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一种具有MR基因成像与靶向治疗双重作用的SPIO-shRNA分子探针

阅读：217发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种具有MR基因成像与靶向治疗双重作用的SPIO-shRNA分子探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种具有MR基因成像与靶向治疗双功能的SPIO-shRNA分子探针，包括SPIO纳米粒和pGenesil1-shRNA质粒，其中，质粒的序列为：AGTGTGTAACGGAATAGGT。该分子探针一方面可用于磁共振（MR）扫描MR基因成像，检测其特异性、靶向性，另一方面还观察探针阻抑细胞中EGFR表达，诱导细胞凋亡、调控细胞周期再分布等,实现靶向基因治疗。，下面是一种具有MR基因成像与靶向治疗双重作用的SPIO-shRNA分子探针专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有MR基因成像与靶向治疗作用的SPIO-shRNA分子探针，包括SPIO纳米粒和pGenesil1-shRNA质粒，其中，质粒的序列为：AGTGTGTAACGGAATAGGT。
2.如权利要求1所述的分子探针，所述SPIO纳米粒经葡聚糖修饰。
3.如权利要求2所述的分子探针，经葡聚糖修饰的SPIO纳米粒的粒径范围为15～
30nm。
4.如权利要求3所述的分子探针，经葡聚糖修饰的SPIO纳米粒的平均粒径为25nm。
5.如权利要求2所述的分子探针，经葡聚糖修饰的SPIO纳米粒偶联多聚赖氨酸。
6.如权利要求5所述的分子探针，葡聚糖修饰的SPIO：多聚赖氨酸的投料质量比为
1:1。
7.如权利要求5所述的分子探针,SPIO-多聚赖氨酸与pGenesil1-shRNA质粒的投料质量比为6～8：1。
8.一种制备权利要求1-5任一项的SPIO-shRNA分子探针的方法，该方法包括以下步骤：①SPIO的制备：将Fe3+和Fe2+按摩尔比1：1.75混合，在溶液中缓慢滴加氨水调节pH值，使铁盐与OH-结合，通入氮气，搅拌40-60min，反应毕，用醋酸调节pH至中性，离心机离心，得到上清液，加水稀释，随后用透析袋透析，微孔滤膜过滤后超声，得到SPIO纳米粒，将所得SPIO纳米粒用萄聚糖修饰；
②SPIO-多聚赖氨酸的制备：步骤1的葡聚糖修饰的SPIO100mL，加入5mg多聚赖氨酸，其中SPIO：多聚赖氨酸的W/W为1：1，超声震荡后，用100mL的150mM NaCl溶液洗涤3次，富集后即得到SPIO-多聚赖氨酸；
③在PH=7时，将步骤2的SPIO-多聚赖氨酸与质粒pGenesil1-shRNA分别按6-8:1质量比混合，在室温下放置充分吸附，得到SPIO-shRNA分子探针。
9.如权利要求6的方法，所述Fe3+和为硫酸铁或氯化铁。
10.如权利要求6的方法，所述Fe2+为硫酸亚铁或氯化亚铁。

说明书全文

一种具有MR基因成像与靶向治疗双重作用的SPIO-shRNA

分子探针

技术领域

[0001] 本发明属于医药和医学领域，具体涉及一种具有MR基因成像与肿瘤靶向治疗双重作用的SPIO-shRNA分子探针。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤是威胁我国城乡人民健康的常见病及多发病，并呈逐年上升趋势，而对恶性肿瘤的早期、特异性诊断与靶向治疗是提高生存率、改善生活质量的关键所在。但是，目前临床上采用的影像诊断方法均是针对肿瘤形成实质性肿块后的形态学成像，此时患者已经处于病程的中晚期，共性化的治疗模式如手术、化疗和放疗等，副作用大，效果不佳。

[0003] RNA干扰（RNAi）是真核生物中普遍存在的一种自然现象，比核酶技术、基因敲出、反义寡核苷酸干扰等特异性更高、抑制作用更完全的mRNA水平干扰技术，表现为与靶基因同源的双链RNA序列特异转录后的基因沉默过程，是当前肿瘤治疗的一个有效新途径和手段。

