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一种重组免疫 缺陷质粒和病毒以及应用

阅读：500发布：2020-05-15

专利汇可以提供一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用。本发明所述免疫缺陷质粒包括LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。本发明通过在致病性的SIVmac239全长质粒框架上引入SEQ ID No.1所示核苷酸序列，构建出包含多个药物靶点的免疫缺陷质粒，并在293T细胞中包装产生免疫缺陷病毒，该病毒具有感染靶细胞的能力和高效的复制能力，能够应用在研究艾滋病毒体内感染过程、病原特性、发病机理、免疫反应以及筛选抗HIV药物和抗HIV药物用药策略中。，下面是一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种重组免疫缺陷质粒，其特征在于，包括LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。
2.根据权利要求1所述免疫缺陷质粒，其特征在于，从5’端开始由LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因、nef基因和LTR组成。
3.根据权利要求1或2所述免疫缺陷质粒，其特征在于，所述免疫缺陷质粒核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种重组免疫缺陷质粒的构建方法，其特征在于，包括：
将SEQ ID No.1所示核苷酸序列连入去掉Pol基因的SIVmac239全长质粒片段中，获得所述重组免疫缺陷质粒。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，包括：
以点突变PCR在SEQ ID No.1所示核苷酸序列两端分别引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后连入T载体中；
以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过重叠PCR在Pol基因两端引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后双酶切获得去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段；
Apa I和Nhe I双酶切连入SEQ ID No.1所示核苷酸序列的T载体，然后SEQ ID No.1所示核苷酸序列与去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段连接，最后连接SIVmac2393’端半长质粒p239SpE3’，获得所述重组免疫缺陷质粒。
6.权利要求1-3任意一项所述免疫缺陷质粒在包装细胞中包装产生的免疫缺陷病毒。
7.根据权利要求6所述免疫缺陷病毒，其特征在于，所述包装细胞为293T细胞。
8.根据权利要求7所述免疫缺陷病毒，保藏编号为CGMCC No.9579。
9.权利要求1-3任意一项所述免疫缺陷质粒在研究艾滋病毒体内感染过程、病原特性、发病机理、免疫反应以及筛选抗HIV药物和抗HIV药物用药策略中的应用。
10.权利要求6-8任意一项免疫缺陷病毒在研究艾滋病毒体内感染过程、病原特性、发病机理、免疫反应以及筛选抗HIV药物和抗HIV药物用药策略中的应用。

说明书全文

一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用。

背景技术

[0002] 艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)，是由于感染人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)而导致的一种免疫缺陷病，同时可并发一系列机会性感染及肿瘤，严重者可导致死亡的综合征。1983年人类首次发现HIV，至今已有三十余年，目前该病毒仍然严重威胁着人类的健康和生命。疫苗和药物是人类防治传染性疾病的两种主要思路和研究方向。直到目前为止，艾滋病疫苗研发尚未成功，临床上药物治疗仍然占据主导地位。

[0003] 目前用于临床的抗艾滋病药物普遍具有很强的毒副作用，严重损害了其他正常代谢器官，加重了病人的痛苦。针对这些现状，科研人员正在研究毒副作用小，更加有效的新一代药物和治疗方案。抗HIV新药研发及联合用药策略探索需要体内评价用靶标病毒。猴/人嵌合免疫缺陷病毒(Simian/Human Chimeric Immunodeficiency Virus,SHIV)是目前广泛应用于药物有效性实验当中，其以猴免疫缺陷病毒SIV作为骨架，将其中env、tat和rev基因由人免疫缺陷病毒的相应片段所替换。

[0004] 但是这些嵌合病毒仍然存在一定的局限性，含有的药物靶点比较单一，不能综合评估多种药物治疗效果。此外，构建猴/人嵌合免疫缺陷病毒能否具有感染细胞的能力是成功与否的重要标准，嵌入的基因以及位点的不适宜虽然在分子水平上能够构建出正确的病毒全长质粒，但是包装成病毒后无感染能力，这其中需要极为精密的构建策略。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用，使得所述免疫缺陷质粒包装成的病毒具有多个药物靶点；

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用，使得所述免疫缺陷质粒包装成的病毒具有感染靶细胞的能力；

