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包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法、间充质系干细胞、细胞群、以及医药组合物

阅读：280发布：2020-06-24

专利汇可以提供包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法、间充质系干细胞、细胞群、以及医药组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的课题在于提供一种用于大量且迅速地制造细胞制剂的、有用且比增殖速度高的间充质系干细胞的制造方法。根据本发明，可以提供一种包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法，该方法包括：筛选工序，通过利用物理刺激或化学刺激对包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理，筛选增殖能力相对高的间充质系干细胞，其中，筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为CD106阴性，且金属硫蛋白家族基因的表达量比利用所述物理刺激或化学刺激进行处理前有所增加。，下面是包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法、间充质系干细胞、细胞群、以及医药组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法，该方法包括：
筛选工序，通过利用物理刺激或化学刺激对包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理，筛选增殖能力相对高的间充质系干细胞，
筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为CD106阴性，且金属硫蛋白家族基因的表达量比利用所述物理刺激或化学刺激进行处理前有所增加。
2.根据权利要求1所述的细胞群的制造方法，其中，通过利用物理刺激对所述包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理是将所述细胞群冷冻后再解冻。
3.根据权利要求1或2所述的细胞群的制造方法，其中，通过利用物理刺激对所述包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理包括：将所述细胞群悬浮于冷冻保存液，冷冻得到的悬浮液并保持冷冻状态，再进行解冻的工序。
4.根据权利要求3所述的细胞群的制造方法，其中，将所述冷冻状态保持2天以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞群的制造方法，该方法还包括：对所述筛选工序中得到的包含间充质系干细胞的细胞群进行培养和/或传代的工序。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞群的制造方法，该方法还包括：细胞群获得工序，通过对胎儿附属物进行酶处理，获得包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群。
7.根据权利要求6所述的细胞群的制造方法，该方法还包括：对所述细胞群获得工序中得到的细胞群进行培养的工序。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞群的制造方法，其中，所述金属硫蛋白家族基因是选自MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及MT2A中的至少1种。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为SA-β-Gal阴性。
10.根据权利要求9所述的细胞群的制造方法，其中，在所述细胞群中，SA-β-Gal阴性的所述间充质系干细胞的平均比率为90％以上。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD45阴性、CD34阴性、CD11b阴性、CD79alpha阴性、及HLA-DR阴性。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞的比增殖速度为0.14(1/天)以上。
13.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径为增殖能力相对低的间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径的80％以下。
14.一种间充质系干细胞，其为CD106阴性，且与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，金属硫蛋白家族基因的表达量增加。
15.根据权利要求14所述的间充质系干细胞，其中，所述金属硫蛋白家族基因是选自MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及MT2A中的至少1种。
16.根据权利要求14或15所述的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞为SA-β-Gal阴性。
17.根据权利要求14～16中任一项所述的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞为CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD45阴性、CD34阴性、CD11b阴性、CD79alpha阴性、及HLA-DR阴性。
18.根据权利要求14～17中任一项所述的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞的比增殖速度为0.14(1/天)以上。
19.根据权利要求14～18中任一项所述的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径为增殖能力相对低的间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径的80％以下。
20.一种包含间充质系干细胞的细胞群，其中，
与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，所述间充质系干细胞的金属硫蛋白家族基因的表达量增加，且为CD106阴性。
21.根据权利要求20所述的细胞群，其中，在所述细胞群中，CD106阳性的所述间充质系干细胞的比率低于5％。
22.根据权利要求20或21所述的细胞群，其中，在所述细胞群中，SA-β-Gal阴性的所述间充质系干细胞的平均比率为90％以上。
23.一种医药组合物，其包含权利要求14～19中任一项所述的间充质系干细胞或权利要求20～22中任一项所述的细胞群、以及药学上可接受的介质。
24.根据权利要求23所述的医药组合物，其中，间充质系干细胞对于人的1次给药量为
109个/kg体重以下。
25.根据权利要求23或24所述的医药组合物，其是选自免疫相关疾病、移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、胶原病、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、或特应性皮炎中的疾病的治疗剂。

说明书全文

包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法、间充质系干细胞、

细胞群、以及医药组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及包含间充质系干细胞(MSC)的细胞群的制造方法，该方法包括制备适于细胞治疗应用的间充质系干细胞(Mesenchymal stem cells：MSC)。另外，本发明涉及间充质系干细胞、包含间充质系干细胞的细胞群(间充质系干细胞群)、以及包含上述间充质系干细胞或上述细胞群的医药组合物。

背景技术

[0002] 也被称为间充质系基质细胞(Mesenchymal stromal cells)的间充质系干细胞是报道存在于骨髓、脂肪组织等的成体干细胞，具有分化为骨、软骨及脂肪等的能力。间充质系干细胞作为细胞治疗中有希望的细胞源而受到关注，最近已知其还存在于胎盘、脐带、胎膜等胎儿附属物。

[0003] 间充质系干细胞因除了分化能力以外还具有免疫抑制能力而备受瞩目，正在进行对使用了骨髓间充质系干细胞的移植物抗宿主反应(GVHD)、以及炎性肠病的Crohn病的实用化。作为间充质系干细胞，已知有各种细胞，其中，羊膜间充质系干细胞的免疫抑制效果好，而且作为细胞源的羊膜能够非侵入地进行采集，因此期待其在以各种免疫相关疾病为对象的细胞治疗中的应用(专利文献1)。

[0004] 专利文献1中记载了羊膜间充质系细胞组合物的制造方法及冷冻保存方法、以及治疗剂。另外，专利文献2中记载了细胞因子生产能力强的片状细胞培养物的制造方法，其中，记载了通过在制造片状细胞培养物时设置将细胞冷冻及解冻的步骤来提高片状细胞培养物的细胞因子生产能力。另外，专利文献3中记载了使用流式细胞术从多能性间充质系干细胞当中筛选具有高增殖能力(传代数、集落形成效率)的多能性间充质系干细胞的方法。另外，专利文献4中记载了如下制备羊膜间充质系干细胞群的方法，该方法包括：(A)从哺乳动物的羊膜采集间充质系细胞的细胞群的步骤；(B)对于所述间充质系细胞的细胞群，(b1)使用流式细胞仪检测前向散射光及侧向散射光，制成二维分布图，(b2)对通过在所述二维分布图上设定四边形的三分门而选择的细胞进行分选的步骤；以及(C)将所述分选的细胞进行传代培养的步骤。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：日本特开2015-61520号公报

[0008] 专利文献2：日本特开2015-15963号公报

[0009] 专利文献3：日本特表2014-501110号公报

[0010] 专利文献4：国际公开WO2013/077428号公报

发明内容

[0011] 发明要解决的课题

[0012] 在本发明等的初步研究中得知，由于间充质系干细胞的增殖性低(比增殖速度低)，因此并不容易大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的细胞。然而，专利文献1对于从间充质系干细胞当中选择性制备特定的具有优异特性的间充质系干细胞并没有任何记载，具体而言，对于获得对大量且迅速地制造细胞制剂有用、且比增殖速度高的间充质系干细胞没有任何记载。另外，专利文献2及3对于获得对大量且迅速地制造细胞制剂有用、且比增殖速度高的间充质系干细胞没有任何记载。专利文献4中虽然记载了从羊膜间充质系细胞的细胞群中制备具有高增殖能力和分化能力的羊膜间充质系干细胞群，但是是利用流式细胞术分选细胞的方法。专利文献4对于羊膜间充质系干细胞群中存在长轴/短轴大的细胞群和长轴/短轴小的细胞群、以及上述两种细胞对于物理刺激或化学刺激的耐受性不同没有任何记载和暗示。

[0013] 如上所述，目前为止，进行了从特定的细胞群中获得细胞因子生产能力、传代数、集落形成效率优异的细胞的尝试。然而，尚没有从间充质系干细胞当中经由对间充质系干细胞进行物理刺激或化学刺激的处理，从而大量且迅速地制造对大量且迅速地制造细胞制剂有用、且比增殖速度高的间充质系干细胞的设想和尝试。

[0014] 本发明的课题在于提供包含对大量且迅速地制造细胞制剂有用、且比增殖速度高的间充质系干细胞(MSC)的细胞群的制造方法、上述间充质系干细胞、包含上述间充质系干细胞的细胞群(间充质系干细胞群)、以及包含上述间充质系干细胞或上述细胞群的医药组合物。

[0015] 解决课题的方法

[0016] 本发明人等发现：间充质系干细胞中存在增殖速度不同的2种以上的细胞；这些细胞对物理刺激或化学刺激的耐受性不同；因此，可以通过利用物理刺激或化学刺激对包含上述2种以上的间充质系干细胞的细胞群进行处理，淘汰增殖速度低的间充质系干细胞；换言之，可以使增殖速度低的间充质系干细胞死亡、或者使其增殖性(比增殖速度)明显降低(即，可以使该细胞难以增加)。另外，本发明人等鉴定了CD106阴性、金属硫蛋白家族基因的表达量增加作为增殖性高的间充质系干细胞的特性。

[0017] 基于这些见解，本发明人等发现：通过利用物理刺激或化学刺激对包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理，可以筛选、获得增殖能力相对高的间充质系干细胞的活细胞；增殖能力相对高的间充质系干细胞的特性为CD106阴性、金属硫蛋白家族基因的表达量增加；或者可以提高该增殖能力相对高的间充质系干细胞的含有率。而且发现：大量含有该增殖能力相对高的间充质系干细胞的细胞群的比增殖速度快、极其适合细胞的大量且迅速的生产；因此，可以通过对该细胞(细胞群)进行培养、扩增来大量且迅速地制造细胞制剂。

[0018] 本发明是基于上述着眼点、设想、以及上述得到的见解而完成的。

[0019] 即，本说明书提供以下的发明。

[0020] [1]一种包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法，该方法包括：

[0021] 筛选工序，通过利用物理刺激或化学刺激对包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理，筛选增殖能力相对高的间充质系干细胞，

[0022] 筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为CD106阴性，且金属硫蛋白家族基因的表达量比利用所述物理刺激或化学刺激进行处理前有所增加。

[0023] [2]根据[1]中记载的细胞群的制造方法，其中，通过利用物理刺激对所述包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理是将所述细胞群冷冻后再解冻。

[0024] [3]根据[1]或[2]中记载的细胞群的制造方法，其中，通过利用物理刺激对所述包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群进行处理包括：将所述细胞群悬浮于冷冻保存液，冷冻得到的悬浮液并保持冷冻状态，再进行解冻的工序。

[0025] [4]根据[3]中记载的细胞群的制造方法，其中，将所述冷冻状态保持2天以上。

[0026] [5]根据[1]～[4]中任一项所记载的细胞群的制造方法，该方法还包括：对所述筛选工序中得到的包含间充质系干细胞的细胞群进行培养和/或传代的工序。

[0027] [6]根据[1]～[5]中任一项所记载的细胞群的制造方法，该方法还包括：细胞群获得工序，通过对胎儿附属物进行酶处理，获得包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群。

[0028] [7]根据[6]中记载的细胞群的制造方法，该方法还包括：对所述细胞群获得工序中得到的细胞群进行培养的工序。

[0029] [8]根据[1]～[7]中任一项所记载的细胞群的制造方法，其中，所述金属硫蛋白家族基因是选自MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及MT2A中的至少1种。

[0030] [9]根据[1]～[8]中任一项所记载的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为SA-β-Gal阴性。

[0031] [10]根据[9]中记载的细胞群的制造方法，其中，在所述细胞群中，SA-β-Gal阴性的所述间充质系干细胞的平均比率为90％以上。

[0032] [11]根据[1]～[10]中任一项所记载的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞为CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD45阴性、CD34阴性、CD11b阴性、CD79alpha阴性、及HLA-DR阴性。

[0033] [12]根据[1]～[11]中任一项所记载的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞的比增殖速度为0.14(1/天)以上。

[0034] [13]根据[1]～[11]中任一项所记载的细胞群的制造方法，其中，所述筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径为增殖能力相对低的间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径的80％以下。

[0035] [14]一种间充质系干细胞，其为CD106阴性，且与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，金属硫蛋白家族基因的表达量增加。

[0036] [15]根据[14]中记载的间充质系干细胞，其中，所述金属硫蛋白家族基因是选自MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及MT2A中的至少1种。

[0037] [16]根据[14]或[15]中记载的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞为SA-β-Gal阴性。

[0038] [17]根据[14]～[16]中任一项所记载的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞为CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD45阴性、CD34阴性、CD11b阴性、CD79alpha阴性、及HLA-DR阴性。

[0039] [18]根据[14]～[17]中任一项所记载的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞的比增殖速度为0.14(1/天)以上。

[0040] [19]根据[14]～[18]中任一项所记载的间充质系干细胞，其中，所述间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径为增殖能力相对低的间充质系干细胞在漂浮状态下的平均直径的80％以下。

[0041] [20]一种包含间充质系干细胞的细胞群，其中，

[0042] 与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，所述间充质系干细胞的金属硫蛋白家族基因的表达量增加，且为CD106阴性。

[0043] [21]根据[20]中记载的细胞群，其中，在所述细胞群中，CD106阳性的所述间充质系干细胞的比率低于5％。

[0044] [22]根据[20]或[21]中记载的细胞群，其中，在所述细胞群中，SA-β-Gal阴性的所述间充质系干细胞的平均比率为90％以上。

[0045] [23]一种医药组合物，其包含[14]～[19]中任一项所记载的间充质系干细胞或[20]～[22]中任一项所记载的细胞群、以及药学上可接受的介质。

[0046] [24]根据[23]中记载的医药组合物，其中，间充质系干细胞对于人的1次给药量为109个/kg体重以下。

[0047] [25]根据[23]或[24]中记载的医药组合物，其是选自免疫相关疾病、移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、胶原病、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、或特应性皮炎中的疾病的治疗剂。

[0048] [26]一种间充质系干细胞，其是通过[1]～[13]中任一项所记载的制造方法得到的。

[0049] [27][14]～[19]中任一项所记载的间充质系干细胞或[20]～[22]中任一项所记载的细胞群的用途，其用于医药组合物的制造。

[0050] [28]根据[27]中记载的用途，其中，医药组合物是间充质系干细胞对于人的1次给药量为109个/kg体重以下的医药组合物。

[0051] [29]根据[27]或[28]中记载的用途，其中，医药组合物是选自免疫相关疾病、移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、胶原病、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、或特应性皮炎中的疾病的治疗剂。

