体细胞快速染色技术

一.技术领域体细胞快速染色技术应用于细胞病理学领域。

二.背景技术

在细胞病理学领域中，Giemsa、巴氏及H&E染色技术等，为组织病理学、细胞病理学的发展作出了巨大贡献并沿用至今。但这些染色技术对细胞显示的结果，与现代细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学的研究结果在以下几个方面不相吻合：(一)正常细胞核中核仁的数目和形态  在细胞形态学观察中，细胞核的特征历来是细胞学家判断细胞“良”与“恶”的重要标准，而核仁则是判断细胞“良”与“恶”的窗口。

在细胞病理学领域中，国外大多偏爱巴氏染色技术，而国内在染色技术的选择上则多样化。在核仁数目和形态观察结果上，国内外至今不统一。有的学者认为：核仁见于某些间期细胞的核内，呈球形，多为1～2个，也有3～5个的。有的学者认为：核仁圆形或卵圆形结构，有1～8个核仁。还有的学者认为：核仁的数目和大小依细胞种类及生理状态不同而有很大变化，一般为1～2个，也有多个的。在我国2000出版的具有权威性的《病理学技术》一书中，也认为正常细胞核内含有1～2个核仁，可见核仁数目范围观察结果的不一致性。

现代生物学、细胞遗传学以及分子生物学研究结果表明，人类正常细胞有46条染色体，其中有10条染色体上含有核仁组织区(hucleolus organizerregion，NOR)。人类rRNA基因定位于5对近端着丝粒染色体上(13、14、15、21和22号染色体)。当10条含有NOR的染色体解螺旋进入间期后，NOR随机分配在球形细胞核内。普通光学显微镜下，仅看到了细胞的一半。在概率上，如果染色技术能清晰显示细胞核结构的话，人类应该观察到的能够分裂的正常细胞核仁的数目应该是5个。在考虑到人类进化过程中端着丝粒染色体随机联合的生物学特征，以及人体细胞类型(包括静止期细胞在内)的差异性，正常细胞核仁的数目的范围应该是0～5个。这样看来，有关核仁的数目和形态，用Giemsa、巴氏、H&E染色技术对细胞显示的结果与现代科学研究结果是不完全吻合的。

电镜研究的结果证明，核仁没有膜包围，是由转录产物的前体rRNA(precursor rRNA，pre RNA)相互缠绕的网状结构。NOR从中期进入间期，随染色质的随机分布而分布，其分布的方向性决定了间期核仁的形态不是千篇一律的圆形或卵圆型，而应该具备多态性。

在国内外判断肿瘤细胞的若干著作中认为：“如果核仁的直径增大达5μm，其数目超过3-4个，应当考虑是癌细胞”。这些观察结果及判断癌细胞的标准与现代科学研究的结论存在一些矛盾，给细胞“炎性病变”、“癌前病变”、“恶性病变”的判断与区别造成诸多不便。细胞病理学是前辈们心血堆集的产物，我们无意因申请专利去批驳细胞学家们的观察结果。但基于细胞是一个整体，细胞核遗传物质(DNA)的复制需RNA转录、以及细胞质中蛋白质合成与运输的客观规律，正常细胞核仁数目与形态是细胞形态鉴别基本参照标准。

(二)细胞质的功能状态  根据现代细胞生物学，细胞核内的各种蛋白质(如组蛋白、DNA和RNA聚合酶、基因调节蛋白等)都是在胞质溶胶内合成，并通过核孔输入到细胞核。核内的蛋白质在细胞分裂时与胞质混合，分裂完成后再输入细胞核。

