花费明显更多的时间(p＜0.001)。相反，海马小的小鼠在这一试 验中仅仅表现出部分空间偏爱性。与第3号象限(p＜0.001)和第4号象 限(p＜0.05)相比，但不是与第2号象限相比，它们在第1号象限内花费 明显更多的时间(p＜0.001)。然而，用AF150(S)或AF267B(采用两 种剂量)或利凡斯的明处理的海马小的小鼠，与海马正常的小鼠一样表 现出完全的空间偏爱性。与此相反，用烟碱处理的海马小的小鼠与用 盐水处理的海马小的小鼠一样，仅仅表现出部分的空间偏爱性。用 AF150(S)-1mg/kg处理的海马正常的小鼠在这种测试中仅仅表现出 部分的空间偏爱性，而用其它药物处理的海马正常的小鼠在这种测试 中则表现出完全的空间偏爱性。路径长度测定的这些结果与逃避潜伏 期测试的结果非常类似。
逆向试验.在试验18-21中，在第5天，将平台的位置改变到与训 练象限相对的西北象限。从而，在逆向学习期间，平台位置相对于房 间内物体构造发生移动，但在整个实验期间水池都在房间内占据相同 位置。对鼠进行的测试和所采用的量度与训练中一样。
对于每只小鼠，将逆向试验中的逃避潜伏期、路径长度和游泳速 度归为一批(18-21号试验)。用两路MANOVA(2×7)分析所有三个 尺度，该两路MANOVA具有两个变量[小鼠品系-C57BL/10SnJ或 C57BL6J，以及处理-AF150(S)和AF267B(每个为两种剂量)，利凡斯 的明和烟碱(每个为一个剂量)以及盐水]。
逃避潜伏期.与具有正常海马的小鼠相比，具有小海马的小鼠在逆 向学习期间表现出更长的逃避潜伏期，F(6/161)＝3.26，p＜0.005。两种 蕈毒碱药物，AF150(S)和AF267B(采用两种剂量)明显地(p＜0.05-p＜0. 01)改善了海马小的小鼠的逃避潜伏期，而AF150(S)-0.5mg/kg明显 地(p＜0.05)削弱了海马正常的小鼠的逃避潜伏期。利凡斯的明和烟碱 对C57BL/10SnJ或C57BL6J都没用明显作用。
路径长度.测试中表现出的唯一明显作用是AF150(S)-1mg/kg在 逆向学习中削弱海马正常的小鼠的路径长度[对于两路相互作用， F(6/161)＝2.85，p＜0.011]。
游泳速度.盐水处理的小鼠的两个品系之间在运动活性方面无明 显的区别。然而，采用两种剂量的两种蕈毒碱药物都明显地(p＜0.01-0. 001)增加了海马小的小鼠的游泳速度，F(6/161)＝8.71，p＜0.0001。 AF150(S)-0.5mg/kg(p＜0.02)，AF267B-1mg/kg(p＜0.05)，利凡斯的明 (p＜0.01)和烟碱(p＜0.05)都明显降低了海马正常的小鼠的游泳速度。
AF150(S)，AF267B和AchE抑制剂利凡斯的明都明显地削弱了海 马小的小鼠中的这些损伤。尽管在逆向学习中两种蕈毒碱药物表现出 了相似的改善，在获悉或保持期间对认知功能的改善更加显著。与此 相反，烟碱对海马小的小鼠的认知性能不具有有益的作用。在逃避潜 伏期测试中表现出的认知缺失的改善程度不同，证明了AF267B在获 悉中具有响应于剂量的作用。1mg/kg剂量的有益作用明显高于 0.5mg/kg剂量的作用。在转移试验中，未处理的海马小的小鼠对平台 仅表现出部分记忆缺失。采用两种测试剂量的两种蕈毒碱药物以及利 凡斯的明同样表现出对这些缺失具有明显的改善作用，但采用烟碱并 未表现出对这些缺失有明显改善作用。两个发现，AF267B在获悉中响 应于剂量的作用以及两种药物在探索(转移)试验中的有益作用突出 体现了AF267B和AF150(S)对学习和记忆过程的贡献。在这一方面， 应该注意到探索试验是MWM任务中最主要的步骤，它为量化最初的 学习力的强度和准确性提供了量度。
实施例49
AF150(S)对局部缺血的大鼠的认知力损伤有恢复作用
