[0001] 本申请包含部份涉及提交于2011年10月11日的美国临时申请号61/546,028，提交于2010年4月13日的美国临时申请号61/323,708；提交于2011年4月12日的国际
申请号PCT/US2011/032184；提交于2011年4月12日的国际申请号PCT/US2011/032188；
以及提交于2008年10月10日并且被公开为国际公开号WO2009/058379A2的PCT申请号
PCT/US2008/012398的主题。将上面引用的每个申请通过引用以其全文结合在此。
序列表的引用

[0002] 本申请通过引用结合以文本文件经由EFS-Web与本申请一起提交的序列表，该序列表题为“CD40L-101WO1_SL.txt”，创建于2012年10月3日，并且具有的大小为232千字节。发明背景
发明领域

[0003] 总体上，本发明涉及抗体模拟物领域，确切地涉及衍生自人类生腱蛋白C的第三纤连蛋白III型结构域的支架，这些支架对于例如产生具有新颖的结合特征的产品是有用的。具体地，本发明涉及CD40L-特异性Tn3支架、制造此类支架的方法、以及用于诊断和治疗系统性红斑狼疮以及其他自身免疫和/或炎性失调的使用方法。

[0004] 本发明涉及与CD40L结合、对于例如治疗自身免疫和/或炎性失调有用的CD40L-特异性蛋白支架。

[0005] 能够与一种所希望的靶标表位特异性结合的生物分子作为治疗、研究、以及医学诊断工具是非常重要的。这类分子的一个熟知的实例是抗体。可以选择与几乎任何结构表位特异性结合并对其有亲和力的抗体。然而，经典的抗体是结构上复杂的异四聚体分子，这些分子在简单的真核系统中难于表达。因此，使用复杂的并且昂贵的哺乳动物细胞表达系统来产生大多数抗体。

[0006] 可以将具有相对确定的三维结构的蛋白质（通常被称为蛋白支架）用作试剂，用于设计工程化产品。此类支架有用的一个具体区域是抗体模拟物设计领域。抗体模拟物（即，小的非抗体蛋白治疗剂）利用抗体和抗体片段的优点（例如与靶标的高亲和力结合以及低的免疫原性和毒性），同时避免了一些不足：例如抗体片段凝集的趋势并且比全长IgG更不稳定。

[0007] 可以通过使用去除部分抗体的天然折叠而创建的抗体片段解决这些缺点。然而，当将被正常地埋于疏水环境（例如可变结构域与恒定结构域之间的界面）中的氨基酸残基暴露于溶剂时，这通常导致凝集。基于支架的抗体模拟物的一个实例是基于纤连蛋白III型结构域（FnIII）的结构，该结构域是一种广泛发现于跨门和蛋白质种类的结构域，例如发现于哺乳动物血液和结构蛋白中。衍生自人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域的FnIII支架的设计和用途描述于PCT申请PCT/US2011/032184和PCT/US2011/032188中，将两者通
过引用以其全文结合在此。

[0008] CD40L是主要表达于激活的T细胞（包括Th0、Th1、以及Th2亚型）上的TNF分子家族的一个成员，并且形成与这一家族的其他成员类似的同源三聚体。此外，还发现CD40L表达于肥大细胞、以及激活的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上。CD40L与抗原呈递细胞（APC）上的CD40受体（CD40R）结合，取决于靶细胞类型，这导致许多效果。通常，CD40L起到共刺激分子的作用并且诱导与由该APC上的MHC分子刺激的T细胞受体有关的APC的激活。

[0009] 由CD40L通过CD40受体的信号传导启动一个级联事件，这导致带有CD40受体的细胞的激活和最优的CD4+T细胞初敏。更确切地说，CD40L与CD40受体之间的同种相互作用促进B细胞分化为抗体分泌细胞和记忆B细胞（Burkly（布克利），在Adv.Exp.Med.Bio.（实验医学和生物学进展）中，第489卷，D.M.Monroe（门罗），U.Hedner（郝德纳），M.R.Hoffman（霍夫曼），C.Negrier（尼格里尔），G.F.Savidge（赛维德格），和G.C.I.White（怀特），编辑Klower学术/全会出版社，2001，第135页）。额外地，CD40L与CD40受体之间的相互作用促进通过巨噬细胞和树突细胞的激活的细胞介导免疫以及自然杀伤细胞和细胞毒T淋巴
细胞的产生（参见布克利，同上）。

[0010] 已经示出CD40L与CD40受体之间的相互作用在若干实验诱导的自身免疫性疾病中是重要的，例如胶原诱导性关节炎、实验性变应性脑脊髓炎、卵巢炎、结肠炎、药物诱导的狼疮性肾炎。确切地，已经示出以所有这些模型中的疾病诱导的都可以在给予抗原时用
CD40L拮抗剂阻断。还已经在患有自发性自身免疫性疾病（包括胰岛素依赖性糖尿病）的动物模型中、连同在移植物抗宿主疾病、移植、肺纤维化、以及动脉硬化疾病模型中看到使用抗-CD40L拮抗剂的疾病阻断。

[0011] 已经示出经由CD40L阻断的CD40L/CD40R通路的破坏在许多自身免疫介导的疾病（例如但不局限于系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、多发性硬化症（MS）、炎症性肠病（IBD）以及同种异体移植排斥）中是有益的。例如，用抗-CD40L抗体的处理预防或改善胶原诱导性关节炎小鼠模型中的肾炎（Mohan（莫汉）等人J.Immuno.（免疫学杂
志）154:1470）。额外地，抗-CD40L抗体在患有建立的肾炎的SNF1小鼠中保留肾脏功能。
（Kalled（凯莱德）等人免疫学杂志160:2158）。在非人类和人类两者中，CD40L水平与临床疾病严重程度（即，炎症的减少）、以及靶组织的损害密切相关。

[0012] SLE是一种进行性的并且有时是致命的自身免疫性疾病。狼疮的各异表现从皮疹和关节炎通过贫血和血小板减少到甚至精神病变化。已经有明显的证据示出在导致肾脏、皮肤、大脑疾病和血栓形成的炎性过程中涉及免疫系统的许多分支。SLE的一个特色特征是B细胞失去耐受性并且在患有这一疾病的患者中自身抗体是显著的。在狼疮性肾脏疾病中，抗双链DNA自身抗体可以形成抗体核小体复合物并且迁入肾脏的肾小球基底膜中。这些免疫复合物反过来激活补体，这可以引起肾小球肾炎。

[0013] 已经发现在患有SLE的患者中CD40R连同CD40L的表达是提高的。增加的共刺激信号可能导致发现于SLE中的病理性炎症应答。SLE T细胞具有与对自身抗原降低的激活
阈有关的自发增加的激活作用。此外，这些细胞对另外的抗原刺激具有低反应性、对细胞凋亡具有抗性、在激活后具有增加的存活并且具有许多改变的细胞内信号传导通路。在由T细胞CD40L激活APC上的CD40R后，APC和T细胞两者都被激活，产生细胞因子并且在SLE中
导致病原性自身抗体的产生和组织损伤（狼疮性肾炎）。单独地或组合地，CD40R/CD40L通路的阻断在阻断易发狼疮小鼠中的疾病中是有效的。在患有SLE的患者中，人源化抗-CD40L抗体减少抗双链DNA和B细胞、蛋白尿，并且改善SLE疾病严重程度。

[0014] 然而，用传统的抗体靶向CD40L已经产生了显著的安全忧虑。例如，由于报道的血栓栓塞性并发症，在患有慢性难治的特发性血小板减少性紫癜（ITP）的患者中的抗-CD40L抗体5c8 的研究被搁置（Davidson（戴维森）等人Arth Rheu（类风湿关节炎），43:S271）。此外，用直接针对CD40L的替代性抗体的额外的尝试导致其他血栓形成相关的并发症（Davis（戴维斯）等人Arth Rheu（类风湿关节炎），43:S281；Schuler（舒乐），Transplantation（移植），77:717）。考虑到CD40L的抗体定向的拮抗作用的并发症，对用一种非抗体替代物靶向并拮抗CD40L存在未满足的需求。因此，通过避免Fab2和/或Fc-介
导的血小板凝集和下游的副作用，用基于Tn3的支架靶向CD40L是一个吸引人的替代方案。

[0015] 在此对参考文献的引用或讨论不应被理解为承认此类参考文献是本发明的现有技术。
发明概述

[0016] 本发明提供了一种包括CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架，其中该单体亚单位包括七个被指定为A、B、C、D、E、F、和G的β链，以及六个被指定为AB、BC、CD、DE、EF、和FG的环区，并且其中该Tn3支架与CD40L特异性结合。在一些实施例中，该Tn3支架包
括一个单一的CD40L-特异性单体亚单位。在其他实施例中，该Tn3支架包括两个一前一后连接的CD40L-特异性单体亚单位。在一些特定实施例中，该Tn3支架包括两个直接连接的CD40L-特异性单体亚单位。

[0017] 在一些实施例中，两个CD40L-特异性单体亚单位被一个接头连接。在其他实施例中，该接头包括可以是柔性肽接头的肽接头。在一些实施例中，该肽接头包括一个(GmX)n序列，其中X是丝氨酸（S）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、Leu（L）、异亮氨酸（I）、或缬氨酸（V）；m和n是整数值；m是1、2、3或4；并且n是1、2、3、4、5、6、或7。在一些实施例中，该肽接头包括SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142或SEQ ID NO：143。

[0018] 在一些实施例中，包括两个CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结合与包括一个单一的CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结合相比是改善的。在
其他实施例中，包括两个CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结合与包括一个
单一的CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结合相比改善对靶标的作用。在
其他实施例中，Tn3支架与CD40L的结合的改善是结合亲合力的改善、结合亲合性的改善、或两者。在某些实施例中，包括两个CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结
合亲和力和Tn3支架蛋白稳定性与包括一个单一的CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架
与CD40L的结合亲和力和Tn3支架蛋白稳定性相比是改善的。在一些实施例中，包括两个
CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结合亲合性和Tn3支架蛋白稳定性与包括
一个单一的CD40L-特异性单体亚单位的Tn3支架与CD40L的结合亲合性和Tn3支架蛋白
稳定性是改善的。

[0019] 在一些实施例中，在Tn3支架中的至少一个CD40L-特异性单体亚单位与接头结合、或与异源部分结合。在其他实施例中，Tn3支架中的接头或异源部分被共轭至一个CD40L-特异性单体亚单位的N端或C端。在某些实施例中，与Tn3支架中的一个CD40L-特
异性单体亚单位结合的接头包括肽接头，这种肽接头在一些实施例中可以是一种柔性肽接头。在某些实施例中，该肽接头可以包括一个(GmX)n序列，其中X是丝氨酸（S）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、或缬氨酸（V）；m和n是整数；m是1、2、3或4；并且n是1、2、3、4、5、6、或7。在一些实施例中，与Tn3支架中的一个CD40L-特异性单体亚单位结合的肽接头包括SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：142或SEQ ID NO：143。

[0020] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个接头,该接头包括一个功能部分。在一些实施例中，这个功能部分是一种免疫球蛋白或其片段。在某些实施例中，这种免疫球蛋白或其片段包括一个Fc结构域。在一些实施例中，这一Fc结构域不能诱导至少一种FcγR-介
导的效应子功能。在一些实施例中，这一至少一种FcγR-介导的效应子功能是ADCC。

[0021] 在一些实施例中，该Tn3支架包括至少一个与异源部分结合的CD40L-特异性单体亚单位。在一些实施例中，这一异源部分包括一种选自下组的组合物，该组由以下各项组成：蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、细胞毒剂、显像剂、放射性核素、放射性化合物、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇（PEG）、生物素、白蛋白、人血清白蛋白（HSA）、HSFcRn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非FnIII支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子，以及两种或更多种所述部分的组合。

[0022] 在一些实施例中，该Tn3支架包括至少一个与PEG共轭的CD40L-特异性单体亚单位。在一些实施例中，该Tn3支架包括至少一个与白蛋白共轭的CD40L-特异性单体亚单位。
在某些实施例中，这一白蛋白是人血清白蛋白（HSA）。在其他实施例中，这一HSA是一种变体HSA。在一些具体实施例中，该变体HSA的氨基酸序列是SEQ ID NO：133。在其他实施
例中，与天然HSA或天然HSA片段相比，该变体HSA具有至少一种改善的特性。在某些实施例中，这种改善的特性是与天然HSA或天然HSA片段的血浆半衰期相比改变的血浆半衰期。
在一些实施例中，这种改变的血浆半衰期是与天然HSA或天然HSA片段的血浆半衰期相比
更长的血浆半衰期。在其他实施例中，这种改变的血浆半衰期是与天然HSA或天然HSA片
段的血浆半衰期相比更短的血浆半衰期。

[0023] 在一些实施例中，该Tn3支架被融合至在HSA结构域III中包括至少一个氨基酸取代的HSA变体。在其他实施例中，该Tn3支架被融合至一种HSA变体，该HSA变体包括全
长成熟的HSA（SEQ ID NO：133或138）或其片段的序列，除了至少一个在选自下组的位置处的氨基酸取代以外，该组由以下各项组成：407、415、463、500、506、508、509、511、512、515、
516、521、523、524、526、535、550、557、573、574、以及580，相对于全长成熟的HSA的位置进行编号；其中至少一个氨基酸取代不包括在位置573处的赖氨酸（K）被取代为谷氨酸（E），并且其中该Tn3支架具有比未共轭至此类HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期更长的血浆半
衰期。

[0024] 在一些实施例中，该Tn3支架被融合至HSA变体，其中相对于在全长成熟HSA中的位置进行编号，至少一个氨基酸取代在选自下组的位置处，该组由以下各项组成：463、508、523、以及524，其中所述Tn3支架具有比未共轭至所述HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期更长的血浆半衰期。在一些实施例中，该HSA变体包括全长成熟HSA（SEQ ID NO：133或138）或其片段的序列，相对于在全长成熟HSA中的位置进行编号，除了至少一个选自下组的氨基酸取代以外，该组由以下各项组成：(a)在位置407处的亮氨酸（L）被天冬酰胺（N)或酪氨酸（Y）取代；(b)在位置415处的缬氨酸（V）被苏氨酸（T）取代；(c)在位置463处的亮氨酸（L）被天冬酰胺（N）取代；(d)在位置500处的赖氨酸（K）被精氨酸（R）取代；(e)在位置
506处的苏氨酸（T）被酪氨酸（Y）取代；(f)在位置508处的苏氨酸（T）被精氨酸（R）取代；
(g)在位置509处的苯丙氨酸（F）被甲硫氨酸（M)或色氨酸（W）取代；(h)在位置511处的丙氨酸(A）被苯丙氨酸（F）取代；(i)在位置512处的天冬氨酸(D）被酪氨酸（Y）取代；(j)在位置515处的苏氨酸（T）被谷氨酰胺（Q）取代；(k)在位置516处的亮氨酸（L）被苏氨酸（T）或色氨酸（W）取代；(l)在位置521处的精氨酸（R）被色氨酸（W）取代；(m)在位置523处的异亮氨酸（I）被天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、甘氨酸（G）、赖氨酸（K）、或精氨酸（R）取代；
(n)在位置524处的赖氨酸（K）被亮氨酸（L）取代；(o)在位置526处的谷氨酰胺（Q）被甲硫氨酸（M）取代；(p)在位置535处的组氨酸（H）被脯氨酸(P）取代；(q)在位置550处的天冬氨酸（D）被谷氨酸(E）取代；(r)在位置557处的赖氨酸（K）被甘氨酸（G）取代；(s)在位置573处的赖氨酸（K）被苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）、脯氨酸（P）、色氨酸（W）、或酪氨酸（Y）取代；(t)在位置574处的赖氨酸（K）被天冬酰胺（N）取代；(u)在位置580处的谷氨酰胺（Q）被赖氨酸（K）取代；以及(v)两种或更多种所述取代的组合，其中所述Tn3支架具有比未共轭至所述HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期更长的血浆半衰期。

[0025] 在一些实施例中，该Tn3支架被融合至HSA变体，该HSA变体包括全长成熟HSA（SEQ ID NO：133或138）或其片段的序列，相对于在全长成熟HSA中的位置进行编号，除了至少一个选自下组的氨基酸取代以外，该组由以下各项组成：(a)在位置463处的亮氨酸
（L）被天冬酰胺（N）取代；(b)在位置508处的苏氨酸（T）被精氨酸（R）取代；(c)在位置
523处的异亮氨酸（I）被天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、甘氨酸（G）、赖氨酸（K）、或精氨酸（R）取代、；(d)在位置524处的赖氨酸（K）被亮氨酸（L）取代；以及(e)两种或更多种所述取代的组合，其中所述Tn3支架具有比未共轭至所述HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期更长的血
浆半衰期。

[0026] 在一些实施例中，该Tn3支架包括至少两个相同的CD40L-特异性单体亚单位。在其他实施例中，该Tn3支架包括至少两个不同的CD40L-特异性单体亚单位。在一些实施例中，该Tn3支架是一种CD40受体激动剂。在一些实施例中，该Tn3支架是一种CD40受体拮抗剂。

[0027] 在一些实施例中，该Tn3支架包括至少两个与同一CD40L表位特异性结合的CD40L-特异性单体亚单位。在其他实施例中，该Tn3支架包括至少两个与不同CD40L表位
特异性结合的CD40L-特异性单体亚单位。在一些实施例中，这些不同的CD40L表位是不重叠的表位。在其他实施例中，这些不同的CD40L表位是重叠的表位。

[0028] 在一些实施例中，该Tn3支架与至少两个CD40L分子结合。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个与至少两个CD40L分子结合的CD40L-特异性单体亚单位。

[0029] 在一些实施例中，该Tn3支架的至少一个CD40L-特异性单体亚单位的β链与SEQ ID NO：3的β链具有至少90%序列一致性。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个
CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：11的Aβ链、或包括一个含有SEQ ID NO：11的Aβ链（除了至少一个突变以外）。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：12的Bβ链、或包括一个含有SEQ ID NO：12的Bβ链（除了至少一个突变以外）。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：13或14的Cβ链、或
包括一个含有SEQ ID NO：13或14的Cβ链（除了至少一个突变以外），并且其中在SEQ ID NO：13或14中的半胱氨酸未被取代。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：15的Dβ链、或包括一个含有SEQ ID NO：
15的Dβ链（除了至少一个突变以外）。

[0030] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：16的Eβ链、或包括一个含有SEQ ID NO：16的Eβ链（除了至少一个突变以外）。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：17的Fβ链、或包括一个含有SEQ ID NO：17的Fβ链（除了至少一个突变以外），并且其中在SEQ ID NO：17中的半胱氨酸未被取代。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个含有SEQ ID NO：18的Gβ链、或包括一个含有SEQ ID NO：18的Gβ链（除了至少一个突变以外）。

[0031] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括以下氨基酸序列：IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
其中：XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、以及XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF、以及FG环中的序列的氨基酸残基；X1表示氨基酸残基A或T；并且环的长度n是一个在2与26之间的整
数。

[0032] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中AB环的序列包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：136，CD环的序列包括SEQ ID NO：6，并且EF环的序列包括SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：137。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、以及168。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中DE环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：
SEQ ID NO：94、95、96、97、98、以及169。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中FG环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：
9、99、139、以及170。

[0033] 在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：100、101、102、103、104、105、
106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、以及174。在某些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中DE环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、以及175。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中FG环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：129、130、和177。在某些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中AB环的序列包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：4和136。

[0034] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：83，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：83，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
99。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：84，DE环的序列包括SEQ ID NO：95，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或
139。

[0035] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：85，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：86，DE环的序列包括SEQ ID NO：96，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序
列包括SEQ ID NO：87，DE环的序列包括SEQ ID NO：97，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
9或139。

[0036] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：88，DE环的序列包括SEQ ID NO：95，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：89，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序
列包括SEQ ID NO：90，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
9或139。

[0037] 在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：91，DE环的序列包括SEQ ID NO：95，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：92，DE环的序列包括SEQ ID NO：98，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序
列包括SEQ ID NO：93，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
9或139。

[0038] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：100，DE环的序列包括SEQ ID NO：118，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：129。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：101，DE环的序列包括SEQ ID NO：119，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：102，DE环的序列包括SEQ ID NO：120，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：103，DE环的序列包括SEQ ID NO：121，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中AB环的序列
包括SEQ ID NO：136。

[0039] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：104，DE环的序列包括SEQ ID NO：122，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：129。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：105，DE环的序列包括SEQ ID NO：121，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：106，DE环的序列包括SEQ ID NO：123，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中AB环的序列
包括SEQ ID NO：136。

[0040] 在某些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：107，DE环的序列包括SEQ ID NO：123，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：129。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：108，DE环的序列包括SEQ ID NO：118，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：109，DE环的序列包括SEQ ID NO：123，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：110，DE环的序列包括SEQ ID NO：121，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特
异性单体亚单位，其中AB环的序列包括SEQ ID NO：136。

[0041] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：111，DE环的序列包括SEQ ID NO：123，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：130。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：108，DE环的序列包括SEQ ID NO：121，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：112，DE环的序列包括SEQ ID NO：124，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：113，DE环的序列包括SEQ ID NO：125，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中AB环的序列
包括SEQ ID NO：136。

[0042] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列包括SEQ ID NO：114，DE环的序列包括SEQ ID NO：118，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：129。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：115，DE环的序列包括SEQ ID NO：126，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：116，DE环的序列包括SEQ ID NO：127，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中BC环的序列
包括SEQ ID NO：117，DE环的序列包括SEQ ID NO：128，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：
129。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中AB环的序列
包括SEQ ID NO：136。

[0043] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42以及146。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括以下氨基酸序列：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9H X10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)其中：(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸（S）或亮氨酸（L）；(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）；(c)X3表示氨基酸残基组氨酸（H）、异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）或色氨酸（W）；(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸（A)、甘氨酸（G)、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸（E)、亮氨酸（L)、谷氨酰胺（Q)、丝氨酸（S)、天冬氨酸（D）或天冬酰胺（N）；(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸（I)、缬氨酸（V)、组氨酸（H)、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸（G）、色氨酸（W）或缬氨酸（V）；(i)X9表示氨基酸残基色氨酸（W)、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸（S)、谷氨酰胺（Q)、甲硫氨酸（M)或组氨酸（H）；(k)X11表示氨基酸残基色氨酸（W）或组氨酸（H）；并且(l)X12表示氨基酸残基精氨酸（R）或丝氨酸（S）。

[0044] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、以及82。

[0045] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位包括以下氨基酸序列：IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDL X12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸（K）或谷氨酸（E）；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸（S）、亮氨酸（L）、丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丝氨酸（S）；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、丙氨酸（A）或组氨酸（H）；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺（N）、天冬氨酸（D）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸（H）、脯氨酸（P）、丝氨酸（S）、亮氨酸（L）或天冬氨酸（D）；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸（G）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸（S）、天冬酰胺（N）、谷氨酸（E）、天冬酰胺（R）或天冬氨酸（D）；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸（P）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丙氨酸（A）或没有氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸（I）或没有氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸（E）或赖氨酸（K）；并且
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸（S）或天冬酰胺（N）。

[0046] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：134、135、205、206、207以及208。在其他实施例中，该Tn3支架由选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：134、135、205、206、207以及208。

[0047] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：201、202、203、以及204。在一些实施例中，该Tn3支架由选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：201、202、203、以及204。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中所述CD40L-特异性产朝向人类CD40L。在一些实施例
中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，其中所述CD40L-特异性朝向膜结合的CD40L（SEQ ID NO：1）、可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）、或其片段。在一些特定实施例中，该Tn3支架结合CD40L并且阻止CD40L结合至CD40。

[0048] 本发明还提供了一种改变CD40L表达细胞的活性的方法，该方法包括使该细胞与Tn3支架接触，其中该Tn3支架结合CD40L并且阻止CD40L结合至CD40。在一些实施例中，该Tn3支架以约1μM或更小的、或约500nM或更小的、或约100nM或更小的、或约50nM或
更小的、或约25nM或更小的、或约10nM或更小的、或约5nM或更小的、或约2nM或更小的亲和力（Kd）与CD40L结合。

[0049] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个与CD40L表位特异性结合的CD40L-特异性单体亚单位，该CD40L表位包括位于SEQ ID NO：2的位置142至155、200至230、或247至
251处的氨基酸。在一些实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位与CD40L氨基酸E142、Y146、M148、N151、L155、R200、R203、以及E230相互作用。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位与CD40L氨基酸R203、I204、V247、H249、以及T251相互作用。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位与CD40L氨基酸E142、Y146、M148、N151、L155（位于第一CD40L分子中）相互作用，并且与CD40L氨基酸R200、R203、和E230（位于第二CD40L分子中）相互作用。在其他实施例中，该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位，该亚单位与CD40L氨基酸R203和I204（位于第一CD40L分子中）相互作用，并且与CD40L氨基酸V247、H249、以及T251（位于第二CD40L分子中）相互作用。

[0050] 本发明还提供了包括一个或多个CD40L-特异性Tn3单体的多肽，单体包括但不局限于在此描述的血清白蛋白融合物。

[0051] 本发明还提供了编码CD40L-特异性Tn3支架的分离的核酸分子、包括编码CD40L-特异性Tn3支架的核酸分子的表达载体、以及包括这样的载体的宿主细胞。本发明还提供了一种生产Tn3支架的方法，该方法包括在表达由该核酸分子编码的CD40L-特异性Tn3支架的条件下培养该宿主细胞。

[0052] 本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种CD40L-特异性Tn3支架以及一种药学上可接受的赋形剂。本发明还提供了一种预防、治疗、缓解、或控制一位对其有需要的患者的自身免疫性疾病的方法，该方法包括给予一个有效量的包括CD40L-特异性Tn3支架的药物组合物。

[0053] 本发明还提供了一种减少向一位患有自身免疫性疾病的患者给予的皮质类固醇的频率或数量的方法，该方法包括向这位患者给予一个治疗有效量的包括CD40L-特异性
Tn3支架的药物组合物。

[0054] 通过给予CD40L-特异性Tn3支架治疗的自身免疫性疾病可以是斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性爱迪生氏病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、舍格伦综合征（Sjogren's syndrome）、银屑病、动脉硬化、糖尿病的和其他视网膜病、晶体后纤维增生症、与年龄相关的黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤、甲状腺增生（包括格雷夫斯病（Grave's disease））、角膜等组织移植、和慢性炎症、脓毒病、类风湿关节炎、腹膜炎、克罗恩病（Crohn’s disease）、再灌注损伤、败血症、内毒素休克、囊性纤维化、心内膜炎、银屑病、关节炎（例如银屑病性关节炎）、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植物排斥、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病（Behcet's disease）、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能失调综合征（CFIDS）、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾病、变应性肉芽肿血管炎（Churg-Strauss syndrome）、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利（Guillain-Barre）、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、IgA的神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔氏病（Meniere's disease）、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病性关节炎、Raynauld氏现象、莱特尔氏综合征（Reiter's syndrome）、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎性血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病。

[0055] 在一些特定实施例中，通过给予CD40L-特异性Tn3支架治疗的自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮（SLE）。

[0056] 用CD40L-特异性Tn3支架治疗的方法可以进一步包括一种额外的疗法，例如免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法、或小分子药物疗法。

[0057] 本发明还提供了一种蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括与可溶性CD40L（SEQID NO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：20组成的Tn3支架，其中该晶体具有
的P212121正交晶空间群和晶胞大小的晶格，
+/-0.1%。在一些实施例中，该晶体的不对称单位包括一个CD40L的三聚物和三个分子的
Tn3支架。在其他实施例中，用于确定结构的晶体衍射X射线与等于或小于 的值的分
辨率相配。

[0058] 本发明还提供了一种蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括与可溶性CD40L（SEQID NO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：68组成的Tn3支架，其中该晶体具有
的P213立方空间群和晶胞大小的晶格，+/-0.1%。在一些实施例中，
该晶体的不对称单位包括一个CD40L分子和一个Tn3支架分子。在其他实施例中，用于确
定结构的晶体衍射X射线与等于或小于 的值的分辨率相配。

[0059] 本发明还提供了一种蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括与可溶性CD40L（SEQ IDNO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：28或146组成的Tn3支架，其中该晶体具有
的P321空间群和晶胞大小的晶格，+/-0.1%。在
一些实施例中，该晶体的不对称单位包括一个CD40L分子和一个Tn3支架分子。在其他实
施例中，用于确定结构的晶体衍射X射线与等于或小于 的值的分辨率相配。

[0060] 本发明还提供了一种蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括两个不同的与可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：28或146组成的Tn3支架，其中该晶体具有 的P21立体空间群和晶胞大小的晶格，+/-0.1%。在一些实施例中，该晶体的不对称单位包括两个CD40L三聚物和六个Tn3支架分子。在其他实施例中，用于确定结构的晶体衍射X射线与等于或小于 的值的分辨率相配。

[0061] 在一些实施例中，通过使用沉滴法蒸汽扩散（sitting-drop vapor diffusion）产生该蛋白质晶体。本发明还提供了一种制造蛋白质晶体的方法，该方法包括：(a)将一体积的包括与CD40L处于复合物形式的Tn3支架（该Tn3支架包括一个CD40L-特异性单体亚单位）溶液与一体积的包括一种沉淀剂的储蓄液混合；并且(b)在适于结晶的条件下，在一个密闭容器中孵育在(a)步骤中获得的混合物，直到形成该蛋白质晶体。在一些实施例中，用于生产该蛋白质晶体的方法包括使用沉滴法蒸汽扩散。

[0062] 在一些实施例中，使用用来制造蛋白质晶体的方法来生产包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：146的CD40L-特异性Tn3单体亚单位的晶体。

[0063] 本发明还提供了一种机器可读的数据存储介质，该存储介质包括一个由机器可读的指令编码的数据存储材料，用于：(a)将数据转化为一种Tn3支架的蛋白质晶体的部分的结构的图形化的三维表示，该Tn3支架包括一个与CD40L复合的CD40L-特异性单体亚单位；以及(b)引起展示所述图形化的三维表示。在一些实施例中，这样的Tn3支架包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：146。在其他实施例中，这样的蛋白质晶体是：

[0064] (a)以下蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括与可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）处于复 合物形式的 由SEQ ID NO：20组成 的Tn3支架，其中 该晶体具 有
的P212121正交晶空间群和晶胞大小的晶格，
+/-0.1%；

[0065] (b)以下蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括与可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：68组成的Tn3支架，其中该晶体具有 的P213立方空间群和晶胞大小的晶格，+/-0.1%；或

[0066] (c)以下蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括一个由SEQ ID NO：20组成的Tn3支架以及一个由SEQ ID NO：68组成的Tn3支架，其中两个Tn3支架都与可溶性CD40L（SEQ IDNO：2）处于复合物形式

[0067] (d)以下蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括与可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：28或146组成的Tn3支架，其中该晶体具有
的P321空间群和晶胞大小的晶格，+/-0.1%

[0068] (e)以下蛋白质晶体，该蛋白质晶体包括两个不同的与可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）处于复合物形式的由SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：28或146组成的Tn3支架，其中该晶体具有 的P21立体空间
群和晶胞大小的晶格，+/-0.1%。
附图简要说明

[0069] 为阐明本发明，在附图中描绘了本发明的某些实施例。然而，并不将本发明限制于图中描绘的实施例的精确安排和机构。

[0070] 图1A示出了使用D10G4.1/PBMC（外周血单核细胞）测定测量的鼠CD40L（MuCD40L）-诱导的CD86表达的抑制。测定了M13小鼠CD40L-特异性Tn3支架、其M31亲
和力优化的变体（约20x亲和力改善）、抗-CD40L MR1单克隆抗体、以及阴性对照。还示出了IC50值。

[0071] 图1B示出了鼠NfkB测定中的CD40L抑制。该测定使用表达鼠CD40R并且包含NfkB-荧光素酶报告基因构建体的NIHT3T细胞。添加CD40L导致由MR1抗-CD40L抗体和
由M31CD40L-特异性Tn3支架两者抑制的信号传导（通过荧光素酶活性测量）。

[0072] 图2A示出了CD40L-特异性串联二价的Tn3支架和血清白蛋白（SA）融合构建体的设计。

[0073] 图2B示出了纯化的单价M13构建体（CD40L-特异性Tn3构建体）、或具有包含1个、3个、5个或7个与两个M13Tn3单体亚单位连接的Gly4Ser单位（被表示为GS）的接头的串联二价支架的SDS-PAGE分析。单价M13构建体在泳道2跑胶，具有1GS单位（C1）的二
聚构建体在泳道3和7跑胶，具有3GS单位（C2）的二聚构建体在泳道4和8跑胶，具有5GS
单位（C3）的二聚构建体在泳道5和9跑胶，并且具有7GS单位（C4）的二聚构建体在泳道6和10跑胶。使样品在非还原条件（泳道2-6）或还原条件（泳道7-10）下跑胶。

