靶向抗微生物部分
阅读：586发布：2023-02-24
专利汇可以提供靶向抗微生物部分专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供新型靶向抗 微 生物 组合物。在各种实施方式中，提供的嵌合部分包含连接于靶向部分的抗微生物肽，所述靶向部分结合细菌菌株或种类。，下面是靶向抗微生物部分专利的具体信息内容。
1.一种嵌合构建物，所述构建物包含：
连接于包含表3和/或表12所示氨基酸序列的肽靶向部分的效应物；和
包含表4和/或表5所示氨基酸序列的抗微生物肽，其连接于靶向部分。
2.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分是包含表3和/或表
12所示肽的氨基酸序列的肽。
3.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分是包含表3所示肽的氨基酸序列的肽。
4.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分是包含表3所示肽的两种或更多种氨基酸序列的肽。
5.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分是其氨基酸序列由表3所示肽的氨基酸序列组成的肽。
6.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述效应物包含选自下组的部分：抗微生物肽、抗生素、配体、脂质或脂质体、物理破坏微生物群落内胞外基质的试剂和聚合粒子。
7.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述效应物包含抗微生物肽，该肽包含表4和/或表5和/或表14和/或表15所示氨基酸序列。
8.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述效应物包含抗微生物肽，该肽包含表4和/或表5所示氨基酸序列。
9.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述效应物包含抗微生物肽，该肽包含的氨基酸序列的特征是选自下组的基序：KIF、FIK、KIH、HIK和KIV。
10.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述构建物包含连接于抗微生物肽的靶向肽，所述靶向肽包含表3所示氨基酸序列，所述抗微生物肽包含表4和/或表5所示氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述构建物包含连接于靶向部分的抗微生物肽，所述抗微生物肽包含表4所示氨基酸序列，所述靶向部分包含表3和/或表10和/或表12所示氨基酸序列。
12.如权利要求1所述的嵌合构建物，其特征在于，所述构建物包含连接于抗微生物肽的靶向肽，所述靶向肽包含表3所示氨基酸序列，所述抗微生物肽包含表4所示氨基酸序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分化学偶联于所述效应物。
14.如权利要求13所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分经接头化学偶联于所述效应物。
15.如权利要求13所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分经包含聚乙二醇(PEG)的接头化学偶联于所述效应物。
16.如权利要求13所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分经表16所示的非肽接头化学偶联于所述效应物。
17.如权利要求1-12中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分直接连接于所述效应物。
18.如权利要求1-12中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分经肽键连接于所述效应物。
19.如权利要求18所述的嵌合构建物，其特征在于，所述效应物包含抗微生物肽且所述构建物是融合蛋白。
20.如权利要求18和19中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述靶向部分通过肽接头连接于所述效应物，所述肽接头包含表16所示氨基酸序列或由其组成。
21.如权利要求1-20中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述构建物携带一个或多个保护基团。
22.如权利要求21所述的嵌合构建物，其特征在于，所述一个或多个保护基团独立选自下组：乙酰基、酰胺、3-20个碳烷基、fmoc、tboc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、 -2-磺酰基(Mts)、4，
4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲苄基(MeBzl)、4-甲氧苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。
23.如权利要求21所述的嵌合构建物，其特征在于，所述构建物在羧基和/或氨基末端包含保护基团。
24.如权利要求23所述的嵌合构建物，其特征在于，羧基末端酰胺化。
25.如权利要求1-24中任一项所述的嵌合构建物，其特征在于，所述构建物用聚合物功能化以延长血清半衰期。
26.如权利要求25所述的嵌合构建物，其特征在于，所述聚合物包括聚乙二醇和/或纤维素或改性纤维素。
27.一种药物组合物，所述药物组合物在药学上可接受的载体中包含权利要求1-26中任一项所述的嵌合构建物。
28.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物配制成单位剂量制剂。
29.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物配制成通过选自下组的方式给药：腹膜内给药、局部给药、口服给药、吸入给药、经皮肤给药、皮下长效给药和直肠给药。
30.一种有效杀伤微生物或抑制其生长和/或生物膜的形成和/或维持的抗微生物组合物，所述组合物包含一种或多种分离的抗微生物肽，所述肽的氨基酸序列包含选自表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤酵母菌或真菌或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤酵母菌或真菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤黑曲霉
(Aspergillus niger)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤黑曲霉或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
33.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤白色念珠菌(C.albicans)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤白色念珠菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
34.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤红色毛癣菌(T.rubrum)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤红色毛癣菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
35.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，该组合物有效杀伤细菌或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤细菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤革兰氏阳性菌或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤革兰氏阳性菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
37.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤内氏放线菌(A.naeslundii)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤内氏放线菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
38.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤枯草芽胞杆菌(B.subtilis)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤枯草芽胞杆菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
39.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤艰难梭菌
(C.difficile)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤艰难梭菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一条或多条序列。
40.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤杰氏棒状杆菌(C.jeikeium)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤杰氏棒状杆菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
41.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤粪肠球菌
(E.faecalis)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤粪肠球菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
42.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤藤黄微球菌(M.luteus)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤藤黄微球菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
43.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤MRSA或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤MRSA或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
44.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤表皮葡萄球菌(S.epidermidis)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤表皮葡萄球菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
45.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤变形链球菌(S.mutans)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤变形链球菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
46.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤肺炎链球菌(S.pneumoniae)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤肺炎链球菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
47.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤革兰氏阴性菌或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤革兰氏阴性菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
48.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤鲍氏不动杆菌(A.baumannii)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤鲍氏不动杆菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
49.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤空肠弯曲菌(C.jejuni)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤空肠弯曲菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
50.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤大肠杆菌
(E.coli)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤大肠杆菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
51.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤具核梭杆菌(F.nucleatum)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤具核梭杆菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
52.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤大肠杆菌或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤黄色粘球菌(M.xanthus)或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
53.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤铜绿假单胞菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
54.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤牙龈卟啉单胞菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表
5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
55.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述组合物有效杀伤奇异变形菌(P.mirabilis)或抑制其生长和/或增殖，所述组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自鉴定为有效杀伤奇异变形菌或抑制其生长和/或增殖的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列。
56.如权利要求30-55中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽包含所有“L”氨基酸
57.如权利要求30-55中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽包含所有“D”氨基酸。
58.如权利要求30-55中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽包含“L”和“D”氨基酸的混合物。
59.如权利要求30-55中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽是β肽。
60.如权利要求30-59中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽包含一个或多个保护基团。
61.如权利要求60所述的组合物，其特征在于，所述肽在羧基末端包含酰胺。
62.如权利要求60或61中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽包含与羧基末端相连的保护基团。
63.如权利要求62所述的组合物，其特征在于，所述与羧基末端相连的保护基团是乙酰基。
64.如权利要求31-63中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肽处于药学上可接受的载体中。
65.如权利要求64所述的组合物，其特征在于，所述载体适合经选自下组的途径给予：
局部给药、气溶胶给药、经吸入给药、口服给药、全身性静脉内给药、眼部给药和直肠给药。
66.一种杀伤微生物和/或抑制其生长和/或增殖的方法，所述方法包括使所述微生物接触权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物或权利要求30-65中任一项所述的组合物。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述微生物是酵母菌或真菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤酵母菌或真菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求31-34中任一项所述的组合物。
68.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述微生物是细菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤细菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求35-55中任一项所述的组合物。
69.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述微生物是革兰氏阳性菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤革兰氏阳性菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求36-46中任一项所述的组合物。
70.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述微生物是革兰氏阴性菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤革兰氏阴性菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求47-55中任一项所述的组合物。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其特征在于，所述效应物是抗微生物肽。
72.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述嵌合构建物或组合物优先靶向形链球菌，所述嵌合构建物或组合物施用于动物或人的口腔。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述方法降低龋齿的发生率或严重程度。
74.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述嵌合构建物或组合物优先靶向棒状杆菌(Corynebacterium spp)，所述嵌合构建物或组合物施用于动物或人的皮肤表面。
75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述方法减少体臭。
76.一种消毒表面的方法，所述方法包括使所述表面接触权利要求1-29中任一项所述的一种或多种嵌合构建物或权利要求30-65中任一项所述的组合物。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述表面包括假肢或医学植入物的表面。
78.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述表面包括医学装置的表面。
79.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述表面包括植物或食物的表面。
80.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述嵌合构建物和/或构成所述组合物的肽与选自其它抗微生物剂的第二消毒剂组合，所述其它抗微生物剂是选自下组的消毒剂：
乙酸、磷酸、柠檬酸、乳酸、甲酸、丙酸、盐酸、硫酸、硝酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化铵、乙醇、异丙醇、苯酚、甲醛、戊二醛、次氯酸盐、二氧化氯、二氯异氰脲酸钠、氯胺-T、碘、聚维酮碘、氯己定、过氧化氢、过乙酸和苯扎氯铵。
81.权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物或权利要求30-65中任一项所述的组合物在制备杀伤微生物和/或抑制其生长和/或增殖和/或抑制包含所述微生物的生物膜生长和/或维持的药物中的应用。
82.如权利要求81所述的应用，其特征在于，所述微生物是酵母菌或真菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤酵母菌或真菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求31-34中任一项所述的组合物。
83.如权利要求66所述的应用，其特征在于，所述微生物是细菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤细菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求35-55中任一项所述的组合物。
84.如权利要求66所述的应用，其特征在于，所述微生物是革兰氏阳性菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤革兰氏阳性菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求36-46中任一项所述的组合物。
85.如权利要求66所述的应用，其特征在于，所述微生物是革兰氏阴性菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤革兰氏阴细菌的效应物的权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物，或权利要求47-55中任一项所述的组合物。
86.如权利要求81-85或权利要求70中任一项所述的应用，其特征在于，所述效应物是抗微生物肽。
87.一种检测细菌和/或细菌膜的方法，所述方法包括：使所述细菌或细菌膜与包含连接于靶向肽的可检测标记物的组合物接触，所述靶向肽包含表3和/或表12所示一种或多种氨基酸序列；和
检测所述可检测标记物，其中所述可检测标记物的量和/或位置表明所述细菌和/或细菌膜的存在。
88.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述靶向肽包含表3所示肽的氨基酸序列，或由其组成。
89.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述可检测标记物是选自下组的标记物：
放射性标记物、不透射线的标记物、荧光染料、荧光蛋白质、酶标记物、比色标记物和量子点。
90.一种包含连接于靶向肽的光敏剂的组合物，所述靶向肽包含表3和/或表12所示肽的氨基酸序列。
91.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述靶向肽包含表3所示肽的氨基酸序列，或由其组成。
92.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述光敏剂是选自下组的试剂：卟啉大环、卟啉、氯、冠醚、吖啶、吖嗪、酞菁、花青、小茴香、补骨脂素和醌型苝。
93.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述光敏剂是图1-12中任一所示的试剂。
94.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述光敏剂经非肽接头连接于所述靶向肽。
95.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述光敏剂经包含聚乙二醇(PEG)的接头连接于所述靶向肽。
96.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述光敏剂经表16所示的非肽接头连接于所述靶向肽。
97.一种抑制微生物或生物膜生长和/或增殖的方法，所述方法包括使所述微生物或生物膜接触权利要求89-96中任一项所述的组合物。
98.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述微生物或生物膜暴露于光源。
99.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述微生物是选自下组的微生物：细菌、酵母菌、真菌、原生动物和病毒。
100.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述生物膜包含细菌膜。
101.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述生物膜是植入的或可植入的医学装置上的生物膜。
102.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述微生物或生物膜是口腔中的生物或生物膜。
103.一种制剂，其包含：
靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP；和
浓度与约0.5X PBS到约2.5X PBS的磷酸缓冲盐水(PBS)相当的盐。
104.如权利要求103所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含表3或10所示靶向肽。
105.如权利要求103所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含抗变形链球菌肽靶向肽。
106.如权利要求103所述的制剂，其特征在于，所述抗变形链球菌靶向肽具有氨基酸序列TFFRLFNRSFTQALGK(SEQ ID NO：3251)。
107.如权利要求106所述的制剂，其特征在于，所述靶向肽连接于抗微生物肽。
108.如权利要求107所述的制剂，其特征在于，所述抗微生物肽是表4、5或14所示的肽。
109.如权利要求107所述的制剂，其特征在于，所述抗微生物肽具有氨基酸序列KNLRIIRKGIHIIKKY(SEQ ID NO：3082)。
110.如权利要求103所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含氨基酸序列C16G2 STAMP(TFFRLFNRSFTQALGKGGGKNLRIIRKGIHIIKKY(SEQ ID NO：3252)。
111.如权利要求103-110中任一项所述的制剂，其特征在于，所述靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP具有一个或多个保护基团。
112.如权利要求111所述的制剂，其特征在于，所述保护基团选自：乙酰基、酰胺、3-20个碳烷基、Fmoc、Tboc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲基苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲苄基(MeBzl)、4-甲氧苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，
6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。
113.如权利要求111所述的制剂，其特征在于，所述靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP在羧基末端酰胺化。
114.如权利要求103-110中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂的pH为约pH
5.0到约pH 8.5。
115.如权利要求114所述的制剂，其特征在于，所述pH为约pH 7.4。
116.如权利要求103-115中任一项所述的制剂，其特征在于，所述盐的浓度与1X PBS的相当。
117.如权利要求103-116中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含PBS。
118.如权利要求117所述的制剂，其特征在于，所述制剂还包含乙醇和/或甘油和/或聚乙二醇和/或氟化物。
靶向抗微生物部分
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2009年1月6日提交的USSN 61/142,830、2009年2月10日提交的USSN 61/151,445、2009年9月18日提交的USSN 61/243,905和2009年9月18日提
交的USSN 61/243,930的权利和优先权，所有这些申请出于所有目的通过引用全部纳入本文。
交的USSN 61/243,930的权利和优先权，所有这些申请出于所有目的通过引用全部纳入本文。
[0004] [不适用]发明领域
[0005] 本发明涉及新型靶向肽、新型抗微生物肽、包含新型靶向和/或新型抗微生物肽的嵌合部分及其用途。
[0006] 发明背景
[0008] 然而，细菌病原体对老的和较新的抗生素快速发展出耐药性，例如扩展的β-内酰胺酶(ESBL)和喹诺酮抗性革兰氏阴性菌、多重耐药淋球菌(gonococci)、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)、万古霉素耐药性肠球菌(enterococci)(VRE)、青霉素非敏感性肺炎球菌(pneumococci)(PNSP)和大环内酯耐药性肺炎球菌和链球菌(streptococci)(参见，例如Panlilo等.(1992)Infect Control Hosp Epidemio.，13：582-586；Morris等.(1995)Ann Intern Me.，d 123：250-259等)。据信，抗生素的过度使用或不恰当使用对于耐药细菌的激发和扩散至关重要。在许多情况中，微生物因持续接触和不适当使用药物而发生改变并耐受抗生素。
[0010] 发明概述
[0011] 在某些实施方式中，提供了特异性和/或优先结合微生物(例如，某些细菌、酵母菌、真菌、霉菌、病毒、藻类、原生动物等)的新型靶向部分(例如，肽)。所述靶向部分可连接于效应物(例如，可检测标记物、药物、抗微生物肽等)以形成嵌合构建物用于特异性/优先将该效应物递送至靶生物和/或之中。在某些实施方式中，提供可用于抑制(例如，杀伤和/或抑制生长和/或增殖)某些微生物(例如，某些细菌、酵母菌、真菌、霉菌、病毒、藻类、原生动物等)的新型抗微生物肽。
[0012] 因此，在某些实施方式中，提供的嵌合构建物(嵌合部分)包含：连接于含表3和/或表12所示氨基酸序列的肽靶向部分的效应物；和/或含表4和/或表5所示氨基酸序列的抗微生物肽，其连接于靶向部分。在某些实施方式中，靶向部分是包含表3和表12所示一个或多个肽的氨基酸序列的肽。在某些实施方式中，靶向部分是包含表3和表12所示一个或多个肽的两个或多个氨基酸序列的肽。在某些实施方式中，靶向部分是其氨基酸序列由表3所示肽的氨基酸序列组成的肽。
[0013] 在各种实施方式中，效应物包含选自下组的部分：抗微生物肽、抗生素、配体、脂质或脂质体、物理破坏微生物群落内胞外基质的药剂和聚合粒子。在某些实施方式中，效应物包含抗微生物肽，该肽含表4、5、14和表15所示一个或多个的氨基酸序列。在某些实施方式中，效应物包含抗微生物肽，该肽含表4和5所示一个或多个的氨基酸序列。在某些实施方式中，效应物包含抗微生物肽，该肽所含氨基酸序列的特征在于选自下组的基序：KIF、FIK、KIH、HIK和KIV(例如，见表7)。在某些实施方式中，构建物包含连接于抗微生物肽的靶向肽，所述靶向肽包含表3所示氨基酸序列，所述抗微生物肽包含表4和/或表5所示氨基酸序列。在某些实施方式中，构建物包含连接于靶向部分的抗微生物肽，所述抗微生物肽包含表4所示氨基酸序列，所述靶向部分包含表3和/或表10和/或表12所示氨基酸序列。在某些实施方式中，构建物包含连接于抗微生物肽的靶向肽，所述靶向肽包含表3所示氨基酸序列，所述抗微生物肽包含表4所示氨基酸序列。
[0014] 在各种实施方式中，靶向部分化学偶联于效应物(直接或经接头)。在某些实施方式中，接头包括聚乙二醇(PEG)，在某些实施方式中，靶向部分经表16所示的非肽接头化学偶联于效应物。在某些实施方式中，靶向部分经肽键连接于效应物。在某些实施方式中，效应物包含抗微生物肽，构建物是融合蛋白。在某些实施方式中，靶向部分通过肽接头连接于效应物，所述肽接头包含表16所示氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，本文所述的任何构建物和/或肽携带一个或多个保护基团。在某些实施方式中，所述一个或多个保护基团独立选自下组：乙酰基、酰胺、3-20个碳烷基、fmoc、tboc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、 -2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲苄基(MeBzl)、4-甲氧苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。在某些实施方式中，肽和/或构建物在羧基和/或氨基末端包含保护基团。在某些实施方式中，羧基末端酰胺化和/或氨基末端乙酰化。在各种实施方式中，嵌合构建物和/或肽用聚合物(例如，包括聚乙二醇、纤维素、修饰纤维素、糊精等)功能化以延长血清半衰期。
[0015] 在某些实施方式中，提供了药物组合物。在各种实施方式中，药物组合物包含在药学上可接受载体中的本文所述嵌合构建物(例如，权利要求1-16中任一项所述的嵌合构建物)和/或本文所述抗微生物肽。在某些实施方式中，组合物配制成单位剂量制剂。在某些实施方式中，组合物配制成经选自下组的途径给药：腹膜内给药、局部给药、口服给药、吸入给药、经皮给药、皮下长效给药、全身性IV施用、眼部给药和直肠给药。
[0016] 在某些实施方式中，提供分离的抗微生物肽。在各种实施方式中，肽包含选自表4和/或表5所列氨基酸序列中的一种或多种序列(和/或逆、反向、逆反向(retroinverso)或β形式)。在各种实施方式中，抗微生物肽具有一个或多个保护基团，例如本文所述。
[0017] 在某些实施方式中，提供的组合物有效杀伤微生物或抑制其生长和/或生物膜的形成和/或维持。该组合物通常包含一种或多种分离的抗微生物肽，该肽的氨基酸序列包含选自表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列(和/或逆、反向或逆反向形式)。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤酵母菌或真菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5(例如，那些表中)所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤酵母菌或真菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤黑曲霉(Aspergillus niger)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤黑曲霉或抑制其生长和/
或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤白色念珠菌(C.albicans)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤白色念珠菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤红色毛癣菌(T.rubrum)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤红色毛癣菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤细菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤细菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤革兰氏阳性菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤革兰氏阳性菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤内氏放线菌(A.naeslundii)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤内氏放线菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤枯草芽胞杆菌(B.subtilis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤枯草芽胞杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤艰难梭菌(C.difficile)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一条或多条序列以便有效杀伤艰难梭菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤杰氏棒状杆菌(C.jeikeium)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤杰氏棒状杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤粪肠球菌(E.faecalis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤粪肠球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤藤黄微球菌(M.luteus)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤藤黄微球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤MRSA或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤MRSA或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤表皮葡萄球菌(S.epidermidis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效
杀伤表皮葡萄球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤变形链球菌(S.mutans)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有
效杀伤变形链球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤肺炎链球菌(S.pneumoniae)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以
便有效杀伤肺炎链球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤革兰氏阴性菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤革兰氏阴性菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤鲍氏不动杆菌(A.baumannii)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤鲍氏不动杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤空肠弯曲菌(C.jejuni)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有
效杀伤空肠弯曲菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤大肠杆菌(E.coli)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀
伤大肠杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤具核梭杆菌(F.nucleatum)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀
伤具核梭杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤大肠杆菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤黄色粘球菌
(M.xanthus)或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤铜绿假单胞菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤牙龈卟啉单胞菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤奇异变形菌(P.mirabilis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤奇异变形菌或抑制其生长和/或增殖。
或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤白色念珠菌(C.albicans)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤白色念珠菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤红色毛癣菌(T.rubrum)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤红色毛癣菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤细菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤细菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤革兰氏阳性菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤革兰氏阳性菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤内氏放线菌(A.naeslundii)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤内氏放线菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤枯草芽胞杆菌(B.subtilis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤枯草芽胞杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤艰难梭菌(C.difficile)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一条或多条序列以便有效杀伤艰难梭菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤杰氏棒状杆菌(C.jeikeium)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤杰氏棒状杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤粪肠球菌(E.faecalis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤粪肠球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤藤黄微球菌(M.luteus)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤藤黄微球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤MRSA或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤MRSA或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤表皮葡萄球菌(S.epidermidis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效
