一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用
阅读：1037发布：2020-09-30
专利汇可以提供一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示， 氨 基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明在已建立完善的杂交鹅掌楸 体细胞 胚胎发生体系﹑且已获得部分转录组数据的 基础 上，同源克隆获得杂交鹅掌楸LhMKK2基因全长，命名为LhMKK2，通过基因表达分析，证明了杂交鹅掌楸LhMKK2基因在 植物 中的广泛表达，参与植株的生长发育，以及逆境胁迫响应过程，通过对其功能分析发现，过表达LhMKK2基因增强植株对 盐胁迫 响应的抗性，影响植株的生长发育，可为开展杂交鹅掌楸抗逆性分子育种提供理论依据，并进一步在植物抗逆境胁迫中有较广泛的应用。，下面是一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用专利的具体信息内容。
一种杂交鹅掌楸LhMKK2 基因及其表达蛋白和应用
技术领域
背景技术
[0002] 杂交鹅掌楸是南京林业大学著名林木遗传育种学家叶培忠教授等人利用中国马褂木（L.chinese（HEMSL.）Sarg）与北美鹅掌楸（L.tulipifera Linn.）杂交试验获得的种间杂交种，具有明显的杂种优势。杂交鹅掌楸因其生长速度快，抗病虫害强，材质纹理细腻，叶形奇特，生长速度快，是集荒山造林、工业用材、园林观赏的优良树种，也被用于庭院绿化，造林和用材树种，市场潜力大。目前杂交鹅掌楸主要通过扦插、嫁接等传统无性繁殖方法及人工杂交的有性繁殖方式进行繁殖，但因为受到季节和杂交制种效率的影响，限制了优良杂种植株的繁殖，传统的育苗繁殖方式，速度缓慢，优良种苗数量远远供不应求，影响杂交鹅掌楸的应用及推广。陈金慧等以杂交鹅掌楸未成熟胚为培养材料，在固体培养基上成功诱导体细胞胚，建立了体细胞胚胎发生技术，并成功进入后期工厂化生产，从根本上提高了传统育种方法的缓慢育苗速度和方式。通过后期研究的不断优化，完善了杂交鹅掌楸胚性细胞的悬浮培养体系，为开展高等木本植物的生长、发育、调控途径和抗逆性等基础实验研究，提供了大量技术基础和试验材料基础。
[0003] 促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）级联路径在真核生物中高度保守，是介导植物细胞外信号传递至细胞内引起细胞响应的重要信号转导路径，在细胞分化和发育过程中，激素，多种生物和非生物胁迫中发挥重要作用。MAPK通路通常由三种三级级联激酶参与信号转导，包括促分裂原活化蛋白激酶的激酶之激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases，MAPKKK，简称MEKK）；促分裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinases，MAPKK，简称MEK或MKK）以及促分裂原活化蛋白激酶MAPK，依次通过逐级磷酸化激活下游信号，将细胞外部多种类型刺激信号传递至细胞核内，进而引起细胞响应，参与介导细胞的生长、发育、分裂、分化、凋亡等多种过程，甚至生长素、脱落酸、乙烯和细胞分裂素的代谢，协同参与植物逆境胁迫响应。因此，二级级联激酶MAPKK家族参与植物的生长发育，激素信号转导，以及植物抗逆性胁迫响应过程。
[0004] 目前，通过对拟南芥基因组序列分析，已鉴定出80个MAPKKK 基因，10个MAPKK 基因，20个MAPK 基因，这些基因也广泛存在于其它植物基因组中。比如，杨树中已鉴定出21个MAPK基因和11个MAPKK基因，水稻中有15个MAPK基因和8个MAPKK基因，75个MAPKKK基因。另外，目前已在许多物种中分离到MAPKK家族基因，如小麦，油菜，水稻，欧芹，烟草等。
发明内容
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸MKK2 基因。本发明的另一目的是提供一种上述杂交鹅掌楸LhMKK2 基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供杂交鹅掌楸LhMKK2 基因在杂种鹅掌楸抗逆性分子育种中的应用。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种杂交鹅掌楸LhMKK2 基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007] 所述的杂交鹅掌楸LhMKK2 基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 所述的杂交鹅掌楸LhMKK2 基因在杂交鹅掌楸抗逆性分子育种中的应用。
[0009] 所述的含有杂交鹅掌楸LhMKK2 基因的载体或宿主细胞。