[0052] [30]用于在疾病治疗中使用的[14]～[19]中任一项所记载的间充质系干细胞或[20]～[22]中任一项所记载的细胞群。

[0053] [31]根据[30]中记载的间充质系干细胞或细胞群，其中，间充质系干细胞对于人的1次给药量为109个/kg体重以下。

[0054] [32]根据[30]或[31]中记载的间充质系干细胞或细胞群，其中，疾病是选自免疫相关疾病、移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、胶原病、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、或特应性皮炎中的疾病。

[0055] [33]一种疾病的治疗方法，该方法包括：对需要治疗的患者给药[14]～[19]中任一项所记载的间充质系干细胞或[20]～[22]中任一项所记载的细胞群。

[0056] [34]根据[33]中记载的疾病的治疗方法，其中，间充质系干细胞对于人的1次给药量为109个/kg体重以下。

[0057] [35]根据[33]或[34]中记载的疾病的治疗方法，其中，疾病是选自免疫相关疾病、移植物抗宿主病、炎性肠病、系统性红斑狼疮、胶原病、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、或特应性皮炎中的疾病。

[0058] [36]一种组合物，其包含[14]～[19]中任一项所记载的间充质系干细胞和介质。

[0059] [37]一种组合物，其包含[20]～[22]中任一项所记载的细胞群和介质。

[0060] 发明的效果

[0061] 根据本发明，能够得到比增殖速度高的间充质系干细胞(细胞群)，由此可以大量且迅速地制造细胞制剂(医药组合物)。例如，每一批次培养可以制备/制造2.3×103(个/cm2/天)以上的细胞。另外，根据本发明，可以得到对冷冻-解冻的耐受性提高了的间充质系干细胞(细胞群)。附图说明

[0062] 图1示出了实施例1的工序1-5中刚刚冷冻-解冻处理后的漂浮状态的羊膜MSC的锥虫蓝染色图像。

[0063] 图2示出了实施例1的工序1-4中得到的预培养2细胞(进行冷冻-解冻处理前的羊膜MSC)的融合的相差显微镜图像。

[0064] 图3示出了实施例1的工序1-6中得到的正式培养1细胞(冷冻-解冻处理后进行了1次培养的羊膜MSC)的融合的相差显微镜图像。

[0065] 图4示出了实施例1的工序1-6中得到的传代1细胞(冷冻-解冻处理后进行了1次传代的羊膜MSC)的融合的相差显微镜图像。

[0066] 图5示出了实施例1的工序1-4中得到的预培养2细胞(进行冷冻-解冻处理前的羊膜MSC)的SA-β-Gal的染色图像。

[0067] 图6示出了实施例3的工序3-5中得到的预培养3细胞(进行冷冻-解冻处理前的羊膜MSC)的SA-β-Gal的染色图像。

[0068] 图7示出了实施例3的工序3-9中得到的传代2细胞(冷冻-解冻处理后进行了2次传代的羊膜MSC)的SA-β-Gal的染色图像。

具体实施方式

[0069] 以下，对本发明的实施方式具体进行说明，以下的说明是为了易于理解本发明，但本发明的范围并不限定于下述实施方式，本领域技术人员适当变更下述实施方式的构成而得到的其它实施方式也包含在本发明的范围内。

[0070] [1]用语说明

[0071] 本说明书中的“胎儿附属物”是指胎膜、胎盘、脐带及羊水。另外，“胎膜”是指容纳胎儿的羊水的胎囊，其自内侧起由羊膜、绒毛膜以及蜕膜构成。其中，羊膜和绒毛膜是因胎儿产生的。“羊膜”是位于胎膜最内层的血管很少透明薄膜。羊膜的内层(也称为上皮细胞层)被具有分泌功能的一层上皮细胞包覆，分泌羊水，羊膜的外层(也称为细胞外基质层，相当于间质)包含间充质系干细胞。

[0072] 本说明书中的“间充质系干细胞(Mesenchymal stem cells：MSC)”是指满足下述定义的干细胞，可以与“间充质系基质细胞(Mesenchymal stromal cells)”无差别地使用。在本说明书中，“间充质系干细胞”有时记载为“MSC”。

[0073] 间充质系干细胞的定义

[0074] i)在标准培养基的培养条件下，显示出对塑料的附着性。

[0075] ii)表面抗原CD105、CD73、CD90为阳性，CD45、CD34、CD11b、CD79alpha、HLA-DR为阴性。

[0076] 本说明书中的“羊膜间充质系干细胞”是指来自于羊膜的间充质系干细胞，可以与“羊膜间充质系基质细胞”无差别地使用。在本说明书中，“羊膜间充质系干细胞”有时记载为“羊膜MSC”。

[0077] 本说明书中的“间充质系干细胞群”是指包含间充质系干细胞的细胞群，其形态没有特别限定，可以列举例如：细胞团、细胞团块、细胞漂浮液或细胞悬浮液等。

[0078] 包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群是指，至少包含增殖能力相对高的间充质系干细胞及增殖能力相对低的间充质系干细胞的细胞群。本发明人等发现，上述的增殖能力相对低的间充质系干细胞对物理刺激或化学刺激的耐受性相对较低，另一方面，上述的增殖能力相对高的间充质系干细胞对物理刺激或化学刺激的耐受性相对较高。在存在增殖能力不同的2种间充质系干细胞的情况下，将增殖能力相对高的细胞称为“增殖能力相对高的间充质系干细胞”，将增殖能力相对低的细胞称为“增殖能力相对低的间充质系干细胞”。

[0079] 本说明书中的“每1批次培养的获得细胞数”是指在1次培养中，单位培养容器表面2
积、单位培养天数所得到的细胞数。因此，“每1批次培养的获得细胞数”的单位为(个/cm /天)。

[0080] 本说明书中的“相对”是指与对应对象相比时的高低或大小。例如，对于包含增殖能力不同的间充质系干细胞的细胞群，在以增殖能力作为指标，将细胞分类为增殖能力高的间充质系干细胞和增殖能力低的间充质系干细胞的情况下，将前者增殖能力高的间充质系干细胞称为“增殖能力相对高的间充质系干细胞”，将后者增殖能力低的间充质系干细胞称为“增殖能力相对低的间充质系干细胞”。

[0081] 同样地，对于包含大小不同的细胞的细胞群，在以大小作为指标，将细胞分类为尺寸大的细胞和尺寸小的细胞的情况下，将前者尺寸大的细胞称为“尺寸相对大的细胞”，将后者尺寸小的细胞称为“尺寸相对小的细胞”。

[0082] 本说明书中的“增殖能力”是指细胞通过进行细胞分裂而使细胞数增加的能力。间充质系干细胞群中的间充质系干细胞(MSC)的增殖能力可以使用比增殖速度来评价。比增殖速度的测定方法如本说明书中后面所述。

[0083] [2]包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法

[0084] 通过本发明得到的包含间充质系干细胞的细胞群的制造方法是包括以下工序的方法：筛选工序，通过利用物理刺激或化学刺激对包含增殖能力不同的间充质系干细胞(MSC)的细胞群进行处理，筛选增殖能力相对高的间充质系干细胞。

[0085] “筛选增殖能力相对高的间充质系干细胞”是指淘汰增殖速度相对低的间充质系干细胞，即，通过使增殖速度相对低的间充质系干细胞死亡、或者使其增殖性(比增殖速度)明显降低，从而实现包含间充质系干细胞的细胞群中增殖能力相对高的间充质系干细胞的比率增高的状态，但不特别限定于该状态。

[0086] 包含增殖能力不同的MSC的细胞群是指至少包含增殖能力相对高的MSC和增殖能力相对低的MSC的细胞群。

[0087] 本发明的制造方法可以包含以下工序：细胞群获得工序，通过对试样(例如，羊膜等胎儿附属物等)进行酶处理，获得包含增殖能力不同的MSC的细胞群。

[0088] 羊膜由表层的上皮细胞层和细胞外基质层构成，后者中含有羊膜MSC。羊膜上皮细胞与其它上皮细胞同样，具有能够表达上皮钙粘蛋白(E-cadherin：CD324)及上皮细胞粘附因子(EpCAM：CD326)的特征，而羊膜MSC不表达这些上皮特异性表面抗原标记物，可以用流式细胞术容易地进行区分。上述的细胞群获得工序可以包括通过剖腹产获得羊膜的工序。

[0089] 试样(例如，羊膜等胎儿附属物等)的酶处理优选为利用能够使试样的细胞外基质层所含的MSC游离、且不分解试样的上皮细胞层的酶(或其组合)来进行的处理。作为所述酶，没有特别限定，可以列举例如胶原酶和/或金属蛋白酶。作为金属蛋白酶，可以举出作为切断非极性氨基酸N末端侧的金属蛋白酶的嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶，但没有特别限定。

[0090] 胶原酶的浓度优选为50CDU/ml以上，更优选为75CDU/ml以上，进一步优选为100CDU/ml以上，进一步优选为125CDU/ml以上，进一步优选为150CDU/ml以上。另外，胶原酶的浓度没有特别限定，例如可以为1000CDU/ml以下、900CDU/ml以下、800CDU/ml以下、
700CDU/ml以下、600CDU/ml以下、500CDU/ml以下、400CDU/ml以下、300CDU/ml以下。这里，CDU(collagen digestion unit)定义为以胶原作为基质，在37℃、pH7.5下，5小时生成相当于1μmol亮氨酸的氨基酸及肽的酶量。金属蛋白酶(例如，嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶)的浓度优选为100PU/ml以上，更优选为125PU/ml以上，进一步优选为150PU/ml以上，进一步优选为175PU/ml以上，进一步优选为200PU/ml以上。另外，金属蛋白酶的浓度优选为800PU/ml以下，更优选为700PU/ml以下，进一步优选为600PU/ml以下，进一步优选为500PU/ml以下，进一步优选为400PU/ml以下。这里，PU(protease unit)定义为以乳酸酪蛋白作为基质，在35℃、pH7.2下，1分钟生成相当于1μg酪氨酸的氨基酸及肽的酶量。在上述的酶浓度的范围内，可以防止混入试样的上皮细胞层所含的上皮细胞、并使细胞外基质层所含的MSC高效率地游离。在将胶原酶的浓度设为低于50CDU/ml、或将金属蛋白酶的浓度设为低于100CDU/ml时，细胞外基质层的消化不充分，有时MSC的回收率明显降低。将金属蛋白酶的浓度设为大于800CDU/ml时，上皮细胞随着上皮细胞层的分解而混入消化液，因此有时MSC的回收率相对降低。胶原酶和/或金属蛋白酶的优选的浓度组合可以根据用显微镜观察酶处理后的试样、用流式细胞术测定获得的细胞来确定。另外，优选利用后述的物理刺激或化学刺激对基本不含有上皮细胞的MSC进行处理。

[0091] 从高效地效率回收活细胞的观点考虑，优选组合胶原酶及金属蛋白酶，将试样同时一并进行处理。作为这种情况下的金属蛋白酶，可以使用嗜热菌蛋白酶和/或中性蛋白酶，但并不限定于此。可以通过使用含有胶原酶及金属蛋白酶的酶液仅对试样进行一次处理就简便地获得MSC。另外，通过同时一并进行处理，可以降低细菌、病毒等的污染风险。

[0092] 试样的酶处理优选将用生理盐水、Hank’s平衡盐溶液等清洗液清洗后的试样浸渍于酶液中，利用搅拌装置一边搅拌一边进行处理。作为所述搅拌装置，从使试样的细胞外基质层所含的MSC高效率地游离的观点考虑，可以使用例如搅拌器或振荡器，但并不限定于此。搅拌速度没有特别限定，但在使用了搅拌器或振荡器的情况下，例如为5rpm以上、10rpm以上、20rpm以上、30rpm以上、40rpm以上或50rpm以上。另外，搅拌速度没有特别限定，但在使用了搅拌器或振荡器的情况下，例如为100rpm以下、90rpm以下、80rpm以下、70rpm以下或60rpm以下。酶处理时间没有特别限定，例如为10分钟以上、20分钟以上、30分钟以上、40分钟以上、50分钟以上或60分钟以上。另外，酶处理时间没有特别限定，例如为6小时以下、5小时以下、4小时以下、3小时以下、2小时以下、110分钟以下、100分钟以下、90分钟以下、80分钟以下或70分钟以下。酶处理温度没有特别限定，例如为15℃以上、16℃以上、17℃以上、18℃以上、19℃以上、20℃以上、21℃以上、22℃以上、23℃以上、24℃以上、25℃以上、26℃以上、27℃以上、28℃以上、29℃以上、30℃以上、31℃以上、32℃以上、33℃以上、34℃以上、35℃以上或36℃以上。另外，酶处理温度没有特别限定，例如为40℃以下、39℃以下、38℃以下或37℃以下。

[0093] 在本发明的制造方法中，可以根据希望利用过滤器对含有游离的MSC的酶溶液进行过滤。仅有游离的细胞通过过滤器，未被分解的上皮细胞层无法通过过滤器而在过滤器上残留，因此，不仅能够容易地回收游离的MSC，而且可以降低细菌、病毒等的污染风险。作为过滤器，没有特别限定，可以列举例如筛网过滤器。筛网过滤器的孔径(网眼的大小)没有特别限定，例如为40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上、110μm以上、120μm以上、130μm以上或140μm以上。另外，筛网过滤器的孔径没有特别限定，例如为200μm以下、190μm以下、180μm以下、170μm以下、160μm以下或150μm以下。对于过滤速度没有特别限定，通过将筛网过滤器的孔径设为上述范围，可以通过自然滴落来过滤含有MSC的酶溶液，由此可以防止细胞生存率降低。

[0094] 作为筛网过滤器的材质，可以优选使用尼龙。可以使用作为研究用途广泛使用的Falcon细胞筛网等含有40μm、70μm或100μm的尼龙筛网过滤器的管。另外，另外，可以使用血液透析等所使用的医疗用网布(尼龙以及聚酯)。另外，也可使用体外循环时使用的动脉过滤器(聚酯筛网过滤器、孔径：40μm以上且120μm以下)。也可使用其它材质，例如，不锈钢筛网过滤器等。