杀伤表皮葡萄球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤变形链球菌(S.mutans)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有
效杀伤变形链球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤肺炎链球菌(S.pneumoniae)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以
便有效杀伤肺炎链球菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤革兰氏阴性菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤革兰氏阴性菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤鲍氏不动杆菌(A.baumannii)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤鲍氏不动杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤空肠弯曲菌(C.jejuni)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有
效杀伤空肠弯曲菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤大肠杆菌(E.coli)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀
伤大肠杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤具核梭杆菌(F.nucleatum)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀
伤具核梭杆菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤大肠杆菌或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤黄色粘球菌
(M.xanthus)或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤铜绿假单胞菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤牙龈卟啉单胞菌或抑制其生长和/或增殖。在某些实施方式中，该组合物有效杀伤奇异变形菌(P.mirabilis)或抑制其生长和/或增殖，该组合物包含一种或多种肽，所述肽的氨基酸序列包含选自经鉴定有效的表4和/或表5所列氨基酸序列的一种或多种序列以便有效杀伤奇异变形菌或抑制其生长和/或增殖。
[0018] 在各种实施方式中，构成组合物的一种或多种肽包含全部“L”氨基酸或全部“D”氨基酸，或“L”和“D”氨基酸的混合物。在各种实施方式中，构成组合物的一种或多种肽是β肽。在各种实施方式中，构成组合物的一种或多种肽包含一个或多个保护基团(例如，保护的羧基和/或氨基末端)。在各种实施方式中，构成组合物的一种或多种肽包含羧基末端上的酰胺和/或氨基末端上的乙酰基。在各种实施方式中，构成组合物的一种或多种肽处于药学上可接受的载体中。在某些实施方式中，所述载体适合经选自下组的途径给药：局部给药、气溶胶给药、经吸入给药、口服给药和/或直肠给药。
[0019] 在各种实施方式中，提供杀伤微生物和/或抑制其生长和/或增殖，或破坏和/或抑制生物膜的生长和/或维持的方法，该方法包括使微生物(或包含微生物的生物膜)接触本文所述的嵌合构建物(例如，参见以上描述和/或权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物)或本文所述的抗微生物肽和/或本文所述组合物(例如，权利要求30-65中任一项所述组合物)。在某些实施方式中，所述微生物是酵母菌或真菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤酵母菌或真菌的效应物的嵌合构建物或是包含本文所述杀伤酵母菌或真菌的抗微生物肽的组合物。在某些实施方式中，所述微生物是细菌(例如，革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌)，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤细菌(例如，革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌)的效应物的嵌合构建物或是包含本文所述杀伤革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌的抗微生物肽的组合物。在某些实施方式中，所述效应物是抗微生物肽。
在某些实施方式中，所述微生物是变形链球菌，所述嵌合构建物或组合物施用于动物或人的口腔，例如，用于降低龋齿和/或牙周病的发生率或严重程度。在某些实施方式中，所述嵌合构建物或组合物优先靶向棒状杆菌(Corynebacterium spp)，所述嵌合构建物或组合物施用于动物或人的皮肤表面(例如，用于减少体臭)。
在某些实施方式中，所述微生物是变形链球菌，所述嵌合构建物或组合物施用于动物或人的口腔，例如，用于降低龋齿和/或牙周病的发生率或严重程度。在某些实施方式中，所述嵌合构建物或组合物优先靶向棒状杆菌(Corynebacterium spp)，所述嵌合构建物或组合物施用于动物或人的皮肤表面(例如，用于减少体臭)。
[0020] 还提供了消毒表面的方法。所述方法通常包括使表面接触本文所述的一种或多种嵌合构建物(例如，权利要求1-29中任一项所述的构建物)或本文所述组合物(例如，权利要求30-65中任一项所述的组合物)。在某些实施方式中，所述表面包括假肢或医学植入物的表面。在某些实施方式中，所述表面包括医学装置的表面。在某些实施方式中，所述表面包括植物或食物的表面。在某些实施方式中，所述嵌合构建物和/或抗微生物肽与选自其它抗微生物剂的第二消毒剂联用，所述其它抗微生物剂是选自下组的消毒剂：乙酸、磷酸、柠檬酸、乳酸、甲酸、丙酸、盐酸、硫酸、硝酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化铵、乙醇、异丙醇、苯酚、甲醛、戊二醛、次氯酸盐、二氧化氯、二氯异氰脲酸钠、氯胺-T、碘、聚维酮碘、氯己定、过氧化氢、过乙酸和苯扎氯铵。
[0021] 在各种实施方式中，提供了本文所述嵌合构建物和/或抗微生物组合物(例如，权利要求1-29中任一项所述的嵌合构建物或权利要求30-65中任一项所述的组合物)在制备杀伤微生物和/或抑制其生长和/或增殖和/或抑制包含微生物的生物膜生长和/或维
持的药物中的应用。在某些实施方式中，所述微生物是酵母菌或真菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤酵母菌或真菌的效应物的嵌合构建物。在某些实施方式中，所述微生物是细菌(例如，革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌)，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤细菌(例如，革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌)的效应物的嵌合构建物或包含本文所述杀伤革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌的抗微生物肽的组合物。在某些实施方式中，所述效应物是抗微生物肽。
持的药物中的应用。在某些实施方式中，所述微生物是酵母菌或真菌，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤酵母菌或真菌的效应物的嵌合构建物。在某些实施方式中，所述微生物是细菌(例如，革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌)，所述嵌合构建物或组合物是包含经鉴定能杀伤细菌(例如，革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌)的效应物的嵌合构建物或包含本文所述杀伤革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌的抗微生物肽的组合物。在某些实施方式中，所述效应物是抗微生物肽。
[0022] 在各种实施方式中，还提供检测细菌和/或细菌膜(例如，包含细菌的生物膜)的方法。所述方法通常包括使细菌或细菌膜与包含连接于靶向肽的的组合物接触，所述靶向肽包含表3和/或表12所示一种或多种氨基酸序列；和检测可检测标记物，其中所述可检测标记物的量和/或位置指示细菌和/或细菌膜的存在。在某些实施方式中，靶向肽包含表3所示肽的氨基酸序列(和/或该序列的逆、反向、逆反向形式)，或由其组成。在某些实施方式中，所述可检测标记物是选自下组的标记物：放射性标记物、不透射线的标记物、荧光染料、荧光蛋白质、酶标记物、比色标记物和量子点。
[0023] 还提供了包含连接于靶向肽(例如，包含表3和/或表12所示肽的氨基酸序列的肽)的光敏或光可活化剂的某些组合物。在某些实施方式中，所述靶向肽包含表3所示肽的氨基酸序列，或由其组成。在某些实施方式中，所述光敏剂是选自下组的试剂：卟啉大环、卟啉、氯、冠醚、吖啶、吖嗪、酞菁、花青、补骨脂素、小茴香和苝醌类。在某些实施方式中，光敏剂包含图1-12中任一所示的一种或多种试剂。在某些实施方式中，光敏剂经非肽接头(例如，聚乙二醇(PEG))连接于靶向肽。在某些实施方式中，光敏剂经表16所示的非肽接头连接于靶向肽。
[0024] 在各种实施方式中，提供杀伤微生物和/或抑制微生物或包含微生物的生物膜的生长和/或增殖的方法，其中所述方法包括使所述微生物或生物膜接触包含连接于靶向肽(例如，包含表3和/或表12所示肽的氨基酸序列的肽)的光敏剂或光可活化试剂的组合物。在某些实施方式中，所述靶向肽包含表3所示肽的氨基酸序列，或由其组成。在某些实施方式中，所述光敏剂是选自下组的试剂：卟啉大环、卟啉、氯、冠醚、吖啶、吖嗪、酞菁、花青、补骨脂素、小茴香和苝醌类。在某些实施方式中，光敏剂包含图1-12中任一所示的一种或多种试剂。在某些实施方式中，所述光敏剂经非肽接头(例如，聚乙二醇(PEG))连接于靶向肽。在某些实施方式中，光敏剂经表16所示的非肽接头连接于靶向肽。在某些实施方式中，所述方法还包括使微生物或生物膜暴露于光源。在某些实施方式中，所述微生物是选自下组的微生物：细菌(例如，革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌)、酵母菌、真菌、原生动物和病毒。在某些实施方式中，所述生物膜包含细菌膜。在某些实施方式中，所述生物膜是在植入的或可植入的医学装置上的生物膜。在某些实施方式中，所述微生物或生物膜是口腔中的生物或生物膜。
[0025] 在各种实施方式中，提供了某些制剂。典型的制剂包括但不限于：靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP；浓度与磷酸缓冲盐水(PBS)(约0.5X PBS到约2.5X PBS)相当的盐。在某些实施方式中，所述制剂包含表3或10所示靶向肽。在某些实施方式中，所述制剂包含抗变形链球菌肽靶向肽(例如，表3或12中所鉴定)。在某些实施方式中，所述抗变形链球菌靶向肽具有氨基酸序列TFFRLFNRSFTQALGK(SEQ ID NO：1)。在某些实施方式中，抗变形链球菌靶向肽连接于抗微生物肽。在某些实施方式中，所述抗微生物肽是表4、5或14所示的肽。在某些实施方式中，所述抗微生物肽具有氨基酸序列KNLRIIRKGIHIIKKY(SEQ ID NO：3082)。在某些实施方式中，所述制剂包含氨基酸序列C16G2 STAMP(TFFRLFNRSFTQALGKGGGKNLRIIRKGIHIIKKY(SEQ ID NO：2)。在各种实施方式中，所述靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP具有一个或多个保护基团。在某些实施方式中，所述保护基团独立选自下列基团：乙酰基、酰胺、3-20个碳烷基、Fmoc、Tboc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、 -2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。在某些实施方式中，所述靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP在羧基末端酰胺化和/或在氨基末端具有乙酰基。在某些实施方式中，所述制剂的pH为约pH 5.0到约pH 8.5。在某些实施方式中，所述pH为约pH 7.4。在各种实施方式中，所述盐的浓度与1X PBS的相当。在某些实施方式中，所述制剂包含PBS。在某些实施方式中，所述制剂还包含乙醇和/或甘油和/或聚乙二醇和/或氟化物。
[0026] 定义
[0027] 本文所用的术语“肽”指通常约2到约50或约60个残基长度的氨基酸残基聚合物。在某些实施方式中，所述肽长约2、3、4、5、7、9、10、或11个残基到约60、50、45、40、45、30、25、20或15个残基。在某些实施方式中，所述肽长约8、9、10、11或12个残基到约15、20或25个残基。在某些实施方式中，构成肽的氨基酸残基是“L-型”氨基酸残基，然而，应该知道在各种实施方式中，可将“D”氨基酸掺入肽。肽还包括其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物以及天然产生的氨基酸聚合物。此外，该术语适用于经肽键或其它“修饰的键”连接的氨基酸(例如，肽键被α-酯、β-酯、硫代酰胺、磷酰胺、carbomate、羟基化物等取代(参见，例如Spatola，(1983)Chem.Biochem.Amino Acids and Proteins 7：267-357)，酰胺被饱和的胺取代(参见，例如Skiles等.，美国专利号4,496,542，其通过引用纳入本文，和Kaltenbronn等.，(1990)第969-970页，刊于第11届美国肽研讨会论文集(Proc.11th American Peptide Symposium)，ESCOM科学出版社(ESCOM Science Publishers)，荷兰，等等))。
[0028] 本文所用的术语“残基”指天然、合成或修饰的氨基酸。各种氨基酸类似物包括但不限于：2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸(β-氨基丙酸)、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4二氨基丁酸、锁链素、2，2‘-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、n-乙基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别(allo)-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、n-甲基甘氨酸、肌氨酸、n-甲基异亮氨酸、6-n-甲基赖氨酸、n-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等。这些修饰的氨基酸是说明性而非限制性的。
[0029] ″β-肽″包含″β氨基酸″，它们的氨基与β碳结合，而非像20种标准生物学氨基酸那样与α-碳结合。唯一的天然产生β氨基酸是β-丙氨酸。
[0031] 应用于本文的肽的术语“常规”和“天然”所指肽仅构建自天然产生的氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。如果本发明化合物引发的生物学活性(例如，抗微生物活性)与天然产生肽的生物学活性和/或特异性相关，则其“对应于”天然肽。引发的活性可以相同于、大于或小于天然肽。如果N-取代的甘氨酸衍生物与原氨基酸在亲水性、疏水性、极性等上类似，这种类肽通常具有实质性对应的单体序列，其中天然氨基酸由该N-取代的甘氨酸衍生物替换。以下是说明性而非限制性的N-取代甘氨酸替换：N-(1-甲基丙-1-基)甘氨酸取代异亮氨酸(Ile)、N-(丙-2-基)甘氨酸取代缬氨酸(Val)、N-苄基甘氨酸取代苯丙氨酸(Phe)、
N-(2-羟乙基)甘氨酸取代丝氨酸(Ser)等。在某些实施方式中，取代无需是″精确的″。
因此，例如，在某些实施方式中，N-(2-羟乙基)甘氨酸可取代Ser、Thr、Cys和/或Met；
N-(2-甲基丙-1-基)甘氨酸可取代Val、Leu和/或Ile。在某些实施方式中，尽管有结构差异，但可用N-(2-羟乙基)甘氨酸取代Thr和Ser：N-(2-羟乙基)甘氨酸中的侧链是长
于Ser的亚甲基基团，与Thr的区别在于羟基-取代的位点。通常可利用N-羟基烷基-取
代的甘氨酸置换任何极性氨基酸，N-苄基-或N-芳烷基-取代的甘氨酸替换任何芳族氨基酸(例如，Phe、Trp等)、N-烷基-取代的甘氨酸如N-丁基甘氨酸替换任何非极性氨基酸(例如，Leu、Val、Ile等)和N-(氨基烷基)甘氨酸衍生物替换任何碱性极性氨基酸(例
如，Lys和Arg)。
N-(2-羟乙基)甘氨酸取代丝氨酸(Ser)等。在某些实施方式中，取代无需是″精确的″。
因此，例如，在某些实施方式中，N-(2-羟乙基)甘氨酸可取代Ser、Thr、Cys和/或Met；
N-(2-甲基丙-1-基)甘氨酸可取代Val、Leu和/或Ile。在某些实施方式中，尽管有结构差异，但可用N-(2-羟乙基)甘氨酸取代Thr和Ser：N-(2-羟乙基)甘氨酸中的侧链是长
于Ser的亚甲基基团，与Thr的区别在于羟基-取代的位点。通常可利用N-羟基烷基-取
代的甘氨酸置换任何极性氨基酸，N-苄基-或N-芳烷基-取代的甘氨酸替换任何芳族氨基酸(例如，Phe、Trp等)、N-烷基-取代的甘氨酸如N-丁基甘氨酸替换任何非极性氨基酸(例如，Leu、Val、Ile等)和N-(氨基烷基)甘氨酸衍生物替换任何碱性极性氨基酸(例
如，Lys和Arg)。
[0032] 在本文提供的氨基酸序列中，还考虑了L-、D-或β氨基酸形式的序列以及逆、反向和逆反向同种型。此外，考虑了保守性取代(例如，在结合肽和/或抗微生物肽和/或接头肽中)。还考虑了非蛋白质主链，例如PEG、烷烃、亚乙基(乙基ene)桥、酯主链和其它主链。还考虑了长约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸到至多肽的全长减1个氨基酸的片段，其中所述片段保留了全长肽的至少50％，优选至少60％、70％或80％，更优选至少90％、95％、98％、99％或至少100％的活性(例如，结合特异性和/或亲合力、抗微生物活性，等等)。
[0033] “复合抗微生物肽”或“复合AMP”指包含两个或更多个彼此连接的AMP的构建物。AMP可直接或经接头相连。它们可化学偶联，或者如果直接或经肽接头连接在一起，其可包含融合蛋白。
[0034] 在某些实施方式中，考虑了构成本文所述任何序列的氨基酸保守取代。在各种实施方式中，1、2、3、4或5个不同残基被取代。术语“保守性取代”用于反映基本不改变分子活性(例如，抗微生物活性和/或特异性)的氨基酸取代。保守性氨基酸取代通常包括用某一氨基酸取代具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的另一氨基酸。某些保守性取代包括“类似物取代”，其中标准氨基酸被与母体残基差异极小的非标准(例如，稀有、合成等)氨基酸替换。氨基酸类似物可考虑从标准氨基酸合成衍生而不显著改变母体的结构，它们是异构体或是代谢物前体。这种“类似物取代”的例子包括但不限于：1)Lys-Orn、2)Leu-正亮氨酸、3)Lys-Lys[TFA]、4)Phe-Phe[Gly]和5)δ-氨基丁基甘氨酸-ξ-氨基己基甘氨酸，其中Phe[gly]指苯基甘氨酸(R基团中是H而非CH3的Phe衍生物)和Lys[TFA]指负电荷离子(例如，TFA)连接于胺R基团的Lys。其它保守性取代包括“功能取代”，其中两个残基的一般化学特性相似且足以模拟或部分恢复天然肽的功能。强功能取代包括但不限于：1)Gly/Ala、2)Arg/Lys、3)Ser/Tyr/Thr、4)Leu/Ile/Val、5)Asp/Glu、6)Gln/Asn和7)Phe/Trp/Tyr，而其它功能性取代包括但不限于：8)Gly/Ala/Pro、9)Tyr/His、10)Arg/Lys/His、11)Ser/Thr/Cys、12)Leu/Ile/Val/Met和13)Met/Lys(疏水性条件下的特例)。各种“广义保守性取代”包括氨基酸替换同一生物化学或生物物理学分组中的其它氨基酸的取代。这是基础水平的相似性，源自对原始20种天然氨基酸的分类。此类取代包括1)非极性侧链：Gly/Ala/Val/Leu/Ile/Met/Pro/Phe/Trp，和/或2)不带电的极性侧链Ser/Thr/Asn/Gln/Tyr/Cys。在某些实施方式中，广义水平取代还可以是成对取代。例如，任何亲水性中性配对[Ser，Thr，Gln，Asn，Tyr，Cys]+[Ser，Thr，Gln，Asn，Tyr，Cys]可被电-中性带电配对[Arg，Lys，His]+[Asp，Glu]替换。在某些实施方式中，以下6组各含有彼此可典型保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。在本文公开氨基酸序列中，还考虑了包含一种或多种以上鉴定的保守性取代的氨基酸序列。
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。在本文公开氨基酸序列中，还考虑了包含一种或多种以上鉴定的保守性取代的氨基酸序列。
[0035] 在某些实施方式中，还考虑了与本文所述任何序列有至少80％，优选至少85％或90％，更优选至少95％或98％序列相同性的靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP。术语“相同”或“相同性”百分比指采用以下序列比较算法之一或通过目测观察检测，在比较和匹配最大对应性时，相同或具有特定百分比相同氨基酸残基的两种或更多序列。对于本发明的肽，测定该肽全长的序列相同性。对于序列比较，通常一个序列用作与测试序列比较的参比序列。使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，指定子序列座标，如需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分比。为作比较，可进行最佳序列比对，例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法((1981)Adv.Appl.Math.2：482)，Needleman和Wunsch的同源性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)，Pearson & Lipman的相似性检索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：2444)，这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，)或目测观察。
[0036] 用于肽的抗微生物活性时，术语“特异性”表明与其它相关和/或无关的微生物相比，该肽优先抑制生长和/或增殖和/或杀伤特定微生物种类。在某些实施方式中，对靶种类的优先抑制或杀伤增加至少10％(例如，LD50减少10％)，优选至少20％、30％、40％或50％，更优选至少2倍、至少5倍或至少10倍。
[0037] 本文所用的“治疗”或“处理”疾病可指预防该疾病、减缓该疾病的发作或发展速度、降低产生该疾病的风险、阻止或延缓该疾病相关症状的产生、减轻或终止该疾病的相关症状、使得该疾病完全或部分复原，或它们的一些组合。
[0038] 用于本文所述抗微生物肽(AMP)或AMP基序时，术语“基本上由…组成”表示文库所包含的一种或多种肽或其变体、类似物或衍生物具有与参比肽基本上相同或更高的抗微生物活性和/或特异性。在某些实施方式中，基本上相同或更高的抗微生物活性表示参比肽对于特定细菌种类(例如，变形链球菌)的抗微生物活性为至少80％、优选至少90％、更优选至少95％。
[0039] 术语“卟啉大环”指卟啉或卟啉衍生物。此类衍生物包括具有外环邻位稠合或邻位周边稠合至卟啉核的的卟啉、用另一元素的原子替换卟啉环的一个或多个碳原子(骨架取代)的卟啉、用另一元素的原子替换卟啉环的氮原子(氮的骨架取代)的衍生物、在卟啉的外周(内消旋-、β-)或核心原子处具有除氢以外的取代基的衍生物、卟啉的一个或多个键饱和的衍生物(氢卟啉，例如二氢卟酚、菌绿素、异细菌二氢卟酚、十氢卟啉、corphins、咕啉(pyrrocorphin)等)、一种或多种金属与一个或多个卟啉原子配位得到的衍生物(金属卟啉)、包括吡咯和吡咯次甲基单位在内的一个或多个原子插入卟啉环的衍生物(扩展卟啉)、从卟啉环中除去一个或多个基团的衍生物(收缩卟啉，例如咕啉、咔咯)和前述衍生物的组合(例如，酞菁、紫菜嗪、萘酞菁、亚酞菁和卟啉异构体)。某些卟啉大环包含至少一个5元环。
[0040] 本文所用的“抗体”指由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段基本编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，进而分别确定免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0041] 已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。各四聚体由两对相同的多肽链组成，各对具有一条“轻”链(约25kD)和一条″重″链(约50-70kD)。各链的N末端有约100到110或更多氨基酸的可变区，该可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
[0042] 抗体存在完整的免疫球蛋白或用各种肽酶消化产生的大量良好表征的片段。因此，例如胃蛋白酶在绞链区的二硫键下消化抗体以产生Fab的二聚体F(ab)′2，其本身是通过二硫键连接于VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab)′2以打开绞链区中的二硫键，从而将(Fab′)2二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体本质上是具有部分绞链
区的Fab(其它抗体片段的更详细描述参见，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，W.E.Paul编.，雷文出版公司(Raven Press)，纽约.(1993))。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但技术人员应知道可通过化学方法或采用重组DNA方法从头合成此类Fab’片段。因此，本文所用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体或采用重组DNA方法从头合成而产生的抗体片段，包括但不限于：Fab’2、IgG、IgM、IgA、scFv、dAb、纳米抗体、单链抗体和双链抗体。
区的Fab(其它抗体片段的更详细描述参见，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，W.E.Paul编.，雷文出版公司(Raven Press)，纽约.(1993))。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但技术人员应知道可通过化学方法或采用重组DNA方法从头合成此类Fab’片段。因此，本文所用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体或采用重组DNA方法从头合成而产生的抗体片段，包括但不限于：Fab’2、IgG、IgM、IgA、scFv、dAb、纳米抗体、单链抗体和双链抗体。
[0043] 在某些实施方式中，本发明的抗体和片段可以是双特异性的。双特异性抗体或片段可以具有几种构型。例如，双特异性抗体可类似于单一的抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。在各种实施方式中，可通过化学技术(Kranz等.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，78：5807)、“多瘤”技术(参见，例如美国专利号4,474,893)或通过重组DNA技术产生双特异性抗体。在某些实施方式中，本发明的双特异性抗体可对至少两种不同抗原表位具有结合特异性，其中至少一个是微生物的抗原表位。微生物结合抗体和片段也可以是异源抗体。异源抗体是连接在一起的两个或更多抗体或抗体结合片段(例如，Fab)，各抗体或片段具有不同特异性。
[0044] 术语“STAMP”指特异性靶向抗微生物肽。在各种实施方式中，STAMP包含与一个或多个抗微生物部分(例如，抗微生物肽(AMP))结合的一个或多个肽靶向部分。MH-STAMP是具有两个或更多靶向结构域的STAMP(即，多头STAMP)。
[0045] 术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指某种物质基本上或实质性不含天然状态下通常与其相伴的组分。以肽为例，分离的(天然产生的)肽通常基本不含其在细胞、组织或机体中相关的组分。术语分离的还表示该肽不存在于噬菌体展示、酵母菌展示或其它肽文库。
[0046] 在各种实施方式中，本文采用表1所示的氨基酸缩写。
[0047] 表1.氨基酸缩写
[0048]
[0049]
[0051] 图1显示了适合用作靶向部分和/或抗微生物效应物的一些示范性卟啉(化合物92-99)。
[0052] 图2显示了适合用作靶向部分和/或抗微生物效应物的一些示范性卟啉(化合物100-118)。
[0053] 图3显示了适合用作靶向部分和/或抗微生物效应物的一些示范性卟啉(特别是酞菁)(化合物119-128)。
[0054] 图4显示了适合用作靶向部分和/或抗微生物效应物的两种酞菁蒙纳斯固蓝B(Monoastral Fast Blue)和蒙纳斯固蓝G的结构。
[0055] 图5显示了适合在本文所述组合物和方法中用作靶向部分和/或抗微生物效应物的某些吖嗪光敏剂。
[0056] 图6显示了适合在本文所述组合物和方法中用作靶向部分和/或抗微生物效应物的示范性花青。
[0057] 图7显示了适合在本文所述组合物和方法中用作靶向部分和/或抗微生物效应物的示范性补骨脂素(白芷素)光敏剂。
[0058] 图8显示了适合在本文所述组合物和方法中用作靶向部分和/或抗微生物效应物的金丝桃蒽酮和苝醌类色素。
[0059] 图9显示了适合在本文所述组合物和方法中用作靶向部分和/或抗微生物效应物的示范性吖啶。
[0060] 图10显示了吖啶孟加拉红的结构。
[0061] 图11显示了适合在本文所述组合物和方法中用作靶向部分和/或抗微生物效应物的各种冠醚。
[0062] 图12显示了小茴香的结构。
[0063] 图13显示了我们构建的靶向光活化卟啉的实施例：包含偶联于C16(SEQ ID NO：3)靶向序列的卟啉的C16-P18。
[0064] 图14是本文所述嵌合构建物的一些示范性构型的示意图。A：显示了单个靶向部分T1通过接头/间隔区连接于单个效应物E1。B：显示了多个靶向部分T1、T2、T3彼此直接连接并通过接头L连接于单个效应物E1。在各种实施方式中，T1、T2和T3可以是融合蛋白中的结构域。C：显示了多个靶向部分T1、T2、T3通过接头L彼此连接和通过接头L连接于单个效应物E1。在各种实施方式中，T1、T2和T3可以是融合蛋白中的结构域。D：显示了单个靶向部分T1通过接头L连接于彼此直接相连的多个效应物E1、E2和E3。E：显示了单个靶向部分T1通过接头L连接于通过接头L彼此连接的多个效应物E1、E2和E3。F：显示了多个靶向部分彼此直接相连和通过接头L连接于经接头L彼此相连的多个效应物。G：显示了多个靶向部分通过接头L彼此连接，和通过接头L连接于经接头L彼此相连的多个效应物。在各种实施方式中，T1、T2和T3和/或E1、E2和E3可以是融合蛋白的结构域。H：描述了多个靶向部分连接于单个效应物的分枝构型。I：描述了多个靶向部分连接于多个效应物的双重分枝构型。J：描述了多个靶向部分连接于多个效应物的分枝构型，其中所述效应物以线形构型彼此相连。
[0065] 图15描述了实施例1所用的各种MH-STAMP。M8(KH)-20(SEQ ID NO：4、5和6)、BL(KH)-20(SEQ ID 7、8和9)和M8(BL)-20(SEQ ID 10、11和12)的设计、序列和观测到的质量(m/z)。
[0066] 图16A和16B显示了M8(KH)-20的HPLC和MS图谱。通过HPLC(图16A)和MALDI*
质谱法(图16B)分析完整MH-STAMP的质量。通过HPLC( 保留体积11.04mL)检测了一种
主要产物的215nm紫外吸光度(也绘制了260和280nm的曲线)。组分收集后，观察到该峰*
的单电荷M8(KH)-20的正确质量(m/z)为4884.91(标记为 )。Y-轴：16A，mAU毫吸光度
单位；16B，强度百分比。
质谱法(图16B)分析完整MH-STAMP的质量。通过HPLC( 保留体积11.04mL)检测了一种
主要产物的215nm紫外吸光度(也绘制了260和280nm的曲线)。组分收集后，观察到该峰*
的单电荷M8(KH)-20的正确质量(m/z)为4884.91(标记为 )。Y-轴：16A，mAU毫吸光度
单位；16B，强度百分比。
[0067] 图17A-17E显示MH-STAMP的生长抑制活性。用肽(如图中所示)处理变形链球菌(图17A)；铜绿假单胞菌(图17B)；表皮葡萄球菌(图17C)；金黄色葡萄球菌(图17D)；
或大肠杆菌(图17E)的单一培养物10分钟。然后除去试剂，换回新鲜培养基。随时间检测培养回收物(OD600)。各图表示至少3次独立实验的平均值与标准偏差。
或大肠杆菌(图17E)的单一培养物10分钟。然后除去试剂，换回新鲜培养基。随时间检测培养回收物(OD600)。各图表示至少3次独立实验的平均值与标准偏差。
[0068] 图18显示了混合培养物中双重靶向和单一靶向MH-STAMP的选择活性。将铜绿假单胞菌(Pa)、变形链球菌(Sm)、大肠杆菌(Ec)和表皮葡萄球菌(Se)浮游细胞与MH-STAMP混合(如图中所示)并处理24小时。温育后，接种于选择性培养基，然后定量测定剩余组*成物种的cfu/mL。 表示回收的存活cfu/mL不到200。
[0069] 图19A和19B显示孟加拉红(图19A)和C16-RB的合成方案，为清楚起见省去了卤化物和侧链(图19B)。
[0070] 图20显示C 16-RB的LC/MS分布。通过LC/MS确认C16-RB的纯度和分子量。在11.92分钟观察到单一产物，质量为1040.8和1560.25道尔顿。预计的C16-RB质量：m/z
2+ 3+
＝3118，m /z＝1559，m /z＝1039。
2+ 3+
＝3118，m /z＝1559，m /z＝1039。
[0071] 图21显示RB和C16-RB对单一物种变形链球菌生物膜的活性。*表示回收少于100cfu/mL。
[0072] 图22显示变形链球菌-特异性C16-RB活性。蓝光照射后，C16-RB(而非单独的RB)优先消除变形链球菌，而非其它口腔葡萄球菌。
[0073] 发明详述
[0074] 在各种实施方式中，鉴定了特异性或优先结合特定微生物(例如，细菌、酵母菌、真菌等)的新型“靶向”肽。这些肽可单用于结合/捕捉，从而鉴定和/或分离特定靶微生物，或者它们可连接于一个或多个效应物(例如，药物、标记物等)并用作靶向部分，藉此提供优先或特异性递送该效应物至靶微生物、靶微生物群、微生物膜、生物膜等的嵌合部分。
[0075] 在各种实施方式中，提供的新型肽具有抵御某些细菌、真菌、酵母菌和/或病毒的抗微生物活性和/或具有抑制包含此类微生物的生物膜的生长或维持的活性。AMP可用于抑制微生物的生长和/或增殖和/或包含微生物的生物膜的生长和/或形成和/或维持。
[0076] 在某些实施方式中，可将靶向部分连接于抗微生物肽以形成特异性靶向抗-微生物肽(STAMP)。在某些实施方式中，将一个或多个靶向部分/肽连接于一个或多个抗微生物肽可缩小AMP的活性谱以提供针对一种或一些靶微生物的效力而不实质性破坏其余微生物的生态学特征，从而效力提高而副作用较少。
[0077] 在某些实施方式中，可递送抗病原性细菌的STAMP或效应物肽，通过在益生菌生物中克隆和表达以便在体内作治疗性递送。在细菌充分证明了抗微生物肽和其它肽的重组表达(和过度表达)和输出，包括也用作益生菌的物种。
[0078] 在各种实施方式中，可单独配制靶向肽、抗微生物肽和/或STAMP，彼此组合，与其它抗微生物肽组合和/或与各种抗菌剂组合以提供抗微生物试剂和/或药物。
[0079] 因此，在某些实施方式中，本发明提供具有抗微生物活性的肽，包含该肽的组合物，利用该肽(或其组合物)抑制多种微生物靶标的生长或杀伤其的方法和利用该肽(或其组合物)治疗或预防植物和动物中的微生物感染及相关疾病的方法。
[0080] 本文所述的各种肽(靶向肽、AMP、STAMP等)表现出抗微生物活性，其对某些微生物靶标具有抑菌或杀菌活性，所述微生物靶标包括但不限于：革兰氏阴细菌，例如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)；革兰氏阳性菌，例如内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(和
MRSA)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；和酵母菌或真菌，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、白色念珠菌(Candida albicans)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)和红色毛癣菌
(Trichophyton rubrum)(参见，例如表2)。本文所述的各种肽对于表现出多重耐药性的临床相关病原体例如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(“MRSA”)有抑菌或杀菌活性。
MRSA)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；和酵母菌或真菌，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、白色念珠菌(Candida albicans)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)和红色毛癣菌
(Trichophyton rubrum)(参见，例如表2)。本文所述的各种肽对于表现出多重耐药性的临床相关病原体例如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(“MRSA”)有抑菌或杀菌活性。
[0081] 表2.示范性靶微生物和相关病理学特性
[0082]
[0083]
[0084] 本文所述的各种物质(靶向肽、复合靶向肽、抗微生物肽(AMP)和/或复合AMP、STAMP和/或其它嵌合部分)或其组合物可在各种应用中用作杀菌剂或抑菌剂或杀真菌剂或抑真菌剂和/或杀病毒剂。例如，这些物质可用于消毒或保藏各种材料，包括医学仪器、食品、药物、化妆品和其它含营养物质的材料。本文所述的各种肽尤其可在各种临床环境中用作对抗多重耐药性病原体，例如MRAS的抑菌剂或杀菌剂。
[0085] 本文所述的物质或其组合物也可用于预防或治疗植物和动物中的微生物感染和相关疾病。此类疾病包括但不限于：革兰氏阴性和革兰氏阳性菌感染、心内膜炎、肺炎和其它呼吸道感染、尿路感染、全身性念珠菌病、口腔粘膜炎、真菌感染、生物膜形成或维持(例如，医学植入物上)等。
[0086] 在各种实施方式中，可单独配制本文所述物质、与彼此组合、与其它抗微生物肽组合和/或与各种抗生素(例如，抗细菌)剂组合成“家庭保健”制剂。此类制剂包括但不限于：牙膏、漱口水、牙齿增白条或溶液、隐形眼镜保存、润湿或清洁溶液、牙线、牙签、牙刷毛、口腔喷雾、口腔锭剂、鼻喷雾、口腔和/或鼻部应用的喷雾器、伤口敷料(例如，绷带)等。
[0087] 此类应用是说明性而非限制性的。利用本文提供的教导，技术人员可明白本文所述AMP和组合物的其它用途。
[0088] I.靶向肽
[0089] A)靶向肽的应用
[0090] 本文所述的新型微生物-结合肽(靶向肽)可用于将效应物优先或特异性递送给微生物(例如，细菌、真菌、原生动物、藻类等)、细菌膜、生物膜等。本文所述的靶向肽可用于结合特定靶标，从而标记该特定靶标，和/或作为捕捉试剂以结合靶微生物，从而提供靶微生物存在和/或数量的指示剂。在某些实施方式中，靶向肽可连接于效应物，例如抗原表位标签和/或可检测标记物，从而促进鉴定该靶标(例如，靶生物)的存在和/或位置和/或数量。因此，靶向部分易改进用于体内诊断和/或离体试验。此外，由于尺寸小和稳定性好，微生物结合肽非常适合微量分析系统(例如，微流体试验(芯片上的实验室)、微阵列试验等)。
[0091] 在某些实施方式中，所述微生物结合肽(靶向肽)可连接于具有抗微生物活性的效应物(例如，抗微生物肽、抗细菌和/或抗真菌剂，含有抗细菌或抗真菌剂的运载体，等等)。在各种实施方式中，这些嵌合部分可体内或离体应用以优先抑制或杀伤靶微生物。
[0092] 在某些实施方式中，可将靶向肽重组表达成酵母菌或噬菌体尾丝的一部分或外壳蛋白以增强该酵母菌或噬菌体与特定细菌革兰氏名称、属、种或菌株的结合。然后含表达肽的噬菌体对设计的靶细菌表现出改变的感染选择性以便用于噬菌体治疗。将编码感兴趣肽的DNA克隆入噬菌体的主要或次要外壳蛋白，例如噬菌体SAP-2、M13或T7的蛋白I到VIII中，产生在噬菌体表面表达1-200个拷贝靶向肽的靶向噬菌体。
[0093] 在某些实施方式中，靶向肽可用于各种预先靶向方案。在预先靶向方案中，利用包含基础靶向物质(例如，微生物结合肽)和效应物的嵌合分子，所述基础靶向物质特异性结合所需靶标(例如，细菌)，所述效应物为与随后施用的第二靶向物质结合提供可用的结合位点。一旦基础靶向物质(嵌合分子)获得充分累积，施用包含(i)诊断或治疗剂和(ii)第二靶向部分的第二靶向物质，其识别基础靶向物质的可用结合位点。
[0094] 预先靶向方案的示范性例子是生物素-亲和素系统，用于将细胞毒性放射性核素给予肿瘤。在典型的过程中，将靶向肿瘤相关抗原的单克隆抗体偶联于亲和素，给予具有该抗体识别的肿瘤的患者。然后，施用治疗剂，例如螯合的放射性核素共价结合的生物素。放射性核素通过其相连的生物素被预先靶向肿瘤的抗体-亲和素缀合物所吸收。预先靶向生物素/亲和素方案的例子描述于，例如Goodwin等.，美国专利4,863,713；
Goodwin 等 .(1988)J.Nucl.Med.29：226；Hnatowich 等 .(1987)J.Nucl.Med.28：1294；
Oehr等.(1988)J.Nucl.Med.29：728；Klibanov等.(1988)J.Nucl.Med.29：1951；Sinitsyn等 .(1989)J.Nucl.Med.30：66；Kalofonos 等 .(1990)J.Nucl.Med.31：1791；Schechter等.(1991)Int.J.Cancer 48：167；Paganelli等.(1991)Cancer Res.51：5960；Paganelli等.(1991)Nucl.Med.Commun.12：211；Stickney等.(1991)Cancer Res.51：6650；和Yuan等.(1991)Cancer Res.51：3119。
Goodwin 等 .(1988)J.Nucl.Med.29：226；Hnatowich 等 .(1987)J.Nucl.Med.28：1294；
Oehr等.(1988)J.Nucl.Med.29：728；Klibanov等.(1988)J.Nucl.Med.29：1951；Sinitsyn等 .(1989)J.Nucl.Med.30：66；Kalofonos 等 .(1990)J.Nucl.Med.31：1791；Schechter等.(1991)Int.J.Cancer 48：167；Paganelli等.(1991)Cancer Res.51：5960；Paganelli等.(1991)Nucl.Med.Commun.12：211；Stickney等.(1991)Cancer Res.51：6650；和Yuan等.(1991)Cancer Res.51：3119。
[0095] 应该知道可用本发明的微生物结合肽替换用于癌症治疗的肿瘤特异性抗体，可采用类似的预先靶向方案将标记物、抗生素等引导至靶生物。
[0096] 三步预先靶向方案也已见诸描述，其中在第一靶向组合物定位于靶位点后给予清除剂。该清除剂结合并除去未结合在靶位点的循环基础缀合物，防止循环基础靶向物质(例如，抗体-亲和素或缀合物)通过竞争活性剂-缀合物上的结合位点而干扰活性物质(生物素-活性剂缀合物)靶向靶位点。当抗体-亲和素用作基础靶向部分时，可通过注射生物素化聚合物，例如生物素化人血清白蛋白来清除过量的循环缀合物。该类试剂与循环亲和素-抗体缀合物形成肝胆管系统快速识别并主要沉积在肝脏中的高分子量物质。
[0097] 公开了这些方案的实施例，例如PCT申请号WO 93/25240；Paganelli等.(1991)Nucl.Med.Comm.，12：211-234；Oehr 等 .(1988)J.Nucl.Med.，29：728-729；Kalofonos等.(1990)J.Nucl.Med.，31：1791-1796；Goodwin等.(1988)J.Nucl.Med.，29：226-234；等等)。
[0098] 本发明微生物结合肽的这些应用应是示范性而非限制性的。采用本文提供的教导，本领域技术人员会知道其它应用。
[0099] B)示范性的新型靶向肽
[0100] 在某些实施方式中，靶向部分包含结合特定细菌、真菌和/或酵母菌和/或藻类和/或病毒和/或结合特定细菌群和/或真菌群和/或酵母菌群和/或藻类群的一个或多个靶向肽。