[0007] 本发明的另一个目的是提供一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用，使得所述免疫缺陷质粒包装成的病毒具有高效的复制能力。

[0008] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0009] 一种重组免疫缺陷质粒，其特征在于，包括LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。

[0010] 其中，所述env基因、tat基因和rev基因部分重叠，这属于本领域公知。

[0011] 优选地，所述免疫缺陷质粒从5’端开始由LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因、nef基因和LTR组成。质粒结构示意图见图1。

[0012] 更优选地，所述免疫缺陷质粒核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0013] 本发明利用基因重组技术，在致病性的SIVmac239全长质粒框架上引入SEQ ID No.1所示核苷酸序列，其上同时包含了HIV-1CRF01-AE亚型的蛋白酶基因PR、逆转录酶基因RT和整合酶基因IN，构建出一种新型的具有多个药物靶点的线性免疫缺陷质粒，并且其包装成病毒后具有感染靶细胞的能力和高效的复制能力。

[0014] 此外，本发明还提供了所述免疫缺陷质粒的构建方法，包括：

[0015] 以点突变PCR在SEQ ID No.1所示核苷酸序列两端分别引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后连入T载体中；

[0016] 以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过重叠PCR在Pol基因两端引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后双酶切获得去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段；

[0017] Apa I和Nhe I双酶切连入SEQ ID No.1所示核苷酸序列的T载体，然后SEQ ID No.1所示核苷酸序列与去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段连接，最后连接SIVmac2393’端半长质粒p239SpE3’，获得所述重组免疫缺陷质粒。

[0018] 作为优选，上述以点突变PCR在SEQ ID No.1所示核苷酸序列两端分别引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后连入T载体中的步骤为：

[0019] 通过分别带有Apa I和Nhe I酶切位点的上游引物(SEQ ID No.3所示核苷酸序列)和下游引物(SEQ ID No.4所示核苷酸序列)，以点突变PCR在SEQ ID No.1所示核苷酸序列两端分别引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后连入T载体；

[0020] F ：ATCCTTTAGCGGG CCCCAAATCACTCTTTG (Apa I) ；R ：CATGTGCTAGCCCTCATCCTGTCTACTTGCCACAC(Nhe I)。

[0021] 作为优选，上述以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过重叠PCR在Pol基因两端引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后双酶切获得去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段的步骤为：

[0022] 以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过分别带有Apa I酶切位点的两对引物2982-F和3736-R(SEQ ID No.5-6所示核苷酸序列)、3736-F和6307-R(SEQ ID No.7-8所示核苷酸序列)扩增，然后以所获得的扩增产物为模板，通过引物2982-OV-F和6307-OV-R(SEQ ID No.9-10所示核苷酸序列)扩增出pol基因5’端引入单酶切位点Apa I的3539bp P-12片段；

[0023] 2 98 2- F ：TT AG G GA GC CG TC A GG AT CA G AT AT ，3 73 6- R ：AAGAGAGAATTGGGGCCCAGCAAATCCTCT(Apa I)；

[0024] 3736-F：AGAGGATTTGCTGGGCCCCAATTCTCTCTT(Apa I)，6307-R：ACTGCTCCTTCCCCTTTCCACAATA；

[0025] 2982-OV-F：AGGATCAGATATTGCAGGAACAACT，6307-OV-R GCCTTCTCTGTAATAGACCCGAAA A；

[0026] 以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过分别带有Nhe I酶切位点的两对引物6307-F和6591-R(SEQ ID No.11-12所示核苷酸序列)、6591-F和7056-R(SEQ ID No.13-14所示核苷酸序列)扩增，然后以所获得的扩增产物为模板，通过引物6307-OV-F和7056-OV-R(SEQ ID No.15-16所示核苷酸序列)扩增出pol基因3’端引入单酶切位点Nhe I的899bp P-34片段；

[0027] 6307-F：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，6591-R：ATATTT TATGAGGCTAGCCCACCTCTCTAG(Nhe I)；

[0028] 6591-F：CTAGAGAGGTGGGCTAGCCTCATAAAATAT(Nhe I)，7056-R：CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT；

[0029] 6307-OV-F：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，7056-OV-R：CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT。