[0074] 图2C示出了鼠CD40L-特异性单价的（M13）或二价的串联支架（M13-xGS-M13，其中x是1、3、5或7，对应于具有包含1个、3个、5个或7个Gly4Ser单位的接头的二价支架）对鼠CD40L与固定于生物传感器芯片上的鼠CD40受体的结合的竞争性抑制。还指示了针对不同构建体的半最大抑制浓度（IC50）。

[0075] 图2D示出了鼠CD40L-特异性Tn3单价的（M13）和二价的串联支架对B细胞上的鼠CD40L-诱导的CD86表达的抑制作用。提供了针对所有Tn3构建体和针对MR1抗-鼠
CD40L抗体的IC50值。

[0076] 图3A示出了融合至小鼠血清白蛋白（MSA）的鼠CD40L-特异性串联的二价Tn3支架在HEK293细胞中的高表达水平。这些构建体在接头中的Tn3支架单位之间具有1个（G4S）重复并且在接头中的Tn3支架与MSA之间具有3个（G4S）重复。另外，该构建体在M13和
M31支架中的每个中包含一个N49Q突变，以除去潜在的N-联糖基化位点。使转染后第3天
或第6天取的10μl培养上清液连同已知量的纯化的蛋白质一起在SDS-PAGE凝胶上跑胶。
在转染后第6天估算表达水平为200mg/l。通过C端组氨酸标签（C-terminal His-tag）经由IMAC进行纯化。

[0077] 图3B示出了使用D10G4.1/PBMC细胞测定测量的鼠CD40L（MuCD40L）-诱导的CD86表达的抑制。测定了CD40L-特异性串联二价Tn3支架（M13-1GS-M13）、融合至小鼠血清白蛋白（MSA）的同一构建体（M13-1GS-M13-MSA）、以及MR1抗-鼠CD40L单克隆抗体。提供了针对所有构建体的IC50值。

[0078] 图3C示出了使用D10G4.1/PBMC细胞测定测量的鼠CD40L（MuCD40L）-诱导的CD86表达的抑制。测定了融合至小鼠血清白蛋白（MSA）的CD40L-特异性串联二价Tn3支
架（M13-1GS-M13）（M13-1GS-M13-MSA）、共轭至MSA的M13支架的亲和力成熟的变体（M31单价-MSA）、包括共轭至MSA的M31亲和力优化的变体的串联二价支架（M31-1GS-M31-MSA）、不结合小鼠CD40L的阴性对照串联二价支架（D1-1GS-D1-MSA）、以及MR1单克隆抗体。提供了IC50值。

[0079] 图4A示出了如通过ELISA确定的小鼠中的若干鼠CD40L特异性构建体的药代动力学。还指示了针对每个构建体的血浆半衰期（t1/2）值。

[0080] 图4B示出了如通过ELISA确定的食蟹猴中的人类CD40L特异性342-HSA和包括在位置463处的Leu被Asn取代（L463N）和在位置524处的Lys被Leu取代（K524L）的
342-HSA变体的药代动力学。

[0081] 图5A示出了来自绵羊红细胞（SRBC）免疫测定的生发中心（GC）中的B细胞成熟。测定了MR1单克隆抗-鼠CD40L抗体。

[0082] 图5B示出了来自绵羊红细胞（SRBC）免疫测定的生发中心（GC）中的B细胞成熟。测定了融合至MSA的M31-衍生的单价的和二价的构建体。将共轭至MSA的D1-D1二价构
建体用作阴性对照。

[0083] 图5C示出了来自绵羊红细胞（SRBC）免疫测定的外围（非GC）中的B细胞成熟。测定了融合至MSA的M31-衍生的单价的和二价的构建体。将共轭至MSA的D1-D1二价构建体用作阴性对照。

[0084] 图5D示出了来自绵羊红细胞（SRBC）免疫测定的CD4阳性细胞的百分比（%CD4）和数目（#CD4）。测定了融合至MSA的M31-衍生的单价的和二价的构建体、以及MR1抗-CD40L单克隆抗体。将共轭至MSA的D1-D1二价构建体用作阴性对照。

[0085] 图5E示出了来自绵羊红细胞（SRBC）免疫测定的CD44hi阳性细胞的百分比（%CD44hi）和数目（#CD44hi）。测定了融合至MSA的M31-衍生的单价的和二价的构建体、以及MR1抗-CD40L单克隆抗体。将共轭至MSA的D1-D1二价构建体用作阴性对照。

[0086] 图5F示出了来自绵羊红细胞（SRBC）免疫测定的抗-SRBC IgG的量。测定了融合至MSA的M31-衍生的单价的和二价的构建体。将共轭至MSA的D1-D1二价构建体用作阴性对照。

[0087] 图5G示出了来自KLH-特异性T细胞依赖型抗体应答（TDAR）模型的抗-KLH IgM滴度。测定了融合至HSA的342-衍生的单价的和二价的构建体。

[0088] 图5H示出了来自KLH-特异性T细胞依赖型抗体应答（TDAR）模型的抗-KLH IgG滴度。测定了融合至HSA的342-衍生的单价的和二价的构建体。

[0089] 图6A示出了人类CD40L-特异性单价Tn3单体支架309和311对用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的人类CD40L-诱导的CD86表达的抑制作用。

[0090] 图6B示出了人类CD40L-特异性单价Tn3单体支架309和311对人类CD40L-刺激的B-细胞增殖的抑制作用。

[0091] 图6C示出了人类CD40L-特异性单价Tn3单体支架309和311对T/B细胞共培养中的浆细胞数目的抑制作用。通过FACS还示出Tn3支架309结合激活的初始T细胞（数据
未示出）。将D1支架（“阴性Tn3”）用作对照。还将被指定为aCD40L（RE）和aCD40L（Bio）的两个抗CD40L的单克隆抗体（生源体的5c8抗-人类CD40L单克隆抗体）用作对照。

[0092] 图7A示出人类CD40L-特异性单价Tn3支架309和311具有相似的生物物理学特征。如通过SEC测量的，两种支架都是单分散的。

[0093] 图7B示出人类CD40L-特异性单价Tn3支架309和311具有相似的生物物理学特征。如通过差示扫描量热法（DSC）所确定的，两种支架都与亲本Tn3支架（在曲线图中被指定为Tn3（野生型））具有相似的热稳定性。

[0094] 图8A示出了人类CD40L-诱导的CD86表达在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的抑制。测定了单价的（311）和二价的（311_3GS和311_7GS）人类CD40L-特异性Tn3支架。示出了针对每个构建体的IC50值。

[0095] 图8B示出了人类CD40L-诱导的CD86表达在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的抑制。测定了单价的（309）和二价的（309_3GS和309_7GS）人类CD40L-特异性Tn3支架、以及生源体的5c8抗-人类CD40L单克隆抗体。示出了针对每个构建体和
抗体的IC50值。

[0096] 图9A示出了融合至人血清清蛋白（HSA）的代表性人类CD40L-特异性串联二价Tn3支架的设计。“GGGGG”（SEQ ID NO：148）和“GGGGA”（SEQ ID NO：149）是“GGGGS”（SEQ ID NO：147）接头的替代接头。

[0097] 图9B示出了来自经过IEX柱的293F细胞的测试纯化。肩部部分（<10%的主峰）包含连接至存在于接头中的丝氨酸参加的O-糖基化蛋白。

[0098] 图9C示出了人类CD40L-诱导的CD86表达在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的抑制。测定了二价的（309）人类CD40L-特异性Tn3支架、融合至HSA的
同一支架，以及生源体的5c8抗-人类CD40L单克隆抗体。

[0099] 图9D示出了人类CD40L-诱导的CD86表达在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的抑制。测试了三个二价的（309）人类CD40L-特异性Tn3支架。在接头的
人类CD40L-特异性亚单位之间存在三个（G4S）重复（在这个实例中的309），而在该接头的
309亚单位与HSA之间的重复在1个至3个（G4S）变化。还测定了生源体的5c8抗-人类
CD40L单克隆抗体。

[0100] 图10A示出了309（左图）和311（右图）的突变的环序列对CD40L结合的影响。结合指示结合测定中的信号强度。WT是具有原始的前导序列（亲本Tn3序列）的变体，而BC、DE和FG表示其中BC、DE、或FG环序列已经相对于如存在于人类生腱蛋白C中的亲本Tn3序列被改变的变体。

[0101] 图10B示出了如通过在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的人类CD40L-诱导的CD86表达所测量的，亲和力优化的支架的图的抑制曲线。人类CD40L-特异
性Tn3克隆309单体是亲和力优化的。将亲和力优化的单体指定为克隆340至克隆349。
克隆309wtFG构建体的整个FG环被亲本Tn3支架的FG环所替代。还测定了5c8抗-CD40L
单克隆抗体。

[0102] 图10C示出了如通过在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的人类CD40L-诱导的CD86表达所测量的的抑制曲线。示出了人类CD40L-特异性Tn3311单体、其
K4E变体、以及阴性对照的曲线。

[0103] 图10D示出了如通过在用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的人类CD40L-诱导的CD86表达所测量的的抑制曲线。示出了人类CD40L-特异性Tn3311K4E单
体、亲和力优化的311K4E_12单体、以及5c8抗-CD40L单克隆抗体的曲线。还呈现了两个
构建体和该抗体的IC50。

[0104] 图11A和图11B示出了亲本的CD40L-特异性Tn3支架309、309FGwt变体、以及亲和力优化的变体340至349的多重序列比对。在图11A中示出了氨基酸残基1至42，并且
在图11B中示出了氨基酸残基43至83。变体环被着色。在多重序列比对下呈现了共有区
氨基酸序列。比对的序列对应于Tn3支架克隆309（SEQ ID NO：20）、309FGwt（SEQ ID NO：
22）、340（SEQ ID NO：24）、341（SEQ ID NO：26）、342（SEQ ID NO：28）、343（SEQ ID NO：
30）、344（SEQ ID NO：32）、345（SEQ ID NO：34）、346（SEQ ID NO：36）、347（SEQ ID NO：
38）、348（SEQ ID NO：40）、以及349（SEQ ID NO：42）的氨基酸序列。

[0105] 图12A和图12B示出了亲本的CD40L-特异性Tn3支架311、311K4E变体、以及亲和力优化的变体311K4E_1至311K4E_21的多重序列比对。在图12A中示出了氨基酸残基1
至44，并且在图12B中示出了氨基酸残基45至87。变体环被着色。在阴影环以外的氨基
酸变化被加框。在多重序列比对下呈现了共有区氨基酸序列。比对的序列对应于Tn3支架克隆311（SEQ ID NO：44）、311K4E（SEQ ID NO：46）、311K4E_1（SEQ ID NO：48）、311K4E_2（SEQ ID NO：50）、311K4E_2（SEQ ID NO：52）、311K4E_3（SEQ ID NO：54）、311K4E_4（SEQ ID NO：56）、311K4E_5（SEQ ID NO：58）、311K4E_7（SEQ ID NO：60）、311K4E_8（SEQ ID NO：
62）、311K4E_9（SEQ ID NO：64）、311K4E_10（SEQ ID NO：66）、311K4E_11（SEQ ID NO：68）、
311K4E_12（SEQ ID NO：70）、311K4E_13（SEQ ID NO：72）、311K4E_14（SEQ ID NO：74）、
311K4E_15（SEQ ID NO：76）、311K4E_16（SEQ ID NO：78）、311K4E_19（SEQ ID NO：80）、
311K4E_20（SEQ ID NO：82）、以及311K4E_21（SEQ ID NO：84）的氨基酸序列。

[0106] 图13示出了使用表达人类CD40受体并且包含NfkB-荧光素酶报告基因构建体的HEK293细胞的人类NfkB抑制抑制。添加人类CD40L导致可以通过CD40L结合分子抑制的
信号传导（通过荧光素酶活性测量）。测定了CD40L-特异性Tn3支架340和342、连同5c8
抗-CD40L单克隆抗体。

[0107] 图14示出了人类CD40L-特异性Tn3支架与24h抗-CD3/28激活的人类CD4+T细胞的结合。测定了融合至HSA的单价342支架（被指定为342-HSA）以及融合至HSA的二价
342支架（被指定为342-342-HSA）。

[0108] 图15示出了初始人类T/B细胞增殖在第3天的抑制。测定了融合至HSA的单价340支架（340-HSA）、融合至HSA的单价342支架（342-HSA）、以及融合至HSA的二价342支架（342-342-HSA）。示出了针对每个构建体的IC50值。

[0109] 图16A示出了在洗涤过的血小板上的凝集测定。该突变示出了针对供体（前三个轨迹，分别为ADP：0.5μM、1μM、和2μM）连同5c8单克隆抗体（600nM）和可溶性人类CD40L（200nM）的免疫复合物（IC）的代表性ADP诱导的凝集阳性对照。

[0110] 图16B示出了在洗涤过的血小板上的凝集测定。该图表示出了当使用309-309二价支架（未融合至HSA）和可溶性人类CD40L的预成型的免疫复合物时凝集的缺乏。人类
CD40L（可溶态）的浓度恒定保持在600nM并且支架构建体的浓度从200nM至800nM变化。

[0111] 图16C示出了在洗涤过的血小板上的凝集测定。该图表示出了当使用融合至HSA的342单价支架和可溶性人类CD40L的预成型的免疫复合物时凝集的缺乏。人类CD40L（可溶态）的浓度恒定保持在600nM并且支架构建体的浓度从100nM至400nM变化。该图表还
示出了由生源体5c8单克隆抗体和可溶性人类CD40L的免疫复合物诱导的迅速凝集。

[0112] 图17A示出了与CD40L-特异性Tn3309单体支架处于复合物形式的可溶性CD40L的晶体结构的带状表现。CD40L形成一个三聚物（多肽A、B和C）。每个309支架（多肽D、E和F，画圈的）都与两个CD40L多肽接触。列出了每个309支架与第一和第二CD40L多肽之
间的特异性接触。这是该结构的“自上而下的”视图。

[0113] 图17B示出了与CD40L-特异性Tn3311K4E_12单体支架处于复合物形式的可溶性CD40L的晶体结构的带状表现。CD40L形成一个三聚物（多肽A、B和C）。每个311K4E_12单体支架（多肽D、E和F，画圈的）都与两个CD40L多肽接触。列出了每个311K4E_12单体支架与第一和第二CD40L多肽之间的特异性接触。这是该结构的“自上而下的”视图。

[0114] 图17C示出了一个带状表现，该带状表现说明311K4E_12和309支架（画圈的）与位于CD40L三聚物复合物的不同部分的不同的表位结合。两个支架都结合在将与CD40受体相互作用的同一沟中。这是该结构的“侧”视图。

[0115] 图17D示出了与CD40L-特异性Tn3342单体支架处于复合物形式的可溶性CD40L的晶体结构的带状表现。只示出了一个CD40L和一个342单体支架。列出了342单体支架
与第一CD40L多肽之间的特异性接触。

[0116] 图17E示出了一个带状表现，该带状表现说明342和311K4E_12支架同时与位于CD40L三聚物复合物的不同部分的不同的表位结合。两个支架都结合在将与CD40受体相互作用的同一沟中。这是该结构的“侧”视图。

[0117] 图18A示出了如在图17A中所示的CD40L-特异性Tn3311K4E_12单体支架（SEQID NO：68）中的氨基酸与由可溶性CD40L（SEQ ID NO：2）分子形成的三聚物之间的接触位置。每个支架都与2个CD40L分子接触。示出了CD40L序列（SEQ ID NO：2）。虚线的下划线=胞质结构域；实线的下划线=信号锚定II型膜蛋白；双下划线=与Tn3支架共结晶的
部分；深色阴影=与Tn3接触的第一CD40L上的残基；浅色阴影=与Tn3接触的第二CD40L
上的残基。

[0118] 图18B示出了如在图17B中所示的CD40L-特异性Tn3309单体支架中的氨基酸与CD40L三聚物之间的接触的位置。每个支架都与2个CD40L分子接触。示出了CD40L序列
（SEQ ID NO：2）。虚线的下划线=胞质结构域；实线的下划线=信号锚定II型膜蛋白；双下划线=与Tn3支架共结晶的部分；深色阴影=与Tn3接触的第一CD40L上的残基；浅色阴
影=与Tn3接触的第二CD40L上的残基；加双框的残基与309支架的FG环接触，该残基似
乎未被保存在具有野生型FG环的克隆中。

[0119] 图19。图A示出了将Tn3支架（309或311K4E_12）、CD40L以及它们之间的复合物从尺寸排阻Superdex20010/300GL柱洗脱的示例性色谱图。图B示出了309-CD40L复合物的晶体。示出晶体长到高达0.15×0.15×0.1mm的大小。图C示出了311K4E_12-CD40L复
合物的晶体。
本发明的详细说明
定义

[0120] 在详细描述本发明之前，应当理解的是，本发明并不局限于特定的组合物或工艺步骤，因为这些组合物或工艺步骤同样可以改变。必须注意的是，除非上下文中以另外的方式清楚地指出，如在本说明书及所附权利要求中所使用的单数形式“一种/一位”、“一个”和“该”包括复数指示物。因此，术语“一个”（或“一种”）、以及术语“一个或多个（一种或多种）”和“至少一个”在此可互换地使用。

[0121] 此外，与或不与另一者一起，“和/或”被看作是这两种特定的特征或组分中的每种的特定披露。因此，如在此在词组例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A（单独的）”以及“B（单独的）”。同样，如在词组例如“A、B、和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每个：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（单独的）；B（单独的）；以及C（单独的）。

[0122] 除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本发明涉及的本领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology（《生物医学与分子生物学简明词典》），Juo，Pei-Show，第二版，2002，CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology（《细胞与分子生物学词典》），第三版，1999，学术出版社（Academic Press）；以及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology（《生物化学与分子生物学牛津词典》），修订版，
2000，牛津大学出版社（Oxford University Press）为技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的常用词典。

[0123] 单位、前缀、以及符号被表示为其Système International de Unites（SI）接受的形式。数值范围将定义该范围的数字包括在内。除非另外指明，将氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。在此提供的标题并非限制本发明的不同方面或实施例，这些可以参考本说明书作为一个整体而具有。因此，下面立即定义的这些术语参考本说明书以其整体被更加充分地定义。

[0124] 应当理解，当用语言“包括”来说明实施例时，还提供了就“由……组成”和/或“主要由……组成”而言所说明的其他类似实施例。

[0125] 在此的氨基酸通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission（IUPAC-IUB生物化学命名委员会）推荐的单字母符号而被提及。同样，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码而被提及。

[0126] 如在此使用，术语“表位”是指能够与本发明的支架结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子（例如氨基酸或糖侧链）的化学活性表面基团组成并且通常具有特定的三维结构特征、连同特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂的存在下，与前者（而不是后者）的结合消失。

[0127] 术语“纤连蛋白III型（FnIII）结构域”、“FnIII结构域”以及“FnIII支架”是指与人类纤连蛋白III型结构域同源的多肽，上述结构域具有至少7个分布于两个β片层之间的β链并且进一步包含被暴露至溶剂的环，这些β片层自身互相抵靠包装以形成该蛋
白质的核心，这些环将β链彼此连接。在β片层夹层的每个边缘处存在至少三个这样的
环，其中边缘是垂直于β链的方向的蛋白质的边界。在某些实施例中，FnIII结构域包括7个连接至六个被指定为AB、BC、CD、DE、EF、以及FG的环区的被指定为A、B、C、D、E、F、以及G的β链，其中一个环区与每个β链都连接。

[0128] 在此使用的术语“Tn3支架”是指包括至少一个FnIII支架的分子，其中Aβ链包括SEQ ID NO：11，Bβ链包括SEQ ID NO：12，Cβ链包括SEQ ID NO：13或14，Dβ链包括SEQ ID NO：15，Eβ链包括SEQ ID NO：16，Fβ链包括SEQ ID NO：17，并且β链G包括SEQ ID NO：18，其中至少一个环是“亲本Tn3支架”中的环的非天然发生的变体。在某些实施例中，Tn3分子的一个或多个β链包括至少一个氨基酸取代，除了在Cβ链中的半胱氨酸残基（例如，在SEQ ID NO：13或14中的半胱氨酸）和Fβ链（SEQ ID NO：17）不被取代以外。

[0129] 如在此使用，术语“亲本Tn3”是指包括SEQ ID NO：3的FnIII支架，即衍生自人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域的热稳定化的半胱氨酸工程化的FnIII支架。

[0130] 术语“多聚体”或“多聚支架”是指一种包括至少两个关联的FnIII支架的分子。形成多聚支架的支架可以通过一个接头被连接，该接头允许每个支架独立地发挥作用。

[0131] 术语“单体”、“单体亚单位”或“单体支架”是指一种只包括一个FnIII支架的分子。

[0132] 如在此使用，术语“CD40L-特异性单体亚单位”是指衍生自“亲本Tn3”的Tn3单体，其中该Tn3与CD40L或其片段（例如，CD40L的可溶态）特异性结合。

[0133] 术语“DNA”是指两个或更多个共价结合的天然发生的或修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。

[0134] 术语“融合蛋白”是指一种包括(i)本发明的一个或多个连接至(ii)一个第二不同的蛋白质（即，“异源”蛋白质）的支架的蛋白质。表1：“亲本Tn3”的组分的序列和SEQ ID NO

[0135] 在此使用术语“异源部分”来指示向本发明的Tn3支架中添加一种组合物，其中该组合物正常地不是FnIII结构域的部分。示例性异源部分包括蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、显像剂、放射性化合物、有机和无机聚合物、以及任何其他可以提供不是该FnIII结构域自身固有的活性的组合物，这些其他组分包括但不局限于聚乙二醇（PEG）、细胞毒剂、放射性核素、显像剂、生物素、二聚体化结构域（例如亮氨酸拉链结构域）、人血清白蛋白（HSA）或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段（例如，抗体可变结构域、CH1结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、CH2、CH3结构域）、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子、以及类似物。

[0136] 如在此使用，术语“接头”是指任何连接（join）或连接（connect）两个或更多个支架的分子组件。接头可以是其功能是在支架中的模块之间充当“间隔子”的分子，或者它还可以是一种具有额外的功能的分子（即，“功能部分”）。包括在“异源部分”的定义中的分子也可以作为接头而发挥作用。

[0137] 术语“被连接”和“被融合”可互换地使用。这些术语是指通过包括化学轭合或重组手段的任何手段将两个或更多个支架、异源部分、或接头连接在一起。

[0138] 术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可以被折叠为稳定的三维结构（通常独立于该蛋白质的剩余部分）并且可以被赋予一种具体的功能的蛋白质的区域。这一结构维持与原始蛋白质内的结构域的功能相关的特定的功能，例如酶活性、用于另一个分子的识别基序的创建，或用来为蛋白质提供必需的结构组分，以在蛋白质的具体环境中存在。在一个蛋白质家族并且在相关蛋白质超家族中，蛋白质结构域可以是进化上保守的区域。当描述一种多聚支架的组分时，术语“结构域”、“单体支架”、“单体亚单位”、以及“模块”能可互换地使用。“天然FnIII结构域”意指由活有机体编码的任何非重组的FnIII结构域。

[0139] “蛋白质序列”或“氨基酸序列”意指以氨基末端至羧基末端方向的多肽中的氨基酸成分的线性表现，其中在该表现中彼此邻接的残基在该多肽的一级结构中是连续的。

[0140] 术语“核酸”是指任何两个或更多个共价结合的核苷酸或核苷酸类似物或衍生物。如在此使用，这一术语包括但不局限于DNA、RNA、和PNA。“核酸”和“多核苷酸”在此可互换地使用。

[0141] 术语“多核苷酸”旨在包涵单数核酸连同复数核酸，并且是指一种分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）。术语“分离的”核酸或多核苷酸是指已经从其天然环境中去除的核酸分子，即DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，编码例如被包含在载体中的本发明的支架的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化（部分地或基本上）多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明，分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。

[0142] 术语“药学上可接受的”是指一种可以给予动物（例如，哺乳动物）而没有显著的有害的医学后果的化合物或蛋白质。

[0143] 术语“生理学上可接受的运载体”是指对被治疗的宿主不具有显著的不利影响并且保留与其一起给予的化合物的治疗特性的运载体。一个示例性的生理学上可接受的运载体是生理盐水。其他生理学上可接受的运载体及其配制品是本领域的普通技术人员已知的并且被描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences（雷明顿氏药物科学），（第18版），编辑A.Gennaro（热那罗），1990，Mack Publishing Company（马克出版公司），伊斯顿,宾夕法尼亚州中，将其通过引用结合在此。

[0144] “多肽”意指两个或更多个由酰胺键（肽键）线性连接的氨基酸的任何序列，不管长度、翻译后修饰、或功能。“多肽”、“肽”、以及“蛋白质”在此可互换地使用。因此，肽、二肽、三肽、或寡肽被包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以被任何这些术语代替使用或可以与其可互换地使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不局限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸来进行的修饰。多肽可得自天然生物来源或通过重组技术来产生，但是不必从一个指定的核酸序列翻译而来。多肽可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。

[0145] 前述多肽的片段、衍生物、类似物、或变体，及其任何组合也作为本发明的多肽被包括在内。变体可天然地存在或非天然地存在。非天然地存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包括保守或非保守氨基酸取代、缺失、或添加。包含二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也作为“衍生物”被包括在内。

[0146] “随机的”或“突变的”意指相对于模板序列，包括一个或多个氨基酸改变（包括缺失、取代或添加）。“随机化”或“突变”意指向序列中引入这样的一种氨基酸改变的过程。随机化或突变可以通常通过核酸编码序列的蓄意的、盲目的、或自发的序列变异而完成，并且可以通过任何技术而发生，例如PCR、易错PCR、或化学DNA合成。术语“随机化”、“随机的”、“突变”、“突变的”以及类似术语在此可互换地使用。

[0147] “同源的”或“同源的非突变的蛋白质”意指与变体蛋白质的序列相同，除了向该变体蛋白质中引入的氨基酸突变以外，其中该变体蛋白质被随机化或被突变。

[0148] “RNA”意指两个或更多个共价结合的天然发生的或修饰的核糖核苷酸的序列。被包括在这一术语内的改性的RNA的一个实例是硫代磷酸RNA。

[0149] 如在此使用，术语“本发明的支架”或“本发明的多个支架”是指多聚Tn3支架连同单体Tn3支架。术语“靶标”是指一种被本发明的特定支架识别的化合物。术语“靶标”和“抗原”在此可互换地使用。如在此使用，例如在术语“特异性结合（specifically binds或specific binding）”中的术语“特异性”是指本发明的Tn3支架经由一个或多个抗原结合结构域与一个或多个抗原结合并且结合需要一些在一个或多个抗原结合结构域与一个或多个抗原之间的互补性的相对亲和力。根据这一定义，当与本发明的Tn3支架将结合至随机的、不相关的表位相比，该Tn3支架更容易结合至某一表位时，该Tn3支架被认为是“特异性结合”至该表位。

[0150] “亲和力成熟的”支架是一种通常在环中具有一个或多个改变的支架，这导致与不拥有那些改变的亲本Tn3支架相比，该Tn3支架对表位的亲和力的改善。

[0151] 如在此使用，术语“亲和力”是指本发明的某一Tn3支架与单独的表位结合的强度的量度。

[0152] 如在此使用，术语“亲合性”是指在本发明的一个群体的Tn3支架与某一表位之间的复合物的总体稳定性，即多个Tn3支架与该抗原结合的功能上地复合强度。亲合性与具有特定表位的单独的抗原结合结构域的亲和力有关，并且还与本发明的支架的效价有关。

[0153] 术语“对靶标的作用”是指本发明的Tn3支架与一个或多个靶标的结合并且是指由这样的结合造成的生物效应。在这一方面中，在Tn3支架中的多个抗原结合单位可以与多种靶标和/或表位相互作用，并且例如使两个靶标物理地离得更近、通过与不同的靶标相互作用触发代谢级联、等。参见CD40L，“对靶标的作用”是指例如通过CD40L的一个或多个生物活性的增强、刺激或激活实现的作用。

[0154] 如在此使用，术语“效价”是指潜在的抗原结合模块的数目，例如在本发明的支架中的FnIII模块的数目。当本发明的Tn3支架包括多于一个抗原结合模块时，每个结合模块都可以与同一靶标或不同靶标中的同一表位或不同表位特异性结合。

[0155] 如在此使用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。

[0156] 术语“免疫球蛋白”和“抗体”包括不同宽泛种类的可以用生物化学方法区分的多肽。本领域的普通技术人员将理解的是，将重链归类为γ、μ、α、δ、或ε。此链的性质是将抗体的“类别”相应地确定为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。技术人员可以容易地辨别这些种类中的每个的修改版本。如在此使用，术语“抗体”包括但不局限于完整的抗体、改性的抗体、抗体VL或VL结构域、CHl结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、Fc结构域（参见以下）、CH2、或CH3结构域。

[0157] 如在此使用，术语“Fc结构域”结构域是指抗体恒定区的一部分。传统地，术语Fc结构域是指涵盖抗体的成对的CH2、CH3和绞链区的蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）切割产物。在本披露的上下文中，术语Fc结构域或Fc是指包括免疫球蛋白多肽的所有CH2、CH3和绞链区或其一部分的任何多肽（或编码这样的多肽的核酸），不管产生手段。

[0158] 如在此使用，术语“改性的抗体”包括被改变这样使得它们不是天然发生的抗体的合成形式，例如包括至少两个重链部分但是不是两个完整的重链的抗体（作为例如结构域删除的抗体或迷你抗体（minibody））；被改变以与两个或更多个抗原结合或与单一抗原的不同表位结合的抗体的多特异性（例如，双特异性的、三特异性的等）形式。此外，术语“改性的抗体”包括抗体的多价形式（例如，与同一抗原的三个或更多个拷贝结合的三价的、四价的等抗体）。（参见例如Antibody Engineering（抗体工程），Kontermann（坎特曼妮）&Dubel（迪贝尔），编辑，2010，Springer Protocols（斯普林格协议），斯普林格）。

[0159] 以其正常含义使用术语“体内半衰期”，即一种多肽的50%的生物活性仍存在于身体/靶器官中的时间，或该多肽的活性是其初始值的50%的时间。作为确定功能性体内半衰期的替代方案，可以确定“血清半衰期”，即在被清除之前50%的多肽分子在血浆或血流中循环的时间。确定血清半衰期通常比确定功能性体内半衰期更简单并且血清半衰期的量级通常是功能性体内半衰期的量级的一个好的指征。血清半衰期的替代术语包括“血浆半衰期”、循环半衰期（circulating half-life）、循环半衰期（circulatory half-life）、血清清除率、血浆清除率、以及清除半衰期。有待保留的功能性正常地选自促凝血活性、蛋白水解活性、辅因子结合活性、受体结合活性、或与具体蛋白质相关的其他类型的生物活性。

[0160] 使用相对于功能性体内半衰期或血浆半衰期的术语“增加的”来指示如在可比较的条件下所确定的，相对于参考分子（例如未改性的多肽）的相关半衰期，该多肽的相关半衰期是统计学上显著增加的。

[0161] 使用相对于功能性体内半衰期或血浆半衰期的术语“减少的”来指示如在可比较的条件下所确定的，相对于参考分子（例如未改性的多肽）的相关半衰期，该多肽的相关半衰期是统计学上显著减少的。

[0162] 如在此使用，术语“表达”是指基因产生生物化学物质（例如本发明的支架或其片段）的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不局限于基因敲除和瞬态表达与稳定表达两者。它包括但不局限于将该基因转录成一个或多个mRNA，和将这样的mRNA翻译成一个或多个多肽。如果最终所希望的产物是生物化学物质，那么表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。

[0163] “表达产物”可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或多肽。在此描述的表达产物进一步包括具有转录后修饰（例如多聚腺苷酸化）的核酸，或具有翻译后修饰（例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白裂解等）的多肽。

[0164] 在此使用术语“载体”或“表达载体”来意指根据本发明用作媒介物以便将所希望的表达产物引入并且表达在宿主细胞中的载具。如本领域技术人员所已知，这类载体可以容易地选自下组，该组由以下各项组成：质粒、噬菌体、病毒、以及逆转录病毒。通常，适合于本发明的载体将包括选择标记物、促进所希望的核酸的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力的适当的限制位点。