[0101] 在某些实施方式中，靶向肽包括含有表3所示一种或多种氨基酸序列(SEQ ID NO：13-1566)或由它们组成的肽。在各种实施方式中，肽包括含有表3所示一种或多种氨基酸序列的逆、反向、逆反向和/或β形式，或由其组成的肽。还包括环形排列的这些序列以及含有此类环形排列的逆、反向、逆反向和/或β形式，或由其组成的肽。
[0102] 还应知道，在某些实施方式中，本文所述的任何肽或复合AMP可以是环形的。
[0103] 在各种实施方式中，肽可任选携带一个或多个保护基团，例如氨基和/或羧基末端，和/或在侧链上。
[0104] 还考虑了包含这些氨基酸序列的1、2、3、4或5个保守性取代的肽。
[0105] 表3.新型靶向肽的示范性列表
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
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[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217] *在根据肽溶解度改变的水性缓冲液中进行肽结合。例如：脑心浸液(BHI)培养基；1X磷酸缓冲盐水(PBS)；0.05％v/v吐温-20；0.05％v/v吐温-80；1％v/v甘油；50μM盐酸胍；0.05％v/v乙酸；50μM脲；1％v/v聚乙二醇400(PEG 400)；20mM谷氨酸钠；50mM哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)(PIPES)；50mM乙酸钠；1％v/v聚醚17R4；1％w/v聚醚F108；1％w/v聚醚P123；0.2％v/v十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；0.8％v/v β-D-辛基葡糖
苷(BOG)；0.2％CTAB和0.05％吐温-20；0.2％CTAB和0.05％吐温-80；0.2％CTAB和1％甘油；和20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，150mM氯化钠，1mM氯化镁和0.1％CTAB。优选在1x PBS中评估结合。
苷(BOG)；0.2％CTAB和0.05％吐温-20；0.2％CTAB和0.05％吐温-80；0.2％CTAB和1％甘油；和20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，150mM氯化钠，1mM氯化镁和0.1％CTAB。优选在1x PBS中评估结合。
[0218] **三氨基酸密码：Dab：二氨基丁酸；Orn：鸟氨酸；cDOrn、cOrn：侧链环状鸟氨酸；缩写：c(X…Y)表明氨基酸是环状的，X连接于Y；DX表示D-同种型氨基酸。
[0219] 在某些实施方式中，靶向肽的氨基酸序列包含一种氨基酸序列或由其构成，例如以上表3中所列的。在某些实施方式中，靶向肽的氨基酸序列包含两拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝、六拷贝或更多拷贝的表3和/或表10和/或表12所列一种或多种氨基酸序列。因此，考虑的复合靶向构建物包含多个各自具有靶向活性的结构域。构成此类构建物的靶向结构域可以相同或不同。在某些实施方式中，所述构建物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个不同的靶向结构域，各结构域包含不同的靶向序列。
[0220] 构成此类构建物的各种靶向结构域可直接彼此相连，或者两个或更多个此类结构域可经接头彼此相连。示范性但非限制性的合适接头列表见表16。因此，在一些实施方式中，构成复合/多重靶向构建物的两个或更多靶向结构域化学偶联在一起。
[0221] 在某些实施方式中，构成所述构建物的两个或更多靶向结构域经肽接头连接。如果所有的靶向结构域直接彼此相连或经肽接头连接，提供的完整构建物是单链肽(融合蛋白)。
[0222] 在各种实施方式中，本文所述的靶向肽包含表3和/或表10和/或表12所示的一种或多种氨基酸序列(和/或此类序列的逆、反向或逆反向等形式)。在某些实施方式中，所述肽长度至多约100个氨基酸，优选至多约80、约70、约60或约51个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽的长度从约8个氨基酸到至多约100个氨基酸，约80个氨基酸、约60个氨基酸或约51个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽的长度从约8个到至多约50、40、30、20、15、15、13或12个氨基酸。
[0223] 如表3、10和12所示，本文所述的各种氨基酸序列靶向特定微生物。可通过包含靶向不同微生物的氨基酸序列作为单独组分和/或作为一个构建物内的多个结构域来增加肽或包含此类肽的组合物的活性范围。
[0224] 在一些实施方式中，通过包含靶向同一微生物的多个不同氨基酸序列获得较高特异性和/或亲合力。
[0225] II.抗微生物肽
[0226] A)抗微生物肽的用途
[0227] 本文所述的抗微生物肽还具有多种应用。例如，这些肽可单独配制、组合配制、与其它抗微生物肽组合组合配制和/或与各种抗菌剂组合配制以提供抗微生物药物。
[0228] 在各种实施方式中，本文所述抗微生物肽可单独配制、组合配制、与其它抗微生物肽组合配制和/或与各种抗生素(例如，抗细菌)剂组合配制成“家庭保健”制剂。此类制剂包括但不限于：牙膏、漱口水、牙齿增白条或溶液、隐形眼镜保存、润湿或清洁溶液、牙线、牙签、牙刷毛、口腔喷雾、口腔锭剂、鼻喷雾、口腔和/或鼻部应用的喷雾器、伤口敷料(例如，绷带)等。
[0229] 在各种实施方式中，本文所述抗微生物肽可单独配制、组合配制、与其它抗微生物肽组合配制和/或与各种抗生素(例如，抗细菌)剂组合配制成各种清洁和/或灭菌制剂以便用于农业、食物制备和运输、家用、工作场所、诊所或医院。
[0230] 在某些实施方式中，本文所述的抗微生物肽连接于一个或多个靶向部分以便将所述肽特异性和/或优先递送至靶标(例如，靶微生物、生物膜、细菌膜、特定组织等)。
[0231] 本文公开的靶向和/或抗微生物肽的其它可能应用包括但不限于：生物膜分散、生物膜保持、生物膜形成、抗生物膜形成、细胞凝集、诱导运动性或运动性类型改变、化学引诱物或化学排斥物、孢子发生或其它形态改变的胞外信号、诱导或抑制毒力基因表达、用作胞外支架、粘附或结合位点、诱导或抑制宿主免疫应答、诱导或抑制细菌/真菌抗微生物分子生成、群体感应、诱导聚集行为、真核细胞中的凋亡或坏死诱导、影响对真核生物、古细菌或原核生物细胞周期的控制或诱导其开启、诱导自溶或程序性细胞死亡、抑制噬菌体/病毒连接或复制、逃避先天免疫、诱导或抑制遗传转化或转导感受态、诱导或抑制纤毛介导的偶联、诱导或抑制细菌和真菌中的交配行为、诱导或抑制结节形成或代谢区域化、金属、离子或营养物质结合、获取或抑制金属、离子或营养物质结合和获取，等等。
[0232] 在某些实施方式中，提供了组合物和方法用于降低各种病原体相关的传染性、发病率和死亡率。本发明还涉及净化受病原体和微生物寄居或感染的区域、样品、溶液和食物的方法和组合物。本发明组合物的某些实施方式是无毒的，人和其它动物可安全摄入。此外，本发明的某些实施方式在化学上稳定，不染色。
[0233] 在一些实施方式中，本发明提供的组合物和方法适合治疗暴露于病原体或病原体威胁下的动物，包括人。在一些实施方式中，所述动物先接触有效量的组合物，再暴露于病原性生物。在其它实施方式中，所述动物或人在暴露于病原性生物后接触有效量的组合物。因此，本发明考虑了预防和治疗微生物和其它感染。
[0234] 在某些实施方式中，提供组合物和方法来净化暴露于病原体或怀疑含有病原体的溶液和表面，包括有机和无机样品。在本发明的其它实施方式中，所述组合物用作添加剂以防止生物和环境样品中有害或不良微生物的生长。
[0235] 本文所述肽的这些应用是示范性而非限制性的。采用本文提供的讲授，本领域技术人员了解其它应用。
[0236] B.示范性的新型抗微生物肽
[0237] 抗微生物肽(也称为宿主防御肽)是先天免疫反应的进化保守组分，在所有生命类别中均有发现。未修饰的这些肽是强效的广谱抗生素，证明其有可能作为新型治疗剂。现已证明抗微生物肽能杀伤革兰氏阴性和革兰氏阳性菌(包括耐受常规抗生素的菌株)、分枝杆菌(包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、有被膜的病毒和真菌。
[0238] 天然产生的抗微生物肽通常是12-50个氨基酸的短肽。这些肽常包含两个或更多由精氨酸、赖氨酸或在酸性环境中由组氨酸提供的带正电残基，还常包含大量(一般＞50％)疏水性残基(参见，例如Papagianni等.(2003)Biotechnol Adv 21：465；Sitaram和Nagaraj(2002)Curr Pharm Des 8：727；Dürr等.(2006)Biochim.Biophys.Acta 1758：
1408-1425)。
1408-1425)。
[0239] 这些分子的二级结构常遵循4类，包括i)α-螺旋，ii)存在2个或更多二硫键所致的β-链，iii)存在一个二硫键和/或肽链环化所致的β-发夹或环，和iv)延伸。许多这些肽在游离溶液中是无结构的，分配入生物膜后折叠成其最终的构型。与膜相联的能力是抗微生物肽的决定特征，虽然膜透化不必要。这些肽具有从膜透化到作用于一系列胞质靶标的各种抗微生物活性。
[0240] 抗微生物肽杀伤细菌的作用模式不同，包括但不限于：破坏膜、干扰代谢和靶向胞质组分。在许多情况中，确切的杀伤机理未知。
[0241] 在某些实施方式中，所述抗微生物肽包括含有表4(SEQ ID NO：1029-1078)和/或表5(SEQ ID NO：1079-1566)所示一种或多种氨基酸序列，或由它们构成的肽。在各种实施方式中，所述肽包括含有表4(SEQ ID NO：1029-1078)和/或表5(SEQ ID NO：1079-1566)所示一种或多种氨基酸序列的的逆、反向、逆反向和/或β形式，或由它们构成的肽。所述肽可全部包含“L”氨基酸、“D”氨基酸，或包含“L”和“D”氨基酸的组合。还包括环形排列的这些序列以及含有此类环形排列的逆、反向、逆反向和/或β形式，或由其构成的肽。
[0242] 还应知道，在某些实施方式中，本文所述的任何肽或复合AMP可以环化。
[0243] 在各种实施方式中，所述肽可任选具有一个或多个保护基团，例如在氨基和/或羧基末端和/或侧链上。
[0244] 还考虑了包含这些氨基酸序列的1、2、3、4或5个保守性取代的肽。
[0245] 表4.新型抗微生物肽、靶微生物和MIC值
[0246]
[0247]
[0248]
[0249] 如果显示保护基团(例如，-NH2)，它们是任选的。相反，显示没有保护基团的任何肽可具有一个或多个此类基团。
[0250] 在某些实施方式中，诱导表型或其它生物学活性改变的肽还可用作抗微生物效应部分。表5显示了示范性的其它肽。
[0251] 表5.新形态、生物膜和生长破坏性肽的示范性列表。
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
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[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
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[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
[0293]
[0294] 缩写关键词：(A)肽聚集体；(B)菌丝形成较少；(C)团块；(D)弥漫性团块和小息肉；(F)弥漫性生长；(H)薄的；(I)生长抑制；(M)微菌落形成；(R)起皱纹；(S)小息肉；(T)厚的；(W)在顶部形成晕圈，在底部形成微菌落。因此，这些数据表明细菌生物膜形成过程、细胞代谢、细胞输入/输出、营养物获取、群体感应和通信、运动性、趋化作用、复制、翻译和/或转录的肽介导破坏。因此，不局限于特定的理论，认为这些基础途径中一种或多种的改变对于发病机理或其停止至关重要。
[0295] 在某些实施方式中，所述抗微生物肽的氨基酸序列包含单一氨基酸序列或由其构成，例如上表4和/或5和/或下表14所列。在某些实施方式中，所述抗微生物肽的氨基酸序列包含两拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝、六拷贝或更多的表4和/或5和/或表15和/或表14所列氨基酸序列中的一种或多种序列。因此，考虑了复合抗微生物构建物，其中该构建物包含各自具有抗微生物活性的多个结构域。构成此类构建物的AMP结构域可以相同或不同。在某些实施方式中，该构建物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、或至少8个各自包含不同AMP序列的不同AMP结构域。
[0296] 构成此类构建物的各种AMP结构域可直接彼此连接或者两个或更多此类结构域可经接头彼此连接。表16提供了合适接头的示范性但非限制性列表。因此，在某些实施方式中，构成复合AMP构建物的两个或更多AMP结构域通过化学方法偶联在一起。
[0297] 在某些实施方式中，构成AMP构建物的两个或更多AMP结构域通过肽接头相连。如果所有的AMP结构域直接彼此相连或经肽接头连接，提供的完整构建物是单链肽(融合蛋白)。
[0298] 在各种实施方式中，本文所述的抗微生物肽包含表4和/或5和/或15和/或表14所示的一种或多种氨基酸序列(和/或此类序列的逆、反向或逆反向等形式)。在某些实施方式中，所述肽长度最多约100个氨基酸，优选最多约80、约70、约60或约51个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽的长度从约8个氨基酸到最多约100个氨基酸，约80个氨基酸、约60个氨基酸或约51个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽的长度从约8个到最多约50、40、30、20、15、15、13或12个氨基酸。
[0299] 如表4和/或5和/或15和/或14所示，本文所述的各种氨基酸序列有效针对特定微生物。可通过包含有效针对不同微生物的氨基酸序列作为单独组分和/或作为单一构建物内的多个结构域来增加肽或包含此类肽的组合物的活性。
[0300] 表6.示范性靶微生物和有效抵御该靶标的肽
[0301]
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306] 在某些实施方式中，可通过增加具有抵御特定微生物或微生物群的活性的肽或肽结构域的数量来增加抵御特定微生物或微生物群的活性。
[0307] 因此，例如，在某些实施方式中，有效杀伤或抑制酵母菌或真菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域具有的序列选自表4、5或6所示序列(例如，PF-S003，PF-053，PF-056，PF-057，PF-071，PF-140，PF-148，PF-168，PF-175，PF-278，PF-283，PF-307，PF-425，PF-426，PF-448，PF-474，PF-475，PF-525，PF-526，PF-527，PF-528，PF-529，PF-531，PF-545，PF-547，PF-606，PF-617，PF-627，PF-632，PF-635，PF-636，PF-639，PF-640，PF-645，PF-646，PF-647，PF-654，PF-668，PF-672，PF-684，PF-686，PF-697，和PF-69)8。有效杀伤或抑制黑曲霉生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域具有选自下组的序列：PF-531、PF-527、PF-672、PF-545、PF-168、PF-448、PF-525、PF-529和PF-148。有效杀伤或抑制白色念珠菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域具有选自下组的序列：PF-053，PF-056，PF-057，PF-071，PF-140，PF-148，PF-175，PF-278，PF-307，PF-425，PF-426，PF-474，PF-475，PF-526，PF-527，PF-528，PF-545，PF-605，PF-606，PF-617，PF-627，PF-632，PF-635，PF-636，PF-639，PF-640，PF-645，PF-646，PF-647，PF-654，PF-668，PF-672，PF-684，PF-686，PF-697，PF-698，和PF-S003。有效杀伤或抑制红色毛癣菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域具有选自下组的序列：PF-283，PF-307，PF-527，PF-531，PF-547和PF-672。
[0308] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制细菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗细菌活性的序列，或由其组成。
[0309] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制革兰氏阳性菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗革兰氏阳性菌活性的序列，或由其构成。在某些实施方式中，有效杀伤或抑制革兰氏阴性菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗革兰氏阴性菌活性的序列，或由其组成。
[0310] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制内氏放线菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗内氏放线菌活性的序列(例如，来自由PF-531，PF-527，PF-672，PF-545，PF-168，PF-448，PF-525，PF-529和PF-148构成的组)，或由其组成。
[0311] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制枯草芽胞杆菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗枯草芽胞杆菌活性的序列(例如，来自由PF-002，PF-005，PF-006，PF-040，PF-053，PF-056，PF-061，PF-063，PF-067，PF-068，PF-069，PF-070，PF-071，PF-145，PF-148，PF-171，PF-175，PF-283，PF-289，PF-292，PF-296，PF-297，PF-301，PF-303，PF-305，PF-306，PF-307，PF-318，PF-319，PF-322，PF-335，PF-339，PF-342，PF-497，PF-499，PF-527，PF-531，PF-545，PF-547，PF-548，PF-549，PF-550，PF-552，PF-553，PF-554，PF-556，PF-557，PF-558，PF-559，PF-560，PF-561，PF-563，PF-564，PF-565，PF-566，PF-569，PF-571，PF-572，PF-574，PF-632，PF-636，PF-655，PF-659，PF-668，PF-670，PF-672，PF-686，PF-998和PF-2003构成的组)，或由其组成。
[0312] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制艰难梭菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗艰难梭菌活性的序列(例如，来自由PF-522，PF-531和PF-538构成的组)，或由其组成。
[0313] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制杰氏棒状杆菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗杰氏棒状杆菌活性的序列(例如，来自由PF-001，PF-003，PF-004，PF-101，PF-011，PF-012，PF-013，PF-021，PF-022，PF-025，PF-028，PF-030，PF-032，PF-033，PF-036，PF-037，PF-040，PF-042，PF-043，PF-046，PF-048，PF-052，PF-053，PF-056，PF-057，PF-063，PF-065，PF-067，PF-068，PF-073，PF-075，PF-076，PF-099，PF-124，PF-127，PF-129，PF-133，PF-135，PF-137，PF-139，PF-140，PF-145，PF-148，PF-164，PF-173，PF-176，PF-186，PF-188，PF-190，PF-191，PF-196，PF-199，PF-203，PF-204，PF-208，PF-527，PF-531，PF-545，PF-546，PF-548，PF-553，PF-556，PF-564，PF-566，PF-567，PF-575，PF-622，PF-523，PF-629，PF-632，PF-635，PF-637，PF-657，PF-668，PF-672，PF-681，PF-685和PF-S003构成的组)，或由其组成。
[0314] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制粪肠球菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗粪肠球菌活性的序列(例如，来自由PF-007，PF-053，PF-057，PF-068，PF-347，PF-349，PF-355，PF-356，PF-363，PF-366，PF-369，PF-374，PF-375，PF-376，PF-379，PF-380，PF-381，PF-386，PF-387，PF-389，PF-390，PF-392，PF-393，PF-394，PF-396，PF-398，PF-399，PF-401，PF-407，PF-410，PF-411，PF-418，PF-422，PF-425，PF-426，PF-427，PF-429，PF-431，PF-432，PF-439，PF-440，PF-444，PF-447，PF-450，PF-451，PF-452，PF-454，PF-456，PF-460，PF-461，PF-469，PF-470，PF-471，PF-472，PF-473，PF-474，PF-475，PF-480，PF-484，PF-514，PF-518，PF-519，PF-524，PF-530，PF-532，PF-533，PF-534，PF-536，PF-544，PF-545，PF-546，PF-547，PF-556，PF-577，PF-581，PF-582，PF-584，PF-585，PF-586，PF-588，PF-591，PF-592，PF-593，PF-594，PF-595，PF-596，PF-597，PF-598，PF-599，PF-601，PF-602，PF-604，PF-605，PF-607，PF-609，PF-610，PF-613，PF-614，PF-615，PF-616，PF-617，PF-618，PF-621，PF-622，PF-623，PF-627，PF-629，PF-631，PF-632，PF-635，PF-636，PF-637，PF-638，PF-639，PF-640，PF-643，PF-649，PF-657，PF-664，PF-667，PF-668，PF-672，PF-675，PF-677，PF-681，PF-684，PF-685，PF-686，PF-690，PF-695和PF-698构成的组)，或由其组成。
[0315] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制藤黄微球菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗藤黄微球菌活性的序列(例如，来自由PF-001，PF-003，PF-004，PF-006，PF-007，PF-010，PF-012，PF-013，PF-020，PF-021，PF-022，PF-025，PF-030，PF-036，PF-037，PF-040，PF-042，PF-043，PF-051，PF-052，PF-053，PF-056，PF-057，PF-063，PF-067，PF-068，PF-071，PF-073，PF-075，PF-076，PF-125，PF-127，PF-137，PF-139，PF-140，PF-145，PF-148，PF-171，PF-175，PF-176，PF-199，PF-204，PF-212，PF-215，PF-224，PF-226，PF-234，PF-235，PF-249，PF-250，PF-255，PF-257，PF-264，PF-270，PF-271，PF-274，PF-276，PF-278，PF-357，PF-527，PF-543，PF-548，PF-556，PF-562，PF-566，PF-567，PF-578，PF-580，PF-600，PF-603，PF-612，PF-624，PF-634，PF-741，PF-745，PF-746，PF-761，PF-763，PF-770，PF-776和PF-S003构成的组)，或由其组成。
[0316] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制MRSA生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗MRSA活性的序列(例如，来自由PF-001，PF-003，PF-004，PF-006，PF-007，PF-010，PF-011，PF-012，PF-013，PF-015，PF-017，PF-019，PF-020，PF-021，PF-022，PF-023，PF-024，PF-025，PF-026，PF-027，PF-028，PF-029，PF-030，PF-031，PF-033，PF-035，PF-036，PF-037，PF-040，PF-041，PF-042，PF-043，PF-045，PF-046，PF-048，PF-049，PF-051，PF-052，PF-053，PF-056，PF-057，PF-058，PF-063，PF-064，PF-065，PF-066，PF-067，PF-068，PF-071，PF-073，PF-074，PF-075，PF-076，PF-140，PF-145，PF-148，PF-149，PF-156，PF-168，PF-171，PF-178，PF-191，PF-209，PF-347，PF-349，PF-350，PF-354，PF-355，PF-356，PF-357，PF-360，PF-362，PF-366，PF-369，PF-370，PF-373，PF-374，PF-375，PF-376，PF-378，PF-379，PF-380，PF-381，PF-382，PF-386，PF-387，PF-389，PF-390，PF-392，PF-393，PF-394，PF-395，PF-396，PF-398，PF-399，PF-401，PF-403，PF-404，PF-405，PF-406，PF-407，PF-408，PF-410，PF-411，PF-413，PF-417，PF-418，PF-422，PF-425，PF-426，PF-427，PF-429，PF-430，PF-431，PF-432，PF-439，PF-440，PF-442，PF-443，PF-444，PF-447，PF-450，PF-451，PF-452，PF-453，PF-454，PF-458，PF-460，PF-461，PF-469，PF-471，PF-472，PF-473，PF-474，PF-475，PF-478，PF-480，PF-518，PF-519，PF-524，PF-526，PF-527，PF-528，PF-530，PF-532，PF-533，PF-534，PF-536，PF-539，PF-540，PF-543，PF-544，PF-545，PF-546，PF-547，PF-548，PF-549，PF-551，PF-553，PF-555，PF-556，PF-558，PF-560，PF-561，PF-562，PF-564，PF-565，PF-566，PF-567，PF-576，PF-577，PF-578，PF-580，PF-581，PF-583，PF-584，PF-585，PF-586，PF-589，PF-592，PF-595，PF-596，PF-598，PF-599，PF-600，PF-603，PF-605，PF-606，PF-607，PF-609，PF-610，PF-612，PF-613，PF-615，PF-619，PF-622，PF-623，PF-624，PF-627，PF-629，PF-630，PF-632，PF-634，PF-635，PF-637，PF-638，PF-639，PF-652，PF-643，PF-654，PF-655，PF-656，PF-657，PF-658，PF-659，PF-661，PF-664，PF-667，PF-778，PF-672，PF-677，PF-680，PF-683，PF-685，PF-686，PF-690，PF-692，PF-694，PF-695，PF-738，PF-741，PF-745，PF-746，PF-760，PF-761，PF-763，PF-764，PF-770，PF-776和PF-S003构成的组)，或由其组成。
[0317] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制表皮葡萄球菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗表皮葡萄球菌活性的序列(例如，来自由PF-001，PF-003，PF-004，PF-006，PF-007，PF-009，PF-010，PF-012，PF-013，PF-020，PF-021，PF-022，PF-024，PF-025，PF-027，PF-028，PF-030，PF-032，PF-033，PF-034，PF-036，PF-037，PF-040，PF-041，PF-042，PF-043，PF-046，PF-048，PF-051，PF-052，PF-953，PF-956，PF-957，PF-961，PF-963，PF-964，PF-965，PF-967，PF-968，PF-971，PF-073，PF-074，PF-075，PF-076，PF-099，PF-123，PF-124，PF-125，PF-127，PF-128，PF-129，PF-137，PF-139，PF-140，PF-145，PF-148，PF-153，PF-157，PF-171，PF-173，PF-176，PF-178，PF-180，PF-186，PF-190，PF-191，PF-192，PF-196，PF-199，PF-203，PF-204，PF-208，PF-209，PF-226，PF-233，PF-273，PF-278，PF-283，PF-290，PF-292，PF-293，PF-294，PF-296，PF-297，PF-301，PF-307，PF-310，PF-313，PF-318，PF-319，PF-322，PF-335，PF-339，PF-342，PF-347，PF-349，PF-350，PF-355，PF-356，PF-357，PF-360，PF-363，PF-366，PF-369，PF-370，PF-373，PF-374，PF-375，PF-376，PF-378，PF-379，PF-380，PF-381，PF-383，PF-386，PF-387，PF-389，PF-390，PF-393，PF-395，PF-396，PF-397，PF-398，PF-399，PF-401，PF-403，PF-404，PF-406，PF-407，PF-408，PF-410，PF-411，PF-413，PF-417，PF-418，PF-422，PF-425，PF-246，PF-249，PF-430，PF-431，PF-432，PF-439，PF-440，PF-444，PF-447，PF-451，PF-452，PF-453，PF-454，PF-460，PF-469，PF-471，PF-473，PF-474，PF-475，PF-478，PF-480，PF-514，PF-518，PF-526，PF-527，PF-528，PF-530，PF-531，PF-533，PF-534，PF-536，PF-540，PF-543，PF-544，PF-546，PF-547，PF-548，PF-556，PF-558，PF-562，PF-576，PF-577，PF-578，PF-580，PF-583，PF-584，PF-585，PF-586，PF-592，PF-595，PF-596，PF-598，PF-599，PF-600，PF-603，PF-605，PF-606，PF-607，PF-610，PF-612，PF-613，PF-614，PF-615，PF-616，PF-619，PF-622，PF-623，PF-624，PF-627，PF-632，PF-634，PF-635，PF-637，PF-638，PF-655，PF-657，PF-659，PF-664，PF-667，PF-778，PF-672，PF-677，PF-681，PF-683，PF-685，PF-686，PF-690，PF-741，PF-746，PF-760，PF-761，PF-763，PF-770，PF-776和PF-S003构成的组)，或由其组成。
[0318] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制变形链球菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗变形链球菌活性的序列(例如，来自由G-1，G-2，G-4，G-8，PF-020，PF-040，PF-051，PF-531，PF-543，PF-547，PF-578，PF-583，PF-600，PF-606，PF-612，PF-624，PF-634，PF-741，PF-745，PF-746，PF-761，PF-770，PF-776，PF-C055，PF-C057，PF-C058，PF-C061，PF-C062，PF-C072，PF-C075，PF-C084，PF-C085，PF-C088，PF-C098，PF-C 131，PF-C135，PF-C139，PF-C142，PF-C146，PF-C180，PF-C194，PF-C281，PF-C290，PF-C291，PF-C293构成的组)，或由其组成。
[0319] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制肺炎链球菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗肺炎链球菌活性的序列(例如，来自由PF-002，PF-005，PF-006，PF-020，PF-033，PF-040，PF-051，PF-053，PF-056，PF-057，PF-061，PF-063，PF-068，PF-071，PF-073，PF-140，PF-144，PF-145，PF-148，PF-171，PF-175，PF-178，PF-220，PF-355，PF-356，PF-357，PF-363，PF-366，PF-380，PF-389，PF-390，PF-393，PF-407，PF-411，PF-414，PF-415，PF-416，PF-417，PF-418，PF-419，PF-421，PF-422，PF-423，PF-424，PF-425，PF-426，PF-427，PF-428，PF-429，PF-430，PF-431，PF-432，PF-433，PF-434，PF-437，PF-439，PF-440，PF-442，PF-443，PF-444，PF-445，PF-446，PF-447，PF-448，PF-449，PF-450，PF-451，PF-452，PF-453，PF-454，PF-455，PF-457，PF-458，PF-469，PF-460，PF-461，PF-462，PF-464，PF-465，PF-466，PF-467，PF-468，PF-469，PF-471，PF-472，PF-473，PF-474，PF-475，PF-476，PF-477，PF-478，PF-479，PF-480，PF-482，PF-485，PF-511，PF-512，PF-513，PF-514，PF-515，PF-516，PF-517，PF-518，PF-519，PF-520，PF-521，PF-522，PF-523，PF-524，PF-525，PF-526，PF-527，PF-528，PF-529，PF-530，PF-531，PF-532，PF-533，PF-534，PF-535，PF-536，PF-537，PF-538，PF-539，PF-540，PF-541，PF-542，PF-543，PF-544，PF-546，PF-548，PF-553，PF-555，PF-556，PF-558，PF-560，PF-562，PF-563，PF-566，PF-567，PF-572，PF-573，PF-575，PF-576，PF-577，PF-578，PF-580，PF-581，PF-583，PF-585，PF-585，PF-586，PF-587，PF-589，PF-591，PF-592，PF-595，PF-596，PF-598，PF-599，PF-600，PF-603，PF-605，PF-606，PF-607，PF-609，PF-610，PF-612，PF-614，PF-615，PF-617，PF-618，PF-619，PF-621，PF-622，PF-623，PF-624，PF-625，PF-626，PF-627，PF-629，PF-631，PF-632，PF-634，PF-635，PF-636，PF-637，PF-638，PF-639，PF-640，PF-643，PF-644，PF-645，PF-646，PF-647，PF-651，PF-652，PF-653，PF-654，PF-655，PF-657，PF-658，PF-659，PF-660，PF-662，PF-663，PF-664，PF-665，PF-666，PF-667，PF-668，PF-670，PF-672，PF-675，PF-677，PF-681，PF-682，PF-683，PF-684，PF-685，PF-686，PF-687，PF-688，PF-690，PF-691，PF-693，PF-694，PF-695，PF-696，PF-697，PF-698，PF-699，PF-700，PF-702，PF-704，PF-737，PF-741，PF-744，PF-745，PF-746，PF-748，PF-749，PF-752，PF-756，PF-757，PF-760，PF-761，PF-762，PF-763，PF-764，PF-770，PF-776和PF-S003构成的组)，或由其组成。
[0320] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制鲍氏不动杆菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗鲍氏不动杆菌活性的序列(例如，来自由PF-531，PF-006，PF-538和PF-530构成的组)，或由其组成。
[0321] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制空肠弯曲菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗空肠弯曲菌活性的序列(例如，来自由PF-006，PF-008，PF-033，PF-040，PF-053，PF-056，PF-057，PF-059，PF-061，PF-063，PF-067，PF-068，PF-069，PF-071，PF-073，PF-140，PF-145，PF-148，PF-171，PF-175，PF-355，PF-356，PF-363，PF-366，PF-380，PF-389，PF-390，PF-392，PF-393，PF-411，PF-418，PF-422，PF-425，PF-426，PF-431，PF-432，PF-456，PF-469，PF-470，PF-471，PF-472，PF-473，PF-474，PF-475，PF-527，PF-548，PF-555，PF-556，PF-558，PF-559，PF-560，PF-562，PF-563，PF-564，PF-566，PF-567，PF-575，PF-576，PF-577，PF-581，PF-584，PF-585，PF-586，PF-590，PF-591，PF-592，PF-595，PF-596，PF-598，PF-599，PF-601，PF-605，PF-607，PF-609，PF-610，PF-614，PF-615和PF-S003构成的组)，或由其构成。
[0322] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制大肠杆菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗大肠杆菌活性的序列(例如，PF-007，PF-040，PF-053，PF-057，PF-068，PF-178，PF-344，PF-347，PF-349，PF-350，PF-355，PF-360，PF-362，PF-363，PF-366，PF-369，PF-370，PF-374，PF-375，PF-376，PF-379，PF-380，PF-381，PF-383，PF-385，PF-386，PF-387，PF-390，PF-395，PF-396，PF-398，PF-399，PF-401，PF-403，PF-410，PF-411，PF-413，PF-418，PF-425，PF-426，PF-427，PF-432，PF-439，PF-440，PF-443，PF-444，PF-451，PF-452，PF-453，PF-454，PF-460，PF-469，PF-471，PF-473，PF-474，PF-478，PF-480，PF-514，PF-518，PF-519，PF-524，PF-526，PF-528，PF-530，PF-531，PF-532，PF-533，PF-534，PF-536，PF-540，PF-541，PF-543，PF-546，PF-576，PF-577，PF-578，PF-584，PF-586，PF-592，PF-595，PF-596，PF-598，PF-600，PF-603，PF-605，PF-606，PF-610，PF-612，PF-615，PF-619，PF-624，PF-634，PF-741，PF-746，PF-761，PF-770和PF-776构成的组)，或由其组成。
[0323] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制具核梭杆菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗具核梭杆菌活性的序列(例如，来自由PF-C055，PF-C061，PF-C062，PF-C064，PF-C065，PF-C069，PF-C071，PF-C072，PF-C075，PF-C084，PF-C086，PF-C088，PF-C091，PF-C095，PF-C098，PF-C120，PF-C131，PF-C135，PF-C136，PF-C137，PF-C143，PF-C145，PF-C181，PF-C194，PF-C214，PF-C291和PF-C293构成的组)，或由其组成。
[0324] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制黄色粘球菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗黄色粘球菌活性的序列(例如，来自由G-5、G-6和G-7构成的组)，或由其组成。
[0325] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制铜绿假单胞菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗铜绿假单胞菌活性的序列(例如，来自由PF-053，PF-063，PF-067，PF-128，PF-140，PF-143，PF-168，PF-204，PF-209，PF-355，PF-356，PF-366，PF-380，PF-411，PF-425，PF-432，PF-454，PF-458，PF-471，PF-474，PF-527，PF-531，PF-535，PF-536，PF-575，PF-577，PF-605，PF-746，PF-761和PF-S003构成的组)，或由其组成。
[0326] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制牙龈卟啉单胞菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗牙龈卟啉单胞菌活性的序列(例如，来自由PF-C052，PF-C072，PF-C075，PF-C084，PF-C088，PF-C089，PF-C 136，PF-C 180，PF-C194和C293构成的组)，或由其组成。
[0327] 在某些实施方式中，有效杀伤或抑制奇异变形菌生长和/或增殖的肽或组合物可包含一种或多种肽和/或一种或多种肽结构域，所述肽或肽结构域包含表4、5或6中鉴定为具有抗奇异变形菌活性的序列(例如，来自由PF-040，PF-578，PF-612，PF-624，PF-634，PF-741和PF-770构成的组)，或由其组成。
[0328] 还出乎意料地发现许多新型抗微生物肽的特征在于存在特定氨基酸基序。此类基序包括KIF、FIK、KIH、HIK和KIV，如表7所示。(SEQ ID NO：1567)
[0329] 表7.以特定基序为特征的抗微生物肽
[0330]
[0331]
[0332]
[0333] 所有组与抗微生物活性相关。
[0334] 在某些实施方式中，本文所述肽可具有多种活性。因此，例如，肽可具有结合/靶向活性和抗微生物活性。具有多种活性的示范性肽示于表8。此类肽可根据任何或所有这些特性用于例如嵌合构建物中。因此，例如，表8中指定为“B“的肽可用作靶向肽。如果其还指定为G或M，则它也可出于抗微生物活性而使用。
[0335] 表8.具有多种活性的肽。B：靶向/结合活性；M：抗微生物活性；G：生长或表型改变.
[0336]
[0337]
[0338]
[0339] 据信显示结合、生长改变和/或抗微生物活性的其它肽示于表9。
[0340] 表9.据信具有结合、生长改变和/或抗微生物活性的其它肽.