[0004] 选择合适的靶基因是实现基因抑制的先决条件，研究显示，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）在多种肿瘤中存在着过度表达，其表达水平与肿瘤的发生、转移、浸润程度等密切相关。EGFR为I型跨膜酪氨酸激酶受体，相对分子质量3
为170×10，是原癌基因c-erbB1的表达产物，该基因定位于第7号染色体短臂，包含26个外显子，能被表皮生长因子或转化生长因子α等配体激活，通过Ras-Raf-MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT和PLC-γ/PKC等通路将信号从细胞外传到细胞内，参与调控细胞增殖、分化、损伤修复和细胞周期等多种生物学功能。由此可见，EGFR是基因治疗的理想靶点。

[0005] 本发明经研究发现，用SPIO标记针对EGFR的短发夹RNA（short-hair RNA,即shRNA），制成SPIO-shRNA探针,通过转染高表达EGFR的卵巢癌SKOV3细胞并在活体荷瘤动物模型上验证，一方面研究该探针用于磁共振（MR）扫描MR基因成像，检测其特异性、靶向性，另一方面还观察探针阻抑细胞中EGFR表达，诱导细胞凋亡、调控细胞周期再分布等,实现靶向基因治疗。这将为治疗恶性肿瘤提供新思路和新途径，并为基因治疗的在体动态无创监测提供一种崭新的分子影像学手段。

[0006] 本发明将分子生物学领域的RNA干扰技术用于影像诊断学中，把两种先进技术的优点和特异性结合起来，最大限度地增加探针的靶/非靶比值，经过MR扫描可显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系，建立一种基因水平的早期、特异诊断与靶向治疗肿瘤的新方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种具有MR基因成像与靶向治疗双功能的SPIO-shRNA分子探针。该分子探针以选择表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）作为研究靶点，人工合成针对EGFR的重组质粒pGenesil1-shRNA序列（简称shRNA序列），将超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide,SPIO）标记于shRNA制成分子探针，引入活体荷瘤动物体内。从理论上分析，该分子探针进入细胞除了通过吞饮作用外，还由于SPIO在血液中容易与转铁蛋白结合，而生长旺盛的肿瘤细胞膜上存在着大量的转铁蛋白受体，表达水平较一般细胞明显增高，故还可将含SPIO的分子探针主动转运入肿瘤细胞内，最大限度地增加了细胞内的探针浓度。这样，一方面在不需要其他载体的情况下，本发明的分子探针可使shRNA也容易进入细胞中，阻抑EGFR基因表达，诱导细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目地；另一方面，探针上的SPIO在MR扫描时可造成肿瘤与周围组织的信号差别明显。这样，不仅能在MR图像上清楚显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系，还便于活体观察基因治疗效果，可望实现对癌基因表达的有效显示与干预，真正实现动态的诊治一体化。

[0008] 为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

[0009] 在一实施方案中，本发明的一种具有MR基因成像与靶向治疗作用的SPIO-shRNA分子探针，包括SPIO纳米粒和pGenesil1-shRNA质粒，其中，shRNA序列为：
AGTGTGTAACGGAATAGGT，所述SPIO纳米粒经葡聚糖修饰。

[0010] 在上述实施方案中，本发明的分子探针，其中，葡聚糖修饰的SPIO与多聚赖氨酸的质量比为1：1，SPIO-多聚赖氨酸与pGenesil1-shRNA质粒的质量比为6～8：1，优选6：1，所述质量比均为投料量比。