[0165] 术语“宿主细胞”是指容纳使用重组DNA技术构建的并且编码至少一种表达产物的载体的细胞。在描述用于从重组宿主中分离表达产物的过程中，可互换地使用术语“细胞”和“细胞培养物”来表示该表达产物的来源，除非它被清楚地以另外的方式指定，即从“细胞”中回收该表达产物意指从旋降的全细胞中回收、或从包含培养基和悬浮的细胞两者的细胞培养物中回收。

[0166] 如在此使用，术语“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”是指治疗性治疗和预防（prophylactic）或预防（preventative）措施，其中目标是预防或减缓（减轻）受试者的不希望的生理变化或失调，例如炎性疾病或病症的进展。有益或所希望的临床结果包括但不局限于缓解症状、减小疾病程度、疾病状态的稳定化（即不恶化）、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态、以及减轻（不论部分或完全），不论可检测到或不可检测到。

[0167] 术语“治疗”还意指如与未接受治疗的预期存活相比的延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有这种病症或失调的那些，连同倾向于患有这种病症或失调的那些，或有待预防这种病症或失调的那些。

[0168] 术语“受试者”、“个体”、“动物”、“患者”、或“哺乳动物”是指需要诊断、预后、或治疗的任何个体、患者或动物，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或宠物动物例如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、等。

[0169] 如在此使用，术语“CD40L”是指但不局限于在T细胞的表面表达的CD40L、重组表达的CD40L、由大肠杆菌或其他适合的重组蛋白表达系统表达并纯化的CD40L、未糖基化的TMCD40L、以及CD40L的可溶性片段。如在此使用，“CD40L”还指MegaCD40L。MegaCD40L 是一种高活性的构建体，其中两个三聚CD40配体经由ACRP30/脂连蛋白的胶原结构域被人工连接。这一构建体在体内非常有效地刺激协助CD40L的凝集的天然膜。它为[CD40L+增强
子]（亚力克西斯生化制品公司（Alexis biochemicals））提供了一种简单并同样有效的替代物。术语“CD40L”是指CD40L的单体形式、连同低聚形式，例如三聚CD40L。

[0170] 术语“CD40L”是指全长CD40L和可溶性片段两者，例如由蛋白水解生成的CD40L的细胞外结构域形式。在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中分别示出了人类CD40L（Swissprot：P29965）的膜合形式和可溶形式的氨基酸序列。

[0171] 以最广泛的意义使用术语“CD40L拮抗剂”或“拮抗剂”，并且包括在体内、在原位、或在体外部分地或完全地抑制、减少或钝化CD40L及其生物活性的变体的一种或多种生物活性的任何分子。例如，由于与CD40L结合，CD40L拮抗剂可以发挥作用来在体内、在体外或在原位部分地或完全地抑制、减少或钝化一个或多个CD40L分子、或一个或多个与CD40或其他靶标结合的CD40L分子的一种或多种生物活性。

[0172] 以最广泛的意义使用术语“CD40L激动剂”或“激动剂”，并且包括在体内、在原位、或在体外部分地或完全地增强、刺激或激活CD40L及其生物活性的变体的一种或多种生物活性的任何分子。例如，由于与CD40L结合，CD40L激动剂可以发挥作用来在体内、在体外或在原位部分地或完全地增强、刺激或激活一个或多个CD40L分子、或一个或多个与CD40R或其他靶标结合的CD40L分子的一种或多种生物活性。

[0173] 如在此使用，术语“晶体”是指物质的固态的一种形式，其中原子被安排为三维地周期性重复的模式，典型地形成一个晶格。

[0174] 如在此使用，术语“空间群对称性”是指将晶格的平移对称性与点群对称性合并的该晶体的整体对称性。由标识晶格群的大写字母（P、A、F等）、随后是点群符号来指定“空间群”，其中将旋转和反射元件延伸以包括螺旋轴和滑移面。要注意的是，可以通过移除空间群的胞心符号并且将所有的螺旋轴用类似的旋转轴替换并将所有的滑移面用镜平面替换来确定给定的空间群的点群对称性。空间群的点群对称性描述了其倒易晶格的真实对称性。

[0175] 如在此使用，术语“晶胞”意指在晶体中以规则重复模式安排的原子，其中最小的重复单位被叫做晶胞。可以由该晶胞的知识重建整个结构，晶胞由三个长度（a、b、和c）以及三个角度（α、β、和γ）来表征。数量a和b是该晶胞的底部的侧面的长度并且γ是这两个侧面之间的角度。数量c是该晶胞的高度。角度α和β描述了该晶胞的底部与垂直侧面之间的角度。

[0176] 如在此使用，术语“机器可读的数据存储介质”意指用机器可读的数据编码的数据存储材料，其中用使用这样的数据的指令将机器程序化并且该机器能够以所希望的格式展示数据，例如分子或分子复合物的图形化的三维表示。

[0177] 术语“X射线衍射图”意指从晶体中的分子或原子的周期性组件的X射线散射获得的图案。X射线结晶学是一种利用了X射线被晶体折射的事实的技术。X射线具有有待被-8
可比较的大小的原子的电子云散射的适当的波长（在埃范围，约10 cm）。基于从该晶体中的分子或原子的周期性组件的X射线散射获得的衍射图，可以重建电子密度。可以从衍射数据抑或从补充衍射实验中提取到额外的相位信息以完成重建（在结晶学中的相位问题）。
一个模型是渐进地建成实验的电子密度，针对数据进行精制，以产生精确的分子结构。X射线结构坐标定义空间中的点的独特构型。本领域的普通技术人员理解的是，针对一种蛋白质或蛋白质-配体复合物、或其部分的一组结构坐标定义一个相关的点集，这个点集反过来定义三维构型。可以通过一组完全不同的坐标限定相似的或相同的构型，其条件是坐标之间的距离和角度保持基本相同。此外，可以通过标量因子增加或减小坐标之间的距离，同时保持角度基本相同来确定点的构型。

[0178] 如在此使用，术语“晶体结构”是指晶体材料中的重复原子单位或分子单位的三维排列或晶格间距排列。可以通过X射线结晶方法确定晶体材料的晶体结构，参见例如Jan Drenth（简卓恩斯）的“Principles of Protein X-Ray Crystallography（蛋白质X射线结晶学原理）”，Springer Advanced Texts in Chemistry（施普林格高级文本化学），Springer Verlag（施普林格出版社），第2版，二月199，ISBN:0387985875和Alexander McPherson（亚历山大麦克弗森），Wiley-Liss（威利-丽丝）的“Introduction to Macromolecular Crystallography（大分子结晶学入门）”，2002年10月18日，ISBN:0471251224。

[0179] 术语“效应子功能”是指由抗体的Fc区（天然Fc区或氨基酸序列变体Fc区）引起的抗体或抗体片段的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）的下调；以及B细胞激活。

[0180] 术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”是指以下形式的细胞毒性，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞（例如，自然杀伤细胞（NK）、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞）上的Fc受体（FcR）上的分泌Ig与带有抗原的靶细胞特异性结合并且随后用细胞毒素杀死这些靶细胞。

[0181] 术语“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。FcR可以是一种自然序列人类FcR。FcR可以与IgG抗体（γ受体）结合并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII
子类的受体，包括这些受体的等位基因变体以及可变剪接的形式。该术语还包括新生受体FcRn。

[0182] 术语“共有序列”是指在比对多个序列以后在具体的位置处示出最常见的氨基酸的蛋白质序列。共有序列是一种表示多重序列比对的结果的方式，其中相关的序列被彼此比较。共有序列示出在一个比对中的每个位置处哪些残基是最丰富的，以及在每个位置处的变异性程度。引言

[0183] CD40L（也被称为CD154、CD40配体、gp39或TBAM）是一种33kDa的II型膜糖蛋白（Swiss-ProtAcc-No P29965）。额外地，存在更短的18kDa的CD40L可溶态（也被称为sCD40L或可溶性CD40L）。通过膜结合蛋白的蛋白水解加工产生CD40L的这些可溶态，但是这些可溶性种类的细胞活性在缺乏更高阶低聚（例如，三聚）的情况下是微弱的。

[0184] 本发明提供了一个能够与CD40L结合的重组的非天然发生的蛋白支架（Tn3支架）家族。具体地，可以使用在此描述的这些蛋白质来展示与抗体的可变区的互补决定区（“CDR”）类似的限定的环。可以使这些环经受随机化或受限的进化，以产生能够与众多的靶标化合物结合的多样性。可以将Tn3支架用作单体或可以将其组装为能够与CD40L结合的
多聚支架。

[0185] 在特定实施例中，本发明提供了用于预防、缓解、检测、诊断、或监测疾病（例如但不局限于自身免疫性疾病）的CD40L-特异性粘合剂。在其他特定实施例中，本发明的CD40L-特异性Tn3支架对于治疗自身免疫性疾病和病症是有用的。在一些实施例中，自身免疫性疾病可以包括但不局限于系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、多发性硬化（MS）、炎症性肠病（IBD）以及同种异体移植排斥。

[0186] 本发明的Tn3支架包括衍生自人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域的CD40L-特异性单体亚单位，其中至少一个非天然发生的分子内二硫键已经被工程化。组成本发明的Tn3支架的单体亚单位彼此独立地正确折叠，保留其结合特异性和亲和力，并且每种单体支架保留其功能特性。当单体亚单元被组装为高效价的多聚Tn3支架时，这些单体亚单位彼此独立地正确折叠，保留其结合特异性和亲和力，并且每种单体保留其功能特性。

[0187] 包括多于一个单体亚单位的本发明的Tn3支架可以与多个表位结合，例如(i)与单一靶标的多个表位结合，(ii)与多个靶标的单一表位结合，(iii)与位于一个靶标的不同亚单位上的多个表位结合，或(iv)与多个靶标上的多个表位结合，由此增加亲合性。

[0188] 此外，由于经由接头的多个单体之间的距离变化的可能性，多聚Tn3支架能够与表面上的多个靶分子结合（在同一细胞/表面上抑或在不同细胞/表面里）。由于其与多于一个靶标同时结合的能力，本发明的Tn3多聚支架可以用来调节多个通路、细胞表面上的交联受体，结合单独的细胞上的细胞表面受体，和/或将靶分子或细胞与底物结合。

[0189] 此外，本发明提供了亲和力成熟的支架，其中经由突变调节支架对于特定靶标的亲和力。而且，本发明提供了用于生产本发明的支架的方法、连同用于工程化具有令人希望的物理化学特性、药理学特性、或免疫学特性的支架的方法。此外，本发明提供了此类支架的用途以及用于治疗、预防、或诊断用途的方法。FnIII结构基序

[0190] 本发明的Tn3支架基于III型纤连蛋白模块（FnIII）的结构，即一种广泛发现于生命体和病毒的所有三个结构域之间并且发现于众多蛋白质种类中的结构域。在特
定实施例中，本发明的支架衍生自人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域（参见被公开为
WO2009/058379的国际申请号PCT/US2008/012398；被公开为WO2011/130324的国际申请号PCT/US2011/032184；以及被公开为WO2011130328的国际申请号PCT/US2011/032188）。

[0191] 在一个特定实施例中，本发明的Tn3支架包括一个衍生自亲本Tn3支架的CD40L-特异性单体亚单位。单体的总体三维折叠与最小的功能性抗体片段（重链的可变区（VH））的三维折叠密切相关，在骆驼和骆驼科动物（例如，美洲驼）的单域抗体中的重链的可变区包括完整的抗原识别单位。

[0192] 本发明的Tn3单体亚单位以及来自生腱蛋白C的天然FnIII结构域特征在于同一三维结构，即由六个环区连接的在一侧具有三个β链（A、B、和E）并且在另一侧具有四个β链（C、D、F、和G）的β夹层结构。根据连接至每个环的N端和C端的β链来指定这
些环区。因此，AB环位于β链A和B之间，BC环位于链B和C之间，CD环位于β链C和
D之间，DE环位于β链D和E之间，EF环位于β链E和F之间，并且FG环位于β链F和
G之间。FnIII结构域拥有耐受随机化的被暴露至溶剂的环，这些环协助能够以高亲和力与特定靶标结合的蛋白支架的不同池的产生。

[0193] 在本发明的一个方面中，使Tn3单体亚单位经受定向进化，旨在随机化与抗体可变区的互补决定区（CDR）类似的的一个或多个环。这样的一种定向进化途径导致对感兴趣的靶标（例如，CD40L）具有高亲和力的抗体样分子的产生。

[0194] 此外，在一些实施例中，可以使用在此描述的Tn3支架来展示限定的暴露的环（例如，先前被随机化的并且在靶标结合的基础上选择的环）以便指导与这样的引入的环结合的分子的进化。可以进行这种类型的选择以鉴定任何单独的CDR样环的识别模块，或可替代地用于被合并进非线性表位结合部分中的两个或全部三个CDR样环的识别。可以赋予特异性靶标结合的一组三个环（被指定为BC、DE、和FG）分别在B和C链；D和E链，以及F和Gβ链之间运行。人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域的BC、DE、和FG环分别为9个、6
个、和10个氨基酸残基长。这些环的长度落入发现于抗体重链中的同源抗原识别环的窄范围内，也就是说长度分别为7-10个、4-8个、以及4-28个氨基酸。类似地，第二组环，即AB、CD、和EF环（长度分别为7个、7个、和8个氨基酸）分别在A和Bβ链；C和Dβ链；以及E
和Fβ链之间运行。

[0195] 一旦针对与一种靶标的高亲和力结合而被随机化并被选择，Tn3单体支架中的这些环可以与靶标接触，相当于抗体中的同源CDR环的接触。因此，在一些实施例中，针对与一个或多个靶标（例如，CD40L）的高亲和力结合将AB、CD、和EF环随机化并对其进行选择。在一些实施例中，可以与BC、DE、和FG环的随机化平行地进行这一随机化和选择过程，而在其他实施例中，连续地进行这一随机化和选择过程。
CD40L-特异性单体亚单位

[0196] 本发明提供了CD40L-特异性重组的非天然发生的Tn3支架，包括被连接至多个环区的多个β链结构域，其中通过至少一个来自野生型Tn3（SEQ ID NO：3）的同源环的氨基酸的缺失、取代或添加来改变一个或多个所述环区（参见表1）。

[0197] 为了产生改进的具有新颖的结合特征的CD40L-特异性Tn3单体亚单位，使亲本Tn3经受氨基酸添加、缺失或取代。将理解的是，当比较CD40L-特异性Tn3单体亚单位
的序列与亲本Tn3的序列时，利用β链和环的相同的定义。在一些实施例中，本发明的
CD40L-特异性Tn3单体亚单位包括以下氨基酸序列：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)n KETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF、和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；并且
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。
表2：在这些研究中使用的Tn3克隆的环序列
包括具有序列CELAYGI（SEQ ID NO：14）的Cβ链的克隆，所有其他克隆包括具有序
列CELTYGI（SEQ ID NO：13）的Cβ链。
*在309家族的一些变体（例如，342）中，FG环可以被SEQ ID NO：139替代。
**在311家族的一些变体中，可以将BC环工程化以替代在位置21处的酪氨酸。在此
特别考虑了取代的氨基酸残基可以具有一个小侧链。

[0198] 在一些实施例中，本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位由以下氨基酸序列组成：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)n KETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF、和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；并且
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。

[0199] 在一个实施例中，CD40L-特异性Tn3单体支架的β链与亲本Tn3支架（SEQ IDNO：3）的β链具有至少90%序列一致性。为了计算这样的序列一致性的百分比，应用本领域已知的方法比对氨基酸序列。将序列一致性的百分比定义为(a)位于在序列比对中相同的β链中的氨基酸的数目与(b)位于β链中的氨基酸的总数之间的比率。

[0200] 在一个实施例中，AB环的序列包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：136。在另一个实施例中，CD环的序列包括SEQ ID NO：6。在另一个实施例中，EF环的序列包括SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：137。在一个实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：136组成。在另一个实施例中，CD环的序列由SEQ ID NO：6组成。在另一个实施例中，EF环的序列由SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：137组成。

[0201] 在一个实施例中，BC环的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：83、84、85、86、87、88、89、90、91、92以及93。在另一个实施例中，BC环的序列由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：由SEQ ID NO：83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92以及93。

[0202] 在一个实施例中，DE环的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：94、95、96、97以及98。在另一个实施例中，DE环的序列由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：94、95、96、97以及98。

[0203] 在一个实施例中，FG环的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：9、99、以及139。在另一个实施例中，FG环的序列由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：9、99、以及139。

[0204] 在一个实施例中，BC环的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116以及117。在另一个实施例中，BC环的序列由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、
116以及117。

[0205] 在一些实施例中，DE环的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：118、119、120、121、122、123、124、125、126、127以及128。在其他实施例中，DE环的序列由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：118、119、120、121、
122、123、124、125、126、127以及128。

[0206] 在一些实施例中，FG环的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：129和130。在其他实施例中，FG环的序列由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：129和130。

[0207] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：83，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在一些实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：83组成，DE环的序列由SEQ ID NO：94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0208] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：83，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：99。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO：83组成，DE环的序列由SEQ ID NO：94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：99组成。

[0209] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：84，DE环的序列包括SEQ ID NO：95，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：84组成，DE环的序列由SEQ ID NO：95组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0210] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：85，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：85组成，DE环的序列由SEQ ID NO：94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0211] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：86，DE环的序列包括SEQ ID NO：96，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：86组成，DE环的序列由SEQ ID NO：96组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0212] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：87，DE环的序列包括SEQ ID NO：97，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：87组成，DE环的序列由SEQ ID NO：97组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0213] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：88，DE环的序列包括SEQ ID NO：95，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：88组成，DE环的序列由SEQ ID NO：95组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0214] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：89，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：89组成，DE环的序列由SEQ ID NO：94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0215] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：90，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：90组成，DE环的序列由SEQ ID NO：94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0216] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：91，DE环的序列包括SEQ ID NO：95，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：91组成，DE环的序列由SEQ ID NO：95组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0217] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：92，DE环的序列包括SEQ ID NO：98，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：92组成，DE环的序列由SEQ ID NO：98组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0218] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：93，DE环的序列包括SEQ ID NO：94，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID
NO：93组成，DE环的序列由SEQ ID NO：94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：9或139
组成。

[0219] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：168，DE环的序列包括SEQ ID NO：169，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：170。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO：
168组成，DE环的序列由SEQ ID NO：169组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：170组成。

[0220] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：100，DE环的序列包括SEQ ID NO：118，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：129。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO：
100组成，DE环的序列由SEQ ID NO：118组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：129组成。

[0221] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：101，DE环的序列包括EQ ID NO：119，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：101组成，DE环的序列由EQ ID NO：119组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0222] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：102，DE环的序列包括EQ ID NO：120，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：102组成，DE环的序列由EQ ID NO：120组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0223] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：103，DE环的序列包括EQ ID NO：121，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：103组成，DE环的序列由EQ ID NO：121组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0224] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：104，DE环的序列包括EQ ID NO：122，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：104组成，DE环的序列由EQ ID NO：122组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0225] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：105，DE环的序列包括EQ ID NO：121，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：105组成，DE环的序列由EQ ID NO：121组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0226] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：106，DE环的序列包括EQ ID NO：123，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：106组成，DE环的序列由EQ ID NO：123组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0227] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：107，DE环的序列包括EQ ID NO：123，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：107组成，DE环的序列由EQ ID NO：123组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0228] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：108，DE环的序列包括EQ ID NO：118，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：108组成，DE环的序列由EQ ID NO：118组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0229] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：109，DE环的序列包括EQ ID NO：123，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：109组成，DE环的序列由EQ ID NO：123组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0230] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：110，DE环的序列包括EQ ID NO：121，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：110组成，DE环的序列由EQ ID NO：121组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0231] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：111，DE环的序列包括EQ ID NO：123，并且FG环的序列包括EQ ID NO：130。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：111组成，DE环的序列由EQ ID NO：123组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：130组成。

[0232] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：108，DE环的序列包括EQ ID NO：121，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：108组成，DE环的序列由EQ ID NO：121组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0233] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：112，DE环的序列包括EQ ID NO：124，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：112组成，DE环的序列由EQ ID NO：124组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0234] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：113，DE环的序列包括EQ ID NO：125，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：113组成，DE环的序列由EQ ID NO：125组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0235] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：114，DE环的序列包括EQ ID NO：118，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：114组成，DE环的序列由EQ ID NO：118组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0236] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：115，DE环的序列包括EQ ID NO：126，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：115组成，DE环的序列由EQ ID NO：126组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0237] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：116，DE环的序列包括EQ ID NO：127，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：116组成，DE环的序列由EQ ID NO：127组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0238] 在一些实施例中，AB环的序列包括EQ ID NO：136，BC环的序列包括EQ ID NO：117，DE环的序列包括EQ ID NO：128，并且FG环的序列包括EQ ID NO：129。在其他实施例中，AB环的序列由EQ ID NO：136组成，BC环的序列由EQ ID NO：117组成，DE环的序列由EQ ID NO：128组成，并且FG环的序列由EQ ID NO：129组成。

[0239] 在一些实施例中，BC环的序列包括SEQ ID NO：174，DE环的序列包括SEQ ID NO：175，并且FG环的序列包括SEQ ID NO：177。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO：
174组成，DE环的序列由SEQ ID NO：175组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO：177组成。

[0240] 在一些实施例中，该CD40L-特异性单体亚单位包括一个选自选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42以及146。在其他实施例中，该CD40L-特异性单体亚单位由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42以及146。

[0241] 在一些实施例中，该CD40L-特异性单体亚单位包括SEQ ID NO：28或146。在其他实施例中，该CD40L-特异性单体亚单位由SEQ ID NO：28或146组成。

[0242] 在一些实施例中，本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位包括以下氨基酸序列：IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9H X10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸（S）或丝氨酸（L）；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸（H）、异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）或色氨酸（W）；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸（E）、亮氨酸（L）、谷氨酰胺（Q）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）或天冬酰胺（N）；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、组氨酸（H）、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸（G）、色氨酸（W）或缬氨酸（V）；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、甲硫氨酸（M）或组氨酸（H）；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸（W）或组氨酸（H）；并且
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸（R）或丝氨酸（S）。

[0243] 在一些实施例中，本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位由以下氨基酸序列组成：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9H X10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸（S）或丝氨酸（L）；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸（H）、异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）或色氨酸（W）；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸（E）、亮氨酸（L）、谷氨酰胺（Q）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）或天冬酰胺（N）；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、组氨酸（H）、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸（G）、色氨酸（W）或缬氨酸（V）；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、甲硫氨酸（M）或组氨酸（H）；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸（W）或组氨酸（H）；并且
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸（R）或丝氨酸（S）。

[0244] 在一些实施例中，该CD40L-特异性单体亚单位包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、以及82。在一些实施例中，该CD40L-特异性单体亚单位由一个选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、
76、78、80、以及82。

[0245] 在一些实施例中，本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位包括以下氨基酸序列：IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDL X12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸（K）或谷氨酸（E）；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸（S）、亮氨酸（L）、丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丝氨酸（S）；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、丙氨酸（A）或组氨酸（H）；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺（N）、天冬氨酸（D）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸（H）、脯氨酸（P）、丝氨酸（S）、亮氨酸（L）或天冬氨酸（D）；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸（G）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸（S）、天冬酰胺（N）、谷氨酸（E）、天冬酰胺（R）或天冬氨酸（D）；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸（P）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丙氨酸（A）或没有氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸（I）或没有氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸（E）或赖氨酸（K）；并且
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸（S）或天冬酰胺(N）。

[0246] 在一些实施例中，本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位由以下氨基酸序列组成：
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDL X12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸（K）或谷氨酸（E）；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸（S）、亮氨酸（L）、丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丝氨酸（S）；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、丙氨酸（A）或组氨酸（H）；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺（N）、天冬氨酸（D）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸（H）、脯氨酸（P）、丝氨酸（S）、亮氨酸（L）或天冬氨酸（D）；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸（G）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸（S）、天冬酰胺（N）、谷氨酸（E）、天冬酰胺（R）或天冬氨酸（D）；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸（P）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丙氨酸（A）或没有氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸（I）或没有氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸（E）或赖氨酸（K）；并且
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸（S）或天冬酰胺(N）。

[0247] 在一些实施例中，CD40L-特异性单体支架包括一个Tn3模块，其中一个或多个β链包括至少一个氨基酸取代，除了在C和Fβ链（分别是SEQ ID NO：13或14；和SEQ ID NO：17）中的半胱氨酸残基可以不被取代之外。

[0248] 可以针对长度和/或序列多样性将连接CD40L-特异性单体亚单位的不同β链的环随机化。在一个实施例中，CD40L-特异性单体亚单位具有至少一个长度和/或序列多样性被随机化的环。在一个实施例中，CD40L-特异性单体亚单位的至少一个环、至少两个环、至少三个环、至少四个环、至少五个环或至少六个环的长度和/或序列多样性被随机化。在一个实施例中，CD40L-特异性单体亚单位的至少一个环保持不变，同时至少一个额外的环的长度和/或序列多样性被随机化。在另一个实施例中，环AB、CD、和EF中的至少一个、至少两个、或全部三个保持不变，同时环BC、DE、和FG中的至少一个、至少两个、或全部三个的长度或序列多样性被随机化。在另一个实施例中，环AB、CD、和EF中的至少一个、至少两个、或至少全部被随机化，同时环BC、DE、和FG中的至少一个、至少两个、或全部三个的长度或序列多样性被随机化。在又另一个实施例中，环AB、CD、EF、BC、DE、以及FG中的至少一个环、至少两个环、至少三个环、至少4个环、至少五个环、或全部六个环的长度或序列多样性被随机化。

[0249] 在一些实施例中，在一个环内的一个或多个残基保持不变，同时其他残基的长度和/或序列多样性被随机化。在一些实施例中，在一个环内的一个或多个残基保持为预先确定的并且有限数目的不同的氨基酸，同时其他残基的长度和/或序列多样性被随机化。因此，本发明的CD40L-特异性单体亚单位可以包括一个或多个具有简并的共有序列的环
和/或一个或多个不变的氨基酸残基。

[0250] 在一个实施例中，本发明的CD40L-特异性单体亚单位包括一个被随机化的AB环。在另一个实施例中，本发明的CD40L-特异性单体亚单位包括一个被随机化的BC环。在一
个实施例中，本发明的CD40L-特异性单体亚单位包括一个被随机化的CD环。在一个实施
例中，本发明的CD40L-特异性单体亚单位包括一个被随机化的DE环。在一个实施例中，本发明的CD40L-特异性单体亚单位包括一个被随机化的EF环。

[0251] 在某些实施例中，本发明的CD40L-特异性单体亚单位包括一个被保持为具有至少一个比人类生腱蛋白C的第三FnIII结构域的同源FG环短的氨基酸残基并且在一个或
多个位置处被进一步随机化的FG环。

[0252] 在具体实施例中，环BC、DE、和FG中至少之一被随机化，其中Aβ链包括SEQ ID NO：10或11，Bβ链包括SEQ ID NO：12，Cβ链包括SEQ ID NO：13或14，Dβ链包括SEQ ID NO：15，Eβ链包括SEQ ID NO：16，Fβ链包括SEQ ID NO：17，并且Gβ链包括SEQ ID NO：18，AB环包括SEQ ID NO：4或136，CD环包括SEQ ID NO：6并且EF环包括SEQ ID NO：8或137。

[0253] 在其他具体实施例中，环AB、CD、和EF中至少之一被随机化，其中Aβ链包括SEQ ID NO：10或11，Bβ链包括SEQ ID NO：12，Cβ链包括SEQ ID NO：13或14，Dβ链包括SEQ ID NO：15，Eβ链包括SEQ ID NO：16，Fβ链包括SEQ ID NO：17，并且Gβ链包括SEQ ID NO：18，BC环包括SEQ ID NO：5，DE环包括SEQ ID NO：7并且FG环包括SEQ ID NO：9或139。
增强的支架稳定性

[0254] 可以通过许多不同的途径增加本发明的Tn3支架的稳定性。在一些实施例中，可以通过延伸N端和/或C端区来稳定本发明的Tn3支架。可以将N端和/或C端区延伸1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸。在其他实施例中，可以通过引入增加血清半衰期的改变来稳定本发明的Tn3支架，如在此所述。在仍另一个实施例中，本发明的Tn3支架包括至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代，以稳定该支架的疏水核。

[0255] 如在国际专利申请号PCT/US2011/032184中所披露，可以通过工程化非天然的二硫键来有效地稳定本发明的Tn3支架。在一些实施例中，本发明的支架包括非天然发生的二硫键，如在PCT申请号：WO2009/058379中所描述。可以利用生物信息学途径来鉴定适于工程化二硫键的候选位置。

[0256] 在一个实施例中，本发明的Tn3单体亚单位包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个非天然发生的分子内二硫键。在一个实施例中，本发明的Tn3单体亚单位包括至少一个非天然发生的分子内二硫键，其中所述至少一个非天然发生的二硫键稳定该单体。在又一个实施例中，本发明的Tn3支架包括至少一个非天然发生的二硫键，其中这个键位于两个不同的单体或多聚体Tn3支架之间，即这个二硫键是一个分子间二硫键。例如，二硫键可以连接不同的支架（例如，两个CD40L-特异性单体支架）、一个Tn3支架和一个接头、一个Tn3支架和一个Fc结构域、或一个Tn3支架和一个抗体或其片段。

[0257] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架包括至少一个非天然发生的分子间二硫键，该分子间二硫键连接一个Tn3单体亚单位和一个分离的异源部分、一个Tn3单体亚单位和一个融合至或共轭至同一Tn3支架的异源部分、或一个Tn3单体亚单位和一个或融合至或
共轭至不同Tn3支架的异源部分。

[0258] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架包括一个形成具有至少2个、至少3个、至少4个或更多个单体亚单位的Tn3多聚支架的二硫键。

[0259] 在另一个实施例中，本发明的Tn3支架可以包括N端和/或C端区的延伸。在一个实施例中，本发明的Tn3支架可以包括一个用于增加血清半衰期的改变，如在此所述。在又一个实施例中，本发明的支架包括至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代，以稳定该支架的疏水核。
稳定性测量

[0260] 可以通过本领域熟知的技术容易地测量分离的或作为多聚Tn3支架的部分的本发明的Tn3单体亚单位的稳定性，例如热变性（Tm）和离液变性（例如用尿素、或胍盐处理）、蛋白酶处理（例如用嗜热菌蛋白酶处理）或另一种领域接受的方法，以确定蛋白质稳定性。
用于测量蛋白质稳定性的技术的综述可以发现于例如约翰威利父子出版公司（John Wiley and Sons），2007的“Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学当前方案）”和“Current Protocols in Protein Science（分子蛋白质科学当前方案）”中。
多聚体Tn3支架

[0261] 本发明的一个方面提供了多聚体Tn3支架，这些多聚体Tn3支架包括至少两个一前一后连接的本发明的Tn3单体亚单位，并且其中至少一个单体是CD40L-特异性单体亚单位。可以将这样的多聚体Tn3支架组装为多种形式。在一个具体方面中，本发明提供了多聚体Tn3支架，其中至少两个CD40L-特异性单体亚单位经由一个肽接头被一前一后地连接。
在一些实施例中，这些多聚体Tn3支架展示出靶标结合的效价和/或亲合性、或该一种或多种靶标的其他作用的增加。在一些实施例中，当多个单体亚单位与同一靶标结合时，靶标结合的效价的和/或亲合性的增加得以实现。在一些实施例中，效价的增加改善对该靶标的特定作用，例如增加靶蛋白的二聚化。

[0262] 在一个特定实施例中，本发明的多体Tn3支架包括至少两个一前一后连接的CD40L-特异性单体亚单位，其中每个CD40L-特异性单体亚单位与至少一个靶标结合，并且其中每个CD40L-特异性单体亚单位包括多个被连接至多个环区的β链，其中至少一个环
是亲本Tn3支架（SEQ ID NO：3）中的同源环的非天然发生的变体。

[0263] 在一个实施例中，例如通过直接连接CD40L-特异性单体亚单位、或通过包含一个接头（例如，肽接头）经由CD40L-特异性单体亚单位之间的共价结合产生多聚体Tn3支架。在具体实例中，通过构建编码CD40L-特异性单体亚单位的融合基因，或可替代地通过将半胱氨酸残基的密码子工程化进入CD40L-特异性单体亚单位并且允许在表达产物之间形成
二硫键来产生共价键合的Tn3支架。

