威灵仙、天花粉和夏枯草是已知的药用植物。其中每种都已长期用于 治疗一般炎症，如多种肿胀、创伤、支气管炎、乳腺炎、扁桃体炎和痔瘘， 还用于缓解多种症状如手冷或麻木、膝痛、腰痛和肩痛、健康状况虚弱和 皮肤疼痛，其应用形式为植物水提取物。这些症状类似于一般性关节炎， 包括现代病理学概念中的慢性风湿病。
威灵仙，是辣蓼铁线莲(Clematis mandshurica)和植物分类学同属的 根，分布于遍布亚洲的成荫的森林中。其于秋天采集，除去茎叶和根毛以 后清洗干净，精细地切碎并日晒干燥以作药用。威灵仙是一种无毒的药用 植物，已长期用于治疗以下症状：末端疼痛、膝关节运动障碍和末端麻痹。 具体而言，威灵仙通常作为一种神奇的药物治疗由于腰、膝和足受寒而站 立时感觉不适的患者。已知威灵仙具有以下多种成分：黄烷酮苷如clematin 等，和皂角苷如铁线莲苷(clemontanoside)A、铁线莲苷B，铁线莲苷C 和铁线莲苷S、葡萄糖以及甾醇[韩国有用植物资源研究档案(Research Archives of Useful Plants Resources in Korea)，韩国化学工艺研究所 (Korea Research Institute of Chemical Technology)，780-781页(1988)，2. 韩国药用植物说明图(An Explanatory Diagram of Korean Medicinal plants)，Youngrim出版，489-490页(1990)]。
已知作为“多种药物”或″Karokon″的天花粉是一种无毒的草药，它 是在秋天采集多年生藤本植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)和植物分类 学同属的根制成。除去清洗干净的根的外壳，适宜地切割根的其余部分， 并日晒干燥以作药用。天花粉因其排脓、退烧、解毒和解热作用而广泛应 用，而且还对症状表现为口渴、各种肿胀、乳腺炎和痔瘘的疾病有效。迄 今已研究发现：天花粉含有作为蛋白质的天花粉蛋白、作为氨基酸的精氨 酸与瓜氨酸以及作为脂肪酸的棕榈酸与亚油酸。最近发现天花粉含有拜俄 尼酸(bryonolic acid)、4-羟基苯甲酸、作为甾醇的α-spinastero[韩国有用 植物资源研究档案，韩国化学工艺研究所，354-357页(1988)，2.韩国药用 植物说明图，Youngrim出版，960-963页(1990)]。
夏枯草是夏枯草(Prunella vulgaris)和植物分类学同属的花或上部， 是一种无毒草药，它是在夏天采集半枯萎的花并日晒干燥而制成。夏枯草 已广泛地用于治疗以下症状：慢性肿胀、天花、急性乳腺炎和淋巴结核。 夏枯草还有效地用于驱散肿块(由于血液渗出而在胃下部产生)等，并治 疗脚气病和末端麻痹。已报道夏枯草含有皂角苷如齐墩果酸苷和熊果酸苷 等，还含有胡罗卜素、维生素C、维生素K、丹宁、咖啡酸和绿原酸。在 夏枯草中还发现了迷迭香酸[韩国有用植物资源研究档案，韩国化学工艺 研究所，480-482页(1988)；夏枯草的化学研究，Lee Jak-pyung等人，Bulletin of Medical College in Beijing，17(4)，297-299页(1985)；Pharm.Acta.Heiv.， 66，No.7，185-188页(1991)]。
传统的东方草药书(如Dong-Eui-Bo-gam，Hyangyak Gibsung-bang和 Kwangjee Beakub)或相关文献提及草药的医疗功效和制备草药水溶液的 方法。但是，它们只描述每种这些药用植物的单方，而没有描述由根据收 割地点和收割时间进行分类以控制活性成分含量的药物植物的适宜组合制 备草药水溶液的配方。而且，这些药用植物是通过热水提取法制备的，并 且对于任何由上述方法提取的物质的生物学活性成分尚未获得详细的认 识。