[0095] 在使MSC通过过滤器时，优选自然滴落(自由滴落)。也可采用利用泵等进行抽吸等的强制过筛，为了避免损伤细胞，希望采用尽量小的压力。

[0096] 通过过滤器的MSC可用2倍或2倍以上量的培养基或平衡盐缓冲液将滤液稀释后，通过离心分离进行回收。作为平衡盐缓冲液，可以使用杜氏膦酸盐缓冲液(DPBS)、厄尔平衡盐缓冲液(EBSS)、Hank’s平衡盐缓冲液(HBSS)、磷酸缓冲液(PBS)等，但并不限定于此。

[0097] 上述的细胞群获得工序中得到的细胞群可以根据希望在上述筛选工序之前通过培养使其增殖。即，本发明的制造方法可以进一步包括对上述细胞群获得工序中得到的细胞群进行培养的工序。所述培养(预培养)优选使用塑料盘或烧瓶在3％以上且5％以下的CO2浓度、37℃环境下进行。另外，在对细胞群获得工序中得到的细胞群进行培养的工序中，可以将细胞传代1次以上。

[0098] 上述培养所用的培养基没有特别限定，可以列举例如：αMEM(Alpha Modification of Minimum Essential Medium Eagle)、DMEM、BME、BGJb、CMRL1066、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option、IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、Eagle MEM、RPMI1640、M199、Ham’s F10培养基、Ham’s F12培养基、Fischer’s培养基、混合培养基(例如DMEM/F12培养基)、无血清培养基、或者以此为基础的培养基。作为无血清培养基，可以列举例如：STK1、STK2(DS Pharma Biomedical公司)、EXPREP MSC Medium(Biomimetics Simpeas公司)、Corning stemgro人间充质系干细胞培养基(Corning公司)等，没有特别限定。这些培养基中可以根据需要添加白蛋白、血清、血清替代试剂、增殖因子、增殖因子的稳定化试剂(肝素等)等，但没有特别限定，也可以添加其它成分。在白蛋白的情况下，优选为大于0.05％且5％以下的浓度。在血清的情况下，优选为5％以上的浓度。

[0099] 本发明的制造方法包括：筛选工序，通过利用物理刺激或化学刺激(优选为物理刺激)对包含增殖能力不同的MSC的细胞群进行处理，筛选增殖能力相对高的MSC。

[0100] 对于物理刺激或化学刺激的种类而言，只要是能够将增殖能力相对高的MSC与增殖能力相对低的MSC分离的刺激即可，没有特别限定。可以列举例如：增殖能力相对高的MSC对该刺激的耐受性高于增殖能力相对低的MSC对该刺激的耐受性的刺激，但没有特别限定。

[0101] 作为物理刺激，可以列举：冷冻及解冻、加热、过滤、离心分离、电泳、施加电压、加压、减压、浸透压变化、紫外线照射、超声波照射等，没有特别限定。可以单独或组合应用多种物理刺激，但并不限定于此。

[0102] 作为化学刺激，可以列举：基因导入、利用细胞毒性化合物进行的处理、利用酸或碱进行的pH变化处理等，但没有特别限定。可以单独或组合应用多种化学刺激，但并不限定于此。

[0103] 作为物理刺激的优选一例，可以举出，将包含增殖能力不同的MSC的细胞群冷冻后再解冻。另外，作为物理刺激的更优选方式，可以列举：将包含增殖能力不同的MSC的细胞群悬浮于冷冻保存液，冷冻得到的悬浮液并保持冷冻状态，再进行解冻。

[0104] 作为化学刺激的优选一例，可以举出，使用含有金属硫蛋白家族基因的碱基序列的载体将基因导入包含CD106阴性的MSC的细胞群。作为导入基因的具体的方式，可以列举：使用了病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等)、或非病毒载体(例如，质粒DNA、人工染色体载体等)的基因导入，但并不限定于此。

[0105] 从提高增殖能力相对高的MSC的生存率的观点考虑，上述的冷冻用保存液优选含有给定浓度的多糖类。多糖类的优选浓度例如为1质量％以上、2质量％以上、3质量％以上、4质量％以上、5质量％以上、6质量％以上、7质量％以上、8质量％以上、9质量％以上、10质量％以上、11质量％以上或12质量％以上。另外，多糖类的优选浓度例如为40质量％以下、
35质量％以下、30质量％以下、25质量％以下、20质量％以下、19质量％以下、18质量％以下、17质量％以下、16质量％以下、15质量％以下、14质量％以下或13质量％以下。作为多糖类，可以列举例如：羟乙基淀粉(HES)或葡聚糖(Dextran40等)等，但并不限定于此。

[0106] 从高效率地筛选增殖能力相对高的MSC的观点考虑，上述的冷冻用保存液优选含有给定浓度的二甲基亚砜(DMSO)。DMSO的优选浓度例如为1质量％以上、2质量％以上、3质量％以上、4质量％以上、5质量％以上、6质量％以上、7质量％以上、8质量％以上或9质量％以上。另外，DMSO的优选浓度例如为20质量％以下、19质量％以下、18质量％以下、17质量％以下、16质量％以下、15质量％以下、14质量％以下、13质量％以下、12质量％以下、11质量％以下或10质量％以下。

[0107] 从提高增殖能力相对高的MSC的生存率的观点考虑，上述的冷冻用保存液优选含有大于0质量％的给定浓度的白蛋白。白蛋白的优选浓度例如为0.5质量％以上、1质量％以上、2质量％以上、3质量％以上、4质量％以上、5质量％以上、6质量％以上、7质量％以上或8质量％以上。另外，白蛋白的优选浓度例如为40质量％以下、35质量％以下、30质量％以下、25质量％以下、20质量％以下、15质量％以下、10质量％以下或9质量％以下。作为白蛋白，可以列举例如：牛血清白蛋白、小鼠白蛋白、人白蛋白等，但并不限定于此。

[0108] 用于冷冻包含增殖能力不同的MSC的细胞群的方法，没有特别限定，可以列举例如：程序冷冻、浸渍冷冻、浸渍于液氮中等。冷冻时的优选温度例如为-30℃以下、-40℃以下、-50℃以下、-60℃以下、-70℃以下、-80℃以下、-90℃以下、-100℃以下、-110℃以下、-120℃以下或-130℃以下。另外，冷冻时的优选温度例如为-196℃(液氮温度)以上、-190℃以上、-180℃以上、-170℃以上、-160℃以上、-150℃以上或-140℃以上。冷冻时的优选冷冻速度例如为-1℃/分、-2℃/分、-3℃/分、-4℃/分、-5℃/分、-6℃/分、-7℃/分、-8℃/分、-9℃/分、-10℃/分、-11℃/分、-12℃/分、-13℃/分、-14℃/分或-15℃/分。在使用程序冷冻作为冷冻方法的情况下，例如，可以以-2℃/分以上且-1℃/分以下的冷冻速度将温度降至-50℃以上且-30℃以下之间的温度(例如-40℃)，再以-11℃/分以上且-9℃/分以下(例如-10℃/分)的冷冻速度将温度降至-100℃以上且-80℃以下的温度(例如-90℃)。

[0109] 在通过上述的冷冻方法进行冷冻时，上述的细胞群可以在装入任意保存容器的状态下被冷冻。作为所述保存容器，可以列举例如：冻存管、冷冻小瓶、冷冻用带、输液袋等，但并不限定于此。

[0110] 从高效率地筛选增殖能力相对高的MSC的观点考虑、上述的冷冻后的细胞群优选在能够保持冷冻状态的温度下保持给定期间。保持冷冻状态时的优选温度的上限例如为-130℃以下、-140℃以下或-150℃以下。另外，保持冷冻状态时的优选温度的下限例如为-
196℃(液氮温度)以上、-190℃以上、-180℃以上、-170℃以上或-160℃以上。细胞质的玻璃化转变温度为-130℃，因此，在将保持冷冻状态时的温度设为高于-130℃时，细胞内形成冰晶，有时会降低细胞生存率。保持冷冻状态的优选期间的下限例如为12小时以上、16小时以上、20小时以上、24小时以上、30小时以上、36小时以上、42小时以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上、15天以上、16天以上、17天以上、18天以上、19天以上、20天以上、21天以上、
22天以上、23天以上、24天以上、25天以上、26天以上、27天以上、28天以上、29天以上、30天以上或31天以上。另外，保持冷冻状态的期间的上限没有特别限定，例如为20年以下、10年以下、5年以下、4年以下、3年以下、2年以下、1年以下、11个月以下、10个月以下、9个月以下、
8个月以下、7个月以下、6个月以下、5个月以下、4个月以下、3个月以下、2个月以下或1个月以下。

[0111] 作为上述冷冻后的细胞群的解冻方法，可以列举例如，与高于冷冻温度的温度的介质(例如，固体、液体、气体)接触(例如，浸渍)，但并不限定于此。上述介质的温度的下限没有特别限定，例如为1℃以上、2℃以上、3℃以上、4℃以上、5℃以上、6℃以上、7℃以上、8℃以上、9℃以上、10℃以上、11℃以上、12℃以上、13℃以上、14℃以上、15℃以上、16℃以上、17℃以上、18℃以上、19℃以上、20℃以上、21℃以上、22℃以上、23℃以上、24℃以上、25℃以上、26℃以上、27℃以上、28℃以上、29℃以上、30℃以上、31℃以上、32℃以上、33℃以上、34℃以上、35℃以上或36℃以上。另外，上述介质的温度的上限没有特别限定，例如为50℃以下、49℃以下、48℃以下、47℃以下、46℃以下、45℃以下、44℃以下、43℃以下、42℃以下、41℃以下、40℃以下、39℃以下、38℃以下或37℃以下。解冻所需要的时间没有特别限定，例如为10秒钟、20秒钟、30秒钟、40秒钟、50秒钟、60秒钟(1分钟)、70秒钟、80秒钟、90秒钟、100秒钟、110秒钟、120秒钟(2分钟)、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。例如，在用37℃的恒温槽对装入聚丙烯制的2ml容量冻存管(外径：13.5mm)的1ml冷冻状态的细胞悬浮液进行解冻时，可以在2分钟以内解冻。另外。例如，在用37℃的恒温槽对装入聚烯烃制的25ml容量冷冻用袋(外部尺寸：81mm×121.5mm)的20ml冷冻状态的细胞悬浮液进行解冻时，可以在5分钟以内解冻。通过快速解冻，可以提高增殖能力相对高的MSC的生存率。

[0112] 上述筛选工序中得到的包含MSC的细胞群可以进一步进行培养和/或传代，由此可以大量得到增殖能力相对高的MSC(后述的比增殖速度高的MSC)，另外，可以提高得到的细胞群中增殖能力相对高的MSC的含有率。即，本发明的制造方法可以进一步包括对上述筛选工序中得到的包含MSC的细胞群进行培养和/或传代的工序。上述筛选工序之后进行培养和/或传代而得到的间充质系干细胞群中，上述的增殖能力相对高的MSC的含有率为10％以上，优选为20％以上，进一步优选为30％以上，进一步优选为40％以上，进一步优选为50％以上，进一步优选为60％以上，进一步优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，进一步优选为99％以上，特别优选为100％。需要说明的是，刺激处理前的细胞群中增殖能力相对高的MSC的含有率随供体而不同，但后述的实施例所示，本发明人等发现该含有率通常为1％以下。

[0113] 上述的筛选工序中得到的MSC的培养(正式培养)例如可以通过以下这样的工序来进行。首先，对冷冻-解冻处理后的融化的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清，用培养基悬浮得到的细胞团。接着，将细胞接种于塑料制培养容器，在3％以上且5％以下的CO2浓度、37℃环境下，使用培养基培养至融合率为95％以下。作为上述的培养基，可以列举例如：αMEM、DMEM、BME、BGJb、CMRL1066、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option、IMDM、Eagle MEM、RPMI1640、M199、Ham’s F10培养基、Ham’s F12培养基、Fischer’s培养基、混合培养基(例如DMEM/F12培养基)、无血清培养基、或者以这些为基础的培养基，但并不限定于此。这些培养基没有特别限定，可以根据需要添加白蛋白、血清、血清替代试剂、增殖因子、增殖因子的稳定化试剂等追加成分。通过上述这样的培养(正式培养)获得的细胞是1次培养后的细胞。

[0114] 上述的1次培养后的细胞例如可以如下所述进一步进行传代、培养。首先，在用乙二胺四乙酸(EDTA)处理1次培养后的细胞之后，用胰蛋白酶进行处理，使其从塑料制培养容器上剥离。接着，将得到的细胞悬浮液离心分离，除去上清，用培养基悬浮得到的细胞团。最后，将细胞接种于塑料制培养容器，在3％以上且5％以下的CO2浓度、37℃环境下，使用培养基培养至融合率为95％以下。作为上述的培养基，可以列举例如：αMEM、DMEM、BME、BGJb、CMRL1066、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option、IMDM、Eagle MEM、RPMI1640、M199、Ham’s F10培养基、Ham’s F12培养基、Fischer’s培养基、混合培养基(例如DMEM/F12培养基)、无血清培养基、或者以这些为基础的培养基，但并不限定于此。这些培养基没有特别限定，可以根据需要添加白蛋白、血清、血清替代试剂、增殖因子、增殖因子的稳定化试剂等追加成分。通过上述这样的传代及培养获得的细胞是1次传代后的细胞。通过进行同样的传代及培养，可以获得N次传代后的细胞(N表示1以上的整数)。从大量制造细胞的观点考虑，传代次数N的下限例如优选为1次以上、2次以上、3次以上、4次以上、5次以上、6次以上、7次以上、8次以上或9次以上。另外，从抑制细胞的衰老的观点考虑，传代次数N的上限例如优选为50次以下、45次以下、40次以下、35次以下、30次以下、25次以下或20次以下。

[0115] 在上述的本发明的方法中，筛选得到的增殖能力相对高的间充质系干细胞的特征在于，其为CD106阴性，且金属硫蛋白家族基因的表达量比利用上述物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞有所增加。对于上述的增殖能力相对高的间充质系干细胞的特性，在本说明书的后面进行说明。

[0116] [3]本发明的间充质系干细胞的特性

[0117] 本发明的间充质系干细胞的特性为CD106阴性，且与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，金属硫蛋白家族基因的表达量增加。因此，本发明的间充质系干细胞(增殖能力相对高的间充质系干细胞)是CD106阴性，且与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，金属硫蛋白家族基因的表达量有所增加的间充质系干细胞。

