技术领域
[0001] 本
发明涉及改进的体细胞克隆犬的方法，尤其是涉及采用低渗透压融合 液连同自体胚胎移植技术制备体细胞克隆犬的方法。
背景技术
[0002] 动物克隆技术是将细胞通过核移植，转移至受体卵母细胞内，生产与供 体细胞具有相同DNA序列信息的动物个体。该技术的最大特点是，所出生 的克隆动物具有与供体细胞完全一致的遗传信息。因此采用克隆技术可以复
制动物体细胞，克隆技术可应用于转基因动物生产、优良
家畜扩繁、濒危动 物资源保存、进行
治疗性克隆等。
[0003] 犬是人类重要的家养动物，不仅可以作为宠物进行饲养，同时也是医学 及
生物学研究中重要的大型模式动物。利用克隆技术生产克隆犬，不仅可以 克隆宠物犬，为人类生活带来乐趣，同时利用该技术生产转基因及基因敲除 动物模型，将极大推动医学及生物学的发展。
[0004] 首例体细胞克隆犬于2005年获得成功，由韩国科学家黄禹
锡教授的科 研团队完成，利用体内成熟的犬卵母细胞进行核移植，成功克隆了阿富汗猎 犬“Snuppy”。
[0005] 犬体细胞克隆技术不仅可以应用于科研，在工作犬克隆方面也得到的广 泛的应用。2007年底，韩国7头体细胞克隆警犬诞生，这7头拉布拉多猎犬 是世界首批体细胞克隆的警犬，是利用一头名为“Chase”的拉布拉多猎犬 的体细胞克隆成功的。这些克隆警犬在出生后不久即开始接受专业训练，并 在训练中表现出很多缉毒犬所必备的优良特性。2009年，韩国科学家家利用 体细胞克隆技术，成功克隆了5只美国“911事件”英雄警犬“特拉克”，这 5只克隆犬继承了“特拉克”优良的基因，具有和“特拉克”一样优秀的工 作能
力。
[0006] 然而，在现有体细胞克隆犬的技术中，常常选择
同期发情的母犬进行异 体胚胎移植，成功率较低，造成克隆犬生产成本的增加，而且，异体胚胎移 植所需要的发情母犬数量较多，操作手段复杂，难以实现产业化的应用。因 此，非常需要改进现有的体细胞克隆犬技术，以简单的操作手段、较少的实 验用犬和低成本获得高成功率的体细胞克隆犬，从而实现体细胞克隆犬的产 业化应用。
发明内容
[0007] 本发明采用了低渗透压的融合液，提高了胚胎的融合效率；而且胚胎移 植受体犬只冲取单侧输卵管中的卵母细胞，卵母细胞经过核移植、融合及激 活后，与其他供体犬获得的克隆胚胎，共同移植入未冲卵的另一侧输卵管中， 实现自体/异体相结合的胚胎移植，提高了克隆犬的怀孕效率。
[0008] 第一方面，本发明提供了体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤： (1)体细胞的分离培养；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将体细 胞导入去核卵母细胞的
细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获 得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵 的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受 体母犬未冲卵的那侧输卵管中。
[0009] 在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，需要先鉴定进入发情期 的母犬，具体而言，每天抽血检测
阴道涂片、孕
酮、促卵胞素及黄体生成素， 当
角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮
水平达到4-7ng/mL左右时，认定母 犬处于排卵期。在排卵后72h-120h，进行单侧冲卵获得成熟的卵母细胞，然 后进行成熟卵母细胞的去核处理。
[0010] 优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的 细胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。
[0011] 优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的 细胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。
[0012] 所述融合液的组成如下：0.2-0.28M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM Hepes和0.05％BSA。
[0013] 优选地，所述融合液的组成如下：0.24M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM Hepes和0.05％BSA。
[0014] 优选地，电融合采用2-4kv/cm的
电压。
[0015] 也可以采用胞质内注射的方法将犬体细胞导入去核卵母细胞的胞质中， 胞质内注射一般用Piezo微注射系统，直接把整个供体细胞或供体细胞核注 入胞质内，胞质内注射的方法不需要进行电融合。