另一方面，本发明的发明者已公开了一种从某种比率的威灵仙、天花 粉和夏枯草的提取物中提取和纯化生物学活性成分的方法，这些活性成分 可用于缓解急性/慢性炎症；用于抑制血小板和全血凝集、与关节组织的退 化有关的酶活性、异常增殖的免疫细胞和诱导炎症的酶；用于清除有毒的 活性氧自由基的活性；并进一步用于治疗慢性风湿性关节炎(美国专利 5,910,307)。美国专利5,910,307的特征是将重量比为1∶0.5-2∶0.5-1.5的威 灵仙、天花粉和夏枯草混合，并用水或水性醇溶液提取混合物；用水饱和 的正丁醇进行分配并减压浓缩醇层；在与水一起恒沸的条件下浓缩所得物， 并冻干以得到粉末形式的提取物。
在后续研究中，本发明者已认识到：仅用重量比难以将威灵仙、天花 和夏枯草的提取物标准化的，因为各种成分的含量变化明显随收割地点和 收割时间而变化。这还使得这种联合提取物难以商品化，因为重现性地获 得具有止痛和抗炎作用、血液循环增强作用、关节炎治疗作用和软骨保护 作用的活性成分是困难的。因此，本发明者进行了广泛的研究，以可重复 地使草药组合物的药理学功效最大化。结果，我们研制了一种通过控制草 药组合物中迷迭香酸的含量，而不是威灵仙、天花粉和夏枯草提取物的重 量比而优化软骨保护作用和止痛与抗炎作用、血液循环增强作用以及关节 炎治疗作用的功效的方法。此外，可以重复性地使草药商品化。
本发明是美国专利5,910,307的改进发明，它以迷迭香酸的适宜含量优 化威灵仙、天花粉和夏枯草草药提取物组成，从而在商品化方面提供了显 著的改进；使药理学功效相对于常规的药物组合物实现了最大化；并进一 步提供了新的疗效。
发明概述
本发明提供一种含有威灵仙、天花粉和夏枯草的草药组合物，其中为 达到可重复性的目的，根据迷迭香酸的含量将萃取和纯化的成分标准化和 商品化，所述成分可用作具有止痛作用的抗炎剂、血液循环增强剂、关节 炎治疗剂和软骨保护剂等。本发明的草药组合物具有与美国专利5,910,307 的常规草药组合物类似或较高的止痛和抗炎作用以及改善血液循环的功 效。除此之外，它对于与关节组织的退化有关的酶具有优良的抑制活性并 具有对软骨的保护活性，因而其对一般炎症、包括风湿病更为有效。
因此，本发明的目的是通过用适当的迷迭香酸的含量将威灵仙、天花 粉和夏枯草的混合提取物标准化而提供一种具有优良的止痛和抗炎作用、 外周血液循环的改善作用、关节炎治疗作用和软骨保护作用的草药组合物。
附图简介
图1表示草药组合物对角叉菜聚糖诱导的水肿的抑制活性
图2表示草药组合物对血小板凝集的抗凝集活性。
图3表示草药组合物对全血凝集的抗凝集活性。
图4表示草药组合物对慢性炎症的抑制活性。
图5表示草药组合物对B-淋巴细胞增殖的抑制活性。
图6表示草药组合物对T-淋巴细胞增殖的抑制活性。
发明详述
本发明的特征在于：包含威灵仙、天花粉、夏枯草以及基于组合物总 重不低于0.6wt％的迷迭香酸的草药组合物。
以下详细描述本发明。
本发明的草药组合物提供了重要的生物学作用如止痛和抗炎、改善血 液循环、免疫调节和抑制与关节组织退化有关的酶，特别是提供软骨保护 作用，因而可用作关节炎治疗剂和软骨保护剂以及止痛和抗炎剂和血液循 环增强剂。
草药中活性成分的含量随收割地点、收割时间、储藏期和储藏条件而 发生显著的变化。因此，需要根据表1-3所示的收割地点以适宜比率将草 药提取物或草药植物组合。也就是说，如果收割地点、收割时间、储藏期 和储藏条件不同，则在相同重量的草药植物中所含的活性成分的含量是不 同的，因此对草药提取物或草药植物的重量比的限制已变得不再重要。