[0118] 在本发明中，MSC的表达标记物可以通过该技术领域中公知的任意检测方法进行检测。作为上述表达标记物，可以列举例如细胞表面抗原或细胞内表达蛋白质，但并不限定于此。作为表达标记物的具体例子，可以列举：CD106(VCAM1)、CD105(Endoglin)、CD73(Ecto-5’-nucleotidase)、CD90(Thy-1)、CD45(Leukocyte Common Antigen)、CD34(Hematopoietic Progenitor Cell Antigen)、CD11b(IntegrinαM)、CD79alpha(Mb-1)、HLA-DR(Human Leukocyte Antigen DR)、CD324(E-cadherin)及CD326(EpCAM)等。

[0119] 本发明的间充质系干细胞为CD106阴性。本发明的间充质系干细胞优选为CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD45阴性、CD34阴性、CD11b阴性、CD79alpha阴性、及HLA-DR阴性。

[0120] 作为检测上述的表达标记物的方法，可以举出例如流式细胞术或细胞染色，但并不限定于此。在使用荧光标记抗体的流式细胞术中，与阴性对照(同型对照)相比，检测出发更强荧光的细胞的情况下，判定该细胞对该标记物为“阳性”。荧光标记抗体可以使用该技术领域中公知的任意抗体，可以列举例如：用异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)等标记的抗体，但并不限定于此。在细胞染色中，显微镜下观察到着色或发荧光的细胞的情况下，判定该细胞对该标记物为“阳性”。细胞染色可以为使用抗体的免疫细胞染色，也可以为不使用抗体的非免疫细胞染色。

[0121] 检测上述表达标记物的时机没有特别限定，可以列举例如：在利用物理刺激或化学刺激进行处理之前(例如，刚刚从生物体试样中分离细胞后、刚刚进行预培养后、即将进行筛选工序之前等)、利用物理刺激或化学刺激进行处理之后(例如，刚刚进行筛选工序后、刚刚进行正式培养后、在正式培养后刚刚进行了N次传代后(N表示1以上的整数)等)、或者在制剂成为医药品组合物之前。

[0122] 本发明的间充质系干细胞优选为SA-β-Gal(senescence-associated beta-galactosidase；衰老相关β半乳糖苷酶)阴性。本发明人等发现，如后述的实施例所示，增殖能力相对低的MSC为SA-β-Gal阳性的衰老细胞，与此相对，增殖能力相对高的MSC为SA-β-Gal阴性的非衰老细胞。MSC为SA-β-Gal阴性表明该细胞为增殖能力相对高的MSC。

[0123] 上述的SA-β-Gal的检测例如可以通过检测SA-β-Gal的活性来进行，具体而言，可以通过使用了SA-β-Gal特异性基质(例如，显色性基质或荧光性基质)的细胞染色来进行。在使用了SA-β-Gal特异性基质的细胞染色中，在光学显微镜下观察到细胞质内被染色的细胞的情况下，判定该细胞对SA-β-Gal为“阳性”。

[0124] 检测上述的SA-β-Gal的时机没有特别限定，可以列举例如：在利用物理刺激或化学刺激进行处理之前(例如，刚刚从生物体试样中分离细胞后、刚刚进行预培养后、即将进行筛选工序之前等)、利用物理刺激或化学刺激进行处理之后(例如，刚刚进行筛选工序后、刚刚进行正式培养后、在正式培养后刚刚进行了N次传代后(N表示1以上的整数)等)、或者在制剂成为医药品组合物之前。

[0125] 在本发明的间充质系干细胞中，与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，金属硫蛋白家族基因的表达量有所增加。金属硫蛋白是富含半胱氨酸残基的低分子量(约6,500)的金属结合蛋白质，已确认在多种生物中存在，哺乳类中存在4种亚型(MT-I、MT-II、MT-III、MT-IV)。作为金属硫蛋白-I及-II的生理功能，已知减轻重金属的毒性、积蓄重金属、调节锌及铜的代谢、抗氧化作用、清除自由基的作用、减少抗癌药物的副作用及抗癌剂耐受性等。可以推测，在本发明中，利用物理刺激或化学刺激进行处理、具体而言例如通过冷冻-解冻处理增加金属硫蛋白家族基因的表达量，从而实现了间充质系干细胞增殖性的提高、以及间充质系干细胞对冷冻-解冻的耐受性的提高，但本发明不受上述理论或机理的任何限制。

[0126] 作为金属硫蛋白家族基因，优选可以列举为选自MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及MT2A中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、或全部6种。

[0127] MT1E是由序列号1所示的碱基序列构成的基因、或者编码由序列号7所示的氨基酸序列构成的多肽的基因。

[0128] MT1F是由序列号2所示的碱基序列构成的基因、或者编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的多肽的基因。

[0129] MT1G是由序列号3所示的碱基序列构成的基因、或者编码由序列号9所示的氨基酸序列构成的多肽的基因。

[0130] MT1H是由序列号4所示的碱基序列构成的基因、或者编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的多肽的基因。

[0131] MT1X是由序列号5所示的碱基序列构成的基因、或者编码由序列号11所示的氨基酸序列构成的多肽的基因。

[0132] MT2A是由序列号6所示的碱基序列构成的基因、或者编码由序列号12所示的氨基酸序列构成的多肽的基因。

[0133] 对于本发明的间充质系干细胞而言，与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，只要金属硫蛋白家族基因的表达量有所增加即可，没有特别限定，优选增大1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、或2.2倍以上。需要说明的是，这里所谓的金属硫蛋白家族基因的表达量可以按照后述的任意方法测定得到，也可以使用除此以外的方法测定得到，测定方法没有特别限定。

[0134] 上述的金属硫蛋白家族基因的表达量的测可以以金属硫蛋白家族基因的转录产物(mRNA)或金属硫蛋白家族蛋白质作为指标来进行。具体而言，金属硫蛋白家族基因的表达量的测定可以通过RT-PCR、Northern印迹杂交、在微阵列上进行杂交的微阵列分析、或免疫测定(例如，ELISA(酶联免疫吸附剂测定，enzyme-linked immuno-sorbent assay))等来进行。

[0135] 上述在微阵列上进行杂交的微阵列分析具体可以通过以下的步骤(1)～(4)来进行。

[0136] (1)使用细胞刮棒(Corning公司制造)将贴壁细胞从塑料制培养容器上非酶促剥离，通过离心分离回收细胞。使用RNA稳定化试剂(RNAlater(Thermo Fisher Scientific公司制造))将细胞稳定保存后，使用RNA提取试剂盒(Rneasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN公司制造))提取总RNA，进行纯化。

[0137] (2)使用纯化后的总RNA作为模板，通过逆转录反应合成cDNA，进一步通过体外转录(in vitro transcription)从合成的cDNA转录为cRNA，进行生物素标记。

[0138] (3)将生物素标记cRNA加入杂交缓冲液，在Human GeneGenome U133A2.0Array(Affymetrix公司制造)上进行16小时的杂交。用GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix公司制造)清洗，进行藻红蛋白染色，然后用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix公司制造)进行扫描，用AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix公司制造)进行图像分析，并使用Affymetrix Expression Console(Affymetrix公司制造)进行数值化。

[0139] (4)使用分析软件GeneSpring GX(Agilent Technologies公司制造)对2个阵列的数值数据文件进行比较分析。用间充质系干细胞样品的Normalized(归一化)值除以利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞样品(对照)的Normalized值，由此计算出Fold Change(倍数变化)值。

[0140] 本发明的间充质系干细胞与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，对冷冻-解冻的耐受性有所提高，这将在实施例中详细说明。对冷冻-解冻的耐受性的评价例如可以以冷冻保存及解冻后的细胞生存率作为指标来进行。具体而言，对冷冻-解冻的耐受性的评价可以通过以下方式进行：将冷冻保存及解冻后的细胞在给定温度(例如，25℃(室温)、37℃(体温))下静置给定时间(例如，0、1或2小时)，然后用锥虫蓝染色，用血球计数板测定细胞生存率，但并不限定于此。

[0141] 本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径有时小于增殖能力相对低的MSC在漂浮状态下的平均直径。MSC在漂浮状态下的直径的测定方法没有特别限定，例如，可以在相差显微镜观察下进行测定，也可以用自动细胞计数器进行测定。MSC在漂浮状态下的平均直径以通过上述测定方法测定得到的多个细胞直径的平均值的形式计算。

[0142] 本发明的增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的直径例如可以为增殖能力相对低的MSC在漂浮状态下的平均直径的80％以下、75％以下、70％以下或65％以下，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径例如可以为增殖能力相对低的MSC在漂浮状态下的直径的45％以上、50％以上或55％以上，没有特别限定。

[0143] 本发明的增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径例如可以为28μm以下、27μm以下、26μm以下、25μm以下、24μm以下、23μm以下、22μm以下、21μm以下、20μm以下、19μm以下、18μm以下、17μm以下、16μm以下、15μm以下或14μm以下，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径例如可以为8μm以上、9μm以上或10μm以上，没有特别限定。

[0144] 本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度有时具有小于增殖能力相对低的MSC在附着状态下的长轴的平均长度的倾向，但对于这一点没有特别限定。另外，本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度有时具有小于增殖能力相对低的MSC在附着状态下的短轴的平均长度的倾向，但对于这一点没有特别限定。MSC在附着状态下的长轴或短轴的长度的测定方法没有特别限定，例如，可以对附着于塑料制培养容器的细胞进行显微镜观察来测定。MSC在附着状态下的长轴或短轴的平均长度以通过上述测定方法测定得到的多个细胞的长轴或短轴的长度的平均值的形式计算。

[0145] 本发明的增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度例如可以为增殖能力相对低的MSC在附着状态下的长轴的平均长度的80％以下、70％以下、60％以下、50％以下或40％以下，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度例如可以为增殖能力相对低的MSC在附着状态下的长轴的平均长度的20％以上、25％以上、30％以上或35％以上，没有特别限定。

[0146] 本发明的增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度例如可以为13μm以上、14μm以上、15μm以上或16μm以上，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度例如可以为48μm以下、46μm以下或44μm以下，没有特别限定。

[0147] 本发明的增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为增殖能力相对低的MSC在附着状态下的短轴的平均长度的80％以下、70％以下、60％以下、50％以下或40％以下，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为增殖能力相对低的MSC在附着状态下的短轴的平均长度的25％以上、30％以上或35％以上，没有特别限定。

[0148] 本发明的增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为4μm以上、5μm以上或6μm以上，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为14μm以下、13μm以下或12μm以下，没有特别限定。

[0149] 本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC的比增殖速度快于增殖能力相对低的MSC的比增殖速度。即，增殖能力相对高的MSC是比增殖速度相对快的MSC，增殖能力相对低的MSC是比增殖速度相对相对慢的MSC。MSC的增殖能力可以用比增殖速度进行评价。比增殖速度定义为单位时间内细胞数的增加，比增殖速度以μ＝ln(mt2/mt1)/(t2-t1)表示。这里，t1及t2为培养天数，mt1为第t1天的细胞数、mt2为第t2天的细胞数(其中，t2＞t1)。因此，比增殖速度的单位为(个/个/天)＝(1/天)。

[0150] 本发明的增殖能力相对高的MSC的比增殖速度优选为增殖能力相对低的MSC的比增殖速度的1.1倍以上，更优选为1.2倍以上，进一步优选为1.3倍以上，进一步优选为1.4倍以上，进一步优选为1.5倍以上，进一步优选为1.6倍以上，进一步优选为1.7倍以上，进一步优选为1.8倍以上，进一步优选为1.9倍以上，进一步优选为2.0倍以上，进一步优选为2.1倍以上，进一步优选为2.2倍以上，进一步优选为2.3倍以上，进一步优选为2.4倍以上，进一步优选为2.5倍以上，进一步优选为2.6倍以上，进一步优选为2.7倍以上，进一步优选为2.8倍以上，进一步优选为2.9倍以上，进一步优选为3.0倍以上，进一步优选为3.1倍以上，进一步优选为3.2倍以上，进一步优选为3.3倍以上，进一步优选为3.4倍以上，特别优选为3.5倍以上。另外，增殖能力相对高的MSC的比增殖速度没有特别限定，例如为增殖能力相对低的MSC的比增殖速度的5.0倍以下、4.5倍以下或4.0倍以下。

[0151] 本发明的增殖能力相对高的MSC的比增殖速度为0.07(1/天)以上，优选为0.08(1/天)以上，更优选为0.09(1/天)以上，进一步优选为0.10(1/天)以上，进一步优选为0.11(1/天)以上，进一步优选为0.12(1/天)以上，进一步优选为0.13(1/天)以上，进一步优选为0.14(1/天)以上，进一步优选为0.15(1/天)以上，进一步优选为0.16(1/天)以上，进一步优选为0.17(1/天)以上，进一步优选为0.18(1/天)以上，进一步优选为0.19(1/天)以上，进一步优选为0.20(1/天)以上，进一步优选为0.21(1/天)以上，进一步优选为0.22(1/天)以上，进一步优选为0.23(1/天)以上，进一步优选为0.24(1/天)以上，进一步优选为0.25(1/天)以上，进一步优选为0.26(1/天)以上，进一步优选为0.27(1/天)以上，进一步优选为0.28(1/天)以上，进一步优选为0.29(1/天)以上，进一步优选为0.30(1/天)以上，进一步优选为
0.31(1/天)以上，进一步优选为0.32(1/天)以上，进一步优选为0.33(1/天)以上，进一步优选为0.34(1/天)以上，进一步优选为0.35(1/天)以上，进一步优选为0.36(1/天)以上，进一步优选为0.37(1/天)以上，进一步优选为0.38(1/天)以上，特别优选为0.39(1/天)以上。另外，增殖能力相对高的MSC的比增殖速度没有特别限定，例如为0.60(1/天)以下或0.50(1/天)以下。

[0152] 本发明的增殖能力相对高的MSC的能够传代的次数为1次以上、优选为2次以上、更优选为3次以上、进一步优选为4次以上、进一步优选为5次以上、进一步优选为6次以上、进一步优选为7次以上、进一步优选为8次以上、进一步优选为9次以上、进一步优选为10次以上、进一步优选为11次以上、进一步优选为12次以上、进一步优选为13次以上、进一步优选为14次以上、进一步优选为15次以上、进一步优选为16次以上、进一步优选为17次以上、进一步优选为18次以上、进一步优选为19次以上、进一步优选为20次以上、进一步优选为25次以上。另外，能够传代的次数的上限没有特别限定，例如为50次以下、45次以下、40次以下、35次以下或30次以下。