然而，自Papanicolaou氏(1928)提出妇科宫颈阴道细胞学及有关“癌前核异质”(1943)以来，在我国有关癌前核异质细胞形态最明确的描述，见中国医学科学院肿瘤研究所和肿瘤医院细胞学室《临床肿瘤细胞学图谱》(1976)。该著作对宫颈鳞状细胞“癌前核异质”形态进行了这样的描述：“核大，核染质不匀，核周有空泡”。1988年美国提出Bethesda系统将“反应性或癌前病变/恶性过程”定义为ASCUS(未明确意义的不典型鳞状细胞)。即ASCUS类型的细胞改变可以反映高度的良性病变或潜在的严重病变，这些病变又不能明确分类，而称之为“未明确意义”。美国细胞病理学家Kini认为：“此种分类已经造成并继续造成在细胞学技术学家、病理学家和临床医师的很大混乱”。(请参阅SudhaR.Kini编著，张慧英主译《细胞病理学鉴别诊断彩色图谱—脱落和穿刺细胞病理学》.天津科技翻译出版公司出版，2000年第1版)。

可见细胞病理学经过半个多世纪的研究和探索，尚未将癌前病变细胞形态鉴别出来。细胞病理学一直以细胞核的形态学特征作为鉴别细胞的标准，即便是近年，Kini在其著作中也强调“必须牢记，无论胞浆的特点表现的如何极端和怪异，都不能鉴别其良、恶性”。其原因在于目前国内外使用的传统染色技术(Giemsa、巴氏、H&E等)尚不能清晰显示细胞质的功能状态，而导致细胞质的功能状态可能被忽略了。

根据细胞生物学、病理生物学、遗传学的研究结果，以及细胞突变形成癌的理论。细胞遗传物质损伤、重组前首先被破坏的是细胞质。按照一般规律：DNA复制、RNA转录、细胞质中的细胞器(如粗面内质网)合成蛋白质。所以，细胞质的功能状态对于判断鳞状上皮细胞的癌前病变极为重要。

这是因为，细胞突变(遗传物质损伤与重组)→选择优势→形成克隆→肉眼可见的肿瘤过程中，在形成克隆前将出现以下几种情况：①如果突变细胞核周围的细胞质完全坏死，突变细胞不可能生长繁殖；②突变细胞核周围的细胞质因损伤坏死而形成的“核周亮晕”，是不被染色液着色的坏死区域，阻断了RNA的信息传递以及细胞质内蛋白质合成与运输途径。这种突变细胞也不能生长繁殖；③突变细胞核周围存在部分能合成蛋白质的细胞质。而这种部分能合成蛋白质的细胞质，是突变细胞生长繁殖的物质基础，在条件适宜时将在新遗传程序控制下进行修复，完成病理状态向一种新的生理状态转化，形成癌细胞克隆，进而可发展成肉眼可见的癌瘤组织。故巴氏(1943)提出的“癌前核异质”、中国医学科学院肿瘤研究所和肿瘤医院细胞学室(1976)描述的癌前核异质的细胞形态、美国1988年Bethesda系统ASCUS定义的“核周亮晕”细胞，是无核仁的，对提示细胞的癌前病变可能没有实际意义。

由于Giemsa、巴氏、H&E染色技术不能完全清晰地显示细胞核染色质细微结构、核仁数目与形态结构、细胞质的功能状态，可能使细胞病理学观察形成了历史性误区，导致了细胞病理学观察的结果与现代细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学的研究结论不完全吻合。正如国际著名病学家Karl Lennert教授的名言：“技术是病理学之母”，以及我国程天明院士指出的那样：“病理学的理论和技术被视为一辆车的两个轮子，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决定病理学的发展”。另一方面，对于癌前病变细胞的鉴别，细胞质的功能状态决定了突变细胞的能量供应。因此，染色液能否清晰显示细胞质的坏死程度的界限就显得非常重要。