因此，本发明的特征在于：选择迷迭香酸作为参照物以获得具有最佳 药理学功效的草药组合物。已知迷迭香酸具有优良的活性，如(i)通过抑制 脂质过氧化和/或在花生四烯酸的代谢中产生的前列环素的生物合成，并清 除由多形核白细胞产生的活性氧而具有的抗氧化活性；(ii)抗炎活性如抑制 作为炎症反应和免疫调节的载体的代谢物的产生，以抑制过敏性炎症；(iii) 通过抑制血小板血液凝集和纤维降解而具有的血液循环增强活性[Agent and Action，17，375-376页(1985)；Pharm.Acta.Helv.，66，No.7，185-188页 (1991)；Biochem.Pharmae.，29，533-538页(1980)； Yoa-Hsueh-Hseuh-Pao，27，96-100页(1992)；Int.J.of Immunopharmae.，10， No.6，729-737页(1988)；J.of Natural Products，50，No.3，392-399页(1987)； Yoa-Hsueh-Hseuh-Pao，28，No.4，241-245页(1993)].
迷迭香酸的含量变化宽泛，取决于收割地点、收割时间、储藏期和储 藏条件等，而其功效随迷迭香酸的含量而变。这就是为什么选择迷迭香酸 作为本发明的参照物的原因。因此，可以不依据各种草药植物的重量比而 依据总草药植物中所含的迷迭香酸的含量，将威灵仙、天花粉、夏枯草的 草药提取物混合或提取威灵仙、天花粉夏枯草的混合物来制备本发明的草 药组合物。
当迷迭香酸的含量高于0.6wt％、优选0.6至5.0wt％时，草药组合物 可以获得所需的药学活性。当含有威灵仙、天花粉和夏枯草的草药组合物 中迷迭香酸的含量高于0.6wt％时，它可提供最佳的效果，如在常规的草 药组合物中没有教导的软骨保护活性，以及缓解疼痛、改善血液循环、免 疫调节以及抑制与关节组织的降解有关的酶。如果迷迭香酸的含量低于 0.6wt％，则草药组合物可提供缓解疼痛、改善血液循环、免疫调节和抑制 与关节组织退化有关的酶的作用，但软骨保护活性非常迟缓。
本发明没有规定迷迭香酸的量的上限，但当它高于某一水平时，活性 没有任何进一步的改善，因而在技术和经济上不期望将迷迭香酸的含量增 至高于某一水平。
根据本发明，当草药组合物除了含有高于0.6wt％的迷迭香酸外，还含 有2.0至6.0wt％的齐墩果酸和0.01至0.04wt％的4-羟基苯甲酸时，其可 提供更强大的软骨保护活性和缓解疼痛、改善血液循环、免疫调节和抑制 与关节组织退化有关的酶的功效。
在威灵仙提取物中存在大量的齐墩果酸。当将提取物水解时，足量的 齐墩果酸以皂角苷的无糖形式皂角苷配基的形式存在。根据分析发现：齐 墩果酸以与多种苷结合的皂角苷存在。已报道齐墩果酸不仅具有显著的抗 炎和止痛作用，还具有优良的治疗由丁酸分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)诱导的慢性风湿性关节炎的作用[J.of Pharm.Pharmacol.，44， No.5，456-458页(1992)；Chung-Kuo-Li-Hsueh-Pao，10，No.4，381-384页 (1984)；Chem.Pharm.Bull.，28，No.4，1183-1188页(1980)；Biochem.Int.， 24，No.5，981-990页(1991)]。
天花粉提取物含有多种有机酸，包括4-羟基苯甲酸。已知4-羟基苯甲 酸对子宫切除骨质疏松模型具有优良的抗氧活性、抗炎活性和激素样作用， 并且由于无论什么样的收割地点、收割时间、储藏期和储藏条件，4-羟基 苯甲酸都保留一定的含量，所以它也是本发明的参照物[Free Radical Biol. & Medcine，27，No.11/12，1427-1436页(1999)；J.Ethnopharmn.，53， 11-14(1996)；Environ.Res.，75，130-134页(1997)]。