[0153] 根据本发明的制造方法，可以得到增殖能力相对高的MSC，由此能够大量且迅速地制造细胞制剂(医药组合物)。每1批次培养的获得细胞数(单位表面积、单位培养天数所得到的细胞数)的下限根据播种细胞数、播种密度等而不同，例如为2.3×103(个/cm2/天)以上、2.4×103(个/cm2/天)以上、2.5×103(个/cm2/天)以上、2.6×103(个/cm2/天)以上、2.7×103(个/cm2/天)以上、2.8×103(个/cm2/天)以上、2.9×103(个/cm2/天)以上、3.0×103(个/cm2/天)以上、3.1×103(个/cm2/天)以上或3.2×103(个/cm2/天)以上。另外，每1批次培养的获得细胞数的上限没有特别限定，例如为4.0×103(个/cm2/天)以下、3.9×103(个/cm2/天)以下、3.8×103(个/cm2/天)以下、3.7×103(个/cm2/天)以下、3.6×103(个/cm2/天)以下、3.5×103(个/cm2/天)以下、3.4×103(个/cm2/天)以下或3.3×103(个/cm2/天)以下。

[0154] 本发明的间充质系干细胞可以以与介质组合而成的组合物的形式提供。作为介质，可以优选使用液体介质(例如，培养基、或后述的药学上可接受的介质等)。

[0155] [4]包含间充质系干细胞的细胞群

[0156] 根据本发明，可以提供包含间充质系干细胞的细胞群，其中，上述间充质系干细胞与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，金属硫蛋白家族基因的表达量增加，且为CD106阴性。

[0157] 在上述细胞群中，CD106阳性的上述间充质系干细胞的比率优选低于5％，更优选低于4％，进一步优选低于3％，进一步优选低于2％，进一步优选低于1％，可以为0％。

[0158] 在上述细胞群中，CD106阴性的上述间充质系干细胞的比率优选为95％以上，更优选为96％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，进一步优选为99％以上，可以为100％。

[0159] 本发明的细胞群可以至少包含CD90阳性的间充质系干细胞。在上述细胞群中，CD90阳性的间充质系干细胞的比率优选为70％以上，更优选为75％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为91％以上，进一步优选为92％以上，进一步优选为93％以上，进一步优选为94％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为96％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，进一步优选为99％以上，可以为
100％。

[0160] 本发明的细胞群可以至少包含CD73阳性的间充质系干细胞。在上述细胞群中，CD73阳性的间充质系干细胞的比率优选为55％以上，更优选为60％以上，进一步优选为65％以上，进一步优选为70％以上，进一步优选为75％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为96％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，进一步优选为99％以上，可以为
100％。

[0161] 作为测定上述细胞群中对上述表达标记物为阳性的细胞的比率的方法，可以举出例如流式细胞术，但并不限定于此。在使用荧光标记抗体的流式细胞术中，在检测出比阴性对照(同型对照)发更强荧光的细胞的情况下，判定该细胞对该标记物为“阳性”。细胞群中对特定表达标记物为阳性的间充质系干细胞的比率可以按照以下步骤(1)～(3)计算。

[0162] (1)用纵轴为细胞数、横轴为被抗体标记的色素的荧光强度的直方图表示测定结果。

[0163] (2)确定用同型对照用抗体测定的全部细胞中荧光强度更强的细胞群为0.1～1.0％时的荧光强度。

[0164] (3)计算出用对特定表达标记物的抗体测定的全部细胞中比上述(2)确定的荧光强度更强的细胞的比例。

[0165] 荧光标记抗体可以使用该技术领域中公知的任意抗体，可以列举例如用异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)等标记的抗体，但并不限定于此。

[0166] 另外，作为测定上述细胞群中对上述表达标记物为阳性的细胞的比率的其它方法，可以举出例如细胞染色，但并不限定于此。在细胞染色中，在显微镜下观察到着色或发荧光的细胞的情况下，判定该细胞对该标记物为“阳性”。使用显微镜以相同放大倍率观察细胞群，求出视场内阳性细胞数相对于总细胞数的比率，由此可以确定细胞群中特定表达标记物为阳性的细胞的比率。细胞染色可以是使用抗体的免疫细胞染色，也可以是不使用抗体的非免疫细胞染色。

[0167] 本发明的细胞群中的增殖能力相对高的MSC优选为SA-β-Gal(senescence-associated beta-galactosidase；衰老相关β半乳糖苷酶)阴性。本发明人等发现，如后述的实施例所示，增殖能力相对低的MSC为SA-β-Gal阳性的衰老细胞，与此相对，增殖能力相对高的MSC为SA-β-Gal阴性的非衰老细胞。MSC为SA-β-Gal阴性表明该细胞为增殖能力相对高的MSC。

[0168] 在上述细胞群中，SA-β-Gal阴性的间充质系干细胞的平均比率优选为90％以上，更优选为91％以上，进一步优选为92％以上，进一步优选为93％以上，进一步优选为94％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为96％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，进一步优选为99％以上，进一步优选为99.5％以上，可以为100％。

[0169] 作为测定上述细胞群中上述的SA-β-Gal为阳性的细胞的平均比率的方法，例如可以通过检测SA-β-Gal的活性来进行，具体而言，可以通过使用了SA-β-Gal特异性基质(例如，显色性基质或荧光性基质)的细胞染色来进行。在使用了SA-β-Gal特异性基质的细胞染色中，在光学显微镜下观察到细胞质内被染色的细胞的情况下，判定该细胞对SA-β-Gal为“阳性”。另外，细胞群中SA-β-Gal阴性的细胞的平均比率(细胞群中SA-β-Gal阴性的细胞比率的算术平均值)可以按照以下步骤(1)～(4)计算。

[0170] (1)准备附着于塑料培养容器的细胞群，进行使用了SA-β-Gal特异性基质的细胞染色。

[0171] (2)在细胞染色后，使用光学显微镜以相同放大倍率观察相同塑料培养容器中至少3个部位，测定视场内的总细胞数和SA-β-Gal阳性细胞数。

[0172] (3)对于各测定部位，按照下式计算出细胞群中SA-β-Gal阴性的细胞的比率。

[0173] 细胞群中SA-β-Gal阴性的细胞的比率＝100-{(SA-β-Gal阳性细胞数/总细胞数)×100(％)}

[0174] (4)计算出细胞群中SA-β-Gal阴性的细胞的平均比率(细胞群中SA-β-Gal阴性的细胞的比率的算术平均值)。

[0175] 与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，本发明的细胞群中的间充质系干细胞只要金属硫蛋白家族基因的表达量增加即可，没有特别限定，优选增大1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、或2.2倍以上。

[0176] 对于上述细胞群而言，上述的金属硫蛋白家族基因的表达量的测定可以以金属硫蛋白家族基因的转录产物(mRNA)或金属硫蛋白家族蛋白质作为指标来进行。具体而言，金属硫蛋白家族基因的表达量的测定可以通过RT-PCR、Northern印迹杂交、在微阵列上进行杂交的微阵列分析、或免疫测定(例如，ELISA(enzyme-linked immuno-sorbent assay))等来进行。

[0177] 上述在微阵列上进行杂交的微阵列分析具体可以通过以下的步骤(1)～(4)来进行。

[0178] (1)使用细胞刮棒(Corning公司制造)将贴壁细胞群从塑料制培养容器上非酶促剥离，通过离心分离回收细胞群。使用RNA稳定化试剂(RNAlater(Thermo Fisher Scientific公司制造))将细胞群稳定保存后，使用RNA提取试剂盒(Rneasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN公司制造))提取总RNA，进行纯化。

[0179] (2)使用纯化后的总RNA作为模板，通过逆转录反应合成cDNA，进一步通过体外转录(in vitro transcription)从合成的cDNA转录为cRNA，进行生物素标记。

[0180] (3)将生物素标记cRNA加入杂交缓冲液，在Human GeneGenome U133A2.0Array(Affymetrix公司制造)上进行16小时的杂交。用GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix公司制造)清洗，进行藻红蛋白染色，然后用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix公司制造)进行扫描，用AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix公司制造)进行图像分析，并使用Affymetrix Expression Console(Affymetrix公司制造)进行数值化。

[0181] (4)使用分析软件GeneSpring GX(Agilent Technologies公司制造)对2个阵列的数值数据文件进行比较分析。用间充质系干细胞样品的Normalized(归一化)值除以利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞样品(对照)的Normalized值，由此计算出Fold Change(倍数变化)值。

[0182] 与利用物理刺激或化学刺激进行处理前的细胞相比，本发明的细胞群中的间充质系干细胞优选对冷冻-解冻的耐受性提高。对冷冻-解冻的耐受性的评价例如可以以冷冻保存及解冻后的细胞生存率作为指标来进行。具体而言，对冷冻-解冻的耐受性的评价可以通过以下方式进行：将冷冻保存及解冻后的细胞在给定温度(例如，25℃(室温)、37℃(体温))下静置给定时间(例如，0、1或2小时)，然后用锥虫蓝染色，用血球计数板测定细胞生存率，但并不限定于此。

[0183] 本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径有时小于增殖能力相对低的MSC在漂浮状态下的平均直径。MSC在漂浮状态下的直径的测定方法没有特别限定，例如，可以在相差显微镜观察下进行测定，也可以用自动细胞计数器进行测定。MSC在漂浮状态下的平均直径以通过上述测定方法测定得到的多个细胞直径的平均值的形式计算。

[0184] 本发明的间充质系干细胞群中增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径例如可以为28μm以下、27μm以下、26μm以下、25μm以下、24μm以下、23μm以下、22μm以下、21μm以下、20μm以下、19μm以下、18μm以下、17μm以下、16μm以下、15μm以下或14μm以下，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在漂浮状态下的平均直径例如可以为8μm以上、9μm以上或10μm以上，没有特别限定。

[0185] 本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度有时具有小于增殖能力相对低的MSC在附着状态下的长轴的平均长度的倾向。另外，本发明人等发现，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度有时具有小于增殖能力相对低的MSC在附着状态下的短轴的平均长度的倾向。MSC在附着状态下的长轴或短轴的长度的测定方法没有特别限定，例如，可以对附着于塑料制培养容器的细胞进行显微镜观察来测定。MSC在附着状态下的长轴或短轴的平均长度以通过上述测定方法测定得到的多个细胞的长轴或短轴的长度的平均值的形式计算。

[0186] 本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度例如可以为13μm以上、14μm以上、15μm以上或16μm以上，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的长轴的平均长度例如可以为48μm以下、46μm以下或44μm以下，没有特别限定。

[0187] 本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为增殖能力相对低的MSC在附着状态下的短轴的平均长度的80％以下、70％以下、60％以下、50％以下或40％以下，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为增殖能力相对低的MSC在附着状态下的短轴的平均长度的25％以上、30％以上或35％以上，没有特别限定。

[0188] 本发明的间充质系干细胞群中增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为4μm以上、5μm以上或6μm以上，没有特别限定。另外，增殖能力相对高的MSC在附着状态下的短轴的平均长度例如可以为14μm以下、13μm以下或12μm以下，没有特别限定。

[0189] 本发明人等发现，本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC的比增殖速度快于增殖能力相对低的MSC的比增殖速度。即，细胞群中增殖能力相对高的MSC是比增殖速度相对快的MSC，细胞群中增殖能力相对低的MSC是比增殖速度相对相对慢的MSC。细胞群中的MSC的增殖能力可以用比增殖速度进行评价。比增殖速度定义为单位时间内细胞数的增加，比增殖速度以μ＝ln(mt2/mt1)/(t2-t1)表示。这里，t1及t2为培养天数，mt1为第t1天的细胞数、mt2为第t2天的细胞数(其中，t2＞t1)。因此，比增殖速度的单位为(个/个/天)＝(1/天)。

[0190] 本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC的比增殖速度优选为增殖能力相对低的MSC的比增殖速度的1.1倍以上，更优选为1.2倍以上，进一步优选为1.3倍以上，进一步优选为1.4倍以上，进一步优选为1.5倍以上，进一步优选为1.6倍以上，进一步优选为1.7倍以上，进一步优选为1.8倍以上，进一步优选为1.9倍以上，进一步优选为2.0倍以上，进一步优选为2.1倍以上，进一步优选为2.2倍以上，进一步优选为2.3倍以上，进一步优选为2.4倍以上，进一步优选为2.5倍以上，进一步优选为2.6倍以上，进一步优选为2.7倍以上，进一步优选为2.8倍以上，进一步优选为2.9倍以上，进一步优选为3.0倍以上，进一步优选为3.1倍以上，进一步优选为3.2倍以上，进一步优选为3.3倍以上，进一步优选为3.4倍以上，特别优选为3.5倍以上。另外，增殖能力相对高的MSC的比增殖速度对比增殖速度没有特别限定，例如为增殖能力相对低的MSC的比增殖速度的5.0倍以下、4.5倍以下或4.0倍以下。

[0191] 本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC的比增殖速度为0.07(1/天)以上，优选为0.08(1/天)以上，更优选为0.09(1/天)以上，进一步优选为0.10(1/天)以上，进一步优选为0.11(1/天)以上，进一步优选为0.12(1/天)以上，进一步优选为0.13(1/天)以上，进一步优选为0.14(1/天)以上，进一步优选为0.15(1/天)以上，进一步优选为0.16(1/天)以上，进一步优选为0.17(1/天)以上，进一步优选为0.18(1/天)以上，进一步优选为0.19(1/天)以上，进一步优选为0.20(1/天)以上，进一步优选为0.21(1/天)以上，进一步优选为0.22(1/天)以上，进一步优选为0.23(1/天)以上，进一步优选为0.24(1/天)以上，进一步优选为0.25(1/天)以上，进一步优选为0.26(1/天)以上，进一步优选为0.27(1/天)以上，进一步优选为0.28(1/天)以上，进一步优选为0.29(1/天)以上，进一步优选为0.30(1/天)以上，进一步优选为0.31(1/天)以上，进一步优选为0.32(1/天)以上，进一步优选为0.33(1/天)以上，进一步优选为0.34(1/天)以上，进一步优选为0.35(1/天)以上，进一步优选为0.36(1/天)以上，进一步优选为0.37(1/天)以上，进一步优选为0.38(1/天)以上，特别优选为0.39(1/天)以上。另外，增殖能力相对高的MSC的比增殖速度没有特别限定，例如为0.60(1/天)以下或0.50(1/天)以下。