造成Giemsa、巴氏及H&E染色技术在细胞病理学领域中，对细胞显示的结果与现代科学理论与研究结果不完全吻合的原因在于：①Giemsa染色技术显示的细胞色差弱，且极易染成模糊的色团，使细胞的细微结构不易分辨；②巴氏染色技术对组织病理学的贡献极其巨大，该技术也被国内外广泛地用于细胞病理学领域，学术界一直认为“细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆着色艳丽。其缺点是试剂种类多、染色手续繁杂、时间长、不宜染厚涂片等”。巴氏染色技术对组织结构的透明性能是无可挑剔的，但巴氏染色技术的这种透明性能对细胞病理学来说，则可能是弱点。细胞病理学观察的重点是细胞核、核仁的细微结构以及细胞浆的功能状态，而巴氏的透明性能是建立在对细胞的破坏基础上的。因为巴氏染色液配方对细胞蛋白质破坏的化合物较多，例如在赫氏(Harris)苏木素中的黄色氧化汞、橘黄G6与EA36中的磷钨酸、分色用的盐酸等都对细胞核、细胞浆蛋白质产生水解作用。这种水解作用是巴氏染色液对组织病理切片产生透明作用的基础，对组织病理结构的观察和鉴别是非常理想的。但在细胞病理学中，这种水解作用将对细胞核染色质细微、特别是细小的核仁将因其水解作用而消失。③H&E染色技术的原理与巴氏相同，只是用伊红染液替代橘黄G6与EA36，但染色过程中使用的乙醇-盐酸分化液也同样对细胞的蛋白质产生水解作用。由于巴氏、H&E染色技术对细胞的破坏作用，半个多世纪以来，细胞病理学观察到的核仁数目范围、核仁形态与现代科学研究结果不完全吻合；也正因为这种水解作用对细胞浆蛋白质的破坏，导致鳞状上皮癌前病变的鉴别至今尚未解决。

三.发明内容

体细胞快速染色技术是在前人基础上发明的。①它克服染色剂对细胞核染色质(富含DNA与组蛋白)、核仁(富含RNA)以及细胞质蛋白质的破坏作用；②新染色技术适合细胞蛋白质的两性电解质特点，解决两种染料的pH值梯度；③新技术改变了作用于细胞核、细胞质的两种染料中一种染料的吸收波长，使作用于同一细胞的两种染料之间的吸收峰距离加大，才能提高被染色细胞组分间的色差；因此，改技术的发明涉及原料制备、配方组成、对细胞产生的高色差染色效果；④新技术以甲醇作溶剂和细胞固定剂，提高了染色速度。

(一)原料制备  水溶性曙红Y与HCl的化学反应式、方法和步骤：1.称取含量不少于85％的水溶性曙红Y(Eosin Y)50克，溶于1000毫升蒸馏水。待完全溶解后加入浓盐酸(含量不少于36～38％)26毫升，用磁力搅拌器充分搅拌后，放置过夜析出沉淀。2～4层滤纸过滤，反复加蒸馏水(每次加水量1000毫升)，洗滤沉淀物5～10次。

2.水溶性署红Y成品中所含的2％杂质NaBr(溴化钠)在水溶液中解离成离子，则由上述蒸馏水反复冲洗而被去除。

3.将沉淀物连同滤纸一起放置于80-90℃烤箱中烘干，即为“体细胞快速染色试剂(A)”的原料，将其收集装瓶、备用(称“原料曙红”)。

(二)配方组成  体细胞快速染色试剂由“A”、“B”液组合：1.体细胞快速染色试剂(A)液配方：原料曙红                      2.50克亚甲蓝                        0.05克甲醇(分析纯)                  800.0毫升蒸馏水                        200.0毫升最终容量                      1000毫升2.体细胞快速染色试剂(B)液配方：亚甲蓝                         2.50克高锰酸钾                       2.50克氯化钠                         8.50克氯化钾                         0.20克氯化钙                         0.20克(亚甲蓝、高锰酸钾分别溶于500毫升蒸馏水后合并，加热氧化至500毫升容积，再依次加入氯化钠、氯化钾、氯化钙。最终容量100毫升，过滤后即可使用)。