[0030] 将P-12和P-34分别连入T载体中得到质粒T-12和T-34，质粒T-12和质粒p239SpSp5’通过BsrG I和Pac I双酶切连接反应将单酶切位点Apa I引入到p239SpSp5’中，然后将所得质粒和质粒T-34通过Pac I和BstB I双酶切连接反应将单酶切位点Nhe I引入到p239SpSp5’中，Apa I和Nhe I双酶切获得去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段。

[0031] 本发明还提供了由本发明所述免疫缺陷质粒在包装细胞中包装产生的免疫缺陷病毒。

[0032] 作为优选，所述包装细胞为293T细胞。更优选地，所述免疫缺陷病毒保藏编号为CGMCC No.9579，简称Pol-SHIV。

[0033] 本发明所述免疫缺陷病毒具有感染性，使用病毒特异性抗体染色Pol-SHIV感染CEMx174细胞，流式细胞检测结果显示，未感染Pol-SHIV的CEMx174细胞背景为1.02％；而感染Pol-SHIV的CEMx174细胞，阳性细胞达到11.30％。

[0034] 本发明所构建的免疫缺陷病毒接种TZM-bl细胞的荧光强度在2500-4000RLU之间，大于细胞对照2.5倍的cutoff值，说明本发明所述Pol-SHIV病毒能感染TZM-bl细胞，该病毒是一个具有感染靶细胞能力的病毒，且与SIVmac239毒株具有相似的生物学特性。在此基础上，本发明进一步测定了免疫缺陷病毒的TCID50为700TCID50/mL。

[0035] 同时，本发明所述免疫缺陷病毒SIV P27蛋白含量和逆转录酶活性均高于猴免疫缺陷病毒，表明其具有高效的复制能力。因此，本发明还提供所述免疫缺陷质粒以及所述免疫缺陷病毒在研究艾滋病毒体内感染过程、病原特性、发病机理、免疫反应以及筛选抗HIV药物和抗HIV药物用药策略中的应用。

[0036] 由以上技术方案可知，本发明通过在致病性的SIVmac239全长质粒框架上引入SEQ ID No.1所示核苷酸序列，构建出包含多个药物靶点的免疫缺陷质粒，并在293T细胞中包装产生免疫缺陷病毒，该病毒具有感染靶细胞的能力和高效的复制能力，能够应用在研究艾滋病毒体内感染过程、病原特性、发病机理、免疫反应以及筛选抗HIV药物和抗HIV药物用药策略中。

[0037] 生物材料保藏信息说明：

[0038] Pol-SHIV，分类命名：含HIV-1Pol基因的杂交免疫缺陷病毒，于2014年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9579。附图说明：

[0039] 图1示本发明所述免疫缺陷质粒结构示意图；其中元件A表示SEQ ID No.1所示核苷酸序列；

[0040] 图2示本发明所述免疫缺陷质粒的酶切鉴定图；其中M为DL10K，1为EcoR I酶切条带，2为Apa I酶切条带，3为Nhe I酶切条带；

[0041] 图3示CEMx174细胞表面病毒蛋白表达的流式细胞仪图谱；其中，A为未感染CEMx174细胞；B为Pol-SHIV感染CEMx174细胞第9天。具体实施方式：

[0042] 本发明公开了一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的免疫缺陷质粒和病毒及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0043] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。

[0044] 实施例1：构建本发明所述免疫缺陷质粒

[0045] 通过分别带有Apa I和Nhe I酶切位点的上游引物(SEQ ID No.3所示核苷酸序列)和下游引物(SEQ ID No.4所示核苷酸序列)，以点突变PCR在SEQ ID No.1所示核苷酸序列两端分别引入Apa I和Nhe I酶切位点，然后连入T载体；

[0046] F ：ATCCTTTAGCGGG CCCCAAATCACTCTTTG (Apa I) ；R ：CATGTGCTAGCCCTCATCCTGTCTACTTGCCACAC(Nhe I)。

[0047] 以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过分别带有Apa I酶切位点的两对引物2982-F和3736-R(SEQ ID No.5-6所示核苷酸序列)、3736-F和6307-R(SEQ ID No.7-8所示核苷酸序列)扩增，然后以所获得的扩增产物为模板，通过引物2982-OV-F和6307-OV-R(SEQ ID No.9-10所示核苷酸序列)扩增出pol基因5’端引入单酶切位点Apa I的3539bp P-12片段；