由改进的局部缺血模型(Voll等，Stroke，20：1700-1706，1989)引 起大鼠体内发生暂时的局部缺血。这一改进的局部缺血模型通过使 Sprague Dauwley大鼠(42个雄性大鼠，3个月大，体重为270-340g)体 内发生两侧颈动脉堵塞和用硝普盐引起血压降低而实现。在21只大鼠 中引起局部缺血，而另外的21只大鼠作为假对照物。在戊巴比妥麻醉 (30mg/kg，腹膜内)的条件下，在25分钟的期间内，将硝普钠 (4.8mg/kg/hr)灌注通过植入到尾部静脉的插管。开始灌注之后的5分 钟后，在平均血压保持在30-60mmHg(初始水平为～110mmHg)时，钳 住两根颈动脉达20分钟。此后立即以1.8mEq碳酸氢钠溶液进行腹膜 内给药，从而使系统性酸中毒最小化。与局部缺血大鼠一样对假手术 的大鼠进行麻醉，并用盐水进行灌注。将其颈动脉暴露，但并不钳住 颈动脉。在遭受局部缺血的大鼠中，在手术后的24小时内记录的死亡 率为约30％。在对行为进行测试之前，先让动物恢复3个星期。将大 鼠随机地分配到4组中的一组中：用AF150(S)(0.5mg/kg，口服)处理 的局部缺血大鼠和假手术的对照大鼠，以及用重蒸馏水(DDW) (10ml/kg，口服)处理的局部缺血大鼠和假手术大鼠。每个组包括10-11 只大鼠。手术后立即以AF150(S)进行每天一次的给药，给药期在进 行行为测试之前的数星期(6天/星期)，然后是三个星期的实验期， 在测试前的60分钟给药。采用MWM中与样品范例匹配的工作记忆力 模式对动物进行评价。
计算每个参数的第2批值对第1批值的比率，得到了逃避潜伏期 比率(REL)和路径长度比率(RPL)。REL和RPL反应了从1号试 验到2号试验在性能上的相对保留。用3路ANOVA(2×2×3)分析REL 和RPL，该3路ANOVA(2×2×3)具有一个重复的变量(星期)和两 个不重复的变量(手术-局部缺血/假手术，以及处理-AF150(S)/DDW)。
对于REL和RPL，手术和处理之间的相互作用具有统计学显著性 [对REL和RPL，分另为F(1/32)＝8.08，p＜0.01；F(1/32)＝6.75； p＜0.025]。简单的主要作用对比分析显示，用DDW处理的局部缺血大 鼠的REL和RPL都高于用DDW处理的对照大鼠的REL和RPL(对 REL和RPL分别为p＜0.01和p＜0.02)。这一结果表明与对照大鼠相 比，局部缺血的大鼠的工作记忆过程出现了缺陷。
与用DDW-处理相比，AF150(S)明显改善了局部缺血的大鼠中工 作记忆性。用AF150(S)处理的局部缺血大鼠的REL和RPL(p＜0.05)都 明显低于用DDW处理的局部缺血大鼠的REL和RPL。用AF150(S) 处理的对照大鼠在性能上未表现出明显的改变。在任一测试组中均未 发现在游泳速度上有所不同。总之，AF150(S)以0.5mg/kg的剂量通过 口服方式进行长期给药，在3个星期的试验期间(是在给药3-6个星期 之后)，局部缺血的大鼠在工作记忆性能方面显示出明显改善。非特 异性的运动协调作用既不能解释局部缺血大鼠的行为效果，也不能解 释AF150(S)的提高效果，原因是在Morris水迷宫实验中大鼠的游泳能 力方面并没有明显效果。
实施例50
AF150(S)，AF267B，AF292和AF704在三己芬迪处理的大鼠中的作用
三己芬迪是一种选择性的M1蕈毒碱拮抗剂，其穿过血脑屏障并 引起记忆力和学习力受到损坏(Bymaster et al.J Pharmacol Exp Ther 267： 16-24，1993.Roldan et al Neurosci.Lett.230：93-96，1997；Kimura et al Brain Res.834：6-12，1999)。