[0192] 本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC的能够传代的次数为1次以上、优选为2次以上、更优选为3次以上、进一步优选为4次以上、进一步优选为5次以上、进一步优选为6次以上、进一步优选为7次以上、进一步优选为8次以上、进一步优选为9次以上、进一步优选为10次以上、进一步优选为11次以上、进一步优选为12次以上、进一步优选为13次以上、进一步优选为14次以上、进一步优选为15次以上、进一步优选为16次以上、进一步优选为17次以上、进一步优选为18次以上、进一步优选为19次以上、进一步优选为20次以上、进一步优选为25次以上。另外，能够传代的次数的上限没有特别限定，例如为50次以下、45次以下、40次以下、35次以下或30次以下。

[0193] 本发明的细胞群中增殖能力相对高的MSC的含有率优选为10％以上，更优选为20％以上，进一步优选为30％以上，进一步优选为40％以上，进一步优选为50％以上，进一步优选为60％以上，进一步优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为91％以上，进一步优选为92％以上，进一步优选为93％以上，进一步优选为94％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为96％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，进一步优选为99％以上，特别优选为100％。

[0194] 本发明的细胞群可以在冷冻状态下保存至即将使用前。本发明的细胞群除了增殖能力相对高的MSC以外，还可以含有任意成分。作为所述成分，可以列举例如：盐类、多糖类(例如，HES、葡聚糖等)、蛋白质(例如，白蛋白等)、DMSO、培养基成分(例如，RPMI1640培养基中含有的成分等)等，但并不限定于此。

[0195] 本发明的细胞群可以以与介质组合而成的组合物的形式提供。作为介质，可以优选使用液体介质(例如，培养基、或后述的药学上可接受的介质等)。

[0196] [5]医药组合物

[0197] 本发明的增殖能力相对高的间充质系干细胞、或包含上述间充质系干细胞的细胞群可以作为医药组合物使用。本发明的医药组合物包含本发明的间充质系干细胞或本发明的细胞群、以及药学上可接受的介质。

[0198] 本发明的医药组合物可以用作细胞治疗剂，例如难治性疾病治疗剂。

[0199] 本发明的医药组合物可以作为选自免疫相关疾病、缺血性疾病(下肢缺血、缺血性心脏病(心肌梗塞等)、冠状动脉性心脏病、缺血性脑血管病、缺血性肾病、肺缺血等)、神经性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)、包括克罗恩病、溃疡性结肠炎的炎性肠病、包括系统性红斑狼疮的胶原病、脑梗塞、脑内血肿、脑血管麻痹、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、特应性皮炎、播散性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮、糖尿病、蕈样肉芽肿(Alibert-Bazin综合征)、硬皮病、软骨等因结缔组织的变性和/或炎症所导致的疾病、眼部疾病、血管发生相关疾病、充血性心力衰竭、心肌病、伤口、上皮损伤、纤维化病、肺部疾病、癌中的疾病的治疗剂而使用。通过以对治疗部位的效果能够测定的量给药本发明的医药组合物，可以抑制炎症。

[0200] 另外，根据本发明，可以提供一种本发明的间充质系干细胞或细胞群的用途，其用于医药组合物的制造。

[0201] 另外，根据本发明，可以提供用于医药组合物的本发明的间充质系干细胞或本发明的细胞群。另外，根据本发明，可以提供用于选自免疫相关疾病、缺血性疾病(下肢缺血、缺血性心脏病(心肌梗塞等)、冠状动脉性心脏病、缺血性脑血管病、缺血性肾病、肺缺血等)、神经性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)、包括克罗恩病、溃疡性结肠炎的炎性肠病、包括系统性红斑狼疮的胶原病、脑梗塞、脑内血肿、脑血管麻痹、放射性肠炎、肝硬化、脑卒中、特应性皮炎、播散性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮、糖尿病、蕈样肉芽肿(Alibert-Bazin综合征)、硬皮病、软骨等因结缔组织的变性和/或炎症导致的疾病、眼部疾病、血管发生相关疾病、充血性心力衰竭、心肌病、伤口、上皮损伤、纤维化病、肺部疾病、癌的疾病治疗的本发明的间充质系干细胞或本发明的细胞群。另外，根据本发明，可以提供本发明的间充质系干细胞或本发明的细胞群，其被给药于患者或受试者，用于心肌的再生、心肌细胞的生成、血管发生、血管的修复、或抑制免疫应答。

[0202] 另外，根据本发明，可以提供一种对患者或受试者移植细胞的方法、以及患者或受试者的疾病的治疗方法，该方法包括：对患者或受试者给药治疗有效量的本发明的间充质系干细胞或本发明的细胞群的工序。

[0203] 作为本发明的医药组合物的给药量，是在对患者或受试者给药的情况下，与未给药的患者或受试者相比，能够获得对疾病的治疗效果的细胞的量。具体的给药量可以根据给药方式、给药方法、使用目的、以及患者或受试者的年龄、体重及症状等适当确定。给药量没有特别限定，例如为104个/kg体重以上、105个/kg体重以上或106个/kg体重以上。另外，给药量没有特别限定，例如为109个/kg体重以下、108个/kg体重以下或107个/kg体重以下。

[0204] 本发明的医药组合物的给药方法没有特别限定，可以列举例如：皮下注射、淋巴结内注射、静脉内注射、静脉滴注、腹腔内注射、胸腔内注射或对局部的直接注射、或对局部的直接移植等。对于医药组合物的给药方法，例如在日本特开2015-61520号公报、Onken JE,t al.American College of Gastroenterology Conference 2006Las Vegas,NV,Abstract 121.,Garcia-Olmo D,et al.Dis Colon Rectum 2005；48:1416-23.等中已知有静脉内注射、静脉滴注、对局部的直接注射、对局部的直接移植等。本发明的医药组合物也可以通过上述文献中记载的各种方法进行给药。

[0205] 本发明的医药组合物可以用作以治疗其它疾病为目的的注射用制剂、或细胞块或片状结构的移植用制剂、或者与任意凝胶混合而成的凝胶制剂。

[0206] 本发明的患者或受试者通常是人，也可以是其它动物。作为其它动物，可以列举例如：狗、猫、牛、马、猪、山羊、绵羊、猴(食蟹猴、恒河猴、普通狨、日本猴)、雪貂、兔、啮齿类(小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠)等哺乳动物、鸡、鹌鹑等鸟类，没有特别限定。

[0207] 本发明的医药组合物可以在冷冻状态下保存至即将使用前。本发明的医药组合物可以包括在人的治疗时使用的任意成分。作为所述成分，可以列举例如：盐类、多糖类(例如，HES、葡聚糖等)、蛋白质(例如，白蛋白等)、DMSO、培养基成分(例如，RPMI1640培养基中含有的成分等)等，但并不限定于此。

[0208] 另外，本发明的医药组合物可以是用作为药学上可接受的介质而使用的输液制剂将间充质系干细胞或细胞群稀释而成的医药组合物。作为本说明书中的“输液制剂(药学上可接受的介质)”，只要是在人的治疗时使用的溶液即可，没有特别限定，可以列举例如：生理盐水、5％葡萄糖液、林格氏液、乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、起始液(1号液)、脱水补充液(2号液)、保持输液(3号液)、术后恢复液(4号液)等。

[0209] 需要说明的是，对于间充质系干细胞等干细胞的医疗用途，例如在日本特表2012-509087号公报、日本特表2014-501249号公报、日本特开2013-256515号公报、日本特开
2014-185173号公报、日本特开2015-038059号公报、日本特开2015-110659号公报、日本特表2006-521121号公报、日本特表2009-542727号公报、日本特表2010-535715号公报、日本特开2014-224117号公报、日本特开2015-061862号公报、日本特表2002-511094号公报、日本特表2004-507454号公报、日本特表2010-505764号公报、日本特表2011-514901号公报、日本特开2013-064003号公报、日本特开2015-131795号公报等中，已知有免疫相关疾病及病症的治疗、血管形成、结缔组织的生成、修复和/或保持、眼部疾病及过度血管发生的治疗、心肌再生、关节修复、基因疾病及病症的治疗、以及免疫调节等。另外，日本特表2010-
518096号公报中记载了使用胎盘干细胞的炎症性疾病的治疗，日本特开2015-178498号公报及日本专利第5950577号记载了使用胎盘干细胞的脑卒中的治疗。另外，J Am Coll Cardiol.2009December 8；54(24):2277-2286.中记载了使用骨髓间充质系干细胞的心力衰竭的治疗，Brain 2011:134；1790-1807.中记载了使用骨髓间充质系干细胞的脑梗塞的治疗，Ann Thorac Surg,2013；95:1827-33.中记载了使用胎盘间充质系干细胞的心力衰竭的治疗。本发明的间充质系干细胞或细胞群也对上述文献中记载的各种疾病的治疗是有用的。

[0210] 在以下的实施例中，对本发明具体进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

[0211] 实施例

[0212] (实施例1)

[0213] 通过以下一系列工序1-1～工序1-6获得了比增殖速度快的羊膜MSC(增殖能力相对高的羊膜MSC)。

[0214] (工序1-1：羊膜的采集)

[0215] 从获得知情同意的择期剖腹产病例的孕妇无菌采集作为胎儿附属物的胎膜及胎盘。将得到的胎膜及胎盘置于装有生理盐水的无菌桶中，用手从胎膜的断端剥离羊膜。用Hank’s平衡盐溶液(不含有Ca、Mg)清洗羊膜2次，除去附着的血液及血块。

[0216] (工序1-2：羊膜的酶处理及羊膜MSC的回收)

[0217] (方法)

[0218] 对每1g羊膜添加含有300CDU/mL纯化胶原酶(Worthington公司、CLSPA)及200PU/mL中性蛋白酶I(和光纯药、型号386-02271)的Hank’s平衡盐溶液(含有Ca、Mg)5mL，在37℃、90分钟、60rpm的条件下进行振荡搅拌。这里，CDU(collagen digestion unit)定义为以胶原作为基质，在37℃、pH7.5下，5小时生成相当于1μmol亮氨酸的氨基酸及肽的酶量。另外，PU(protease unit)定义为以乳酸酪蛋白作为基质，在35℃、pH7.2下，1分钟生成相当于1μg酪氨酸的氨基酸及肽的酶量。用2倍量的含有10％胎牛血清(FBS)的αMEM(Alpha
Modification of Minimum Essential Medium Eagle)悬浮羊膜的酶处理物。使用尼龙筛网过滤器(孔径：100μm)过滤得到的细胞悬浮液，对含有羊膜MSC的滤液进行回收。通过苏木素-伊红(HE)染色对残留在尼龙筛网过滤器上的未消化的羊膜进行了评价。以400xg对含有羊膜MSC的滤液进行5分钟离心，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团，获得了含有增殖能力不同的羊膜MSC的细胞悬浮液。将Turk’s染色液与一部分得到的细胞悬浮液混合，测定了细胞数。在用标记抗体于4℃下将从滤液回收的羊膜MSC染色15分钟后，添加用于除去死细胞的碘化丙啶(Propidium Iodide)或7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)，使用流式细胞仪(FACSCanto：Becton,Dickinson and Company、日本BD公司(以下简称为BD公司))分析了表面抗原。标记抗体使用了抗CD90-FITC抗体(BD公司)。

[0219] (结果)

[0220] 根据苏木素-伊红(HE)染色的结果可知，残留在过滤器上的羊膜的上皮细胞层保留下来而未被消化，上皮细胞层内存在大量的上皮细胞。另外，残留在过滤器上的羊膜的细胞外基质层已被消化，在过滤器上未确认到羊膜MSC。这表明，通过采用以羊膜的细胞外基质层为标靶、且不以羊膜的上皮细胞层为标靶的胶原酶及中性蛋白酶，可以回收基本上不含有上皮细胞的滤液。

[0221] 利用Turk’s染色进行的细胞数测定的结果确认了从羊膜组织获得的细胞数为每1g组织重量2.3×106个。

[0222] 流式细胞术的结果为，包含从滤液回收的细胞的细胞群是CD90阳性。这表明，从滤液回收的细胞是间充质系干细胞。

[0223] (工序1-3：预培养1)

[0224] 将从羊膜的酶处理物得到的细胞群的一部分接种于塑料制培养容器，使用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。将通过该工序获得的细胞称为预培养1细胞。

[0225] (工序1-4：预培养2)

[0226] (方法)

[0227] 将预培养1细胞用乙二胺四乙酸(EDTA)处理后，再用胰蛋白酶处理，使其从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团。将细胞接种于塑料制培养容器，使得接种密度为2.8×103个/cm2，在含有10％FBS的αMEM中培养8天。将通过该预培养获得的细胞称为预培养2细胞。将预培养2细胞用于随后的试验。

[0228] (结果)

[0229] 在培养8天后，得到了预培养2细胞4.6×103个/cm2。在该情况下，预培养2细胞的比增殖速度为0.06(1/天)。

[0230] (工序1-5：利用冷冻-解冻进行的羊膜MSC的刺激处理)

[0231] (方法)

[0232] 将预培养2细胞用EDTA处理后，再用胰蛋白酶进行处理，使其从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有0.5％(w/v)人血清白蛋白(HSA)(Benesis公司制造、献血白蛋白25％静注12.5g/50mL)的RPMI1640培养基悬浮得到的细胞团，使其为2.0×107个/mL以下。制备了包含12％(w/v)羟乙基淀粉(HES)(Nipro公司制造、型号HES40)、10％(w/v)二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich公司制造、型号D2650)及8％(w/v)人血清白蛋白(HSA)(Benesis公司制造、献血白蛋白25％静注12.5g/50mL)的冷冻用保存液。在冰上将细胞悬浮液与冷冻用保存液等量混合，将1mL转移至冻存管。使用程序冷冻将冻存管以-2℃/分以上且-1℃/分以下的速度冷却至-40℃，接着以-10℃/分的速度冷却至-90℃，然后在-150℃的超低温冰箱内冷冻保存2天。将冷冻保存的冻存管浸入37℃恒温槽，快速融化。采集融化的细胞悬浮液的一部分，用锥虫蓝进行染色，使用血球计数板测定细胞数、生存率及大小。

[0233] (结果)