[0048] 2 98 2- F ：TT AG G GA GC CG TC A GG AT CA G AT AT ，3 73 6- R ：AAGAGAGAATTGGGGCCCAGCAAATCCTCT(Apa I)；

[0049] 3736-F：AGAGGATTTGCTGGGCCCCAATTCTCTCTT(Apa I)，6307-R：ACTGCTCCTTCCCCTTTCCACAATA；

[0050] 2982-OV-F：AGGATCAGATATTGCAGGAACAACT，6307-OV-R GCCTTCTCTGTAATAGACCCGAAA A；

[0051] 以SIVmac2395’端半长质粒p239SpSp5’为模板，通过分别带有Nhe I酶切位点的两对引物6307-F和6591-R(SEQ ID No.11-12所示核苷酸序列)、6591-F和7056-R(SEQ ID No.13-14所示核苷酸序列)扩增，然后以所获得的扩增产物为模板，通过引物6307-OV-F和7056-OV-R(SEQ ID No.15-16所示核苷酸序列)扩增出pol基因3’端引入单酶切位点Nhe I的899bp P-34片段；

[0052] 6307-F：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，6591-R：ATATTT TATGAGGCTAGCCCACCTCTCTAG(Nhe I)；

[0053] 6591-F：CTAGAGAGGTGGGCTAGCCTCATAAAATAT(Nhe I)，7056-R：CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT；

[0054] 6307-OV-F：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，7056-OV-R：CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT。

[0055] 将P-12和P-34分别连入T载体中得到质粒T-12和T-34，质粒T-12和质粒p239SpSp5’通过BsrG I和Pac I双酶切连接反应将单酶切位点Apa I引入到p239SpSp5’中，然后将所得质粒和质粒T-34通过Pac I和BstB I双酶切连接反应将单酶切位点Nhe I引入到p239SpSp5’中，Apa I和Nhe I双酶切获得去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段。

[0056] Apa I和Nhe I双酶切连入SEQ ID No.1所示核苷酸序列的T载体，然后SEQ ID No.1所示核苷酸序列与去掉Pol基因的p239SpSp5’质粒片段连接，最后连接SIVmac2393’端半长质粒p239SpE3’，获得所述重组免疫缺陷质粒。

[0057] 实施例2：所述免疫缺陷质粒的大量制备

[0058] 将所述免疫缺陷质粒转化JM109菌株，30℃平板培养18～20小时后，挑取单菌落接种到5mL含有氨苄的LB液体培养基中。30℃，180rpm震荡培养12～14小时后，取1.5mL菌体培养液进行质粒小提，酶切鉴定无误后，将剩余的3.5mL菌体培养液全部接种到1L含有氨苄的2×YT液体培养基中。30℃、180rpm震荡培养12小时后，取1.5mL菌体培养液再次进行小提，酶切鉴定无误后，参照Qiagen公司的的说明书，将1L的菌液用Endofree Plasmid Giga Kit进行质粒的大量制备。步骤如下：

[0059] (1)将菌液于4℃，6000rpm离心15min，弃去上清，将沉淀重悬于500ml冰预冷的STE溶液中，4℃，6000rpm离心15min，弃去上清；

[0060] (2)菌体沉淀重悬于125ml的Buffer P1中,振荡至无沉淀团块出现，加入125ml的Buffer P2，轻轻的颠倒离心管数次，室温下静置5min，待裂解充分后加入125ml的Buffer P3,颠倒离心管数次,充分混匀；

[0061] (3)将混匀后的裂解产物倒入滤器(Mega-Giga Cartridge)中，室温下静置20min以上，打开真空泵加压抽滤，待液体抽滤完毕后，加入50ml的Buffer FWB2，用无菌玻璃棒轻轻搅动沉淀团块，继续进行抽滤；

[0062] (4)在裂解液中加入30ml的Buffer ER，颠倒混匀，冰浴30min，待溶液澄清后加入预先用75ml的Buffer QBT平衡好的制备柱；

[0063] (5)待裂解液完全通过DNA制备柱后，用600ml的Buffer QC洗脱杂质，待液体全部过柱后，以100ml的洗脱液Buffer QN洗脱DNA；