下面的试验中采用未试验过的Wistar大鼠。被动回避(PA)任务 由训练(获悉)阶段和保持(retention)阶段组成。在训练步骤中，将每 只大鼠分别置于明亮的小室中，在熟悉/适应60秒之后，打开大室的门， 测定进入潜伏期(初始潜伏期)。在进入暗室之后，立即关闭门，通 过格栅地板传递不可逃避的足部电击刺激(0.6mA，3秒)。起始潜伏 期的截止点设为180秒。将未能在180秒之内进入(步入)的动物从 实验中排除。进行获悉试验之后，大鼠回到自己的居住笼子中。通过 再次将大鼠置入明亮的室中，在60秒的适应时间间隔之后打开门并测 定再次进入暗室的潜伏期，从而在24小时后测定被动回避试验的保持 力。保持潜伏期的截止点设为300秒。从装置中移走未能在300秒之 内步入的动物，将它们的潜伏期计为300秒。
测试的化合物包括：AF150(S)(0.5，1和5mg/kg，口服)，AF267B(0.5， 1和5mg/kg，口服)，AF102B(0.5，1和5mg/kg，口服)。用AF150(S) -5mg/kg(保持潜伏期为222±25.6)，AF267B-0.5mg/kg(保持潜伏 期为181.1±35.4)，AF267B-1mg/kg(保持潜伏期为290.1±8.5)和 AF102B-1mg/kg(保持潜伏期为234.4±35.3)处理过的三己芬迪大鼠 的保持潜伏期明显长于用重蒸溜水(DDW)(保持潜伏期为82.9± 19.55)处理的三己芬迪大鼠的保持潜伏期(p＜0.01-0.001)。此外，用 AF267B-1mg/kg处理的三己芬迪大鼠的保持潜伏期明显长于用 AF267B-0.5mg/kg处理的三己芬迪大鼠的保持潜伏期(p＜0.01)或用 AF150(S)-5mg/kg处理的三己芬迪大鼠的保持潜伏期(p＜0.05)。未 发现用不同药物或DDW处理的对照组之间的保持潜伏期有所不同。 AF704在该试验中也很有效。因此用DDW处理的三己芬迪大鼠的保 持潜伏期(116.25±36.36)明显短于用DDW处理的对照(DDW)大 鼠的保持潜伏期(300±0)(p＜0.001)。然而，用AF704-0.1mg/kg， 口服(保持潜伏期为214.70±36.63)，0.5mg/kg，口服(保持潜伏期 为283.50±17.39)，和1mg/kg，口服(保持潜伏期为274.44±26.97) 处理过的三己芬迪大鼠的保持潜伏期明显长于用DDW处理的三己芬 迪大鼠的保持潜伏期(p＜0.01-0.001)。
在被测试的激动剂中，AF292是最有效的化合物。在剂量为 0.1-0.05mg/kg，口服时，AF292明显有效。口服的最低剂量为AF292 0.03mg/kg，在24和72小时之后进行测试时，仅72小时的延迟对PA 的保持潜伏期有明显效果(与用DDW处理的三己芬迪大鼠相比，为 225.9±36∶DDW-93.1±29.0，p＜0.01)。未发现在起始的潜伏期中有效。 这些结果表明AF292为高度有效的激动剂(如比AF150(S)的有效性高 出两个数量级)，尽管AF150(S)在抗哌仑西平的结合研究中表现出更 高的效力(高亲和性&低亲和性)。AF292的这一效果不能仅仅归因 于与AF150(S)相比，AF292在大鼠中具有更高的生物利用度(49％∶ 31％)。
实施例51
AF267B，AF292对老年大鼠的认知力功能的作用
在MWM中，测试老年(年龄为22-24月)和年轻(年龄为3个 月)的Sprague-Dawley大鼠。与年轻大鼠相比，老年大鼠表现出明显 更慢的学习力曲线，对逃避潜伏期和路径长度分别为F(3/267)＝6.74， p＜0.0001，以及F(3/267)＝4.66，p＜0.003。对于任一测试化合物都未发现 对学习力有明显的影响，然而，用AF267B-1mg/kg处理的老年大鼠表 现出改善的趋势。与老年大鼠相比，所有年轻的大鼠在探索试验(probe trial)中在都表现出有空间偏爱性，分别对逃避潜伏期和路径长度的两 个参数为F(3/267)＝34.91，p＜0.0001，以及F(3/267)＝9.06，p＜0.0001。对 于任一测试化合物都未发现对记忆力有明显的影响，然而，与用DDW 处理的老年大鼠相比，用两种剂量的AF292处理的老年大鼠在该试验 中表现出部分的空间偏爱性。
