提高分子靶向治疗肝细胞癌的敏感性的分析方法
阅读：401发布：2020-05-13
专利汇可以提供提高分子靶向治疗肝细胞癌的敏感性的分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于确定 肝细胞 癌患者对索拉非尼 治疗 是否有敏感性或抗性的分析方法。通过本发明已发现FGFR1与对索拉非尼治疗的敏感性有关。因此，对FGFR1mRNA表达以及可选地其它 生物 标记物(即VEGFR2、PDGFRβ、c‑KIT、c‑RAF、EGFR和/或mTOR)的mRNA表达的分析使得在使用索拉非尼的 分子靶向治疗 之前选择对索拉非尼治疗有敏感性的患者和对索拉非尼治疗有抗性的患者成为可能。，下面是提高分子靶向治疗肝细胞癌的敏感性的分析方法专利的具体信息内容。
1.测量SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平的试剂在制备用于获得选择对索拉非尼治疗具有敏感性的肝细胞癌患者的信息的试剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中获得信息包括：
(i’)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平，以及
(ii’)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平之间的比例。
3.根据权利要求1所述的用途，其中获得信息包括：
(i”’)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平，以及
(ii”’)计算所述mRNA表达水平的总和。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述mRNA表达水平通过实时逆转录酶-聚合酶链反应来测量。
提高分子靶向治疗肝细胞癌的敏感性的分析方法
技术领域
背景技术
[0002] 肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝恶性肿瘤。HCC是世界上第六常见的癌和癌症死亡率第三常见的原因(Yang JD,et al.,(2010)Nat Rev Gastroenterol Hepatol 7:314448-458)。许多分子靶向药物已进入临床试验作为HCC的缓解和辅助治疗(Villanueva A,et al.,(2011)Gastroenterology 140:3161410-1426)。由于统计学上显著但温和地改善两个随机对照试验中的总存活数和进展时间，多重激酶抑制剂索拉非尼已被批准用于晚期HCC的一线治疗(Llovet JM,et al.,(2008)N Engl J Med 359:378-390and Cheng AL,et al.,(2009)Lancet Oncol 10:25-34)。已将其它分子靶向药物与索拉非尼组合或在辅助装置中进行检验(Zhu AX(2012),Semin Oncol 39:493-502.and Huynh H(2010)Biochem Pharmacol 80:550-560)。然而，本领域众所周知，目前的分子靶向分子药剂包括索拉非尼的益处非常有限。使用索拉非尼的III期临床试验中应答率非常低，即仅为2.3-3.30％(Villanueva A,et al.,(2012)Clin Cancer Res 18:1824-1826)。
[0003] 生物标记物越来越多地被用于不同癌症的诊断、预断和治疗决策，推动了癌症治疗中的典范转移(paradigm shift)。生物标记物帮助患者分层，并因此在临床中实现给定药物更好的效果。一种HER2靶向单克隆抗体曲妥单抗(trastuzumab)对具有由免疫组织化学(IHC)或HER2基因扩增检测的3+HER2过表达的转移性乳腺癌患者有效(Vogel CL,et al.,(2002)J Clin Oncol 20:719-726)。而且，EGFR激酶域内怀有激活突变的非小细胞肺癌患者表现出对EGFR抑制剂吉非替尼(gefitinib)令人印象深刻的临床应答(Lynch TJ,et al.,N Engl J Med 350:2129-2139)。将个体肿瘤分层为靶向治疗可有潜在功效的分子亚型的这种分子分类被描述为可控分子分型(actionable molecular subtyping)(West L,et al.,PLoS One 7:e31906.and Vidwans SJ,et al.,PLoS One 6:e18257)。
发明内容
[0004] 技术问题