[0010] MAPKK家族基因在MAPK级联路径中起“承上启下”的作用，是上下游信号转导通路的交叉点，拟南芥中，MKK2 基因参与茉莉酸、水杨酸等激素信号转导过程，以及MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6；MKK2-MPK4级联路径，是对低温、盐胁迫应答信号转导的组成部分，也参与植物的生长发育过程。本发明是在已建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，同源克隆促分裂原活化蛋白激酶之激酶LhMKK2 基因全长。
[0011] 有益效应：与现有技术相比，本发明是在已建立的完善的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系的基础上，通过对杂交鹅掌楸MAPKK家族基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，基因的遗传转化等手段，分析验证其功能，证明了杂交鹅掌楸LhMKK2 基因参与植物体细胞胚胎发生过程，过表达LhMKK2基因能够提高植株对盐胁迫响应的抗性，影响植株的生长发育，因此可用于提高植株的抗逆性胁迫响应，为杂交鹅掌楸的抗逆性分子育种提供依据，有很好的工业应用前景。附图说明
[0012] 图1是杂交鹅掌楸叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；图2是LhMKK2 基因全长PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图3是目的片段双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：DL2000 Marker；a，b：
TM
LhMKK2 与pMD 19-T Vector连接载体用Xba I，Sac I双酶切反应；
图4是空表达载体pBI121双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；图中，a：空载体PBI121质粒用Xba I，Sac I双酶切反应；M1：DL2000 Marker；M2：从上到下条带大小分别为：
23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp，564bp；
图5是构建好的LhMKK2 过表达载体图；
图6是LhMKK2 基因在不同部位的实时定量结果图；图中，1：雄蕊；2：根；3：茎；4：叶；
5：芽；6：花；7：花瓣；8：雌蕊；
图7是LhMKK2 基因在不同时期的实时定量结果图；图中，1：胚性愈伤组织；2：液体悬浮培养7d；3：过渡培养期；4：球形胚；5：鱼雷胚；6：早期子叶胚；7：成熟子叶胚；
图8是T1、T2代阳性植株PCR检测结果图；图中，p：LhMKK2+PBI121的重组质粒，阳性对照；M：DL2000 Marker；1-12转基因植株的PCR产物；a，b：野生型拟南芥扩增的PCR产物，阴性对照；c：水，空白对照；
图9是T1代LhMKK2 转基因株系与野生型Ler的生长情况图；图中，A：LhMKK2 转基因株系；B：野生型Ler；C：LhMKK2 转基因株系的侧枝；D：野生型Ler的侧枝；
图10是T1代LhMKK2 转基因株系与野生型Col的生长情况图；图中，A，B，C：LhMKK2 转基因株系；D：野生型Col；E，F：LhMKK2转基因株系的叶片；
图11是过表达LhMKK2 转基因拟南芥T2代植株生长统计图；
图12是盐胁迫下T2代转基因植株和野生型Col的生长情况图；图中，A：野生型拟南芥对照；B：200mmol/L NaCl下野生型拟南芥；C：转基因植株对照；D：200mmol/L NaCl下转基因植株；
图13是盐胁迫下第七天野生型和转基因植株生长情况图；图中，A：200mmol/LNaCl下野生型拟南芥；B：200mmol/LNaCl下转基因植株。
图3是目的片段双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：DL2000 Marker；a，b：
TM
LhMKK2 与pMD 19-T Vector连接载体用Xba I，Sac I双酶切反应；
图4是空表达载体pBI121双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；图中，a：空载体PBI121质粒用Xba I，Sac I双酶切反应；M1：DL2000 Marker；M2：从上到下条带大小分别为：
23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp，564bp；
图5是构建好的LhMKK2 过表达载体图；
图6是LhMKK2 基因在不同部位的实时定量结果图；图中，1：雄蕊；2：根；3：茎；4：叶；
5：芽；6：花；7：花瓣；8：雌蕊；
图7是LhMKK2 基因在不同时期的实时定量结果图；图中，1：胚性愈伤组织；2：液体悬浮培养7d；3：过渡培养期；4：球形胚；5：鱼雷胚；6：早期子叶胚；7：成熟子叶胚；
图8是T1、T2代阳性植株PCR检测结果图；图中，p：LhMKK2+PBI121的重组质粒，阳性对照；M：DL2000 Marker；1-12转基因植株的PCR产物；a，b：野生型拟南芥扩增的PCR产物，阴性对照；c：水，空白对照；