3.吸收波长的测定  按GB/T 9721-88化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分)。吸收池厚度：1nm；原料水溶性曙红Y的参比溶液为蒸馏水。测定方法：①称市售的水溶性曙红Y0.25g定溶于100ml蒸馏水中，测定时用蒸馏水作1∶500稀释；②体细胞快速染色试剂(A)液用80％的甲醇作1∶500稀释，参比溶液为80％的甲醇，扫描范围200～1000nm。③体细胞快速染色试剂(B)液用蒸馏水作1∶500稀释，参比溶液为蒸馏水，扫描范围200～1000nm。④将Giemsa原液0.07ml定溶于100ml蒸馏水中，以蒸馏水作参比，吸收池厚度1cm，扫描范围200～1000nm。

原料水溶性曙红Y在可见光区有一个515.0nm吸收峰，符合HG/T 3495-1999的最大吸收波长510～518nm(图1)。

体细胞快速染色试剂(A)液在紫外光区出现2个吸收峰，分别为214.0nm和215.0nm；在可见光区有一个521.0nm吸收峰(图2)。

体细胞快速染色试剂(B)液在紫外光区出现1个吸收峰，波长为289.0nm；在可见光区有一个657.0nm吸收峰(图3)Giemsa染色液在可见光区有2个吸收峰，分别为539.0nm和649.0nm，两个吸收峰间距为110.0nm(图4)。

4.体细胞快速染色试剂吸收峰值范围  经国家药品生物制品检定所的检定：体细胞快速染色试剂(A)液在可见光区的吸收峰值范围为521.0±5nm；体细胞快速染色试剂(B)液在可见光区的吸收峰值范围为657±5nm。

(三)体细胞快速染色试剂与传统Giemsa染色液的区别1.染色时机生成色差的区别  体细胞快速染色试剂(A)与(B)液在可见光区2个吸收峰间距达到136.0nm(657.0-521.0)；Giemsa染色液在可见光区2个吸收峰间距为110.0nm(649.0-539.0)。染料分子结构与化学基团不同，吸收波长不同，对被染细胞产生的染色效果必然不同。客观上，作用于细胞浆与细胞核的两种不同染料，在可见光区吸收峰间的距离决定生成有色化合物的色差。

2.pH值范围与染色时间上的区别  Giemsa染色试剂是由作用于细胞核、细胞质的两种染料按一定比例混合配制的，染色时要求pH范围为6.4～6.8，一步完成染色(即染色时在规定的pH范围内只能有一种pH值)，染色时间范围10～40分钟。由于蛋白质在某一pH时游离成正、负离子的趋势相等(即成为兼性离子)，对作用于细胞核、细胞质的两种染料的吸附量相等；又由于Giemsa染色液中作用细胞核、细胞质的两种染料吸收峰距离小、导致Giemsa染色技术难以形成高色差。

体细胞快速染色技术分二步染色，体细胞快速染色试剂(A)液pH4～5、体细胞快速染色液试剂(B)液pH6～7，形成了适合细胞核、细胞质特别是核仁着色的pH梯度，其染色时间仅为1～2分钟。

3.染色效率与清晰度的区别  体细胞快速染色技术的染色时间仅相当于传统Giemsa染色技术的1/10～1/20。高色差、梯度pH特点使细胞核、核仁、细胞质的分色性能得以充分显示(请参阅李元堂等，《临床脱落细胞学图谱》，山东科学技术出版社.2001年第1版)。

(四)体细胞快速染色技术与巴氏、H&E染色技术在细胞显示上的区别根据同一肝细胞性肝癌细胞涂片样本的染色比较：①体细胞快速染色技术对细胞无破坏作用，尽管细胞经过体细胞快速染色液(A)中溶剂甲醇的短暂固定，但基本形态保持了自然状态。由于体细胞快速染色技术的高色差、梯度pH，使细胞核染色质细微结构(染色质点、块或条索状浓集)、核仁(包括很细小的核仁)数目以及核仁的多样性变化、细胞的分色性能充分显示了出来(图5)；②巴氏染色技术对同一肝细胞性肝癌细胞的显示表明，核染色质的细微结构、核仁的数目，特别是细小的核仁的色差以及细胞浆的分色性则较差，但其通明性能极佳(图6)；③H&E染色技术对同一肝细胞性肝癌细胞的显示则不如巴氏，但其染色步骤和时间则优于巴氏(图7)。