[0341]
[0342]
[0343] III.STAMP和其它嵌合构建物的设计和构建
[0344] 在各种实施方式中，本发明提供包含一个或多个靶向部分的嵌合部分，所述靶向部分与一个或多个效应物相连。可选择靶向部分以便优先结合靶微生物(例如，细菌、病毒、真菌、酵母菌、藻类、原生动物等)或微生物群(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，特定属、种，等等)。在某些实施方式中，所述靶向部分包含本文所述的一个或多个新型微生物结合肽(参见，例如表3和/或表10和/或表12)。在某些实施方式中，所述靶向部分包含非肽部分(例如，抗体、受体、受体配体、凝集素等)。
[0345] 在各种实施方式中，效应物包含其活性有待递送至一种或多种靶微生物、包含一种或多种靶微生物的生物膜、包含一种或多种靶微生物的细胞或组织等等的部分。在某些实施方式中，所述靶向部分包含本文所述的一种或多种抗微生物肽(参见，例如表4、5和/或14)、抗生素(包括但不限于类固醇抗生素)、可检测标记、卟啉、光敏剂、抗原表位标签、脂质或脂质体、纳米颗粒、枝状聚合物等。
[0346] 在某些实施方式中，一个或多个靶向部分连接于一个效应物。在某些实施方式中，一个或多个效应物连接于一个靶向部分。在某些实施方式中，多个靶向部分连接于多个效应物。一个或多个靶向部分可直接或经接头连接于一个或多个效应物。如果靶向部分和效应物包含肽，则嵌合部分可以是融合蛋白。
[0347] A)靶向部分
[0348] 在各种实施方式中，本发明提供优先和/或特异性结合微生物(例如，细菌、真菌、酵母菌等)的靶向部分。一个或多个此类靶向部分可连接于一个或多个效应物以提供能将所述一个或多个效应物递送至靶标(例如，细菌、真菌、酵母菌、包含细菌或真菌或酵母菌的生物膜等)的嵌合部分。
[0349] 在各种实施方式中，靶向部分包括但不限于上述优先结合特定微生物(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、藻类、病毒等)或此类微生物群的肽，结合特定微生物或微生物群的抗体，结合特定微生物或微生物群的受体配体，卟啉(例如，金属卟啉)，结合特定微生物或微生物群的凝集素，等等。应理解，提及微生物或微生物群，则包括细菌或细菌群、病毒或病毒群、酵母菌或酵母菌群、原生动物或原生动物群、病毒或病毒群，等等。
[0350] i.靶向肽
[0351] 在某些实施方式中，靶向部分包括结合特定细菌、真菌和/或酵母菌和/或藻类和/或病毒，和/或结合细菌群和/或真菌群和/或酵母菌群和/或藻类群的一种或多种靶向肽。
[0352] 在某些实施方式中，所述靶向肽可包含能结合、特异性结合或优先结合微生物，例如靶微生物的一个或多个结构域(参见，例如表3)。在某些实施方式中，通过筛选肽文库鉴定靶向肽。例如，可用靶微生物或所需抗原或其抗原表位筛选噬菌体展示肽文库。通过此类筛选鉴定的任何肽可用作靶微生物的靶向肽。示范性的其它靶向肽示于表10。
[0353] 表10.其它示范性靶向部分.
[0354]
[0355]
[0356]
[0357]
[0358] 公开所述抗体的专利和专利公布见表。
[0359] 在某些实施方式中，所述靶向部分可包含其它实体，特别是与例如表4所述抗微生物肽联用时。示范性靶向部分可包括与靶微生物，例如靶微生物的细胞表面附属物如鞭毛和纤毛、表面暴露的蛋白质、脂质和多糖特异性相互作用的多肽、肽、小分子、配体、受体、抗体、蛋白质、或其部分。
[0360] ii.靶向抗体
[0361] 在某些实施方式中，靶向部分可包含特异性或优先结合微生物或微生物群(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒、藻类等)的一种或多种抗体。选择抗体以便结合特征性抗原表位或特定靶微生物。在各种实施方式中，此类抗原表位或抗原通常是革兰氏阳性或革兰氏阴性特异性，或属特异性，或种特异性，或菌株特异性，定位于靶微生物的表面。结合抗原表位或抗原的抗体能将抗微生物肽部分或其它效应物引导至位点。此外，在某些实施方式中，除了效应物部分提供的活性外，抗体本身可提供抗微生物活性，因为抗体可结合免疫系统效应物(例如，T-细胞)，从而引发抗体相关的免疫应答，例如体液免疫应答。
[0362] 采用本领域技术人员可用的任何方法制备结合特定靶微生物的抗体。例如，如美国专利号6,231,857(通过引用纳入本文)所述，制备了抗变形链球菌的三种单克隆抗体，即SWLA1，SWLA2和SWLA3。还可通过本领域可用的任何方式人源化从非人动物获得的要用于靶向部分的单克隆抗体，从而降低它们的免疫原性并提高它们引发人的抗微生物免疫应答的能力。示范性微生物和/或抗体所针对的靶标示于例如表3和11。
[0363] 各种形式的抗体包括但不限于：完整的抗体、抗体片段(例如，(Fab′)2、Fab′等)、单链抗体(例如，scFv)、微抗体、二价微抗体(Di-miniantibody)、四价微抗体(Tetra-miniantibody)、(scFv)2、双链抗体、sc双链抗体、三链抗体、四链抗体、串联双链抗体、VHH、纳米抗体、亲和体、单抗体(unibody)等。
[0364] 本领域技术人员熟知制备此类抗体的方法。在各种实施方式中，此类方法通常包括提供微生物或其组分以便用作可引发生物中免疫应答的抗原，或用于筛选方案(例如，噬菌体或酵母菌展示)。
[0366] 如果需要，可组合施用免疫微生物或其衍生的抗原与载体蛋白，或可采用本领域熟知的技术通过结合将免疫微生物或其中衍生的抗原与载体蛋白偶联。化学偶联于肽的此类常用载体包括匙孔 血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后利用偶联的肽免疫动物(例如，小鼠或家兔)。
[0367] 然后从取自哺乳动物的血液样品中获得抗体。本领域已知用于产生多克隆抗体的技术(参见，例如《酶学方法》(Methods of Enzymology)，″用小剂量的免疫原产生抗血清：多次真皮内注射(Production of Antisera With Small Doses of Immunogen：Multiple Intradermal Injections)″，Langone等编，(学术出版社(Acad.Press)，1981))。可进一步纯化动物产生的多克隆抗体，例如通过结合于结合了产生该抗体的肽的基质并从该基质洗脱。本领域技术人员知道免疫学领域常用的各种技术以便纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体，参见，例如Coligan等，(1991)第9单元，《最新免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)，Wiley Interscience)。
[0368] 在某些实施方式中，产生的抗体是单克隆抗体(“mAb”)。用于产生分泌mAb的杂交瘤的通用方法是熟知的(Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495)。
[0369] 还可采用噬菌体展示和/或酵母菌展示技术产生/选择抗体片段，例如单链抗体(scFv或其它)。在感染细菌(细菌噬菌体或噬菌体)的病毒或酵母菌的病毒表面表
10
达抗体片段的能力使得从例如超过10 个非结合克隆的文库分离一种结合抗体片段成
为可能。为在噬菌体(噬菌体展示)或酵母菌表面表达抗体片段，将抗体片段基因插入
编码噬菌体表面蛋白(例如，pIII)的基因，抗体片段-pIII融合蛋白展示在噬菌体表
面(McCafferty等 .(1990)Nature，348：552-554；Hoogenboom等 .(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137)。
10
达抗体片段的能力使得从例如超过10 个非结合克隆的文库分离一种结合抗体片段成
为可能。为在噬菌体(噬菌体展示)或酵母菌表面表达抗体片段，将抗体片段基因插入
编码噬菌体表面蛋白(例如，pIII)的基因，抗体片段-pIII融合蛋白展示在噬菌体表
面(McCafferty等 .(1990)Nature，348：552-554；Hoogenboom等 .(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137)。
[0370] 由于噬菌体或酵母菌表面的抗体片段有功能，可通过抗原亲和色谱分开具有抗原结合抗体片段的噬菌体和非结合噬菌体(McCafferty等.(1990)Nature，348：552-554)。根据抗体片段的亲和力，一轮亲和选择获得20倍到1,000,000倍的富集因子。
[0371] 通过在噬菌体上展示非常大且不同的V-基因库可产生人抗体而无需在先免疫(Marks等.(1991)J.Mol.Biol.222：581-597)。
[0372] 在某些实施方式中，纳米抗体可用作靶向部分。制备VhH(纳米抗体)的方法也是本领域技术人员熟知的。发现驼科(Camelidae)重链抗体是经其恒定区二聚合的单一重链的同型二聚体。这些驼科重链抗体的可变区称为VHH结构域或VHH，其本身可用作纳米抗体和/或用作获得纳米抗体的起点。分离的VHH保留了高特异性结合抗原的能力(参见，例如Hamers-Casterman等.(1993)Nature 363：446-448)。在某些实施方式中，此类VHH结构域或编码它们的核苷酸序列可衍生自驼科物种，例如骆驼、单峰骆驼(dromedary)、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)和原驼(guanaco)产生的抗体。除了驼科，其它物种(例如，鲨鱼、河豚)可产生功能性抗原结合重链抗体，从中(编码核苷酸序列)可获得此类天然产生的VHH，例如，采用美国专利公开US 2006/0211088所述的方法。
[0373] 在各种实施方式中，为用于治疗，优选人蛋白质，主要是因为给予患者时它们不大可能引起免疫应答。将驼VHH与人抗体的VH结构域比较揭示了驼VHH结构域框架区中对应于人VH结构域的VH/VL界面的几个关键差异。将这些人残基突变成VHH类似残基产生保留抗原结合活性，但表达和溶解性提高的“驼化”人VH结构域。
[0374] 单VH结构域的文库也衍生自，例如从免疫小鼠脾脏的基因组DNA或mRNA扩增并在大肠杆菌中表达的VH基因(Ward等.(1989)Nature 341：544-546)，可利用本文所述的VH结构域和/或VL结构域进行类似的方法。分离的单VH结构域称为“dAb”或结构域抗体。“dAb”是特异性结合抗原的抗体单可变域(VH或VL)多肽。“dAb”不依赖其它V结构域结合抗原；然而，如该术语在本文所用，“dAb”可存在同型多聚物或含其它VH或VL结构域的异型多聚物，其中所述其它结构域对于dAb结合抗原不是必需的，即，dAb结合抗原不依赖于其它VH或VL结构域。
[0375] 如美国专利公开2006/0211088所述，已知方法来克隆和指导筛选可用作此类纳米抗体的一部分和/或构建此类纳米抗体的免疫球蛋白序列(包括但不限于包含以下的多价多肽：两个或更多个可变域—或抗原结合域—特别是VH结构域或VHH结构域；VL、VH或VHH结构域的片段，例如CDR区，例如CDR3区；常规4-链抗体的抗原结合片段，例如Fab片段和scFv、重链抗体和结构域抗体；以及特别是VH序列，尤其是VHH序列)。
[0376] 产生VHH/纳米抗体的方法和过程还可见，例如WO 94/04678，WO 96/34103，WO 97/49805，WO 97/49805WO 94/25591，WO 00/43507 WO 01/90190，WO 03/025020，WO 04/062551，WO 04/041863，WO 04/041865，WO 04/041862，WO 04/041867，PCT/
BE2004/000159，Hamers-Casterman 等 .(1993)Nature 363：446；Riechmann 和
Muyldermans(1999)J.Immunological Meth.，231：25-38；Vu 等 .(1997)Molecular Immunology，34(16-17)：1121-1131；Nguyen 等 .(2000)EMBO J.，19(5)：921-930；
Arbabi Ghahroudi 等 .(19997)FEBS Letters 414：521-526；van der Linden
等 .(2000)J.Immunological Meth.，240：185-195；Muyldermans(2001)Rev.Molecular Biotechnology 74：277-302；Nguyen等.(2001)Adv.Immunol.79：261，等等。
BE2004/000159，Hamers-Casterman 等 .(1993)Nature 363：446；Riechmann 和
Muyldermans(1999)J.Immunological Meth.，231：25-38；Vu 等 .(1997)Molecular Immunology，34(16-17)：1121-1131；Nguyen 等 .(2000)EMBO J.，19(5)：921-930；
Arbabi Ghahroudi 等 .(19997)FEBS Letters 414：521-526；van der Linden
等 .(2000)J.Immunological Meth.，240：185-195；Muyldermans(2001)Rev.Molecular Biotechnology 74：277-302；Nguyen等.(2001)Adv.Immunol.79：261，等等。
[0377] 在某些实施方式中，抗体靶向部分是单抗体。单抗体提供的抗体技术能产生稳定、较小抗体形式，但预计治疗窗长于某些小抗体形式。在某些实施方式中，通过消除抗体的绞链区从IgG4抗体产生单抗体。与全尺寸IgG4抗体不同，半分子片段非常稳定，称为单特异抗体。平分IgG4分子在单抗体上仅留下一个能结合靶标的区域。产生单抗体的方法详细描述于PCT公开WO2007/059782，其通过引用全部纳入本文(还参见，Kolfschoten等.(2007)Science 317：1554-1557)。
[0378] 亲和体分子是基于58-氨基酸残基蛋白质结构域的一类亲和蛋白，衍生自葡萄球菌A蛋白的IgG结合域之一。这三个螺旋束结构域已用作构建组合噬菌粒文库的支架，采用噬菌体展示技术可从中选择靶向所需分子的亲和体变体(参见，例如Nord等.(1997)Nat.Biotechnol.15：772-777；Ronmark等.(2002)Eur.J.Biochem.，269：2647-2655)。本领域已知亲和体和产生方法的细节(参见，例如美国专利号5,831,012，其通过引用全部纳入本文)。
[0379] 还应知道可由任何商业服务机构制备抗体(例如，伯克利抗体实验室(Berkeley antibody laboratories)，贝氏实验室(Bethyl Laboratories)，安华公司(Anawa)，欧洲基因技术公司(Eurogenetec)，等)。
[0380] 结合各种微生物的示范性抗体示于表11。
[0381] 表11.结合靶微生物的示范性抗体
[0382]
[0383]
[0384] 此外，采用，例如上述方法不难产生结合其它微生物的抗体(靶向部分)。
[0385] iii.卟啉
[0386] 在某些实施方式中，卟啉或其它光敏剂可用作本文所述构建物中的靶向部分。具体地说，金属卟啉，特别是许多非铁金属卟啉的分子结构类似血红素，并由细菌通过高亲和力血红素-摄取系统积极累积。可利用同一摄取系统递送抗生素-卟啉和抗菌剂-卟啉缀合物。适合该目的的示范性靶向卟啉描述于美国专利6,066,628，在本文中示于例如图1和2。
[0387] 例如，某些人工(非-铁)金属卟啉(MP)(Ga-IX，Mn-IX)积极抵御革兰氏阴性和革兰氏阳性菌和抗酸杆菌(例如，小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)、粘质沙雷菌(S.marcescens)、大肠杆菌、奇异变形杆菌(P.mirabills)、肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae)、奥克西托克雷伯杆菌(K.oxytoca)、铜绿假单胞菌、弗罗因德枸橼酸杆菌(C.freundii)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、脑膜败血黄杆菌(F.menigosepticum)、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿脓链球菌(S.pyogenes)A、粪肠球菌、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、结核分枝杆菌(M.tuber.)、酿酒酵母(S.crevisiae))，如美国专利6,066,628中表1-5所述。这些MP可用作抗这些微生物的靶向部分。
[0388] 类似地，一些MP还对酵母菌有生长抑制作用，表明它们可用作靶向部分以靶向念珠菌(例如，白色念珠菌、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、多毛念珠菌(C.pillosus)、光滑念珠菌(C.glabrata)等)和其它海藻糖，包括但不限于毛癣菌、表皮癣菌(Epidermophyton)、组织胞浆菌(Histoplasma)、曲霉、隐球菌(Cryptococcus)导致的海藻糖，等等。
[0389] 卟啉和其它光敏剂也具有抗微生物活性。因此，在某些实施方式中，卟啉或其它光敏剂可用作效应物(例如，连接于本文所述的靶向肽)。在各种实施方式中，卟啉或其它光敏剂可提供双功能，例如作为靶向部分和抗微生物剂，可连接于本文所述的靶向肽和/或抗微生物肽。
[0390] 示范性卟啉和其它光敏剂示于图1-11，下文对效应物的讨论中有更详细的描述。
[0391] iv.信息素
[0392] 在某些实施方式中，微生物的信息素可用作靶向部分。细菌和真菌的示范性信息素示于表12。
[0393] 表12.用作靶向部分的示范性细菌和真菌信息素
[0394]
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399] v.靶向增强剂/调理素
[0400] 在某些实施方式中，考虑了掺入靶向增强剂(例如，调理素)连同一种或多种靶向部分(例如，靶向肽)的组合物。靶向增强剂包括增强结合亲和力和/或结合特异性和/或靶细胞/微生物对某部分内化的部分。
[0401] 因此，在某些实施方式中，靶向部分和/或靶向抗微生物分子包含具有所需结合特异性和/或亲合力水平的、连接(例如，接合)于调理素的肽。当通过靶向肽结合于靶细胞时，调理素组分通过驻留型巨噬细胞、树突细胞、单核细胞或PMN促进吞噬作用和破坏作用。考虑用于接合的调理素可以是直接或间接类型。
[0402] 直接调理素包括，例如任何细菌表面抗原、PAMP(病原体相关分子模式)或宿主PRR(病原体识别受体)识别的其它分子。调理素可包括但不限于：细菌蛋白、脂质、核酸、碳水化合物和/或寡糖部分。
[0403] 在某些实施方式中，调理素包括但不限于：N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基-D-半乳糖胺(GlaNAc)、含有N-乙酰葡糖胺的胞壁酰肽、NAG-胞壁酰肽、NAG-NAM、肽聚糖、磷壁酸、脂磷壁酸、LPS、o-抗原、甘露糖、岩藻糖、ManNAc、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖、葡糖胺、蔗糖、甘露糖胺、半乳糖-α-1，3-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰基葡糖胺或α-1，3-gal-gal或其它糖。
[0404] 在某些实施方式中，调理素包括间接调理素。间接调理素通过与早已存在的直接调理素结合而起作用。例如，抗体的Fc部分、糖结合凝集素蛋白(例如MBL)或宿主补体因子(例如，C3b、C4b、iC3b)。
[0405] 在某些实施方式中，调理素是半乳糖-α-1，3-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰基葡糖胺或α-1，3-gal-gal。
[0406] 调理素分子的其它例子包括但不限于：抗体(例如，IgG和IgA)、补体系统的组分(例如，C3b、C4b和iC3b)、甘露糖结合凝集素(MBL)(起始C3b的形成)，等。
[0407] 将调理素偶联于靶向部分的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如以下关于效应物连接于靶向部分的讨论)。
[0408] B)效应物
[0409] 许多效应物可偶联于本文所述的靶向部分以将效应物优先递送至靶生物和/或组织。示范性效应物包括但不限于：可检测标记物、小分子抗生素、抗微生物肽、卟啉或其它光敏剂、用于预先靶向方案的抗原表位标签/抗体，物理破坏微生物群体内的胞外基质的试剂，微粒和/或微囊、纳米颗粒和/或纳米囊，“载体”包括但不限于脂质、脂质体、枝状聚合物、基于胆酸的肽模拟物或其它肽模拟物、类固醇抗生素等。
[0410] i.可检测标记物
[0411] 在某些实施方式中，提供的嵌合构建物包含直接或经接头连接于可检测标记物的靶向部分(例如，表3所述)。此类嵌合部分可有效检测靶向部分所指向的微生物的存在和/或量和/或位置。类似地，这些嵌合部分可用于鉴定感染了靶向微生物的细胞和/或组织和/或食物和/或其它组合物。
[0412] 适用于此类嵌合部分的可检测标记物包括可通过光谱法、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。示范性的可用标记物包括但不限于：用标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素，用生物素缀合物荧光染料标记的亲和素或链霉亲和素(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等，参见，例如美国俄勒冈州尤3
金市的分子探针公司(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA))，放射性标记(例如，H、
125 35 14 32 99 203 67 68 72 111 113m 97 62 52 52m 51 186
I、S、C、P、Tc、 Pb、Ga、Ga、As、 In、 In、Ru、Cu、641Cu、Fe、 Mn、Cr、Re、
188 77 90 67 169 121 127 142 143 198 199 161 109 165 149 151
Re、As、Y、Cu、 Er、 Sn、 Te、 Pr、 Pr、 Au、 Au、 Tb、 Pd、 Dy、 Pm、 Pm、
153 157 159 166 172 169 175 177 105 111
Sm、 Gd、Gd、 Ho、Tm、 Yb、Yb、 Lu、Rh、 Ag等)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)、各种比色标记物、磁性或顺磁标记物(例如，磁性和/或顺磁纳米颗粒)、自旋标记物、不透射线的标记物等。讲授使用此类标记物的专利包括，例如美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和
4,366,241。
金市的分子探针公司(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA))，放射性标记(例如，H、
125 35 14 32 99 203 67 68 72 111 113m 97 62 52 52m 51 186
I、S、C、P、Tc、 Pb、Ga、Ga、As、 In、 In、Ru、Cu、641Cu、Fe、 Mn、Cr、Re、
188 77 90 67 169 121 127 142 143 198 199 161 109 165 149 151
Re、As、Y、Cu、 Er、 Sn、 Te、 Pr、 Pr、 Au、 Au、 Tb、 Pd、 Dy、 Pm、 Pm、
153 157 159 166 172 169 175 177 105 111
Sm、 Gd、Gd、 Ho、Tm、 Yb、Yb、 Lu、Rh、 Ag等)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)、各种比色标记物、磁性或顺磁标记物(例如，磁性和/或顺磁纳米颗粒)、自旋标记物、不透射线的标记物等。讲授使用此类标记物的专利包括，例如美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和
4,366,241。
[0413] 应该知道荧光标记物不限于单一物质有机分子，还包括无机分子、有机和/或无机分子的多分子混合物、晶体、杂聚物等。因此，例如可衍生封闭在二氧化硅壳中的CdSe-CdS核壳纳米晶体以便偶联于生物分子(Bruchez等.(1998)Science，281：
2013-2016)。类似地，高度荧光量子点(硫化锌封端的硒化镉)共价偶联于生物分子以便用于超敏生物学检测(Warren和Nie(1998)Science，281：2016-2018)。
2013-2016)。类似地，高度荧光量子点(硫化锌封端的硒化镉)共价偶联于生物分子以便用于超敏生物学检测(Warren和Nie(1998)Science，281：2016-2018)。
[0414] 在各种实施方式中，由受体分子提供自旋标记物，该分子含有可通过电子自旋共振(ESR)光谱法检测的未配对电子自旋。示范性的自旋标记物包括但不限于：有机自由基、过渡金属络合物，特别是钒、铜、铁和锰等。示范性的自旋标记物包括，例如氮氧自由基。
[0415] 检测此类标记物的装置是本领域技术人员熟知的。因此，例如，如果标记物是放射性标记物，检测装置包括闪烁计数器或放射自显影中的照相胶片。如果标记物是荧光标记物，检测可通过用合适波长的光激发荧光色素并检测得到的荧光，例如通过显微术、目测观察、照相胶片、利用电子检测器，如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增器等，类似地，可通过提供酶的合适底物并检测得到的反应产物来检测酶标记物。最后，可简单通过观察标记物相关的颜色来检测简单的比色标记物。
[0416] ii.抗生素
[0417] 在某些实施方式中，提供的嵌合部分包含直接或经接头连接于小分子抗生素和/或载体(例如，脂质或脂质体、聚合物等)的靶向部分(例如，如表3所述)，所述载体包含小分子抗生素。示范性抗生素见表13。
[0418] 表13.用于本文所述嵌合部分的示范性抗生素
[0419]
[0420]
[0421]
[0422]
[0423]
[0424]
[0425] iii.卟啉和非卟啉光敏剂
[0426] 在某些实施方式中，卟啉和其它光敏剂可用作本发明方法和组合物中的靶向部分和/或效应物。光敏剂是增加生物(例如，细菌、酵母菌、真菌等)光敏性的药物或其它化学物质。作为靶向部分，光敏剂(例如，卟啉)优先为靶微生物所摄取，从而促进嵌合部分递送至靶微生物。
[0427] 作为效应物，光敏剂可用于光动力抗微生物化疗(PACT)。在各种实施方式中，PACT利用光敏剂和光(例如，可见光、紫外光、红外光等)以在靶生物中产生光毒性反应，常是通过氧化破坏。
[0428] 目前，PACT的主要应用是消毒血液制品，特别是用于病毒灭活，虽然在例如口腔感染或局部感染的治疗中更多采用临床方案。该技术显示在体外有效抵御细菌(包括耐药性菌株)、酵母菌、病毒、寄生虫等。
[0429] 将靶向部分(例如，靶向肽)连接于例如本文所述的光敏剂提供了将光敏剂特异性或优先靶向特定微生物种类或菌株的方法。
[0430] 本领域技术人员已知各种天然和合成的光敏剂(参见，例如Wainwright(1998)J.Antimicrob.Chemotherap.42：13-28)。可用的光敏剂具有不同的理化组成和光吸收特性。在各种实施方式中，光敏剂通常是有效形成长久三联激发状态的芳族分子。根据芳族体系吸收的能量，这仍取决于涉及的分子结构。例如，呋喃香豆素光敏剂(补骨脂素)吸收较高能量紫外(UV)光(c.300-350nm)，而大环、杂芳族分子，例如酞菁吸收较低能量的近红外光。
[0431] 示范性光敏剂包括但不限于：卟啉大环(特别是卟啉、二氢卟酚等，参见，例如图1和2)。具体地说，金属卟啉，特别是许多非铁金属卟啉的分子结构类似血红素，并由细菌通过高亲和力血红素-摄取系统积极累积。可利用同一摄取系统递送抗生素-卟啉和抗菌剂-卟啉缀合物。适合该目的的示范性靶向卟啉描述于美国专利6,066,628，在本文中示于例如图1和2。
[0432] 示范性的靶向卟啉描述于实施例5和相关附图以及图13。
[0433] 例如，某些人工(非-铁)金属卟啉(MP)(Ga-IX，Mn-IX)积极抵御革兰氏阴性和革兰氏阳性菌和抗酸杆菌(例如，小肠结肠炎耶尔森菌、脑膜炎奈瑟球菌、粘质沙雷菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奥克西托克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、弗罗因德枸橼酸杆菌、产气肠杆菌、脑膜败血黄杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿脓链球菌A、粪肠球菌、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、酿酒酵母)，如美国专利6,066,628中表1-5所述。这些MP可用作抗这些微生物的靶向部分。
[0434] 类似地，一些MP还对酵母菌有生长抑制作用，表明它们可用作靶向部分以靶向念珠菌(例如，白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、多毛念珠菌、光滑念珠菌等)和其它海藻糖，包括但不限于毛癣菌、表皮癣菌、组织胞浆菌、曲霉、隐球菌导致的海藻糖，等等。
[0435] 其它光敏剂包括但不限于花青(参见，例如图6)和酞菁(参见，例如图4)，吖嗪(参见，例如图5)，特别是包括亚甲基蓝和四苯胺蓝，金丝桃蒽酮(参见，例如图8)，吖啶(参见，例如图9)，特别是包括孟加拉红(参见，例如图10)，冠醚(参见，例如图11)等。在某些实施方式中，光敏剂包括二氢卟酚锡6和相关化合物(例如，其它二氢卟酚和卟啉锡)。
[0436] 另一光活化化合物是小茴香(参见图12)。
[0437] 在某些实施方式中，所述光敏剂是无需光活化的毒性或生长抑制剂。例如，一些非铁金属卟啉(MP)(参见，例如本文的图1和2)具有不依赖于光的强抗微生物活性。此外，作为最熟知的天然卟啉，血红素具有显著的抗细菌活性，在生理浓度的过氧化氢或还原剂存在下可提高该活性。
[0438] 光活化时，毒性或生长抑制作用通常大幅增加。它们通常产生影响附近任何物质的自由基。在某些实施方式中，为从靶向光敏剂得到最佳选择性，可利用抗氧化剂猝灭未结合的光敏剂，从而将破坏作用仅局限于由靶向肽引起的积累缀合物的细胞。在该情况中，靶细胞的膜结构用作质子供体。
[0439] 在典型的光动力抗微生物化疗(PACT)中，通过施加光源(例如，可见光源、紫外光源、红外光源等)活化靶向光敏剂。然而，PACT应用无需局限于局部应用。可照射口腔、咽喉、鼻、鼻窦区域。可采用内窥镜技术照射肠的类似区域。可采用腹腔镜检方法或在其它外科手术期间照射其它内部区域。例如，在涉及插入或修复或置换可植入装置(例如，假体性装置)的某些实施方式中，考虑了可用包含靶向部分的嵌合部分包被或与之接触的装置，所述靶向部分连接于本文所述光敏剂。可在外科手术期间和/或就在结束前用适当光源照射该装置以活化光敏剂。
[0440] 本文所述的靶向光敏剂及其用途是示范性而非限制性的。采用本文的讲授，本领域技术人员知道其它靶向光敏剂及其用途。
[0441] iv.抗微生物肽
[0442] 在某些实施方式中，效应物可包含一种或多种抗微生物肽或复合抗微生物肽，例如如上所述。许多抗微生物肽是本领域技术人员熟知的。
[0443] 在某些实施方式中，抗微生物肽包含上述一种或多种氨基酸序列(例如，包含表4和/或5所示氨基酸序列的一个或多个结构域)和/或表14所示一种或多种氨基酸序列。在某些实施方式中，抗微生物肽包含“抗微生物肽集合”(CAMP)(Collection of Anti-Microbial Peptides)(为推进理解抗微生物肽而开发的在线数据库)所述的一种或多种氨基酸序列(参见，例如Thomas等.(2009)Nucleic Acids Research，2009，1-7.doi：
10.1093/nar/gkp1021)，可见www.bicnirrh.res.in/antimicrobial。
10.1093/nar/gkp1021)，可见www.bicnirrh.res.in/antimicrobial。
[0444] 表14.其它示范性抗微生物肽。AP编号指抗微生物肽数据库中的ID(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)。
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[0535] 缩写：U-氨基异丁酸(Aib)；J-异缬氨酸(Iva)；O-羟脯氨酸(Hyp)；Z-乙基正缬氨酸(EtNor)；x或xx表示该位置是L或I；Ac-任选乙酰化的N末端；OH，OCH3-任选的C*
末端；烷烃长链标注在括号中；任选酰胺化的C末端。在显示保护基团之处，该基团是任选的。相反，显示没有保护基团的任何肽可任选具有一个或多个保护基团。如果显示肽是环状的，还包括线性形式。相反，如果显示线性肽，也包括环状形式。
末端；烷烃长链标注在括号中；任选酰胺化的C末端。在显示保护基团之处，该基团是任选的。相反，显示没有保护基团的任何肽可任选具有一个或多个保护基团。如果显示肽是环状的，还包括线性形式。相反，如果显示线性肽，也包括环状形式。
[0536] 在某些实施方式中，抗微生物肽由LL-37(LLGDFFRK SKEKIGKEFKRIVQRIKD FLRNL VPRTES，SEQ ID NO：3192)的氨基酸序列或LL-37的变体组成或包含其。LL-37是对应于人阳离子性抗微生物蛋白18(hCAP18)的氨基酸134-170的抗微生物导管素。在某些
实施方式中，所述抗微生物肽由美国专利公开号2009/0156499A1所述的LL-37变体的氨基酸序列组成或包含其。示范性变体包含与氨基酸序列FKRIVQRIKDFLRX1(SEQ ID NO：
3193)有至少90％、95％或98％序列相同性的氨基酸序列或由其组成，其中X1选自0、1、
2、3、4、5、6、7和8个氨基酸组成的组。在某些实施方式中，示范性变体包含与氨基酸序列X1RLFDKIRQVIRKFX2(SEQ ID NO：3194)有至少90％、95％或98％序列相同性的氨基酸序列或由其组成，其中X1是0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，X2是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15或16个氨基酸。
实施方式中，所述抗微生物肽由美国专利公开号2009/0156499A1所述的LL-37变体的氨基酸序列组成或包含其。示范性变体包含与氨基酸序列FKRIVQRIKDFLRX1(SEQ ID NO：
3193)有至少90％、95％或98％序列相同性的氨基酸序列或由其组成，其中X1选自0、1、
2、3、4、5、6、7和8个氨基酸组成的组。在某些实施方式中，示范性变体包含与氨基酸序列X1RLFDKIRQVIRKFX2(SEQ ID NO：3194)有至少90％、95％或98％序列相同性的氨基酸序列或由其组成，其中X1是0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，X2是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15或16个氨基酸。
[0537] 在某些实施方式中，抗微生物肽由表15所示LL-37变体的氨基酸序列组成或包含其。
[0538] 表15.LL-37肽和变体
[0539]
[0540] 以下美国专利还公开了许多抗微生物肽：7,271,239、7,223,840、7,176,276、6,809,181、6,699,689、6,420,116、6,358,921、6,316,594、6,235,973、6,183,992、
6,143,498、6,042,848、6,040,291、5,936,063、5,830,993、5,428,016、5,424,396、
5,032,574、4,623,733，其中特定抗微生物肽的内容通过引用纳入本文。
6,143,498、6,042,848、6,040,291、5,936,063、5,830,993、5,428,016、5,424,396、
5,032,574、4,623,733，其中特定抗微生物肽的内容通过引用纳入本文。
[0541] v.配体
[0542] 在某些实施方式中，效应物可包含一种或多种配体、抗原表位标签和/或抗体。在某些实施方式中，优选的配体和抗体包括结合免疫细胞表面标记的配体和抗体。利用此类抗体作为效应物分子的嵌合部分用作在具有配体或抗体结合伴侣的免疫细胞和靶微生物之间建立连接的双功能接头。
[0543] 术语“抗原表位标签”或“亲和标签”在本文可互换使用，指为抗体或其它结合伴侣所特异性识别的分子或分子的结构域。该术语还指结合伴侣复合物。因此，例如生物素或生物素/亲和素复合物均视作亲和标签。除了抗原表位/抗体相互作用中识别的抗原表位，亲和标签还包括其它结合分子识别的“抗原表位”(例如，受体结合的配体)，其它配体结合的配体以形成异质二聚体或同质二聚体，Ni-NTA结合的His6，亲和素结合的生物素，链霉亲和素或抗生物素抗体等等。
[0544] 本领域技术人员熟知抗原表位标签。此外，各种抗原表位标签的特异性抗体市场上有售。这些包括针对DYKDDDDK(SEQ ID NO：3207)抗原表位的抗体、c-myc抗体(可购自西格玛公司(Sigma)，圣路易斯)、HNK-1碳水化合物抗原表位、HA抗原表位、HSV抗原表位、His抗原表位特异性抗体识别的His4(SEQ ID NO：3208)、His5(SEQ ID NO：3209)和His6(SEQ ID NO：3210)抗原表位(参见，例如恰根公司(Qiagen))，等等。此外，抗原表位标签蛋白的载体市场上有售。因此，例如，pCMV-Tag1载体是设计用于哺乳动物细胞中基因表达的抗原表位标签载体。插入pCMV-Tag1载体的靶基因可用FLAG 抗原表位(N末端、C末端或内部标签)、c-myc抗原表位(C末端)或FLAG(N末端)和c-myc(C末端)抗原表位同时标记。
[0545] vi.脂质和脂质体