与年轻的大鼠相比，年老的大鼠在逆向学习中表现出明显差得多 的能力。AF267B-1mg/kg明显改善了老年大鼠的逆向学习能力，对逃 避潜伏期和路径长度分别为F(4/88)＝2.62，p＜0.0001，以及F(4/88)＝2.58， p＜0.003。AF267B对老年大鼠逆向学习力的有益作用不能被归于非特 异性的运动协调作用，原因是AF267B对这些大鼠的游泳能力无明显 影响。AF292对老年大鼠的逆向学习力没有达到显著性，但从曲线的 形状来看，对两种测试剂量，即1和0.5mg/kg，口服，存在改善的趋势。
实施例52
AF292的CNS安全性曲线(表1)
在啮齿动物中，测试AF292对一般行为的可能影响，以及其它CNS 相关的药理学作用。与赋形剂对照组相比，以1，10，30，60或100mg/kg AF292进行口服给药的大鼠中未观察到明显的身体或行为病征。在给 药后24小时，未观察到有明显的行为或身体病征。将所有的大鼠保留 14天，经过保留期的所有大鼠表现正常。与此相比较的是，AF267B 在给药后的第一小时内就开始表现出某些作用(在约40mg/kg口服给 药时表现出流涎和流泪)。
实施例53
AF292的心血管安全性
1.阿司咪唑(人类ether-a-go-go相关性基因(HERG)通道)结 合试验。由于它对与hERG-编码的通道相结合的[3H]-阿司咪唑无抑制 作用，因此AF292在结合试验中不具有活性。
2.隔离的几内亚猪右心房(心房肌纤维震颤)。AF292对收缩力 无明显作用，但与赋形剂组相比，其轻微地降低了收缩率。
3.AF292(剂量，5mg/kg口服)对干预的(instrumented)苏醒比 格尔狗的体内心脏电心理学的和心脏血液动力学作用。不同年龄的， 体重为9.4到12kg的，健康的，经过训练和慢性干预(instrumented) 雌性比格尔狗用于记录心血管参数：心率、心脏舒张和收缩血压，心 率压力乘积(pressure rate product)，LV dp/dt max，LV dp/dt max/pd，LV dp/dt min，心输出量，心搏出量，系统性血管阻力和ECG参数(PQ-， QRS-，QT-，QTcBazett-(QTcB)，QTcFridericia-(QTcF-)和QTcVan de Water-(QTcVdW-)间歇持续时间和QT-分散性)。在实验前的最后18 小时期间，狗不能得到食物。可以随意喝水。在每一实验开始之前， 至少用30分钟记录各种参数的对照值。此后，用管饲法通过口服给药 以5mg/kg的AF292(n＝4)和相应体积的溶剂(n＝4)。此后连续4小时 记录各种血液动力学参数。
以剂量5mg/kg通过口服给药的AF292在统计学上对血液动力学或 以下的ECG参数显著性和相关的作用，其中ECG参数如血压、心脏 收缩(LV dp/dt max；LV dp/dt max/pd)和舒张(LV dp/dt min)，心搏 出量，系统性血管阻力，PQ-，QRS-，QT-，QTcB，QTcF-和QTcVdW- 间歇持续时间，QT-分散性；以及对ECG-形态学。
实施例54
AF292对细胞色素P450同工型的抑制作用
细胞色素P450可以是潜在的药物-药物之间的相互作用的指示剂。 在微量滴定平板试验中测定AF292的P450抑制作用。在浓度达到10 μM时，AF292并未明显抑制响应于药物代谢和相关的药物-药物之间 的相互作用的5种主要人类P450酶，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19， CYP3A4和CPY2D6同工型。
实施例55
AF292的体内代谢作用
当AF292与大鼠，狗，猴和人类肝脏微粒体一起培养时，通过监 测AF292的消失，可测定AF292的代谢稳定性。采用睾酮和心得安作 为试验对照物。结果如表1所示。
实施例56