[0264] 在一个实施例中，本发明的多聚体Tn3支架包括被直接彼此连接而没有任何额外的介入氨基酸的至少两个CD40L-特异性单体亚单位。在另一个实施例中，本发明的多聚体Tn3支架包括经由一个接头（例如，肽接头）而被一前一后连接的至少两个CD40L-特异性单体亚单位。

[0265] 在一个特定实施例中，本发明的多聚体Tn3支架包括经由一个肽接头被一前一后连接的至少两个CD40L-特异性单体亚单位，其中该肽接头包括1个至约1000个、或1个至约500个、或1个至约250个、或1个至约100个、或1个至约50个、或1个至约25个氨基
酸。在一个特定实施例中，该多聚体Tn3支架包括经由一个肽接头被一前一后连接的至少两个CD40L-特异性单体亚单位，其中该肽接头包括1个至约20个、或1个至约15个、或1
个至约10个、或1个至约5个氨基酸。

[0266] 在一个特定实施例中，该多聚体Tn3支架包括经由一个接头（例如，肽接头）被一前一后连接的至少两个CD40L-特异性单体亚单位，其中该接头是一个功能部分。将基于该多聚体Tn3支架的所希望的功能和/或特征来选择该功能部分。例如，可以将对于纯化有用的功能部分（例如，组氨酸标签）用作接头。作为接头有用的功能部分包括但不局限于：聚乙二醇（PEG）、细胞毒剂、放射性核素、显像剂、生物素、二聚化结构域、人血清白蛋白（HSA）或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非Tn3支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子、以及类似物。在下文披露了可以被用作接头的特定的肽接头以及功能部分。

[0267] 在特定实施例中，这个功能部分是一种免疫球蛋白或其片段。在一些实施例中，这种免疫球蛋白或其片段包括一个Fc结构域。在一些实施例中，这一Fc结构域不能诱导至少一种FcγR-介导的效应子功能，例如ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）。在本领域中已知可以改变Fc结构域，以减少或消除至少一种FcγR-介导的效应子功能，参见例如美国专利号5,624,821和6,737,056。

[0268] 在一些实施例中，该多聚体Tn3支架包括经由一个或多个接头连接的至少两个CD40L-特异性单体亚单位，其中在每个CD40L-特异性单体亚单位之间施置的接头可以是
相同的接头或不同的接头。在一些实施例中，一种接头可以包括多个接头，这多个接头可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施例中，当多个接头被串联时，这些接头中的一些或全部可以是功能部分。
支架结合化学计量

[0269] 在一些实施例中，单体或多聚体Tn3支架包括一个对不同表位具有特异性的CD40L-特异性单体亚单位，这些不同的表位可以是单一CD40L分子上的或不同CD40L靶分
子上的不同表位。在一些实施例中，多聚体Tn3支架可以包括以下CD40L-特异性单体亚单位，其中每个亚单位靶向一个或多个CD40L分子上的一个或多个不同的表位。

[0270] 在其他实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与同一CD40L分子上的两个或更多个不同表位结合。在一些实施例中，这些不同的表位是不重叠的表位。在其他实施例中，这些不同的表位是重叠的表位。

[0271] 在又另一个具体实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与一个CD40L分子上的一个或多个表位结合并且额外地与第二个CD40L分子上的一个或多个表位结合。在一些实施例中，这些不同的靶分子是低聚复合物（例如，三聚体CD40L复合物）的一部分。

[0272] 在仍另一个具体实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与CD40L三聚体上的单一表位结合。在仍另一个实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与至少两个CD40L三聚体上
的同一表位结合。

[0273] 在某些实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与相邻细胞表面上的CD40L分子的两个或更多个拷贝的同一表位结合。在某些实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与溶液中的CD40L分子的两个或更多个拷贝的同一表位结合。在一些实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与具有相同或不同结合亲和力和/或亲合性的CD40L上的同一表位或不同表位结
合。

[0274] 在另一个实施例中，单体或多聚体Tn3支架可以与CD40L的一个或多个拷贝上的表位结合并且实现或增强（例如，协同地）对该靶标的所希望的作用，例如阻止与受体结合或阻止低聚化。

[0275] 此外，当本发明的单体或多聚体Tn3支架包括多个CD40L-特异性单体亚单位（例如不同单体），其中的每个单体靶向CD40L上的不同表位时，可以根据某种模式或特殊的方向排列此类单体亚单位，以实现或增强某一种生物效应。可以使用本领域已知的方法组装单体亚单位的这样的组合并且随后对其进行评估。融合

[0276] 本发明提供了以下Tn3支架，其中至少一个CD40L-特异性单体亚单位可以被融合至一个异源部分。在此背景下，使用该异源部分不是来作为间隔区连接支架而是可以为该Tn3支架提供额外的官能度。在一些实施例中，异源部分还可以作为接头而发挥作用。本发明涵盖共轭至或融合至一个或多个异源部分的Tn3支架的用途，这些异源部分包括但不局限于肽、多肽、蛋白质、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、以及有机分子。因此，本发明提供了包括一个或多个CD40L-特异性Tn3单体的多肽，单体包括但不局限于在此描述的融合蛋白。

[0277] 本发明涵盖重组地融合至或化学地共轭至异源蛋白质或多肽或其片段的Tn3支架的用途。共轭包括共价共轭和非共价共轭两者。在一些实施例中，Tn3支架可以被融合至或化学地共轭至具有至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少200个、至少300个、至少500个、或至少1000个氨基酸的多肽，以产生融合蛋白。

[0278] Tn3支架与一个或多个异源部分的融合或共轭可以是直接的，即无需在Tn3支架与异源部分之间施置接头，或可以经由一个或多个在此描述的接头序列。在一些实施例中，可以使用支架通过将该Tn3支架融合至或共轭至对靶细胞中的具体细胞表面受体具有特
异性的抗体来将异源多肽体外地或体内地靶向具体的细胞类型。

[0279] 还可以使用本领域已知的方法将融合至或共轭至异源多肽的Tn3支架用于体外免疫测定以及纯化方法中。参见例如国际公开号WO93/21232；欧洲专利号EP439,095；
Naramura（那拉穆拉）等人，Immunol.Lett.（免疫学快报）39:91-99，1994；美国专利号
5,474,981；Gillies（吉利斯）等人，PNAS89:1428-1432，1992；以及Fell（菲尔）等人，J.Immunol.（免疫学杂志）146:2446-2452，1991，将其通过引用以其全文结合。

[0280] 在一些实施例中，可以通过将支架与免疫球蛋白或其结构域融合或共轭而将Tn3支架与人类免疫应答整合在一起，这些免疫球蛋白或其结构域包括但不局限于IgG的恒定区（Fc），经由通过N端或C端。类似地，可以使用在Tn3支架与补体蛋白（例如CIq）之间的融合物来靶向细胞。

[0281] 不同公开物描述了用于获得生理学上有活性的分子的方法，通过向这些分子中引入FcRn-结合多肽（参见例如WO97/43316；美国专利号5,869,046；美国专利号5,747,035；WO96/32478；以及WO91/14438）、通过将这些分子与保留FcRn-结合亲和力但是对其他Fc受体的亲和力已经被大大减小的抗体融合（参见例如WO99/43713）、或通过将这些分子与抗体的FcRn结合结构域融合（参见例如WO00/09560；美国专利号4,703,039）来修改这些分子的半衰期。还可以在美国专利号7,083,784中发现增加生理学上有活性的分子的半衰
期的具体技术和方法。确切地，在此考虑了可以将Tn3支架融合至来自IgG的Fc区，其中
该Fc区包括氨基酸残基突变M252Y/S254T/T256E或H433K/N434F/Y436H，其中根据卡巴特
（Kabat）编号模式来指定氨基酸位置。在此确切考虑了Tn3支架与不能够诱导ADCC的Fc
结构域变体的融合。

[0282] 在一些实施例中，可以通过将Tn3支架与本质上非结构化的重组多肽（例如，TM
XTEN 多肽）基因地融合或通过与聚乙二醇（PEG）共轭来增加Tn3支架的半衰期。

[0283] 在一些实施例中，可以将Tn3支架与增加或延长体内血清半衰期的分子融合。在一些实施例中，可以将支架与白蛋白（例如人血清白蛋白（HSA））、其新生儿Fc受体（FcRn）结合片段、PEG、多糖、抗体、补体、血红蛋白、结合肽、脂蛋白以及其他因子共轭，以增加其在血流中的半衰期和/或其组织渗透。可以通过标准技术产生任何这些融合物，例如通过由使用公众可获得的基因序列构建的重组融合基因表达融合蛋白。

[0284] 在一些实施例中，可以通过共轭至或融合至一种HSA变体来改善Tn3支架的一种特性，该HSA变体即是衍生自包括至少一个氨基酸取代、缺失、或序列平截的全长HSA（SEQ ID NO：139）的分子。

[0285] 在一些实施例中，通过与HSA变体共轭而改善的特性是血浆半衰期。Tn3支架的血浆半衰期的改善可以是由于以下特性的改变，例如血浆半衰期的增加或减少、或其他药物代谢动力学参数的变化。在一些实施例中，该HSA变体是一种衍生自全长HSA（SEQ ID NO：138）的突变体。在一个具体实施例中，该HSA变体在位置34处包括一个半胱氨酸至丝氨酸的取代（SEQ ID NO：133）。可以用来修饰Tn3支架的血浆半衰期的HSA变体描述于例如国际公布WO2011/103076和WO2011/051489中，将二者通过引用以其全文而结合。在一
些实施例中，通过将Tn3支架与在HSA的结构域III中包括至少一个氨基酸取代的HSA变
体融合来增加本发明的Tn3支架的血浆半衰期。

[0286] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架包括一个HSA变体，该HSA变体包括全长成熟的HSA（SEQ ID NO：138）或其片段的序列，除了至少一个在选自下组的位置处的氨基酸取代以外，该组由以下各项组成：407、415、463、500、506、508、509、511、512、515、516、521、
523、524、526、535、550、557、573、574、以及580，相对于全长成熟的HSA的位置编号；其中至少一个氨基酸取代不包括在位置573处的赖氨酸（K）被取代为谷氨酸（E），并且其中该Tn3支架具有比未共轭至该HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期长的血浆半衰期。

[0287] 在一些其他实施例中，相对于在全长成熟HSA中的位置进行编号，至少一个氨基酸取代在选自下组的位置，该组由以下各项组成：463、508、523、以及524，其中该Tn3支架具有比未共轭至该HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期长的血浆半衰期。

[0288] 在其他实施例中，本发明的Tn3支架包括一个HSA变体，该HSA变体包括全长成熟HSA（SEQ ID NO：133或138）或其片段的序列，相对于在全长成熟HSA中的位置进行编号，除了至少一个选自下组的氨基酸取代以外，该组由以下各项组成：(a)将位置407处的亮氨酸（L）取代为天冬酰胺（N）或酪氨酸（Y）；
(b)将位置415处的缬氨酸（V）取代为苏氨酸（T）；
(c)将位置463处的亮氨酸（L）取代为天冬酰胺（N）；
(d)将位置500处的赖氨酸（K）取代为精氨酸（R）；
(e)将位置506处的苏氨酸（T）取代为酪氨酸（Y）；
(f)将位置508处的苏氨酸（T）取代为精氨酸（R）；
(g)将位置509处的苯丙氨酸（F）取代为甲硫氨酸（M）或色氨酸（W）；
(h)将位置511处的丙氨酸（A）取代为苯丙氨酸（F）；
(i)将位置512处的天冬氨酸（D）取代为酪氨酸（Y）；
(j)将位置515处的苏氨酸（T）取代为谷氨酰胺（Q）；
(k)将位置516处的亮氨酸（L）取代为苏氨酸（T）或色氨酸（W）；
(l)将位置521处的精氨酸（R）取代为色氨酸（W）；
(m)将位置523处的异亮氨酸（I）取代为天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、甘氨酸（G）、赖氨酸（K）、或精氨酸（R）；
(n)将位置524处的赖氨酸（K）取代为亮氨酸（L）；
(o)将位置526处的谷氨酰胺（Q）取代为甲硫氨酸（M）；
(p)将位置535处的组氨酸（H）取代为脯氨酸（P）；
(q)将位置550处的天冬氨酸（D）取代为谷氨酸（E）；
(r)将位置557处的赖氨酸（K）取代为甘氨酸（G）；
(s)将位置573处的赖氨酸（K）取代为苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）、脯氨酸（P）、色氨酸（W）,或酪氨酸（Y）；
(t)将位置574处的赖氨酸（K）取代为天冬酰胺（N）；
(u)将位置580处的谷氨酰胺（Q）取代为赖氨酸（K）；以及
(v)两个或更多个所述取代的组合，
其中所述Tn3支架具有比未共轭至所述HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期更长的血浆
半衰期。

[0289] 在一些实施例中，该Tn3支架包括一个HSA变体，该HSA变体包括全长成熟HSA（SEQ ID NO：133或138）或其片段的序列，相对于在全长成熟HSA中的位置进行编号，除了至少一个选自下组的氨基酸取代以外，该组由以下各项组成：
(a)将位置463处的亮氨酸（L）取代为天冬酰胺（N）；
(b)将位置508处的苏氨酸（T）取代为精氨酸（R）；
(c)将位置523处的异亮氨酸（I）取代为天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、
甘氨酸（G）、赖氨酸（K）、或精氨酸（R）；
(d)将位置524处的赖氨酸（K）取代为亮氨酸（L）；以及
(e)两个或更多个所述取代的组合，
其中所述Tn3支架具有比未共轭至所述HSA变体的Tn3支架的血浆半衰期更长的血浆
半衰期。

[0290] 此外，可以将本发明的Tn3支架融合至标记物序列（例如肽），以协助纯化。在一些实施例中，标记物氨基酸序列是多组氨酸肽（His-标签），例如八-组氨酸-标签（His-8-标签）或六-组氨酸-标签（His-6-标签），例如在pQE表达载体（凯捷公司（QIAGEN,Inc.），9259伊顿大街，查茨沃思庄园（Chatsworth），加州，91311）提供的标签，在其他载体中，许多标签是可商购的。如在Gentz（根茨）等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国国家科学院论文集）86:821-824，1989中所描述，例如，多组氨酸为融合蛋白的纯化提供便利。可用于纯化的其他台标签包括但不局限于对应于衍生自流感血凝素血凝素蛋白的表位的（“HA”）标签（参见例如，Wilson（威尔逊）等人，Cell（细胞）37:767，1984）、FLAG标签、Strep-标签、myc-标签、V5标签、GFP-标签、AU1-标签、AU5-标签、ECS-标签、GST-标签、或OLLAS标签。

[0291] 可以通过基因改组（gene-shuffling）、基序改组（motif-shuffling）、外显子改组、和/或密码子改组（统称为“DNA改组”）技术产生包括本发明的Tn3支架的额外的融合蛋白。

[0292] 可以采用DNA改组来改变Tn3支架对靶标的作用（例如，产生具有更高亲和力和更低离解速率的支架）。在重组之前，可以通过随机诱变经由易错PCR、随机核苷酸插入、以及其他方法改变Tn3支架。可以将一个或多个编码与特定靶标结合的支架的多核苷酸的部分与一个或多个异源分子的一种或多种组分、基序、部分、部件、结构域、片段等重组。抗体和Fc结构域融合

[0293] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架包括一个融合至抗体（例如，IgG）的结构域或片段（包括但不局限于Fc结构域）的CD40L-特异性单体亚单位。

[0294] 在一些实施例中，仅仅一个CD40L-特异性单体亚单位被共轭至或融合至抗体的结构域或片段。例如，可以将单一的CD40L-特异性单体亚单位融合至抗体的结构域或片
段（例如，抗体的重链或轻链）的多肽的N端。在其他实施例中，可以通过将一个或多个CD40L-特异性单体亚单位与抗体的结构域或片段（例如，抗体的的重链和/或轻链、或Fc结构域）的多肽的N端和/或C端融合或共轭来创建Tn3支架。

[0295] 在一些实施例中，一些或全部融合至抗体的结构域或片段的CD40L-特异性单体亚单位是相同的。在一些其他实施例中，一些或全部融合至抗体的结构域或片段的
CD40L-特异性单体亚单位是不同的。

[0296] 在一个特定实施例中，本发明的Tn3支架包括一个融合至Fc结构域的CD40L-特异性单体亚单位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架包括至少两个融合至Fc结构域的
CD40L-特异性单体亚单位。在一个特定实施例中，两个融合至Fc结构域的CD40L-特异性
单体亚单位是相同的。在一个特定实施例中，两个融合至Fc结构域的CD40L-特异性单体
亚单位是不同的。在一个特定实施例中，两个融合至Fc结构域的CD40L-特异性单体亚单
位一前一后地彼此连接，并且一个CD40L-特异性单体亚单位被融合至该Fc结构域。

[0297] 在一些实施例中，可以通过使用偏好形成异源二聚体的Fc结构域突变来二聚化本发明的Tn3支架。在本领域中已知的是，Fc区的变体（例如，氨基酸取代和/或添加和/或缺失）增强或降低抗体的效应子功能并且可以改变该抗体的药物代谢动力学特性（例如半衰期）。因此，在某些实施例中，本发明的Tn3支架包括一个或多个含有被改变的Fc区的Fc结构域，其中在Fc区中已经做出了一个或多个改变，以改变该Tn3支架的功能特性和/
或药物代谢动力学特性。在某些实施例中，本发明的Tn3支架包括一个或多个含有被改变的Fc区的Fc结构域，其中在Fc区中已经做出了一个或多个改变，以减少或消除至少一种
Fc R-介导的效应子功能。

[0298] 还已知的是，可以修饰Fc区的糖基化，以增加或减少效应子功能和/或抗炎性活性。因此，在一个实施例中，本发明的Tn3支架包括一个具有改变的氨基酸残基的糖基化的Fc区，以便改变Tn3支架的细胞毒特性和/或抗炎性特性。Tn3支架拓扑结构

[0299] 本发明的Tn3支架能以任何适合的空间排布融合至Fc结构域、抗体轻链、以及抗体重链的C端。参加例如，国际公开PCT/US2011/032184，得到预期的支架拓扑结构的详细说明。本发明的支架的产生

[0300] 可以将在此描述的Tn3支架在任何用于演化出新的或改善的靶标结合蛋白的技术中使用。在一个具体实例中，该靶标被固定在固相支持体（例如柱树脂或微量滴定板孔）上，并且该靶标与基于候选支架的结合蛋白的文库相接触。这样的一个文库可以由通过CDR样环的序列和/或长度的随机化由Tn3支架构建的克隆组成。

[0301] 在此方面中，细菌噬菌体（噬菌体）展示是一种熟知的技术，该技术允许人们筛选大的寡肽文库，以鉴定那些文库中能够与一种靶标特异性结合的一个或多个成员。噬菌体展示是一种将变体多肽展示为在细菌噬菌体颗粒的表面上的外壳蛋白的融合蛋白的技术（Scott（斯科特），J.K.和Smith（史密斯），G.P.（1990）Science（科学）249:386）。可以采用生物信息学途径确定自然发生的FnIII结构域的环长和多样性偏好。使用这一分析，可以采用环长和序列多样性的偏好研发一个“受限随机化”途径。在这一受限随机化中，将相对环长和序列偏好合并进文库策略的研发中。将环长和序列多样性分析整合进文库研发中导致受限随机化（即被随机化的环中的某些位置受限于可以在那一位置存在哪种氨基酸）。

[0302] 本发明还提供了包括具有非天然发生的Tn3支架的多样群体的重组文库。在一个实施例中，这些文库包括非天然发生的Tn3支架，这些支架包括多个被连接至多个环区的β链结构域，其中一个或多个所述环通过至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而变化。在一个具体实施例中，这些文库包括衍生自野生型Tn3支架的Tn3支架。

[0303] 如以上详细说明的，可以将连接这些支架的不同β链的环的长度和/或序列多样性随机化。在一个实施例中，本发明的这些文库包括具有长度和/或序列多样性被随机化的的至少一个环的Tn3支架。在一个实施例中，这些Tn3支架的至少一个环、至少两个环、至少三个环、至少四个环、至少五个环或至少六个环的长度和/或序列多样性被随机化。在一个实施例中，至少一个环保持不变，同时至少一个另外的环的长度和/或序列多样性被随机化。在另一个实施例中，环AB、CD、和EF中的至少一个、至少两个、或全部三个保持不变，同时环BC、DE、和FG中的至少一个、至少两个、或全部三个的长度或序列多样性被随机化。在另一个实施例中，环AB、CD、和EF中的至少一个、至少两个、或至少全部被随机化，同时环BC、DE、和FG中的至少一个、至少两个、或全部三个的长度或序列多样性被随机化。

[0304] 在一个特定实施例中，本发明的这些文库包括FnIII支架，其中Aβ链包括SEQ ID NO：10或11，Bβ链包括SEQ ID NO：12，Cβ链包括SEQ ID NO：13或14，Dβ链包括SEQ ID NO：15，Eβ链包括SEQ ID NO：16，Fβ链包括SEQ ID NO：17，并且Gβ链包括SEQ ID NO：18。

[0305] 在一个特定实施例中，本发明的这些文库由FnIII支架，其中Aβ链由SEQ ID NO：10或11组成，Bβ链由SEQ ID NO：12组成，Cβ链由SEQ ID NO：13或14组成，Dβ链由
SEQ ID NO：15组成，Eβ链由SEQ ID NO：16组成，Fβ链由SEQ ID NO：17组成，并且Gβ链由SEQ ID NO：18组成。

[0306] 在一个特定实施例中，本发明的这些文库基本由FnIII支架，其中Aβ链基本由SEQ ID NO：10或11组成，Bβ链基本由SEQ ID NO：12组成，Cβ链基本由SEQ ID NO：13或14组成，Dβ链基本由SEQ ID NO：15组成，Eβ链基本由SEQ ID NO：16组成，Fβ链基本由SEQ ID NO：17组成，并且Gβ链基本由SEQ ID NO：18组成。

[0307] 如以上详细说明的，在一个环内的一个或多个残基可以保持不变，同时其他残基的长度和/或序列多样性被随机化。可任选地或可替代地，在一个环内的一个或多个残基可以保持为预先确定的并且有限数目的不同的氨基酸，同时其他残基的长度和/或序列多样性被随机化。因此，本发明的文库包括以下Tn3支架，这些支架可以包括一个或多个具有简并的共有序列的环和/或一个或多个不变的氨基酸残基。在另一个实施例中，本发明的这些文库包括具有被随机化的BC环的Tn3支架。在另一个实施例中，本发明的这些文库包括具有被随机化的BC环的Tn3支架。在仍另一个实施例中，本发明的这些文库包括具有被随机化的BC环的Tn3支架。

[0308] 在一个实施例中，本发明的这些文库包括具有被随机化的DE环的Tn3支架。在一个实施例中，本发明的这些文库包括具有被随机化的FG环的Tn3支架。在另一个实施例中，本发明的这些文库包括具有被随机化的FG环的FnIII支架。

[0309] 在一个特定实施例中，本发明的这些文库包括以下支架，其中这些支架包括以下氨基酸序列：IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)n KETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF、和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基A或T；并且
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。

[0310] 在一些实施例中，本发明的这些文库包括含有以下氨基酸序列的本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9H X10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸（S）或丝氨酸（L）；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸（H）、异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）或色氨酸（W）；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸（E）、亮氨酸（L）、谷氨酰胺（Q）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）或天冬酰胺（N）；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）、组氨酸（H）、谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸（G）、色氨酸（W）或缬氨酸（V）；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、甲硫氨酸（M）或组氨酸（H）；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸（W）或组氨酸（H）；并且
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸（R）或丝氨酸（S）。

[0311] 在一些实施例中，本发明的这些文库包括含有以下氨基酸序列的本发明的CD40L-特异性Tn3单体亚单位：
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDL X12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸（K）或谷氨酸（E）；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸（S）、亮氨酸（L）、丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丝氨酸（S）；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、丙氨酸（A）或组氨酸（H）；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺（N）、天冬氨酸（D）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸（H）、脯氨酸（P）、丝氨酸（S）、亮氨酸（L）或天冬氨酸（D）；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸（G）、苯丙氨酸（F）、组氨酸（H）或酪氨酸（Y）；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸（S）、天冬酰胺（N）、谷氨酸（E）、天冬酰胺（R）或天冬氨酸（D）；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）或丙氨酸（A）；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸（P）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）或丙氨酸（A）或没有氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸（I）或没有氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸（E）或赖氨酸（K）；并且
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸（S）或天冬酰胺(N）。

[0312] 本发明进一步提供了通过筛选本发明的这些文库，用于鉴定与靶标（例如，CD40L）结合并且与亲本Tn3支架相比对该靶标（例如，CD40L）具有增加的稳定性或改善的作用的重组Tn3支架的方法。

[0313] 在某些实施例中，用于鉴定与亲本Tn3支架相比具有增加的蛋白质稳定性并且与靶标特异性结合的重组Tn3支架的方法包括：

[0314] 在适于形成支架：靶标配体复合物的条件下，使该靶标配体与本发明的一个文库接触；

[0315] 从该络合物中获得与该靶标配体结合的支架；

[0316] 确定在步骤(b)中获得的支架的稳定性是否大于野生型Tn3支架的稳定性。

[0317] 可以使用同一方法鉴定对该靶标具有改善的结合亲和力、亲合力等的重组Tn3支架。在一个实施例中，在步骤(a)中，将本发明的支架文库与固定的靶标一起孵育。在一个实施例中，在步骤(b)中，洗涤该支架:靶标配体络合物以除去非特异性粘合剂，并且在非常严格条件下洗脱最紧的粘合剂并且使其经受PCR，以回收序列信息。在此确切考虑了可以使用在此披露的方法或本领域普通技术人员已知的方法，将在步骤中(b)获得的粘合剂和/或序列信息用来创建新的文库，在需要或无需进一步突变该序列的情况下，可以使用该文库来重复选择过程。在一些实施例中，可以继续多轮选择，直到获得对该抗原具有足够的亲和力的粘合剂。

[0318] 本发明的一个另外的实施例是一批编码包括本发明的支架并且如上所述的文库的分离的核酸分子。

[0319] 可以使本发明的支架经受亲和力成熟。在这一领域接受的过程中,使特定的结合蛋白经受一个方案，选择该方案来对特定的靶标具有增加的亲和力进行的方案（参见Wu（吴）等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.（美国国家科学院论文集）95(11):6037-42）。本发明形成的支架可以展示出在亲和力成熟之前，至少与该支架一样高的结合特征。

[0320] 本发明还提供了鉴定能够与靶标结合的蛋白支架的氨基酸序列的方法，以便形成支架:靶标复合物。在一个实施例中，该方法包括：(a)使本发明的一个文库与固定的或可分离的靶标接触；(b)将支架:靶标复合物与游离的支架分离；(c)使(b)的分离的支架
复制，以便生成一个以具有降低的多样性并且以富含能够与该靶标结合的显示的支架而与(a)中的文库区分开的新的多肽展示文库；d)用(c)的新的文库可任选地重复步骤(a)和
(b)；以及e)确定编码来自(d)的一个种类的显示支架的区域的核酸序列并且因此推导出
能够与该靶标结合的肽序列。

[0321] 在另一个实施例中，在由一个文库筛选鉴定以后，本发明的Tn3支架可以被进一步随机化。在一个实施例中，本发明的方法包括进一步随机化使用在此描述的一种方法从文库中鉴定的支架的至少一个环、至少两个环、至少三个环、至少四个环、至少五个环或至少六个环。在另一个实施例中，使进一步被随机化的支架经受鉴定能够与靶标结合的支架的随后的方法。这一方法包括(a)使所述进一步被随机化的支架与固定的或可分离的靶标接触，(b)将进一步被随机化的支架:靶标复合物与游离的支架分离，(c)使(b)的分离的支架复制，可任选地重复步骤(a)-(c)，以及(d)确定编码所述进一步被随机化的支架的区域的核酸序列并且因此，推导出能够与该靶标结合的肽序列。

[0322] 在一个另外的实施例中，进一步被随机化的支架包括预先在第一文库中被随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个被随机化的环。在一个交替的另外的实施例中，进一步被随机化的支架包括预先在第一文库中未被随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个被随机化的环。

[0323] 本发明还提供了一种用于获得至少两个与至少一个或多个靶标结合的Tn3支架的方法。这一方法允许筛选合作地发挥作用以引起具体应答的试剂。当需要多于一个支架的合作的激动活性时，使用这样的一种筛选可以是有利的。这一方法允许筛选协同试剂而无需重定文库的格式，以形成多聚体复合物。在一个实施例中，本发明的方法包括使靶标配体与本发明的文库在允许形成支架:靶标配体复合物的条件下进行接触，使所述支架与交联剂（被定义为使至少两个相同的或不同的支架离得很近的试剂）结合，其中这些支架的交联引起一个可检测的应答并且从该复合物中获得与该靶标结合的所述支架。在一个另外的实施例中，该交联剂是支架特异性抗体或其片段、表位标签特异性抗体或其片段、二聚化结构域（例如Fc区）、卷曲螺旋基序（例如但不局限于亮氨酸拉链）、化学交联剂、或本领域已知的另一种二聚化结构域。

[0324] 本发明还提供了利用本发明的Tn3支架检测化合物的方法。基于通过文库筛选获得的Tn3支架的结合特异性，在测定中使用此类Tn3支架来检测样品中的特定靶标是可能的，例如用于诊断方法。在一个实施例中，检测化合物的方法包括使样品中的所述化合物与本发明的Tn3支架在允许形成化合物:支架复合物的条件下进行接触并且检测所述支架，
由此检测样品中的所述化合物。在另外的实施例中，将该支架标记（即，放射性标记、荧光、酶联或比色标记），以协助该化合物的检测。

[0325] 本发明还提供了利用本发明的Tn3支架捕捉化合物的方法。基于通过文库筛选获得的Tn3支架的结合特异性，在测定中使用此类Tn3支架来捕获样品中的特定靶标是可能的，例如用于纯化方法。在一个实施例中，捕获样品中的化合物的方法包括使样品中的所述化合物与本发明的支架在允许形成化合物:支架复合物的条件下进行接触并且将所述复
合物从该样品中除去，由此捕获所述样品中的所述化合物。在另外的实施例中，将Tn3支架固定，以协助除去化合物：支架复合物。

[0326] 在一些实施例中，从本发明的文库中分离的Tn3支架包括至少一个、至少两个、至少四个、至少五个、至少六个、或更多个被随机化的环。在一些实施例中，来自供体支架的分离的Tn3支架环序列可以与FnIII接收者支架中的任何环互换，接收者支架包括但不局限于Tn3接收者支架（例如，来自供体支架的FG环序列可以被转移至接收者FnIII支架中的
任何环）。在特定实施例中，分离的环序列可以被转移至接收者支架中的同源环（例如，来自供体支架的FG环序列可以被转移至FnIII接收者支架的FG环位置处）。在一些实施例中，分离的环序列可以与不同接收者支架随机地“混合并相配”。

[0327] 在其他实施例中，可以通过环序列鉴定分离的Tn3支架序列。例如，使用一个文库来淘具体的靶标并且分离一批特定的粘合剂。可以将随机化的环序列表征为独立于Tn3支架背景的特异序列（即，与靶标X结合的支架，其中所述支架包括SEQ ID NO：X的FG环序列）。在替代性实施例中，在一个支架展示出两个与靶标X结合的环序列的情况下，可以将这些环序列表征为在该支架序列不存在的情况下结合靶标X。换言之，在此考虑了从结合具体靶标的文库中分离的支架可以被表达为独立于该支架骨架结合那一靶标的可变环序列。这一过程类似于抗体的可变区中的CDR的概念。
亲和力成熟

[0328] 本发明的Tn3支架的研发可以涉及一个或多个体外或体内亲和力成熟步骤。在一些实施例中，Tn3单体亚单位可以经历单步的亲和力成熟。在一些实施例中，Tn3单体亚单位可以经历两步或更多步的亲和力成熟。可以采用通常导致亲本Tn3支架中的氨基酸改变、或确切地亲本Tn3支架的环中的氨基酸改变的任何亲和力成熟途径，这些改变改善亲和力成熟的Tn3支架与所希望的抗原的结合。