被选作参照物的迷迭香酸、齐墩果酸和4-羟基苯甲酸是得自本发明的 草药组合物的活性成分。当它们基于活性成分的含量以某一比率组合时， 由于其显著的协同作用而可使功效得到大大提高。而且，除了这些本发明 的草药组合物的活性成分以外，在本发明中不可排除其它不同的成分。
为包含一定量的参比物，根据对原始草药植物的化学分析，本发明的 草药组合物可通过混合每一种威灵仙、天花粉和夏枯草的粉末形式的提取 物或者提取威灵仙、天花粉和夏枯草的混合物而制备。制备草药组合物的 方法可使软骨保护活性稍有差别。用于制备草药组合物的方法如下文详述。
用5至10体积的水或水性醇溶液将威灵仙、天花粉和夏枯草或其混合 物回流提取4至6小时并过滤。继续在回流下用5至10体积的水或水性醇 溶液萃取滤液并过滤。合并每一种提取物并浓缩至干燥。因此，如果使用 少量的溶剂，由于提取物较低的溶解度和提取物搅拌困难而导致较低的提 取效率。但在使用过量溶剂的情况下，必须蒸发和除去饱和了水中低级醇 的较大量的溶剂，从而使其不经济和操作困难。本发明进行了一系列的提 取步骤，即第一次和第二次提取，因为当进行大规模提取时，尽管进行有 效过滤，但由于药用植物的含水量高，所以预计会有大量的损失。因此第 二次提取而不仅仅是第一次起取可防止提取效率的降低。而且，已知经两 次提取可获得总提取物量的大约85至95％。还发现三步以上萃取在经济 方面并不理想。
将提取物过滤并浓缩，通过用3至4体积的水饱和的等量的低级醇对 滤液进行纯化以除去某些杂质如蛋白质、多糖和脂肪酸。本发明中所用的 低级醇的实例包括丁醇和丙醇。如果水饱和的低级醇的量少于滤液的量， 则由于分层不良，较高浓度的具有较强极性的杂质(如多糖和蛋白质)可 使提取物中活性成分的浓度较低。
在分层之后，于60至70℃下减压浓缩所得的醇提部分以除去样品中 的低级醇。然后，与25至50体积的水一起恒沸进一步浓缩2至3次，得 到总提取物量，然后用另一份等量的水得到均匀的悬浮液。在与水恒沸的 条件下浓缩残余物的原因是控制残余的低级醇的含量，以将提取溶液可用 作药物原料。然后将所得的提取物冻干得到提取物粉末。
所得的提取物粉末具有显著的药理学作用，如作为止痛和抗炎剂、血 液循环增强剂、风湿性关节炎治疗剂和软骨保护剂。
根据一般制备方法，可将本发明的粉末提取物制成用于口服或肠胃外 施用的剂型，如片剂、软明胶胶囊、注射液、软膏和透皮剂。
用于人体时，本发明的草药组合物可以单独施用，但一般与根据预期 施用途径和标准制药实践所选择的药物载体混合施用。例如，草药组合物 可以口服、口含或舌下施用，剂型为含有赋形剂如淀粉或乳糖的片剂，或 者为单独或与赋形剂混合存在的胶囊或小球(ovule)，或者为含有矫味剂 或着色剂的酏剂或混悬剂。这些液体制剂可以用可药用的添加剂如助悬剂 (如甲基纤维素、半合成甘油酯如witepsol，或甘油酯的混合物如杏仁油 和EPG-6酯或PEG-8和辛酸/辛酸甘油酯的混合物)制备。化合物还可以 经肠胃外注射，例如静脉内、肌内、皮下或冠脉内注射。对于肠胃外施用， 化合物最好以可含有其它物质如盐或单糖(如甘露醇或葡萄糖)的无菌水 溶液的形式使用，以使溶液与血液等渗。
施用于人时，草药组合物的有效剂量可以随年龄、体重、身体状况和 特定患者的反应而改变，且可以根据内科医师的指示每天施用一次或数次。 优选的普通成人患者(70Kg)的剂量如下：口服施用剂型如单独的片剂 或胶囊为每天50至2400mg、肠胃外施用剂型每天50至400mg、软膏的 施用为每天300至2400mg、透皮施用为每天150至1200mg。以上剂量为 通常情况下的实例，但在个别情况下，较高或较低的剂量可能是有益的， 而且这些剂量也处于本发明的范围内。而且，如果草药组合物的日剂量小 于以上范围，则不能获得目标作用。另一方面，如果它们高于以上范围， 则其由于毒副作用的原因而不被优选。