图9是T1代LhMKK2 转基因株系与野生型Ler的生长情况图；图中，A：LhMKK2 转基因株系；B：野生型Ler；C：LhMKK2 转基因株系的侧枝；D：野生型Ler的侧枝；
图10是T1代LhMKK2 转基因株系与野生型Col的生长情况图；图中，A，B，C：LhMKK2 转基因株系；D：野生型Col；E，F：LhMKK2转基因株系的叶片；
图11是过表达LhMKK2 转基因拟南芥T2代植株生长统计图；
图12是盐胁迫下T2代转基因植株和野生型Col的生长情况图；图中，A：野生型拟南芥对照；B：200mmol/L NaCl下野生型拟南芥；C：转基因植株对照；D：200mmol/L NaCl下转基因植株；
图13是盐胁迫下第七天野生型和转基因植株生长情况图；图中，A：200mmol/LNaCl下野生型拟南芥；B：200mmol/LNaCl下转基因植株。
具体实施方式
[0013] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0014] 实施例1以杂交鹅掌楸植株为材料，提取总RNA，并反转录成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂TM
糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，与pMD 19-T Vector（Takara D102A）载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，添加适当酶切位点后与表达载体PBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下进行连接后，转入农杆菌菌株GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，观察T1，T2代表型，进行统计分析，并进行抗逆性胁迫处理，分析其功能。
糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，与pMD 19-T Vector（Takara D102A）载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，添加适当酶切位点后与表达载体PBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下进行连接后，转入农杆菌菌株GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，观察T1，T2代表型，进行统计分析，并进行抗逆性胁迫处理，分析其功能。
[0015] （1）总RNA的提取以杂交鹅掌楸的幼叶为材料，按照NORGEN试剂盒（Norgen Bioteke）的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均经过0.1%DEPC水处理使其无RNA酶。杂交鹅掌楸幼叶总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带完整清晰；用紫外分光光度法测定总RNA的吸光值，OD260/OD280值为2.05，OD260/OD230为2.01，RNA完整性较好，纯度高，可用于反转录。
[0016] RNA提取的具体过程如下：1、取适量杂交鹅掌楸叶片，置于研钵中，加入600μL Lysis Solution，将样品研磨充分。2、将裂解液转移至离心管中。3、颠倒混匀，放置2min，使其充分裂解，12000rpm离心2min，吸取上清移至新离心管中。4、加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。5、将混合液移至离心柱中（下接2mL收集管），12000rpm离心1min，弃滤液，放回收集管。6、加入400μL Wash Solution，12000rpm离心1min，弃滤液，放回收集管。7、加入适量DNAase消化样品中所含的DNA，14000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25℃-30℃静置15min。8、加入400μL Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。9、第三次加入400μL Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。10、将离心柱放回收集管，14000rpm离心2min，弃收集管。11、将离心柱置于心得1.5mL离心管中，加入50μL Elution Solution洗脱RNA。12、200~2,000rpm离心2min，14000rpm离心1min，体积不足50μL，再用14000rpm离心1min（可反复洗脱）。
[0017] （2）cDNA的获得以所提RNA为模板，反转录获得cDNA，所使用的是Invitrogen公司的SuperScript® III First-Strand Synthesis Kit。实验中的RNA使用量为1μg，具体步骤如下：