(五)体细胞快速染色技术对人类细胞的染色效果  体细胞快速染色试剂使用范围为血液及骨髓细胞涂片、肿瘤穿刺物细胞涂片、手术切除物的组织细胞涂片、宫颈/阴道分泌物涂片、浆膜积液、尿液沉渣等涂片的快速染色。无论人类何种部位的细胞涂片，均能清晰地显示细胞核、核膜、染色质和核仁的数目、结构、形态；胞浆的细微特征、组织碎片的结构、涂片背景内的基质和分泌物。尤其是细胞核、核仁数目和形态以及细胞浆的分色性能优于多种传统的染色剂，更便于观察者对某些诊断性特征的鉴别和分析，而获得最有利于病人的判断和解释。

1.体细胞快速染色技术对细胞核与核仁的显示  ①体细胞快速染色技术能清晰地显示出间期细胞核中染色质的网状、颗粒状结构，以及点状、块状和条索状的染色质浓集；②清晰显示能分裂细胞的核仁数目、形态以及核仁网眼中暴露出的紫红色染色质颗粒。③核内染色质与核仁的色差显著，染色质为紫红色，核仁则为蓝色或淡蓝色。

2.体细胞快速染色技术对细胞浆细微结构的显示  ①体细胞快速染色技术对细胞浆具有显著的分色性能，能清晰地显示出鳞状上皮细胞胞浆功能状态，即细胞浆功能完好部分呈蓝或淡蓝色，而细胞浆坏死部分不着色(白色)；②对腺细胞或具有分泌功能的细胞分泌物不着色(白色)，便于观察者根据细胞形态和胞浆内空泡的特点对细胞类型的确定；③能清晰显示出细胞浆内的各种颗粒(包括细胞吞噬的各种异物)。

3.体细胞快速染色技术对涂片背景物质的显示  能清晰显示涂片背景中的基质、细胞碎片、组织碎片、粘液丝、尿液沉渣中的结晶等。

4.体细胞快速染色技术对宫颈/阴道分泌物涂片的显示  ①能清晰显示出光学显微镜下宫颈/阴道分泌物涂片中各种成分，包括炎性病变细胞、癌前病变细胞、癌细胞；②能清晰显示出霉菌芽孢、假菌丝以及假菌丝内含有的不规则染色质；③清晰显示出淋球菌、纤毛菌、加特纳球杆菌；④清晰显示出阴道毛滴虫的形态特征：前后鞭毛为紫色或淡紫红色，与蓝色或淡蓝色胞浆形成显著色差；并清晰显示出滴虫胞浆内的紫红色颗粒与空泡(由滴虫吞噬的淀粉颗粒所致，体细胞快速染色对淀粉不着色)，这是目前国内外传统染色试剂尚未实现的染色效果。新疆维吾尔自治区中医院国家药品临床试验基地的试验报告证明“体细胞快速染色液对滴虫和加特纳球杆菌的检出率，显著和非常显著地优于Giemsa染色液”。

(六)体细胞快速染色技术的染色效果而产生的发现  由于体细胞快速染色技术在细胞显示上所产生的高色差，使细胞核、染色质形态结构；核仁的数目、形态结构；细胞浆细微结构的分色性能得到了充分显示。使细胞形态学观察的结果与现代细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学的相关理论与研究结果比较吻合，这就突破了国内外传统细胞病理学在核仁数目及形态、细胞质功能状态(被传统细胞病理学一直排斥在判断标准以外)的若干规定；并由体细胞快速染色试剂对鳞状上皮细胞的染色效果，可能否定巴氏(1943)提出的“核异质”中有关“癌前核异质”作为提示癌前病变的形态学标准(沿用至今)。由于这种否定，导致产生和确定了鳞状上皮“癌前病变细胞”形态的鉴别与判断。“癌前病变细胞”形态的确定，可能使宫颈/阴道脱落细胞形态鉴别分成炎性(包括细胞反应性改变)、癌前病变、恶性病变(癌)三大类。而这种分类一但成立，将有可能扭转美国(1988)提出的Bethesda系统ASCUS定义造成的混乱。因ASCUS类型的细胞改变可以反映高度的良性病变或潜在的严重病变，这些病变又不能明确分类，而称之为“未明确意义的不典型鳞状细胞”(ASCUS)。