[0329] 可以经由例如随机诱变、“漫步（walk though）”诱变、以及“浏览（look through）”诱变实现这些氨基酸改变。可以通过使用例如易错PCR、酵母菌或细菌的“增变基因”菌株、在基于FnIII的结合分子的全部从头合成或部分从头合成过程中掺入随机的或限定的核酸改变来实现这样的诱变。用于进行亲和力成熟和/或诱变的方法描述于例如美国专利 号 7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，
5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5,866,344以及PCT公开WO06023144中。

[0330] 此类亲和力成熟方法可能进一步需要增加抗原结合筛选测定的严谨度，以选择对抗原具有改善的亲和力的Tn3支架。可以在这里使用增加蛋白质相互作用测定的严格性的领域公认的方法。在一个实施例中，可以改变一个或多个测定条件（例如，测定缓冲液的含盐浓度），以减小Tn3支架与所希望的抗原的亲和力。在另一个实施例中，Tn3支架与所希望的抗原结合所允许的时间的长度被减少。

[0331] 在另一个实施例中，可以向蛋白质相互作用测定中添加竞争性结合步骤。例如，首先可以允许该Tn3支架与所希望的固定抗原结合。然后添加特定浓度的非固定抗原，用来与固定抗原竞争结合，这样使得对抗原具有最低亲和力的Tn3支架被从固定抗原上洗脱下来，导致选择出对具有改善的抗原结合亲和力的Tn3支架。可以通过增加向该测定中添加的非固定抗原的浓度来进一步增加测定条件的严谨度。

[0332] 筛选方法可能也需要多轮选择，以富集一个或多个具有改善的抗原结合的Tn3支架。在一个实施例中，在每一轮选择中，向该Tn3支架中引入另外的氨基酸突变。在另一个实施例中，在每一轮选择中，增加与所希望的抗原的结合的严格性，以选择对抗原具有增加的亲和力的Tn3支架。

[0333] 在一些实施例中，通过Tn3的BC、DE、和FG环的部分的饱和诱变进行亲和力成熟。在一些实施例中，使用孔克尔致变作用（Kunkel mutagenesis）进行饱和诱变。在其他实施例中，通过使用PCR进行饱和诱变。

[0334] 在一些实施例中，应用至少一轮、至少两轮、至少三轮、至少四轮、至少五轮、或多于五轮的亲和力成熟。在一些实施例中，仅对一个环应用饱和诱变，而在一些其他实施例中，在一轮亲和力成熟的过程中，仅对一个环或一个环的一部分进行突变。在一些实施例中，在同一轮的亲和力成熟过程中，对多于一个环或一个或多个环的部分进行突变。

[0335] 在其他实施例中，在同一轮的亲和力成熟过程中，同时突变BC、DE、和FG环。

[0336] 在将单体组装为与同一靶标的不同表位结合的多聚体Tn3支架的情况下，可以单独筛选每个结合特异性。

[0337] 在一些实施例中，使用噬菌体展示文库随机化这些环。在一些实施例中，可以使用本领域公认的方法确定Tn3支架与所希望的靶标的结合。而且，可以使用领域公认的方法确定在筛选中鉴定的Tn3支架的氨基酸序列。

[0338] 在一些实施例中，与亲和力成熟之前的同一Tn3支架相比，本发明的单体亲和力成熟的支架展示出对CD40L的至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少60倍、至少80倍、或至少100倍或更多倍的亲和力的增加，如通过表面等离振子共振（Surface Plasmon Resonance）或通过本领域已知的其他测定所测量的。在一些实施例中，本发明的单体亲和力成熟的支架具有小于5μM、小于1μM、小于500μM、小于250μM、小于100μM、或者小于50μM的解离常数（Kd），如通过表面等离振子共振或通过本领域已知的其他测定所测量的。

[0339] 可以将这些亲和力成熟方法应用于研发具有令人希望的改善的结合特性，例如增加的亲和力或其他令人希望的特征（例如有利的药物代谢动力学特性、高效力、低免疫原性、增加的或减少的交叉反应性等）的Tn3支架。串联重复序列的产生

[0340] 可以通过使用本领域已知的限制性内切酶在限制位点处连接寡核苷酸来产生串联构建体（即通过将两个CD40L-特异性单体亚单位连接而形成的二聚体）的连接，这些限制性内切酶包括但不局限于II型和IIS型限制性内切酶。

[0341] 本发明的多聚体Tn3支架在C端和/或N端和/或如在此所描述的结构域之间可以包括一个接头。另外，包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个多肽支架的本发明的支架可以被融合至或共轭至一个二聚化结构域，包括但不局限于选自以下的抗体部分：
(i)具有VL、CL、VH以及CH1结构域的Fab片段；
(ii)作为在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段的Fab'片段；
(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；
(iv)具有VH和CH1结构域并且在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的
Fd'片段；
(v)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；
(vi)由VH结构域组成的dAb片段；
(vii)分离的CDR区；
(viii)F(ab')2片段，即包括两个由绞链区的二硫桥键连接的Fab'片段的二价片段；
(ix)单链抗体分子（例如，单链Fv；scFv）；
(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，包括一个被连接至同一多肽链中的轻链可变
域（VL）的重链可变域（VH）；
(xi)包括一对串联Fd区段（VH-CH1-VH-CH1）的“线性抗体”，这对串联Fd区段与互补
的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；
(xii)全长抗体；以及
(xiii)包括CH2-CH3的Fc区，该Fc区可以进一步包括全部绞链区和/或CH1区或其
一部分。
Tn3支架生产

[0342] 本发明的Tn3支架的重组表达需要构建一个包含编码该Tn3支架的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码Tn3支架的多核苷酸，便可以使用本领域中熟知的技术经由重组DNA技术生产用于产生该Tn3支架的载体。因此，在此描述了通过表达含有编码Tn3支架的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域普通技术人员熟知的方法来构建包含编码支架多肽的序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内基因重组。因此，本发明提供了包括编码本发明的Tn3支架的核苷酸序列、被可操作地连接至启动子的可复制的载体。

[0343] 通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，并且然后通过常规技术来培养所转染的细胞，以产生本发明的Tn3支架。因此，本发明提供了包含编码本发明的支架的多核苷酸、被可操作地连接至异源性启动子的宿主细胞。适合的宿主细胞包括但不限于微生物，例如细菌（如大肠杆菌和纳豆芽孢杆菌）。

[0344] 可以利用多种宿主表达载体系统来表达本发明的Tn3支架。此类宿主表达系统代表通过其可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，但还代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，原位表达本发明的一种支架的细胞。这些包括但不局限于用包含支架编码序列的重组细菌噬菌体DNA的、质粒DNA的或粘粒DNA的表达载体转化的微生物，如细菌（例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌），或哺乳动物细胞系统（例如，COS、CHO、BHK、293、NSO、以及3T3细胞）。

[0345] 用于生产本发明的Tn3支架的方法披露于例如国际专利申请公开号WO2009/058379中。一旦已经通过重组表达产生本发明的支架，便可以通过本领域已知的用于蛋白质纯化的任何方法纯化该支架。

[0346] 在一些实施例中，可以通过在重组表达过程中替代可以被糖基化的氨基酸残基来以糖基化形式生产本发明的支架。在一个特定实施例中，在甘氨酸-丝氨酸接头（例如，SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：132）中的丝氨酸氨基酸可以被其他氨基酸残基替代，例如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸（参见例如SEQ ID NO：140、141、142和143），以便在重组表达过程中阻止糖基化作用。在一些特定实施例中，将N-糖基化位点从本发明的Tn3支架中去除。在其他实施例中，在重组表达之后，可以将本发明的支架去糖基化。使用例如酶混合物在重组表达之后体外去糖基化的方法在本领域中是已知的（例如，PFGase F、Enodo F Multi、Orela O-linked Glycan Release（Orela O-连接的聚糖释放酶）、Enzymatic CarboRelease（酶的碳水化合物释放酶）、以及由QA-bio公司，Palm Desert（棕榈沙漠），加州销售的Enzymatic DeGlycoMx去糖基化试剂盒）。

[0347] 可以将在研究实验室中的本发明的Tn3支架的生产按比例放大用于在分析规模的反应器或生产规模的反应器中生产支架，如描述于美国专利公开号US2010-0298541A1
中。
分泌型Tn3支架的大规模生产

[0348] 可以将本发明的Tn3支架细胞内地生产或将其生产为分泌形式。在一些实施例中，这些分泌型支架是适当折叠并完全功能化的。本发明的Tn3支架能以大规模过程生产。
在一些实施例中，在研究实验室中能以大规模过程生产本发明的支架，可以将其按比例放大以在分析规模的生物反应器（例如但不局限于5L、10L、15L、30L、或50L生物反应器）中生产本发明的支架。在其他实施例中，在研究实验室中能以大规模过程生产本发明的Tn3支架，可以将其按比例放大以在生产规模的生物反应器（例如但不限75L、100L、150L、300L、或
500L）中生产本发明的Tn3支架。在一些实施例中，与在研究实验室中进行的生产过程相比，本发明的大规模过程导致在生产效率上很少的减少或没有减少。
接头

[0349] 在多聚体Tn3支架中的单体亚单位可以由蛋白质和/或非蛋白质接头连接，其中每个接头被融合到至少两个单体单体。适合的接头可以由蛋白质接头、非蛋白质接头、及其组合组成。接头的组合可以是同数的或异数的。在一些实施例中，本发明的多聚体Tn3支架包括多个单体亚单位，其中所有的接头都是相同的。在其他实施例中，多聚体Tn3支架包括多个单体亚单位，其中至少一个接头与剩余的接头在功能上或结构上是不同的。在一些实施例中，接头可以本身通过直接或间接参与与靶标的结合而有助于多聚体Tn3支架的活性。

[0350] 在一些实施例中，该蛋白质接头时一种多肽。接头多肽应该具有适合以这样一种方式连接两个或更多个单体亚单位的长度，在该方式中它们相对于彼此采取正确的构象，这样使得它们保留所希望的活性。

[0351] 在一个实施例中，该多肽接头包括1个至约1000个氨基酸残基、1个至约50个氨基酸残基、1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、1-15个氨基酸残基、1-10个氨基酸残基、1-5个氨基酸残基、1-3个氨基酸残基。本发明进一步提供了编码该多肽接头序列的核酸，例如DNA、RNA、或两者的组合。选择被包含在该多肽接头中的氨基酸残基应该展示出不显著地干扰本发明的多聚体Tn3支架的活性或功能的特性。因此，多肽接头应该大体上不展示出将与本发明的Tn3多聚体支架的活性或功能不一致的职责、或干扰内部折叠、或与一个或多个单体亚单位中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重地妨碍本发明的多聚体Tn3支架与CD40L的结合。

[0352] 将天然发生的连同人工的肽接头用于将多肽连接进新颖的连接的融合多肽中在该文献中是熟知的。因此，与两个或更多个单体亚单位融合的接头是天然的接头、人工接头、或其组合。在一些实施例中，存在于本发明的Tn3多聚体支架中的所有肽接头的氨基酸序列都是相同的。在其他实施例中，存在于本发明的多聚体Tn3支架中的至少两个肽接头的氨基酸序列是不同的。

[0353] 在一些实施例中，多肽接头拥有构象柔性。在一些实施例中，多肽接头序列包括一个(G-G-G-G-X)m氨基酸序列，其中X是丙氨酸（A）、丝氨酸（S）、甘氨酸（G）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）或缬氨酸（V）并且m是一个正整数（参见例如，SEQ ID NO：209）。在一个特定实施例中，多肽接头序列包括一个(G-G-G-G-S)m氨基酸序列，其中m是一个正整数（参见例如，SEQ ID NO：147）。在另一个具体实施例中，多肽接头序列包括一个(G-G-G-G-G)m氨基酸序列，其中m是一个正整数（参见例如，SEQ ID NO：148）。在仍另一个具体实施例中，多肽接头序列包括一个(G-G-G-G-A)m氨基酸序列，其中m是一个正整数（参见例如，SEQ ID NO：149）。在一些实施例中，多肽接头是固有非结构化的天然的或人工的多肽（参见例如，Schellenberger（舍伦贝格尔）等人，Nature Biotechnol.（自然生物技术）27:1186-1190，2009；还参见，Sickmeier（斯科米尔）等人，Nucleic Acids Res.（核酸研究）35:D786-93，
2007）。

[0354] 能以引入包括非多肽部分的附接基团的氨基酸残基的这样一种方式修饰该肽接头。这样的氨基酸残基的实例可以是半胱氨酸残基（然后非多肽部分顺序附接至其上）或该氨基酸残基可以包括一个体内N-糖基化位点（由此将糖部分（体内）附接至该肽接头）。

[0355] 在一些实施例中，存在于该多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列都是相同的。可替代地，存在于该多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列可以是不同的。
Tn3支架的标记或共轭

[0356] 可以将本发明的Tn3支架以非共轭形式使用或可以被共轭至多种异源部分中的至少一个，以协助靶标检测或用于成像或治疗。可以在纯化前或纯化后、进行纯化时标记或共轭本发明的Tn3支架。

[0357] 许多异源部分缺少本发明的Tn3支架可以连接至其上的适合的官能团。因此，在一些实施例中，通过一个接头将效应分子附接至该支架，其中该接头包含用于共轭的反应基团。在一些实施例中，共轭至本发明的Tn3支架的异源部分可以起接头的作用。在其他实施例中，经由一个可以是可剪切的或不可剪切的接头将该部分共轭至该Tn3支架。在一个实施例中，可剪切的连接分子是一种氧化还原可剪切的连接分子，这样使得该连接分子在具有更低的氧化还原电位的环境中（例如细胞质）以及其他具有更高浓度的具有游离的巯基的分子的区域中是可剪切的。由于氧化还原电位的变化可以被剪切的连接分子的实例包括：包含二硫化物的那些。

[0358] 在一些实施例中，将本发明的Tn3支架工程化，以提供用于共轭的反应基团。在这样的支架中，N端和/或C端也可以用来提供用于共轭的反应基团。在其他实施例中，N端可以被共轭至一个部分（例如但不限于PEG），同时C端被共轭至另一个部分（例如但不限于生物素），或反之亦然。

[0359] 术语“聚乙二醇”或“PEG”意指具有或不具有偶联剂、偶联部分或激活部分（例如，具有硫醇、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶、环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺部分）的聚乙二醇化合物或其衍生物。术语“PEG”旨在指示具有在500Da与150,000Da之间的分子量的聚乙二醇（包括其类似物），其中例如末端OH-基团已经被甲氧基替代（被称为mPEG）。

[0360] 本发明的Tn3支架可以用聚乙二醇（PEG）衍生。PEG是具有两个末端羟基基团的氧化乙烯重复单位的一种线性的水溶性聚合物。通过PEG的分子量对其进行分类，其分子量典型地在从约500道尔顿至约40,000道尔顿的范围。在一个特定实施例中，采用的PEG具有在从5,000道尔顿至约20,000道尔顿的范围的分子量。与本发明的支架偶联的PEG可
以是支链的或直链的。参见例如，Monfardini（蒙法蒂妮），C等人1995Bioconjugate Chem（生物共轭化学）6:62-69。PEG从奈克塔公司（Nektar Inc.）、西格玛化学制品公司（Sigma Chemical Co.）以及其他公司是可商购的。此类PEG包括但不局限于单甲氧基聚乙二醇
（MePEG-OH）、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯（MePEG-S）、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯（MePEG-S-NHS）、单甲氧基聚乙二醇-胺（MePEG-NH2）、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯（MePEG-TRES）、以及单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-碳酰（MePEG-IM）。

[0361] 简言之，由非反应基团（如甲氧基或乙氧基）为利用的亲水聚合物（例如，PEG）在一端加帽。此后，通过与一种适合的激活剂反应在另一端将该聚合物激活，该激活剂是例如氰尿卤化物（例如，氰尿氯化物、溴化物或氟化物）、羰基二咪唑、酸酐剂（例如，二卤代琥珀酸酐，如二溴代琥珀酸酐）、酰基叠氮、对重氮鎓苄基醚、3-(对重氮鎓苯氧基)-2-羟丙基醚)以及类似物。然后，激活的聚合物与如在所述的多肽进行反应，以产生衍生自聚合物的多肽。可替代地，可以将本发明的Tn3支架中的一个官能团激活，用于与该聚合物反应，或可以使用已知的偶联方法将两个基团结合在一个协定的偶联反应中。将容易理解的是，可以使用本领域普通技术人员已知并且使用的大量的其他反应方案用PEG衍生化本发明的多肽。可以在该Tn3支架的任一端或该Tn3支架内的一个或多个官能团处将PEG偶联至本发
明的支架。在某些实施例中，在N端抑或C端偶联PEG。

[0362] 在其他实施例中，可以将本发明的Tn3支架、其类似物或衍生物共轭至一种诊断剂或可检测的试剂。此类Tn3支架可以作为临床测试程序的一部分用于监测或预测疾病的发展或进展，例如确定具体治疗的疗效。

[0363] 本发明进一步涵盖共轭至治疗部分的Tn3支架的用途。可以将Tn3支架共轭至治疗部分（例如细胞毒素，如细胞抑制剂或杀细胞剂）、治疗剂或放射性金属离子（如，α-发射体）。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。
测定Tn3支架

[0364] 可以通过多种本领域已知的体外测定方法确定Tn3支架与抗原的结合亲和力以及其他结合特性，这些体外测定方法包括例如平衡法（如，酶联免疫吸附测定法（ELISA）或动力学（如， 分析），以及其他方法，例如间接结合测定法、竞争性结合测定法、
凝胶电泳法和色谱法（如，凝胶过滤法）。这些以及其他方法可以利用在被检查的一种或多种成分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不局限于生色标记、荧光标记、发光标记、或同位素标记。可以在Paul（保罗），W.E.，编辑，Fundamental Immunology（基础免疫学），第4辑，Lippincott-Raven（利平科特-瑞文），Philadelphia（费城）（1999）中发现结合亲和力和动力学的详细说明。

[0365] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架与具有特定动力学的靶标特异性结合。在-2 -3 -4 -5
一些实施例中，本发明的Tn3支架可以具有小于1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M、
-6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14
1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M、1×10 M
-15
或小于1×10 M的解离常数或Kd（koff/kon）。在特定实施例中，本发明的Tn3支架具有
500μM、100μM、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的Kd，如通过BIAcore测定 或通过本领域已知的其他测定所确定的。

[0366] 在一个替代性实施例中，将本发明的Tn3支架的亲和力按照缔合常数（Ka）进行描2 -1 3 -1 4 -1 5 -1
述，缔合常数被计算为kon/koff的比率，具有至少1×10M 、1×10M 、1×10M 、1×10M 、
6 -1 7 -1 8 -1 9 -1 10 -1 11 -1 12 -1 13 -1
1×10M 、1×10M 、1×10M 、1×10M 、1×10 M 1×10 M 1×10 M 、1×10 M 、
14 -1 15 -1 15 -1
1×10 M 、1×10 M 、或至少5X l0 M 的缔合常数。

[0367] 在某些实施例中，本发明的Tn3支架从靶标表位解离的速率可能比Kd或Ka的值-3 -1 -3 -1 -4 -1
更相关。在一些实施例中，本发明的Tn3支架具有小于10 s 、小于5x10 s 、小于10 s 、-4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1
小于5x10 s 、小于10 s 、小于5x10 s 、小于10 s 、小于5x10 s 、小于10 s 、小于
-7 -1 -8 -1 -8 -1 -9 -1 -9 -1 -10 -1
5x10 s 、小于10 s 、小于5x10 s 、小于10 s 、小于5x10 s 、或小于10 s 的koff。

[0368] 在某些其他实施例中，本发明的Tn3支架与靶标表位缔合的速率可能比Kd或Ka的5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
值更相关。在此情况下，本发明的Tn3支架以至少10M s 、至少5x10M s 、至少10M s 、
6 -1 -1 7 -1 -1 7 -1 -1 8 -1 -1 9 -1 -1
至少5x10M s 、至少10M s 、至少5x10M s 、或至少10M s 、或至少10M s 的kon速
率与靶标结合。

[0369] 本发明的Tn3支架还可以被附接至固相支持体，这尤其可用于靶标抗原的免疫测定或纯化。这样的固相支持体包括但不局限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。CD40L-特异性Tn3支架

[0370] 本发明提供了与CD40L特异性结合的Tn3支架。在特定实施例中，本发明的支架与人类CD40L特异性结合。在其他特定实施例中，本发明的Tn3支架与来自小鼠、鸡、恒河猴、猕猴、大鼠、或兔的CD40L同系物结合。在一些实施例中，本发明的Tn3支架与CD40L的暴露表位结合。此类实施例包括在细胞和/或被转染以异位表达该受体的细胞上内源表达的CD40L。

[0371] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在单体CD40L上的表位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在CD40L的三聚体形式上的表位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在膜结合的CD40L上的表位。在其他实施例中，本发明的Tn3支
架识别展示在可溶性CD40L上的表位。

[0372] 在另外的其他实施例中，本发明的Tn3支架与单体CD40L结合并且阻止或干扰CD40L分子的低聚化。在另外的其他实施例中，本发明的支架减少或抑制CD40L与CD40的
相互作用。在其他实施例中，本发明的Tn3支架激动由CD40L介导的细胞信号传导。在另
外的其他实施例中，本发明的Tn3支架拮抗由CD40L介导的细胞信号传导。

[0373] 本发明还提供了使用在此描述的Tn3支架调节CD40L活性的方法。在一些实施例中，本发明的方法包括使CD40L与CD40L-特异性支架接触并且阻断CD40与CD40L之间的
相互作用。在其他实施例中，本发明的方法包括使表达CD40L的细胞与CD40L-特异性Tn3
支架接触并且阻止CD40L从细胞表面的蛋白裂解。在其他实施例中，本发明的方法包括使CD40L单体与CD40L-特异性Tn3支架接触并且阻止CD40L低聚化。在其他实施例中，可以
通过使用多聚体Tn3支架实现CD40L的二聚化或低聚化。

[0374] 在一些实施例中，本发明的方法包括给予减少CD40-介导的免疫应答（参见例如Elqueta（艾奎塔）等人229:152-172，2009）或由CD40与CD40L的结合引发的下游信号传导通路（如通过本领域已知的常规测定所测量）的CD40L特异性支架。

[0375] 不希望被任何具体的理论所束缚，本发明的CD40L支架可以通过以下方式发挥作用：通过阻止CD40L与CD40的结合，通过结合并多价螯合可溶性CD40L，通过改变CD40L与CD40的相互作用而非阻止结合，通过阻止或增强金属蛋白酶介导的CD40L从细胞表面的酶法裂解以产生可溶性CD40L，通过阻止或增强细胞表面CD40L胞吞作用等。特异性CD40L结合序列

[0376] 在一些实施例中，本发明的Tn3支架包括以下CD40L-特异性单体亚单位，这些亚单位包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个与CD40L结合的环序列。

[0377] 在一些实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个选自以下的CD40L-结合单体克隆的环序列：309（分离自天然Tn3文库的亲本309家族克隆；SEQ ID NO：20），309FGwt（具有人源化的FG环的亲本309克隆；SEQ ID NO：22），340（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：24），341（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：26），342（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：
146），343（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：30），344（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：32），345（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：34），346（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：36），347（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：38），348（亲和力成熟的309克隆；
SEQ ID NO：40），349（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：42），311（分离自天然Tn3文库的亲本311家族克隆；SEQ ID NO：44），311K4E（来自第一轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：46）；311K4E_1（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：
48），311K4E_2（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：50），311K4E_3（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：52），311K4E_4（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：54），311K4E_5（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：56），311K4E_7（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：58），311K4E_8（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：60），311K4E_9（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：62），311K4E_10（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：64），311K4E_11（来自第二轮亲和力成熟的变体
311家族克隆；SEQ ID NO：66），311K4E_12（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；
SEQ ID NO：68），311K4E_13（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：70），
311K4E_14（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：72），311K4E_15（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：74），311K4E_16（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：76），311K4E_19（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：78），311K4E_20（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：80），以及311K4E_21（来自第二轮亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO：82）。

[0378] 在一些实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括至少一个选自列于表2中的环序列的环序列。在其他实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括至少一个选自列于表2中的BC环序列的BC环序列。在其他实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括至少一个选自列于表2中的DE环序列的DE环序列。在其他实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括至少
一个选自列于表2中的FG环序列的FG环序列。

[0379] 在一些实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括一个选自列于表2中的BC环序列的BC环序列；以及一个选自列于表2中的DE环序列的DE环序列。在其他实施例中，
CD40L-特异性单体亚单位包括一个选自列于表2中的BC环序列的BC环序列；以及一个选
自列于表2中的FG环序列的FG环序列。在其他实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括
一个选自列于表2中的DE环序列的DE环序列；以及一个选自列于表2中的FG环序列的
FG环序列。在一些实施例中，CD40L-特异性单体亚单位包括对应于来自一个、两个或三个不同Tn3克隆的环序列的环序列。

[0380] 在某些实施例中，在CD40L-特异性单体支架序列在该序列的C端包含一个接头和/或组氨酸标签（例如，His-8标签）、或额外的N端氨基酸的情况下，可以去除这些C端接头和/或组氨酸标签以及额外的N端氨基酸，因此对应的氨基酸序列包含C端接头和His标签序列以及N端额外的一个或多个氨基酸的缺失。

[0381] 在一些实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括一个单一的单体亚单位，例如342克隆序列（亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO：28和/或SEQ ID NO：146）。在其他实施例中，CD40L-特异性支架包括多于一个单体亚单位，例如一前一后两个342克隆单体亚单位（SEQ ID NO：28和/或SEQ ID NO：146）（参见例如，SEQ ID NO：135）。在特定实施例中，本发明的Tn3支架被共轭至变体HSA（参见例如，SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：135）。在另外的实施例中，可以在多聚体Tn3支架的N端抑或C端共轭该HSA。

[0382] 在一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括一个单一的311K4E_12单体亚单位、一个GS接头、以及一个C34S HSA变体（参见例如，SEQ ID NO：201）。在另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括一个具有β链C CELTYG变体的单一的311K4E_12单
体亚单位、一个全是甘氨酸的接头、以及一个C34S HSA变体（参见例如，SEQ ID NO：202）。
在另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个一前一后地311K4E_12亚单位、
以及两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二个GS接头将一个亚单位与
C34S HSA变体连接（参见例如，SEQ ID NO：203）。在仍另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个一前一后地311K4E_12亚单位、以及两个全是甘氨酸的接头，其中一个全是甘氨酸的接头将亚单位彼此连接并且第二个全是甘氨酸的接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接（参见例如，SEQ ID NO：204）。

[0383] 在一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个经由一个GS接头一前一后连接的309亚单位（参见例如，SEQ ID NO：205）。在另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括一个单一的连接至C34SHSA变体的309亚单位（参见例如，SEQ ID NO：206）。
在另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个一前一后地309亚单位、以及两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二个GS接头将一个亚单位与C34S HSA
变体连接（参见例如，SEQ ID NO：207）。

[0384] 在一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括一个单一的342单体亚单位、一个GS接头、以及一个C34S HSA变体（参见例如，SEQ ID NO：134）。在另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括一个单一的342单体亚单位、一个全是甘氨酸的接头、以及一个C34S HSA变体（参见例如，SEQ ID NO：144）。在另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个一前一后地342亚单位、以及两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二个GS接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接（参见例如，SEQ ID NO：135）。在又另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个一前一后地342亚单位、以及两个全是甘氨酸的接头，其中一个全是甘氨酸的接头将亚单位彼此连接并且第二个全是甘氨酸的接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接（参见例如，SEQ ID NO：145）。在又另一个特定实施例中，CD40L-特异性Tn3支架包括两个经由一个GS接头一前一后连接的342亚单位
（参见例如，SEQ ID NO：208）。

[0385] 在一个特定实施例中，该CD40L-特异性Tn3支架包括在另一个特定实施例中，该CD40L-特异性Tn3支架包括一前一后地一个311亚单位或一个衍生自311（例如，
311K4E_12）的亚单位和一个309亚单位或一个衍生自309（例如，342）的亚单位以及两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二个GS接头将一个亚单位与C34S HSA
变体连接（参见例如，SEQ ID NO：135）。在又另一个具体实施例中，该CD40L-特异性Tn3支架包括一前一后地一个311亚单位或一个衍生自311（例如，311K4E_12）的亚单位和一个
309亚单位或一个衍生自309（例如，342）的亚单位以及两个全是甘氨酸的接头，其中一个全是甘氨酸的接头将亚单位彼此连接并且第二个全是甘氨酸的接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接（参见例如，SEQ ID NO：145）。

[0386] CD40L-特异性串联二价Tn3支架和血清白蛋白（SA）融合物的实例示出图2A中（还参见图9A）。尽管在图2A中提供了特定的接头，但是考虑了如在此提供的其他接头。尽管可以使用野生型成熟SA，例如鼠血清白蛋白（MSA）或人血清白蛋白（HSA），但是在此考虑了在成熟SA中的一个或多个半胱氨酸（C）氨基酸残基可以被例如丝氨酸（S）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、等取代。

[0387] 下面示出了代表性构建体。SA的序列被加下划线。接头被加框。将理解的是许多改变在本发明的范围内。例如，接头可以被改变（在此提供了若干非限制性实例），第一个或前两个N端氨基酸残基（SQ）可以不存在和/或被替代性氨基酸残基取代，可以掺入标签（例如，6xHis标签），可以在类似构建体中使用替代性CD40L-特异性支架（例如，基于纤连蛋白的第10个Fn3结构域的那些）等。
342单价HSA构建体1（SEQ ID NO：134）
[342单体]-(G4S)2接头-HSAC34S
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI
AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG
EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR
HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK
FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV
FLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ
NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR
MPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE
TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE
TCFAEEGKKLVAASQAALGL
342单价HSA构建体2（SEQ ID NO：144）
[342单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI
AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG
EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR
HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK
FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV
FLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ
NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR
MPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE
TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE
TCFAEEGKKLVAASQAALGL
342二价HSA构建体1（SEQ ID NO：135）
[342单体]-(G4S)3接头-[342单体]-(G4S)2接头-HSAC34S：
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS
SNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV
KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE
CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS
QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE
KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD
YSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE
YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQL
CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE
RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL
342二价HSA构建体2（SEQ ID NO：145）
[342单体]-G15接头-[342单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS
SNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV
KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE
CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS
QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE
KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD
YSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE
YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQL
CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE
RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL
311K4E_12单价HSA构建体1（SEQ ID NO：201）
[311K4E_12单体]-(G4S)2接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL
VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE
TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI
ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS
LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK
YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA
KDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE
EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE
AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF
NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD
DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
311K4E_12单价HSA构建体2（SEQ ID NO：202）
[311K4E_12单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL
VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE
TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI
ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS
LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK
YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA
KDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE
EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE
AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF
NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD
DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
311K4E_12二价HSA构建体1（SEQ ID NO：203）
[311K4E_12单体]-G4S3接头-[311K4E_12单体]-(G4S)2接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVEDVTDTT
ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL
TTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS
PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ
EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL
LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW
AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK
LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY
ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL
FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS
VVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC
TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK
LVAASQAALGL
311K4E_12二价HSA构建体2（SEQ ID NO：204）
[311K4E_12单体]-G15接头-[311K4E_12单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVEDVTDTT
ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL
TTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS
PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ
EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL
LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW
AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK
LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY
ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL
FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS
VVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC
TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK
LVAASQAALGL
药物组合物

[0388] 在另一个方面中，本发明提供了一种组合物（例如但不局限于药物组合物），该组合物包含与药学上可接受的运载体一起配制的一个本发明的Tn3支架或其组合。此类组合物可以包括例如但不局限于一个本发明的Tn3支架或两个或更多个不同的Tn3支架的组
合。例如，本发明的药物组合物可以包括与靶标抗原上的不同表位结合或具有互补活性的Tn3支架的组合。在一个特定实施例中，药物组合物包括一个本发明的单一的单体Tn3支
架。在一个特定实施例中，药物组合物包括一个本发明的多聚体Tn3支架。在仍另一个具体实施例中，药物组合物包括本发明的二聚体Tn3支架。

[0389] 本发明的药物组合物还能以联合治疗的方式被给予，例如与其他试剂组合。例如，联合治疗可以包括与至少一种其他的治疗组合的一个本发明的Tn3支架，其中该治疗可以是免疫治疗、化学治疗、放射治疗、或药物治疗。本发明的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。使用支架的方法

[0390] 本发明的Tn3支架具有体外和体内诊断和治疗用途。例如，可以向培养物（例如，体外的或离体的）或受试者（例如，体内的）中的细胞给予这些分子，用于治疗、预防或诊断多种失调。