1、配置反应液（10μL）：1μL RNA（≤5μg），1μL Primer（Oligo dT），1μL 10mM dNTP mix， DEPC-Treated Water up to 10μL。短暂低速离心，65℃，5min后，立即置于冰上1~2min。
1、配置反应液（10μL）：1μL RNA（≤5μg），1μL Primer（Oligo dT），1μL 10mM dNTP mix， DEPC-Treated Water up to 10μL。短暂低速离心，65℃，5min后，立即置于冰上1~2min。
[0018] 2、向上一步的PCR管中按以下顺序加入相应试剂：2μL 10×RT Buffer，4μL25mM MgCl2，2μL 0.1M DTT，1μL RNase OUT （40U/μL），1μL SuperScript III RT。轻柔混匀后，置于PCR仪上，反应程序为50℃50min，85℃5min。
[0019] 3、低速离心后，每管中加入1μL的RNase H，37℃消化20min后，收集得cDNA，-20℃保存备用。
[0020] （3）同源克隆获得目的基因利用Oligo7.0设计引物，进行PCR，从而获得目的基因，进行转化测序，最后进行比对分析。设计的引物序列如下：
LhMKK2-F：5’-ATTTCGGACTTACAGTGCCACAAC-3’；
LhMKK2-R：5’-ACACTGCTCTTCCTCCATGTAACC-3’。
LhMKK2-F：5’-ATTTCGGACTTACAGTGCCACAAC-3’；
LhMKK2-R：5’-ACACTGCTCTTCCTCCATGTAACC-3’。
[0021] （1）PCR扩增体系：依据说明书按下列组分配制PCR反应液，50μL反应体系：5μL 10×PCR Buffer，5μL
2mMdNTPs，3μL 25mMMgSO4，1.5μL Forward Primer，1.5μL Reverse Primer，1μL cDNA，
1μL KOD-Plus polymerase，32μL ddH2O。
2mMdNTPs，3μL 25mMMgSO4，1.5μL Forward Primer，1.5μL Reverse Primer，1μL cDNA，
1μL KOD-Plus polymerase，32μL ddH2O。
[0022] （2）PCR反 应 条 件：94 ℃，2min；98 ℃，10sec，55-60 ℃，30sec，68 ℃，1min，36 cycles；4℃，Forever。
[0023] 杂交鹅掌楸LhMKK2基因全长PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，获得预期目的片段，使用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒，对目的片段进行回收纯化，步骤如下：1）在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μL体积）。2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。3）加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；
当分离的DNA 片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。4）吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，12000×g离心1min。弃滤液。5）将制备管置回离心管，加0.5 mL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。6）将制备管置回离心管，加0.7 mL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。7）将制备管置于2mL离心管中，12000×g离心1 min。8）将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μL水或Eluent buffer，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。
当分离的DNA 片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。4）吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，12000×g离心1min。弃滤液。5）将制备管置回离心管，加0.5 mL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。6）将制备管置回离心管，加0.7 mL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。7）将制备管置于2mL离心管中，12000×g离心1 min。8）将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μL水或Eluent buffer，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。