1.体细胞快速染色技术对人类正常细胞核仁数目与形态的显示  用正常人工流产的子宫内膜细胞，一部分涂片用国际公认的Ag-NOR染色技术可以显示出含有10个核仁组织区(NOR)的细胞。由于人类近端着丝粒染色体在进化过程中随机联合的生物学特性，导致NOR的数目和形态在细胞群体中各占一定的比率(图8)。另一部分涂片则用体细胞快速染色试剂染色，可清晰地显示出5个形态、大小不一的蓝色或淡蓝色核仁。而细胞群体中处于静止期的细胞，则由于DNA不复制NOR不活动，因而核仁不被显示。故体细胞快速染色试剂对正常细胞核仁数目的显示范围为0～5个(图9)，与传统细胞病理学观察到的正常细胞有1～2个核仁的结论不同。但体细胞快速染色试剂对正常细胞核仁数目的显示结果与现代细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学研究结果非常吻合。

2.体细胞快速染色技术对人类恶性肿瘤细胞的核仁数目与形态的显示由于正常分裂细胞核仁数目被体细胞快速染色试剂显示的结果为0～5个，这就为鉴别人类恶性肿瘤细胞提出了一个新的参照标准。经过大量的观察，人类大多数恶性肿瘤细胞涂片中可以观察到5个以上的核仁数目(小细胞型恶性肿瘤、血液及骨髓发生的恶性肿瘤例外)，最多时可以显示出恶性肿瘤细胞几十个核仁(图10)。

国内外电镜研究的结果证明，核仁没有膜包围，是由转录产物的前体rRNA(precursor rRNA，pre RNA)相互缠绕的网状结构。体细胞快速染色技术对人类细胞，特别是肿瘤细胞核仁形态的显示结果表明：核仁的形态为多态性，与传统细胞病理学认为的“圆形或卵圆形”有所不同。而且在核仁内可以显示出核仁网眼中暴露出的紫红色染色质颗粒(图11)，这与电镜证明的网状结构特点相似。这是迄今为止，传统染色试剂均尚未实现的染色效果。

4.体细胞快速染色技术对细胞浆细微结构的显示  ①由于部分坏死细胞浆的电荷改变，与体细胞快速染色试剂不发生染色反应而形成白色区域：有功能的部分细胞浆则与体细胞快速染色试剂产生染色反应，形成蓝或淡蓝色区域。这种较强烈的色差，为鉴别细胞浆的功能状态提供了可靠依据。②由于细胞核内染色质被体细胞快速染色试剂染成紫红色，凡是进入细胞浆的染色质碎片或颗粒(包括细胞吞噬的物质)，在细胞浆蓝、白背景的衬托下均显示的格外清晰。

5.体细胞快速染色技术对鳞状上皮“癌前病变细胞”的显示  根据现代细胞遗传学“突变细胞形成癌”的理论和研究结果，癌的形成是单克隆的，即细胞突变(遗传物质损伤与重组)→选择优势→克隆形成→形成肉眼可见的恶性肿瘤。无疑，细胞突变(遗传物质损伤与重组)→选择优势这个阶段应属于“癌前病变”范畴。