[0011] 在上述实施方案中，本发明的SPIO-shRNA分子探针，经葡聚糖修饰的SPIO纳米粒的粒径范围为15-30nm，优选25nm。

[0012] 在上述实施方案中,本发明的分子探针，经葡聚糖修饰的SPIO纳米粒偶联多聚赖氨酸。

[0013] 在一优选实施方案中，本发明的一种具有MR基因成像与靶向治疗作用的SPIO-shRNA分子探针，包括SPIO纳米粒和pGenesil1-shRNA质粒，其中，shRNA序列为：AGTGTGTAACGGAATAGGT，所述SPIO纳米粒经葡聚糖修饰，其表面偶联多聚赖氨酸，其中，葡聚糖修饰的SPIO与多聚赖氨酸的质量比为1：1，SPIO-多聚赖氨酸与pGenesil1-shRNA质粒的质量比为6～8：1，优选6：1，所述质量比均为投料量比。

[0014] 在上述实施方案和优选实施方案中，本发明的分子探针，其中，葡聚糖修饰的SPIO与多聚赖氨酸的质量比为1：1，SPIO-多聚赖氨酸与pGenesil1-shRNA质粒的质量比为6～8：1，优选6：1，所述质量比均为投料量比。

[0015] 在另一实施方案中，本发明的目的还提供了一种制备上述本发明的SPIO-shRNA分子探针的方法，该方法包括以下步骤：

[0016] ①SPIO的制备：将Fe3+和Fe2+按摩尔比1：1.75混合，在溶液中缓慢滴加氨水调节pH值，使铁盐与OH-结合，通入氮气，搅拌40-60min，反应毕，用醋酸调节pH至中性，离心机离心，得到上清液，加水稀释，随后用透析袋透析，微孔滤膜过滤后超声，得到SPIO纳米粒，将所得SPIO纳米粒用萄聚糖修饰；

[0017] ②SPIO-多聚赖氨酸的制备：步骤1的葡聚糖修饰的SPIO100mL，加入5mg多聚赖氨酸，其中SPIO：多聚赖氨酸的W/W为1：1，超声震荡后，用100mL的150mM NaCl溶液洗涤3次，富集后即得到SPIO-多聚赖氨酸；

[0018] ③在PH=7时，将步骤2的SPIO-多聚赖氨酸与质粒pGenesil1-shRNA分别按6～8：1的质量比混合，在室温下放置充分吸附，得到SPIO-shRNA分子探针。

[0019] 在上述另一实施方案中,步骤1)中所述Fe3+和/可以是硫酸铁、氯化铁，Fe2+硫酸亚铁、氯化亚铁。

[0020] 有益效果：本发明的分子探针，一方面在不需要其他载体的情况下，可使shRNA容易进入细胞中，阻抑EGFR基因表达，诱导细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目地；另一方面，探针上的SPIO在MR扫描时可造成肿瘤与周围组织的信号差别明显。这样，不仅能在MR图像上清楚显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系，还便于活体观察基因治疗效果，可望实现对癌基因表达的有效显示与干预，真正实现动态的诊治一体化。附图说明