对AF292的人类结肠腺癌(Caco-2)细胞渗透性研究
本试验用于测定被测试化合物的肠渗透性。在半透性过滤器上生 长时，Caco-2细胞在细胞培养物中自发地分化出来，形成既在结构上， 又在功能上与小肠上皮相似的融合单层。由于这一性质，因此Caco-2 细胞能用作在肠粘膜吸收期间的药物吸收性和代谢性的体外研究模 型。在12孔平板中，用胶原覆盖的多微孔聚碳酸酯膜上生长Caco-2 单层至铺满，并测定被测物质的渗透性。AF292的平均渗透性系数 (Papp)为17.4×106cm/秒，使其被归类为具有高吸收性潜力(进行双 向试验)。
实施例57
蛋白质结合
在人类血浆，α1-糖蛋白，人类血清白蛋白(HSA)和Dulbecco’s 磷酸缓冲盐水(PBS)中进行蛋白结合研究。加入AF292，至最终浓度 为10μM。结果表明在PBS缓冲液剂量浓度(μM)和在人类α1-糖 蛋白(AGP)中蛋白结合为0％(见表1)。
实施例58
AF292在大鼠和狗中的药物代谢动力学曲线
AF292在大鼠和毕尔格猎犬中的PK曲线(整夜禁食；药物以水溶 液形式给药；管饲法)列于表1中。
实施例59
AF267B的毒理学曲线
在慢性毒性研究中，对Wistar大鼠和毕尔格猎犬体内的AF267B 进行长达13周的广泛测试。在狗体内，认为无副作用水平 (no-adverse-effect-level，NOAEL)的范围为6-9mg/kg/天，口服。在狗 体内观察到的作用(＞9mg/kg)和在大鼠体内观察到的作用(＞40mg/kg) 与AF267B作为蕈毒碱激动剂的曲线相一致，不具有中毒的心血管作 用(在苏醒的狗中进行测试)。在口服毒性研究中，对毕尔格猎犬体 内AF267B进行长达13周的广泛测试，在测试试剂给药之前和给药之 后常规地记录心电图(ECG)。测定心率、P波时程&幅度、P-Q、QRS 和QT间隔，观察到被认为是与测试试剂的给药有关的ECG未发生变 化。
实施例60
AF267B对暴露于Aβ原纤维中的大鼠海马神经元的作用，以下列各项 而言：存活性和细胞凋亡；GSK-3β活性；β-连环蛋白的细胞质和核 稳定性；细胞周期蛋白D1表达
该研究采用Garrido JL等(FASEB J 2002；16：1982)描述的方法 在大鼠海马原代细胞培养物中进行。
AF267B在浓度为0.5-50μM时并不影响海马神经元的存活和形态。 然而，AF267B(10μM)保护＞90％的海马神经元不受Aβ1-40(5μM) 的损害，该Aβ1-40(5μM)独自导致海马神经元在存活性和形态方 面减少45％。由于被哌仑西平(10μM)，即一种M1拮抗剂所阻断， 因此AF267B的这些保护作用是由M1蝇蕈碱受体介导的。在大鼠海马 神经元的培养物中，AF267B(100μM)对GSK-3β活性降低达60％。 与对照物(100％)相比，10μM的Aβ原纤维在这类制剂中使GSK-3β活 性增加至370％。此外，AF267B(10μM)使Aβ原纤维(10μM)降低 GSK-3β活性的作用受到拮抗的程度为与对照物相比的150％。AF267B (10μM)防止Aβ1-40(5μM)诱导的细胞凋亡至对照物的水平。当 所培养的海马神经元暴露于Aβ1-40(5μM)中时，可溶性的β-连环 蛋白发生分解，而该分解受到了AF267B(100μM)的阻止。事实上， AF267B以依赖于浓度的方式使可溶性β-连环蛋白的水平增加至对照 物之上[如1μM(100％)，10μM(300％)，100μM(350％)]。β1-40(5μM) 降低核的β-连环蛋白(降低60％)，这是由AF267B造成的阻断作用 (1μM(与对照物相比为140％))。由于被哌仑西平(10μM)所阻断， 因此AF267B的这些保护作用是由M1 mAChR介导的。Aβ1-40 (5μM)在大鼠海马神经元中的破坏稳定作用，是通过由萤光免疫检 验染色所检测的树突皱缩显示。细胞核的位置由c-jun抗体显示。 AF267B保护神经元，当被这一M1激动剂处理时，细胞具有健康的轴 突。由于被哌仑西平(10μM)所阻断，因此AF267B的作用是由M1 mAChR介导的。最后AF267B对Aβ1-40(5μM)诱导的细胞周期 蛋白D1减少(相对于对照物为40％)具有保护作用(相对于对照物 有50％的增加)，其中细胞周期蛋白D1是Wnt路径的一个靶基因。 AF267B的这一作用再次被哌仑西平(10μM)所阻断。