具体而言，当本发明的草药组合物施用于人时，其毒副作用远远小于 其它化学合成药物。实际上，许多毒理学试验表明：本发明的联合提取物 对人没有毒性。
参照以下实施例更为详细地解释了本发明，但这些实施例不应被理解 为对本发明保护范围的限定。
参比实施例1
用2L30％(v/v)含乙醇的水将250g充分风干并用水清洗除去碎渣的威 灵仙在搅拌下回流提取6小时。过滤后，再用1.5L 30％(v/v)含乙醇的水 将残余物在搅拌下回流提取6小时。合并滤液并浓缩使总体积为1L。用相 同体积的水饱和的正丁醇将滤液萃取三次。合并正丁醇层，并于60至70 ℃下减压浓缩至干燥。将0.3L的水加到残余物中、在恒沸下提取并重复此 过程两次。将提取物充分悬浮于等量的蒸馏水中，并冻干得到粉末提取物。
用以上方法制备在不同地点收割的其它威灵仙，并通过高效液相色谱 法进行分析。结果总结于表1，其中列出了齐墩果酸的含量(％)。
表1

参比实施例2
用2.5L 30％(v/v)含乙醇的水将250g充分风干并用水清洗除去碎渣的 夏枯草在搅拌下回流提取4小时。过滤后，再用1.5L水将残余物在搅拌下 回流提取3小时。合并滤液并浓缩至总体积为1L。用等体积的水饱和的正 丁醇将滤液萃取三次。合并正丁醇层，并于60至70℃下减压浓缩至干燥。 将0.2L水加到残余物中并在恒沸下提取，重复此过程两次。将提取物充分 悬浮于等量的蒸馏水中，并冻干得到粉末提取物。
用以上方法制备在不同地点收割的其它夏枯草，并通过高效液相色谱 法进行分析。结果总结于表2，其中列出了迷迭香酸的含量(％)。
表2

参比实施例3
用2L水将250g充分风干、长度为2.0至4.0cm并用水清洗除去碎渣 的天花粉在搅拌下回流提取5小时。过滤后，再用2L水将残余物在搅拌 下回流提取3小时。合并滤液并浓缩至总体积为1L。用等体积的水饱和的 正丁醇将滤液萃取三次。合并正丁醇层，并于60至70℃下减压浓缩至干 燥。将0.1L水加到残余物中并在恒沸下提取，重复此过程两次。将提取物 充分悬浮于等量的蒸馏水中，并冻干得到粉末提取物。
用以上方法制备在不同地点收割的其它天花粉，并通过高效液相色谱 法进行分析。结果总结于表3，其中列出了4-羟基苯甲酸的含量(％)。
表3

实施例1：草药提取物混合物的制备
将含有1.5％(w/w)迷迭香酸、3.5％(w/w)齐墩果酸和0.02％(w/w)4-羟 基苯甲酸的威灵仙、天花粉和夏枯草混合，并分别用正丁醇分级三次。合 并每步所得的提取物，将其充分悬浮于等量的蒸馏水中并冻干得到粉末提 取物。
实施例2：草药提取物混合物的制备
将含有0.7％(w/w)迷迭香酸、5.0％(w/w)齐墩果酸和0.01％(w/w)4-羟 基苯甲酸的威灵仙、天花粉和夏枯草混合，并分别用正丁醇分级三次。合 并每步所得的提取物，将其充分悬浮于等量的蒸馏水中并冻干得到粉末提 取物。
实施例3：草药提取物混合物的制备
将含有4.0％(w/w)迷迭香酸、2.0％(w/w)齐墩果酸和0.04％(w/w)4-羟 基苯甲酸的威灵仙、天花粉和夏枯草混合，并分别用正丁醇分级三次。合 并每步所得的提取物，将其充分悬浮于等量的蒸馏水中并冻干得到粉末提 取物。
实施例4：混合植物的草药提取物的制备
将200g充分干燥并用水清洗除去碎渣的在黑龙江A收割的威灵仙、 450g在河南A收割的长度为2.0至4.0cm的天花粉和350g在河南B收割 的夏枯草混合，并用10L水将混合物回流提取6小时。过滤后，再用7L 水将残余物在搅拌下回流提取3小时。合并滤液并浓缩至总体积为5L。用 等体积的水饱和的正丁醇将滤液分级三次。合并正丁醇层，并于60至70 ℃下减压浓缩至干燥。将1升水加到残余物中并在恒沸下提取，重复此过 程两次。将提取物充分悬浮于等量的蒸馏水中，并冻干得到粉末提取物。