[0021] 图1SPIO-PLL与质粒pGenesil1-shRNA不同质量比结合游离DNA含量

[0022] 图2分子探针与对照组的凝胶阻滞实验结果

[0023] 图3SPIO、SPIO-PLL和分子探针zeta电位

[0024] 图4分子探针转染后的细胞普鲁士蓝染色光镜下观察结果及电镜测试结果[0025] 图5分子探针转染后的细胞荧光显微镜测试图

[0026] 图6注射分子探针后在动物各器脏中的分布

[0027] 图7分子探针传染卵巢癌SKOV3细胞MR成像

[0028] 图8探针注射前后T2WIFSE各浓度组肿瘤组织MR图像

具体实施方式

[0029] 以下实施例用于进一步阐明或理解本发明的实质，但不以此限制本发明的范围。

[0030] 实施例1

[0031] 制备SPIO-shRNA分子探针

[0032] ①SPIO的制备：采用共沉淀法完成，反应原理为：Fe2++2Fe3++8OH-→Fe3O4+4H2O。

[0033] 精密称取FeCl3·6H2O1.17g与FeCl2·4H2O0.43g(Fe3+和Fe2+的摩尔比=1：1.75)和萄聚糖T-32.5g溶解在40ml超纯水中，在溶液中缓慢滴加氨水调节pH值，使铁盐与OH-结合，然后置于80℃的水浴中搅拌，以450r/min搅拌60min，期间保持通入氮气，反应毕，醋酸调节pH至10，离心机以12000r.min-1速度离心15min，得到上清液，加水稀释至100mL，随后用透析袋透析24h，微孔滤膜过滤后超声5min，得到葡聚糖修饰的SPIO。样品经过透射电镜和原子力显微镜测定：核心粒径为5nm左右，葡聚糖包被后的颗粒大小为25nm，振动样品磁强计测定出样品的饱和磁化强度为69.42162emu/g Fe，比饱和磁化强度
68.39568emu/g，比剩余磁化强度为30.4648emu/g，剩磁为21.46374Gs（几乎为0），驰豫率
6 -1 -1
为0.155×10mol ·sec ；此外，该磁化曲线为一条过原点的单一曲线，说明当外加磁场为
0时，SPIO样品几乎没有剩磁，即有超顺磁性。可见，样品的物理性质和磁学性质符合作为载体用于MR成像的要求。

[0034] ②SPIO-PLL复合物制备：将上步制备的葡聚糖修饰的SPIO100mL，装入500mL烧瓶，将5mg多聚赖氨酸(polylysine，PLL)加入其中（葡聚糖修饰SPIO：PLL的W/W为1：1），超声（80W)震荡1h后，100mL的150mM NaCl溶液洗涤3次，洗涤时将强磁铁置于装有超声溶液的烧瓶底部，富集后即得到SPIO-PLL，密封后4℃冰箱保存。粒度电位分析和TEM结果显示SPIO-PLL的平均粒径73.7nm，平均电位13.6mV；GPC、FTIR及1HNMR.结果显示SPIO及PLL之间已经成功连接；高精度原子力显微镜清楚显示出SPIO与PLL之间以亚胺键形式稳定相连。

[0035] ③分子探针的制备

[0036] 在PH=7时，将SPIO-PLL复合物与质粒pGenesil1-shRNA（从上海生工生物工程技术服务有限公司购得）分别按质量比0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1质量比混合，编号各组复合物，室温下放置30min以便充分吸附即得SPIO-shRNA分子探针。将所制备的SPIO-shRNA分子探针以12000r/min离心20min，微量分光光度计测定上清液中的质粒浓度，以单纯质粒为对照组，计算各组游离质粒百分比并换算成相应的结合率。

[0037] 实施例2性能指标测定

[0038] 性能指标：

[0039] （一）生物及物理性质检测：

[0040] 1、SPIO-PLL复合物与质粒pGenesil1-shRNA的结合率检测:随着SPIO-PLL浓度的增加，与质粒的结合率逐渐上升，当两者比例达6:1时，进入平台期（见图1），提示二者的结合已接近饱和，因此，最佳的质量比为6-8：1。

[0041] 2、凝胶阻滞实验：从下图中显示，在中性条件下，对照组（泳道1为质粒pGenesil1-shRNA，泳道3为SPIO-PLL复合物）均可见到白色亮条带泳出，实验组（泳道2的分子探针）仅于点样孔处有光亮，未见质粒条带泳出（见图2）。

[0042] 3、zeta电位检测：在PH=7时，SPIO的zeta电位为（-14.8±0.35）mV，SPIO-PLL zeta电位为（14.7±0.68）mV，本发明的分子探针zeta电位为（-4.7±0.85）mV，三组结果差异有显著统计学意义，见图3。

[0043] 4、细胞培养及准备：将卵巢癌SKOV3置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5%CO2孵箱中常规培养，待细胞至对数生长期时，用0.25%胰酶消化并加入适量培养基制成细胞悬液用于细胞转染。

