血小板生成素在辐射造成肠组织损伤中的应用
阅读：957发布：2020-06-05
专利汇可以提供血小板生成素在辐射造成肠组织损伤中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于医药领域，具体涉及血小板生成素在 辐射 造成肠组织损伤中的应用。，下面是血小板生成素在辐射造成肠组织损伤中的应用专利的具体信息内容。
血小板生成素在辐射造成肠组织损伤中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及血小板生成素(thrombopoietin，TPO)在辐射造成肠组织损伤中的应用。
背景技术
[0002] TPO是刺激巨核细胞生长及分化的内源性细胞因子，对巨核细胞生成的各阶段均有刺激作用，包括前体细胞的增殖和多倍体巨核细胞的发育及成熟，从而升高血小板数目。近年的研究表明，TPO对辐射损伤的造血干细胞的恢复有显著的促进作用。但在放疗过程中由于辐射造成的肠道损伤一直未能找到有效的解决办法，TPO可促进辐射损伤后的肠组织的修复，有可能解决急性放射病中肠道损伤严重的问题。
[0003] 肿瘤放射治疗是利用放射线治疗恶性肿瘤的一种方法。目前放射治疗仍是恶性肿瘤重要的局部治疗方法，大约70％的癌症病人在治疗癌症的过程中需要用放射治疗，约有40％的癌症可以用放疗根治。放射治疗已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一，尤其被越来越多的腹腔、盆腔及腹膜后恶性肿瘤病人所接受，因此伴随着这些病人的长期生存情况的改善，急、慢性放射性肠炎甚至肠癌变成了一个不断增长的医学问题。接受小骨盆放射治疗的患者中约50％发生了放射性肠炎，同时大约20％-25％的患者将进展为慢性小肠炎和结肠炎，一部分直接或间接导致肠道肿瘤的产生。目前临床上仍然缺少基于循证医学支持的对放射性肠炎确切有效的治疗方法。因此能找到显著改善辐射造成的肠组织损伤的药物将在临床上将具有深远意义。
[0004] 关于辐射造成肠组织损伤的机制现在还没有合理的解释和有效的治疗办法。放射线可通过直接或间接作用导致细胞损伤。直接损伤主要是由于细胞直接吸收了高量的辐射能，而间接损伤常常是由于放射线与组织细胞内的水分子相互作用产生自由基并经由自由基作用引起DNA损伤和复制障碍。另外小肠上皮是机体更新速度最快的器官之一，也是放射敏感性最高的器官之一，极易发生发射性损伤。小鼠的肠上皮细胞每3-5天就完全更新一次。肠上皮的自身稳定更新就依赖于对肠干/祖细胞增殖和分化的调节，将这类肠上皮干细胞的存在部位称为“干细胞小境”(stem cell niche)。有文献报道这类干/祖细胞位于肠隐窝基底部。很早就有人提出“放射诱导的小肠损伤的机制中是否具有原发灶”的问题。有研究认为放射线首先损伤了肠隐窝干细胞，诱导其凋亡增加，肠上皮细胞更新障碍，因此使得肠上皮完整性遭到破坏，肠上皮的分泌、吸收及屏障功能均受到破坏。研究证实在体内转化生长因子TGF-β3预处理能够保护肠干细胞受到的放射性损伤。转化生长因子TGF-β3很可能是通过使肠隐窝干细胞产生可逆性的G1期阻滞以改变其放射敏感性，增加肠隐窝存活，并且使接受放射处理的大鼠存活时间延长。
[0005] 大量的动物实验和临床实验结果已经证明TPO对造血干细胞的修复和扩增存在显著作用。早期动物实验通过应用敲除(knockout)技术证实，在转基因(TPO-/-)小鼠经致死剂量辐射后，其血小板的恢复速度远低于正常小鼠，肝星状细胞(HSC)也出现了渐进式的数量减少。