[0391] 本发明还提供了使用本发明的Tn3支架的方法。本发明还涵盖使用本发明的Tn3支架（单独地抑或与其他疗法组合）用来预防、诊断、管理、治疗或缓解与以下疾病、疾病的失调或失调（包括但不局限于癌症、炎性疾病和自身免疫性疾病、传染病）相关的一种或多种症状。本发明还涵盖使用共轭至或融合至一个部分（例如，治疗剂或药物）的本发明的Tn3支架（单独地或与其他疗法组合）用来预防、管理、治疗或缓解与以下疾病、失调或感染（包括但不局限于癌症、炎性疾病和自身免疫性疾病、传染病）相关的一种或多种症状。

[0392] 本发明还提供了用传统的抗体不容易完成的靶向表位的方法。例如，在一个实施例中，可以使用本发明的Tn3支架首先靶向临近的抗原并且同时结合，另一个结合结构域可能吸引隐藏的抗原。

[0393] 本发明还提供了使用Tn3支架来使不同的细胞类型集合的方法。在一个实施例中，本发明的蛋白质可以与具有一个结合结构域的靶细胞结合并且经由另一个结合结构域募集另一个细胞。在另一个实施例中，第一个细胞可以是癌细胞并且第二个细胞可以是免疫效应细胞（例如NK细胞）。在另一个实施例中，可以使用本发明的Tn3支架强化两个不同的细胞（例如抗原呈递细胞和T细胞）之间的相互作用，来可能地促进免疫应答。

[0394] 本发明还提供了使用Tn3支架来耗尽细胞群体的方法。在一个实施例中，本发明的方法可在以下细胞类型的耗尽中有用：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞以及肿瘤细胞。

[0395] 本发明还提供了将Tn3支架用作诊断剂的方法。可以使用此类诊断剂来测试CD40L的存在或不存在、CD40受体的存在或不存在、CD40L与CD40受体的结合效率、患者中游离的CD40L、样品中游离的CD40L、或样品中与CD40受体结合的CD40L。

[0396] 本发明的Tn3支架以及包括它的组合物对于许多目的是有用的，例如，作为针对大范围的慢性疾病和急性疾病以及失调（包括但不局限于自体免疫性疾病和/或炎性疾病）的治疗剂。在此描述的本发明的组合物以及方法对于预防或治疗自身免疫性失调和/或炎性失调是有用的。

[0397] 自身免疫性失调和/或炎性失调的实例包括但不局限于：斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性爱迪生氏病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、舍格伦综合征（Sjogren's syndrome）、银屑病、动脉硬化、糖尿病的和其他视网膜病、晶体后纤维增生症、与年龄相关的黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤、甲状腺增生（包括格雷夫斯病（Grave's disease））、角膜等组织移植、和慢性炎症、脓毒病、类风湿关节炎、腹膜炎、克罗恩病（Crohn’s disease）、再灌注损伤、败血症、内毒素休克、囊性纤维化、心内膜炎、银屑病、关节炎（例如银屑病性关节炎）、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植物排斥、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病（Behcet's disease）、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能失调综合征（CFIDS）、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾病、变应性肉芽肿血管炎（Churg-Strauss syndrome）、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利（Guillain-Barre）、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、IgA的神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔氏病（Meniere's disease）、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病性关节炎、Raynauld氏现象、莱特尔氏综合征（Reiter's syndrome）、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎性血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病。

[0398] 炎性失调的实例包括但不局限于：哮喘、脑炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病（COPD）、变应性紊乱、感染性休克、肺纤维化、未分化的脊柱关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨质溶解、以及由慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。可以将本发明的组合物和方法与用来预防、管理或治疗以上疾病的一种或多种常规治疗一起使用。

[0399] 本发明提供了用于预防、管理、治疗或缓解癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者给予与一种或多种非癌症治疗剂的治疗剂组合的一个或多个本发明的Tn3支架（亦称，非癌症疗法）。

[0400] 此类试剂的实例包括但不局限于镇吐剂、抗真菌剂、抗细菌剂（例如抗生素）、抗炎性剂、以及抗病毒剂。镇吐剂的非限制性实例包括美托哌丙嗪和甲氧氯普胺。抗真菌剂的非限制性实例包括唑类药物、咪唑、三唑、多烯、两性霉素以及嘧啶。抗细菌剂的非限制性实例包括更生霉素、博来霉素、红霉素、青霉素、光神霉素、头孢菌素、亚胺培南、氨曲南（axtreonam）、万古霉素、环丝氨酸、杆菌肽、氯霉素、克林霉素、四环素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、大观霉素、甲氧苄啶、诺氟沙星、利福平（refampin）、多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、异烟肼、甲硝唑以及喷他脒。抗病毒剂的非限制性实例包括核苷类似物（例如，叠氮胸苷、阿昔洛韦（acyclivir）、更昔洛韦（gangcyclivir）、阿糖腺苷（vidarbine）、碘苷、曲氟尿苷以及三唑核苷）、膦甲酸钠（foscaret）、金刚烷胺、金刚烷乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、干扰素（“IFN”）-α,β或γ以及AZT。抗炎剂的非限制性实例包括非甾体抗炎药（“NSAID”）、甾体抗炎药、β激动剂、抗胆碱能剂以及甲基黄嘌呤。

[0401] 在一个实施例中，本发明包括能够治疗慢性炎症的组合物。在一个实施例中，这些组合物在免疫细胞的靶向中有用，用于破坏或钝化。在一个实施例中，这些组合物在靶向激活的T细胞、休眠的T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、或树突状细胞中有用。在另一个实施例中，本发明包括能够减少免疫细胞功能的组合物。在另一个实施例中，这些组合物能够去除免疫细胞功能。

[0402] 在另一个实施例中，本发明包括对于治疗胃肠道的疾病有用的组合物。本发明的支架在低pH条件下展示出高水平的稳定性。在低pH下的稳定性提示该组合物将适于口服给予用于多种肠胃疾病，例如肠易激综合征、胃食管反流、假性肠梗阻、倾倒综合征、难治的呕吐、消化性溃疡、阑尾炎、缺血性结肠炎、溃疡性结肠炎、胃炎、幽门螺杆菌病、克罗恩病、惠普耳氏病、口炎性腹泻、憩室炎、憩室病、吞咽困难、食管裂孔疝、感染性食管失调、打嗝、反刍以及其他疾病。

[0403] 本发明进一步提供了组合的组合物以及使用此类组合物预防、治疗、减少、或缓解疾病或其症状的方法。本发明的Tn3支架可以与适于预防、治疗、减少或缓解疾病或其症状的常规的治疗组合。示例性的常规治疗可以发现于Physician’s Desk Reference（医师桌上参考手册）（第56版，2002年以及第57版，2003年）中。在一些实施例中，本发明的Tn3支架可以与化学疗法、放射疗法、手术、用生物制剂（抗体或肽）的免疫疗法、小分子、或本领域已知的另一种疗法组合。在一些实施例中，一起给予组合疗法。在其他实施例中，分开给予组合疗法。

[0404] 本发明还提供了诊断疾病的方法。可以将与疾病相关的特定靶标结合的本发明的Tn3支架应用于用来诊断所述疾病的方法中。在一个实施例中，在诊断受试者的疾病的方法中使用本发明的Tn3支架，所述方法包括从该受试者获得一个样品，使靶标与所述样品中的Tn3支架在允许形成靶标：支架相互作用的条件下进行接触，鉴定靶标：支架复合物并且由此检测在该样品中的靶标。在其他实施例中，在此描述了有待诊断的疾病。

[0405] 本发明还提供了使特定靶标成像的方法。在一个实施例中，可以在用来使特定靶标的存在、位置、或进展成像的方法中使用共轭至显像剂的本发明的Tn3支架，显像剂是例如绿色荧光蛋白、其他荧光标签（Cy3、Cy5、罗丹明以及其他）、生物素、或放射性核素。在一些实施例中，在体外进行使包括本发明的Tn3支架的靶标成像的方法。在其他实施例中，在体内进行使包括本发明的Tn3支架的靶标成像的方法。在其他实施例中，通过MRI、PET扫描、X射线、荧光检测或通过其他本领域已知的检测方法进行使包括本发明的Tn3支架的靶标成像的方法。

[0406] 本发明还提供了使用本发明的支架监测疾病进展、复发、治疗、或缓解的方法。在一个实施例中，通过如在此呈现的成像、诊断、或使化合物/靶标与本发明的Tn3支架接触的方法完成监测疾病进展、复发、治疗、或缓解的方法。药物剂量和给予

[0407] 为了制备包括本发明的Tn3支架的药物组合物或无菌组合物，将支架与一种药学上可接受的运载体或赋形剂混合。用于给予，组合物优选是无热原的，这些组合物基本不含内毒素和/或相关的生热物质。为治疗剂选择给予方案取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状的水平、实体的免疫原性、以及生物基质中的靶细胞的可亲性。在某些实施例中，给予方案使向患者递送的治疗剂与可接受水平的副作用一致的量最大化。

[0408] 在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以被改变，以便获得针对具体的患者、组合物、以及给予模式有效地实现所希望的治疗响应的量的活性成分，而对这位患者是无毒的。选择的剂量水平将取决于各种药物代谢动力学因素，包括所采用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给予途径、给予时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗的持续时间、与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。

[0409] 还可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种给予途径来给予本发明的组合物。在某些实施例中，可以将本发明的Tn3支架进行配制，以保证在体内的适当分布。
等效物

[0410] 本领域的普通技术人员将认识到，或使用不超出常规实验能够确定在此描述的相对于本发明的特定的实施例的很多等效物。这样的等效物也旨在涵盖于以下的权利要求书中。

[0411] 在本说明书提到的所有公开、专利和专利申请均通过引用结合在此，引用程度就如同每个单独公开、专利或专利申请特定地并且单独地指示通过引用结合在此一般。实例

[0412] 现在参考以下实例描述本发明。这些实例仅是说明性的，并且本发明决不应该被解释为局限于这些实例，而是应该被解释为涵盖由于在此所提供的这些教导而变得明显的任何以及所有变化。实例1
在亲本Tn3支架上构建3环文库

[0413] 在描述于国际专利申请公开号WO2009/058379中的亲本Tn3支架的基础上构建一个文库，其中它被指定为“Tn3SS4”。该文库包含BC、DE和FG环的随机化区域。这一设计将特征标记的序列和环长多样性掺入进该Tn3文库中，这与针对天然FnIII结构域所描述的
多样性的模式是一致的，即针对BC和FG环的三个不同的长度，并且使用“NHT”混合密码子方案用来向该文库中引入多样性（H=A、T、C）。这一方案产生了编码12/20氨基酸的12个密码子（参见表3），即每个密码子编码一个独特的氨基酸。此外，不存在终止密码子或半胱氨酸（Cys）密码子。
表3

[0414] 使用示于表4中的简并寡核苷酸产生文库多样性。表4
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T

[0415] 使用示于表5中的寡核苷酸组装该文库。表5

[0416] 将简并寡核苷酸（等摩尔比例的分别对应于BC和FG环的寡核苷酸）、BCX-DE桥v2、DE-FGX桥v2、以及KpnI amp rev v2的混合物组装在20个循环的PCR反应中，而无需过量的外部引物。稀释该产物并且使用引物BC文库amp v2和KpnI反向v2在常规PCR反应中
进行扩增。生成的PCR产物产生一个完整的Tn3基因，然后将该基因用NcoI和KpnI消化
并且将其连接筋噬菌体展示载体中（描述于WO2009/058379中）。通过电穿孔将DNA转化进
10
大肠杆菌中。估计该文库的最终多样性约为7.9x10 成员。

[0417] 电穿孔之后，在振荡下，将该文库在37℃下孵育1小时。添加M13K07辅助噬菌体并且一小时之后，将细胞稀释为更大的体积并且在摇动下，使其在37℃下生长过夜。第二天，除去噬菌体并且用PEG8000通过沉淀从上清液中进行浓缩。实例2
淘选人类CD40L-特异性Tn3支架的文库
10

[0418] 针对CD40L淘选包含>10 独特序列的噬菌体展示的Tn3文库。这些文库中的多样性来源于BC、DE和FG环中的序列和长度变异性，BC、DE和FG环类似于抗体可变域内的
三个CDR环。通过在重组的生物素化的人类CD40L和过量表达CD40L的CHO细胞系上淘选
文库来选择先导物Tn3蛋白质。使用针对这两种试剂的交替轮的淘选来确保先导物将识别重组的细胞外结构域连同天然的膜锚定CD40L。

[0419] 使用5倍摩尔过量的生物素化试剂用EZ-Link sulfo-NHS-生物素（皮尔斯公司（Pierce），罗克福德，伊利诺斯州）生物素化重组的人类CD40L（人类MegaCD40L；Axxora公司）。在室温下孵育1小时后，将该样品在PBS中透析过夜，以除去非共轭的生物素。将10μg生物素化的CD40L固定在M280链亲和素珠粒（Dynal公司，卡尔斯巴德，加州）上，随后在包含10mg/ml BSA的PBS中封闭2小时。输入由如在实例1中描述而研发的文库组成，或额
外地，由使用标准构建技术而研发的文库（例如描述于WO2009/058379中）组成。

[0420] 将噬菌体在包含10mg/ml BSA的PBS中封闭2小时。将封闭的输入添加至封闭的M280链亲和素对照珠粒（没有靶标）中，并且在室温下在摇床（rocker）上孵育2小时，以耗尽具有至珠粒的粘合剂的文库。然后将耗尽的文库添加至CD40L包衣的珠粒中并且在室温下在摇动平台上孵育2小时。在用PBST（PBS+0.1%吐温）洗涤三次以除去未结合的噬菌体之后，将这些珠粒添加至以指数方式生长的大肠杆菌XL-1蓝色细胞（E.coli XL-1Bluecell）中，随后在包含50μg/ml羧苄青霉素的60ml2xYT培养基中用M13KO7辅助噬菌体共感染。
在摇动下在37℃下生长过夜之后，通过PEG沉淀从过夜的培养基中收获噬菌体。

[0421] 在过量表达CD40L的CHO细胞系上进行第二轮淘选（轮2）。将噬菌体文库在在室温下摇动1小时的3%BSA/PBS中进行封闭。用Accutase酶（英杰公司（Invitrogen））分离7
细胞，用5ml PBS洗涤2次，并且将10 个细胞在在室温下摇动30分钟的1ml3%BSA/PBS中
进行封闭。使封闭的细胞在500x g下旋下，持续5分钟，将其轻轻地重悬于封闭的噬菌体文库溶液中，并且在室温下孵育1小时。通过将细胞在1ml3%BSA/PBS中轻轻地洗涤3次并
且在PBS中轻轻地洗涤一次来除去未结合的噬菌体，针对每次洗涤使用新鲜的微量离心管在微量离心机中通过在500x g下离心5分钟来粒化细胞。将细胞小球直接添加至以指数
方式生长的大肠杆菌XL-1蓝色细胞中，然后将其如针对轮1描述的进行处理。

[0422] 如针对轮1描述的进行第3轮淘选，除了通过添加100mM HCl来洗脱结合的噬菌体、随后用1M Tris-HCl，pH8中和以外。如针对轮1描述的，使用洗脱的、中和的噬菌体感染大肠杆菌XL1蓝色细胞。

[0423] 如针对轮2描述的，再次在细胞上进行第4轮淘选，除了在3%BSA/PBS中进行5次洗涤以外。使用5μg的生物素化的MegaCD40L进行第5轮，然而在别的方面却如针对轮3
描述的。

[0424] 在5轮淘选之后，对作为可溶性蛋白的生成的Tn3变体进行筛选。在PCR中使用扩增的并经PEG沉淀的噬菌体液，以扩增一池的涵盖编码Tn3序列的片段。将这一片段池
用NcoI+KpnI消化并且将其克隆进质粒pSec-oppA(L25M)-Tn3的对应的NcoI-KpnI位点
中（参见例如，WO2009/058379）。用pSec-oppA(L25M)-Tn3衍生的构建体转化的大肠杆菌BL21DE3细胞接种在96孔深孔平板中的包含羧苄青霉素（100μg/ml）的自动诱导的魔力培养基（MagicMedia）（英杰公司）中。将培养物在37℃下、在摇动下生长18小时，并且通过离心将细胞与培养基分离。在用于CD40L结合的筛选测定中直接使用包含分泌的、可溶性Tn3变体的培养基。

[0425] 筛选十组克隆，每组96个，以鉴定与重组CD40L特异性结合的Tn3蛋白。简言之，利用的筛选测定通过与固定于微板的孔中的抗-His抗体结合来捕获被分泌进培养基中的可溶性His-标记的Tn3变体。在捕获后，洗掉培养基和过量的蛋白质，并且通过利用生物素化的人类MegaCD40L并且通过SA-HRP和常规的ELISA试剂测量剩余的靶标（在洗涤平板
以后）来监测捕获的Tn3变体与CD40L之间的相互作用。

[0426] 在捕获步骤中，将固定的抗-His抗体用Tn3饱和，并且在每个孔中的捕获的Tn3的摩尔量变得几乎是相同的，与单独的克隆的表达水平无关。Tn3水平的归一化导致检定水平与靶标相互作用的有效率成比例并且不受蛋白质表达水平中的潜在差异的影响。

[0427] 对来自这一测定的阳性物测序，以鉴定与重组CD40L结合的34个独特Tn3序列。从一组独特的CD40L-结合Tn3序列，使通过培养上清液的SDS-PAGE判断的具有鲁棒的测
定信号以及良好的表达水平的一组24个克隆经历再表达以及小规模纯化。

[0428] 简言之，用pSec-oppA(L25M)-Tn3衍生的构建体转化的大肠杆菌BL21DE3细胞接种包含羧苄青霉素（100μg/mL）、具有1%葡萄糖的超级肉汤培养基。使培养物在37℃下生长至0.5-0.8的光密度（O.D.），然后用0.2mM IPTG诱导。在37℃下摇动5小时后，通过离心将细胞与培养基分离。通过使用Ni-NTA Superflow（凯杰公司），在具有20mM咪唑的
2x PBS中洗涤，并且用具有250mM咪唑的2x PBS洗脱进行分批纯化，实现从培养基中纯化Tn3支架。根据Gill（吉尔）和von Hippel（希佩尔）（Anal.Biochem.（分析生物化学）
182:319,1989），将样品在PBS中透析，并且通过在280nm处的UV吸光度确定浓度。

[0429] 基于测定排序和SEC行为，将8个先导物的表达按比例放大并纯化，以降低内毒素水平（<1EU/mg），用于在功能性细胞测定中测试。

[0430] 两个Tn3克隆（被指定为309和311）在生物化学测定和基于细胞的测定中示出相似的活性（图6A、6B、6C），并且比最近的竞争性克隆有力3-5倍。

[0431] 人类CD40L-特异性单价Tn3支架309和311抑制总B细胞数目，浆细胞数目以及Ig类别转换（图6A、6B、6C）。图6A示出了309和311对被Jurkat D1.1细胞刺激的CD19
阳性人类PBMC上的HuCD40L-诱导的CD86表达的抑制作用；图6B示出了309和311对
HuCD40L刺激的B-细胞增殖的抑制；并且图6C示出了T/B细胞共培养中的浆细胞数目的
抑制。通过FACS还示出309结合激活的初始T细胞（数据未示出）。用重组人类MegaCD40L（Axxora公司）或表达人类CD40L的CD40L细胞（D1.1，ATCC）刺激PBMC，并且在24小时后，通过FACS测量CD19+/CD86+细胞的百分比。

[0432] 单分散309和311先导物克隆并且在溶液中不展示出任何凝集或形成较高阶低聚物的趋势，如通过纯化的样品的尺寸排阻色谱法（SEC）分析所确定的（图7A）。

[0433] 使用在PBS pH7.2中的1mg/mL的蛋白质样品通过差示扫描量热法（DSC）确定309和311先导物克隆的热稳定性，并且与亲本Tn3蛋白的热稳定性进行比较（图7B）。309和311先导物克隆具有70±1℃的Tm，该Tm仅略低于亲本Tn3的Tm（72℃）。

[0434] 因为没有鉴定鼠交叉反应的克隆，所以进行如上所述的类似的淘选过程以鉴定被指定为M13的鼠特异性Tn3。M13在基于PBMC细胞的测定中也示出活性（参见图1A）实例3
CD40L-特异性Tn3支架先导物优化

[0435] 使用亲和力优化来增加选择的Tn3先导物的效价。通常，在与靶标接触的Tn3环内进行一轮或多轮诱变，同时从组合的噬菌体展示文库中选择改进的变体。
3.1环交换

[0436] 为了确定在与CD40L的相互作用中涉及两个先导物中的3个环中的哪个环，产生以下构建体，其中每个单一的环序列改变为如在人类生腱蛋白C中发现的亲本Tn3环序列。
如以上描述的针对筛选检定所描述的而进行，在结合测定中比较突变的变体与原始的变体的活性（图10A）。对两个先导物而言，突变BC和DE环导致与CD40L的结合的完全丧失，然而将FG环改变为亲本Tn3序列对结合没有影响（针对309）或具有有限的影响（311）。因此，BC和DE环似乎包含主要负责接触CD40L的序列，并且因此首先被选择用于亲和力优化。
3.2CD40L-特异性Tn3支架309先导物优化

[0437] 因为环交换实验表明309FG-环序列可以被亲本Tn3FG-环序列取代而不实质丢失结合效力，所以决定将这一构建体（被叫做309FGwt）用作亲和力成熟的骨架。这将消除脱离亲本生腱蛋白C序列的非必需突变，以便减少可能的免疫原性风险。应该注意的是，亲本Tn3FG-环序列包含一个RGD基序，该RGD基序稍后通过突变被从最终的先导物分子中消除。
产生三个BC环文库和一个DE-环文库。

[0438] 针对三个BC环文库，进行三轮PCR，使用简并寡核苷酸BC9PCR、BC9-环NNK和309BC-环NNKdope（表6）连同反向引物Kpn1amp rev v2（表5），使用309FGwt衍生的模
板，该模板中的BC-环密码子已经被终止密码子替代。随后，用引物BC文库amp v2（表5）和KpnI反向v2，PCR扩增那些片段，给出全长Tn3文库片段。

[0439] 针对该DE-环文库，用DE PCR和KpnI amp反向v2在309FGwt衍生的模板（其中的DE-环密码子已经被终止密码子替代）上进行PCR扩增，给出一个包含随机化的DE环和
野生型Tn3FG-环的片段，将该片段与编码DE环的Tn3区上游的片段组合，用BC文库amp
v2和BCX-DE桥v2在309模板上通过PCR产生该DE环。在用外部引物BC文库amp v2和
KpnI反向v2的重叠PCR中，将两个片段连接。
表6：用于产生309FGwt LO文库的DNA寡核苷酸
1=所有19aa（-cys）的密码子 2=Ala/Pro的密码子 3=Ala/Gly的密码子；
4=70%G10%A10%C10%T 5=10%G，70%A，10%C，10%T
6=10%G，10%A，70%C，10%T 7=10%G，10%A，10%C，70%T
8=70%A15%C15%T K=50%G/50%T

[0440] 将NcoI-KpnI片段克隆进噬菌体展示载体中，并且如在实例1中所描述的产生噬菌体文库。

[0441] 如在实例2中针对第一轮所描述的，在生物素化的人类MegaCD40L上分别地淘选四个文库，在第1轮中使用4μg CD40L并且在第2轮中使用1μg CD40L。在扩增第2轮
后输出的噬菌体以后，使用Qiagen Spin M13试剂盒（凯杰公司，瓦伦西亚，加州）分离单链DNA，并且使用BC libamp v2和BC改组rev扩增包含来自BC环文库的片段的BC-环的池，
然而使用引物DE-改组FWD和KpnI反向的v2，扩增包含来自DE-环文库的片段的DE-环
的池。将PCR片段进行凝胶纯化并且使用外部引物BC lib amp v2和KpnI反向的v2通过
其重叠序列进行组装。使用生成的PCR片段在噬菌体载体中产生文库，如先前所述。如在实例2中所述，在生物素化的人类MegaCD40L上将这一文库淘选总共5轮，除了在用阻断的M280链亲和素磁珠孵育10分钟随后进行洗涤之前，针对第1轮至第4轮，使文库最初与处
于50nM、20nM、20nM、以及10nM的浓度的靶标（总体积为50μl）进行接触，持续2小时以外。

[0442] 将输出集中克隆进质粒pSec-oppA(L25M)-Tn3pSec的NcoI-KpnI位点中，并且使用在上面所描述的筛选测定中的可溶性蛋白针对CD40L结合对十六个96孔平板进行筛选。
择优挑选270个最高得分的克隆，再次测定并测序。选择十个克隆用于基于结合测定和序列分析的进一步表征。这包括在PBMC测定中评估效价、在生物传感器测定中进行针对结合至CD40L的Kd确定、通过差示扫描量热法确定热力学稳定性、并且通过尺寸排阻色谱法分析确定在溶液中凝集或形更高阶低聚物的趋势。将结果总结于表7中。与十个优化克隆（被指定为340、341、342、343、344、345、346、347、348以及349）比对的309和309FGwt克隆的序列示于图11A和11B中。

[0443] 亲和力成熟的变体展示出比309克隆高1-3个对数的效价，如通过DSC测量的保留高的稳定性，并且如通过SEC测量的大多数是单分散的。
表7

[0444] 通过用表达人类CD40L的Jurkat细胞（D1.1，ATCC）刺激PBMC进行PBMC测定，并且在24小时后，通过FACS测量CD19+/CD86+细胞的百分比。使用这一测定测试一系列先导Tn3支架并对其排序，以出现自基于生化指标的优先次序。PBMC测定的结果示于图10B
中并且总结于表7中。

[0445] 在25℃下，用GLC传感片在ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统（Bio-Rad，赫拉克勒斯（Hercules），加州）上进行亲和力测量。将具有0.005%吐温20的ProteOn磷酸盐缓冲盐水，pH7.4（PBS/吐温）用作电泳缓冲液。将人类MegaCD40L以约2300RU的表面密度固定在芯片上。在PBS/吐温/0.5mg/ml BSA，pH7.4（从150nM至4.7nM）中制备Tn3变
体（340、342、343、345、346、347、348、以及349）的两倍稀释物。将每个浓度的样品以30μl/min的流速注入进六个分析物槽中，持续300秒钟。通过在ProteOn软件中使用平衡分析设置确定Kd。将结果示于表7中。

[0446] 通过DSC对十个TCD40L-特异性Tn3变体的稳定性进行分析。简言之，在VP-Capillary DSC（迈克罗公司（MicroCal））上进行DSC测量。将蛋白质通过广延性透析（extensive dialysis）交换进PBS（pH7.2）中，并且调节至0.25-0.5mg/ml的浓度，用于DSC分析。将样品以90℃/小时的扫描速率从20℃-95℃进行扫描，无需重复扫描。将结
果示于表7中。

[0447] 针对最好的克隆获得了超过309的IC50的高达300倍的改善，以及超过用于产生先导物优化文库的309FGwt骨架的超过1000倍的改善。七个克隆具有个数位nM范围内的
Kd。
3.3CD40L-特异性Tn3支架311先导物优化
在进行先前提到的环用途实验之前（参见图10A）

[0448] 进行聚焦于在311的FG-环中引入多样性的先导物优化文库的初始尝试，产生噬菌体展示文库并对生成的噬菌体展示文库进行筛选。如先前所述，在生物素化的人类
MegaCD40L上淘选4轮之后进行筛选，并且发现大多数阳性目标（hit）在Tn3的N端恒定区（即，BC-环的上游）中包含残基K4至E的偶然突变。没有检测到阳性目标的FG-环序列之间的明显的共有区。向311中引入单K4E突变导致在PBMC测定中的约100倍的效价增加
（从约4μM至36nM）（参见图10C）。

[0449] 因为环交换实验表明与CD40L的结合需要BC和DE环序列，所以然后靶向在311K4E骨架中的这些环，用于进一步的亲和力成熟。产生两个单独的文库。一个文库以下面的策略靶向BC-环，其中每个残基具有50%成为野生型311序列的机会，以及约50%成为
其他11个编码NHT的残基中之一的机会。另一个文库完全随机化6-残基DE-环。

[0450] 针对BC-环文库，在PCR反应中使用寡核苷酸BC11-311Gly和BC11-311NHT（表8），在311衍生的模板上用反向引物KpnI amp rev v2（表5），在311衍生的模板中BC-环密码子已经被终止密码子替代，以产生包括BC、DE和FG环的片段。最后，用引物BC文库
amp K4E和KpnI amp rev v2扩增这些片段的1:1混合物，给出全长Tn3文库片段。

[0451] 如以上描述的309FGwt DE-环文库产生DE-环文库，除了在PCR反应中使用311衍生的模板并且在最终的PCR扩增中使用BC文库amp K4E引物以外。
表8.用于产生311K4E先导物优化文库的寡核苷酸。
1=70%G，10%A，10%C，10%T 2=10%G，70%A，10%C，10%T
3=10%G，10%A，70%C，10%T 4=10%G，10%A，10%C，70%T
5=70%A，15%C，15%T 6=15%A，70%C，15%T
7=15%A,15%C,70%T V=33%A，33%C，33%G
H=33%A，33%C，33%T

[0452] 用NcoI和KpnI消化全长文库片段，将其克隆进噬菌体展示载体中，并且如在实例1中所描述的产生噬菌体文库。

[0453] 如在实例1中所描述的，在生物素化的人类MegaCD40L上分别淘选两个文库，在第1轮中使用10g的蛋白质，在第2轮中使用5g的蛋白质，并且在第3轮中使用5g的蛋白质。
在扩增第3轮后输出的噬菌体后，使用Qiagen试剂盒（凯杰公司，瓦伦西亚，加州）分离单链DNA，并且如针对309FGwt文库所描述的，对两个文库进行改组。如上针对309FGwt改组的文库所描述的，在生物素化的人类MegaCD40L上对改组的文库淘选总共5轮，针对第1轮至第5轮使用100nM、20nM、4nM、1nM以及1nM的靶标。

[0454] 如先前所述，将输出集中克隆进可溶性分泌载体中，并且使用先前所述的可溶性蛋白筛选测定，针对CD40L结合对五个96孔平板进行筛选。相对于用311K4E骨架变体获得的信号鉴定阳性目标。对作为粗的未纯化的蛋白质的18个最高得分的独特克隆，被指
定 为 311K4E_1、311K4E_2、311K4E_3、311K4E_4311K4E_5、311K4E_7、311K4E_8、311K4E_9、
311K4E_10、311K4E_11、311K4E_12、311K4E_13、311K4E_14、311K4E_15、311K4E_16、
311K4E_19、311K4E_20以及311K4E_21（序列示于图12A和图12B中）进行测定，用于解离速率排序。在生物传感器测定中，在ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统（Bio-Rad，赫拉克勒斯（Hercules），加州）上，用固定于芯片上的CD40L进行未纯化的Tn3支架的解离速率估计。将Mega人类CD40L固定于GLC芯片（BioRad）上并且将所有变体稀释至80nM的估
计浓度，将其以30μl/min的流速进行注入，持续300秒钟，同时将解离时间设置为1200秒钟。将PBS，0.005%吐温20，3mMEDTA，pH7.4用作电泳缓冲液。通过目测传感图为解离速率排序。纯化一个亚组的展示出最慢解离速率的四个变体（311K4E_3、311K4E_11、311K4E_12和311K4E_15），并且确定Kd值在1.1nM与6.4nM之间（表9）。
表9.311K4E以及4个与人类CD40L结合的亲和力纯化的变体的Kd。
311变体 Kd（nM）
311K4E 18
311K4E_12 1.1
311K4E_11 6.3
311K4E_15 1.6
311K4E_3 6.4

[0455] 如在图10D中表明的，311K4E_12的降低的Kd（从18nM至1nM）与相对于311K4E骨架在PBMC测定中的效价的12倍的增加相对应。

[0456] 总之，来自天然文库的原始目标309和311的先导物优化活动导致CD40L的个位数nM的粘合剂。

[0457] 在鼠特异性M13分子上进行类似的优化活动（数据未示出）。在PBMC测定中，生成的优化的鼠CD40L-特异性分子（被指定为M31）示出超过亲本分子约20倍的效价的增加（图1A）。
实例4
未加标签的CD40L-特异性Tn3-HSA融合物的表达与纯化