[0546] 在某些实施方式中，效应物包含可加载效应试剂(例如，药物、标记物等)的一种或多种微粒或纳米颗粒。在某些实施方式中，所述微粒或纳米颗粒是脂质颗粒。脂质颗粒是包含至少一种脂质组分从而形成浓缩脂质相的微粒或纳米颗粒。脂质纳米颗粒的组成通常大多是脂质。各种浓缩的脂质相包括固体无定形或真正结晶相；同型液相(液滴)；和各种水合介晶定向液相，例如液晶和伪晶双层相(L-α、L-β、P-β、Lc)，交错双层相和非片层相(参见，例如《生物膜结构》(The Structure of Biological Membranes)，P.Yeagle编，CRC出版公司(CRC Press)，保拉拉屯(Bora Raton)，佛罗里达州，1991)。脂质微粒包括但不限于：脂质体、脂质-核酸复合物、脂质-药物复合物、脂质-标记物复合物、固体脂质颗粒、微乳液滴等。本领域已知制备和利用这些类型的脂质微粒和纳米颗粒以及其连接亲和部分例如抗体的方法(参见，例如美国专利：5,077,057；5,100,591；5,616,334；6,406,713；5,576,016；6,248,363；Bondi 等 .(2003)Drug Delivery 10：245-250；Pedersen 等 .，(2006)Eur.J.Pharm.Biopharm.62：155-162，2006(固体脂质颗粒)；美国专利：5,534,502；
6,720,001；Shiokawa等.(2005)Clin.Cancer Res.11：2018-2025(微乳液)；美国专利
6,071,533(脂质-核酸复合物)，等)。
6,720,001；Shiokawa等.(2005)Clin.Cancer Res.11：2018-2025(微乳液)；美国专利
6,071,533(脂质-核酸复合物)，等)。
[0547] 脂质体通常定义为包含封闭内部空间(通常是水性内部空间)的一个或多个脂双层的颗粒。因此，脂质体常是双层脂膜形成的囊泡。有许多方法制备脂质体。其中一些用于制备小囊泡(d＜0.05微米)，一些用于制备较大囊泡(d＞0.05微米)。一些用于制备多层囊泡，一些用于制备单层囊泡。几份综述文献详述了制备脂质体的方法，例如Szoka和Papahadjopoulos(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467，Deamer和Uster(1983) 第
27-51页刊于：《脂质体》(Liposomes)，M.J.Ostro编，Marcel Dekker，纽约，等。
27-51页刊于：《脂质体》(Liposomes)，M.J.Ostro编，Marcel Dekker，纽约，等。
[0548] 在各种实施方式中，脂质体包含亲水性聚合物链的表面涂层。“表面涂层”指脂质体表面上的任何亲水性聚合物的涂层。通过在脂质体组成中包含用亲水性聚合物链衍生的一种或多种囊泡形成脂质从而在脂质体中包含亲水性聚合物。在某些实施方式中，优选含二酰基链的囊泡形成脂质，例如磷脂。一种示范性磷脂是磷脂酰乙醇胺(PE)，其含有反应活性氨基，从而可方便偶联于活化的聚合物。一种示范性PE是二硬脂酰基PE(DSPE)。另一例子是用亲水性聚合物链衍生的非磷脂双链两性脂质，例如二酰基或二烷基甘油。
[0549] 在某些实施方式中，用于偶联囊泡形成脂质的亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，优选分子量在1,000-10,000道尔顿、更优选1,000-5,000道尔顿、最优选2,000-5,000道尔顿的PEG链。PEG的甲氧基或乙氧基-加帽类似物还是有用的亲水性聚合物，各种聚合物尺寸市售可得，例如120-20,000道尔顿。
[0550] 其它适当亲水性聚合物包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基唑啉(polymethyloxazoline)、聚乙基唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生的纤维素，例如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
[0551] 含有连接于合适脂质例如PE的所述聚合物的脂质-聚合物缀合物的制备方法描述于，例如美国专利号5,395。
[0552] 可任选制备脂质体以便连接于本文所述的一种或多种靶向部分。此处，包含在脂质体中的脂质组分包括用靶向部分衍生的脂质或具有极性-头化学基团(例如，在接头上)的脂质，所述基团可按照已知方法用预成型脂质体中的靶向部分衍生。
[0553] 本领域技术人员熟知用亲和部分例如抗体来功能化脂质和脂质体的方法(参见，例如DE 3,218,121；Epstein等.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82：3688(1985)；
Hwang 等 .(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77：4030；EP 52,322；EP 36,676；EP
88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利公开83-118008；美国专利号4,485,045和
4,544,545；和EP 102,324，这些均通过引用纳入本文)。
Hwang 等 .(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77：4030；EP 52,322；EP 36,676；EP
88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利公开83-118008；美国专利号4,485,045和
4,544,545；和EP 102,324，这些均通过引用纳入本文)。
[0554] vii.物理破坏微生物群体内胞外基质的试剂
[0555] 在某些实施方式中，肽可偶联于物理破坏微生物群体，例如生物膜内胞外基质的试剂。在某些优选的实施方式中，此类试剂可以是细菌细胞壁降解酶，例如，SAL-2或糖苷酶、藻酸酶、肽酶、蛋白酶、脂酶中的任一种或DNA或RNA降解酶或化合物，例如rhRNA酶。破坏生物膜的胞外基质可产生清除和治疗益处。
[0556] 肽还可连接于抗微生物蛋白，例如蛋白抑制剂C或大肠杆菌素，或其片段，例如大肠杆菌素的IIa结构域或蛋白抑制剂C的发夹-结合结构域。
[0557] viii.聚合微粒和/或纳米颗粒
[0558] 在某些实施方式中，效应物包含聚合微粒和/或纳米颗粒和/或胶束。
[0559] 基于微粒和纳米颗粒的药物递送系统对于处理各种微生物极有潜力。用作药物载体的聚合微粒或纳米颗粒的技术优势是稳定性高、载体容量高、掺入亲水性和疏水性物质可行和各种给药途径可行，包括口腔施用和吸入。还可将聚合纳米颗粒设计成能控制(维持)药物从基质释放。纳米颗粒的这些特性能改善药物生物利用度和降低给药频率。
[0560] 聚合纳米颗粒通常是微米或亚微米(＜1μm)胶体颗粒。该定义包括药物吸收、溶解或分散在基质中的单体式纳米颗粒(纳米球)和药物局限于被外壳样壁包围的水性或油性核心的纳米颗粒。或者，在某些实施方式中，可将药物共价连接于表面或连接入基质。
[0561] 聚合微粒和纳米颗粒通常由生物相容和生物可降解的材料制成，如天然(例如，明胶、白蛋白)或合成(例如，聚丙交酯、聚烷基氰基丙烯酸酯)的聚合物或固体脂质。在体内，加载在纳米颗粒中的药物一般通过扩散、溶胀、侵蚀或降解从基质中释放。一种常用的材料是(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)。
[0562] 本领域技术人员熟知制造和加载聚合纳米颗粒或微粒的方法。因此，例如Matsumoto等((1999)Intl.J.Pharmaceutics，185：93-101)教授了制造聚(L-乳酸)-聚(乙二醇)-聚(L-乳酸)纳米颗粒，Chawla等((2002)Intl.J.Pharmaceutics 249：
127-138)教授了制造和利用聚(e-己内酯)纳米颗粒递送他莫昔芬，Bodmeier等((1988)Intl.J.Pharmaceutics，43：179-186)教授了采用溶剂蒸发方法制备聚(D，L-乳酸)微球。其它纳米颗粒制剂描述于，例如Williams等(2003)J.Controlled Release，91：
167-172；Leroux 等 .(1996)J.Controlled Release，39：339-350；Soppimath 等 .(2001)J.Controlled Release，70：1-20；Brannon-Peppas(1995)Intl.J.Pharmaceutics，116：
1-9；等等。
127-138)教授了制造和利用聚(e-己内酯)纳米颗粒递送他莫昔芬，Bodmeier等((1988)Intl.J.Pharmaceutics，43：179-186)教授了采用溶剂蒸发方法制备聚(D，L-乳酸)微球。其它纳米颗粒制剂描述于，例如Williams等(2003)J.Controlled Release，91：
167-172；Leroux 等 .(1996)J.Controlled Release，39：339-350；Soppimath 等 .(2001)J.Controlled Release，70：1-20；Brannon-Peppas(1995)Intl.J.Pharmaceutics，116：
1-9；等等。
[0563] C)肽制备
[0564] 可采用标准化学肽合成技术化学合成本文所述肽，或者特别是当肽不含“D”氨基酸残基时，可重组表达肽。如果“D”多肽是重组表达，可在环境中培养宿主生物(例如，细菌、植物、真菌细胞等)，其中只给生物体提供D形式的一种或多种氨基酸。然后在此类系统中重组表达的肽包含所述D氨基酸。
[0565] 在某些实施方式中，可利用识别D-氨基酸的修饰氨基酰基-tRNA合成酶将D氨基酸掺入重组表达的肽中。
[0566] 在某些实施方式中，通过本领域技术人员已知的任何液相或固相肽合成技术化学合成肽。固相合成是化学合成本发明多肽的优选方法，其中序列的C末端氨基酸连接于不可溶支持物，然后依次添加序列中其余的氨基酸。固相合成技术是本领域技术人员已知的，描述于例如Barany和Merrifield(1963)“固相肽合成”(Solid-Phase Peptide Synthesis)；第3-284页刊于“肽：分析、合成、生物学性质”(The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology).第2卷：“肽合成的具体方法”(Special Methods in Peptide Synthesis)，A部分.；Merrifield等.(1963)J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2156，和Stewart等.(1984)《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版.皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.)，罗克福德，伊利诺斯州。
[0567] 在一个实施方式中，可利用二苯甲基(benzhyderyl)胺树脂(BB公司(Beckman Bioproducts)，0.59mmol NH2/g树脂)作为固体支持物，通过固相肽合成方法合成肽。COOH末端氨基酸(例如，叔丁基羰基-Phe)通过4-(氧基甲基)苯乙酰基连接于固体支持物。该连接键比常规的苄基酯连接键更稳定，但完成的肽仍能通过氢化作用切割。为此目的可采用甲酸作为氢供体进行转移氢化。
[0568] 应该注意，在肽(特别是包含D氨基酸的肽)的化学合成中，除了所需的全长产物外，合成通常产生许多截短的肽。因此，通常采用例如HPLC纯化肽。
[0569] 在化学合成中可利用合适的衍生氨基酸残基将D-氨基酸、β氨基酸、非天然氨基酸等简单地掺入肽的一个或多个位置。固相肽合成的修饰残基可商购自许多供应商(参见，例如路易斯维尔的先进化学技术公司(Advanced Chem Tech，Louisville)；圣迭戈的NB公司(Nova Biochem，San Diego)；圣路易斯的西格玛公司；托兰斯的BC公司(Bachem California Inc.，Torrance)，等)。可视需要完全省去D形和/或其它修饰的氨基酸或掺入肽中任何位置。因此，例如，在某些实施方式中，肽可包含一个修饰的酸，而在其它实施方式中，肽包含至少两个、通常至少3个、更常见至少4个、最常见至少5个、优选至少6个、更优选至少7个或甚至所有修饰的氨基酸。在某些实施方式中，基本上每个氨基酸是D形氨基酸。
[0570] 如上所述，还可重组表达本发明的肽和/或融合蛋白。因此，在某些实施方式中，利用重组表达系统合成本发明的抗微生物肽和/或靶向部分和/或融合蛋白。这通常涉及产生编码所需肽或融合蛋白的DNA序列，将该DNA置于表达盒中特定启动子的控制下，在宿主中表达该肽或融合蛋白，分离该表达的肽或融合蛋白和如果需要，使肽或融合蛋白复性。
[0571] 可通过上述任意合适方法制备编码本文所述肽或融合蛋白的DNA，包括，例如合适序列克隆和限制或直接化学合成。
[0572] 该核酸容易连接入含有合适表达控制序列(例如，启动子、增强子等)和任选含有一种或多种可选择标记(例如，抗生素抗性基因)的适当载体。
[0573] 可在各种宿主细胞中表达编码本文所述肽或融合蛋白的核酸序列，包括但不限于大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母菌、真菌和各种高级真核细胞，例如昆虫细胞(如SF3)、COS、CHO和HeLa细胞系及骨髓瘤细胞系。重组蛋白质基因通常可操作连接于各宿主的适当表达控制序列。对于大肠杆菌，这可包括启动子，例如T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点，优选转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可包含启动子，通常包含增强子(例如，衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子)和聚腺苷酸化序列，可包含剪接供体和受体序列。
[0574] 可通过熟知的方法，例如用于大肠杆菌的氯化钙转化和用于哺乳动物细胞的磷酸钙处理或电穿孔，将质粒转移入选择的宿主细胞。可通过质粒上包含的基因，例如amp、gpt、neo和hyg基因所赋予的抗生素耐受性来选择质粒转化的细胞。
[0575] 一旦表达，可按照本领域的标准方法纯化重组蛋白或融合蛋白，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(通常参见R.Scopes，(1982)《蛋白质纯化》(Protein Purification)，SV公司(Springer-Verlag)，纽约；Deutscher(1990)《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第182卷：“蛋白质纯化指南”(Guide to Protein Purification).，学术出版公司(Academic Press，Inc.)纽约)。优选具有至少约90-95％均质性，最优选至少98-99％或更高均质性的基本纯的组合物。
[0576] 本领域技术人员了解在化学合成、生物学表达或纯化后，肽或融合蛋白具有的构象可能与所需天然构象基本不同。在该情况中，必需使肽或融合蛋白变性和还原，然后使分子重折叠成优选的构象。本领域技术人员熟知使蛋白质还原和变性及诱导重折叠的方法(参见，例如Debinski等.(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；和Buchner等.，(1992)Anal.Biochem.，205：
263-270)。例如，Debinski等描述了包涵体蛋白在胍-DTE中的变性和还原。然后蛋白质在含有氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重折叠。
263-270)。例如，Debinski等描述了包涵体蛋白在胍-DTE中的变性和还原。然后蛋白质在含有氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重折叠。
[0577] 技术人员知道可对肽和/或融合蛋白进行修饰而不减弱它们的生物学活性。可作出某些修饰以促进靶向分子的克隆、表达或掺入融合蛋白。本领域技术人员熟知此类修饰，包括，例如在氨基末端加入甲硫氨酸以提供起始位点，或将额外氨基酸(例如，聚His)置于任一末端从而产生方便定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
[0578] D)将靶向部分连接于效应物
[0579] i.化学偶联
[0580] 通过将一个或多个本文所述靶向部分连接于一个或多个效应物来形成嵌合部分。在某些实施方式中，所述靶向部分通过天然产生的反应性基团直接连接于效应物，或者可功能化靶向部分和/或效应物以提供此类反应性基团。
[0581] 在各种实施方式中，靶向部分通过一种或多种连接剂连于效应物。因此，在各种实施方式中，靶向部分和效应物经一种连接试剂或多种连接试剂结合。例如，靶向部分和效应物可经一种多功能(例如，二、三或四-)连接剂或一对互补的连接试剂结合。在另一实施方式中，靶向部分和效应物经两种、三种或更多连接剂结合。合适的连接剂包括但不限于，例如官能团、亲和试剂、稳定基团和其组合。
[0582] 在某些实施方式中，连接剂是或包含官能团。官能团包括含有反应性基团的单功能接头和含有两个或更多能与两个或更多不同功能靶标(例如，标记物、蛋白、大分子、半导体纳米晶体或基材)形成键的反应性基团的多功能交联剂。在一些优选的实施方式中，所述多功能交联剂是包含两种或更多不同反应性基团的异质双功能交联剂。
[0583] 合适的反应性基团包括但不限于：硫醇(-SH)、羧酸酯基(COOH)、羧基(-COOH)、羰基、胺(NH2)、羟基(-OH)、醛(-CHO)、醇(ROH)、酮(R2CO)、活性氢、酯、巯基(SH)、磷酸酯基(-PO3)或光反应性部分。胺反应性基团包括但不限于：例如，异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基、叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、芳基化试剂、亚胺酯、碳二亚胺和酐。硫醇反应性基团包括但不限于：例如卤代乙酰基和烷基卤衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化试剂和硫醇-二硫键交换试剂。羧酸酯反应性基团包括但不限于：例如，重氮烷和重氮乙酰基化合物，例如羰二咪唑和碳二亚胺。羟基反应性基团包括但不限于：例如环氧化物和环氧乙烷、羰二咪唑、用高碘酸盐氧化、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯、酶促氧化、烷基卤和异氰酸酯。醛和酮反应性基团包括但不限于：例如，用于希夫碱形成或还原胺化的肼衍生物。活性氢反应性基团包括但不限于：例如用于曼尼希缩合和碘化反应的重氮衍生物。光反应性基团包括但不限于：例如芳基叠氮化物和卤化芳基叠氮化物、二苯甲酮、重氮化合物和重氮甲烷衍生物。
[0584] 可用于形成嵌合部分的其它合适反应性基团和反应类别包括生物缀合物化学领域熟知的反应性基团和反应类别。目前可用反应性螯合剂的优选反应类别是在相对温和条件下进行。这些包括但不限于：亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤化物、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)和碳-碳和碳-杂原子多键加成(例如，迈克尔反应(Michaelreaction)、狄尔斯-阿德尔加成(Diels-Alder addition))。这些和其它可用的反应讨论于，例如March(1985)《高级有机化学》(Advanced Organic Chemistry)，第三版.，约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons)，纽约；Hermanson(1996)《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈；和Feeney等.(1982)《蛋白质修饰；
化学进展丛书》(Modification of Proteins；Advances in Chemistry Series)，第198卷，美国化学协会(American Chemical Society)，华盛顿，哥伦比亚特区。
化学进展丛书》(Modification of Proteins；Advances in Chemistry Series)，第198卷，美国化学协会(American Chemical Society)，华盛顿，哥伦比亚特区。
[0585] 在某些实施方式中，连接剂包括螯合物。例如，包含分子DOTA(DOTA＝1，4，7，3+
10-四(羧基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)的螯合物易用放射性标记物，例如Gd 和
64 3+ 64
Cu作标记，从而分别得到连接于靶向部分的Gd -DOTA和 Cu-DOTA。本领域技术人员已知其它合适的螯合物，例如最常用的1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)衍生物(参见，例如Lee等.(1997)Nucl Med Biol.24：2225-23019)。
10-四(羧基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)的螯合物易用放射性标记物，例如Gd 和
64 3+ 64
Cu作标记，从而分别得到连接于靶向部分的Gd -DOTA和 Cu-DOTA。本领域技术人员已知其它合适的螯合物，例如最常用的1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)衍生物(参见，例如Lee等.(1997)Nucl Med Biol.24：2225-23019)。
[0586] 本文所用的“接头”或“连接剂”是用于连接两个或更多分子的分子。在某些实施方式中，接头通常能形成连接两个分子(例如，靶向部分和效应物)的共价键。本领域技术人员熟知合适的接头，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在某些实施方式中，接头可通过侧链连接于组成氨基酸(例如，通过二硫键连接于半胱氨酸)。然而，在某些实施方式中，接头连接于末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
[0587] 双功能接头具有与一种分子(例如，靶向肽)上的一个基团和另一分子(例如，抗微生物肽)上的另一基团具有反应性的官能团，此类接头可用于形成所需缀合物。或者，可进行衍生以提供官能团。因此，例如，还知道在肽上产生游离巯基的方法(参见美国专利号4,659,839)。
[0588] 在某些实施方式中，连接剂是包含两个或更多不同反应性基团的异双功能交联剂，所述基团形成能与肽相互作用的杂环。例如，异双功能交联剂，例如半胱氨酸可包含胺反应性基团且硫醇反应性基团可与衍生肽上的醛相互作用。适合异双功能交联剂的其它反应性基团组合包括，例如胺-和巯基反应性基团；羰基和巯基反应性基团；胺和光反应性基团；巯基和光反应性基团；羰基和光反应性基团；羧酸酯和光反应性基团；精氨酸和光反应性基团。在一个实施方式中，异双功能交联剂是SMCC。
[0589] 已知将各种分子连接于肽或蛋白质的许多方法和接头分子(参见，例如欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958；4,659,839；4,414,148；4,699,784；4,680,338；4,569,789；和4,589,071；和Borlinghaus等.(1987)Cancer Res.47：4071-4075)。示范性连接方案见本文的实施例2和3。
[0590] ii.融合蛋白
[0591] 在某些实施方式中，如果靶向部分和效应物均是肽或均包含肽，嵌合部分可以化学合成或重组表达为融合蛋白(即，嵌合融合蛋白)。
[0592] 在某些实施方式中，采用重组DNA方法合成嵌合融合蛋白。这通常涉及产生编码该融合蛋白的DNA序列，将该DNA置于表达盒中特定启动子的控制下，在宿主中表达该蛋白，分离表达的蛋白，如需要，使该蛋白复性。
[0593] 制备编码融合蛋白的DNA可通过任何合适的方法，包括例如合适序列的克隆和限制性(酶切)，或通过例如以下所述的方法直接化学合成：Narang等.(1979)Meth.
Enzymol.68：90-99磷酸三酯方法；Brown等.(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等.(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固体支持物方法。
Enzymol.68：90-99磷酸三酯方法；Brown等.(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等.(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固体支持物方法。
[0594] 化学合成产生单链寡核苷酸。可通过与互补序列杂交或用该单链作为模板通过DNA聚合酶聚合将其转化成双链DNA。技术人员应知道虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，可通过连接较短序列得到较长序列。
[0595] 或者，可克隆子序列，利用合适的限制性酶切割适当子序列。然后可连接所述片段以产生所需DNA序列。
[0596] 在某些实施方式中，可采用DNA扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)克隆编码本发明融合蛋白的DNA。因此，例如编码靶向抗体、靶向肽等的核酸可利用含有NdeI的限制性位点的有义引物和含有HindIII的限制性位点的反义引物作PCR扩增。如此产生编码靶向序列并具有末端限制性位点的核酸。类似地，可提供具有互补限制性位点的一种和/或几种效应物/接头/间隔区。将序列连接和插入载体产生编码融合蛋白的载体。
[0597] 虽然靶向部分和效应物可直接连接在一起，技术人员应理解可通过一个或多个氨基酸构成的肽间隔区/接头将其分开。除了连接蛋白质或保留它们之间的一定最短距离或其它空间关系外，间隔区通常不具有特定的生物学活性。然而，可选择间隔区的组成氨基酸以影响该分子的某些特性，例如折叠、净电荷或疏水性。
[0598] 可在各种宿主细胞中表达编码融合蛋白的核酸序列，所述宿主细胞包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母菌和各种高级真核细胞，如COS、CHO和HeLa细胞系及骨髓瘤细胞系。重组蛋白质基因可操作连接于各宿主的合适表达控制序列。对于大肠杆菌，这包括启动子，例如T7、trp或λ启动子，核糖体结合位点，优选转录终止信号。对于真核细胞，控制序列包括启动子，优选包括衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子和聚腺苷酸序列，还可包括剪接供体和受体序列。
[0599] 可通过熟知方法，例如用于大肠杆菌的氯化钙转化和磷酸钙处理或用于哺乳动物细胞的电穿孔将质粒转移入选择的宿主细胞。可通过质粒所含基因，例如amp、gpt、neo和hyg基因赋予的抗生素耐受性来选择质粒转化的细胞。
[0600] 一旦表达，可按照本领域的标准方法纯化重组融合蛋白，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(通常参见，R.Scopes(1982)《蛋白质纯化》(Protein
Purification)，S-V公司，纽约；Deutscher(1990)《酶学方法》(Methods in Enzymology)第182卷：蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification).，学术出版社.纽约)。优选具有至少约90到95％均质的基本纯的组合物，98到99％或更高的均质对于药物应用是最优选的。一旦纯化(视需要部分纯化或纯化至均质)，可治疗性使用多肽。
Purification)，S-V公司，纽约；Deutscher(1990)《酶学方法》(Methods in Enzymology)第182卷：蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification).，学术出版社.纽约)。优选具有至少约90到95％均质的基本纯的组合物，98到99％或更高的均质对于药物应用是最优选的。一旦纯化(视需要部分纯化或纯化至均质)，可治疗性使用多肽。
[0601] 本领域技术人员知道在化学合成、生物学表达或纯化后，融合蛋白具有的构象可能基本上不同于组成型多肽的天然构象。在此情况中，可能需要使多肽变性和还原，然后使得该多肽重折叠成优选的构象。本领域技术人员熟知使蛋白还原和变性以及诱导重折叠的方法(参见，Debinski等.(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；和Buchner 等，(1992)Anal.Biochem.，205：
263-270)。
263-270)。
[0602] 技术人员知道可对融合蛋白进行修饰而不损害其生物学活性。可作出某些修饰以促进靶向分子的克隆、表达或掺入融合蛋白。本领域技术人员已知此类修饰，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一末端放置额外的氨基酸以产生方便定位的限制性位点或终止密码子。
[0603] 如上所述，在各种实施方式中，肽接头/间隔区用于连接一个或多个靶向部分与一个或多个效应物。在各种实施方式中，所述肽接头较短，通常短于约10氨基酸，优选至少约8个氨基酸和更优选约3-约5个氨基酸。合适的示范性接头包括但不限于PSGSP((SEQ ID NO：3211)、ASASA(SEQ ID NO：3212)或GGG(SEQ ID NO：3213)。在某些实施方式中，可利用较长的接头，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO：3214)。示范性肽接头和其它接头示于表16。
[0604] 表16.示范性肽和非肽接头
[0605]
[0606]
[0607] 2-硝基苯或邻-硝基苄基
[0608] 硝基吡啶基二硫化物
[0609] 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)
[0610] S-乙酰基巯基琥珀酸
[0611] 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)
[0612] β-葡糖苷酸和β-葡糖苷酸变体
[0613] 多聚(烷基丙烯酸)
[0614] 基于苯的接头(例如：2，5-双(己氧基)-1，4-双[2，5-双(己
[0615] 氧基)-4-甲酰基-苯撑乙烯撑]苯)等分子
[0616] 二硫键
[0617] 聚(酰胺胺)或类似的枝状聚合物，将多个靶和杀伤肽连
[0618] 接在一个分子中
[0620] 腙和腙变体接头
[0621] 任何链长的PEG
[0622] 琥珀酸、甲酸、乙酸、丁酸、其它类似的有机酸
[0623] 羟醛、醇或烯醇
[0624] 过氧化物
[0625] 任何链长的烷烃或烯烃基团
[0626] 含有游离酰胺和羧酸基团的一个或多个卟啉或染料分子
[0627] 一个或多个DNA或RNA核苷酸，包括含有多胺和聚羧基
[0628] 的变体
[0629] 胰岛素、蔗糖、葡萄糖或其它单糖、二糖或多糖
[0631] 含有卤素或硫醇基团的任何以上接头的变体
[0632] (所有基于氨基酸的接头可以是L、D、L和D形式的组合、β-形式，等等)
[0633] E)多个靶向部分和/或效应物
[0634] 如上所示，在某些实施方式中，本文所述的嵌合部分包含连接于一个效应物的多个靶向部分或连接于一个靶向部分的多个效应物，或连接于多个效应物的多个靶向部分。
[0635] 如果嵌合构建物是融合蛋白，其可通过提供连接于一个或多个效应物结构域的多个结构域(靶向结构域)获得。图14是一些但非所有构象的示意图。在各种实施方式中，多个靶向结构域和/或多个效应物结构域可彼此直接连接或可为接头(例如，上述氨基酸或肽接头)所隔开。
[0636] 当嵌合构建物是化学缀合物时，利用分支或多功能接头和/或多个不同接头可产生线形或支状构象(例如，图14所示)。
[0637] F)保护基团
[0638] 虽然本文所述各种肽(例如，靶向肽、抗微生物肽、STAMP)显示可能不含保护基团，但在某些实施方式中，它们可具有1、2、3、4或更多保护基团。在各种实施方式中，保护基团可偶联于肽的C和/或N末端和/或构成该肽的一个或多个内部残基(例如，可阻断组成型氨基酸上的一个或多个R基团)。因此，例如，在某些实施方式中，本文所述的任何肽可具有例如保护氨基末端的酰基和/或保护羧基末端的酰氨基。此类受保护肽的一个实施例是具有氨基酸序列KFINGVLSOFVLERKPYP (SEQ ID NO：3234)的
1845L6-21 STAMP，其中星号表明酰胺化的羧基末端。当然，可消除和/或用本文所述的另一保护基团取代该保护基团。
1845L6-21 STAMP，其中星号表明酰胺化的羧基末端。当然，可消除和/或用本文所述的另一保护基团取代该保护基团。
[0639] 不想局限于具体的理论，但发现加入保护基团，特别是在羧基末端，(在某些实施方式中是在氨基末端加入保护基团)能提高肽的稳定性和效率。
[0640] 各种保护基团适用于该目的。此类基团包括但不限于：乙酰基、酰胺和烷基，其中N末端保护尤其优选乙酰基和烷基，羧基末端保护优选酰胺基。在某些特别优选的实施方式中，保护基团包括但不限于：脂肪酸中的烷基链、丙酰基、甲酰基和其它基团。特别优选的羧基保护基团包括酰胺、酯和醚-形成保护基团。在一个优选的实施方式中，乙酰基用于保护氨基末端，酰胺基用于保护羧基末端。这些封闭基团增强肽形成螺旋的可能性。某些特别优选的封闭基团包括各种长度的烷基，例如式CH3-(CH2)n-CO-所示的基团，其中n为约1到约20，优选约1到约16或18，更优选约3到约13，最优选约3到约10。
[0641] 在某些实施方式中，保护基团包括但不限于：脂肪酸中的烷基链、丙酰基、甲酰基和其它基团。尤其优选的羧基保护基团包括酰胺、酯和醚-形成保护基团。在一个实施方式中，乙酰基用于保护氨基末端和/或氨基用于保护羧基末端(即酰胺化的羧基末端)。在某些实施方式中，封闭基团包括各种长度的烷基，例如式CH3-(CH2)n-CO-所示的基团，其中n为约3到约20，优选约3到约16，更优选约3到约13，最优选约3到约10。
[0642] 在某些实施方式中，C末端上的酸性基团可被醇、醛或酮基封闭和/或N末端残基可具有天然酰胺基团，或被酰基、羧酸、醇、醛或酮基封闭。
[0643] 其它保护基团包括但不限于：Fmoc、叔丁氧基羰基(t-BOC)、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲基苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙酰基(Ac)和三氟乙酰基(TFA)。
[0644] 本领域技术人员熟知保护/封闭基团和将此类基团偶联于构成本发明肽的合适残基的方法(参见，例如Greene等.，(1991)《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第2版.，约翰韦利父子公司，萨默塞特，新泽西州)。在示范性的实施方式中，例如，利用乙酸酐在合成期间实现乙酰化，此时肽在树脂上。可通过选择用于合成的合适树脂来实现酰胺保护。例如，可利用林克(rink)酰胺树脂。合成完成后，酸性双功能氨基酸如Asp和Glu和碱性氨基酸Lys上的半永久式保护基团或Tyr的羟基均同时除去。采用酸性处理从此类树脂上释放的肽最终是n-末端保护为乙酰基，羧基末端保护为NH2，所有其它保护基团同时除去。
[0645] 本文公开氨基酸序列之处，还包括含有一个或多个保护基团，例如上述保护基团(或用于例如boc或fmoc肽合成的任何其它市售可得的氨基酸保护基团)的氨基酸序列。
[0646] G)肽环化
[0647] 在某些实施方式中，本文所述肽(例如，AMP、复合AMP、STAMP等)经圈化/环化以产生环状肽。本文考虑的环状肽包括头/尾、头/侧链、尾/侧链和侧链/侧链的环化肽。此外，本文考虑的肽包括仅含有肽键的纯环肽(homodet)，和另外含有二硫键、酯键、硫酯键或其它键的杂环肽(heterodet)。
[0648] 实际上可采用本领域已知制备环状肽的任何技术来制备环状肽。例如，可采用常规液相或固相肽合成制备线形或非环化形式的肽，并采用标准化学方法环化。用于环化肽的化学方法优选足够温和，从而避免实质性降解肽。合成本文所述肽的合适方法以及环化该肽的合适化学方法在本领域熟知。
[0649] 在各种实施方式中，可通过直接偶联N和C末端以形成肽键(或其它键)来实现环化，还可通过氨基酸侧链进行环化。此外，可基于利用其它官能团，包括但不限于氨基、羟基、巯基、卤素、磺酰基、羧基和硫代羧基。这些基团可位于氨基酸侧链或连接于其N或C末端。
[0650] 因此，应该理解用于共价环化本发明肽的化学连接键不一定是酰胺键。在许多实例中，需要修饰线形或非环化肽的N和C末端以提供，例如可在温和反应条件下环化的反应性基团。此类连接键包括例如但不限于：酰胺、酯、硫酯、CH2--NH等。本领域熟知合成具有修饰末端的肽的技术和试剂以及适合环化此类修饰肽的化学方法。
[0651] 或者，在肽的末端被构象局限或以其它方式局限从而难于环化的情况中，需要将接头连接于N和/或C末端以促进肽环化。当然，应该知道此类接头具有能与肽的末端形成共价键的反应性基团。本领域熟知合适的接头和化学反应，包括以上所述那些。
[0652] 已充分鉴定了环状肽和缩肽(包含酯(缩酚酸)键作为主链一部分的杂环(heterodetic)肽)，其显示多种生物学活性。环化导致构象自由度降低常造成受体结合亲和力更高。还常在这些环状化合物中产生额外的构象局限性，例如利用D-和N-烷化氨基酸，α，β-脱氢氨基酸或α，α-二取代的氨基酸残基。
[0653] 本领域技术人员熟知在肽中形成二硫键的方法(参见，例如Eichler和Houghten(1997)Protein Pept.Lett.4：157-164)。
[0654] 还可参考以下文献：Marlowe(1993)Biorg.Med.Chem.Lett.3：437-44，其描述了利用三甲基硅烷基(TMSE)酯作为正交保护基团在TFA树脂上的肽环化；Pallin和Tam(1995)J.Chem.Soc.Chem.Comm.2021-2022)，其描述了通过肟形成在水溶液中环化未保护的肽；Algin等.(1994)Tetrahedron Lett.35：9633-9636，其公开了通过赖氨酸侧链锚定进行头-尾环状肽固相合成；Kates等.(1993)Tetrahedron Lett.34：1549-1552，其描述了通过三维固相方案产生头-尾环状肽；Tumelty等.(1994)J.Chem.Soc.Chem.