[0234] 如图1及表1所示，刚刚冷冻-解冻处理后的漂浮状态的羊膜MSC包含直径19.9±3.1μm(即，平均直径19.9μm)的细胞群和直径12.0±1.9μm(即，平均直径12.0μm)的细胞群这样的2种细胞(即，尺寸相对大的细胞和尺寸相对小的细胞)。刚刚冷冻-解冻处理后的细胞生存率为55％，(活细胞中的)尺寸相对小的细胞的含有率、即尺寸相对小的细胞的数量/尺寸相对大的细胞的数量的比率为2％(即，尺寸相对小的细胞的数量/尺寸相对大的细胞的数量＝2/98)。

[0235] 需要说明的是，供于冷冻-解冻处理的细胞(预培养2细胞)的细胞生存率为91％，(活细胞中的)尺寸相对小的细胞的含有率为1％(即，尺寸相对小的细胞的数量/尺寸相对大的细胞的数量＝1/99)。

[0236] 根据上述的结果可知，通过冷冻-解冻处理，羊膜MSC的生存率降低，而且该生存率降低是由于尺寸相对大的细胞(直径大的细胞)的死亡所导致的。

[0237] 表1.羊膜MSC在漂浮状态下的直径

[0238] 漂浮状态下的直径(μm)
尺寸相对大的细胞 19.9±3.1
尺寸相对小的细胞 12.0±1.9

[0239] (工序1-6：正式培养)

[0240] (方法)

[0241] 如下所述对冷冻-解冻处理后的羊膜MSC进行了培养。对融化的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞细胞悬浮液的一部分接种于塑料制培养容器，用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。将通过该培养获得的细胞称为正式培养1细胞。

[0242] 将贴壁的正式培养1细胞用EDTA处理后，再用胰蛋白酶进行处理，使其从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的一部分接种于6300cm2(总培养表面积)的塑料制培养容器，用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。将该通过传代及培养获得的细胞称为传代1细胞。通过EDTA-胰蛋白酶处理及离心分离回收了传代1细胞。

[0243] 采集正式培养1细胞及传代1细胞的一部分，用锥虫蓝染色，使用血球计数板测定了细胞数及生存率。使用Cellular Senescence Detection Kit(SA-β-Gal Staining)(Cell Biolabs公司)进行了正式培养1细胞及传代1细胞的细胞衰老测定。另外，采集正式培养1细胞及传代1细胞的一部分，用标记抗体在4℃下染色15分钟后，添加用于除去死细胞的碘化丙啶(Propidium Iodide)或7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)，使用流式细胞仪(FACSCanto：BD公司)分析了表面抗原。作为上述的标记抗体，使用了抗CD90-FITC抗体(BD公司)、抗CD105-FITC抗体(Ancell公司)、抗CD73-PE抗体(BD公司)、抗CD106-PE抗体(Miltenyi Biotec公司)、抗CD324-PE抗体(BD公司)、抗CD326-FITC抗体(BD公司)、抗CD45-FITC抗体(BD公司)、抗CD34-PE抗体(BD公司)及抗HLA-DR-FITC抗体(BD公司)。细胞群中CD106阳性的间充质系干细胞的比率按照以下步骤(1)～(3)进行计算。

[0244] (1)用纵轴为细胞数、横轴为被抗体标记的色素的荧光强度的直方图表示测定结果。

[0245] (2)确定用同型对照用抗体测定的全部细胞中荧光强度更强的细胞群为0.1～1.0％时的荧光强度。

[0246] (3)计算出用对CD106的抗体测定的全部细胞中比上述(2)确定的荧光强度更强的细胞的比例。

[0247] (结果)

[0248] 冷冻-解冻处理后的细胞(正式培养1细胞及传代1细胞)达到融合率为90％以上且95％以下的天数分别为10天、11天。在该情况下，正式培养1细胞的比增殖速度为0.20(1/天)，传代1细胞的比增殖速度为0.19(1/天)(表2)。由此可知，冷冻-解冻处理后的羊膜MSC的比增殖速度非常快。以上的结果表明，尺寸相对小的羊膜MSC是比增殖速度快的羊膜MSC(即，增殖能力相对高的羊膜MSC)。另外，得到的传代1细胞的细胞数为2.0×108个。由此可知，每1批次培养可以获得2.9×103(个/cm2/天)细胞(传代1细胞)。以上的结果表明，可以大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的羊膜MSC。

[0249] 表2.羊膜MSC的比增殖速度

[0250] 预培养2细胞正式培养1细胞传代1细胞
比增殖速度(1/天) 0.06 0.20 0.19

[0251] 图2、图3及图4示出了附着的羊膜MSC的相差显微镜像。无论是否进行冷冻-解冻处理，羊膜MSC在附着状态下的形态均为成纤维细胞样的纺锤形或小多边形。

[0252] 未进行冷冻-解冻处理的羊膜MSC(预培养2细胞)在融合的状态下，基本上全部细胞是长轴长度为78.4±25.3μm(即，长轴的平均长度为78.4μm)、短轴长度为22.8±6.0μm(即，短轴的平均长度为22.8μm)的细胞(长轴、短轴长的细胞，即尺寸相对大的细胞)(表3)。需要说明的是，如上所述，该预培养2-细胞中尺寸相对小的细胞的含有率为1％。

[0253] 另一方面，在冷冻-解冻处理后培养至融合的细胞(正式培养1细胞)不仅包括上述的尺寸相对大的细胞，还包括长轴长度为30.1±13.6μm(即，长轴的平均长度为30.1μm)、短轴长度为8.7±2.5μm(即，短轴的平均长度为8.7μm)的细胞(长轴、短轴短的细胞、即尺寸相对小的细胞)(表3)。需要说明的是，正式培养1细胞中尺寸相对小的细胞的含有率为90％(即，尺寸相对小的细胞的数量/尺寸相对大的细胞的数量＝90/10)，传代1细胞中尺寸相对小的细胞的含有率为98％(即，尺寸相对小的细胞的数量/尺寸相对大的细胞的数量＝98/2)。

[0254] 根据以上的结果可知，通过冷冻-解冻处理，尺寸相对大的细胞的增殖性(比增殖速度)明显降低，因此，在培养中，尺寸相对大的细胞不增殖，而主要是尺寸相对小的细胞增殖。

[0255] 表3.羊膜MSC在附着状态下的长轴、短轴的长度

[0256] 长轴的长度(μm) 短轴的长度(μm)
尺寸相对大的细胞 78.4±25.3 22.8±6.0
尺寸相对小的细胞 30.1±13.6 8.7±2.5

[0257] 对能够传代的次数进行了研究，将传代1细胞进一步持续进行传代及培养，结果可以获得传代17细胞(进行了17次传代的细胞)。由此可知，冷冻-解冻处理后得到的细胞至少能够传代17次。

[0258] 以衰老标记物Senescence associatedβ-galactosidase(SA-β-Gal)作为指标，进行了羊膜MSC的细胞衰老测定(细胞染色)。其结果是，尺寸相对大的羊膜MSC(即，比增殖速度慢的羊膜MSC，即，增殖能力相对低的羊膜MSC)为SA-β-Gal阳性的衰老细胞(图5)，与此相对，尺寸相对小的羊膜MSC(即，比增殖速度快的羊膜MSC、即，增殖能力相对高的羊膜MSC)为SA-β-Gal阴性的非衰老细胞。

[0259] 流式细胞术的结果是，正式培养1细胞和传代1细胞的CD90、CD105及CD73均为阳性，CD106、CD324、CD326、CD45、CD34及HLA-DR均为阴性。包含正式培养1细胞的细胞群中CD106阳性的细胞的比率为1.4％。另一方面，包含传代1细胞的细胞群中CD106阳性的细胞的比率为0.0％。由此表明，正式培养1细胞和传代1细胞是基本上不含有上皮细胞、血球系细胞及血管内皮细胞的羊膜间充质系干细胞。需要说明的是，得到的羊膜间充质系干细胞是适于细胞制剂化的活细胞。

[0260] (实施例2)

[0261] 通过以下一系列工序2-1～工序2-8获得了比增殖速度快的羊膜MSC(增殖能力相对高的羊膜MSC)。

[0262] (工序2-1：羊膜的采集)

[0263] 从获得知情同意的择期剖腹产病例的孕妇无菌采集作为胎儿附属物的胎膜及胎盘。将得到的胎膜及胎盘置于装有生理盐水的无菌桶中，用手从胎膜的断端剥离羊膜。用Hank’s平衡盐溶液(不含有Ca、Mg)清洗羊膜2次，除去附着的血液及血块。

[0264] (工序2-2：羊膜的酶处理及羊膜MSC的回收)

[0265] 对每1g羊膜添加含有300CDU/mL纯化胶原酶及200PU/mL中性蛋白酶I的Hank’s平衡盐溶液(含有Ca、Mg)5mL，在37℃、90分钟、60rpm的条件下进行振荡搅拌。用2倍量的含有10％FBS的αMEM悬浮羊膜的酶处理物。使用尼龙筛网过滤器(孔径：100μm)过滤得到的细胞悬浮液，对含有羊膜MSC的滤液进行回收。以400xg对得到的滤液进行5分钟离心，除去上清。
用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团，获得了细胞悬浮液。

[0266] (工序2-3：预培养1)

[0267] 将从羊膜的酶处理物得到的细胞群接种于1890cm2(总培养表面积)的塑料制培养容器，使用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。

[0268] (工序2-4：预培养2)

[0269] 对工序2-3中得到的附着状态的细胞处理EDTA-胰蛋白酶，使细胞从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的全部量接种于6300cm2(总培养表面积)的塑料制培养容器，使用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。

[0270] (工序2-5：预培养3)

[0271] 对工序2-4中得到的附着状态的细胞处理EDTA-胰蛋白酶，使细胞从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的全部量接种于2.5m2(总培养表面积)的塑料制培养容器，使用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。

[0272] (工序2-6：利用冷冻-解冻进行的羊膜MSC的刺激处理)

[0273] 对工序2-5中得到的附着状态的细胞处理EDTA-胰蛋白酶，使细胞从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。用含有0.5％(w/v)人血清白蛋白7
(HSA)的RPMI1640培养基悬浮得到的细胞团，使其为2.0×10 个/mL以下。制备了包含12％(w/v)HES、10％(w/v)DMSO及8％(w/v)HAS的冷冻用保存液。在冰上将细胞悬浮液与冷冻用保存液等量混合，分别装入4个的冷冻用袋。使用程序冷冻，将冷冻用袋以-2℃/分以上且-1℃/分以下的速度冷却至-40℃，接着以-10℃/分的速度冷却至-90℃，然后在-150℃的超低温冰箱内冷冻保存14天。将冷冻保存后的4个冷冻用袋中的1个浸入37℃恒温槽，快速融化。

[0274] (工序2-7：正式培养1)

[0275] (方法)

[0276] 对工序2-6中得到的融化的细胞悬浮液(1个冷冻用袋量)进行离心分离，除去上清。用含有10％FBS的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的全部量接种于2.5m2(总培养表面积)的塑料制培养容器，使用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。通过EDTA-胰蛋白酶处理及离心分离，对细胞(包含比增殖速度快的羊膜MSC的细胞群、即包含增殖能力相对高的羊膜MSC的细胞群)进行了回收。

[0277] (结果)

[0278] 工序2-7中得到的细胞的数量为7.6×108个。另外，在本工序中，从将细胞接种至融合率达到90％以上且95％以下的培养天数为10天。根据这些结果可知，每1批次培养可得到3.0×103(个/cm2/天)细胞。需要说明的是，得到的细胞的比增殖速度为0.14(1/天)。另外，得到的羊膜MSC是适于细胞制剂化的活细胞。以上的结果表明，可以大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的羊膜MSC。

[0279] (工序2-8：正式培养2)

[0280] (方法)

[0281] 将工序2-7中得到的细胞的全部量接种于10.1m2(总培养表面积)的塑料制培养容器，使用含有10％FBS的αMEM培养至融合率为90％以上且95％以下。通过EDTA-胰蛋白酶处理及离心分离，对细胞(包含比增殖速度快的羊膜MSC的细胞群、即包含增殖能力相对高的羊膜MSC的细胞群)进行了回收。

[0282] (结果)

[0283] 工序2-8中得到的细胞的数量为3.0×109个。另外，在本工序中，从接种细胞至融合率达到90％以上且95％以下的培养天数为9天。根据这些结果可知，每1批次培养可得到3.3×103(个/cm2/天)细胞。需要说明的是，得到的细胞的比增殖速度为0.15(1/天)。另外，得到的羊膜MSC是适于细胞制剂化的活细胞。以上的结果表明，可以大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的羊膜MSC。

[0284] (实施例3)

[0285] 通过以下一系列工序3-1～工序3-9获得了比增殖速度快的羊膜MSC(增殖能力相对高的羊膜MSC)。

[0286] (工序3-1：羊膜的采集)

[0287] 从获得知情同意的择期剖腹产病例的孕妇无菌采集作为胎儿附属物的胎膜及胎盘。将得到的胎膜及胎盘置于装有生理盐水的无菌桶中，用手从胎膜的断端剥离羊膜。用Hank’s平衡盐溶液(不含有Ca、Mg)清洗羊膜2次，除去附着的血液及血块。

[0288] (工序3-2：羊膜的酶处理及羊膜MSC的回收)

[0289] (方法)

[0290] 对每1g羊膜添加含有300CDU/mL纯化胶原酶及200PU/mL中性蛋白酶I的Hank’s平衡盐溶液(含有Ca、Mg)5mL，在37℃、90分钟、60rpm的条件下进行振荡搅拌。用2倍量的含有10％FBS的αMEM悬浮羊膜的酶处理物。使用尼龙筛网过滤器(孔径：100μm)过滤得到的细胞悬浮液，对含有羊膜MSC的滤液进行回收。用苏木素-伊红(HE)染色对残留在尼龙筛网过滤器上的未消化的羊膜进行了评价。以400xg对得到的滤液进行5分钟离心，除去上清。使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific公司制造)的αMEM悬浮得到的细胞团，获得了细胞悬浮液。将Turk’s染色液与一部分得到的细胞悬浮液混合，测定了细胞数。在用标记抗体于4℃下将从滤液回收的羊膜MSC染色15分钟后，添加用于除去死细胞的碘化丙啶(Propidium Iodide)或7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)，使用流式细胞仪(FACSCanto：Becton,Dickinson and Company、日本BD公司(以下简称为BD公司))分析了表面抗原。标记抗体使用了抗CD90-FITC抗体(BD公司)。

[0291] (结果)