[0458] 通过瞬时转染在哺乳动物293F细胞系中表达如图2A和9A中所概述的融合至HSA的Tn3构建体。基于内部产生的哺乳动物表达载体产生Tn3-HSA融合表达构建体。为了增
加产物同质性，采用HSA的突变形式（被指定为HSA C34S），其中未成对的、部分暴露的半胱氨酸34已经被突变为丝氨酸（Zhao（赵）等人，2009，Eur.J.Pharm.Biopharm.（欧洲制药与生物制药杂志）72:405-11）。

[0459] 可以通过离子交换色谱法（IEX）以一步纯化方式纯化该融合蛋白。通过盐梯度将309-309-HSA从Q-HP柱（GE医疗保健公司（GE HealthCare））洗脱的一个实例示于图9B中。
除了主峰以外，看到次要的稍后的洗脱峰（构成小于10%的总峰面积）。质谱法分析表明这些次要的侧峰富含O-糖基化的309-309-HSA种类。收集包含主峰的部分并且将其用于随
后的活性测定。

[0460] 对于更大规模的纯化，上面提及的IEX步骤的前面是使用HSA亲和基质（例如，HiTrap Blue HP（GE医疗保健公司））通过亲和色谱法从培养上清液中捕获Tn3-HSA融合物。洗涤后，可以用包含辛烯酸的缓冲液洗脱HSA融合蛋白。在磷酸盐缓冲液中稀释3倍
后，将洗脱物装载在Q-HP栏上。

[0461] 一个或多个次要峰的分析揭示O-联的碳水化物部分的存在。提出了O-聚糖是一种衍生自下面所示的先前报道的O-木糖化的核心结构的碳水化合物的异质混合物
（Wakabayashi（若林）等人，1999，J.Biol.Chem.（生物化学杂志）274:5436-5442）：

[0462] 确定占优势的附接位点位于Tn3结构域之间的GGGGS接头中。还发现该聚糖在较小程度上存在于在Tn3与HSA之间发现的GGGGS接头中。因此，与单价构建体相比，O-聚
糖的水平在二价构建体中更高并且与CHO细胞相比，在HEK细胞产生的材料中更高。在不
同Tn3构建体之间的水平也是变化的。因此，可以通过仔细的宿主细胞切割减少O-聚糖的水平，例如使用CHO细胞或其他发现的细胞，用来生产具有更低水平的O-聚糖的材料。此外，可以经由纯化方法除去包含O-聚糖的材料，以产生缺少O-聚糖的更同质的产物。可替代地，可以修饰该接头，以除去O-聚糖附接的一个或多个基本位点，例如通过将Ser残基突变为Gly。将若干构建体中的接头再工程化，以具有一个或多个GGGGG接头，在具有一个或多个GGGGG接头的材料中没有检测到任何类型的O-聚糖并且没有看到活性的差异（数据未示出）。
实例5
CD40L-特异性Tn3支架的血清半衰期的延长

[0463] 将至血清白蛋白的融合开发为用来延长CD40L-特异性Tn3支架的血清半衰期的策略。为了确定鼠CD40L特异性Tn3-MSA融合物的药物代谢动力学（PK）特性，进行小鼠PK测定。由于小鼠FcRn与HSA结合显著地弱于它与MSA的结合，所以选择MSA融合物用于优
于对应的HSA融合物的替代分子的研究，这导致来自核内体的减少的再循环以及因此增加的周转（Andersen（安徒生）等人J.Biol.Chem.（生物化学杂志）285，4826-4836，2010）。

[0464] 使用HEK293细胞表达融合至MSA的小鼠CD40L-特异性串联的二价Tn3支架。观察到高水平的表达（图3A）。这些构建体在Tn3支架单位之间具有1个（G4S）接头并且在支架与MSA之间的接头中具有3个（G4S）重复。此外，向每个M13和M31支架中引入一个N49Q突变，以除去潜在的N-联糖基化位点。这一突变不影响这些支架的效价（数据未示出）。在转染后第6天估算表达水平为200mg/L。通过C端组氨酸标签（C-terminal His-tag）经由IMAC进行纯化。将纯化的蛋白质的产量评估为125mg/L培养上清液。

[0465] 当MSA被融合至二价M13支架时，观察到与不具有MSA的M13二聚体支架相比的8倍的效价的减少（图3B）。包括融合至MSA的亲和力成熟的M31的二价支架比融合至MSA
的对应的二价M13支架有力140倍，比单价M31MSA融合物有力约900倍，并且具有与MR1
抗鼠CD40L单克隆抗体可比较的效价（图3C）。

[0466] 为了确定CD40L-特异性Tn3-MSA融合物的PK特性，进行小鼠PK分析。以10mg/kg向5-7周龄的雌性CD-1小鼠静脉内给予蛋白构建体。在不同时间点将每只小鼠放血
150μl，并且通过ELISA测定确定Tn3-HSA融合物的血清浓度。简言之，将Nunc MaxiSorp平板用抗-FLAG M2抗体（安捷伦公司（Agilent））包衣，在PBS+0.1%吐温（PBST）中的PBST的4%乳中进行封闭，并且用鼠MegaCD40L（Axxora公司）进行孵育。通过其FLAG标签固
定MegaCD40L。将血清样品和蛋白标准品稀释于4%乳PBST中并且在洗涤平板后添加至
PBST中。在孵育之后，将该平板在PBST中洗涤，并且使用兔抗-TN3多克隆抗体（科文斯公司（Covance））来检测Tn3-HSA融合构建体，在标准ELISA方案中使用山羊抗-兔HRP-共
轭的抗体（杰克逊免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch））。基于通过同一Tn3-MSA融合构建体的稀释测定产生的标准曲线的线性回归确定血清样品中的浓度。将浓度确定为3只不同的小鼠的平均值。

[0467] 如在图4A中所见，M31-MSA和M13-M13-MSA分别具有38小时和31小时的半衰期，然而M31-M31-HSA构建体具有12小时的半衰期。相比之下，M13-M13串联构建体（未融合
至MSA）自身展示出30分钟的半衰期（未示出）。

[0468] 与在小鼠支架中的观察结果形成对照，当HSA被融合至人类CD40L特异性支架时，在效价上没有显著的减少。图9C示出通过将包括两个309单体的人类CD40L-特异性二价Tn3支架与HSA融合，在效价上没有显著的减少，如在PMBC测定中所测量的。

[0469] 将人类CD40L-特异性342-HSA单体构建体的PK特性与包括两个取代（L463N和K524L）以在单一的静脉注射后增强猕猴的血清半衰期的342-HSA变体的PK特性进行比
较。向体重在2-5kg的雄性猕猴经由缓慢的团注以10mg/kg给予蛋白构建体。在预剂量、
给药后5分钟和30分钟；给药后2小时、12小时、24小时、以及48小时；以及在第4天、第
8天、第11天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天以及第57天从外周血管中收集
1mL的血液/动物/时间点。通过ELISA测定确定Tn3-HSA融合物的血清浓度。简言之，
将Nunc MaxiSorp平板用抗-FLAG M2抗体（安捷伦公司（Agilent））包衣，在PBS+0.1%吐温（PBST）中的PBST的4%乳中进行封闭，并且用人类MegaCD40L（Axxora公司）进行孵育。
通过其FLAG标签固定MegaCD40L。将血清样品和蛋白标准品稀释于4%乳PBST中并且在洗
涤平板后添加至PBST中。在孵育之后，将该平板在PBST中洗涤，并且使用兔抗-TN3多克
隆抗体（科文斯公司（Covance））来检测Tn3-HSA融合构建体，在标准ELISA方案中使用山羊抗-兔HRP-共轭的抗体（杰克逊免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch））。基于通过同一Tn3-HSA融合构建体的稀释测定产生的标准曲线的线性回归确定血清样品中的浓度。
将浓度标绘于图4B中。342-HSA的构建体的半衰期是约7天，同时342-HSAL463N/K524L变
体构建体在初始线性相期间示出13-17天的增加的半衰期（图4B）。30天后，与野生型HSA构建体比较，342-HSA L463N/K524L变体构建体的血清浓度下降地更迅速。这些观察结果可以表明这一构建体在猴中的一些免疫原性。
实例6
CD40L-特异性Tn3支架的表征
6.1实验方法

[0470] 6.1.1PBMC刺激测定：根据医学免疫公司（MedImmune）安全指南，从健康供体中获得血液。经由CPT试管分离PBMC（在1500g下旋转20分钟）并且用重组人类MegaCD40L6
（Axxora公司）或表达人类CD40L的Jurkat细胞（D1.1，ATCC）刺激1x10PBMC（每种条件）。
在刺激24小时后，通过FACS测量CD19+/CD86+细胞的百分比。使用这一测定测试一系列先导Tn3支架并对其排序，以出现自基于生化指标的优先次序。因为鼠配体与人类受体交叉反应，还可以用表达鼠CD40L的细胞系（D10.G4）或鼠MegaCD40L（Axxora公司ALX522120）代替人类细胞或重组蛋白刺激进行该测定。

[0471] 6.1.2鼠CD40R/NFκB测定：在具有或不具有Tn3支架的情况下，用鼠MegaCD40L（Axxora公司，目录号ALX522120）重组蛋白或过量表达CD40L的D10.G4细胞（ATCC）刺激NFκB报告基因NIH3T3细胞（Panomics公司NFκB报告基因系统和内部mCD40R转染）24小
时。根据制造商的指示，添加Bright-Glow（普洛麦格（Promega）E2610）。经由在EnVision系统（珀金埃尔默（Perkin Elmer））上进行的NFκB报告基因激活，读数为冷光（700）。

[0472] 6.1.3人类CD40R/NFκB测定：在具有或不具有Tn3支架的情况下，用MegaCD40L（Axxora公司ALX522110）重组蛋白或过量表达CD40L的D1.1Jurkat亚克隆细胞（ATCC）刺激报告基因HEK293细胞（Panomics公司并且是内部的）24小时。根据制造商的指示，添加Bright-Glow（普洛麦格（Promega）E2610）。经由在EnVision系统（珀金埃尔默（Perkin Elmer））上进行的NFκB报告基因激活，读数为冷光（700）。

[0473] 6.1.4双细胞测定：从不同供体中分离初始T/B细胞。用纯化的人类B细胞（5x104）5
培养用抗-CD3刺激的、丝裂霉素C处理的人类CD4+T细胞（1x10）。如下进行读数：第2天：
激活标记物（FACS），第5天：B细胞增殖（ATP代谢物，Cell-Titer Glo，英杰公司），第7天：
浆细胞分化（FACS）第7天：Ig产生（ELISA，R&D系统）。

[0474] 6.1.5血小板凝集测定：腺苷二磷酸（ADP）来自Chrono-Log（Havertown，宾夕法尼亚州，美国）。所有其他时间产品至少是试剂等级的。将来自健康志愿者的血样收集在12.9mM柠檬酸钠中并且在150x g下离心15分钟，以获得PRP（富血小板血浆）。在分离PRP后，将试管再次在1,200x g下离心15分钟，以获得PPP（贫血小板血浆）。使用由Mustard（马斯塔德）等人（Br.J.Haematol.（英国血液学杂志）22:193-204，1972）描述的方法洗涤血小板，并且将其重悬于包含CaCl22mM、MgCl21mM、0.1%右旋糖、0.35%牛血清白蛋白、0.05U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶，pH7.35的蒂罗德液中。使用光透透射凝集计（Chrono-Log700-4DR，Chrono-Log公司，Havertown，宾夕法尼亚州，美国）研究血小板凝集并且在用表明的如所描述的血小板激动剂刺激血小板后记录10min。在添加之前，用可溶性CD40L（sCD40L）预孵育Tn3支架，以形成免疫复合物。

[0475] 6.1.6免疫测定：从Colorado Serum（丹佛，科罗拉多州）购买绵羊红细胞（SRBC）并且在使用之前将其立即10倍地稀释于HBSS培养基中。在第0天，用0.2ml稀释的SRBC免疫小鼠。在免疫后第14天经由FACS测定激发的小鼠中的主生发中心（GC）响应（GC B细胞、非-GC B-细胞、以及所有的T细胞亚群）。在第9-13天，在24小时内以表明的增量给予Tn3支架和对照物。

[0476] 6.1.7KLH-特异性T细胞依赖性抗体应答（TDAR）测定：每周向中国来源并且体重为3.1-4.6kg的猕猴（食蟹猴）（科文斯研究产品（Covance Research Products），Alice TX）静脉内地（隐静脉或头静脉）给予一次表明剂量（0.5mg/kg、5mg/kg、40mg/kg）的抑制剂（342-单体-Tn3-HSA和342-342二价体-Tn3-HSA或对照物/载具）。在无菌条
件下，用适当量的灭菌注射用水（供应商中西部兽医供应（Midwest Veterinary Supply），诺里斯，宾夕法尼亚州）使KLH（Lot No.MD158678A，供应商皮尔斯生物技术公司（Pierce Biotechnologies），罗克福德，伊利诺伊州）复水。将小瓶涡旋用于混合并且然后将其收集在无菌的小瓶中。在两种情况下（第1天和第29天），在测试或对照物品给予结束的1小时内，在每个动物的背部的中线的左边皮下地给予1mL的KLH溶液（10mg/mL）。在以下时间点处从所有动物中获得用于进一步分析的血样：预先测试、第4天、第6天、第8天、第11天、第15天、第22天、第25天、第32天、第34天、第36天、第39天、第43天、第46天、第50
天以及第57天。在给药之前，取在第8天、第15天以及第22天收集的样品。在第8天、第
11天以及第15天进行KLH-特异性IgM和IgG抗体滴度的评估。在第15天，KLH-特异性
IgM和IgG抗体的滴度分别示于图5G和5H中。割点滴定法利用ELISA格式，以检测猴血清
中的抗-KLH抗体。将样品用固定在ELISA板上的KLH孵育。孵育后，洗涤平板，并且用山
羊抗-猴IgG-HRP或IgM-HRP检测结合的抗体并且然后用四甲基联苯胺（TMB）可视化。

[0477] 对于所有利用动物的实验而言，遵循当前可接受的良好畜牧业的惯例，例如Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（实验动物的护理和使用指导）；National Academy Press（国家学术出版社），2011。亨廷顿生命科学（Huntingdon Life Sciences），East Millstone，新泽西州被实验动物护理评估和认证国际协会（Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International）（AAALAC）完全认可。针对所需的可能的兽医护理的任何条件并且必要时进行处理，由技术人员监测动物。
6.2CD40L-特异性Tn3支架功能上抵消CD40L:CD40相互作用。

[0478] 表达CD40L的T细胞吸引表达CD40的B细胞导致NFκB信号通路的激活（Zangani（赞格尼），2009）。因此，使用NFκB-荧光素酶报告基因细胞系来确定抗CD40L-Tn3分子是否可以抑制CD40衔接向下游发信号。用处于EC90（导致90%抑制的有效浓度；即，对于人类MegaCD40L而言是1.5μg/ml，并且对于鼠MegaCD40L而言是3μg/ml）的人类抑或鼠
MegaCD40L刺激表达人类CD40L和报告基因的HEK293细胞。

[0479] 人类特异性342分子以1.5nM的IC50抑制人类CD40L-诱导的NFκB活性（图13）。鼠特异性M31分子以IC50=1.6nM抑制鼠CD40L-诱导的NFκB活性（图1B）。阳性对照抗-CD40L单克隆抗体5c8（抗人类CD40L）和MR1（抗鼠CD40L）两者的表现都比单体Tn3
支架好约10倍，IC50为0.200nM+/-SD（测定的最低阈值）。这可能部分归因于单克隆抗体的二价性质，这有助于与其对应的CD40L的相互作用的亲和性。
6.3二聚体CD40L-特异性Tn3支架展示出改善的结合。

[0480] 实验数据表明相对于CD40L-特异性Tn3单体支架的结合，CD40L-特异性Tn3二价支架的结合是改善的。CD40L-特异性Tn3二价支架与CD40L的结合改善对靶标的作用，在
一些情况下，在体外超过CD40L特异性Tn3单体支架的作用的约3个对数，如示于图2C和
图2D中（鼠科动物），以及图8A和图8B中（人类）。

[0481] 图2C示出了鼠CD40L-特异性单价（M13）或二价串联支架对鼠CD40L与固定于生物传感器芯片上的鼠CD40受体的结合的竞争性抑制。M13单体与变化长度的肽接头
连接，这些肽接头包括一个（1GS）、三个（3GS）、五个（5GS）或七个（7GS）“GGGGS”重复。
M13-1GS-M13支架的IC50是29nM，然而单体M13支架的IC50是71nM。具有更长接头的二价
M13支架的IC50是引人注目地更低的（5-6nM）。

[0482] 图2D示出了鼠CD40L-特异性单价的（M13）或二价的串联支架对B细胞上的鼠CD40L-诱导的CD86表达的抑制作用。二价支架比单价支架有力约3个对数。

[0483] 图8A和8B示出人类CD40L-特异性Tn3支架309和311以二价串联模式展示出增强的效价。二价311支架（图8A）和二价309支架（图8B）在抑制用Jurkat D1.1细胞刺激的CD19阳性人类PBMC上的人类CD40L-诱导的表达方面分别示出约7倍和500-1000倍
的改善。二价309支架与生源体的5c8抗-人类CD40L单克隆抗体在效价上是可比较的。

[0484] 溶解度、稳定性以及纯化的容易没有被添加的不同长度的肽接头破坏，这些肽接头包括一个（1GS）、三个（3GS）、五个（5GS）或七个（7GS）“GGGGS”重复（参见图2B）。6.4CD40L-特异性Tn3支架结合与功能。

[0485] 除了上面描述的生物化学结合以外，重要的是证实这些新颖的Tn3支架能够结合激活后在初始T细胞上表达的内源CD40L。从多个供体中分离T细胞并且如所描述的进行激活。24小时后，上调CD40L表达，如通过用5c8（人类-特异性的）单克隆抗体和MR1
（鼠-特异性的）单克隆抗体染色所确定的（数据未示出）。因为单克隆抗体证实这些分子可以结合天然蛋白质，所以CD40L-特异性Tn3支架分子能够检测的可比较水平的CD40L表
达。

[0486] CD40L:CD40相互作用的功能后果之一是B细胞上的共刺激分子的上调（Yellin（叶琳）等人，J.Exp.Med.（实验医学杂志）6:1857-1864，1995）。针对其阻止共刺激分子的上调的能力对CD40L-定向的Tn3分子进行测试。使用内源表达人类或鼠CD40L（分别是
D1.1Jurkat亚克隆或D10.G4）的细胞系刺激外周血单核细胞（PBMC）。一旦被刺激，便经由流式细胞计数法通过测量由CD19+B细胞上调的CD86的百分比评估B细胞的激活。在这
一测定中，阳性对照单克隆抗体能够以0.170nM（5c8）和0.230nM（MR1）的IC50抑制表达CD86的细胞的CD19+百分比。人类特异性优化的Tn3（342）能够以IC50值=0.700nM拮抗
CD86上调（n=5个供体）（参见图10B和表7）。

[0487] 鼠特异性优化的Tn3（M31）具有1.5nM的IC50。当使用Mega-CD40L重组蛋白刺激PBMC时，观察到这些类似的结果。实验数据证明两种分子（无论是鼠特异性的还是人类特异性的）不仅可以抑制细胞内的主要信号通路（NFκB），还可以抑制抑制其最重要的功能角色之一：T-B细胞相互作用。这一抑制作用可以消解CD40L在许多自身免疫性疾病和病
症中的贡献。
6.5抗-CD40L Tn3抑制T/B共培养后的B细胞增殖和浆细胞分化。

[0488] T细胞上的CD40L与表达CD40的B细胞的相互作用是T细胞帮助的一个基本方面，这协助获得性免疫应答的发展（Banchereau（邦舍罗），1994；Oxenius（欧恩尼斯），1996，van Kooten（范库腾）&Banchereau（邦舍罗），1997）。为了模拟这一相互作用，在T细胞和B细胞的初始细胞共培养物中评价340、342以及342-342二聚体的抗-hCD40L Tn3-HSA融
合物，其中用纯化的人类B细胞培养抗-CD3刺激的、丝裂霉素C处理的人类CD4+T细胞。
测量B细胞在第四天增殖到第七天分化为浆细胞（PC）并且转换其产生的抗体类别的能力（PC和抗体数据未示出）（图15）（Ettinger（埃廷格），2007）。在不存在支架的情况下，或在存在非特异性对照支架的情况下，如与B细胞的细胞增殖相比，CD40L-特异性Tn3支架
342-342-HSA能够以至少50%减少T细胞诱导的增殖。当CD40L:CD40连接时，增殖是浆细
胞分化的前体信号。还观察到浆细胞分化以及抗体类别转换的抑制（数据未示出）。
6.6CD40:CD40L轴的体内破坏。

[0489] CD40L:CD40R相互作用在T-依赖性免疫应答中的中心作用已经被很好地表征（Noelle（诺艾尔），1992；Renshaw（伦肖），1994，Wykes（威克斯），2003）。通过在第零天用绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠（静脉内地），使用鼠CD40L-特异性Tn3支架M31（M31-MSA和M31-M31-MSA）评价这些新颖的分子在T-依赖性免疫模型中的作用。

[0490] 在第9-13天，每天用表明的剂量的抑制剂腹膜内地注射小鼠并且在第14天，测定脾脏和淋巴结GC B细胞的数量。需要每天给药，给出这一分子体内的短的T1/（2 即31小时）（图4）。从先前发现（Jacob（雅各布），1991）中已经公认CD40L控制体液应答，例如在解剖部位（例如脾脏和淋巴结）中的生发中心的产生。在此，在用M31-MSA对比天然的或我们的非特异性对照物（D1-MSA）的剂量依赖性方式中观察到有助于生发中心形成的CD40L:CD40轴的破坏，如由GC B细胞的百分比所示出的。

[0491] 甚至在10mg/kg处，M31-MSA能够摧毁GC B细胞（图5B）连同MR1单克隆抗体（图5A）的百分比。其他的细胞亚群（包括特异性T细胞群体）似乎是正常的，这保证观察到的这些结果不是由于T细胞耗尽（图5C、图5D、图5E）。此外，来自抗-SRBC Ig ELISA数据的结果反映生发中心B细胞数据的结果（图5F）。一并考虑，这些数据表明鼠-特异性Tn3支架M31-MSA可以废除经由CD40信号传导驱动的反应。

[0492] 类似地，使用人类CD40L-特异性Tn3支架342（342-HSA和342-342-HSA）来评价这些新颖的分子在猕猴中的KLH-特异性T细胞依赖性抗体应答（TDAR）模型中的作用。
在此，CD40L:CD40轴的破坏导致至KLH抗原的抗体的产生的剂量依赖性方式抑制。如在图
5G和5H中所示，342-二价构建体在0.5mg/kg（mpk）处抑制IgM和IgG抗体的水平并且在
5mg/kg处看到几乎完全抑制。342-单体构建体也抑制IgM和IgG的水平，但是在40mg/kg
的更高浓度处看到几乎完全抑制。这些数据表明人类特异性Tn3支架构建体342-HSA和
342-342-HSA两者都可以废除经由CD40信号传导驱动的反应。
6.7人类CD40L-特异性Tn3支架不诱导血小板凝集。

[0493] 当在若干患者中出现血栓栓塞时，便停止了用抗-CD40L单克隆抗体的人类临床试验（Davidson（戴维森）等人Arth Rheu（类风湿关节炎），43:S271）。随后的预临床分析提示这是抗-CD40L单克隆抗体的靶标类别效应。因此，重要的是在血小板凝集测定中测试人类CD40L-特异性Tn3支架。

[0494] 当使用三个具有生理学CD40L的分子与一个具有抗-CD40L单克隆抗体的分子的比率时，在柠檬酸盐富血小板血浆（PRP）、洗涤的血小板、以及全血中观察到促凝结效应（图
16A）。这些效应是由单克隆抗体Fc结构域依赖性相互作用随后是CD40L结合介导的（数据未示出）。在不存在Fc结构域融合物的情况下，没有观察到凝集。在具有任何作为二聚体或作为HSA融合蛋白的人类CD40L特异性Tn3支架的多个供体中没有观察到凝集（图16B
和16C）。

[0495] 在血小板的存在下，通过创建可溶性CD40L/抗-CD40L单克隆抗体免疫复合物观察到如在临床试验中观察到的有害的副作用（图16A和在16C图上的5C8轨迹）。此现象的另一个实例可以在转基因人类FcγRIIa鼠研究的组织学中看到（Francis（弗朗西斯）等人，2010）。当给予可溶性CD40L/单克隆抗体免疫复合物时，在给予后的数分钟内，在肺组织内看到丰富的血栓。然而，当用抗-CD40L Tn3支架重复时，根据对照样品，在肺中存在正常的组织学（数据未示出）。
实例7
被工程化以结合CD40L的纤连蛋白III型结构域：两种复合物的克隆，表达，纯化，结晶
以及初步的X射线衍射分析。

[0496] 将重组人类可溶性CD40L与两个都被从噬菌体展示文库中分离为CD40L粘合剂的CD40L-特异性Tn3单体支架309和311K4E-12共结晶。晶体衍射分别为 和
此外，将重组人类可溶性CD40L与优化的Tn3单体342单独共结晶并且与342单体
和311K4E_12单体两者共结晶。针对这些结构，晶体衍射分别为 和 对应的晶体
结构有助于理解Tn3支架与CD40L之间的相互作用并且可以将其用来设计更高亲和力的
CD40L粘合剂以及结合多个表位的串联构建体。
7.1Tn3分子和人类可溶性CD40L的表述与纯化

[0497] 为了产生用于结晶的无标签的Tn3分子，使用内部IPTG-可诱导的载体在大肠杆菌中表达蛋白质，该载体被设计用来将重组表达的蛋白质分泌进周质间隙。除了
凝血酶切割位点以外，这一载体具有一个Ptac启动子，即OppA信号肽突变体L25/M
（MTNITKRSLVAAGVLAALMAGNVAMA）（SEQ ID NO：210）、一个C端8xHis-标签。将Tn3序列在信号肽与凝血酶切割位点之间进行亚克隆。

[0498] 根据制造商的说明（凯杰公司，瓦伦西亚，加州，美国），使用Ni-NTA树脂纯化表达的分泌型His-标记的蛋白质，并且然后由凝血酶切割，随后再次进行Ni-NTA亲和纯化，以除去未切割的完全蛋白质和切割的His-标记的片段。这一纯化步骤之后是使用HiTrap Q柱（GE医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国）的离子交换步骤，在 提纯器（GE医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国）上进行。基于SDS-PAGE和SEC结果，纯化的无标签的Tn3蛋白质示出大于95%的纯度和同质性。

[0499] 通过GeneArt用N端6xHis-标签合成人类可溶性CD40L（113-261，UNIPROT：P29965）基因并且在巨细胞病毒主要立即早期（hCMVie）启动子的控制下将其内部地克隆进哺乳动物表达载体中（Boshart（包沙特）等人，Cell（细胞）41：521–530,1985）。将CD40L基因克隆进具有CD33信号肽的框架中。使用在该载体中的EBNA和Ori P基因增加蛋白
质表达。CD40L基因还掺入SV40多-A序列，以允许其mRNA3’-端的适当加工。将该构建
体瞬时转染进293F悬浮细胞（生长在293Freestyle培养基中并且使用293Fectin的人胚
肾细胞[HEK]，英杰公司，卡尔斯巴德，加州，美国）中。使用标准方案使细胞生长并且在第
4天和第8天后收获培养基。然后使用Ni-NTA树脂纯化可溶性CD40L蛋白质，随后是使用
Hi-Trap SP FF柱（GE医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国）的离子交换步骤，并且在50mM Tris pH7.5，50mM NaCl中透析。

[0500] 为了制备复合物，将分子Tn3（309或311K4E_12或342）与CD40L以1.1:1比率混合，使用Vivaspin浓缩器（30,000Da截留；GE医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国）浓缩至约10mg/ml并且使其经受尺寸排阻色谱法（SEC），使用用50mM Tris-HCl，pH7.5、
100mM NaCl、0.02%NaN3预平衡的Superdex20010/300GL柱（GE医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国）（图19，图A）。在分离步骤后，将该复合物浓缩至18mg/ml并且使其经受结晶。基本如上所述，使用1.1:1.1:1比率的三种组分制备342-311K4E_12-CD40L复合物。
7.2结晶筛选与优化

[0501] 使用Phoenix结晶机器人（艺术罗宾斯仪器公司（Art Robbins Instruments），桑尼维尔，加州，美国）在96-孔易达利平板（Intelli-plate）（艺术罗宾斯仪器公司（Art Robbins Instruments），桑尼维尔，加州，美国）上建立沉滴结晶实验，通过将300nL体积的孔溶液与蛋白复合物溶液混合在滴隔区中并且使其针对50μL的孔溶液而平衡。使用来自汉普顿研究公司（Hampton Research）（亚里索维耶荷，加州，美国）、绿宝生物系统公司（Emerald BioSystems）（班布里奇岛，华盛顿州，美国）以及分子维度公司（Molecular Dimensions）（阿波普卡（Apopka），佛罗里达州，美国）的商业结晶筛选。

[0502] 309-CD40L、342-CD40L和342-311K4E_12-CD40L复合物的结晶各自都需要一个优化步骤，该优化步骤包括使用Additive Screen HT（汉普顿研究公司，亚里索维耶荷，加州，美国）的额外的筛选。在优化步骤中，将96孔平板的孔溶液用来自初始筛选的80%的成功溶液（successful solution）以及20%的对应的添加剂填充。在将后者彻底混合后，滴剂由300nL的蛋白溶液以及300nL的新的孔溶液组成。直接从96孔平板收获衍射品质的晶体。用于低温保存，将晶体转移至具有增加的甘油浓度的母液的三个连续溶液中。

[0503] 使衍射品质的311-CD40L晶体在不需要添加低温试剂的初始筛分溶液中生长。7.3X射线衍射和数据收集

[0504] 在配备有ADSC Q315R CCD X射线检测器（区域检测器系统公司（Area Detector Systems Corporation），波威，加州，美国）的劳伦斯伯克利国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory）（加利福尼亚大学，伯克利）中，在Beamline5.0.3的高级光源处从单晶体中收集309-CD40L复合物的衍射图。在300mm的晶体对检测器（crystal-to-detector）距离以及0.8秒钟的曝光时间下收集360个具有0.5°的振荡区间的连续图像。

[0505] 在配备有Rayonix225HE检测器（Rayonix有限责任公司，埃文斯顿，伊利诺伊州，美国）的阿贡国家实验室（Argonne National Laboratory）（芝加哥大学，芝加哥，伊利诺伊州）中，在Beamline31-ID-D的高级光子处从单晶体中收集311K4E_12-CD40L、
342-CD40L以及342-311K4E_12-CD40L复合物的X射线衍射图。在300mm的晶体对检测器
（crystal-to-detector）距离以及0.8秒钟的曝光时间下收集180个具有1°的振荡区间
的连续图像。

[0506] 使用HKL2000套具进行所有数据组的减少和缩放（Otwinowski（敖提因思科）&Minor（米诺尔），Methods in Enzymology（酶学方法），276:307-326.1997）。
7.4结果和讨论

[0507] 309-CD40L复合物的最具重复性的结晶条件似乎是Peg/Ion筛选（汉普顿研究公司）中的B5（0.2M NaNO3，20%PEG3350）。用附加的筛选（Additive Screen）的进一步优化从A1条件（0.1M BaCl2·2H2O）产生了衍射品质的晶体。从96孔平板收获示于图19，图B
中的晶体，并且在转移至补充有20%甘油的母液溶液中后将其在液氮中冷却。

[0508] 空间群对称：该晶体属于具有 的晶胞参数并且衍射为 的正交晶空间群。预期不对称单位包含一个CD40L的三聚体以及三
个具有约 的VM值的309分子。

[0509] 对于311K4E_12-CD40L结晶，Cryo I&II筛选（绿宝生物结构公司（EmeraldBioStructures））产生了许多既不需优化又不需低温保存的条件。将来自条件F7
（40%PEG600，0.1M CH3COONa，0.2M MgCl2）的单晶体（图19，图C）用于数据收集。

[0510] 空间群对称：该晶体属于具有 的晶胞参数并且衍射为 的立体空间群P213。该不对称单位包含一个CD40L以及一个具有约 的VM值的311K4E_12
分子。

[0511] 342-CD40L空 间 群 对 称：该 晶 体 属 于 具 有的晶胞参数，分离度为 的空间群P321。该不对称单位包含一个
CD40L单体以及一个342单体。