[0024] 目的片段加尾。KOD-PLUS高保真酶为平末端酶，所得PCR产物为平末端，需要先添加poly A尾才能进行TA克隆，步骤如下：20μL体系：10μL DNA，2μL 10×PCR Buffer，0.4μL 10mMdNTPs，1.6μL 25mMMgCl2，0.2μL rTaq polymerase，5.8μL ddH2O。反应程序：72℃，30min；4℃，Forever。
[0025] 将目的基因片段与克隆载体pMDTM19-T Vector（Takara D102A），进行连接反应。连接体系如下，在已灭菌烘干的PCR管中，依次加入下列溶液：4μL PCR纯化产物（10ng），TM
5μL Solution I，1μL pMD 19-T Vector。用移液器轻轻吸打混匀，低速离心，16℃连接过夜。
5μL Solution I，1μL pMD 19-T Vector。用移液器轻轻吸打混匀，低速离心，16℃连接过夜。
[0026] 将连接产物转入大肠杆菌JM109菌株中。具体步骤如下：实验前准备LB固体培养基（添加Amp+IPTG+X-gal）（每个培养基平板涂布50mg/mL IPTG和20mg/mL X-gal各40uL，室温静置备用）；（1）从-80℃超低温冰箱取出感受态细胞，置于冰上融化，100uL的感受态细胞添加5uL的连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；（2）42℃热激90sec，立即置于冰上静置2min；（3）加入800uLLB液体培养基（不添加Amp抗生素），37℃，180rpm震荡培养1-2h；4）
4000rpm离心3min，洗掉800uL上清，将剩余菌液吸打重悬；（5）取适量重悬液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。
4000rpm离心3min，洗掉800uL上清，将剩余菌液吸打重悬；（5）取适量重悬液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。
[0027] 检测重组质粒，将得到的阳性克隆进行测序分析。结果分析，LhMKK2基因编码区长度为1190bp，包含完整的开放阅读框（ORF），序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，包括369个氨基酸。将测序所获得的序列在NCBI中BLAST工具分析，经比对发现，序列与拟南芥、毛白杨、番茄等的MAPKK家族基因同源性达到90%以上。
[0028] 实施例2（1）基因功能分析
首先构建杂交鹅掌楸35S：LhMKK2 过表达载体，并将其转入农杆菌菌株，通过花序浸泡法转化两种野生型拟南芥哥伦比亚Col（Columbia）和兰茨伯格Ler（Landsberg），获得过表达LhMKK2基因的阳性转基因植株，并对T2代阳性植株进行胁迫处理，研究分析杂交鹅掌楸LhMKK2 的功能。
首先构建杂交鹅掌楸35S：LhMKK2 过表达载体，并将其转入农杆菌菌株，通过花序浸泡法转化两种野生型拟南芥哥伦比亚Col（Columbia）和兰茨伯格Ler（Landsberg），获得过表达LhMKK2基因的阳性转基因植株，并对T2代阳性植株进行胁迫处理，研究分析杂交鹅掌楸LhMKK2 的功能。
[0029] （2）载体的构建本发明所用大肠杆菌菌株为E. coli JM109（宝生物工程（大连）有限公司购入）；表达载体为pBI121（Biovector Co.,LTD公司购入）。
[0030] 具体过程如下：1.通过PCR在LhMKK2基因片段上下游分别添加Xba I和Sac I双酶切位点，PCR体系
及反应条件同全长扩增，所用引物如下：
LhMKK2+Xba I-F：5’-TCTAGAATTTCGGACTTACAGTGCCACAAC-3’；
LhMKK2+ Sac I-R：5’-GAGCTCACACTGCTCTTCCTCCATGTAACC-3’。
及反应条件同全长扩增，所用引物如下：
LhMKK2+Xba I-F：5’-TCTAGAATTTCGGACTTACAGTGCCACAAC-3’；
LhMKK2+ Sac I-R：5’-GAGCTCACACTGCTCTTCCTCCATGTAACC-3’。
[0031] 2.重组质粒经测序正确后与载体同时进行双酶切反应。使用Xba I和Sac I限制性内切酶进行双酶切反应，得到含有黏性末端的并覆盖整个ORF的LhMKK2基因片段。用同样的酶切反应处理空的pBI121表达载体。
[0032] 双酶切反应体系（20μL）：1ug回收产物，2μL 10×M buffer，1μL Xba I，1μL Sac I，ddH2O up to 20μL。
[0033] 轻轻吸打混匀，37℃水浴，双酶切反应4h，加入10×终止缓冲液终止酶切反应。