[0016] 第二方面，本发明提供了体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤： (1)体细胞的分离培养；(2)从受体母犬和供体母犬制备去核卵母细胞；(3) 将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4) 获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：一部分去核卵母细胞获自只 单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管，另一部分去核卵母细胞获自双侧输卵管 均进行了冲卵的供体母犬的双侧输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆 胚胎移植到受体母犬未冲卵的输卵管中。
[0017] 在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，需要先鉴定进入发情期 的母犬，具体而言，每天抽血检测阴道涂片、孕酮、促卵胞素及黄体生成素， 当角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右时，认定母 犬处于排卵期。在排卵后72h-120h，进行冲卵获得成熟的卵母细胞，然后进 行成熟卵母细胞的去核处理。
[0018] 优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的 细胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。
[0019] 优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的 细胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。
[0020] 所述融合液的组成如下：0.2-0.28M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM Hepes和0.05％BSA。
[0021] 优选地，所述融合液的组成如下：0.24M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM Hepes和0.05％BSA。
[0022] 优选地，电融合采用2-4kv/cm的电压。
[0023] 也可以采用胞质内注射的方法将犬体细胞导入去核卵母细胞的胞质中， 胞质内注射一般用Piezo微注射系统，直接把整个供体细胞或供体细胞核注 入胞质内，胞质内注射的方法不需要进行电融合。
[0024] 本发明的体细胞可以是来自各种组织和器官，例如
胎儿组织、
皮肤、肌 肉、
耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管、管腔内皮 等的细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于：胎儿成
纤维 细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、
成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、 乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞、成骨细胞等。
[0025] 从上述实施方案可以看出，本发明的方法中受体母犬本身也提供卵母细 胞，而且是只对单侧输卵管进行冲卵来获得卵母细胞；并且将经核移植、电 融合和激活获得的克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中，因此， 上述两种技术方案必然涉及自体移植，与
现有技术中异体移植需要发情母犬 数量较多相比大大减少了实验用犬的使用量。现有技术中，通常需要40只 以上的犬。本发明的方法只需要几只实验用犬。
[0026] 而且，现有技术中需要选择同期发情的母犬进行异体胚胎移植，但是母 犬发情鉴定较难，通过发情进行同期化鉴定准确率较低，这也是造成异体胚 胎移植成功率较低的原因。相比而言，本发明的技术方案中必然包含的自体 移植很大程度上避免了通过发情进行同期化判断的步骤；同时，自体移植可 以大幅度提高克隆胚胎的着床效率，从而实现了降低克隆犬的生产成本和高 效生产克隆犬的目标。
[0027] 此外，本发明采用渗透压为200-280mOSM的融合液，与现有技术中渗 透压为280-310mOSM的融合液相比，显著提高了胚胎的融合效率。
[0028] 缩略语和关键术语定义：
[0029] 克隆：采用相应的技术手段，生产与供核细胞具有相同DNA序列的动 物个体。