[0005] 本发明人已发现通过对作为分子标记物的特定基因即VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、EGFR、c-RAF、mTOR和FGFR1的mRNA表达的聚类分析而进行的HCC患者分层，使得选择对一种分子靶向药剂索拉非尼的治疗有敏感性的患者成为可能。特别地，新发现FGFR1与对索拉非尼治疗的敏感性有关。因此，对FGFR1的mRNA表达以及可选地其它生物标记物(即VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF、EGFR和/或mTOR)的mRNA表达的分析使得在使用索拉非尼的分子靶向治疗之前选择对索拉非尼治疗有敏感性的患者和对索拉非尼治疗有抗性的患者成为可能。
[0006] 因此，本发明的一个目的是提供确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括使用FGFR1作为生物标记物或使用VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF、EGFR和/或mTOR与FGFR1一起作为生物标记物。
[0007] 技术方案
[0008] 根据本发明的一个方面，提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平；以及(ii)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平之间的比例。
[0009] 在一个实施方案中，提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i’)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和选自SEQ ID NO:2-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平，以及(ii’)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平之间的比例，以及肝细胞癌组织中SEQ ID NO:2-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:2-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平之间的比例。
[0010] 在另一个实施方案中，提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i”)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织中SEQ ID NO:1、3、4、6和7所示基因的mRNA表达水平，以及(ii”)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1、3、4、6和7所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1、3、4、6和7所示基因的mRNA表达水平之间的比例。
[0011] 在又一实施方案中，提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i”’)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平，以及(ii”’)计算mRNA表达水平的总和。
[0012] 在本发明的分析方法中，mRNA表达水平可通过实时逆转录酶-聚合酶链反应来测量。
[0013] 发明有益效果
[0014] 通过本发明已发现通过对作为分子标记物的特定基因即VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、EGFR、c-RAF、mTOR和FGFR1的mRNA表达的聚类分析而进行的HCC患者分层，使得选择对使用作为一种分子靶向药剂的索拉非尼的治疗有敏感性的患者成为可能。另外，通过本发明已发现对索拉非尼治疗有敏感性的患者可通过仅使用肿瘤组织的分析来选择，该分析涉及使用所述7种标记物基因的表达水平的总和。特别地，已新发现FGFR1与对索拉非尼治疗的敏感性有关。因此，对FGFR1的mRNA表达以及可选地其它生物标记物(即VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF、EGFR和/或mTOR)的mRNA表达的分析使得选择对索拉非尼治疗有敏感性的患者成为可能。附图说明
[0015] 图1示出130例HCC和匹配的非肿瘤组织中作为已知与索拉非尼的功效有关的基因的4种标记物基因(VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF)的mRNA过表达的频率。
[0016] 图2示出根据BCLC阶段(A：早期；B：中期；C晚期)的匹配的非肿瘤组织和肿瘤组织中标记物基因的表达水平。图2中，A-G分别示出VEGFR2(A)、PDGFRβ(B)、c-KIT(C)、c-RAF(D)、EGFR(E)、mTOR(F)和FGFR1(G)的表达水平。