Comm.1067-1068，其描述了从固定化的活化中间体合成环状肽，其中活化固定化肽，维持N-保护基团完整并随后除去，进而引起环化；McMurray等.(1994)Peptide Res.7：
195-206)，其公开了经天冬氨酸和谷氨酸的侧链来头-尾环化连接于不可溶支持物的肽；
Hruby等.(1994)Reactive Polymers 22：231-241)，其教授了通过固相支持物环化肽的另外方法；Schmidt和Langer(1997)J.Peptide Res.49：67-73，其公开了合成环四肽和环五肽的方法。
Comm.1067-1068，其描述了从固定化的活化中间体合成环状肽，其中活化固定化肽，维持N-保护基团完整并随后除去，进而引起环化；McMurray等.(1994)Peptide Res.7：
195-206)，其公开了经天冬氨酸和谷氨酸的侧链来头-尾环化连接于不可溶支持物的肽；
Hruby等.(1994)Reactive Polymers 22：231-241)，其教授了通过固相支持物环化肽的另外方法；Schmidt和Langer(1997)J.Peptide Res.49：67-73，其公开了合成环四肽和环五肽的方法。
[0655] 肽环化的这些方法是说明性和非限制性的。利用本文提供的讲授，本领域技术人员可采用其它环化方法。
[0656] H)鉴定/验证活性肽
[0657] 可采用体外筛选试验鉴定和/或验证活性AMP、STAMP等。实际上，在许多实例中，本文所述的AMP和/或STAMP可在体外用作防腐剂、局部抗微生物处理，等等。此外，虽然体外敏感性测试明显有一定局限性，临床数据表明最低抑制浓度(MIC)测试结构与抗生素化合物的体内效力之间存在良好相关性(参见，例如Murray等.(1994)“抗微生物敏感性测试”(Antimicrobial Susceptibility Testing)，Poupard等编.，普莱纳姆出版社(Plenum Press)，纽约；Knudsen等.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39(6)：1253-1258；等等)。因此，也可通过已证明在体外抗特定微生物靶标的抗微生物活性来方便鉴定用于治疗感染及其相关疾病的AMP，例如表4所示。
[0658] 通常采用标准NCCLS细菌抑制试验或MIC测试检验抗微生物剂的体外抗微生物活性(参见，临床实验室标准国家委员会(National Committee on Clinical Laboratory Standards)″抗微生物敏感性测试操作标准(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing)″NCCLS文件M100-S5第14卷，第16号，1994年12月；″
《需氧生长细菌的稀释抗微生物敏感性测试方法-第三版》(Methods for dilution
antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically-Third Edition)″批准的标准M7-A3，临床标准国家委员会(National Committee for Clinical Standards)，维拉诺瓦(Villanova)，宾夕法尼亚州)。
《需氧生长细菌的稀释抗微生物敏感性测试方法-第三版》(Methods for dilution
antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically-Third Edition)″批准的标准M7-A3，临床标准国家委员会(National Committee for Clinical Standards)，维拉诺瓦(Villanova)，宾夕法尼亚州)。
[0659] 应该理解还可采用本领域熟知或本领域技术人员阅读本文后明白的其它试验来鉴定活性AMP。此类试验包括，例如Lehrer等.(1988)J.Immunol.Meth.，108：153；
Steinberg和Lehrer，″抗微生物肽的设计师试验：“一种大小适应全部”理论的争
论 (Designer Assays for Antimicrobial Peptides：Disputing the`One Size Fits All`Theory)″刊于：《抗菌肽方案》(Antibacterial Peptide Protocols)，Shafer编.，休玛娜出版社(Humana Press)，新泽西州所述的试验。本发明的活性肽通常显示小于约
100μM、优选小于约80或60μM、更优选约50μM或更低、约25μM或更低、或约15μM或更低、或约10μM或更低的MIC(采用实施例所述试验检测)。
Steinberg和Lehrer，″抗微生物肽的设计师试验：“一种大小适应全部”理论的争
论 (Designer Assays for Antimicrobial Peptides：Disputing the`One Size Fits All`Theory)″刊于：《抗菌肽方案》(Antibacterial Peptide Protocols)，Shafer编.，休玛娜出版社(Humana Press)，新泽西州所述的试验。本发明的活性肽通常显示小于约
100μM、优选小于约80或60μM、更优选约50μM或更低、约25μM或更低、或约15μM或更低、或约10μM或更低的MIC(采用实施例所述试验检测)。
[0660] IV.给药和制剂
[0661] A)药物制剂
[0662] 在某些实施方式中，将抗微生物肽和/或嵌合构建物(例如，连接于抗微生物肽的靶向部分、连接于可检测标记物的靶向部分等等)给予需要其的哺乳动物细胞、细胞、组织、组合物(例如，食物)等。在各种实施方式中，可施用组合物以检测和/或定位和/或定量特定微生物、微生物群体、包含特定微生物的生物膜等的存在。在各种实施方式中，可施用所述组合物以抑制特定微生物、微生物群体、包含特定微生物的生物膜，等等。
[0663] 可以“天然”形式，或者如果需要，以盐、酯、酰胺、前药、衍生物等形式施用这些活性试剂(抗微生物肽和/或嵌合部分)，只要所述盐、酯、酰胺、前药或衍生物在药学上合适，即，在本发明方法中有效。可采用合成有机化学领域技术人员已知和例如March(1992)高级有机化学；反应、机理和结构(Advanced Organic Chemistry；Reactions，Mechanisms and Structure)，第4版.纽约.WI公司所述的标准方法制备活性剂的盐、酯、酰胺、前药和其它衍生物。
[0664] 本领域技术人员已知配制此类衍生物的方法。例如，许多递送试剂的二硫化物盐描述于PCT公开WO 2000/059863，其通过引用纳入本文。类似地，可采用通常涉及与合适酸反应的常规方法从游离碱制备治疗、拟肽或其它模拟物的酸性盐。通常将碱性形式的药物溶解于极性有机溶剂，例如甲醇或乙醇，并向其中加入酸。通过加入较低极性溶剂使得到的盐沉淀或析出。制备酸加成盐的合适酸包括但不限于：有机酸，例如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸等，以及无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可用合适的碱处理将酸加成盐再转化成游离碱。本文活性剂的某些特别优选的酸加成盐包括卤化物盐，例如可利用盐酸或氢溴酸制备。相反，可利用药学上可接受的碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等，以相似方式制备本发明活性剂的碱性盐制品。在某些实施方式中，碱性盐包括碱金属盐，例如钠盐和铜盐。
[0665] 为制备盐形式的碱性药物，抗衡离子的pKa优选比该药物的pKa低至少约2pH。类似地，为制备盐形式的酸性药物，抗衡离子的pKa优选比该药物的pKa高至少约2pH。如此，抗衡离子使得溶液的pH水平低于实现盐高台(salt plateau)的pHmax，此时盐的溶解度超过游离酸或碱的溶解度。活性药物成分(API)和酸或碱中可电离基团的pKa单位差异的准则表示在能量上有利于质子转移。当API和抗衡离子的pKa没有显著差异时，可形成固体复合物，但在水环境中可快速丧失比例(即，分解成药物和抗衡离子的各实体)。
[0666] 抗衡离子优选药学上可接受的抗衡离子。合适的阴离子盐形式包括但不限于：乙酸盐、苯甲酸盐、苄化盐、酒石酸氢盐、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、巴莫酸盐(双羟萘酸盐)、磷酸盐和二磷酸盐、水杨酸盐和双水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物、戊酸盐等，而合适的阳离子盐形式包括但不限于：铝、苄星青霉素、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、缓血酸胺、锌等。
[0667] 在各种实施方式中，制备酯通常包括功能化存在于活性剂分子结构内的羟基和/或羧基。在某些实施方式中，酯通常是游离醇基的酰基取代衍生物，即，衍生自式RCOOH所示羧酸的部分，其中R是烷基，优选低级烷基。如果需要，可采用常规氢解或水解方法将酯再转化为游离酸。
[0668] 还可采用本领域技术人员已知或相关文献描述的技术制备酰胺。例如，可利用合适的胺反应物从酯制备酰胺，或者可通过与铵或低级烷基胺反应从酸酐或酰氯制备酰胺。
[0669] 在各种实施方式中，本文鉴定的活性剂可用于胃肠外、局部、口头、鼻部(或者其它方式吸入)、直肠或局部给药，例如通过气溶胶或经皮肤给药以便检测和/或定量测定和/或定位和/或预防性和/或治疗性治疗感染(例如，微生物感染)。可根据给药方法给予各种单位剂型的组合物。合适的剂型包括但不限于：粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂、贴剂、鼻喷雾剂、注射剂、可植入缓释制剂、脂质复合物等。
[0670] 本文所述的活性剂(例如，抗微生物肽和/或嵌合构建物)还可与药学上可接受的载体(赋形剂)组合以形成药物组合物。在某些实施方式中，药学上可接受的载体包括联邦或州政府的管理机构批准或美国药典或其它普遍认可药典列出的载体以便用于动物中/之上，更具体是用于人中/之上。“载体”指，例如与本发明活性剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助试剂或载体。
[0671] 药学上可接受的载体可含有用于，例如稳定组合物或增加或降低活性剂吸收的一种或多种生理学上可接受的化合物。生理学上可接受的化合物可包括，例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，保护和摄取增强剂如脂质，降低活性剂清除或水解的组合物，或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。
[0673] 在某些实施方式中，为制备口服剂型(例如，片剂)，可将例如赋形剂(例如，乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇等)、任选的崩解剂(例如，碳酸钙、羧甲基纤维素钙、淀粉乙醇酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等)、粘合剂(例如，α-淀粉、阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、环糊精等)、和任选的润滑剂(例如，滑石粉、硬脂酸镁、聚乙二醇6000，等)加入一种或多种活性组分(例如，活性肽)，并压缩得到的组合物。如果需要，可包被所压缩的产品，例如用于遮蔽味道或肠溶或缓释的已知方法。合适的包被材料包括但不限于：乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙二醇、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和Eudragit(德国罗姆哈斯公司(Rohm & Haas)；甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)。
[0674] 其它生理学上可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，尤其是可用于防止微生物生长或作用。各种防腐剂是熟知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员应知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于，例如活性剂的给药途径和活性剂的具体理化性质。
[0675] 在某些实施方式中，赋形剂是无菌的，通常没有不需要的物质。可通过常规的熟知灭菌技术消毒这些组合物。对于各种口服剂型赋形剂，例如片剂和胶囊，无需灭菌。USP/NF标准通常足矣。
[0676] 在某些治疗性应用中，施用本发明组合物，例如局部施用或施用至口腔或鼻腔、给予感染或具有感染风险的患者，或预防性施用以防止龋齿或特征为微生物感染的其它牙齿或口腔粘膜的病理学状况，施用量足以防止和/或治愈和/或至少部分防止或停止疾病和/或其并发症。足以实现该目的的用量定义为“治疗有效剂量”。该用途的有效量取决于该疾病的严重性和患者的总体健康状况。根据所需和患者耐受的剂量和频率，可一次或多次给予组合物。在任何情况中，组合物应提供充足量的本发明制剂的活性剂以有效治疗患者(缓解其中的一种或多种症状)。
[0677] 活性剂的浓度可以极为不同，主要基于活性成分的活性、体重等，根据所选具体给药方式和患者的需要作出选择。然而，通常选择浓度以提供约0.1或1毫克/千克/天到约50毫克/千克/天的剂量，有时更高。典型的剂量范围是约3毫克/千克/天到约3.5
毫克/千克/天，优选约3.5毫克/千克/天到约7.2毫克/千克/天，更优选约7.2毫克
/千克/天到约11.0毫克/千克/天，最优选约11.0毫克/千克/天到约15.0毫克/千
克/天。在某些优选的实施方式中，剂量为约10毫克/千克/天到约50毫克/千克/天。
在某些实施方式中，剂量为约20毫克到约50毫克，每日口服给予两次。应该理解，可调节此类剂量以优化具体对象或对象组中的治疗和/或预防方案。
毫克/千克/天，优选约3.5毫克/千克/天到约7.2毫克/千克/天，更优选约7.2毫克
/千克/天到约11.0毫克/千克/天，最优选约11.0毫克/千克/天到约15.0毫克/千
克/天。在某些优选的实施方式中，剂量为约10毫克/千克/天到约50毫克/千克/天。
在某些实施方式中，剂量为约20毫克到约50毫克，每日口服给予两次。应该理解，可调节此类剂量以优化具体对象或对象组中的治疗和/或预防方案。
[0678] 在某些实施方式中，将本发明的活性剂给予至口腔。利用锭剂、气溶胶喷雾、漱口剂、包被的拭子等可实现该目的。
[0679] 在某些实施方式中，将本发明的活性剂局部给予至，例如皮肤表面、局部病损或伤口、外科手术部位等。
[0680] 在某些实施方式中，根据本领域技术人员熟知的标准方法全身性给予(例如，口服或作为注射剂)本发明的活性剂。在其它优选的实施方式中，还可利用常规透皮药物递送系统，即，透皮“贴剂”递送药剂，其中活性剂通常包含在用作药物递送装置的分层结构内以便贴合于皮肤。在此类构造中，药物组合物通常包含在上部背衬层下的某层或“储器”中。应该知道，此处的术语“储器”指最终可用于递送至皮肤表面的一定量“活性成分”。因此，例如，“储器”可在贴剂背衬层上的粘合剂中，或在本领域技术人员已知的各种不同基质配方中包含活性成分。贴剂可包含一个储器或可包含多个储器。
[0681] 在一个实施方式中，储器包含药学上可接受接触粘合材料的聚合基质，所述材料用于在药物递送期间将该系统贴合于皮肤。合适的皮肤接触粘合材料的例子包括但不限于：聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。或者，含有药物的储器和皮肤接触粘合剂存在于隔开和不同的层，其中粘合剂在储器以下，在该情况中，其可以是上述聚合基质或可以是液体或水凝胶储器，或可采取其它形式。这些层中用作装置上表面的背衬层优选起到“贴剂”的主要结构元件的作用并为装置提供大量灵活性。选择的背衬层材料优选基本上不透过存在的活性剂和任何其它材料。
[0682] 用于局部递送的其它制剂包括但不限于：软膏、凝胶、喷雾剂、液体和乳膏。软膏是通常基于矿脂或其它石油衍生物的半固体制品。含有所选活性剂的乳膏一般是各种粘液或半固体乳液，常是水包油或油包水。乳膏基料通常是水溶性的，含有油相、乳化剂和水相。油相有时也称为“内部”相，其通常由矿脂和脂肪醇，例如鲸蜡醇或硬脂醇构成；水相体积通常大于油相，但不一定，且通常含有润湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。本领域技术人员应该知道，所用的特定软膏或乳膏基料能提供最佳药物递送。与其它载体或运载体一样，软膏基料应是惰性、稳定、无刺激性和非致敏的。
[0683] 如上所示，还包括各种口腔和舌下制剂。
[0684] 在某些实施方式中，提供的一种或多种本发明活性剂可以是“浓缩物”，例如在储存容器中(例如，预定体积)以便稀释，或在可溶胶囊中以便加入一定体积的水、醇、过氧化氢或其它稀释剂。
[0686] B)纳米乳液制剂
[0687] 在某些实施方式中，本文所述的靶向肽、抗微生物肽和/或嵌合部分(例如，STAMP)配制成纳米乳液。纳米乳液包括但不限于水包油(O/W)纳米乳液和油包水(W/O)纳米乳液。纳米乳液可定义为平均液滴直径为约20到约1000nm的乳液。平均液滴大小通常在约20nm或50nm和约500nm之间。术语亚微米乳液(SME)和迷你乳液作为同义词使用。
[0688] 示范性水包油(O/W)纳米乳液包括但不限于：
[0689] 表面活性剂胶束-由小分子表面活性剂或洗涤剂组成的胶束(例如，SDS/PBS/2-丙醇)，主要适合于疏水性肽。
[0690] 聚合物胶束-由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂组成的胶束(例如，Pluronic L64/PBS/2-丙醇)，主要适合于疏水性肽；
[0691] 混合胶束：其中有超过一种表面活性剂组分或其中液相之一(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束形成的胶束(例如，辛酸/PBS/EtOH)，主要适合于疏水性肽；
[0692] 整体肽胶束-混合胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，从而形成胶束主要部分(例如，两性肽/PBS/矿物油)，主要适合于两性肽；和
[0693] 皮克林(固相)乳液-其中肽与固体纳米颗粒的外部相连的乳液(例如，聚苯乙烯纳米颗粒/PBS/非油相)，主要适合于两性肽。
[0694] 示范性水包油(W/O)纳米乳液包括但不限于：
[0695] 表面活性剂胶束-由小分子表面活性剂或洗涤剂组成的胶束(例如，磺基琥珀酸二辛酯/PBS/2-丙醇)，主要适合于亲水性肽；
[0696] 聚合物胶束-由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂组成的胶束(例如，PLURONIC L121/PBS/2-丙醇)，主要适合于亲水性肽；
[0697] 混合胶束--其中有超过一种表面活性剂组分或其中液相之一(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束形成的胶束(例如，癸酸/辛酸甘油二酯/PBS/EtOH)，主要适合于亲水性肽；
[0698] 整体肽胶束-混合胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，从而形成胶束主要部分(例如，两性肽/PBS/聚丙二醇)，主要适合于两性肽；和
[0699] 皮克林(固相)乳液-其中肽与固体纳米颗粒的外部相连的乳液(例如，壳聚糖纳米颗粒/非水相/矿物油)，主要适合于两性肽。
[0700] 如上所述，在某些实施方式中，纳米乳液包含一种或多种表面活性剂或洗涤剂。在一些实施方式中，表面活性剂是非阴离子洗涤剂(例如，聚山梨醇酯表面活性剂、聚氧乙烯醚等)。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于表面活性剂，例如TWEEN TRITON 和TYLOXAPOL 家族化合物。
[0701] 在某些实施方式中，乳液还包含一种或多种含阳离子卤素的化合物，包括但不限于氯化十六烷基吡啶。在进一步的实施方式中，所述组合物还包含增加组合物与微生物的相互作用(“相互作用增强剂”)的一种或多种化合物(例如，螯合剂，如缓冲液中的乙二胺四乙酸，或亚乙基双(氧亚乙基次氨基)四乙酸)。
[0702] 在一些实施方式中，纳米乳液还包含乳化剂以促进乳液形成。乳化剂包括在油/水界面聚集的化合物，以形成防止毗邻的两液滴直接接触的一类连续膜。本发明的某些实施方式的特征在于水包油乳液组合物可用水稀释至所需浓度而不损害其抗病原体特性。
[0703] 除了分散在水相中的离散油滴外，某些水包油乳液还可含有其它脂质结构，例如小的脂质囊泡(例如，常由几个基本上同心的脂双层组成的脂质球，这些脂双层由水相层彼此隔开)、胶束(例如，两性分子，50-200个分子的小簇，它们排列成极性头对外朝向水相，而非极性尾朝内与水相隔绝)、或薄层相(其中各颗粒由平行两性双层组成的液体分散体，所述双层由水薄膜隔开)。
[0704] 疏水作用力驱动非极性残基(例如，长烃链)远离水，从而形成这些脂质结构。通常将以上脂质制品描述成表面活性剂脂质制品(SLP)。SLP对粘膜的毒性极低，认为其在小肠内代谢(参见，例如Hamouda等.，(1998)J.Infect.Disease 180：1939)。
[0705] 在某些实施方式中，乳液包含分布在水相中的不连续油相，包含醇和/或甘油的第一组分和包含表面活性剂或含卤素化合物的第二组分。水相可包含任何类型的水相，包括但不限于水(例如，去离子水、蒸馏水、自来水)和溶液(例如，磷酸缓冲盐水或其它缓冲液系统)。油相可包含任何类型的油，包括但不限于：植物油(例如，大豆油、鳄梨油、亚麻子油、椰油、棉籽油、角鲨烯油、橄榄油、芸苔油、玉米油、菜籽油、红花油和葵花子油)、动物油(例如，鱼油)、调味油、水不溶性维生素、矿物油和机油。在某些实施方式中，油相包含30-90体积％的水包油乳液(即，占最终乳液总体积的30-90％)，更优选50-80％。
[0706] 在某些实施方式中，如果存在醇，其是乙醇。
[0707] 虽然本发明不限于表面活性剂的性质，但在一些优选的实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯表面活性剂(例如，TWEEN 20 TWEEN 40 TWEEN 60 和TWEEN 80 )、苯氧基聚乙氧基乙醇(例如，TRITON X-100、X-301、X-165、X-102和X-200及TYLOXAPOL
)或十二烷基硫酸钠等。
)或十二烷基硫酸钠等。
[0708] 在某些实施方式中，存在含卤素的组分。含卤素化合物的性质，在一些优选的实施方式中，含卤素的化合物包含氯化物盐(例如，NaCl、KCl等)、卤化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化鏻、十二烷基三甲基卤化铵、十四烷基三甲基卤化铵、氯化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、溴化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化鏻、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵等。
[0709] 在某些实施方式中，乳液包含季铵化合物。季铵化合物包括但不限于：N-烷基二甲基苄基糖精铵、1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇；癸基磺基甜菜碱(1-Decanaminium)、N-癸基-N，N-二甲基-，氯化物(或)二癸基二甲基氯化铵；
2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；氯化烷基1或3苄基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉；
烷基二(2-羟乙基)苄基氯化铵；烷基脱甲基(demethyl)苄基氯化铵；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(55％C14、23％C12、20％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(41％C14、28％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(47％C12、18％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(55％C16、20％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(58％C14、28％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(60％C14、25％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C11、23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C12、23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(65％C12、25％C14)；
烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12、24％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12、25％
C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(90％C14、5％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(93％C14、4％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(95％C16、5％C18)；烷基二甲基苄基氯化铵(和)二癸基二甲基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(在脂肪酸中)；烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C16)；
烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C18)；烷基二甲基苄基和二烷基二甲基氯化铵；烷基二甲基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)；烷基二甲基乙基溴化铵(在大豆油的脂肪酸中混合烷基和烯基)；烷基二甲基乙基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C14)；烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、
3％C18)；烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)；烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)；烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵(C12-18)；二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基甲基苄基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二异癸基二甲基氯化铵；二辛基二甲基氯化铵；十二烷基二(2-羟乙基)辛基氢氯化铵；十二烷基二甲基苄基氯化铵；十二烷基氨甲酰基甲基二甲基苄基氯化铵；氯化十七烷基羟基乙基咪唑啉；六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪；肉豆蔻基苄基二甲基氯化铵(和)Quat RNIUM 14；N，N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物；n-烷基二甲基苄基氯化铵；n-烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物；辛基癸基二甲基氯化铵；辛基十二烷基二甲基氯化铵；辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵；氧基二亚乙基二(烷基二甲基氯化铵)；季铵化合物、二椰油基烷基二甲基、氯化物；三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵；三甲氧基甲硅烷季铵化乙烯吡咯烷酮聚合物、三甲基十二烷基苄基氯化铵；n-十二烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十六烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基乙基苄基氯化铵；和n-十八烷基二甲基苄基氯化铵。
2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；氯化烷基1或3苄基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉；
烷基二(2-羟乙基)苄基氯化铵；烷基脱甲基(demethyl)苄基氯化铵；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(55％C14、23％C12、20％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(41％C14、28％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(47％C12、18％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(55％C16、20％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(58％C14、28％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(60％C14、25％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C11、23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C12、23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(65％C12、25％C14)；
烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12、24％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12、25％
C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(90％C14、5％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(93％C14、4％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(95％C16、5％C18)；烷基二甲基苄基氯化铵(和)二癸基二甲基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(在脂肪酸中)；烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C16)；
烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C18)；烷基二甲基苄基和二烷基二甲基氯化铵；烷基二甲基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)；烷基二甲基乙基溴化铵(在大豆油的脂肪酸中混合烷基和烯基)；烷基二甲基乙基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C14)；烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、
3％C18)；烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)；烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)；烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵(C12-18)；二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基甲基苄基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二异癸基二甲基氯化铵；二辛基二甲基氯化铵；十二烷基二(2-羟乙基)辛基氢氯化铵；十二烷基二甲基苄基氯化铵；十二烷基氨甲酰基甲基二甲基苄基氯化铵；氯化十七烷基羟基乙基咪唑啉；六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪；肉豆蔻基苄基二甲基氯化铵(和)Quat RNIUM 14；N，N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物；n-烷基二甲基苄基氯化铵；n-烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物；辛基癸基二甲基氯化铵；辛基十二烷基二甲基氯化铵；辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵；氧基二亚乙基二(烷基二甲基氯化铵)；季铵化合物、二椰油基烷基二甲基、氯化物；三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵；三甲氧基甲硅烷季铵化乙烯吡咯烷酮聚合物、三甲基十二烷基苄基氯化铵；n-十二烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十六烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基乙基苄基氯化铵；和n-十八烷基二甲基苄基氯化铵。
[0710] 本领域技术人员熟知纳米乳液制剂及其制备方法，其描述于例如美国专利号：7,476,393、7,468,402、7,314,624、6,998,426、6,902,737、6,689,371、6,541,018、
6,464,990、6,461,625、6,419,946、6,413,527、6,375,960、6,335,022、6,274,150、
6,120,778、6,039,936、5,925,341、5,753,241、5,698,219、d5,152,923 和 Fanun
等.(2009)《微乳液：特性和应用(表面活性剂科学)》(Microemulsions：Properties and Applications(Surfactant Science))，CRC出版社，保拉拉屯，佛罗里达州。
6,464,990、6,461,625、6,419,946、6,413,527、6,375,960、6,335,022、6,274,150、
6,120,778、6,039,936、5,925,341、5,753,241、5,698,219、d5,152,923 和 Fanun
等.(2009)《微乳液：特性和应用(表面活性剂科学)》(Microemulsions：Properties and Applications(Surfactant Science))，CRC出版社，保拉拉屯，佛罗里达州。
[0711] C)优化活性的制剂
[0712] 在某些实施方式中，选择制剂以优化靶向肽、抗微生物肽、嵌合部分和/或STAMP的结合特异性和/或结合亲和力和/或抗微生物活性和/或稳定性/构象。就此而言，出乎意料地发现有盐存在下某些STAMP，推定是组成型靶向肽和/或抗微生物肽的活性得到优化。因此，考虑了某些实施方式，其中靶向肽和/或抗微生物肽和/或STAMP与一种或多种盐组合配制。然而，本文公开的制剂不限于含盐制剂。还考虑了在没有盐存在下配制靶向肽和/或抗微生物肽和/或STAMP的实施方式。