[0006] 直至今日，辐射引起的肠组织病变的临床治疗仍然是非常困难，治疗策略的选择依然富有争议，缺乏良好的多中心的、随机对照的循证医学证据指导临床治疗。减少照射剂量和照射野仍然是预防急慢性放射性肠炎的主要方法。褪黑激素(melatonin)和奥曲肽对辐射造成的小鼠肠损伤有一定的保护效果；除此之外高压氧治疗也是潜在的治疗慢性放射性肠炎的方法之一，但是其花费较高，并且需要到具有相当经验的专业治疗机构。相比较来说，作为辐射后提升病人血小板、促进病人造血干细胞修复的特效治疗药物，TPO无疑具有更广阔的市场。
[0007] TPO作为治疗实体瘤化疗后所致的血小板减少症药物，在临床上已应用十年，其间先后开发了7500U和15000U剂量。由于TPO本身的结构与天然的TPO分子几乎完全相同，因此无论是在前期的动物实验还是临床治疗过程中均未出现因使用TPO过量致死案例，具有起效快、安全性高等优势，值得进一步推广。
发明内容
[0008] 为了解决上述现有技术问题，本发明提供了一种TPO治疗新的适应症的方法。具体而言，本发明涉及血小板生成素在制备用于治疗辐射造成肠组织损伤的药物中的应用。
[0009] 根据本发明，TPO为天然TPO及其变体或衍生物，例如，人TPO，中国专利申请No.95190305.5、公开号CN1131438A中所公开的那些TPO变体，包括TPO1-332，TPO1-163，TPO1-232，TPO1-151，N端缺失1-6个氨基酸的TPO，以及聚乙二醇化的TPO衍生物等。在此以其全文并入本申请，作为申请文件的一部分内容。
[0010] 根据本发明，肠组织损伤包括急慢性放射性肠炎、肠道肿瘤等。
[0011] 根据本发明，TPO可与其他药物一起联用，用于治疗辐射造成的肠道损伤。这些药物包括褪黑激素和奥曲肽等。
[0012] 根据本发明，TPO的治疗还可与其他疗法组合，用于治疗辐射造成的肠道损伤，例如，高压氧治疗等。
[0014] 为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于这些附图。
[0015] 图1显示TPO提高辐射损伤小鼠的存活率；
[0016] 图2显示致死剂量辐射损伤后，TPO给药不同时间对肠组织的修复；
[0017] 图3显示辐射后14天体重变化；
[0018] 图4显示辐射损伤后TPO给药不同时间肠组织病理切片图及诊断；
[0019] 图5显示辐射损伤后TPO给药不同时间小肠绒毛的长度和绒毛上皮细胞数比较；以及
[0020] 图6显示活体示踪展示辐射损伤后，移植造血干细胞同时注射TPO对肠组织的修复。
具体实施方式
[0021] 为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。
[0022] 实施例一
[0023] TPO提高辐射损伤小鼠存活率实验
[0024] 实验用动物为C57BL/6小鼠，周龄6-8周、体重18-20g，辐射源为Co60，辐射剂量8Gy。所有小鼠按给药剂量不同分为5组，每组10只，辐射后2h内给予不同剂量的TPO药物治疗并连续给药14天，对照组给安慰剂，给药方式腹部皮下注射。辐射后按实验方案给药，同时记录小鼠状态变化和每日死亡情况。存活率结果参见图1。
[0025] 实施例二
[0026] 致死剂量辐射损伤后，TPO给药不同时间对肠组织的修复
[0027] A.辐射损伤后肠修复实验模式图(参见图2)
[0028] 根据存活率实验确定辐射后最佳的TPO给药剂量为50μg/kg，因此在接下来的实验中设定的TPO给药组均为该剂量组，选择C57BL/6小鼠，周龄一般在6-8周、体重18-20g，为了60