[0017] 图3通过测量源自成对的130例HCC患者的组织中7种标记物基因的表达水平，示出相较于匹配的非肿瘤组织，肿瘤组织中过表达的频率。
[0018] 图4通过测量源自成对的130例HCC患者的组织中7种标记物基因的表达水平，示出相较于非肿瘤组织，根据BCLC阶段的肿瘤组织中过表达的频率。
[0019] 图5示出根据使患者聚类的标记物基因表达模式的分层聚类分析的结果。
[0020] 图6示出源于23例施用索拉非尼的患者的样品中标记物基因表达模式和索拉非尼功效之间的关系。
[0021] 图7示出获自23例施用索拉非尼的患者的NTBS值的交互式点图(A)；和获自其的ROC(受试者工作特征)曲线(B)。
[0022] 发明最佳实施方式
[0024] <式1>
[0025]
[0026] 术语“对索拉非尼治疗有敏感性的患者”指的是根据索拉非尼给药显示出应答(即肿瘤应答)的肝细胞癌患者。“肿瘤应答”指的是根据Llovet JM,et al.(2008)Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma(晚期肝细胞癌中的索拉非尼).N Engl J Med 359:378-390中定义的RECIST(实体瘤应答评价标准)的完全应答、部分应答或稳定疾病。
[0027] 术语“肝细胞癌组织”和“正常组织”指的是通过例如活组织检查从源于肝细胞癌患者的肝细胞癌组织和周围非肿瘤组织外部排出的组织样品。临床中，一般从患者采集癌组织和周围正常组织，然后对其进行组织检查以诊断肝细胞癌和/或建立治疗方案。因此，术语“肝细胞癌组织”和“正常组织”指的是由患者外部排出的例如用于临床中组织检查的组织样品。
[0028] 为了提高索拉非尼非常低的应答率(约3％)，本发明人对来自HCC患者的组织样品中的各种靶生物标记物的表达模式进行了分析，包括分层聚类分析。结果是通过本发明出人意料地发现，FGFR1与对索拉非尼治疗的敏感性有关，这在之前的文献中没有报道。即新发现了表现出肿瘤组织中FGFR1基因(SEQ ID NO:1所示基因)的mRNA表达水平比正常组织中的低的患者对索拉非尼治疗具有高抗性，从而表现出显著低的疗效。因此，通过分析正常组织中FGFR1(SEQ ID NO:1所示基因)的mRNA表达水平和肝细胞癌组织中FGFR1(SEQ ID NO:1所示基因)的mRNA表达水平之间的比例，可提前选择对索拉非尼治疗有敏感性或抗性的患者；并因此可显著提高对索拉非尼治疗的应答率。
[0029] 因此，本发明提供了用于确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织两者中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平；以及(ii)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平之间的比例。在本发明的分析方法中，如果肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平之间的T/N比例(肿瘤/非肿瘤比例)大于2，则可将患者分类为对索拉非尼治疗具有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗具有高敏感性的患者。
[0030] 而且，除了FGFR1(SEQ ID NO:1所示基因)之外，本发明人还对VEGFR2(SEQ ID NO:2所示基因)、PDGFRβ(SEQ ID NO:3所示基因)、c-KIT(SEQ ID NO:4所示基因)、c-RAF(SEQ ID NO:5所示基因)、EGFR(SEQ ID NO:6所示基因)和mTOR(SEQ ID NO:7所示基因)进行了分层聚类分析。结果发现，对这类基因以及FGFR1(SEQ ID NO:1所示基因)的分析使得以较高效率选择对索拉非尼治疗有敏感性的肝细胞癌患者成为可能。因此，在一个实施方案中，本发明提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i’)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和选自SEQ ID NO:2-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平，以及(ii’)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平之间的比例，以及肝细胞癌组织中SEQ ID NO:2-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:2-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平之间的比例。在所述实施方案中，如果(1)肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1基因的mRNA表达水平与正常组织中SEQ ID NO:1基因的mRNA表达水平的T/N比例(肿瘤/非肿瘤比例)大于2；(2)肝细胞癌组织中选自SEQ ID NO:2-5中的一种或多种基因的mRNA表达水平与正常组织中选自SEQ ID NO:2-5中的一种或多种基因的mRNA表达水平的T/N比例大于2；以及(3)肝细胞癌组织中SEQ ID NO:6-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平与正常组织中选自SEQ ID NO:
6-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平的T/N比例小于2，则可将患者分类为对索拉非尼具有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗具有高敏感性的患者。
6-7中的一种或多种基因的mRNA表达水平的T/N比例小于2，则可将患者分类为对索拉非尼具有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗具有高敏感性的患者。
[0031] 而且，已发现SEQ ID NO:2-7所示基因中的SEQ ID NO:3、4、6和7所示基因更优选作为用于与SEQ ID NO:1所示基因组合被分析的基因。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i”)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织和正常组织两者中SEQ ID NO:1、3、4、6和7所示基因的mRNA表达水平，以及(ii”)测量肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1、3、4、6和7所示基因的mRNA表达水平和正常组织中SEQ ID NO:1、3、4、6和7所示基因的mRNA表达水平之间的比例。在所述实施方案中，如果(1)肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平与正常组织中SEQ ID NO:1所示基因的mRNA表达水平的T/N比例大于2；(2)肝细胞癌组织中SEQ ID NO:3-4所示基因的mRNA表达水平与正常组织中SEQ ID NO:3-4所示基因的mRNA表达水平的T/N比例大于2；以及(3)肝细胞癌组织中SEQ ID NO:6-7所示基因的mRNA表达水平与正常组织中SEQ ID NO:6-7所示基因的mRNA表达水平的T/N比例小于2，则可将患者分类为对索拉非尼具有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗具有高敏感性的患者。
[0032] 另外，已发现对索拉非尼治疗有敏感性的患者可通过仅使用肿瘤组织的分析来选择，该分析包括使用新参数即NTBS(Nexavar治疗受益分数)。NTBS指的是所述7种标记物基因表达水平的总和。即NTBS值指的是SEQ ID NO:1-7所示标记物基因的各mRNA表达水平(2-ΔCT)的总和。因此，在又一个实施方案中，本发明提供了确定肝细胞癌患者对索拉非尼治疗是否有敏感性或抗性的分析方法，该方法包括：(i”’)测量由肝细胞癌患者外部排出的肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的mRNA表达水平，以及(ii”’)计算mRNA表达水平的总和。在所述实施方案中，如果肝细胞癌组织中SEQ ID NO:1-7所示基因的所有mRNA表达水平的总和(即NTBS值)大于阈值(例如0.0758)，更优选大于0.1，则可将患者分类为对索拉非尼治疗具有敏感性的患者。
[0033] 在本发明的分析方法中，可根据生物技术领域中使用的常规方法例如根据实时逆转录酶-聚合酶链反应(实时RT-PCR)来测量mRNA表达水平。可对各基因用适当的引物组(primer set)来进行实时RT-PCR。该引物组可以是已知的引物组；或根据常规方法制备的引物组。
[0034] 参照以下实施例将进一步详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明的目的，并不意图限制本发明的范围。
[0035] 1.测试方法
[0036] (1)患者、材料和方法
[0037] 从在1998至2006年之间在韩国亚洲和三星医疗中心(Ajou and Samsung Medical Center)接受原发性HCC治愈切除术的130例患者中获得肝细胞癌(HCC)组织和对应的非癌肝组织以及知情同意书。研究方案获得各医疗中心机构审查委员会的批准。表1概括了该研究中研究的130例HCC患者的个人背景特征。本发明人根据公布的标准使用BCLC阶段和Edmondson和Steiner等级(Forner A,et al.,(2010)Semin Liver Dis 30:61-74.346；and Edmondson HA,et al.,(1954)Cancer 7:462-503)。