通过HPLC分析法测定粉末提取物，其含有2.1％(w/w)迷迭香酸、 2.1％(w/w)齐墩果酸和2.5％(w/w)4-羟基苯甲酸。
对比实施例1
将充分干燥并用水清洗除去碎渣的在黑龙江B收割的威灵仙、500g在 安徽C收割的长度为2.0至4.0cm的天花粉和250g在湖北A收割的夏枯 草混合，并用15L水将混合物回流提取6小时。过滤后，再用7L水将残 余物在搅拌下回流提取3小时。合并滤液并浓缩至总体积为5L。用等体积 的水饱和的正丁醇对滤液分级三次。合并正丁醇层，并于60至70℃下减 压浓缩至干燥。将1升水加到残余物中并在恒沸下提取，重复此过程两次。 将提取物充分悬浮于等量的蒸馏水中，并冻干得到粉末提取物。
通过HPLC分析法测定粉末提取物，其含有0.4％(w/w)迷迭香酸、 6.8％(w/w)齐墩果酸和0.05％(w/w)4-羟基苯甲酸。
对比实施例2：草药提取物混合物的制备
将在参比实施例1、2和3中制备的每一种威灵仙、天花粉和夏枯草的 提取物混合，并将其溶解于水性醇溶液中，以使迷迭香酸的含量为 0.45％(w/w)、齐墩果酸的含量为6.11％(w/w)以及4-羟基苯甲酸的含量为 0.02％(w/w)。将混合物减压浓缩。将提取物充分悬浮于等量的蒸馏水中， 并冻干得到粉末提取物。
实验实施例1：止痛作用试验
为研究由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的各种提取物的止痛 作用，如以下实验方法所示进行了扭体试验，结果如表4所示。
实验方法：
将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物经口服施用 于ICR(癌症研究所)小鼠，剂量为每Kg体重200mg或400mg。
施用后1小时，经腹膜内向动物注射0.6％(v/v)乙酸，注射体积为每 10g体重0.1ml，并从施用后5分钟开始，观察每只小鼠在10分钟内的扭 体频率，作为痛阈。
表4


根据表4，由扭体频率的减少表明：本发明制备的提取物具有优异的 止痛作用。
对比实施例2：对急性炎症的抑制活性试验
在大鼠中进行了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取 物对急性炎症的抑制活性研究。与对照组相比，将对水肿后爪的抗炎作用 表示为百分比，结果显示于附图1。
实验方法：
向SD(Spraque-Dawley)大鼠口服施用由所述实施例1-4和对比实施 例1-2制备的草药提取物。在施用后1小时，将0.1ml 1％的角叉菜聚糖经 皮内注射于大鼠的左后爪，并在5小时内以1小时的时间间隔测定该部位 的水肿。
如附图1所示，表明由本发明实施例1-4制备的草药提取物显著地抑 制了角叉菜聚糖诱导的炎症。
实验实施例3：抗凝集活性试验
对由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物在兔血浆中 的抗凝血活性进行了研究，用胶原诱导凝集，结果显示于附图2中。
实验方法：
由兔血样品制备PRP(富含血小板的血浆)，并将血液中血小板的数 量调节至2×108/ml。将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提 取物加入到PRP中并在37℃下于凝集计的小玻璃管中调节2分钟。加入 胶原后，用双波长凝集计(dual aggregometer)测定血小板凝集。
如附图2所示，草药没有增加血小板凝集。
实验实施例4：对全血凝固的抗凝血活性试验
使用兔全血研究了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提 取物的抗凝血活性，结果显示于附图3。
实验方法：