[0030] NT：体细胞核移植，将犬成体细胞移植入去核的犬卵母细胞中构建克 隆胚胎的方法。
[0031] DC：供核细胞，包含有完整的遗传物质的细胞，将其移植入受体卵母 细胞内用于制备体细胞克隆动物。
[0032] AET：自体胚胎移植，发情母犬冲出MII卵母细胞进行体细胞核移植后， 再以冲卵母犬作为克隆胚胎移植的受体，制备体细胞克隆犬。
附图说明
[0033] 图1是编号为161207的APOE基因敲除犬-苹果(图1A)与编号为 170502的克隆犬“龙龙”(图1B)分别出生30天的对比照片。。
具体实施方式
[0034] 下面结合
实施例及
说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些 实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
[0035] 实施例：
[0036] (1)体细胞的分离培养
[0037] 本实验中，体细胞的供体犬为北京希诺谷生物科技有限公司饲养的实验 用比格犬-苹果(编号为161207)，是北京希诺谷生物科技有限公司制备的世 界首例APOE基因敲除犬(带有其全部遗传信息的分类命名为载脂蛋白E (APOE)基因敲除比格犬耳成纤维细胞：BGD-APOEKO-EF0保藏在中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.13804，保藏日期为2017年3月1日)。取皮肤组织时，首先用刮毛刀刮 掉要采集的狗耳缘组织周围的皮毛，利用75％酒精消毒，用灭菌后的
剪刀剪 取狗的耳缘组织约1cm2，然后置入含有
100IU/ml的青霉素+100IU/ml链 霉素的DMEM
基础培养基中，于12h内带回实验室。
[0038] 组织
块首先利用PBS清洗3次或3次以上，再利用含5倍双抗(青霉 素及
链霉素)的DMEM培养基清洗3次，用眼科剪小心去除脂肪组织，达 到露出真皮层的目的。将皮肤组织转到另一个无菌培养皿中，利用手术刀将 其剪切割成l mm2大小的组织块。用眼科镊将组织块移至培养皿的皿底，用 枪头将其铺散均匀，然后将培养瓶翻转，加入含有20％的FBS及5倍双抗 的DMEM培养液，放入环境为37℃、5％CO2、100％湿度的
培养箱中培养。 7-8小时后，待组织块帖服后进行翻瓶，使培养基完全浸没组织块后继续培 养，每48小时更换培养液一次。
[0039] (2)母犬发情鉴定
[0040] 本实施例中共使用卵母细胞供体及受体犬16只，发情鉴定采用阴道涂 片及血清孕酮检测。进入发情期的母犬，每天进行阴道涂片检测，采用长度 为5cm的
棉棒用生理盐水浸润后插入阴道，然后将提取物涂至
载玻片，用 吉姆萨染液
染色后，在
显微镜下计数阴道上皮细胞角化程度，角化程度大于 80％时认为其处于排卵期。孕酮检测时，
抽取3mL血液，离心分离血清， 采用孕酮检测仪器检测孕酮含量，当孕酮值达到4-7ng/mL是认为其处于排 卵期，排卵后72-120h冲取成熟卵母细胞。
[0041] (3)成熟卵母细胞的获取
[0042] 母犬麻醉首先使用0.1mL的犬眠宝诱导麻醉，然后使用异氟烷及呼吸 机维持麻醉。暴露卵巢及子宫的宫管结合部，将带有圆形前端的金属注射针 从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部，然后将针管固定；在宫管结合部输卵管 处插入注射针，用含有10％FBS的TCM199培养基冲洗输卵管，将长度为 3cm的塑料管穿刺入子宫内部，固定后使用冲卵液从共管结合部冲洗卵母细 胞。冲卵方向也可逆向进行，但接取冲卵液一端的针管直径要大于冲卵液进 入的针管直径。选为受体的母犬仅进行一侧输卵管的冲卵，另一侧保留为胚 胎移植做准备。冲卵结束后，母犬立即进行苏醒处理，胚胎移植时再进行麻 醉。其他仅提供卵母细胞的供体犬则进行双侧输卵管的冲卵，获得的卵母细 胞用于体细胞核移植。
[0043] (4)卵母细胞去核
[0044] 将收集的体内或体外成熟的卵母细胞放入含有0.1％透明质酸酶的 DPBS溶液中，在37℃热台上，利用移液枪反复吹打，将卵丘细胞移除。在 倒置显微镜下，放大200倍观察，以挑选含有第一极体的成熟卵母细胞。
[0045] 将挑选好的卵母细胞，放入HEPES缓冲的含有10％FBS和5ug/ml细胞 松弛素B的CR2aa显微操作液中，孵育30min，使其细胞骨架
软化，然后使 用显微注射针将第一极体、相邻的细胞质(少于5％)和卵母细胞核移除， 然后将该去核卵母细胞保存在SOF培养基中。将显微注射针吸出的第一极 体及胞质，放入Hochest33342溶液中染色，然后在
荧光显微镜下观察所吸出 的胞质是否含有细胞核，判断去核效率。如果去核率在90％以上，可进行体 细胞注射，否则将采用Hochest33342对卵母细胞进行染色，在荧光显微镜下 进行紫外照射，将所指示的细胞核去除干净。
[0046] (5)去核卵母细胞注核、融合及激活