[0038] 表1
[0039]
[0040]
[0041] *负值指的是没有相关临床病理学信息的患者的数量。
[0042] <2>RNA提取、cDNA合成以及实时RT-PCR
[0043] 用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,德国)根据供应商说明书从HCC组织和周围正常组织提取总RNA。使用生物分析仪2100(Agilent Technologies,美国)对所得总RNA提取物进行定量分析。提取期间，通过用脱氧核糖核酸酶I(DNase I)处理RNA提取物来除去污染物(即基因组DNA)。各总RNA(4μg)与2μl 1μM低聚糖d(T)18引物(Genotech,韩国)于70℃下反应7分钟，然后于冰上冷却5分钟。分别制备酶混合物(2μl 0.1M DTT(Duchefa,Nethelands)、2μl 10×逆转录酶缓冲液、5μl 2mM dNTP、1μl 200U/μl MMLV逆转录酶和1μl
40U/μl核糖核酸酶抑制剂(Enzynomics,韩国)；共11μl)。将酶混合物加入含RNA混合物中。
于42℃下培养所得混合物90分钟，然后于80℃下培养10分钟，以使逆转录酶失活。将焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水加入混合物中，以获得最终体积为400μl的含cDNA溶液。所得溶液用于定量实时RT-PCR。
40U/μl核糖核酸酶抑制剂(Enzynomics,韩国)；共11μl)。将酶混合物加入含RNA混合物中。
于42℃下培养所得混合物90分钟，然后于80℃下培养10分钟，以使逆转录酶失活。将焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水加入混合物中，以获得最终体积为400μl的含cDNA溶液。所得溶液用于定量实时RT-PCR。
[0044] 按如上所述进行实时RT-PCR(Kwon JH,et al.,(2010)Clin Cancer Res 16:350 5511-5521)。简言之，根据供应商说明书在基因标记物上使用PRISM 7900HT(Applied Biosystems,美国)对各cDNA样品进行实时RT-PCR。用含5μl 2×TaqMan基因表达预混液(Gene Expression Master Mix)(Applied Biosystems,美国)、1μl 5μM上游引物、1μl 5μM下游引物、1μl 1μM探针(Genotech,韩国)、2μl cDNA(在对照组的情况中，相同体积的水)的溶液(共10μl)进行实时RT-PCR。于95℃下预变性10分钟后，以95℃下变性15秒和60℃下延伸1分钟的循环进行扩增。使用引物设计软件(Primer Express 3.0，Applied Biosystems,美国)制备引物和探针，然后分别在5’端和3’端用FAM和TAMRA标记。各标记物基因的表达均测量三次，然后通过减去参比基因mRNA水平的平均值标准化为5种参比基因(B2M、GAPDH、HMBS、HPRT1和DHA)。测量各标记物基因的CT(要达到阈值的循环数量)。由ΔCT值(标记物基因的CT-参比基因的平均CT)，按2-ΔCT计算其mRNA表达水平。下表2中示出各标记物基因的引物和探针。
[0045] 表2
[0046]
[0047]
[0048] <3>NTBS(Nexavar治疗受益分数)的计算
[0049] 为了评价是否可仅使用肿瘤组织选择对索拉非尼有敏感性的患者，我们引入了基于肿瘤组织中7种标记物基因的表达水平的新参数即NTBS(Nexavar治疗受益分数)。通过下式计算NTBS值：
[0050] NTBS＝GVEGFR2+GPDGFRβ+Gc-KIT+Gc-RAF+GEGFR+GmTOR+GFGFR1。
[0051] 上式中，GVEGFR2、GPDGFRβ、Gc-KIT、Gc-RAF、GEGFR、GmTOR和GFGFR1分别指的是肿瘤组织中对应标记物基因的mRNA表达水平(2-ΔCT)。
[0052] <4>统计分析
[0053] 该研究中用开源统计编程环境R进行统计分析。盒须图中示出各基因的2-ΔCT值，且使用学生t-检验评价肿瘤和非肿瘤组织之间差异的显著性。使用χ2和费希尔精确检验(Fisher’s exact test)评价基因表达和临床病理变量的关系。使用肿瘤和周围非肿瘤组织之间2-ΔCT值的倍差来评价上调的、不变的或下调的基因表达。对2-ΔCT值的T/N比例(肿瘤/非肿瘤)进行分层聚类分析用于患者分层。
[0054] 2.测试结果
[0055] (1)与索拉非尼功效有关的标记物基因mRNA过表达的频率