[0034] 将双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，双酶切结果如图3，图4所示，根据条带大小判断出LhMKK2 基因和pBI121表达载体已经被正确切开。
[0035] 将目的基因片段，空表达载体PBI121的双酶切产物，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN）凝胶回收试剂盒进行回收纯化，溶于20μL的TE缓冲液中。
[0036] 3.检测所回收的酶切产物浓度和纯度，按连接体系加入各试剂（目的片段分子数：载体分子数=3~5:1），16℃水浴连接过夜。20uL连接反应体系如下：2μL T4 DNA ligase buffer（10×），1μL pBI121，4μL目的片段，1μL T4 DNA ligase，12μL ddH2O。
[0037] 4.连接产物转化大肠杆菌JM109超级感受态细胞，挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600值为0.55-0.6；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，之后用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AXYGEN）提取质粒进行双酶切验证。同时将阳性克隆进行测序，检测载体构建过程中是否发生碱基突变或者缺失现象。构建过表达载体如图5所示，包含启动子，目的基因，终止子的长度及位置。
[0038] （2）实时荧光定量PCR选用材料分别为杂交鹅掌楸不同部位材料，及杂交鹅掌楸1×5002 基因型体胚发育不同时期材料，包含完整的体细胞胚胎发育各时期材料，对LhMKK2基因进行RT-PCR，分析其在不同组织部为和不同发育时期的表达差异情况。具体过程如下：
实时定量PCR采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，在ABI 7500 Real time PCR Systems（Applied Biosystems）上完成，每个样品反应重复三次，数据采用
7500 System SDS software（Applied Biosystems）提取分析。
实时定量PCR采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，在ABI 7500 Real time PCR Systems（Applied Biosystems）上完成，每个样品反应重复三次，数据采用
7500 System SDS software（Applied Biosystems）提取分析。
[0039] 1）RT-PCR引物的设计根据RT-PCR的要求，设计了LhMKK2 基因的引物，经过溶解曲线的分析，最终选择杂交鹅掌楸中的18S rRNA作为内参，引物如下：
18SrRNA-F：5’-ATTTCTGCCCTATCAACTTTCG-3’；
18SrRNA-R：5’-TTGTTATTTATTGTCACTACCTCCC-3’；
LhMKK2-F（qPCR）：5’-GCTTTCCTTATTCACCGCCTG-3’；
LhMKK2-R（qPCR）：5’-TGTGCTGCCTTTCTATCCTTCG-3’。
18SrRNA-F：5’-ATTTCTGCCCTATCAACTTTCG-3’；
18SrRNA-R：5’-TTGTTATTTATTGTCACTACCTCCC-3’；
LhMKK2-F（qPCR）：5’-GCTTTCCTTATTCACCGCCTG-3’；
LhMKK2-R（qPCR）：5’-TGTGCTGCCTTTCTATCCTTCG-3’。
[0040] 2）RT-PCR反应体系（20μL）：10μL 2 × Power SYBR Green PCR Master Mix，1μL Forward Primer，1μL Reverse Primer，1μL cDNA，7μL ddH2O。
[0041] 3）qRT-PCR反应条件：95℃，10min；95℃，15sec，60℃，1min，40 Cycles。
[0042] 4）试验材料杂交鹅掌楸不同部位材料。分别为杂交鹅掌楸实生苗的雄蕊，根，茎，叶，芽，花苞，花瓣，雌蕊。杂交鹅掌楸不同发育时期材料。以杂交鹅掌楸1×5002 基因型为原始材料，诱导获得的体细胞胚胎发育不同时期的同步化材料。包括：胚性愈伤组织，液体悬浮细胞，液体悬浮系调整期细胞，球形胚，鱼雷胚，早期子叶胚，成熟子叶胚七个时期。
[0043] 5）试验结果根据实时定量PCR的结果发现，LhMKK2 基因在杂交鹅掌楸不同部位根，茎，叶，芽，花，花瓣，雄蕊，雌蕊中均有表达，无组织特异性（如图6所示）；LhMKK2 基因在杂交鹅掌楸体细胞胚胎发育不同时期的表达量有较大差异，在胚性愈伤组织中的表达量最高，在球形胚和鱼雷胚时期均不表达，在成熟子叶胚中的表达量均较低（如图7所示）。
[0044] （3）农杆菌的转化1．本发明使用的农杆菌菌株为GV3101（Biovector Co.,LTD公司购入），采用液氮冻融法将构建好的LhMKK2 过表达载体转入农杆菌。具体过程如下：1）冰浴融化农杆菌感受态细胞，每管加入1-5uL（100ng）回收纯化的重组质粒，轻轻吸打混匀，置于冰上，静置冰浴