[0064] (6)收集DNA洗脱液，加入70ml的异丙醇，充分混匀后，于12℃，10000rpm离心50min；

[0065] (7)小心倒去上清，用10ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃去乙醇洗液，离心管倒置在纸巾上自然干燥；

[0066] (8)加入5ml-10ml的生理盐水溶解质粒DNA；

[0067] (9)分光光度计测定质粒DNA的浓度，根据测定的质粒浓度稀释为终浓度为1μg/μl(或0.4μg/μl，40ng/μl)，-20℃保存。

[0068] 结果得到2.205mg的所述免疫缺陷质粒，使用三个限制性内切酶(EcoR I，Apa I和Nhe I)酶切所述免疫缺陷质粒，酶切产物电泳图见图2，结果显示：EcoR I不能酶切该质粒，Apa I把质粒剪切成两段，长度分别为7725bp和5476bp，Nhe I把质粒剪切成两段，长度分别为9865bp和3336bp，证明成功构建序列正确的免疫缺陷质粒。同时使用PCR方法特异性扩增所述免疫缺陷质粒中的SEQ ID No.1所示核苷酸序列，序列测定发现质粒保持稳定。

[0069] 实施例3：本发明所述免疫缺陷质粒的转染包装

[0070] 使用实施例2制备的所述免疫缺陷质粒转染293T细胞，获得具有感染性的完整病毒颗粒，使用6孔板进行293T细胞培养并获得病毒颗粒，具体步骤如下：

[0071] (1)用10％完全DMEM培养基将293T细胞铺入6孔板中(5×105/孔)，过夜培养，细胞密度达到70％，目的是为了培养较长时间。

[0072] (2)每孔用2ml不含抗生素的完全DMEM培养基换液，继续培养2小时。

[0073] (3)将5μg所述免疫缺陷质粒DNA稀释于650μl无血清、无抗生素的DMEM培养基，轻轻混匀。

[0074] (4)10μl Lipofectamine 2000 试剂(使用前轻轻混匀)稀释于650μl无血清、无抗生素的DMEM培养基，室温孵育5分钟。

[0075] (5)将稀释的质粒DNA和稀释的Lipofectamine 2000试剂(总体积为1.3ml)混合，轻轻混匀，室温20分钟，注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。

[0076] (6)直接将混合液分别加入每孔细胞中，轻轻摇动孔板混匀，5％CO2，37℃培养5小时。

[0077] (7)取2ml新鲜的2％完全培养基换液，5％CO2，37℃培养40小时。

[0078] (8)收集每孔上清，用0.45μM滤器过滤后，获得包含所述免疫缺陷病毒的上清。

[0079] 用SIV P27抗原检测试剂盒测定，转染上清检测到高水平的SIVP27抗原含量，SIV P27抗原含量大于33.11ng/mL，证明转染出能高水平表达的免疫缺陷病毒Pol-SHIV。所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV于2014年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9579

[0080] 实施例4：本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV感染CEMx174细胞试验[0081] 使用病毒特异性抗体染色Pol-SHIV感染CEMx174细胞，流式细胞检测结果见图3。A为未感染Pol-SHIV的CEMx174细胞背景1.02％；B为感染Pol-SHIV的CEMx174细胞，感染第9天，阳性细胞达到11.30％。表明本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV具有感染性。

[0082] 实施例5：本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的TCID50滴定

[0083] 对所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV在TZM-bl细胞中单循环感染周期(48小时培养)的TCID50进行测定，将对照的relative luminescence units(RLU)的2.5倍定为Cutoff值。步骤如下：

[0084] (1)将所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV从液氮中取出后4℃缓慢融化，用完全DMEM培养基2倍稀释病毒，取100μl病毒稀释液加入96孔培养板中，设四孔重复。

[0085] (2)10ml含45μg/ml DEAE的完全培养基实验前补充30μl Indinavir。

[0086] (3)消化一瓶TZM-bl细胞，离心，用3ml完全培养基悬浮细胞，取1ml细胞悬浮液，加3ml完全培养基以及8ml含45μg/ml DEAE完全培养基，混匀，每孔加100μl。