[0056] 在许多种癌症中，已显示标记物基因的表达被异常地调控。因此本发明人研究了130例HCC和匹配的非肿瘤组织中4种标记物基因(即被认为是与索拉非尼功效有关的基因VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT和c-RAF)的mRNA过表达。图1中示出结果。我们认为由于其过表达，肿瘤组织中各标记物基因的表达水平(2-ΔCT)比非肿瘤组织中的至少高2倍。
[0057] 如图1中所示，80.0％的患者表现出4种标记物基因中的至少一种标记物基因过表达。21.54％的患者表现出仅一种标记物基因过表达；23.1％的患者表现出两种标记物基因过表达；18.5％的患者表现出三种标记物基因过表达；以及16.9％的患者表现出所有四种标记物基因过表达。结果表明，仅基于之前已知为与索拉非尼功效有关的基因的所述标记物基因的过表达不能确定索拉非尼的功效。因此，除了所述标记物基因(VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF)之外，本发明人还对各种标记物基因的表达进行了分析；以及进行其分层聚类分析。结果，我们证实，需要分析另外3种标记物基因(EGFR、mTOR、FGFR1)以及所述标记物基因(VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF)，以将表现出对索拉非尼治疗的不同功效和安全特性的患者聚类(未示出数据)。
[0058] (2)7种标记物基因表达的表征
[0059] 根据盒须图(Box-Whisker plot)方法分析非肿瘤组织(NT)和肿瘤组织(T)中7种标记物基因的表达水平(2-ΔCT)。也分析了非肿瘤组织和肿瘤组织(T)中各BCLC阶段(A：早期；B：中期；C：晚期)的标记物基因的表达水平。使用学生t-检验评价肿瘤和非肿瘤组织之间各标记物基因表达差异的显著性，且P值<0.05被认为是统计学上显著的。图2示出其结果。图2中，A-G分别示出VEGFR2(A)、PDGFRβ(B)、c-KIT(C)、c-RAF(D)、EGFR(E)、mTOR(F)和FGFR1(G)的表达水平。
[0060] 在VEGFR2(图2A)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织中表达上调，但其差异在统计学上不显著。然而，BCLC阶段A的患者的肿瘤组织中表达水平明显较高。BCLC阶段B和C的患者的肿瘤组织中表达水平也较高，但其各差异在统计学上不显著。
[0061] 在PDGFRβ(图2B)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织以及所有BCLC阶段A、B和C的患者的肿瘤组织中表达明显较高。
[0062] 在c-KIT(图2C)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织以及所有BCLC阶段A和B的患者的肿瘤组织中表达明显较高。与非肿瘤组织相比，BCLC阶段C的患者的肿瘤组织中表达水平较高，但其差异在统计学上不显著。
[0063] 在c-RAF(图2D)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织以及所有BCLC阶段A、B和C的患者的肿瘤组织中表达明显较高。
[0064] 在EGFR(图2E)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织中表达水平明显较高。然而，仅BCLC阶段A的患者的肿瘤组织中表达水平明显较高。BCLC阶段B的患者的肿瘤组织中表达水平也较高，但其差异在统计学上不显著。BCLC阶段C的患者的肿瘤组织中表达水平甚至更低，但其差异在统计学上也不显著。
[0065] 在mTOR(图2F)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织以及所有BCLC阶段A、B和C的患者的肿瘤组织中表达明显较高。
[0066] 在FGFR1(图2G)的情况中，与非肿瘤组织相比，所有患者的肿瘤组织以及所有BCLC阶段A、B和C的患者的肿瘤组织中表达甚至更低，但其差异在统计学上不显著。
[0067] (3)7种标记物基因表达频率的表征
[0068] 本发明人测量了在来自130例HCC患者的肿瘤组织和周围非肿瘤组织中7种标记物基因的表达水平，然后研究了与非肿瘤组织相比，肿瘤组织中过表达的频率。结果示出在图3中。图3中，红色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少高两倍的患者；绿色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少低两倍的患者；黑色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达高或低不到两倍的患者，即被认为没有显著差异的患者。EGFR mRNA水平在35.4％的肿瘤中上调，而在47.7％的肿瘤中不变；VEGFR2分别在42.3％、39.2％和18.5％的肿瘤中上调、不变或下调。肿瘤中PDGFRβ以高速率(61.5％)上调。FGFR1的表达不变和下调的患者分别为40％和35.4％，而仅24.6％的患者表现出FGFR1在肿瘤中上调。发现mTOR在一半的肿瘤中上调。