增加肠损伤程度，辐射剂量提高到10Gy，辐射源为Co 。将实验小鼠分为2组，TPO治疗组和空白对照组，每组10-15只，在辐射后2h内分别给予TPO药物治疗和安慰剂治疗，连续给药14天，给药方式为腹部皮下注射。
增加肠损伤程度，辐射剂量提高到10Gy，辐射源为Co 。将实验小鼠分为2组，TPO治疗组和空白对照组，每组10-15只，在辐射后2h内分别给予TPO药物治疗和安慰剂治疗，连续给药14天，给药方式为腹部皮下注射。
[0029] 在肠修复实验设计中，根据前期的血象分析结果，致死剂量辐射后第5-7天，白细胞数和血小板数降至最低，小鼠达到损伤最严重阶段；而在10-14天，TPO组基本恢复至正常范围内。除此之外，对照组在10天之内基本全部死亡。另外，在肠损伤实验中，为了增加损伤程度，通常将辐射剂量增加至10Gy或12Gy。综合上述考虑，本实验在考察肠损伤修复过程中选择10Gy辐射剂量，在辐射后5、7、10天分别随机取TPO组和对照组实验小鼠作解剖后肠组织修复分析，包括病理切片、小肠绒毛长度和绒毛上皮细胞数分析。
[0030] B.辐射后14天体重变化
[0031] 体重变化
[0032]
[0033] (1)自辐射之后3天起，小鼠开始出现消化问题，消瘦明显；
[0034] (2)在7天后小鼠开始出现部分死亡，最终在10天时TPO给药组死亡5只，对照组全部死亡，存活率提高50％，且存活的TPO组小鼠体重恢复正常。
[0035] 体重变化结果参见图3。
[0036] C.辐射损伤后TPO给药不同时间，肠组织病理切片和诊断，以及小肠绒毛的长度和绒毛上
[0037] 皮细胞数的比较
[0038] 辐射后按照实验方案分别进行TPO给药和安慰剂治疗，同时每日观察并记录小鼠状态变化、体重变化和死亡情况。在辐射后的第5、7、10天，每组分别取2-3只小鼠，将小鼠处死，解剖取空肠部分，将待制备切片的空肠浸泡于含4％多聚甲醛的平皿中固定，平皿放于4℃冰箱24h，制备切片时直接取出；制备切片完成后经HE染色观察各指标差别。病理切片直接观察病理损伤及修复程度，小肠绒毛长度和绒毛上皮细胞数对比，每个切片取80-100个小肠绒毛，比较不同组别之间小肠绒毛长度的差异和绒毛上皮细胞数的变化，确定TPO在促进辐射损伤的肠组织的修复中的作用(结果参见图5)。
[0039] 病理切片参见图4，诊断结果如下：
[0040] 7天时：对照组绒毛变短，排列疏松，纹状缘脱落，肠绒毛断裂+++；TPO组也有上述病变，但明显有所改善++，提示TPO对辐射损伤肠组织有修复作用。
[0041] D.活体示踪展示辐射损伤后移植造血干细胞同时注射TPO对肠组织的修复[0042] 开展辐射后干细胞移植实验，选择荧光素酶(Luciferase)转基因小鼠作为供者，正常的CD45.1小鼠作为受者，所有实验用小鼠周龄在6-8周，体重20-22g。实验当天将受者CD45.1小鼠以9.5Gy剂量辐射清髓(分为4.5Gy和5Gy剂量2次辐射，中间间隔至少1小时)，同时将正常的荧光素酶转基因小鼠处死，分离骨髓单个核细胞，按照1×106cells/ml的细胞数分成若干份，每份移植一只清髓的CD45.1小鼠，移植方式为尾静脉注射，体积在500-1000μl/只。移植结束后将小鼠分为2组，TPO给药治疗组和空白对照组，每组6-10只，2小时内分别给予TPO和安慰剂治疗，给药方式为腹部皮下给药，连续给药14天，在移植后1个月时将小鼠处死，将其解剖取空肠(Jejunum)组织作荧光检测，由于供者荧光素酶转基因小鼠本身有荧光吸收，因此通过比较不同组别之间空肠组织荧光吸收的强弱，确定TPO在促进辐射并干细胞移植后肠组织修复的作用。结果参见图6。
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