由MTT还原，神经丝的萤光免疫检验和细胞凋亡分析评价的显示 结果表明：F267B保护神经元细胞。
如上所述，本发明实施方案中所采用的化合物为能穿过血脑屏障 的低分子化合物。许多这样的化合物具有其它的有益作用，尤其包括 以优秀的安全范围改善模拟AD和其它相关疾病的各个方面的多种动 物模型的记忆力和学习力。
表1比较了对AF292和AF267B进行测试的一些结果。
表1 作用 AF292 AF267B 1-环己基-1-苯 基-3-(3-哌啶 基)丙醇-大鼠 —被动回避 0.03，0.05，0.1，0.3，0.5mg/kg， 口服，积极作用； MED＜/0.03mg/kg，口服， 长期作用 0.5，1，5积极作用 MED 0.1-0.5mg/kg，口 服 CNS(大鼠)： 欧文氏测试(IRWIN)@ 瞳孔放大：25mg/kg，口 一般性检测 1，10，30，60，100mg/kg，口 服 对以下方面无作用： 运动活动{露地，垂直&水 平隔板，旋转棒(rotarod)， 运动失调，身体姿势&健康状 况(tone)，震颤，颤搐(twich)， 麻痹，僵住症} 反射{翻正，角膜，耳廓，牵 张，肢体状况(limb tone)，屈肌 回撤，震惊} 兴奋作用或镇静作用 {阵挛的/紧张性痉挛，角弓反 张，发声，C-尾部，施特劳布 氏举尾(Straub tail)，循环 (cycling)，刻板症，镇静， 催眠状态(睡眠)} 眼部疾病 眼睑下垂，流泪症，血泪症， 眼球内陷，眼球突出} 皮肤病 {皮肤可塑性，立毛，变白(耳 部)，充血，发绀} 各种作用 {流涎，腹泻，多尿，对处理的 反应，腹部收缩，直肠温度， 死亡} 服 流涎：40mg/kg，口服 流泪：50mg/kg，口服 体温过高：50mg/kg，口 服 啮蚀：50mg/kg，口服 惊厥：50mg/kg，口服 镇静：100mg/kg，口服 血泪：100mg/kg，口服 IRWIN测试：1，10， 100mg/kg口服 1&10对总的行为&生理 状态无影响。 100mg/kg：运输异常， 冷淡，角膜反射下降， 痢疾， 理毛行为减少，泌尿增 强，流涎，流泪&血泪 症，运动活动下降，被 动性，呼吸作用下降， 惊吓反应下降(开始点： 0.5小时；经历时间3-6 小时)。 [3PZ]；大鼠皮 层；Ki，μM 1.64+/-0.13 3.74+/-0.59 [3OXO-M]； 大鼠皮层；Ki， 0.57+/-0.15 1.62+/-0.34 μM 大鼠M1 mAChR转染 的细胞培养物 中的α-APPs 分泌(最大 CCh的％) 尽管对PI的效力较小，但与 AF267B&碳酰胆碱(CCh) 100％均等，EC50＝3μM 100％ 大鼠M1 mAChR转染 的细胞培养物 中的抗Aβ 25-35& H2O2的MTT 试验 尽管对PI的效力较小，但在 100μM处与AF267B&碳酰 胆碱均等； 100％ 人类M1 mAChR亚型 转染的细胞培 养物中的与 CCh(为100 ％)相比的PI 转换率 PI，AA：M1 mAChR：35％， ＞88％ PI，AA：M3 mAChR：作为激动 剂无活性 M3拮抗剂(pKb＝660nM) M2 mAChR-作为激动剂无作 用 PI，AA：M5 mAChR：作为激动 剂无作用 PI，大鼠M1 mAChR：50％ PI，AA：M1 mAChR： 66％，100％ PI，M3 mAChR：30％ PI，大鼠M1 mAChR： 75％ 代谢稳定性 大鼠肝脏微粒体：T1/2＝92分 