(1)“癌前核异质”提示癌前病变可能无意义  有关巴氏(1943)提出“核异质”中的鳞状上皮细胞“癌前核异质”，在我国较早的形态描述，见于中国医学科学院肿瘤研究所与肿瘤医院细胞学室(1976)《临床肿瘤细胞学图谱》，该著作对宫颈鳞状细胞“癌前核异质”形态进行了这样的描述：“核大，核染质不匀，核周有空泡”(图12)。直到1988年，美国提出的Bethesda系统仍没有解决“癌前病变细胞”的形态鉴别，而将鳞状上皮细胞出现的“核周亮晕”归入ASCUS(未明确意义的不典型鳞状细胞)。这个ASCUS定义包括了高度良性病变和潜在的严重病变，正如美国细胞病理学家Kini指出的那样“此种分类已经造成并继续造成在病理学技术学家、病理学家和临床医师的很大混乱”。由于体细胞快速染色试剂对细胞浆部分坏死区域不着色，部分完好细胞浆因蛋白质等电点未改变而被染成蓝或淡蓝色(图13)。

根据细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学理研究结果：细胞核中DNA复制必需RNA转录，RNA将遗传信息传递给细胞浆中的粗面内质网并指导蛋白质的合成；细胞核所需的蛋白质，如组蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、基因调节蛋白等，都是在细胞浆中合成的。细胞浆中合成的蛋白质通过核蛋白输入信号而输入细胞核。

过去30年的研究已证明损伤因子对细胞器和中间代谢途径造成的影响。损伤因子可引起细胞器代偿失调，细胞内外环境的恒定就会受到损害。离子泵运送机制障碍导致细胞肿胀，出现内质网池扩张(浑浊肿胀)、破裂和融合成大泡，这就是光学显微镜下见到的水样变性。损伤因子可引起聚核蛋白体完全脱粒(degranulation)和解聚(disaggregation)及蛋白质合成停止。当蛋白质合成停止时，就不能形成脂蛋白的主要成分，结果出现脂肪空泡和包涵体。损伤严重时，将出现滑面内质网、粗面内质网和高尔基器的广泛破坏。破坏的内质网最初表现为细胞浆的灶状变性区。而线粒体则因低氧、缺氧和营养障碍，导致基质蛋白质凝聚和收缩、嵴肿胀和展开以及膜破裂。线粒体损伤将减少细胞ATP的供应，对蛋白质的合成和细胞分裂具有深远影响。损伤早期还严重影响线粒体内膜和细胞膜的离子运送。

对鳞状细胞来说，核周空泡是由随机的细胞浆区域性坏死所致。由于坏死区域蛋白质表面电荷性质发生了改变，体细胞快速染色技术显示出了显著色差。胞浆蛋白质变性的程度，决定部分坏死细胞质的颜色变化。

无论从核仁制造核糖体，还是从粗面内质网合成蛋白质，或是从胞浆内蛋白质运输途径考虑。有核周空泡的细胞不可能生存下去，因为遗传信息传递和蛋白质向核内运输的途径被坏死区域所阻断；核周围细胞浆凝固性坏死或液化，都将导致细胞核的固缩而最终死亡。所以，鳞状上皮“癌前核异质”细胞以及Bethesda系统中ASCUS细胞出现的“核周亮晕”可能是细胞炎性病变的一种形态类型，对提示鳞状上皮细胞癌前病变可能无实际意义。

(2)体细胞快速染色技术对鳞状上皮“癌前病变细胞”形态的显示  由外源或/和内源性损伤因子，引起遗传物质损伤和重组的突变细胞具有新遗传特征，但必须在细胞核周围，存在部分完好的细胞浆以及浆内部分完好的细胞器，才能保证遗传信息传递、细胞浆内蛋白质合成及运输。可以说，这是突变细胞修复损伤，从病理向一种新的生理状态转化，形成选择优势→克隆→肉眼可见肿瘤的物质基础。

由于体细胞快速染色试剂的高色差、合适的pH值剃度对细胞核、核仁以及细胞浆细微结构的清晰显示，癌前病变的鳞状上皮细胞被清晰显示：“核染色质不均；核周有部分蓝或淡蓝色细胞浆，浆内可出现紫红色颗粒或部分红蓝交替的色调；有1～2个蓝或淡蓝色的核仁，有时可见很大的核仁；胞体因发展阶段不同而呈现多形性变化”(图14-18)。