[0713] 在某些实施方式中，氯化钠加少量氯化钾使得测试盐的活性最佳。然而，其它盐，例如CaCl2、MgCl2、MnCl2也提高活性。因此，在某些实施方式中，考虑了靶向肽和/或抗微生物肽和/或嵌合部分和/或STAMP与一种或多种盐一起配制。
[0714] 在某些实施方式中，合适的盐包括许多药学上可接受的盐中的任一种。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、苯磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐与月桂基磺酸盐等(参见，例如Berge等.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)，虽然注意到柠檬酸盐似乎抑制某些STAMP的活性。
[0715] 在某些实施方式中，本发明的药学上可接受的盐包括所述化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如来自无毒的有机或无机酸。例如，这种常规无毒盐包括从无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等衍生的盐；从有机酸，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、延胡索酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、草酸、异硫羰酸等制备的盐。
[0716] 在其它情况中，本发明化合物可含有一个或多个酸性官能团，因此能与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物的相对无毒的、无机和有机碱加成盐。类似地，这些盐可以在给药载体或剂型制造过程中原位制备，或者用合适的碱例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，氨，或药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独处理游离酸形式的化合物来制备。代表性的碱或碱土盐包括锂、钠、钾、钙、镁与铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见，例如Berge等.，同上；Stahl和Wermuth(2002)《药物盐手册：特性、选择和应用》(Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use)，WV公司(Wiley-VCH)，苏黎世，瑞士)。
[0717] 在各种实施方式中，所述盐可以简单地是氯化钠和/或氯化钾，且容易制备成例如磷酸缓冲盐水(PBS)溶液。在某些实施方式中，盐浓度与0.5X PBS到约2.5X PBS，更优选约0.5X PBS到约1.5X PBS中的相当。在某些实施方式中，在1X PBS中观察到最优活性。
[0718] 在各种实施方式中，制剂的pH为约pH 5.0到约pH 8.5、优选约pH 6.0到约pH8.0、更优选约pH 7.0到约pH 8.0。在某些实施方式中，pH是约pH 7.4。
[0719] 虽然对于某些STAMP，利用PBS缓冲液系统观察到最优结果，但其它缓冲液系统也可接受。此类缓冲液包括但不限于：硫酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液、CHAPS缓冲液、PIPES缓冲液等，只要包含该盐。
[0720] 在各种实施方式中，靶向肽和/或抗微生物肽和/或嵌合部分和/或STAMP在制剂中的浓度是约1nM、到约1、10或100mM，更优选约1nM、约10nM、约100nM、约1μM，或约
10μM到约50μM、约100μM、约200μm、约300μM、约400μM、或约500μM，优选约1μM、约10μM、约25μM、或约50μM到约1mM、约10mM、约20mM、或约5mM，最优选约10μM、约
20μM、或约50μM到约100μM、约150μM、或约200μM。
10μM到约50μM、约100μM、约200μm、约300μM、约400μM、或约500μM，优选约1μM、约10μM、约25μM、或约50μM到约1mM、约10mM、约20mM、或约5mM，最优选约10μM、约
20μM、或约50μM到约100μM、约150μM、或约200μM。
[0721] D)家庭保健/卫生产品制剂
[0722] 在某些实施方式中，将本文所述靶向肽和/或抗微生物肽(AMP)和/或嵌合部分和/或STAMP中的一种或多种掺入保健制剂，例如以供家庭使用。此类制剂包括但不限于：牙膏、漱口水、牙齿增白条或溶液、隐形眼镜保存、润湿或清洁溶液、牙线、牙签、牙刷毛、口腔喷雾、口腔锭剂、鼻喷雾、口腔和/或鼻部应用的喷雾器、伤口敷料(例如，绷带)等。
[0723] 例如，抗变形链球菌的嵌合部分和/或STAMP和/或AMP很适合于抑制龋齿形成的频率或严重程度、牙菌斑形成、牙周病和/或口臭。
[0724] 抗棒状杆菌(Corynebacterium)的嵌合部分和/或STAMP和/或AMP在应用于皮肤表面时，能减少/消除棒状杆菌，从而减轻臭味。此类部分不难掺入肥皂、抗生素、防腐剂、消毒剂等。
[0725] 技术人员熟知此类保健产品制剂，将有效量(例如，预防剂量以抑制龋齿形成等)的抗微生物肽和/或嵌合构建物简单地加入此类制剂。
[0726] 例如，本领域技术人员熟知牙膏制剂。此类制剂通常是以下组分的混合物：研磨剂和表面活性剂；防龋齿剂，例如氟化物；牙垢控制成分，例如焦磷酸四钠和甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物；pH缓冲液；润湿剂，以防变干并增加舒适的口感；和粘合剂，以提供稠度和形状(参见，例如表17)。粘合剂使得固相适当地悬浮在液相中以防液相与牙膏分离。它们还为牙粉提供本体，特别是从管中挤到牙刷上之后。
[0727] 表17.牙膏的典型组分
[0728]成分 重量％
润湿剂 40-70
水 0-50
缓冲液/盐/牙垢控制剂 0.5-10
有机增稠剂(树胶) 0.4-2
无机增稠剂 0-12
研磨剂 10-50
活性物质(例如，三氯生) 0.2-1.5
表面活性剂 0.5-2
调味剂和甜味剂 0.8-1.5
润湿剂 40-70
水 0-50
缓冲液/盐/牙垢控制剂 0.5-10
有机增稠剂(树胶) 0.4-2
无机增稠剂 0-12
研磨剂 10-50
活性物质(例如，三氯生) 0.2-1.5
表面活性剂 0.5-2
调味剂和甜味剂 0.8-1.5
[0729] 氟化物源提供1000-15000ppm氟
[0730] 表18列出了制剂中所用的典型成分；最终的组合取决于例如成分相容性和成本、当地用户、所需益处和产品中的递送质量等因素。应该知道可将本文所述的一种或多种抗微生物肽和/或嵌合构建物简单地加入此类制剂或用于替代一种或多种其它成分。
[0731] 表18.典型成分列表
[0732]
[0733] 美国专利6,113,887描述的一种示范性制剂包含(1)水溶性杀菌剂，选自吡啶化合物、季铵化合物和双胍化合物，根据组合物的总重，其含量为0.001重量％到5.0重量％；(2)阳离子修饰的羟乙基纤维素，其羟乙基纤维素部分的平均分子量为1,000,000或更高，阳离子化程度为0.05到0.5摩尔/葡萄糖，根据组合物的总重，其含量为0.5重量％到5.0重量％；(3)选自聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物或烷醇酰胺化合物的表面活性剂，根据组合物的总重，其含量为0.5重量％到13重量％；和(4)非二氧化硅型的抛光剂，根据组合物的总重，其含量为5重量％到50重量％。在某些实施方式中，本文所述的抗微生物肽和/或嵌合构建物可用于替换杀菌剂或与杀菌剂联用。
[0734] 类似地，本领域技术人员也熟知漱口水制剂。因此，例如，美国专利号2,913,373、3,975,514和4,548,809，和美国专利公开US 2003/0124068A1、US 2007/0154410A1等
公开了含有氟化钠的漱口水。还知道含有各种碱金属化合物的漱口水：苯甲酸钠(WO
9409752)；碱金属次卤酸盐(US 20020114851A1)；二氧化氯(CN 1222345)；碱金属磷酸盐(US 2001/0002252A1，US 2003/0007937A1)；硫酸氢盐/碳酸氢盐(JP 8113519)；氯化十六烷基吡啶(CPC)(参见，例如US6,117,417、US 5,948,390和JP 2004051511)。还知道含有高级醇(参见，例如US 2002/0064505A1，US 2003/0175216A1)；过氧化氢(参见，例如CN
1385145)；CO2气泡(参见，例如JP 1275521和JP 2157215)的漱口水。在某些实施方式中，这些和其它漱口水制剂还可含有本发明AMP或复合AMP中的一种或多种。
公开了含有氟化钠的漱口水。还知道含有各种碱金属化合物的漱口水：苯甲酸钠(WO
9409752)；碱金属次卤酸盐(US 20020114851A1)；二氧化氯(CN 1222345)；碱金属磷酸盐(US 2001/0002252A1，US 2003/0007937A1)；硫酸氢盐/碳酸氢盐(JP 8113519)；氯化十六烷基吡啶(CPC)(参见，例如US6,117,417、US 5,948,390和JP 2004051511)。还知道含有高级醇(参见，例如US 2002/0064505A1，US 2003/0175216A1)；过氧化氢(参见，例如CN
1385145)；CO2气泡(参见，例如JP 1275521和JP 2157215)的漱口水。在某些实施方式中，这些和其它漱口水制剂还可含有本发明AMP或复合AMP中的一种或多种。
[0735] 本领域技术人员还熟知隐形眼镜保存、润湿或清洁溶液、牙线、牙签、牙刷毛、口腔喷雾、口腔锭剂、鼻喷雾和口腔和/或鼻部应用的喷雾器等，可改进它们以掺入本文所述的一种或多种抗微生物肽和/或嵌合构建物。
[0736] 以上药物和/或家庭保健制剂和/或器件是示范性而非限制性的。采用本文的讲授，本文所述的抗微生物肽和/或嵌合构建物可掺入其它产品。
[0737] E)示范性的口腔护理制剂
[0738] 本文所述的靶向肽和/或抗微生物肽和/或嵌合部分和/或STAMP可用于许多应用，如上文所述。在某些实施方式中，可利用抗变形链球菌STAMP、AMP和/或其它嵌合构建物降低龋齿的发生率或严重程度、抑制牙菌斑形成、减轻口臭等。因此，在某些实施方式中，此类部分包含在牙齿应用的装置和制剂中，例如茶或其它饮料、牙签涂层、牙线涂层、牙膏、凝胶、漱口水、清漆，甚至专业牙齿产品。
[0739] 在某些实施方式中，提供治疗或减轻牙周病的发病率、持续时间或严重程度的方法。所述方法可包括将包含本文所述靶向肽和/或抗微生物肽和/或STAMP和/或其它嵌合部分与载体/稳定剂的组合物给予牙龈沟或牙周袋。在应用的组合物中，载体/稳定剂可提供活性剂(例如，STAMP)的保留作用、组织透过、沉积和缓释以便减少牙周生物膜和相关组织内特定细菌群体。在某些实施方式中，载体剂透过和保留在牙龈沟或牙周袋和相关组织中，并缓释活性剂以加强对牙龈组织和牙质小管组织内所选细菌群体的减少作用。
[0740] 在各种实施方式中，载体剂可包括但不限于：聚乳酸、聚乙醇酸、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸内酯、基于纤维素的聚合物、乙二醇聚合物及其共聚物、氧乙烯聚合物、聚乙烯醇、壳聚糖和透明质烷及其共聚物。在一方面，载体剂包括羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、壳聚糖、透明质烷及其共聚物、或它们的组合。在另一方面，载体剂包括透明质烷或透明质酸和共聚物，包括透明质酸的盐、透明质酸的酯、透明质酸的交联凝胶、透明质酸的酶促衍生物、透明质酸的化学修饰衍生物或其组合。本文所用的透明质酸广义指各种分子量的酸性多糖的天然产生的、微生物和合成的衍生物，所述多糖由D-葡糖醛酸多糖和N-乙酰基-D-葡糖胺残基构成。
[0741] 在某些实施方式中，活性剂(例如，STAMP、AMP等)和载体试剂是混合物形式、复合物形式，共价偶联，或其组合。在某些实施方式中，载体试剂包含生物粘合剂。合适的生物粘合载体剂包括但不限于：基于纤维素的聚合物和/或糊精。合适的基于纤维素的聚合物包括但不限于：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟甲基纤维素或其混合物。在一个示范性实施方式中，生物粘合载体剂包括聚乳酸、聚乙醇酸、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙二醇、透明质烷、透明质酸、壳聚糖或其混合物。在某些实施方式中，生物粘合载体剂可包括含有聚乙二醇、透明质烷、透明质酸、壳聚糖的共聚物，或其混合物。
[0742] 在某些实施方式中，载体剂透过牙周组织。合适的透过性载体剂包括但不限于：透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物或其混合物。在一个实施方式中，透过性载体剂包括透明质酸的盐、透明质酸的酯、透明质酸的酶促衍生物、透明质酸的交联凝胶、透明质酸的化学修饰衍生物或其组合。
[0743] V.微生物检测
[0744] 如上所示，靶向部分和/或STAMP可用于诊断组合物和方法以测定环境、食物、生物样品等中一种或多种微生物的存在与否和/或含量。
[0745] 例如，靶向肽-抗微生物肽缀合物(例如，特异性靶向抗微生物肽(STAMP))可用作诊断试剂。STAMP(和本文所述的其它靶向抗微生物构建物)能特异性结合微生物如变形链球菌，透过或破坏它们的膜，从而不能透过细胞的染料或其它试剂(碘化丙啶等)可进入该微生物，或者使得所靶向微生物的胞内分子或内含物(ATP、DNA、钙等)释放入环境以供分析。在一个方法中，STAMP，例如C16G2可在制备的培养物或临床样品本身、体外或体内生物膜中透过或破坏靶微生物的膜，例如变形链球菌。向样品中加入细胞不可透过的染料(例如，碘化丙啶等)以标记和检测STAMP所靶向的那些微生物。还可加入细胞可透过的染料(例如，SYTO9)以标记和检测样品中整个微生物群体。然后可通过荧光显微术、荧光测定法、流式细胞术或其它方法定量测定标记的细胞。
[0746] 在另一例子中，STAMP处理的样品与萤光素酶和与STAMP处理细胞所释放ATP反应的荧光素混合，得到的荧光用于检测和定量测定靶向的细胞。
[0747] VI.试剂盒
[0748] 在另一实施方式中，本发明提供在哺乳动物中抑制感染和/或治疗和/或预防龋齿的试剂盒。所述试剂盒通常包括含有本文所述一种或多种活性剂(即，抗微生物肽和/或嵌合构建物)的容器。在某些实施方式中，可以单位剂量制剂(例如，栓剂、片剂、囊片、贴剂等)提供活性剂，和/或可任选与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
[0749] 在某些实施方式中，所述试剂盒包含本文所述的一种或多种家庭保健产品制剂(例如，牙膏、漱口水、牙齿增白条或溶液、隐形眼镜保存、润湿或清洁溶液、牙线、牙签、牙刷毛、口腔喷雾、口腔锭剂、鼻喷雾、口腔和/或鼻部应用的喷雾器等)。
[0750] 在某些实施方式中，提供试剂盒以便检测和/或定位和/或定量测定某些靶微生物和/或包含某些靶微生物的细胞或组织和/或具有某些靶微生物的假体和/或包含某些靶微生物的生物膜。在各种实施方式中，这些试剂盒通常包含嵌合部分，而所述嵌合部分含有本文所述的靶向部分和可检测标记和/或连接于亲和标签的靶向部分以便用于本文所述预靶向方案。
[0751] 此外，所述试剂盒任选包括标记和/或使用说明材料，为实施本发明方法或本发明“治疗剂”或“预防剂”或检测试剂的应用提供指导(即，操作方法)。某些使用说明材料描述了治疗性或预防性应用一种或多种本发明活性剂以抑制或防止感染和/或抑制龋齿形成。使用说明材料还可任选教授优选的剂量/治疗方案、禁忌症等。
[0752] 虽然使用说明材料通常包含书面或打印材料，但它们不限于此。本发明包括能保存此类使用说明并将它们告知最终用户的介质。此类介质包括但不限于：电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式贮存器、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可包括提供所述说明材料的因特网地址。实施例
[0753] 提供以下实施例以说明而非限制进行权利要求的本发明。
[0754] 实施例1
[0755] “双重靶向”抗微生物肽的设计和活性
[0756] 许多报道表明人正常菌群在防止微生物病理学状况和疾病中的重要作用。证据提示粘膜表面的感染是微生物群体内子群或簇所致，与单独一种病原性生物无关。为维持保护性正常菌群而同时处理群体内的大多数感染性细菌，需要能区分良性“旁观者”和多种病原性生物的可调式治疗剂。在此，我们描述了此类多靶向抗微生物剂：多头特异性靶向抗微生物肽(MH-STAMP)的原理论证。完整的MH-STAMP，M8(KH)-20表现出体外抗靶向微生物(铜绿假单胞菌和变形链球菌)的特定活性，可从混合漂浮培养物中除去两种微生物而对非靶向的细菌影响很小。这些结果证明可从多种抗微生物肽前体构建功能性双靶向分子。
[0757] 引言
[0758] 近30年来，大量研究了抗微生物肽(AMP)作为小分子抗生素的替代方案以及日益增长的抗生素耐药性细菌感染危机的可能解决之道(Ganz(2003)Nat Rev Immunol.，3：710-720；Hancock和Lehrer(1998).，16：82-88)。许多报道鉴定了天然来源的潜在AMP，由于固相肽合成(SPPS)的可接近性质，还进行了大量工作来设计“定制”AMP(Genco等.(2003)Int J Antimicrob Agents，21：75-78；He和Eckert(2007)Antimicrob Agents Chemother.，51：1351-1358)。后者的数个例子对真菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及一些被膜病毒表现出显著的体外活性(Brogden(2005)Nat Rev Microbiol.3：238-250)。
[0759] 与即便渐增地修饰基础结构时也可能丧失活性的小分子抗生素不同，肽是分子改变的方便“画布”。可通过掺入或多或少的疏水性或带电氨基酸来优化AMP，所述掺入已显示影响革兰氏阳性、革兰氏阴性或真菌膜的选择性(Muhle和Tam JP(2001)Biochemistry，40：5777-5785；Tossi等.(2000)Biopolymers 55：4-30)。此外，可利用赖氨酸残基提高每μM的AMP活性。在该方法中，多条AMP链可通过赖氨酸ε-胺的分支连接于一个肽支
架 (Tam 等 .(2992)Eur.J.Biochem.，269：923-932；Pini 等 .(2005)Antimicrob Agents Chemother.，2005；49：2665-2672)。可通过连接于靶向肽区域来特异性调节AMP活性，如所述用于一类新型分子，特异性靶向抗微生物肽或STAMP(Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：3651-3657；Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，
50：1480-1488)。这些嵌合分子可由线性肽序列内功能上独立的靶向和杀伤部分组成。可去除多种细菌群体中靶向肽识别(即，结合)的病理性细菌，而对“旁观”正常菌群影响甚微。作为此概念的延伸，我们假设可利用中心赖氨酸残基分支点构建多个靶向肽“头”连接于一个AMP的STAMP。靶向“头”可能对同一病原体具有特异性，或具有不同的结合特征。
采用前一方法，可抑制或降低靶向肽相关的微生物耐受性进化，因为微生物群体无一具有在一个细胞中突变多个离散靶向肽受体的遗传学多样性(Drake等.(1998)Genetics 148：
1667-1686)。
架 (Tam 等 .(2992)Eur.J.Biochem.，269：923-932；Pini 等 .(2005)Antimicrob Agents Chemother.，2005；49：2665-2672)。可通过连接于靶向肽区域来特异性调节AMP活性，如所述用于一类新型分子，特异性靶向抗微生物肽或STAMP(Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：3651-3657；Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，
50：1480-1488)。这些嵌合分子可由线性肽序列内功能上独立的靶向和杀伤部分组成。可去除多种细菌群体中靶向肽识别(即，结合)的病理性细菌，而对“旁观”正常菌群影响甚微。作为此概念的延伸，我们假设可利用中心赖氨酸残基分支点构建多个靶向肽“头”连接于一个AMP的STAMP。靶向“头”可能对同一病原体具有特异性，或具有不同的结合特征。
采用前一方法，可抑制或降低靶向肽相关的微生物耐受性进化，因为微生物群体无一具有在一个细胞中突变多个离散靶向肽受体的遗传学多样性(Drake等.(1998)Genetics 148：
1667-1686)。
[0760] 具有不同细菌靶标的多头STAMP(MH-STAMP)分子可用于治疗多细菌感染，或可有利地除去一群生物膜组分而无需利用几种不同的分子，例如同时治疗龋齿和牙周
炎，或除去分别涉及痤疮和皮肤感染的丙酸杆菌(Propionibacteria spp)和葡萄球菌
(Staphylococcus spp)。
炎，或除去分别涉及痤疮和皮肤感染的丙酸杆菌(Propionibacteria spp)和葡萄球菌
(Staphylococcus spp)。
[0761] 在该实施例中，我们提供此类MH-STAMP、M8(KH)-20的原理论证设计，合成和体外活性。以前，我们坚鉴定了两个功能性STAMP靶向结构域，一个特异性识别生龋齿病原体变形链球菌(Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：3651-3657)，另一个具有假单胞菌-水平选择性(Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：3833-3838)。与正常的广谱线型AMP连接在一起，我们观察到体外特异性抗铜绿假单胞菌和变形链球菌的抗微生物作用。此外，用多头MH-STAMP处理混合细菌群体导致特异性除去靶微生物，而对“旁观”群体水平影响很小。
[0762] 方法和材料
[0763] 细菌菌株和生长条件
[0764] 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC 15692、肺 炎 克 雷 伯 杆 菌KAY 2026(Sprenger 和Lengeler(1984)J Bacteriol.，157：39-45)、大肠杆菌DH5α(pFW5，大观霉素抗性)(Podbielski等.(1996)Gene，177：137-147)、金 黄 色 葡 萄 球 菌Newmann(Duthie 和Lorenz(1952)J Gen Microbiol.，6：95-107)和表皮葡萄球菌ATCC 35984在37℃，需氧条件下培养并剧烈振荡。需氧革兰氏阴性微生物在Lauri-Bertaini(LB)肉汤中生长，革兰氏阳性菌在脑心浸液(BHI)肉汤中生长。在37℃，厌氧条件下(80％N2，15％CO2，5％H2)，变形链球菌JM11(大观霉素抗性，UA140背景)生长于Todd-Hewitt(TH)肉汤培养(Merritt
等.(2005)J Microbiol Meth.，61：161-170)。所有细菌生长过夜至OD600为0.8-1.0，然后适当稀释并作抗微生物检验。
等.(2005)J Microbiol Meth.，61：161-170)。所有细菌生长过夜至OD600为0.8-1.0，然后适当稀释并作抗微生物检验。
[0765] 合成多头STAMP肽
[0766] 采用常规固相肽合成(SPPS)方法构建图15所示的全部肽(Symphony合成仪，PTI，图森，亚利桑那州)。化学试剂、氨基酸和合成树脂购自加利福尼亚州圣何塞的安娜斯派克公司(Anaspec，San Jose，CA)。BD2.20(FIRKFLKKWLL(SEQ ID NO：3235)，酰胺化c末端，分子量(mw)1491.92)是本实验室开发的抗微生物肽，其对许多细菌种类有强效的抗微生物活性(表19)，其用作连接不同靶向肽的根序列：首先，通过SPPS合成BD2.20(Rink-酰胺-MBHA树脂，0.015mmol)，然后将功能化烷烃(NH2(CH2)7COOH)和Fmoc-保护的Lys(用
4-甲基三苯己基(Mtt)保护侧链)分步偶联于N末端。随后采用标准SPPS方法将变形链
球菌靶向肽M8加上三Gly接头区域(TFFRFLNR-GGG(SEQ ID NO：3236))分步加入中心Lys的N末端。Fmoc-M8-GGG-K(Mtt)-(CH2)7CO-BD2.20(SEQ ID NO：3237)装配后，用DMF配制的25％哌啶除去Fmoc基团，用Ac2O/DIEA(1∶1，20摩尔过量)处理2小时使乙酰基重新
保护N末端。然后中心Lys的Mtt保护的氨基选择性暴露于DCM配制的2％TFA(1.5mL)15
分钟(三轮，每轮5分钟)。将得到的产物再次加载入合成仪，采用标准Fmoc SPPS方法完成从Lys侧链构建肽序列。如图15所示，完整的MH-STAMP M8(KH)-20含有侧链肽KH(假
单胞菌-靶向，KKHRKHRKHRKH-GGG(SEQ ID NO：3238))，而在MH-STAMP M8(BL)-20中，使用不结合细菌的肽(数据未显示)BL-1(DAANEA-GGG)。构建与M8(KH)-20相同的BL(KH)-20，利用BL-1替代M8(图15)。
4-甲基三苯己基(Mtt)保护侧链)分步偶联于N末端。随后采用标准SPPS方法将变形链
球菌靶向肽M8加上三Gly接头区域(TFFRFLNR-GGG(SEQ ID NO：3236))分步加入中心Lys的N末端。Fmoc-M8-GGG-K(Mtt)-(CH2)7CO-BD2.20(SEQ ID NO：3237)装配后，用DMF配制的25％哌啶除去Fmoc基团，用Ac2O/DIEA(1∶1，20摩尔过量)处理2小时使乙酰基重新
保护N末端。然后中心Lys的Mtt保护的氨基选择性暴露于DCM配制的2％TFA(1.5mL)15
分钟(三轮，每轮5分钟)。将得到的产物再次加载入合成仪，采用标准Fmoc SPPS方法完成从Lys侧链构建肽序列。如图15所示，完整的MH-STAMP M8(KH)-20含有侧链肽KH(假
单胞菌-靶向，KKHRKHRKHRKH-GGG(SEQ ID NO：3238))，而在MH-STAMP M8(BL)-20中，使用不结合细菌的肽(数据未显示)BL-1(DAANEA-GGG)。构建与M8(KH)-20相同的BL(KH)-20，利用BL-1替代M8(图15)。
[0767] 表19.MH-STAMP和组成肽的MIC
[0768]
[0769] 平均MIC与标准偏差，n＝10次试验.
[0770] 通过茚三酮测试监测合成进展，利用合适的清除剂，以95％TFA从树脂上切割完整的肽，在甲基叔丁基醚中沉淀。采用线性梯度的渐增流动相(含0.1％TFA的10到90％乙腈水溶液)和Waters XBridge BEH 130 C18柱(4.6x100mm，颗粒大小5μm)，通过HPLC确认纯化和MH-STAMP质量。215nm的吸光度作为监测波长，也收集260到280nm(吸光度)。用MassLynx软件4.1版(Waters)分析LC图谱。采用基体辅助激光解吸电离(MALDI)质谱
法确认正确的肽质量(Voyager System 4291，应用生物系统公司(Applied Biosystems))(Anderson等.(2008)Biotechnol Lett.，30：813-818)。
法确认正确的肽质量(Voyager System 4291，应用生物系统公司(Applied Biosystems))(Anderson等.(2008)Biotechnol Lett.，30：813-818)。
[0771] MIC试验
[0772] 如以前所述，通过肉汤微量稀释评估肽的基础抗微生物活性(Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：3651-3657；Eckert 等 .(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：1480-1488)。简言之，用TH(变形链球菌)或Mueller-Hinton(MH)肉汤(所有其它微生物)稀释约lx105cfu/mL细菌，分配至96孔板。然后加入连续稀释(2倍)的肽，将平板在37℃孵育18-24小时。肽MIC测定为肉眼观察到完全抑制微生物生长(透明孔)的肽浓度。所有实验进行10次。
[0773] 抗生素后效应试验
[0774] 10分钟孵育后，通过生长迟滞实验测定MH-STAMP对单一培养物中靶向和非靶向细菌的活性和选择性，如前所述(同前)。用MH(或对于变形链球菌用含1％蔗糖的TH)将过夜培养物的细胞稀释至约5x106cfu/mL，根据OD6000.05-0.1标准化并接种入96-孔板。然后培养物在合适条件下生长2小时(变形链球菌生长3小时)，然后加入肽，10分钟。然后以3000x g离心平板5分钟，弃去上清液，加入新鲜培养基(MH或对于变形链球菌用不含蔗糖的TH)，再次温育。然后通过OD600监测处理后细菌随时间的生长情况。
[0775] 微生物群体迁移试验
[0776] 利用铜绿假单胞菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和变形链球菌的混合漂浮群体检验处理后MH-STAMP针对培养物内各种细菌组合的可能性。在BHI中将样品制备为含有：约4 4
6x 10cfu/mL变形链球菌、约2x 10cfu/mL大肠杆菌、约2x104cfu/mL表皮葡萄球菌和
4
约0.5x 10cfu/mL铜绿假单胞菌(混合后立即加入肽)。然后加入肽(10μM)或模拟处
理(1xPBS)，样品在37℃、厌氧条件下(80％N2，15％CO2，5％H2)孵育24小时。孵育后，用
1xPBS连续稀释样品(1∶10)，然后将各稀释度的等份试样点于混合物中各细菌的选择性琼脂平板：TH+800μg/mL大观霉素(变形链球菌)、LB+25μg/mL氨苄西林(铜绿假单胞
菌)、LB+200μg/mL大观霉素(大肠杆菌)和甘露醇盐琼脂(MSA，表皮葡萄球菌)以定量
测定各细菌中的存活菌落。然后于37℃，在需氧条件下(TH平板作厌氧温育)温育平板，24小时后计数菌落以测定存活菌落。接种到选择性培养基上时，观察各细菌的预计菌落形态。
采取革兰氏染色和直接显微镜观察(所选的分离菌落)以验证细菌特性(数据未显示)。
该试验的检测下限是200cfu/mL。
6x 10cfu/mL变形链球菌、约2x 10cfu/mL大肠杆菌、约2x104cfu/mL表皮葡萄球菌和
4
约0.5x 10cfu/mL铜绿假单胞菌(混合后立即加入肽)。然后加入肽(10μM)或模拟处
理(1xPBS)，样品在37℃、厌氧条件下(80％N2，15％CO2，5％H2)孵育24小时。孵育后，用
1xPBS连续稀释样品(1∶10)，然后将各稀释度的等份试样点于混合物中各细菌的选择性琼脂平板：TH+800μg/mL大观霉素(变形链球菌)、LB+25μg/mL氨苄西林(铜绿假单胞
菌)、LB+200μg/mL大观霉素(大肠杆菌)和甘露醇盐琼脂(MSA，表皮葡萄球菌)以定量
测定各细菌中的存活菌落。然后于37℃，在需氧条件下(TH平板作厌氧温育)温育平板，24小时后计数菌落以测定存活菌落。接种到选择性培养基上时，观察各细菌的预计菌落形态。
采取革兰氏染色和直接显微镜观察(所选的分离菌落)以验证细菌特性(数据未显示)。
该试验的检测下限是200cfu/mL。
[0777] 结果
[0778] 多头STAMP的设计和合成
[0779] 我们从已建立的靶向肽KH(假单胞菌特异性)和M8(变形链球菌特异性)构建原型MH-STAMP。对于所有MH171 STAMP构建，利用广谱抗微生物肽BD2.20作为基础AMP。
BD2.20是有阳离子和两性残基布置的新合成AMP，对各种革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物有强效MIC(表19)。为合成MH-STMAP M8(KH)-20(构建物见图15)，将BD2.20和Lys(Mtt
保护的侧链)残基经活化的烷烃间隔区连接，然后将M8靶向肽加入该产物的N末端。然后进行中心Lys(Mtt)侧链的选择性去保护并连接KH靶向肽。通过HPLC和MALDI质谱法验
证正确的分子量(4888.79)和约90％的纯度(图16)。
BD2.20是有阳离子和两性残基布置的新合成AMP，对各种革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物有强效MIC(表19)。为合成MH-STMAP M8(KH)-20(构建物见图15)，将BD2.20和Lys(Mtt
保护的侧链)残基经活化的烷烃间隔区连接，然后将M8靶向肽加入该产物的N末端。然后进行中心Lys(Mtt)侧链的选择性去保护并连接KH靶向肽。通过HPLC和MALDI质谱法验
证正确的分子量(4888.79)和约90％的纯度(图16)。
[0780] 非结合“空白”靶向肽BL-1纳入合成方案，替代KH或M8以构建具有单一功能靶向头的变体MH-STAMP：M8(BL)-20和BL(KH)-20。观察到这些MH-STAMP的正确分子量(MW)和可接受的纯度(图15，数据未显示)。
[0781] 多头构建物的通用抗微生物活性
[0782] 合成后，通过抗一组细菌的MIC评估完整MH-STAMP的总体抗微生物活性。如表19所示，发现MH-STAMP构建物M8(KH)-20、BL(KH)-20和M8(BL)-20对检测的微生物的活性特征与BD2.20相似(10倍差异中少于两个滴定步骤)。此外，我们观察到铜绿假单胞菌和其它测试微生物之间有总体敏感性的差异，提示该细菌更耐受BD2.20。总之，这些数据表明能耐受将靶向结构域加入基础序列，并且不完全抑制抗微生物肽的活性。
[0783] 采用这些方法不能测定肽选择性，因为STAMP和其亲代AMP分子常表现出相似MIC，但由于靶向区域介导的特异性杀伤增加而具有根本不同的抗微生物动力学特性和选择性(同前)。因此，我们进行不同实验以测试抗微生物选择性和功能性MH-STAMP构建。
[0784] MH-STAMP构建物的选择性和抗生素后效应
[0785] 采用经典抗生素后效应试验的改进形式确认MH-STAMP抗微生物动力学特性，该试验检测短暂接触期后物质影响生物生长的能力。MH-STAMP-靶向和未靶向生物的单培养物暴露于M8(KH)-20、M8(BL)-20、BL(KH)-20或未修饰的BD2.20，然后可回收。如图17A所示，含有M8的构建物(M8(KH)-20、M8(BL)-20)有效延滞变形链球菌生长，但缺乏该区域的MH-STAMP构建物(BL(KH)-20)不改变其生长。类似地，其它靶向细菌铜绿假单胞菌的生长以KH-依赖性方式受到抑制(图17B)。相比之下，非靶向细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌不受任何MH-STAMP处理的抑制，仅受基础抗微生物肽BD2.20的抑制，其对所有检测的菌株表现出强抗微生物活性。这些结果表明含有KH或M8靶向结构域的MH-STAMP分别具有抗铜绿假单胞菌或变形链球菌的活性，而对其它细菌没有活性。此外，用非结合肽替换靶向区域消除了特定活性。
[0786] MH-STAMP引导混合细菌群体中“群体移动”的能力
[0787] 我们假定潜在的MH-STAMP双功能可影响混合群体中特定组的细菌，从而促进非靶向生物的生长并“移动”组成。为检测该可能性，连续处理漂浮细胞的指定混合群体，24小时后检测群体的构成。如图18所示，24小时后，用广谱AMP BD2.20处理导致24小时后混合物中所有种类的可回收cfu/mL显著丧失。发现用M8(KH)-20处理能改变该模式；我们5
观察到约1x10cfu/mL存活的大肠杆菌和表皮葡萄球菌，但未回收变形链球菌或铜绿假单胞菌cfu/mL。在BL(KH)-20处理的样品中，未观察到铜绿假单胞菌cfu/mL，虽然我们从变形链球菌回收的高于输入cfu/mL，而表皮葡萄球菌和大肠杆菌数未改变。在接触M8(BL)-20的样品中，与输入cfu/mL相比，变形链球菌可回收cfu/mL极大降低，而其它种类未受影响或影响程度较低。令人感兴趣的是，这些结果提示M8(KH)-20、M8(BL)-20和BL(KH)-20保留其影响存在的靶向区域识别生物的能力，即便在细菌的混合群体中。
观察到约1x10cfu/mL存活的大肠杆菌和表皮葡萄球菌，但未回收变形链球菌或铜绿假单胞菌cfu/mL。在BL(KH)-20处理的样品中，未观察到铜绿假单胞菌cfu/mL，虽然我们从变形链球菌回收的高于输入cfu/mL，而表皮葡萄球菌和大肠杆菌数未改变。在接触M8(BL)-20的样品中，与输入cfu/mL相比，变形链球菌可回收cfu/mL极大降低，而其它种类未受影响或影响程度较低。令人感兴趣的是，这些结果提示M8(KH)-20、M8(BL)-20和BL(KH)-20保留其影响存在的靶向区域识别生物的能力，即便在细菌的混合群体中。