30min。2）液氮速冻1min，37℃热击1-5min，迅速置于冰上1-2min。3）加入800ul无抗生素的LB液体培养基，28℃，100rpm，慢速振荡培养2-4h。4）4000rpm离心3min，吸去部分上清。5）留取适量菌液，轻轻混匀，涂布于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB固体培养基上。6）28℃倒置培养30-48h，至长出单菌落。7）菌液PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。
30min。2）液氮速冻1min，37℃热击1-5min，迅速置于冰上1-2min。3）加入800ul无抗生素的LB液体培养基，28℃，100rpm，慢速振荡培养2-4h。4）4000rpm离心3min，吸去部分上清。5）留取适量菌液，轻轻混匀，涂布于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB固体培养基上。6）28℃倒置培养30-48h，至长出单菌落。7）菌液PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。
[0045] 2．待种植的拟南芥生长至开花，维持其健康状态。将PCR检测过的阳性克隆，摇菌至OD600为0.6-0.8时，采用花序浸泡法将目的基因转入野生型拟南芥中。具体过程如下：1）将菌液5000 rpm，5 min离心，收集菌体，用含有5%蔗糖的1/2MS溶液悬浮；2）在浸泡前，加入浓度为0.05%的SilwetL-77，晃出泡沫；3）将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15~30 sec，期间轻轻晃动；4）将浸泡过的拟南芥平放至托盘上，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；5）取下保鲜膜，正常条件下培养至种子成熟，成熟后停止浇水。
[0046] （5）转基因植株表型观察1.收获干燥的种子，将T1代种子用添加50mg/L卡纳霉素的1/2MS培养基进行筛选，发现阳性植株仍然正常生长，其它无卡纳霉素抗性的植株已经死亡。
[0047] 2.将筛选出的可能的转基因阳性植株移栽至营养土中，正常培养。选取转基因阳性植株，取适量幼嫩叶片，提取DNA作为模板进行PCR检测，确定其为阳性植株。T2代阳性植株检测方法与之相同。检测结果如图8所示，显示阴性对照无条带，转基因植株PCR目的条带与阳性对照一致，确定为阳性植株。
[0048] 3.过表达LhMKK2基因的T1代转基因植株的表型观察。发现转野生型Ler背景下的转基因植株，与野生型Ler对照比较，出现植株生长缓慢，荚果短小，败育的表型特征。转野生型Col背景下的转基因植株，与野生型Col对照比较，出现植株生长缓慢，叶片卷曲的表型特征。结果如图9，10所示。
[0049] 4.过表达LhMKK2 基因的T2代转基因植株的统计分析。分别统计主枝数目，侧枝数目，叶片数目等，计算平均值，转基因植株前期因抗生素影响比野生型拟南芥生长慢，等移栽至营养土里生长一周后，开始快速长大，观察发现转基因株系的主枝，莲座叶分枝数和茎生叶分枝数均多于野生型，叶片数目也多于野生型拟南芥。如表1，图11所示。
[0050] 表1. 转基因植株生长两周的统计结果5. 过表达LhMKK2基因的T2代转基因植株的盐胁迫处理。分别选取三个株系，分别编号为：T2-17，T2-21，T2-23，NaCl浓度梯度为：0mmol/L，50mmol/L，100mmol/L，200mmol/L；
每个株系每个处理各重复三皿，每皿各50株，生长7d，期间观察植株生长情况，并统计致死植株数目及致死率。结果显示，在50mmol/L，100mmol/L的NaCl盐胁迫条件下，转基因植株和野生型拟南芥表型均无太大差异，植株能够正常生长，均未出现植株致死。在200mmol/L的NaCl盐胁迫下，第三天植株叶片逐渐白化出现死亡，至第七天野生型拟南芥基本全部致死，致死率达96%，而转基因植株平均仍有15株正常生长，致死率最高为70%。统计结果如表2所示，表型如图12，13所示。
每个株系每个处理各重复三皿，每皿各50株，生长7d，期间观察植株生长情况，并统计致死植株数目及致死率。结果显示，在50mmol/L，100mmol/L的NaCl盐胁迫条件下，转基因植株和野生型拟南芥表型均无太大差异，植株能够正常生长，均未出现植株致死。在200mmol/L的NaCl盐胁迫下，第三天植株叶片逐渐白化出现死亡，至第七天野生型拟南芥基本全部致死，致死率达96%，而转基因植株平均仍有15株正常生长，致死率最高为70%。统计结果如表2所示，表型如图12，13所示。
[0051] 表2. 200mmol/L的NaCl盐胁迫下转基因植株与野生型拟南芥的生长情况由此可见，LhMKK2 基因参与植物生长发育过程，过表达LhMKK2 基因可以提高植株对盐胁迫的抗性，参与植物逆境胁迫响应。
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