钟 狗肝脏微粒体：T1/2＞100分钟 猴肝脏微粒体：T1/2＝74分钟 人类肝脏微粒体：T1/2＞100 分钟 [优于AF267B] 大鼠肝脏微粒体： T1/2＝88分钟 狗肝脏微粒体： T1/2＞100分钟 猴肝脏微粒体：T1/2＝27 分钟 人类肝脏微粒体： T1/2＞100分钟 蛋白结合 PBS＝0％ 人类α-糖蛋白(AGP)＝0％ 人类血清白蛋白(HSA)＝22％ 人类血浆＝35％ PBS＝0％ AGP＝5.7％ HAS＝32％ 人类血浆＝25％ 药物代谢动力 学研究^ T1/2，hr Tmax，hr MRT，hr Cmax，ng/ml AUC(0-无穷 大)，ng*hr/ml 生物利用度 (％F) 大鼠10 mg/kg，口服 0.99 0.5 1.5 1906 2146   49 狗，5mg/kg， 口服 2.04 0.8 4.85 1193 4648   70 大鼠5 mg/kg，口服   0.64 0.25 1 852，1704** 773，1546**   30*** 狗，1 mg/kg， 口服 1.33 0.58-0.75 1.96 257，1085# 552，2760#   53 毒性动力学研 究：13w * AUC(0-无穷 大)ng*h/ml MRT(面积) [h] 排除半周期 [h] F(1x)：逸出值，3901-4840； M(1x)：1142-10932 F(13w)：1866-12723； M(13w)：1609-4170 F(1x)：逸出值，8.7-18.7； M(1x)：5-27.3 F(13w)：5.1-33.7；M(13w)： 5-7.8 平均半衰期 T1/2(M)＝6.3+/-5.9； 平均半衰期 T1/2(F)＝10.6+/-7.6 F(1x)：985-3179； M(1x)：800-3691 F(13w)：1033-4164； M(13w)：1041-4471 F(1x)：4.7-5.3；M(1x)： 3.8-5 F(13w)：3.6-5.2； M(13w)：3.0-4.2 平均半衰期 T1/2(M)＝2.1+/-0.6； 平均半衰期 T1/2(F)＝3.3+/-1.5
*狗：AF267B{1.5，3，6mg/kg，口服；单次＝1x，&，13个星期＝13w}；
(AF292来自于AF267B，体内)；进食后1/2小时以管饲法处理；胶囊 中的固体药。用LC-MS(液相色谱-质谱)在不同的时间点处分析血浆 水平；**对10mg/kg进行外推；***计算2mg/kg的值，口服；#(对 5mg/kg进行外推)。比较浓度-时间曲线下口服和静脉内方式的面积 (AUC)，由下列公式确定生物利用度％(F％)：剂量(IV)X AUC(口 服)/剂量(口服)X AUC(IV)。超过30％的F％通常表示生物利用度 良好。如果获得的血浆水平足以产生预期的药理学作用，则Cmax水 平对测定相当重要，通常来说，＞1μM就足够了。AUMC是AUC的 第一个统计时刻，用于计算平均滞留时间(MRT＝AUMC/AUC)，平 均滞留时间是化合物在动物体内存在的平均时间。Cmax表示所观测到 的最大浓度，Tmax是达到最大浓度的时间，T1/2是化合物在血浆中的 计算的半衰期(ln 2X MRT)。清除率是单位时间内其中的化合物被完 全除去的流体(含有化合物)体积。^大鼠和狗通过静脉内(iv)或口 服管饲法方式进行给药。采用LC-MS-MS(液相色谱-质谱-质谱)在不 同时间点分析药物的血浆水平。
@Irwin，S.PSYCHOHPARM 13：222-257，1968.
表1中所示的结果表明AF267B和AF292具有相同的亲和性，但 对mAChR亚型的效力有所不同。
本领域的技术人员应该理解本发明不限于以上所特别展示和说明 的内容。相反地，本发明的范围包括以上所述的特征的组合和次级组 合，及其本领域的技术人员在阅读前面的说明书即可作出的且并不包 含在现有技术中的改变和变化。