[0044] 普鲁士蓝染色：调整卵巢癌SKOV3细胞悬液浓度为4×105/mL，接种于预先放有爬片的24孔板，常规培养24h后，将分子探针加入其中混匀（经过多次预实验，最终设置探针的铁浓度为20ug/mL），继续培养24h后取出，吸弃培养液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，蒸馏水洗涤3次，再加入2％亚铁氰化钾和等体积2％盐酸的混合液，反应30min后再用蒸馏水洗涤3次，核固红复染5min，蒸馏水洗涤后晾干，中性树胶封片，用于显微镜及电镜下观察。

[0045] 光镜下观察结果：几乎所有细胞内均可见到蓝染的铁颗粒（见图4A放大200倍，图4B放大400倍）。

[0046] 电镜下观察结果：可见蓝染的铁颗粒大部分分布于胞浆内，少部分位于胞核（图4C），此外，还可以观察到胞膜出现空泡化、细胞固缩、核固缩，以及向外突出的凋亡小体（图
4D）。

[0047] 上述结果表明，分子探针能够顺利被细胞摄取，并使细胞出现凋亡，即出现RNA干扰效应。

[0048] 5、荧光显微镜观察体外细胞转染：质粒pGenesil-1载体含增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，能在转入的细胞内表达后，即可在荧光显微镜下发出绿色荧光。分子探针转染后的细胞(见图5)，可见到斑片状的绿色荧光，而SPIO-PLL复合物、质粒pGenesil1-shRNA组于镜下均未见到发绿色荧光的细胞。

[0049] 6、细胞活性检测：检测内容包括①台盼蓝排除实验、②CCK-8实验、③蛋白表达检测（Western blot法），发现当探针浓度为25ug/ml时，细胞内铁含量为（17.92±0.16）p g，细胞活力、存活率及细胞内蛋白表达量明显降低（P＜0.05），说明可以有效转染并特异性抑制肿瘤细胞株的表达，具有治疗效果。

[0050] （二）磁学性质检测：

[0051] 饱和磁化强度为67.75310emu/g Fe，比饱和磁化强度65.57329emu/g，比剩余磁化6 -1 -1
强度为26.33780emu/g，剩磁为14.47826Gs，驰豫率为0.175×10mol ·sec 。磁化曲线为一条过原点的单一曲线，说明本探针具有超顺磁性。

[0052] （三）稳定性检测：

[0053] 参照2005年3月我国制定的《化学药物稳定性研究技术指导原则》（编号【H】GPH6-1），在光照和1月常温条件下观察实施例1的样品的性状、pH值、铁浓度、粒径、饱和磁化强度及T2磁豫率等参数，发现样品的稳定性好。

[0054] （四）急性毒理实验：

[0055] 按照我国2005年版《化学药物急性毒性试验技术指导原则》（编号：【H】GPT1-1），试验组分为3组，分别给予本发明的分子探针，其中，一组按总剂量为2104.8mg/kg，给药容积40ml/kg口服灌胃；一组按总剂量为438.5mg/kg，给药容积25ml/kg静脉注射；一组以及总剂量为1578.6mg/kg，给药容积30ml/kg腹腔注射，连续观察14d，记录昆明小鼠急性毒理反应、主要脏器的病理学改变和血清主要生化指标改变。结果显示，各组小鼠均未出现死亡；肝、脾、肾、心、肺、骨髓等主要脏器未见明显病理改变，仅肝、脾内分布少许蓝色铁颗粒；各组生化指标无明显差异。

[0056] （五）一般药理学研究

[0057] 设置的分子探针高剂量浓度为12mgFe/kg，中剂量浓度为6mgFe/kg，低剂量浓度为3mgFe/kg。高、中、低剂量的探针在体内符合二室模型，二室模型动力学过程的药动学参数见下表。

[0058]

[0059]

[0060] 注射分子探针后，脾脏富集量最高（180min达到高峰），经方差分析dunnett法检验，显示α=0.05水平，在脾脏的分布与其他脏器之间存在差异，p=0.017＜0.05；其次富集量在肝脏（180min达到高峰），经方差分析dunnett法检验，显示α=0.05水平，分布与其他脏器之间存在差异，p=0.006＜0.05；肾脏在注射后60min达高峰，经方差分析dunnett法检验，在α=0.05水平，60min的分布与其他时间组均有差异，p=0.022＜0.05,见图6。