[0788] 讨论
[0789] 结果表明我们成功地构建了具有双重抗微生物特异性的STAMP，而这种特异性由分子中存在的靶向肽控制；KH用于假单胞菌，M8用于变形链球菌。在封闭的多种类系统中(图18)，易辨别M8(KH)-20的双重特异性：MH-STAMP处理后培养物的群体“移动”偏离靶向的微生物。除去靶向的细菌，未靶向生物群在不同程度上增加至输入cfu/mL以上。此外，用非结合肽BL-1中断MH-STAMP构建物中的KH或M8预计仅消除一种靶向的种类。这些结果支持可从广谱的基础AMP构建功能性MH-STAMP这一假定。
[0790] 宏基因组学的出现和更灵敏的分子诊断方法的发展推动人相关微生物生态学和宿主-微生物相互作用的理解加深(Aas等.(2005)J Clin Microbiol.，43：5721-5732；Boman(2000)Immunol Rev.，173：5-16；Kreth等.(2005)J Bacteriol.，187：7193-7203)。
在粘膜表面，我们的身体明显具有丰富的驻留菌群，它们可能影响先天和体液免疫力、营养物可用性、抗病原体的保护作用、甚至宿主生理学特征(Metges(2000)J Nutr.，130：
1857S-64；Sears(2005)Anaerobe，11：247-251；Lievin-Le 等 .(2006)Clin Microbiol Rev.，19：315-337；DiBaise 等 .(2008)Mayo Clinic Proceedings 83：460-469)。 此外，观测结果表明正常菌群多样性的改变与负面临床结果有关；例如，生龋齿期间口腔中变形链球菌过度生长(与蔗糖摄取有关)或艰难梭菌在肠道中的抗生素辅助集群
(Loesche(1986)Microbiol Rev.，50：353-380；Gould 和 McDonald(2998)Crit Care 12：
203)。其它群体改变可能与腋臭(棒状杆菌(Corynebacteria spp))(Leyden等.(1981)
J Invest Dermatol.，77：413-416；Elsner(2006)Curr Probl Dermatol.，33：35-41) 或者甚至宿主肥胖有关。由于所存在微生物的数量和多样性，粘膜表面的发病机理不大可能与一种菌株或种类的过度生长有关。通常，群体改变导致两种或更多种类占优势；例如，囊性纤维化气道中主要是洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和铜绿假单胞菌或在牙龈炎中是齿垢密螺旋体和牙龈卟啉单胞菌及其它“红簇(red cluster)”生物(Govan和 Deretic(1996)Microbiol Rev.，60：539-574；Paster 等 .(2001)J Bacteriol.，183：
3770-3783)。在许多情况中(例如后者)，这些种类可仅具有远的系统发生关系，对抗生素治疗显示不同的敏感性，从而即便治疗依然导致持久的疾病进展(Schlessinger(1988)Clin Microbiol Rev.，1：54-59；Tresse 等 .(1997)J Antimicrob Chemother.，40：
419-421)。目前，粘膜表面感染的可用治疗多是非特异性的(传统的小分子抗生素、机械除去)，因此不能有效维持菌群或将组成平衡改变回健康相关组成(Keene和Shklair(1974)J Dent Res.，53：1295)。需要能选择性靶向多种病原体的治疗性处理，而无论它们的系统发生关系，MH-STAMP有助于实现该目的。
在粘膜表面，我们的身体明显具有丰富的驻留菌群，它们可能影响先天和体液免疫力、营养物可用性、抗病原体的保护作用、甚至宿主生理学特征(Metges(2000)J Nutr.，130：
1857S-64；Sears(2005)Anaerobe，11：247-251；Lievin-Le 等 .(2006)Clin Microbiol Rev.，19：315-337；DiBaise 等 .(2008)Mayo Clinic Proceedings 83：460-469)。 此外，观测结果表明正常菌群多样性的改变与负面临床结果有关；例如，生龋齿期间口腔中变形链球菌过度生长(与蔗糖摄取有关)或艰难梭菌在肠道中的抗生素辅助集群
(Loesche(1986)Microbiol Rev.，50：353-380；Gould 和 McDonald(2998)Crit Care 12：
203)。其它群体改变可能与腋臭(棒状杆菌(Corynebacteria spp))(Leyden等.(1981)
J Invest Dermatol.，77：413-416；Elsner(2006)Curr Probl Dermatol.，33：35-41) 或者甚至宿主肥胖有关。由于所存在微生物的数量和多样性，粘膜表面的发病机理不大可能与一种菌株或种类的过度生长有关。通常，群体改变导致两种或更多种类占优势；例如，囊性纤维化气道中主要是洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和铜绿假单胞菌或在牙龈炎中是齿垢密螺旋体和牙龈卟啉单胞菌及其它“红簇(red cluster)”生物(Govan和 Deretic(1996)Microbiol Rev.，60：539-574；Paster 等 .(2001)J Bacteriol.，183：
3770-3783)。在许多情况中(例如后者)，这些种类可仅具有远的系统发生关系，对抗生素治疗显示不同的敏感性，从而即便治疗依然导致持久的疾病进展(Schlessinger(1988)Clin Microbiol Rev.，1：54-59；Tresse 等 .(1997)J Antimicrob Chemother.，40：
419-421)。目前，粘膜表面感染的可用治疗多是非特异性的(传统的小分子抗生素、机械除去)，因此不能有效维持菌群或将组成平衡改变回健康相关组成(Keene和Shklair(1974)J Dent Res.，53：1295)。需要能选择性靶向多种病原体的治疗性处理，而无论它们的系统发生关系，MH-STAMP有助于实现该目的。
[0791] 在单培养物实验中(图17)，我们的结果提示MH-STAMP中包含M8或KH驱动针对变形链球菌或铜绿假单胞菌的活性，存在靶向结构域还降低亲代AMP BD2.20抗非靶向生物的活性。相反，MIC试验的结果(表19)表明BD2.20和任何MH-STAMP之间的活性差异极小。针对非靶向生物，M8和KH区域对BD2.20活性可能具有负面，但非完全抑制性的影响。由于MIC试验中活性的持续时间长且接种量较低(与图17中的实验相比)，可能所有含BD2.20的肽可实现相等水平的生长抑制，虽然抗微生物速度中有较大和靶标特异性差异。当利用针对变形链球菌和门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的STAMP比较靶向和非靶向生物的MIC时，也观察到该结果模式(Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，
50：3651-3657；Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：1480-1488)。
50：3651-3657；Eckert等.(2006)Antimicrob Agents Chemother.，50：1480-1488)。
[0792] 尽管需要更严格的区域研究和医学上更相关的病原体靶标组合，但这些观测结果表明可设计基于抗微生物肽的、具有多种和指定体外保真度的疗剂。MH-STAMP可有助于通过促进健康的微生物构成而改善人体健康。
[0793] 实施例2
[0794] 合成肽-卟啉缀合物：
[0795] 将600mL干燥二氯甲烷(DCM)∶DMF∶二甲基亚砜(DMSO)(1∶1∶1(v/v))中的偶联剂HATU(5当量过量，10mg)和红紫素-18(分子量564，5当量过量，15mg)的混合物加入肽树脂(1摩尔当量，15mg)，所述树脂于反应前在最低限度DMF中放置30分钟使之溶胀。
然后将26μL(10摩尔当量)DIPEA加入反应烧瓶以起始反应。用氩气保护反应混合物，室温下搅拌3小时。
然后将26μL(10摩尔当量)DIPEA加入反应烧瓶以起始反应。用氩气保护反应混合物，室温下搅拌3小时。
[0796] 完成后，反应混合物随后通过烧结玻璃过滤小瓶，用DMF和DCM充分洗涤以除去所有废试剂。然后真空干燥树脂过夜，室温下用1ml三氟乙酸(TFA)/苯甲硫醚/水/
EDT(10/0.5/0.5/025)切割2小时，用10mL甲基-叔丁基醚沉淀切割溶液。用相同量的醚洗涤沉淀物两次。
EDT(10/0.5/0.5/025)切割2小时，用10mL甲基-叔丁基醚沉淀切割溶液。用相同量的醚洗涤沉淀物两次。
[0797] 实施例3
[0798] 合成肽-CSA缀合物
[0799] 在冰浴中，向300μL DMF配制的完全保护肽(B43-GGG溶液(FIDSFIRSF-GGG，0.025mmol)和三-Boc-CSA-15(0.0125mol)中加入DCC(7.7mg)、HOBt(5.1mg)和13μL
DIEA。室温下搅拌4天后，将反应混合物倒入5ml水中，用氯仿(5×3mL)萃取。真空下蒸发CHCl3萃取物，在干燥器中干燥过夜。然后在冰浴中将干燥的CHCl3萃取物溶解于1mL DCM，再加入1mL TFA。室温下再搅拌反应混合物2小时，用甲基叔丁基醚(10mL)沉淀。沉淀物用等量醚再洗涤一次，真空干燥。
DIEA。室温下搅拌4天后，将反应混合物倒入5ml水中，用氯仿(5×3mL)萃取。真空下蒸发CHCl3萃取物，在干燥器中干燥过夜。然后在冰浴中将干燥的CHCl3萃取物溶解于1mL DCM，再加入1mL TFA。室温下再搅拌反应混合物2小时，用甲基叔丁基醚(10mL)沉淀。沉淀物用等量醚再洗涤一次，真空干燥。
[0800] 实施例4
[0801] 抗杰氏棒状杆菌和变形链球菌STAMP
[0802] 本实施例说明了开发STAMP以选择性靶向和降低或消除混合微生物群体中的变形链球菌(龋齿)或杰氏棒状杆菌(体臭、机会性感染)。
[0803] 棒状杆菌的过度生长和代谢物生成导致腋臭，该细菌取代了较轻体臭相关的葡萄球菌和微球菌。目前的卫生(肥皂、抗生素、杀菌剂、消毒剂)实践除去所有的细菌，从而棒状杆菌与正常菌群在再次生长中仍维持高比例。除臭剂和止汗剂是暂时解决方案，其掩盖甚至加剧该问题。
[0804] 变形链球菌是龋齿的主要病原。目前治疗生龋齿的方法(刷牙、杀菌口腔清洗剂)致力于完全除去细菌，即，除去变形链球菌和其它无害的口腔细菌。尽管采用这些方法，龋齿仍持续，在许多病例中，变形链球菌可成为口腔中的优势生物。有几种变形链球菌和酸靶向方法(益生置换，唾液pH调节)处于开发中，但无一显示临床功效。
[0805] 本实施例描述了优先或选择性减少或消除混合群体中的变形链球菌和/或棒状杆菌的许多STAMP。
[0806] 本文还公开了具有抗杰氏棒状杆菌的特定活性的几种主要STAMP。
[0807] 本文所述的STAMP包含肽分子或化学缀合物内的功能区域。这些区域包括含有一个或多个靶向部分(例如，靶向肽)、接头和一个或多个杀伤部分(例如，抗微生物肽(AMP)、卟啉等)的靶向区域。
[0808] STAMP通过靶向区域起作用，其将STAMP选择性累积在感兴趣微生物上或其附近，由此累积杀伤区域。该靶向区域不识别其它菌群，因此避免或减少STAMP累积和细胞破坏。
[0809] 在某些实施方式中，抗口腔变形链球菌的STAMP最好配制成口腔清洗剂、牙膏、乳膏、凝胶或粘合剂条带，在某些优选的实施方式中，其提供成包含0.5到2.5x PBS(或其它盐)和口腔保健制剂(例如，口腔清洗制剂)中其它常见成分的制剂。某些示范性制剂示于表20。
[0810] 在评估STAMP、抗微生物肽(AMP)和结合肽的所需活性的过程中，发现与在默认缓冲液系统(1xPBS)中的活性水平相比，某些制剂可减弱或促进肽活性。在一些情况中，1xPBS可提供最佳活性水平。以下是改变，或可改变肽或STAMP活性的许多制剂。对于复合缓冲液系统，除非另有表述，假定基础溶剂是水。
[0811] 配方1(1xPBS，pH 7.4)：136.8mM NaCl，2.68mM KCl，1.01mM Na2HPO4和1.37mM KH2PO4。
[0812] 配方2(HEPES/CTAB)：20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，150mM NaCl，1mM MgCl2和0.1％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。
[0813] 配方3(TRIS/CTAB)：20mM Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)，pH 7.5，150mM NaCl，1mM MgCl2和0.1％CTAB。
[0814] 配方4：20mM HEPES。
[0815] 配方5：20mM Tris，pH 7.5。
[0816] 配方6：0.2％CTAB。
[0817] 配方7：1％甘油。
[0818] 配方8：1％普朗尼克F108(非离子型表面活性剂：α-氢-ω-羟基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物)。
[0819] 配方9：1％普朗尼克F123(聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)，平均Mn～5,800)。
[0820] 配方10：1％普朗尼克F17R4(聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)，平均Mn～2,700)。
[0821] 配方11：1％到7％PEG400。
[0822] 配方12：50mM脲。
[0823] 配方13：10mM AOT(双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠)
[0824] 配方14：0.5-0.1％吐温20(非离子型洗涤剂，也称为聚山梨醇酯20或PEG(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯失水山梨糖醇单月桂酸酯)。
[0825] 配方15：0.5-0.1％吐温80(非离子型表面活性剂，C64H124O26，也称为聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯、(x)-山梨聚糖单-9-十八碳二烯酸酯聚(氧-1，2-乙二基)，或POE(20)失水山梨糖醇单油酸酯)。
[0826] 配方16：5-10％乙醇。
[0827] 制剂17：20％甘油。
[0828] 配方18：20％山梨醇。
[0829] 配方19：10％甘油/10％山梨醇。
[0830] 配方20：0.1％SLS(月桂基硫酸钠)。
[0831] 配方21：1％普朗尼克F127(非离子型表面活性剂：α-氢-ω-羟基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物)。
[0832] 配方21：0.1％吐温20(非离子型洗涤剂，也称为聚山梨醇酯20，或PEG(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯)。
[0833] 配方21：10％PG(磷脂凝胶)。
[0834] 1号口腔清洗剂纯溶液(1xPBS中制备)：7％ETOH，20％甘油，7％PEG400和1％PLURONIC F127。
[0835] 2号口腔清洗剂纯溶液(1xPBS中制备)：7％ETOH，20％山梨糖醇，7％PEG 400和1％PLURONIC F127。
[0836] 3号口腔清洗剂纯溶液(1xPBS中制备)：7％ETOH，20％甘油和7％PEG 400。
[0837] 4号口腔清洗剂纯溶液(1xPBS中制备)：7％ETOH，20％山梨糖醇和7％PEG 400。
[0838] 其它示范性但非限制性的口腔清洗制剂示于表20。
[0839] 表20.示范性口腔清洗制剂
[0840]清洗剂编号 ETOH 甘油 PEG400 F127 水1 氟化物
1 5 22.5 7 1 64.5 187.5
2 6 25 1 0 68 0
3 6 20 7 0 67 0
4 6 20 1 1 72 0
5 7 25 7 0 61 0
6 7 20 1 0 72 0
7 7 20 7 0 66 250
8 5 20 7 1 67 0
9 6.472 21.139 5.361 0.722 66.306 250
10 7 22.5 1 0 69.5 250
11 5 25 1 0 69 250
12 7 20 7 0 66 250
13 5 20 1 1 73 250
14 5 25 7 0.5 62.5 250
15 7 25 1 0.5 66.5 250
16 7 25 7 1 60 250
17 5 25 7 0.5 62.5 0
18 7 20 1 1 71 250
19 6 25 1 1 67 250
20 7 25 7 1 60 125
21 5 25 1 0 69 250
22 5 20 1.5 0.5 73 0
23 7 20 1 1 71 250
24 6 20 1 0 73 250
25 5 22.333 3.778 0.444 68.444 125
26 7 25 1 1 66 0
27 6 25 7 0 62 250
28 7 20 7 1 65 0
29 7 25 4 1 63 62.5
30 5 25 4 0 66 0
31 5 25 1 1 68 0
32 7 25 7 1 60 0
33 7 22.5 4 0.5 66 0
34 5 20 4.5 0 70.5 250
35 5 23 1 0 71 62.5
36 6 20 1 1 72 0
37 5 20 7 1 67 250
38 7 20 1 0 72 0
39 5 25 4 1 65 250
40 5 22.5 7 0 65.5 0
n1 7 20 7 1 65 0
n2 7 20％山梨糖醇 7 1 65 0
n3 7 20 7 0 66 0
n4 7 20％山梨糖醇 7 0 66 0
1 5 22.5 7 1 64.5 187.5
2 6 25 1 0 68 0
3 6 20 7 0 67 0
4 6 20 1 1 72 0
5 7 25 7 0 61 0
6 7 20 1 0 72 0
7 7 20 7 0 66 250
8 5 20 7 1 67 0
9 6.472 21.139 5.361 0.722 66.306 250
10 7 22.5 1 0 69.5 250
11 5 25 1 0 69 250
12 7 20 7 0 66 250
13 5 20 1 1 73 250
14 5 25 7 0.5 62.5 250
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n2 7 20％山梨糖醇 7 1 65 0
n3 7 20 7 0 66 0
n4 7 20％山梨糖醇 7 0 66 0
[0841]
[0842]
[0843] 11xPBS可取代水。
[0844] 在某些实施方式中，棒状杆菌特异性STAMP配制成任何乳膏、纳米乳液、脂质胶束、水性或非水性凝胶、喷雾剂、肥皂或滚涂棒或用于腋下或其它卫生保健的其它产品。
[0845] STAMP-介导的选择性抗微生物活性可维持口腔或腋下粘膜表面的正常菌群，从而导致保护性集群和将有害菌群转化成有益菌群。病原体过度生长的复发得到降低，如此还限制了STAMP递送的数量和频率(因而降低成本)。STAMP还考虑到“外科手术式”抗微生物精确度，其限制抗微生物耐受性产生，这也是杀伤区域介导的细胞膜破坏的一般机制所致。
[0846] 已设计和检验了许多抗变形链球菌STAMP(参见表21)和抗杰氏棒状杆菌STAMP，一些制成制剂。这些均在体外显示抗其细菌靶标(包括生物膜形式)的强效选择活性。测试时，STAMP在体外对细胞系几乎没有细胞毒性。
[0847] 表21.示范性抗变形链球菌STAMP。单下划线是结合肽。双下划线是抗微生物肽*(AMP)。无下划线是接头。 表示任选保护(例如，酰胺化)的C末端。
[0848]
[0849] 表22.示范性抗杰氏棒状杆菌STAMP。单下划线是结合肽。双下划线是抗微生物肽(AMP)。无下划线是接头。*表示任选保护(例如，酰胺化)的C末端。
[0850]
[0851]
[0852] 出乎意料地发现某些抗变形链球菌STAMP的最佳活性需要在配方中有盐(例如，PBS)。因此，例如，包含通过肽接头(GGG)连接于抗微生物肽(AMP)KNLRIIRKGIHIIKKY(SEQ ID NO：3250)的TFFRLFNRSFTQALGK(SEQ ID NO：3249)的抗变形链球菌STAMP C16G2(TFFRLFNRSFTQALGKGGGKNLRIIRKGIHIIKKY*，SEQ ID NO：3248)在基于水的无盐缓冲液和纳米乳液中基本上无活性，但在磷酸缓冲盐水(PBS)制剂中有活性。合适的PBS制剂为0.5X PBS到约2.5X PBS，约1X PBS时活性最佳。认为其它抗变形链球菌STAMP以及大量其它STAMP获得类似结果。在某些实施方式中，通过在口腔清洗剂中包含氟化物提高了溶液中的STAMP稳定性。
[0853] 实施例5
[0854] 靶向抵御变形链球菌的光动力学治疗
[0855] 龋齿(牙齿腐烂)是美国最普遍和最多花费的感染性疾病。目前，牙科机构每年的费用支出超过850亿美元，大多数这些花费是龋齿及其后遗症所致(www.ada.org/)。口腔具有复杂的微生物群体，其由超过600种不同的无害/共生微生物种类以及数量有限的病原性细菌一起组成，所述病原性细菌包括龋齿的主要病原变形链球菌。一旦建群，变形链球菌在饮食糖的发酵期间产生酸，其导致牙齿结构的去矿化并抑制同一微生物小环境内非病原性共生细菌的生长。虽然不断使用广谱抗微生物化合物并刷牙，变形链球菌仍维持在口腔内并导致龋齿反复发生。最近的“通除、通杀”方法显示效力有限，因为“清洁”的牙齿表面为共生以及病原性细菌提供相等的机会以便重新集群在口腔的非无菌环境中。为解决该缺陷，我们构建并评估了光活化的变形链球菌-选择性抗微生物剂。通过将变形链球菌感受态刺激肽与光动力学染料孟加拉红偶联构建了C16-RB，其在暴露于手提式牙齿治疗光的蓝光后显示出强效的体外抗变形链球菌活性。在混合生物膜的情况下，C16-RB对其它口腔链球菌的活性减弱，体外细胞毒性有限。
[0856] 为开发一种方法以选择性除去牙齿生物膜中的变形链球菌从而有益种类施加保护性集群作用并长期保护避免变形链球菌再建群，我们开发了一类新型靶向抗微生物剂，称为特异性靶向抗微生物肽，或STAMP。STAMP由线性肽序列内功能独立，但连接在一起的结构域；靶向区域和抗微生物区域组成。特异性结合感兴趣细菌种类的靶向区域递送该分子的杀伤部分，其由普通广谱抗微生物肽组成。之前，我们利用感受态刺激信息素(CSP)肽成功设计了抵御变形链球菌的STAMP，所述肽由该生物产生并已证实具有变形链球菌-特异性识别。具有CSP的诸部分作为靶向结构域的合成STAMP具有抵御变形链球菌的特异性抗微生物活性，但对其它口腔链球菌或生物膜中的非龋齿产生性微生物无活性。
[0857] 我们假设可利用非肽抗微生物分子，例如卟啉类或PDT中所用的染料实现靶向杀伤。在此，我们提供靶向的、肽指导的光动力学分子C16-RB的原理论证构建和体外效力。蓝光活化后，C16-RB显示变形链球菌选择性抗微生物活性，但对非龋齿产生性口腔链球菌和上皮细胞活性有限。
[0858] 材料与方法
[0859] 合成C16-RB
[0860] 所有氨基酸、合成树脂和试剂是肽合成级(加利福尼亚州圣何塞的安娜斯派克公司；费希尔科学公司(Fisher Scientific))。为构建C16-RB缀合物，以二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作为溶剂，在N-羟基苯并三唑、HBTU(邻-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基-脲六氟磷酸盐)和异丙基乙胺(DIEA)中采用双重偶联循环，使用常规9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相方法合成CSPC16肽并连接琥珀酸和PEG接头，如前所述。然后在DMF中使肽树脂(1摩尔当量，15mg)溶胀30分钟，再将PEG末端酰胺基连接于RB中的羧基内酯(图19B)。该反应在二氯甲烷(DCM)∶DMF∶二甲基亚砜(DMSO)(1∶1∶1(v/v))
配制的2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，5-摩尔过量)混合物中进行。将10摩尔当量的DIEA加入反应烧瓶以起始反应，用氩气保护反应并在室温下搅拌5小时。完成后，反应混合物随后通过烧结玻璃过滤小瓶，用DMF和DCM充分洗涤以除去所有废试剂。然后真空干燥树脂过夜，室温下用1ml三氟乙酸(TFA)/苯甲硫醚/水/EDT(10/0.5/0.5/025)切割2小时。用10mL甲基-叔丁基醚沉淀切割溶液，用相
同量的醚洗涤沉淀物两次。通过制备水平的HPLC(Source 15RPC柱，ACTA纯化仪，阿姆仙姆公司(Amersham))纯化粗产物，在10分钟内用10到35％的梯度乙腈/水洗脱，在8分钟期间增加至90％，最后用95％乙腈洗涤15分钟。
配制的2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，5-摩尔过量)混合物中进行。将10摩尔当量的DIEA加入反应烧瓶以起始反应，用氩气保护反应并在室温下搅拌5小时。完成后，反应混合物随后通过烧结玻璃过滤小瓶，用DMF和DCM充分洗涤以除去所有废试剂。然后真空干燥树脂过夜，室温下用1ml三氟乙酸(TFA)/苯甲硫醚/水/EDT(10/0.5/0.5/025)切割2小时。用10mL甲基-叔丁基醚沉淀切割溶液，用相
同量的醚洗涤沉淀物两次。通过制备水平的HPLC(Source 15RPC柱，ACTA纯化仪，阿姆仙姆公司(Amersham))纯化粗产物，在10分钟内用10到35％的梯度乙腈/水洗脱，在8分钟期间增加至90％，最后用95％乙腈洗涤15分钟。
[0861] 利用含0.01％TFA的乙腈水溶液的渐增疏水性梯度，将C16-RB进一步纯化至＞90％，通过LC/MS证实分子量，如上所述(Waters X-bridge BEH 130 C18柱，4.6x100mm，颗粒大小5μm，Waters 3100系统)。用MassLynx软件4.1版(Waters)分析LC图谱。以线
性、正离子模式，通过电喷雾电离(ESI)质谱法确认C16-RB质量(3118.0)。冻干终产物，随时避光。C16-RB溶解于50％甲醇中。
性、正离子模式，通过电喷雾电离(ESI)质谱法确认C16-RB质量(3118.0)。冻干终产物，随时避光。C16-RB溶解于50％甲醇中。
[0862] 细菌和细胞生长
[0863] 37℃，在80％N2、10％CO2和10％H2的厌氧空气中，口腔链球菌(Streptococcus oralis)ATCC 10557、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)(Challis)、血链 球菌(Streptococcus sanguinis)(NY101)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)ATCC 903、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)ATCC13419和变形链球菌野生型UA140及JM11(大观霉素耐受性)菌株在Todd-Hewitt(TH)肉汤中生长。37℃，5％CO2下，BHK-21(ATCC CRL-10)成纤维细胞在含10％FBS、1mM丙酮酸钠、100单位/毫升青霉素G和100μg/mL大观霉素
的DMEM中繁殖。用0.25％胰蛋白酶解离细胞，按照供应商的推荐作次代培养。
的DMEM中繁殖。用0.25％胰蛋白酶解离细胞，按照供应商的推荐作次代培养。
[0864] 抵御生物膜的光动力学抗微生物试验
[0865] 为评估C16-RB对单培养物生物膜的抵御作用，将变形链球菌UA140在TH中培养过夜，然后接种以便形成生物膜。对于生物膜，在2mL离心管中用含1％蔗糖的TH制备过夜培养物的1∶5000稀释液(200μL体积)，厌氧条件下生长24小时。接种后，用1xPBS配制的5或25μM C16-RB或5μM RB，或单用PBS处理生物膜5分钟，然后除去上清液并
暴露于Astralis7(IV公司(Ivoclar Vivodent)，奥地利)手持式LED的蓝光5分钟(发
2
射400-550nm，功率400mW/cm)，该光通常用作牙科治疗光。光源离试管底部(甚至试管口)4cm悬挂。一组样品副本盖上盖子以用作避光对照。处理后，机械破坏生物膜，涂布以测定cfu/mL。
暴露于Astralis7(IV公司(Ivoclar Vivodent)，奥地利)手持式LED的蓝光5分钟(发
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射400-550nm，功率400mW/cm)，该光通常用作牙科治疗光。光源离试管底部(甚至试管口)4cm悬挂。一组样品副本盖上盖子以用作避光对照。处理后，机械破坏生物膜，涂布以测定cfu/mL。
[0866] 为检测C16-RB对变形链球菌的选择性，进行针对多种类生物膜的类似试验。用含1％蔗糖、1％葡萄糖和1％甘露糖的TH稀释(1∶5000)等份口腔链球菌、格氏链球菌、缓症链球菌、血链球菌、唾液链球菌和变形链球菌JM11(从过夜培养物制得)的混合物来接种混合生物膜。如上所述孵育和处理生物膜，但加入维生素C或葡糖酸钾。加入该试剂并孵育
5分钟后，用1xPBS洗涤生物膜1次，然后暴露于光下。PDT和生物膜破坏后，将存活菌接种于TH和添加了800μg/mL大观霉素的TH上，从而能分别定量测定总的存活口腔链球菌和存活变形链球菌。
5分钟后，用1xPBS洗涤生物膜1次，然后暴露于光下。PDT和生物膜破坏后，将存活菌接种于TH和添加了800μg/mL大观霉素的TH上，从而能分别定量测定总的存活口腔链球菌和存活变形链球菌。
[0867] 评估C16-RB细胞毒性
[0868] 如生产商所述，采用Promega CellTiterGlo试验确认RB和C16-RB对人成纤维细胞的作用。简言之，成纤维细胞生长至汇合，解离并以每孔约5,000个细胞接种在96孔不透明壁，透明底96孔板(努克国际公司(Nunc International))。对于长期避光毒性，先使细胞粘附18小时，然后将培养基换成加有连续稀释的RB或C16-RB(200μM到390nM)的培养基或单独培养基。18-24小时后，将等体积的Cell Titer Glo试剂加入各孔并混合。然后定量测定萤光素酶活性以检测细胞活力(生物发光模式(Biolumenescence mode)的瓦里安荧光计(Varian Fluorometer))。为检测RB或C16-RB光接触后的细胞毒性，以每孔约10,000个细胞接种细胞，使之粘附4小时。然后将细胞生长培养基换成含有RB或C16-RB
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的培养基，再暴露于(一次一孔)离孔底约3cm悬挂的蓝光(400mW/cm)。暴露后，如上所述用Cell Titer Glo破坏培养物并定量测定萤光素酶活性。
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的培养基，再暴露于(一次一孔)离孔底约3cm悬挂的蓝光(400mW/cm)。暴露后，如上所述用Cell Titer Glo破坏培养物并定量测定萤光素酶活性。
[0869] 结果
[0870] 设计光动力学肽-染料缀合物
[0871] 对于嵌合分子的靶向肽组分，我们选择变形链球菌CSP的缩短衍生物，CSPC16(序列：TFFRLFNRSFTQALGK)。CSPC16已经在数种构建物中成功用作STAMP靶向肽，证明选择性结合变形链球菌但不结合其它非生龋齿细菌。对于光动力学染料，我们选择孟加拉红(RB，图19A)，其是一种呫吨染料，在视力测定中作为诊断工具已有安全记录。与TBO或亚甲基蓝不同，RB不为流出泵所识别，有绿光或蓝光存在下(最大吸收约549nm)，其在体外对各种细菌显示强效活性，并可由手提式牙科治疗LED活化。
[0872] C16-RB合成
[0873] 如图19B所示，RB通过琥珀酸/PEG接头连接于CSPC16的N末端以构建C16-RB分子。采用常规固相肽方法合成CSPC16，然后使接头和RB偶联，再从树脂上切割。切割后，先通过LC/MS反复纯化C16-RB，再作评估。如图20所示，实现95％以上的纯度，观察到预计的质量。CSPC16连接导致RB中的内酯环打开。然而，为原理论证，我们假设该缀合物会保留足够的单态氧产生活性，因为具有活性的其它呫吨染料缺乏该环。
[0874] 抵御单一种类变形链球菌生物膜的C16-RB效力
[0875] 合成后，评估C16-RB的基本光敏潜能是通过用C16-RB或未修饰的RB攻击成熟的单一种类变形链球菌生物膜(生长24小时)，然后用牙科治疗光的蓝光射线。如图21所示，5或25μM下，在暴露于C16-RB或RB和蓝光的培养物中观察到强效的抗微生物活性：
从5或25μM的输入cfu/mL降低超过3 log10。相反，在单用蓝光或5μM RB或C16-RB避
光对照处理的变形链球菌中未观察到明显的cfu/mL降低。在用25μM C16-RB处理的样品中观察到中等避光毒性。总之，这些结果表明肽-染料缀合物对变形链球菌有活性，其水平与亲代RB分子大致相似。
从5或25μM的输入cfu/mL降低超过3 log10。相反，在单用蓝光或5μM RB或C16-RB避
光对照处理的变形链球菌中未观察到明显的cfu/mL降低。在用25μM C16-RB处理的样品中观察到中等避光毒性。总之，这些结果表明肽-染料缀合物对变形链球菌有活性，其水平与亲代RB分子大致相似。
[0876] 抵御多种类生物膜的选择性PDT
[0877] 然后在含有变形链球菌和非龋齿产生性口腔链球菌的混合培养物中评估C 16-RB的选择性，二者竞争牙齿表面的同一小环境。我们采用转化了大观霉素耐受性的变形链球菌(菌株JM11，Merritt等.，2005)加上口腔链球菌、格氏链球菌、缓症链球菌、血链球菌和唾液链球菌的混合生物膜。如本文所示，混合培养物生长24小时，然后用RB或C16-RB处理，加入葡糖酸钾，通过降低未与变形链球菌结合的游离C16-RB的过氧化物生成活性以最小化杀伤非靶向细菌。乙醇处理用作非区分性杀伤对照。如图21所示，单用RB显示针对混合生物膜系统中变形链球菌和非变形链球菌的强效非区分性光动力学抗微生物作用(存活变形链球菌∶非龋齿产生性链球菌cfu之比约1)。相反，C16-RB表现出针对变形链球菌的特异性光动力学活性，对检测的其它口腔链球菌没有活性，表现为回收的变形链球菌与其它链球菌之比低。这些结果提示，有蓝光存在下，C16-RB具有抗微生物活性，该活性是变形链球菌特异性并依赖于CSPC16靶向肽。
[0878] 针对真核细胞的细胞毒性
[0879] 由于RB-C16证明有PDT潜能，进行实验以检验该缀合物和单独RB的细胞毒性。获得了有和没有蓝光暴露下，接触C16-RB、RB或蜂毒肽B(细胞毒性的阳性对照)的BHK细胞的IC50。如表23所示，有或没有光时，在5分钟或24小时观察到接触所测试最低肽稀释度的蜂毒肽B的细胞有细胞毒性(IC50＜1.56μM)，而仅RB处理的样品观察到光依赖性毒性。用C16-RB处理的BHK细胞中未观察到光相关毒性，虽然接触24小时后检测到不依赖光的中等细胞毒性(IC50＝90μM)。这些结果提示照射后，C16-RB对BHK细胞无毒性，暴露
24小时后显示温和的毒性作用(与蜂毒肽B相比)。
24小时后显示温和的毒性作用(与蜂毒肽B相比)。
[0880] 表23.RB和C16-RB化合物的细胞毒性
[0881]IC50(μM)
5分钟避光： BHK
RB-C16 ＞100
RB ＞100
蜂毒肽B ＜1.56
5分钟w/蓝光：
RB-C16 ＞100
RB 40
蜂毒肽B ＜1.56
24小时避光
RB-C16 55
RB 90
蜂毒肽B ＜1.56
5分钟避光： BHK
RB-C16 ＞100
RB ＞100
蜂毒肽B ＜1.56
5分钟w/蓝光：
RB-C16 ＞100
RB 40
蜂毒肽B ＜1.56
24小时避光
RB-C16 55
RB 90
蜂毒肽B ＜1.56
[0882] 应理解，本文所述的实施例和实施方式只是为了说明，本领域技术人员据此可想到各种改进或改变，它们包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用全部纳入本文。
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