[0512] 342-311K4E_12-CD40L空 间 群 对 称：该 晶 体 属 于 具 有β=98.22°的晶胞参数，分离度为 的空间群P21。该
不对称单位包含两个CD40三聚体、六个342单体、以及六个311K4E-12单体。

[0513] 针对所有结构的数据统计示于表10中。表10.X射线数据收集统计。

[0514] CD40L形成一个三聚体（图17A中的多肽A、B和C）。每个309Tn3支架（图17A中的多肽D、E和F）都与两个CD40L多肽接触。晶体结构揭示在每个309支架与第一和第二
CD40L多肽之间存在六个特异性接触。BC中的天冬氨酸17与第一CD40L中的苏氨酸251接
触。BC环中的谷氨酸18与第一CD40L中的精氨酸203接触并且与第二CD40L中的异亮氨
酸204接触。DE环中的丝氨酸47与第一CD40L中的组氨酸249接触。DE环中的色氨酸49
与第一CD40L中的缬氨酸247接触。FG环中的天冬氨酸70与第二CD40L中的丝氨酸185
接触（参见图17A）。与311支架接触的CD40L氨基酸残基也被示于图18A中。

[0515] 在309的情况下，每个311K4E_12单体支架（图17B中的多肽A、B、和C）都与两个CD40L多肽接触。晶体结构显示在每个311K4E_12支架与第一和第二CD40L多肽之间存在19个特异性接触。BC环中的天冬酰胺17与第一CD40L中的酪氨酸146和谷氨酸142接触。
BC环中的精氨酸18与第一CD40L中的谷氨酸142、酪氨酸146、以及甲硫氨酸148接触。BC
环中的丝氨酸19与第一CD40L中的谷氨酸142和亮氨酸155接触。BC环中的丝氨酸22与
第一CD40L中的天冬酰胺151接触。BC环中的组氨酸15与第一CD40L中的酪氨酸146接
触。DE环中的组氨酸51与第一CD40L中的酪氨酸146接触并且与第二CD40L中的谷氨酸
230接触。DE环中的缬氨酸50与第二CD40L中的谷氨酸230接触。311K4E_12单体支架的
N端区被连接至第二CD40L。第二CD40L中的精氨酸200与311K4E_12的N端区中的苏氨
酸7、天冬氨酸8、以及苏氨酸10接触。第二CD40L中的精氨酸203与谷氨酸4和天冬氨酸
5接触。与309支架接触的CD40L氨基酸残基也被示于图18B中。

[0516] 与309和311K4E_12处于复合物形式的CD40L的晶体结构示出311K4E_12和309单体与位于该CD40L三聚体复合物的不同部分中的不同表位结合（图17C）。这些结构示出，两个支架都结合在将与CD40受体相互作用的同一沟中。

[0517] 与CD40L一起的342的晶体结构提供于图20中并且示出与亲本309克隆相比，尽管342与CD40L的同一部分结合，但是看到接触残基中的特异性变化。确切地，在342中，BC环中的天冬氨酸18与CD40L的苏氨酸251接触并且DE环的组氨酸47与CD40L的组氨
酸249接触，DE环的组氨酸48与CD40L的组氨酸249、丝氨酸245和丝氨酸248接触，并且
DE环的组氨酸50与CD40L的缬氨酸247接触。

[0518] 与CD40L一起的342和311K4E_12的晶体结构证明两个支架都可以同时与其对应的表位结合，这些表位位于该CD40L三聚体复合物的不同部分（图21）。维持每个单独的支架（如上所述）的接触。

[0519] 上面示出的这些实例说明本发明的不同方面以及本发明的方法的实践。这些实例并不旨在提供本发明的许多不同实施例的穷尽性的描述。因此，尽管出于理解的清楚的目的已经经由说明和实例较为详细地描述了本发明，但是本领域的普通技术人员将容易认识到，可以在不偏离所附权利要求书的精神或范围的情况下做出许多改变和修饰。

[0520] 在本说明书提到的所有公开、专利和专利申请均通过引用结合在此，引用程度就如同每个单独公开、专利或专利申请特定地并且单独地指示通过引用结合在此一般。序列
SEQ ID NO：1
CD40L sp|P29965|CD40L_人类–膜形式
胞质域=1-20
信号锚定II型膜蛋白区=21-46
可溶态=113-261
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLH
EDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNP
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSN
REASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVN
VTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
SEQ ID NO：2
CD40L–可溶态，也对应于共结晶的构建体
MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIY
AQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQ
PGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
SEQ ID No：3
Tn3（具有未修饰的环）
IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：4
生腱蛋白C的第三FnIII，AB环（Tn3）
KDVTDTT
SEQ ID NO：5
生腱蛋白C的第三FnIII，BC环（Tn3）
FKPLAEIDG
SEQ ID NO：6
生腱蛋白C的第三FnIII，CD环（Tn3）
KDVPGDR
SEQ ID NO：7
生腱蛋白C的第三FnIII，DE环（Tn3）
TEDENQ
SEQ ID NO：8
生腱蛋白C的第三FnIII，EF环（Tn3）
GNLKPDTE
SEQ ID NO：9
生腱蛋白C的第三FnIII，FG环（Tn3）；还在309FGwt、340、341、342、343、344、345、346、
347、348、以及349克隆中
RRGDMSSNPA
SEQ ID NO：10
生腱蛋白C的第三FnIII，β链A（Tn3）
RLDAPSQIEV
SEQ ID NO：11
生腱蛋白C的第三FnIII，β链A（Tn3）N端平截
IEV
SEQ ID NO：12
生腱蛋白C的第三FnIII，β链B（Tn3）
ALITW
SEQ ID NO：13
生腱蛋白C的第三FnIII，β链C（Tn3变体）
CELAYGI
SEQ ID NO：14
生腱蛋白C的第三FnIII，β链C（Tn3）
CELTYGI
SEQ ID NO：15
生腱蛋白C的第三FnIII，β链D（Tn3）
TTIDL
SEQ ID NO：16
生腱蛋白C的第三FnIII，β链E（Tn3）
YSI
SEQ ID NO：17
生腱蛋白C的第三FnIII，β链F（Tn3）
YEVSLIC
SEQ ID NO：18
生腱蛋白C的第三FnIII，β链G（Tn3）
KETFTT
SEQ ID NO：19
克隆309-分离自天然Tn3文库的亲本克隆
AIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：20
克隆309-分离自天然Tn3文库的亲本克隆（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICYTDQEAGNPAKETFTT
SEQ ID NO：21
克隆309FGwt-具有“人源化的”FG环的亲本克隆
AIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：22
克隆309FGwt-具有“人源化的”FG环的亲本克隆（w/o N-端A，以及C-端接头和His8
标签）
IEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：23
克隆340-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDDFDNYEWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：24
克隆340-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDDFDNYEWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：25
克隆341-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDDFADYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：26
克隆341-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDDFADYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：27
克隆342-亲和力成熟的变体（w/WT FG环）
AIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：28
克隆342-亲和力成熟的变体（w/WT FG环；w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：29
克隆343-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWLDDWGSYHVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHQAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：30
克隆343-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWLDDWGSYHVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHQAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：31
克隆344-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDEVGDYVVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：32
克隆344-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDEVGDYVVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：33
克隆345-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDDFAEYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：34
克隆345-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDDFAEYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：35
克隆346-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDDFEEYVVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：36
克隆346-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDDFEEYVVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：37
克隆347-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDEVGQYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：38
克隆347-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDEVGQYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：39
克隆348-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDDIGLYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWFHQAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：40
克隆348-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDDIGLYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWFHQAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：41
克隆349-亲和力成熟的变体
AIEVKDVTDTTALITWSDEHAEFIGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT
EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：42
克隆349-亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWSDEHAEFIGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE
YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：43
克隆311-分离自天然Tn3文库的亲本克隆
AIEVKDVTDTTALITWTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：44
克隆311-分离自天然Tn3文库的亲本克隆（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标签）
IEVKDVTDTTALITWTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：45
克隆311K4E-来自第一轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：46
克隆311K4E-来自第一轮亲和力成熟的变体（w/o N-端A，以及C-端接头和His8标
签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：47
克隆311K4E_1-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWINRSYYADLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLDQIYVHYSIGNLKP
DTKYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：48
克隆311K4E_1-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWINRSYYADLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLDQIYVHYSIGNLKPD
TKYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：49
克隆311K4E_2-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSHLDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSAAIYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：50
克隆311K4E_2-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSHLDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSAAIYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：51
克隆311K4E_3-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体
AIEVEDVTDTTALITWINRSSYHNFPHCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：52
克隆311K4E_3-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWINRSSYHNFPHCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：53
克隆311K4E_4-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNHLGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNNIYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：54
克隆311K4E_4-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNHLGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNNIYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：55
克隆311K4E_5-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNFHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：56
克隆311K4E_5-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNFHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：57
克隆311K4E_7-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSFYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：58
克隆311K4E_7-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSFYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：59
克隆311K4E_8-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYAYLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：60
克隆311K4E_8-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYAYLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：61
克隆311K4E_9-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWINRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：62
克隆311K4E_9-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWINRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：63
克隆311K4E_10-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：64
克隆311K4E_10-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：65
克隆311K4E_11-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYANLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：66
克隆311K4E_11-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYANLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：67
克隆311K4E_12-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：68
克隆311K4E_12-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTT
SEQ ID NO：69
克隆311K4E_13-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWINRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：70
克隆311K4E_13-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWINRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：71
克隆311K4E_14-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTARSAYSHHHYCELTYGIKDVPGDRTTIDLRQPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：72
克隆311K4E_14-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTARSAYSHHHYCELTYGIKDVPGDRTTIDLRQPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：73
克隆311K4E_15-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHHCELTYGIKDVPGDRTTIDLELYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：74
克隆311K4E_15-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHHCELTYGIKDVPGDRTTIDLELYVHYSIGNLKPDT
EYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：75
克隆311K4E_16-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSDLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：76
克隆311K4E_16-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSDLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：77
克隆311K4E_19-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTHRSAYSNHSFCELTYGIKDVPGDRTTIDLNTPYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：78
克隆311K4E_19-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTHRSAYSNHSFCELTYGIKDVPGDRTTIDLNTPYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：79
克隆311K4E_20-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSLYANFHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLEQVYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：80
克隆311K4E_20-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSLYANFHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLEQVYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：81
克隆311K4E_21-来自第二轮亲和力成熟的变体
AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQVYVHYSIGNLKP
DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH
SEQ ID NO：82
克隆311K4E_21-来自第二轮亲和力成熟的克隆变体（w/o N-端A，以及C-端接头和
His8标签）
IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQVYVHYSIGNLKPD
TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT
SEQ ID NO：83
克隆309和309FGwt-BC环
SDEFGHYDG
SEQ ID NO：84
克隆340-BC环
SDDFDNYEW
SEQ ID NO：85
克隆341-BC环
SDDFADYVW
SEQ ID NO：86
克隆342-BC环
SDDFGEYVW
SEQ ID NO：87
克隆343-BC环
LDDWGSYHV
SEQ ID NO：88
克隆344-BC环
SDEVGDYVV
SEQ ID NO：89
克隆345-BC环
SDDFAEYVG
SEQ ID NO：90
克隆346-BC环
SDDFEEYVV
SEQ ID NO：91
克隆347-BC环
SDEVGQYVG
SEQ ID NO：92
克隆348-BC环
SDDIGLYVW
SEQ ID NO：93
克隆349-BC环
SDEHAEFIG
SEQ ID NO：94
克隆309、309FGwt、341、345、346、349-DE环
WWHSAW
SEQ ID NO：95
克隆340、344、347-DE环
WYHMAW
SEQ ID NO：96
克隆342-DE环
WYHHAH
SEQ ID NO：97
克隆343-DE环
WYHQAW
SEQ ID NO：98
克隆348-DE环
WFHQAW
SEQ ID NO：99
克隆309-FG环
YTDQEAGNPA
SEQ ID NO：100
克隆311、311K4E-BC环
TNRSSYYNLHG
SEQ ID NO：101
克隆311K4E_1-BC环
INRSYYADLHG
SEQ ID NO：102
克隆311K4E_2-BC环
TNRSSYSHLDG
SEQ ID NO：103
克隆311K4E_3-BC环
INRSSYHNFPH
SEQ ID NO：104
克隆311K4E_4-BC环
TNRSSYSNHLG
SEQ ID NO：105
克隆311K4E_5-BC环
TNRSSYSNFHG
SEQ ID NO：106
克隆311K4E_7-BC环
TNRSFYSNLHG
SEQ ID NO：107
克隆311K4E_8-BC环
TNRSSYAYLHG
SEQ ID NO：108
克隆311K4E_9、311K4E_13-BC环
INRSSYANLHG
SEQ ID NO：109
克隆311K4E_10-BC环
TNRSSYANYHG
SEQ ID NO：110
克隆311K4E_11-BC环
TNRSSYANLPG
SEQ ID NO：111
克隆311K4E_12-BC环
TNRSSYSNLHG
SEQ ID NO：112
克隆311K4E_14-BC环
TARSAYSHHHY
SEQ ID NO：113
克隆311K4E_15-BC环
TNRSSYANYHH
SEQ ID NO：114
克隆311K4E_16-BC环
TNRSSYSDLPG
SEQ ID NO：115
克隆311K4E_19-BC环
THRSAYSNHSF
SEQ ID NO：116
克隆311K4E_20-BC环
TNRSLYANFHG
SEQ ID NO：117
克隆311K4E_21-BC环
TNRSSYSNLPG
SEQ ID NO：118
克隆311、311K4E、311K4E_9、311K4E_16-DE环
SSPYVH
SEQ ID NO：119
克隆311K4E_1-DE环
DQIYVH
SEQ ID NO：120
克隆311K4E_2-DE环
SAAIYVH
SEQ ID NO：121
克隆311K4E_3、311K4E_5、311K4E_11、311K4E_13-DE环
NSPYVH
SEQ ID NO：122
克隆311K4E_4-DE环
NNIYVH
SEQ ID NO：123
克隆311K4E_7、311K4E_8、311K4E_10、311K4E_12-DE环
NQPYVH
SEQ ID NO：124
克隆311K4E_14-DE环
RQPYVH
SEQ ID NO：125
克隆311K4E_15-DE环
ELYVH
SEQ ID NO：126
克隆311K4E_19-DE环
NTPYVH
SEQ ID NO：127
克隆311K4E_20-DE环
EQVYVH
SEQ ID NO：128
克隆311K4E_21-DE环
NQVYVH
SEQ ID NO：129
克 隆 311、311K4E、311K4E_1、311K4E_2、311K4E_3、311K4E_4、311K4E_5、311K4E_7、
311K4E_8、311K4E_9、311K4E_10、311K4E_11、311K4E_13、311K4E_14、311K4E_15、
311K4E_16、311K4E_19、311K4E_20、311K4E_21-FG环
LTTDGTYSNPA
SEQ ID NO：130
克隆311K4E_12-FG环
LTTDGTYNNPA
SEQ ID NO：131
2GS接头–(Gly4Ser)2
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO：132
3GS接头–(Gly4Ser)3
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：133
HSA C34S突变体
Cys->Ser突变位置被加下划线
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE
NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV
DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP
KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK
VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA
DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC
CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST
PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES
LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT
KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：134
342-2GS-HSAC34S-单价构建体
HSAC34S被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI
AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG
EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR
HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK
FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV
FLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ
NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR
MPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE
TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE
TCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：135
342-3GS-342-2GS-HSAC34S二价构建体
HSA被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS
SNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV
KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE
CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS
QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE
KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD
YSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE
YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQL
CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE
RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL
SEQ ID NO：136
311克隆家族AB环N-端E变体
EDVTDTT
SEQ ID NO：137
311克隆家族EF环C-端K变体
GNLKPDTK
SEQ ID NO：138
HSA人类全长
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE
NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV
DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP
KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK
VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA
DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC
CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST
PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES
LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT
KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：139
309FG环变体（RR->RS突变体）；可以存在于342构建体中
RSGDMSSNPA
SEQ ID NO：140
2GX接头–(Gly4X)2；X=Ala、Gly、Leu、Ile、Val
GGGGXGGGGX
SEQ ID NO：141
3GX接头–(Gly4X)3；X=Ala、Gly、Leu、Ile、Val
GGGGXGGGGXGGGGX
SEQ ID NO：142
G10接头–(Gly4Gly)2
GGGGGGGGGG
SEQ ID NO：143
G15接头–(Gly4Gly)3
GGGGGGGGGGGGGGG
SEQ ID NO：144
342-G10-HSAC34S-单价构建体2–全是Gly的接头
HSA被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI
AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG
EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR
HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK
FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV
FLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ
NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR
MPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE
TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE
TCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：145
342-G15-342-G10-HSAC34S二价构建体2–全是Gly的接头
HSA被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS
SNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV
KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE
CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS
QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE
KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD
YSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE
YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQL
CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE
RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL
SEQ ID NO：146
克隆342-亲和力成熟的变体（w/FG环变体RR->RS被加下划线）
IEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTE
YEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：147
示出了Gly-Ser接头模块，(G4S)n其中n=1-7；(G4S)n模块，其中n=1
GGGGS
SEQ ID NO：148
示出了Gly接头模块，(G5)n其中n=1-7；(G5)n模块，其中n=1
GGGGG
SEQ ID NO：149
示出了Gly-Ala接头模块，(G4A)n其中n=1-7；(G4A)n模块，其中n=1
GGGGA
SEQ ID NO：150
多组氨酸标签（H8）-一种用对于纯化有用的Tn3支架的任选组分可以与额外的接头残
基组合。
HHHHHHHH
SEQ ID NO：151
接头-多组氨酸标签-一种对于纯化有用的Tn3支架的任选组分
GGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO：152
成熟的MSA野生型
EAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAA
NCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEA
EAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTP
KLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTK
VNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPA
DLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKC
CAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVST
PTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGS
LVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKAT
AEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA
SEQ ID NO：153
成熟的MSA-C34S/C579S Cys突变体；突变的残基被加下划线
EAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAA
NCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEA
EAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTP
KLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTK
VNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPA
DLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKC
CAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVST
PTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGS
LVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKAT
AEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDALA
SEQ ID NO：154
克隆M13；BC、DE、FG环被加下划线
IEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHNYSIGNLKPDT
EYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTT
SEQ ID NO：155
克隆M13N49Q；N49Q突变被加下划线
IEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDT
EYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTT
SEQ ID NO：156
M13N49Q-1GS-M13N49Q二价构建体；N49Q突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD
TEYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDAFGY
DFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICANDHGFDSNPAKET
FTT
SEQ ID NO：157
M13N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S单价构建体；突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD
TEYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHF
KGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPN
LRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYL
HEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMK
CSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAE
LAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNY
AEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQP
LVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCT
LPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVP
KEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCC
KAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDALA
SEQ ID NO：158
M13N49Q-1GS-M13N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S二价构建体；突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD
TEYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDAFGY
DFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICANDHGFDSNPAKET
FTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKL
VQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECF
LQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYN
EILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQT
FPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKP
LLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYS
VSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYG
FQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCL
LHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQ
IKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDA
LA
SEQ ID NO：159
克隆M31；BC、DE、FG环被加下划线
IEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHNYSIGNLKPDTE
YEVSLICANDHGFDSYPAKETFTT
SEQ ID NO：160
克隆M31N49Q；N49Q突变被加下划线
IEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTE
YEVSLICANDHGFDSYPAKETFTT
SEQ ID NO：161
M31N49Q-1GS-M31N49Q二价构建体；N49Q突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD
TEYEVSLICANDHGFDSYPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDPSGY
DFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICANDHGFDSYPAKET
FTT
SEQ ID NO：162
M31N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S单价构建体；突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD
TEYEVSLICANDHGFDSYPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHF
KGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPN
LRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYL
HEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMK
CSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAE
LAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNY
AEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQP
LVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCT
LPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVP
KEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCC
KAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDALA
SEQ ID NO：163
M31N49Q-1GS-M31N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S二价构建体；突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD
TEYEVSLICANDHGFDSYPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDPSGY
DFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICANDHGFDSYPAKET
FTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKL
VQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECF
LQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYN
EILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQT
FPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKP
LLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYS
VSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYG
FQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCL
LHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQ
IKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDA
LA
SEQ ID NO：164
克隆D1-阴性对照Tn3
IEVKDVTDTTALITWSPGERIWMFTGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPD
TEYEVSLICPNYERISNPAKETFTTT
SEQ ID NO：165
D1-1GS-D1-3G-MSA-C34S/C579S二价构建体；突变被加下划线
SQIEVKDVTDTTALITWSPGERIWMFTGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLK
PDTEYEVSLICPNYERISNPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWSPGER
IWMFTGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLICPNYERISNPAK
ETFTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHA
KLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNE
CFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQ
YNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLS
QTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD
KPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPD
YSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGE
YGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRV
CLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKE
KQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSK
DALA
SEQ ID NO：166
克隆342RDG至SDG突变体；突变被加下划线
IEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTE
YEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：167
309FGwt共有区
所有的链是亲本Tn3链；β链C是CELTYGI变体（SEQ ID NO：14）；
AB、CD、EF环是亲本Tn3环
X1=Ser或Leu
X2=Asp或Glu
X3=His、Ile、Val、Phe或Trp
X4=Ala、Gly、Glu或Asp
X5=Glu、Leu、Gln、Ser、Asp或Asn
X6=Phe或Tyr
X7=Ile、Val、His、Glu或Asp
X8=Gly、Trp或Val
X9=Trp、Phe或Tyr
X10=Ser、Gln、Met或His
X11=Trp或His
X12=Arg或Ser
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTE
YEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT
SEQ ID NO：168
309FGwt共有区，BC环
X1=Ser或Leu
X2=Asp或Glu
X3=His、Ile、Val、Phe或Trp
X4=Ala、Gly、Glu或Asp
X5=Glu、Leu、Gln、Ser、Asp或Asn
X6=Phe或Tyr
X7=Ile、Val、His、Glu或Asp
X8=Gly、Trp或Val
X1DX2X3X4X5X6X7X8
SEQ ID NO：169
309FGwt共有区，DE环
X9=Trp、Phe或Tyr
X10=Ser、Gln、Met或His
X11=Trp或His
WX9HX10AX11
SEQ ID NO：170
309FGwt共有区，FG环
X12=Arg或Ser
RX12GDMSSNPA
SEQ ID NO：171
311共有区；所有的链是亲本Tn3链；两个β链C变体（SEQ ID NO：13和14）；CD环是
亲本Tn3环
X1=Lys或Glu
X2=Thr或Ile
X3=Asn或Ala
X4=Ser、Leu、Ala、Phe或Tyr
X5=Tyr、Ala、Gly、Val、Ile或Ser（BC/N-端接触）
X6=Tyr、Ser、Ala或His
X7=Asn、Asp、His或Tyr
X8=Leu、Phe、His或Tyr
X9=His、Pro、Ser、Leu或Asp
X10=Gly、Phe、His或Tyr
X11=Ala或Thr
X12=Ser、Asn、Glu、Arg或Asp
X13=Ser、Gln、Thr、Asn或Ala
X14=Pro、Val、-、Ile或Ala（-没有氨基酸）
X15=-或Ile（-没有氨基酸）
X16=Glu或Lys
X17=Ser或Asn
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVH
YSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT
SEQ ID NO：172
311共有区；311家族克隆中的β链C
X11=Ala或Thr
CELX11YGI
SEQ ID NO：173
311共有区；AB环
X1=Lys或Glu
X1DVTDTT
SEQ ID NO：174
311共有区；BC环
X2=Thr或Ile
X3=Asn或Ala
X4=Ser、Leu、Ala、Phe或Tyr X5=Tyr、Ala、Gly、Val、Ile或Ser（BC/N-端接触）
X6=Tyr、Ser、Ala或His
X7=Asn、Asp、His或Tyr
X8=Leu、Phe、His或Tyr
X9=His、Pro、Ser、Leu或Asp
X10=Gly、Phe、His或Tyr
X2X3RSX4X5X6X7X8X9X10
SEQ ID NO：175
311共有区；DE环
X12=Ser、Asn、Glu、Arg或Asp X13=Ser、Gln、Thr、Asn或Ala
X14=Pro、Val、-、Ile或Ala（-没有氨基酸）
X15=-或Ile（-没有氨基酸）
X12X13X14X15YVH
SEQ ID NO：176
311共有区；EF环
X16=Glu或Lys
GNLKPDTX16
SEQ ID NO：177
311共有区；FG环
X17=Ser或Asn
LTTDGTYX17NPA
SEQ ID NO：178
BC9NHT寡核苷酸；环BC
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
ACCGCGCTGATTACCTGGNHTNHTSCGNHTGSTNHTNHTNHTGGCTGTGAACTGACCTAT
GGCATTAAA
SEQ ID NO：179
BC11NHT寡核苷酸；环BC
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
ACCGCGCTGATTACCTGGNHTNHTBSTNHTNHTNHTNHTNHTNHTNHTGGCTGTGAACTG
ACCTATGGCATTAAA
SEQ ID NO：180
BC12NHT寡核苷酸；环BC
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
ACCGCGCTGATTACCTGGNHTVMACCGNHTNHTNHTRRCRGCNHTVTTNHTGGCTGTGAA
CTGACCTATGGCATTAAA
SEQ ID NO：181
DE NHT寡核苷酸；DE环
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
CGATCGCACCACCATAGATCTGNHTNHTNHTNHTNHTNHTTATAGCATTGGTAACCTGAA
ACCG
SEQ ID NO：182
FG9NHT寡核苷酸；FG环
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
GAATATGAAGTGAGCCTGATTTGCNHTAMSNHTNHTGGTNHTNHTNHTKCGAAAGAAACC
TTTACCACCGGTG
SEQ ID NO：183
FG10NHT寡核苷酸；FG环
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
GAATATGAAGTGAGCCTGATTTGCNHTAMSNHTNHTNHTNHTRGCNHTCCGGCGAAAGAA
ACCTTTACCACCGGTG
SEQ ID NO：184
FG11NHT寡核苷酸；FG环
核苷酸密码：N=G/A/T/C；H=A/T/C；R=A/G；S=G/C；B=T/C/G；V=A/C/G；M=A/C；K=G/T
GAATATGAAGTGAGCCTGATTTGCNHTAMSNHTNHTGGTNHTNHTAGCAACCCGGCGAAA
GAAACCTTTACCACCGGTG
SEQ ID NO：185
BCX-DE桥v2寡核苷酸
CAGATCTATGGTGGTGCGATCGCCCGGCACATCTTTAATGCCATAGGTCAGTTCACA
SEQ ID NO：186
DE-FGX桥v2寡核苷酸
GCAAATCAGGCTCACTTCATATTCGGTATCCGGTTTCAGGTTACCAATGCTAT
SEQ ID NO：187
KpnI amp rev v2寡核苷酸
CGGGTCGGTTGGGGTACCGCCACCGGTGGTAAAGGTTTCTTT
SEQ ID NO：188
KpnI反向的v2寡核苷酸
CGGGTCGGTTGGGGTA
SEQ ID NO：189
BC文库amp v2寡核苷酸
GGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATTGAAGTGAAAGATGTGACCGATACCACCGCGCTGAT
TACCTGG
SEQ ID NO：190
BC9PCR寡核苷酸
核苷酸密码：1=所有19aa（-cys）的密码子2=Ala/Pro50/50的密码子；3=Ala/Gly的
密码子
ACCGCGCTGATTACCTGGTCT1213111GGCTGTGAACTGACCTATGGCATTAAAGATG
SEQ ID NO：191
BC9-环NNK寡核苷酸
核苷酸密码：K=50%G/50%T
ACCGCGCTGATTACCTGGNNKNNKSMGNNKGSTNNKNNKNNKGGCTGTGAACTGACCTA
TGGCATTAAA
SEQ ID NO：192
309BC-环NNKdope寡核苷酸
核 苷 酸 密 码：4=70%G10%A10%C10%T；5=10%G，70%A，10%C，10%T；6=10%G，10%A，70%C，
10%T；7=10%G，10%A，10%C，70%T；8=70%A15%C15%T；并且K=50%G/50%T
ACCGCGCTGATTACCTGG76K45K45K77K44K65K78T45K44KTGTGAACTGACCTA
TGGCATTAAA
SEQ ID NO：193
DE PCR寡核苷酸
核苷酸密码：1=所有19aa（-cys）的密码子
GATGTGCCGGGCGATCGCACCACCATAGATCTG111111TATAGCATTGGTAACCTGAAA
CCGG
SEQ ID NO：194
上游BC环Rev寡核苷酸
CCAGGTAATCAGCGCGGTGGTAT
SEQ ID NO：195
BC改组rev寡核苷酸
CAGATCTATGGTGGTGCGATCGC
SEQ ID NO：196
DE改组FWD寡核苷酸
TGTGAACTGACCTATGGCATTAAAGATGT
SEQ ID NO：197
BC11-311Gly寡核苷酸
核苷酸密码：1=70%G，10%A，10%C，10%T；2=10%G，70%A，10%C，10%T；3=10%G，10%A，70%C，
10%T；4=10%G，10%A，10%C，70%T；5=70%A，15%C，15%T；6=15%A，70%C，15%T；7=15%A，15%C，
70%T；V=33%A，33%C，33%G。
ACCGCGCTGATTACCTGG26T25TV1T46T46T45T45T25T37T35TGGCTGTGAACTG
ACCTATGGCATTAAA
SEQ ID NO：198
BC11-311NHT寡核苷酸
核苷酸密码：1=70%G，10%A，10%C，10%T；2=10%G，70%A，10%C，10%T；3=10%G，10%A，70%C，
10%T；4=10%G，10%A，10%C，70%T；5=70%A，15%C，15%T；6=15%A，70%C，15%T；7=15%A，15%C，
70%T；V=33%A，33%C，33%G；并且H=33%A，33%C，33%T
ACCGCGCTGATTACCTGG26T25TV1T46T46T45T45T25T37T35TNHTTGTGAACTG
ACCTATGGCATTAAA
SEQ ID NO：199
BC文库amp K4E寡核苷酸
GGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATTGAAGTGGAAGATGTGACCGATACCACCGCGCTGAT
TACCTGG
SEQ ID NO：200
延长的半衰期HSA变体（C34S，L463N，K524L）；突变被加下划线
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE
NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV
DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP
KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK
VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA
DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC
CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST
PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVNHEKTPVSDRVTKCCTES
LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQILKQTALVELVKHKPKAT
KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：201
311K4E_12-I变体单价构建体（包括GS接头和C34S HSA）；接头和突变的丝氨酸被加下
划线
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL
VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE
TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI
ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS
LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK
YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA
KDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE
EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE
AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF
NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD
DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：202
311K4E_12-I变体单价构建体（包括β链C CELTYG变体，所有的G街头，以及C34S
HSA）；接头和突变的丝氨酸被加下划线
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL
VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE
TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI
ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS
LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK
YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA
KDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE
EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE
AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF
NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD
DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：203
311K4E_12-I变体二价构建体（包括GS接头和C34S HSA）；接头和突变的丝氨酸被加下
划线
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVEDVTDTT
ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL
TTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS
PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ
EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL
LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW
AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK
LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY
ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL
FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS
VVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC
TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK
LVAASQAALGL
SEQ ID NO：204
311K4E_12-I变体二价构建体（包括所有G接头和S34HSA）；接头和突变的丝氨酸被加
下划线
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVEDVTDTT
ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL
TTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS
PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ
EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL
LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW
AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK
LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY
ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL
FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS
VVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC
TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK
LVAASQAALGL
SEQ ID NO：205
309-3GS-309二价构建体
SQIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPD
TEYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTEYEVSLICYTDQEA
GNPAKETFTT
SEQ ID NO：206
309-2GS-HSAC34S单价构建体
SQIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPD
TEYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI
AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG
EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR
HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK
FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV
FLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ
NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR
MPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE
TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE
TCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：207
309-3GS-309-2GS-HSAC34S二价构建体
SQIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPD
TEYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTEYEVSLICYTDQEA
GNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV
KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE
CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS
QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE
KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD
YSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE
YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQL
CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE
RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL
SEQ ID NO：208
342-3GS-342二价构建体
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI
TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS
SNPAKETFTT
SEQ ID NO：209
示出了Gly-Ser接头模块，(G4X)n其中X=G、S、A、L、I、或V并且n=1-7；(G4X)n模块，其中n=1
GGGGX
SEQ ID NO：210
OppA信号肽突变体L25/M
MTNITKRSLVAAGVLAALMAGNVAMA