[0292] 根据苏木素-伊红(HE)染色的结果可知，残留在过滤器上的羊膜的上皮细胞层保留下来而未被消化，上皮细胞层内存在大量的上皮细胞。另外，残留在过滤器上的羊膜的细胞外基质层已被消化，在过滤器上未确认到羊膜MSC。这表明，通过采用以羊膜的细胞外基质层为标靶、且不以羊膜的上皮细胞层为标靶的胶原酶及中性蛋白酶，可以回收基本上不含有上皮细胞的滤液。

[0293] 利用Turk’s染色进行的细胞数测定的结果确认了从羊膜组织获得的细胞数为每6
1g组织重量1.5×10个。

[0294] 流式细胞术的结果为，包含从滤液回收的细胞的细胞群是CD90阳性。这表明，从滤液回收的细胞是间充质系干细胞。

[0295] (工序3-3：预培养1)

[0296] 将从羊膜的酶处理物得到的细胞群的一部分接种于150cm2的塑料制培养容器，使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM培养了3天。

[0297] (工序3-4：预培养2)

[0298] 对工序3-3中得到的附着状态的细胞处理TrypLE Select(1×)(Thermo Fisher Scientific公司制造)，使细胞从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的一部分接种于150cm2的塑料制培养容器，使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM培养了7天。

[0299] (工序3-5：预培养3)

[0300] (方法)

[0301] 对工序3-4中得到的附着状态的细胞处理TrypLE Select(1×)(Thermo Fisher Scientific公司制造)，使细胞从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的一部分接种于150cm2的塑料制培养容器，使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM培养了8天。将通过该预培养获得的细胞称为预培养3细胞。将预培养3细胞用于随后的试验。

[0302] (结果)

[0303] 在培养8天后，得到了预培养3细胞6.7×103个/cm2。在该情况下，预培养3细胞的比增殖速度为0.11(1/天)。

[0304] (工序3-6：利用冷冻-解冻进行的羊膜MSC的刺激处理)

[0305] (方法)

[0306] 对工序3-5中得到的附着状态的细胞(预培养3细胞)处理TrypLE Select(1×)，使细胞从塑料制培养容器上剥离。对得到的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。使用含有0.5％(w/v)人血清白蛋白(HSA)的RPMI1640培养基悬浮得到的细胞团，使其为2.0×106个/mL。制备了包含12％(w/v)HES、10％(w/v)DMSO及8％(w/v)HAS的冷冻用保存液。在冰上将细胞悬浮液与冷冻用保存液等量混合，分装于冻存管。使用程序冷冻，将冻存管以-2℃/分以上且-1℃/分以下的速度冷却至-40℃，接着以-10℃/分的速度冷却至-90℃，然后在-150℃的超低温冰箱内冷冻保存30天。将冷冻保存的冻存管浸入37℃恒温槽，快速融化。采集融化后的细胞悬浮液的一部分，用锥虫蓝染色，使用血球计数板测定了细胞数、生存率及大小。

[0307] (结果)

[0308] 刚刚冷冻-解冻处理后的漂浮状态的羊膜MSC的直径为22.2±5.0μm(即，平均直径22.2μm)。

[0309] (工序3-7：正式培养1)

[0310] (方法)

[0311] 对工序3-6中得到的融化的细胞悬浮液进行离心分离，除去上清。使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM悬浮得到的细胞团。将得到的细胞悬浮液的一部分接种于150cm2的塑料制培养容器，使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM培养了7天。通过TrypLE Select(1×)处理及离心分离，对细胞(包含比增殖速度快的羊膜MSC的细胞群、即包含增殖能力相对高的羊膜MSC的细胞群)进行了回收。将通过该工序获得的细胞称为正式培养1细胞。

[0312] (结果)

[0313] 工序3-7中得到的正式培养1细胞的数量为2.2×106个。根据该结果可知，每1批次培养可得到2.1×103(个/cm2/天)细胞。需要说明的是，得到的细胞的比增殖速度为0.21(1/天)。另外，得到的羊膜MSC是适于细胞制剂化的活细胞。以上的结果表明，可以大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的羊膜MSC。

[0314] (工序3-8：正式培养2)

[0315] (方法)

[0316] 将工序3-7中得到的正式培养1细胞的一部分接种于150cm2的塑料制培养容器，使得接种密度为6.0×103个/cm2，使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM培养了5天。通过TrypLE Select(1×)处理及离心分离，对细胞(包含比增殖速度快的羊膜MSC的细胞群、即包含增殖能力相对高的羊膜MSC的细胞群)进行了回收。将通过该工序获得的细胞称为传代1细胞。

[0317] (结果)

[0318] 工序3-8中得到的传代1细胞的数量为4.6×106个。根据该结果可知，每1批次培养可得到4.4×103(个/cm2/天)细胞。需要说明的是，得到的细胞的比增殖速度为0.32(1/天)。另外，得到的羊膜MSC是适于细胞制剂化的活细胞。以上的结果表明，可以大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的羊膜MSC。

[0319] (工序3-9：正式培养3)

[0320] (方法)

[0321] 将工序3-8中得到的传代1细胞的一部分接着于150cm2的塑料制培养容器，使得接3 2
种密度为2.5×10个/cm ，使用含有10％FBS及1×Antibiotic-Antimycotic的αMEM培养了6天。通过TrypLE Select(1×)处理及离心分离，对细胞(包含比增殖速度快的羊膜MSC的细胞群、即包含增殖能力相对高的羊膜MSC的细胞群)进行了回收。将通过该工序获得的细胞称为传代2细胞。

[0322] 使用Cellular Senescence Detection Kit(SA-β-Gal Staining)(Cell Biolabs公司)进行了预培养3细胞及传代2细胞的细胞衰老测定(细胞染色)。另外，采集正式培养1细胞、传代1细胞及传代2细胞的一部分，用标记抗体在4℃下染色15分钟，然后添加用于除去死细胞的碘化丙啶(Propidium Iodide)或7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)，使用流式细胞仪(FACSCanto：BD公司)分析了表面抗原。作为上述标记抗体，使用了抗CD90-FITC抗体(BD公司)、抗CD105-FITC抗体(Ancell公司)、抗CD73-PE抗体(BD公司)、抗CD106-PE抗体(Miltenyi Biotec公司)、抗CD324-PE抗体(BD公司)、抗CD326-FITC抗体(BD公司)、抗CD45-FITC抗体(BD公司)、抗CD34-PE抗体(BD公司)及抗HLA-DR-FITC抗体(BD公司)。对于细胞群中特定的表达标记物(CD106、CD90)为阳性的间充质系干细胞的比率按照以下步骤(1)～(3)进行计算。

[0323] (1)用纵轴为细胞数、横轴为被抗体标记的色素的荧光强度的直方图表示测定结果。

[0324] (2)确定用同型对照用抗体测定的全部细胞中荧光强度更强的细胞群为0.1～1.0％时的荧光强度。

[0325] (3)计算出用对特定的表达标记物(CD106、CD90)的抗体测定的全部细胞中比上述(2)确定的荧光强度更强的细胞的比例。

[0326] (结果)

[0327] 工序3-9中得到的传代2细胞的数量为3.9×106个。根据该结果可知，每1批次培养可得到3.7×103(个/cm2/天)细胞。需要说明的是，得到的细胞的比增殖速度为0.39(1/天)。另外，得到的羊膜MSC是适于细胞制剂化的活细胞。以上的结果表明，可以大量且迅速地制备/制造细胞制剂化所需要的羊膜MSC。

[0328] 为了对能够传代的次数进行研究，将工序3-9中得到的传代2细胞进一步持续进行传代及培养，结果可以得到传代10细胞(进行了10次传代的细胞)。由此可知，冷冻-解冻处理后得到的细胞至少可以传代10次。

[0329] 以衰老标记物Senescence associatedβ-galactosidase(SA-β-Gal)作为指标，进行了羊膜MSC的细胞衰老测定(细胞染色)。其结果是，预培养3细胞为SA-β-Gal阳性，与此相对，传代2细胞为SA-β-Gal阴性。包含预培养3细胞的细胞群中SA-β-Gal阴性的间充质系干细胞的比率为2.9±2.3％(平均比率：2.9％)。另一方面，包含传代2细胞的细胞群中SA-β-Gal阴性的间充质系干细胞的比率为94.3±3.9％(平均比率：94.3％)。

[0330] 流式细胞术的结果是，正式培养1细胞、传代1细胞及传代2细胞的CD90、CD105及CD73均为阳性，CD106、CD324、CD326、CD45、CD34及HLA-DR均为阴性。在包含正式培养1细胞、传代1细胞或传代2细胞的细胞群中，CD106阳性的间充质系干细胞的比率均为0.0％。在包含正式培养1细胞、传代1细胞或传代2细胞的细胞群中，CD90阳性的间充质系干细胞的比率分别为95％、99％、97％。这表明，正式培养1细胞、传代1细胞及传代2细胞是基本上不含有上皮细胞、血球系细胞及血管内皮细胞的羊膜MSC。需要说明的是，得到的羊膜MSC是适于细胞制剂化的活细胞。

[0331] (实施例4)

[0332] 通过以下的工序4-1～工序4-3对比增殖速度不同的羊膜MSC的基因表达进行了比较分析。

[0333] (工序4-1：总RNA的提取)

[0334] (方法)

[0335] 使用细胞刮棒(Corning公司制造)将实施例3的工序3-5中得到的附着状态的预培养3细胞(比增殖速度：0.11(1/天))和实施例3的工序3-9中得到的附着状态的传代2细胞(比增殖速度：0.39(1/天))从塑料制培养容器上剥离，通过离心分离进行回收。向得到的细胞团添加RNAlater(Thermo Fisher Scientific公司制造)，将RNA稳定保存，然后使用Rneasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN公司制造)提取总RNA，进行纯化。

[0336] (结果)

[0337] 利用LabChip试剂盒及Agilent 2100生物分析仪进行电泳图谱分析，结果是任一RNA样品均检测出了清晰的2个核糖体RNA(18SrRNA、28SrRNA)的峰。另外，使用分光光度计NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司制造)进行了定量，结果是任一RNA样品的A260/A280比均为1.8～2.1之间的值。由此可以确认，两个RNA样品具有作为阵列分析用样品的合适的纯度。

[0338] (工序4-2：微阵列数据的获得)

[0339] (方法)

[0340] 通过逆转录反应从100ng的总RNA合成cDNA，通过体外转录(in vitro transcription)从cDNA转录为cRNA，进行了生物素标记(使用3’IVT PLUS Reagent Kit)。
将10.0μg标记cRNA加入杂交缓冲液，在Human GeneGenome U133A 2.0Array(Affymetrix公司制造)上进行了16小时的杂交。使用GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix公司制造)清洗，进行藻红蛋白染色，然后用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix公司制造)进行扫描，用AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix公司制造)进行图像分析，并使用Affymetrix Expression Console(Affymetrix公司制造)进行了数值化。

[0341] (结果)

[0342] 在用Affymetrix Expression Console分析的数据中，各样品中的管家基因GAPDH的信号(3’/5’)比分别为0.98、1.04(理想值3以下)，因此确认了得到的cRNA在品质方面不存在问题。

[0343] (工序4-3：微阵列数据的分析)

[0344] (方法)

[0345] 使用分析软件GeneSpring GX(Agilent Technologies公司制造)对2个阵列的数值数据文件进行了比较分析。用传代2细胞的样品的Normalized(归一化)值除以作为对照的预培养3细胞的样品的Normalized值，筛选商为2以上的探针，由此检索出表达波动了2倍以上的基因(显示出2倍以上Fold Change(倍数变化)值的基因)。

[0346] (结果)

[0347] 将对传代2细胞与预培养3细胞的金属硫蛋白的同种型的基因表达进行比较的结果示于表4。

[0348] 表4.传代2细胞与预培养3细胞的金属硫蛋白家族基因的表达的比较

[0349]

[0350] 根据表4可知，与预培养3细胞相比，传代2细胞对于金属硫蛋白-1E(MT1E)、金属硫蛋白-1F(MT1F)、金属硫蛋白-1G(MT1G)、金属硫蛋白-1H(MT1H)、金属硫蛋白-1X(MT1X)及金属硫蛋白-2A(MT2A)显示出2倍以上的Fold Change值。由此可知，传代2细胞高度表达了这些金属硫蛋白家族基因。

[0351] (实施例5)

[0352] 制备含有比增殖速度快的羊膜MSC的组合物，将该组合物冷冻保存及解冻后，测定了组合物中的细胞的生存率。

[0353] (方法)

[0354] 制备了由实施例3的工序3-9中得到的羊膜MSC(传代2细胞)8.0×106个、葡聚糖20mg、DMSO 52mg、以及含有人血清白蛋白40mg的RPMI1640培养基1mL构成的组合物。将组合物封入冻存管，在-150℃下以冷冻状态保存7天。将冷冻保存后的组合物在37℃的恒温槽中快速解冻，然后在25℃(室温)或37℃(体温)下静置1或2小时。采集得到的组合物的一部分，用锥虫蓝染色后，使用血球计数板测定了细胞的生存率。

[0355] (结果)

[0356] 刚刚解冻后的组合物中含有的细胞的生存率为96.3±1.2％。在25℃下静置了1或2小时的组合物中含有的细胞的生存率分别为94.7±1.5％、93.0±1.0％。在37℃下静置了
1或2小时的组合物中含有的细胞的生存率分别为92.7±3.1％、90.3±2.9％。由此可以确认，在25℃及37℃下均能够将90％以上的高细胞生存率保持到至少2小时后。

[0357] (实施例6)

[0358] (细胞制剂化和给药)

[0359] 将实施例2的工序2-8或实施例3的工序3-9中得到的羊膜MSC(比增殖速度快的羊膜MSC、即增殖能力相对高的羊膜MSC)的一部分供于医药组合物的制备。制备了由增殖能力相对高的羊膜MSC 2.3×108个、HES或葡聚糖0.50g、DMSO 1.3g、以及含有人血清白蛋白1.0g的RPMI1640培养基25mL构成的医药组合物(细胞制剂)。将该医药组合物封入冷冻用袋，在冷冻状态下保存。

[0360] 在使用医药组合物时，首先将冷冻保存的医药组合物在37℃下快速解冻，然后用生理盐水稀释解冻后的医药组合物。接着，可以平稳地搅拌稀释后的组合物中的细胞，使其均匀分散，并通过静脉内注射、静脉滴注或对局部的直接注射对患者给药医药组合物。

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