[0061] （六）MR细胞成像：

[0062] 实验组（分子探针转染卵巢癌SKOV3细胞）及对照组（分子探针转染不表达EGFR的Fuda细胞、SPIO转染卵巢癌SKOV3细胞、质粒转染卵巢癌SKOV3细胞、未转染的卵巢癌SKOV3细胞和蒸馏水）分别置入6个Ependoff管，3英寸表面线圈固定，采用美国GE公司3.0TMR成像仪横断位扫描，扫描参数为：GRE（梯度回波）序列，TR/TE225/5.3ms，翻转角30·，视野8.0mm，层厚1.8cm，矩阵256×256。分别沿各管内径勾画感兴趣区（ROI），测定各管信号值及背景信号值，计算信噪比（SNR）＝管内信号值/背景信号值。实验中每组均设置3组平行管，分别计算平均值。

[0063] 成像结果示，实验组的T2信号强度均比对照组低，各浓度组信号强度差异有统计学意义（P<0.05），说明分子探针转染卵巢癌SKOV3细胞后，探针能够顺利进入细胞内，并能被MR成像所显示出来。见图7,说明：管6为实验组，管1为蒸馏水，管2为未转染的卵巢癌SKOV3细胞，管3为质粒转染卵巢癌SKOV3细胞，管4为分子探针转染不表达EGFR的Fuda细胞，管5为SPIO转染卵巢癌SKOV3细胞。

[0064] （七）MR活体成像与抑瘤效果观察：

[0065] 注射探针后，对比荷瘤裸鼠肿瘤组织在不同浓度探针注射前后的信号强度变化，发现12.0mg组裸鼠在注射探针后信号变化最明显，裸鼠肿瘤组织的信号变化已可明显肉眼辨识，在MR扫描图像上能清楚显示。HE染色发现肿瘤组织结构紊乱，存在大量异性肿瘤细胞，排列呈“癌巢”状，在各浓度组表现相似；而普鲁士蓝染色发现各浓度组的肿瘤组织标本中均散在分布斑点状蓝色铁颗粒，以12.0mg组分布最密集。

[0066] 对比荷瘤裸鼠在探针注射前后的不同时间点扫描的信号强度，发现肿瘤组织在注射后360min信号变化最明显，在MR扫描图像上能清楚显示。HE染色发现肿瘤组织结构紊乱，存在大量异性肿瘤细胞，排列呈“癌巢”状，在各时间点表现相似；而普鲁士蓝染色发现各观察时间点标本的肿瘤组织中均散在分布斑点状蓝色铁颗粒，以注射反义探针后360min分布最密集。

[0067] 可见，用于BALB/c裸鼠MR的最佳扫描浓度为12.0mg Fe/Kg，最佳扫描时间为注射后360min；检测肿瘤病灶的各种序列中，以GRE T2﹡WI最为敏感，其次是双回波的T2WI+PDWI序列。

[0068] 小结：SPIO-shRNA分子探针，具有标记率高、稳定性好、细胞摄取率高、生物性能良好等优点。体内分布以肝、肾较多，肿瘤组织摄取高，注入后即可保证MR成像成功并出现治疗效果。因此，可望为肿瘤的早期诊断及治疗提供一种新的方法。

[0069] 本发明的分子探针的创新之处在于将分子生物学领域的RNA干扰技术用于影像诊断学中，把两种先进技术的优点和特异性结合起来，最大限度地增加探针的靶/非靶比值，经过MR扫描可显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系，可以作为一种基因水平的早期、特异诊断与治疗肿瘤的新成像方法。

[0070] 本发明的直接经济效益和社会意义：本发明的分子探针可以用于多种恶性肿瘤如卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌和头颈部鳞癌的早期影像诊断与靶向治疗。

[0071] 本发明的分子探针可开发为MR临床诊断及治疗药物，具广阔应用前景，将创造更高的经济效益。

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