[0069] 另外，根据BCLC阶段，我们测量了在来自130例HCC患者的肿瘤组织和周围非肿瘤组织中7种标记物基因的表达水平，然后检验了与非肿瘤组织相比，肿瘤组织中过表达的频率。结果示出在图4中。图4中，红色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少高两倍的患者；绿色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少低两倍的患者；黑色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达高或低不到两倍的患者，即被认为没有显著差异的患者。观察到EGFR在BCLC阶段A41.9％的肿瘤中上调，但后期比例降低了17.6％，并且明显发现EGFR在晚期肿瘤(35.3％)中下调。VEGFR2上调的阶段相关性与EGFR的相似。BCLC阶段A、B和C中分别在66.2％、51.3％和64.7％的肿瘤中观察到PDGFRβ上调。不考虑阶段，在约20％的肿瘤中FGFR1水平上调。所有阶段中约一半的肿瘤中mTOR上调。
[0070] (4)临床特征与标记物基因表达的关系
[0071] 为了获得对HCC中生物标记物基因表达的进一步了解，研究了基因的mRNA水平和临床病理特征之间的关系。EGFR的高mRNA表达与BCLC阶段相关(P＝0.049,表3和4)。肿瘤分化程度(Edmondson等级)与EGFR和VEGFR2二者的表达显著相关(分别为P＝0.003和0.004)，这表明分化良好的HCC倾向于高水平地表达EGFR和VEGFR2。单发肿瘤中EGFR明显过表达(P＝0.001)。
[0072] 表3
[0073]
[0074]
[0075] 表4
[0076]
[0077]
[0078] (5)分层聚类分析
[0079] 本发明人进行了分层聚类分析以将患者聚类。结果示出在图5中。作为肿瘤组织中标记物基因的表达水平与非肿瘤组织中标记物基因的表达水平的比例(即肿瘤/非肿瘤)，计算各标记物基因的表达水平(2-ΔCT)。图5中，红色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少高四倍的患者；深红色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少高两倍的患者；黑色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达高或低不到两倍的患者，即表达水平之间没有显著差异的患者；深绿色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少低两倍的患者；以及绿色表示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织中表达至少低四倍的患者。在意为肝细胞癌阶段的BCLC阶段中，A表示早期HCC(蓝色)；B表示中期HCC(绿色)；且C表示晚期HCC(红色)。图5中，行意指单个靶向分子；柱意指130例单个患者。首先根据BCLC阶段将患者分类，然后根据靶分子的表达比例(肿瘤/非肿瘤)聚类。
[0080] 如图5中所示可见，可根据BCLC阶段和标记物基因将130例患者分类为某个聚类。即在BCLC阶段A中所有7种标记物基因过表达的患者被分类为“患者组aI”；在BCLC阶段A中5种标记物基因(VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT、c-RAF和FGFR1)过表达但两种基因(EGFR和mTOR)低表达的患者可被分类为“患者组aII”；在BCLC阶段A中所有7种标记物基因低表达的患者被分类为“患者组aIII”；BCLC阶段B和C的患者可根据与BCLC阶段A中相同的方式分类。因此，通过分层聚类分析，可预期表现出不同生物标记物表达的患者将引起对分子靶向药剂例如索拉非尼的不同功效和安全特性。
[0081] (6)施用索拉非尼的患者的敏感性试验
[0082] 在源于23例施用索拉非尼的患者的样品中，我们分析了7种标记物基因表达模式和索拉非尼功效之间的关系。由图5的分层聚类分析结果，在没有根据BCLC阶段首次分类的情况下，根据靶分子的表达比例(即肿瘤/非肿瘤)进行聚类；然后将23例施用索拉非尼的患者(i至xxiii)对应地分配至其中(图6)。在23例施用索拉非尼的患者中，仅患者“viii,x,xi”对索拉非尼治疗敏感，即表现出根据Llovet JM,et al.(2008)Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma.N Engl J Med 359:378-390中定义的RECIST(实体瘤应答评价标准)部分应答。剩余20例患者对索拉非尼治疗不敏感。