[0047] 将去核卵母细胞置于无CB的CR2aa显微操作液中，然后将选取的供核 细胞注射到卵母细胞透明带和细胞质之间，用注射针轻轻点压透明带，使体 细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。将重构胚置于渗透压为240mOSM 的融合液(包含0.24M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM Hepes和0.05％BSA) 中，然后放入融合槽的平行
电极之间，采用ECM2001(BTX)在2-4kv/cm 电压、2次脉冲、脉冲间隔10μs条件下进行电融合。融合后30min在体式 显微镜下观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合情况，统计融合效率。判定 为融合的重构胚用10μmol/L的离子霉素激活4min，然后采用含2mmol/L 的6-DMAP的mSOF再激活4h，完成激活后准备进行胚胎移植。参见下表 一，可以看出，胚胎融合时，采用240mOsm渗透压的融合液，可维持融合 率在70％以上；而采用现有技术中常用渗透压(300mOsm)的融合液，融 合率仅为50％左右。
[0048] 表一、融合液渗透压对融合率的影响
[0049]融合液渗透压(mOsm) 电击胚胎数 融合胚胎数 融合率
240 61 45 73％
300 43 7 53.4％
[0050] (6)胚胎移植
[0051] 受体犬麻醉后，选择未冲卵一侧腹壁暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及 卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管， 将胚胎植入受体体内。参见表二，胚胎移植后25天进行B超检测，胚胎移 植结果显示，采用自/异体胚胎移植方式大幅度提高了怀孕率，本实验共移植 受体4只，其中2只怀孕并产下合计3只克隆犬。
[0052] 表二、胚胎移植汇总
[0053]
[0054] (7)克隆犬的微卫星及APOE基因敲除鉴定
[0055] 为确定出生克隆幼犬与体细胞供体犬-“苹果”(编号：161207)是否具 有相同的遗传信息，以及确定与胚胎移植受体母犬的亲缘关系，采集克隆幼 犬及代孕母犬血液，采用微卫星鉴定的方法鉴定三者间的遗传关系，选择14 个微卫星位点，分别为：PEZ2、PEZ3、PEZ5、PEZ6、PEZ8、PEZ12、PEZ15、 PEZ20、PEZ21、FH2011、FH2054、FH2079、FH2132、FH2611及VWFX， 本次鉴定由公安部南昌警犬基地DNA实验室进行。
[0056] 在第一个鉴定中，利用编号为161207的苹果的送检样本作为1号样本， 采用由受体犬NTR1217生出的编号为170502的克隆幼犬龙龙作为2号样本， 采用受体犬NTR1217作为3号样本，鉴定2号样本与1号样本的同一性， 并鉴定2号样本与3号样本的亲子关系。
[0057] 血液样品平均分为两份，做平行对照，使用犬STR荧光检测
试剂盒进 行PCR扩增。扩增产物利用AB131030遗传分析仪进行
电泳和分型。
[0058] STR多态性检验结果：经过比对，2号犬样本与1号犬样本STR分型 一致；2号犬与3号犬样本在PEZ2，FH2054，FH2132和PEZ15等多个基 因座不匹配。
[0059] 在第二个鉴定中，利用编号为161207的苹果的送检样本作为2号样本， 采用由受体犬NTR1243生出的编号为170610的克隆幼犬作为3号样本，由 受体犬NTR1243生出的编号为170611的克隆幼犬作为4号样本，采用受体 犬NTR1243作为1号样本，鉴定3号、4号样本与2号样本的同一性，并鉴 定3号样本与1号样本的亲子关系。
[0060] 用取样器从每份样本上各取两份，做平行对照，使用犬STR荧光检测 试剂盒进行PCR扩增。扩增产物利用AB131030遗传分析仪进行电泳和分型。
[0061] STR多态性检验结果：经过比对，3号、4号样本与2号样本基因座数 据匹配；3号、4号样本与1号样本在PEZ12、PEZ15等多个基因座不匹配。
[0062] 鉴定结果显示，编号为170502的克隆犬“龙龙”、编号为170610的克 隆犬以及编号为170611的克隆犬与编号为161207的细胞供体犬“苹果”， 在所有的微卫星位点分型均为一致，而与胚胎移植受体犬NTR1217和NTR1243，在PEZ2、PEZ5、PEZ6、PEZ8、PEZ12、PEZ15、PEZ20、FH2011、 FH2054、FH2079、FH2132、FH2611及VWFX等位点不匹配(参见下表三)， 证明编号为170502的克隆犬“龙龙”、编号为170610的克隆犬以及编号为 170611的克隆犬是编号为161207的细胞供体犬“苹果”的克隆犬。附图1 是编号为161207的APOE基因敲除犬-苹果(图1A)与编号为170502的克 隆犬“龙龙”(图1B)分别出生30天的对比照片。
[0063] 表三、克隆犬微卫星鉴定结果
[0064]