客观上，细胞(包括正常细胞或突变细胞)对核糖体需求量非常大，rRNA基因数目必须重复和高速转录才能与之匹配。所以，癌前病变细胞的核仁被“体细胞快速染色试剂”显示出来是符合科学逻辑的。核仁的存在，表明了DNA复制、RNA转录、核糖体生产、胞浆中蛋白质合成和运输在进行。这可能是癌前病变细胞形态学鉴别的科学依据。

自巴氏(1943)、中国医学科学院肿瘤研究所及肿瘤医院细胞学室(1976)、美国(1988)提出的Bethesda系统ASCUS定义中有关“癌前核异质”、“核周亮晕”的鳞状上皮形态描述的全部文献记载中，尚未发现此类细胞有核仁存在的描述。既然此类鳞状上皮细胞无核仁，就不能证明DNA复制、RNA转录、核糖体生产、胞浆中蛋白质合成和运输在进行。因此，“癌前核异质”、“核周亮晕”的鳞状上皮作为提示癌前病变可能缺乏科学依据的支持。

由于肿瘤来源于单一细胞克隆之前的突变概率以及时间的依赖过程所决定，在宫颈/阴道分泌物涂片的细胞群体中，癌前病变细胞的数量很少，这需要观察者仔细认真。在一定意义上说，每次的发现和确定都可能使宫颈原位癌的形成减少一次，这是一件非常有意义而有益于全人类的工作。

四.附图说明

图1是原料水溶性曙红Y的吸收波长；图2是体细胞快速染色试剂(A)液的吸收波长；图3是体细胞快速染色试剂(B)液的吸收波长；图4是Giemsa染色剂的吸收波长；图5-7是同一肝细胞性肝癌样本体细胞快速染色技术与巴氏、H&E染色效果的比较；图8是Ag-NOR技术显示的正常人工流产子宫内膜细胞核仁组织区：图9是体细胞快速染色试剂显示的正常人工流产子宫内膜细胞核仁(与图5为同一样本)；图10是体细胞快速染色技术显示巨大癌细胞核仁数目；图11是体细胞快速染色技术显示巨大癌细胞核仁形态与核仁中颗粒；图12中国医学科学院肿瘤研究所与肿瘤医院细胞学室(1976)描述的鳞状上皮“癌前核异质”形态(原图复制)；图13是体细胞快速染色技术显示鳞状上皮核周围胞浆坏死区域；图14-18是体细胞快速染色技术显示鳞状上皮癌前病变细胞形态；图19是体细胞快速染色技术显示的阴道分泌物中霉菌(分泌物涂片)；图20是体细胞快速染色技术显示的阴道分泌物中滴虫(分泌物涂片)；图21是体细胞快速染色技术显示的卵巢转移癌细胞(手术切除物涂片)。

五.具体实施方式

体细胞快速染色技术对人体各系统的细胞涂片，空气干燥后即可滴加体细胞快速染色试剂(A)液4～5滴，染30～60秒钟，自来水冲洗后再加体细胞快速染色试剂(B)液4～5滴，染30～60秒钟，自来水冲洗后即可镜检。若长期保存标本，用乙醚脱去镜油，光学树脂胶封片即可。体细胞快速染色技术配方大吸收峰距离(图2-3)形成的高色差、pH值梯度，使细胞核染色质细微结构、核仁数目范围(图8、9)、核仁形态多样性以及核仁内紫红色颗粒(图10、11)、细胞质功能状态(图14-18)得到清晰显示，从而使鳞状上皮“癌前病变细胞”形态的鉴别成为可能。

经体细胞快速染色试剂染色的霉菌芽胞呈蓝或淡蓝色、假菌丝内染色质呈不规则块状(图19)；与原核细胞无核膜的特点吻合。对阴道滴虫(图47)的显示结果比较独特，清晰显示出前后鞭毛与胞浆内的紫红色颗粒；与滴虫自身生物学特性吻合(滴虫靠鞭毛前进、靠波动膜旋转)。