[0087] (4)用封口膜封住平板四周，37℃，5％CO2孵育48小时。

[0088] (5)除去培养基，200μl 1×PBS洗一遍。加入50μl CCRL裂解液，室温400rpm振荡30分钟。镜下观察细胞是否裂解完全。

[0089] (6)将细胞裂解液转移到黑色96孔读数板中(Optiplate-96F)，避免气泡产生。

[0090] (7)避光在96孔读数板中每孔加入50μl luciferase底物，轻轻振荡混匀。

[0091] (8)将96孔读数板上机(1420Multilabel Counter)，计数荧光强度。

[0092] (9)半数细胞感染剂量TCID50可运用Reed-Muench法公式计算：

[0093] TCID50＝CPE>50％病毒稀释度+(>50％的百分数-50)/(50％的百分数-<50％的百分数)

[0094] TZM-bl细胞表达功能性TAT蛋白，激活荧光素酶报告基因的表达，并且感染细胞的病毒量与细胞产生的荧光素酶活性成正比，而没感染病毒细胞的荧光素酶活性很差。根据该原理检测本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的感染性，结果发现细胞对照的荧光强度为638RLU，Pol-SHIV转染上清1:2稀释后，接种TZM-bl细胞的荧光强度在2500-4000RLU之间，大于细胞对照2.5倍的cutoff值，说明本发明所述Pol-SHIV病毒能感染TZM-bl细胞，该病毒是一个具有感染靶细胞能力的病毒，且与SIVmac239毒株具有相似的生物学特性。在此基础上，进一步测定了转染上清的TCID50，经计算，本发明构建质粒转染上清中含有700TCID50/mL的病毒。

[0095] 实施例6：本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的生物活性鉴定

[0096] 所测样品为：本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV、猴免疫缺陷病毒SIVmac239。

[0097] 1、测定SIV P27蛋白

[0098] 取450μL样品加入50μL Lysing Buffer，振荡混匀。用300μL 1×Plate Wash Buffer洗板，扣干，洗6次。加入梯度稀释的标准品，每孔200μL，留一孔作空白对照，加入处理好的样品200μL。封板，37℃孵育2小时。洗板。加入100μL SIV P27Detector Antibody，空白孔不加。封板，37℃孵育1小时；洗板。加入100μL Streptavidin Peroxidase Working Solution，空白孔不加。封板，37℃孵育30分钟；洗板。加入100μL Substrate Working Solution，不封板，室温孵育30分钟，用酶标仪读数，结果见表1。

[0099] 2、测定逆转录酶活性

[0100] 取样品于4℃、8000×g离心10min去除细胞碎片；上清移入新的离心管。将PEG与含病毒上清以1:2体积比小心混匀，冰上置放过夜。4℃，8000×g离心10min。弃上清并尽量移去PEG。用50-60μL裂解液(solution 4)重悬沉淀，15-25℃放置30min，以完全裂解病毒。取40μL移入一新离心管，加入20μL反应液(solution 3a)于病毒裂解液中，37℃孵育1～15h。
取微孔板固定好并标记名称，将60μL逆转录液移入微孔板，加盖于37℃孵育lh。仔细移去微孔板内上清，用250μL洗液(solution6)清洗5次，每次30s，最后尽量去净上清。每孔加入200μL anti-DIG-POD工作液(solution 5a)，S5:S8＝l:100稀释，加盖37℃孵育lh。尽量移去上清，用250μL洗液(solution 6)清洗5次，每次30s,最后尽量去净上清。每孔加入ABTS基质液(Solution 7)或含基质增强剂的ABTS基质液(solution 7a)200μL 15～25℃孵育至显色，酶标仪读数，结果见表1。

[0101] 表1本发明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的生物活性鉴定

[0102]样品 SIV P27(OD值) RT activity(OD值)
Pol-SHIV 3.311 1.899
SIVmac239 3.195 0.326
阳性对照 0.825 0.538
阴性对照 0.034 0.096

[0103] 由表1可知，本发明所述免疫缺陷病毒SIV P27蛋白含量和逆转录酶活性均高于猴免疫缺陷病毒，表明其具有高效的复制能力。

[0104] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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