[0083] 当将23例施用索拉非尼的患者的敏感/不敏感应答对应地分配至分层聚类分析结果时，可见肿瘤组织中FGFR1基因(SEQ ID NO:1所示基因)的mRNA低表达的患者(即患者i-vii、ix和xii-xxiii)对索拉非尼治疗不敏感。因此，如果HCC肿瘤组织中FGFR1基因的mRNA表达水平比正常组织中的表达水平高(即当FGFR1基因的T/N(肿瘤/非肿瘤)比例大于2时)，可将患者分类为对索拉非尼治疗有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗有高敏感性的患者。由于没有关于索拉非尼和FGFR1基因之间关系的报道，因而这些结果是非常意外的。
[0084] 而且，对已知为索拉非尼靶向基因的VEGFR2(SEQ ID NO:2所示基因)、PDGFRβ(SEQ ID NO:3所示基因)、c-KIT(SEQ ID NO:4所示基因)和c-RAF(SEQ ID NO:5所示基因)；和/或已知为索拉非尼抗性基因的EGFR(SEQ ID NO:6所示基因)和mTOR(SEQ ID NO:7所示基因)的mRNA表达，结合FGFR1基因的mRNA表达的分析，使得更有效地选择对索拉非尼治疗有敏感性的患者成为可能。例如，如果(1)FGFR1基因的T/N比例大于2；(2)选自VEGFR2、PDGFRβ、c-KIT和c-RAF中的一种或多种基因的T/N比例大于2；以及(3)选自EGFR和mTOR中的一种或多种基因的T/N比例小于2，则可将患者分类为对索拉非尼治疗有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗有高敏感性的患者。
[0085] 从图6的结果也可看出，其中的PDGFRβ(SEQ ID NO:3所示基因)、c-KIT(SEQ ID NO:4所示基因)、EGFR(SEQ ID NO:6所示基因)和mTOR(SEQ ID NO:7所示基因)更优选作为与FGFR1组合用于分析的基因。因此例如，如果(1)FGFR1基因的T/N比例大于2；(2)PDGFRβ和c-KIT的T/N比例大于2；以及(3)EGFR和mTOR的T/N比例小于2，则可将患者分类为对索拉非尼治疗有低抗性的患者，即对索拉非尼治疗有高敏感性的患者。
[0086] (7)基于施用索拉非尼的患者中NTBS值的敏感性试验
[0087] 本发明人也评价了是否可仅使用肿瘤组织选择对索拉非尼治疗有敏感性的患者。我们基于23例中每例施用索拉非尼的患者的肿瘤组织中7种标记物基因的mRNA表达水平计算NTBS值。结果示出在图7(A)和下表5中。
[0088] 表5
[0089]HCC患者 NTBS
i 0.001851
ii 0.001784
iii 0.029121
iv 0.002138
v 0.059301
vi 0.033066
vii 0.018625
viii 0.1735
ix 0.003082
x 0.11626
xi 0.1144
xii 0.027969
xiii -0.00073
xiv 0.047356
xv 0.07577
xvi 0.029827
xvii -0.00108
xviii 0.003726
xix 0.029899
xx 0.00343
xxi 0.028935
xxii 0.027161
xxiii -0.00165
i 0.001851
ii 0.001784
iii 0.029121
iv 0.002138
v 0.059301
vi 0.033066
vii 0.018625
viii 0.1735
ix 0.003082
x 0.11626
xi 0.1144
xii 0.027969
xiii -0.00073
xiv 0.047356
xv 0.07577
xvi 0.029827
xvii -0.00108
xviii 0.003726
xix 0.029899
xx 0.00343
xxi 0.028935
xxii 0.027161
xxiii -0.00165
[0090] 图7(A)中，S指的是从对索拉非尼治疗敏感的患者(即患者viii、x和xi)获得的NTBS值；R指的是从对索拉非尼治疗不敏感的患者(即患者i-vii、ix和xii-xxiii)获得的NTBS值。图7(B)中示出由NTBS值获得的ROC(受试者工作特征)曲线。由ROC曲线分析计算的阈值是0.0758。从上述结果可见，可使用参数即NTBS选择对索拉非尼治疗有敏感性的患者。即如果NTBS值大于阈值(即0.0758)，优选大于0.1，则可将患者分类为对索拉非尼治疗有敏感性的患者。
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