将等量的盐水溶液加入到兔全血中并在用于本实验前充分混合。将由 所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物加入到重构的全血中， 并预融合(preworm)2分钟。通过加入胶原诱导凝血。用凝集计测定全 血凝固。如附图3所示，当加入由本发明的实施例1-4制备的草药提取物 时全血凝固没有增加。
实验实施例5：对与关节组织退化有关的酶即透明质酸酶的抑制活性试验
研究了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对与关 节组织退化有关的酶即透明质酸酶的抑制活性，结果显示于下表5。
实验方法：
在醋酸盐缓冲液存在下，于37℃下、20分钟内制备透明质酸酶并将其 活化。然后将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物和作 为底物的透明质酸钾加入到缓冲液中，并培养约40分钟。用氢氧化钠使反 应终止后，向培养物中加入硼酸钾并在100℃下加热。通过DMBA(二甲 基苯并蒽)显色测定吸光度，并与对照组比较计算抑制率。
表5
  类别   试验浓度(mg/ml)   抑制率(％)   实施例1   1   82.3   实施例2   1   83.7   实施例3   1   89.6   实施例4   1   87.5   对比实施例1   1   80.5   对比实施例2   1   79.1
如表5所示，由本发明制备的联合草药提取物显著地抑制了与关节组 织退化有关的酶的活化作用。
实验实施例6：对慢性炎症的抑制活性试验
在注射了丁酸分枝杆菌的大鼠模型中研究了由所述实施例1-4和对比 实施例1-2制备的草药提取物对慢性风湿性关节炎的抗炎活性。结果显示 于附图4。
实验方法：
为诱导慢性水肿，将悬浮于矿物油中并进行热处理的丁酸分枝杆菌注 射到白鼠的右后爪中，每只剂量0.05ml。然后在16天内每天一次向大鼠 口服施用由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物，并用器 官充满度测量器测量爪水肿。
如附图4所示，本发明的联合草药提取物显著地抑制了水肿。
实验实施例7：对白细胞三烯B4的抑制活性试验
通过对花生四烯酸和钙离子载体(A23187)诱导的白细胞三烯B4 (LTB4)生物合成的抑制率，评价了由所述实施例1-4和对比实施例1-2 制备的草药提取物对5-脂氧化酶的抑制活性，结果显示于表6。
实验方法：
将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的提取物加入到调节至37 ℃的大鼠嗜碱性白血病-1(RBL-1)细胞中，并反应5分钟。然后用20μg/ml A23187和花生四烯酸将反应混合物处理15分钟，以诱导产生LTB4。用乙 酸乙酯对产生的LTB4进行萃取，并对其进行HPLC分析。
表6
  类别   试验浓度(mg/ml)   抑制率(％)   实施例1   0.5   87.3   实施例2   0.5   82.5   实施例3   0.5   79.1   实施例4   0.5   85.7   对比实施例1   0.5   71.5   对比实施例2   0.5   70.6
如表6所示，本发明制备的联合草药提取物显著地抑制了5-脂氧化酶。
实验实施例8：对环加氧酶-I的抑制活性试验
评价了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对环加 氧酶-I的抑制活性，结果显示于表7。
实验方法：
将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的提取物加入到调节至37 ℃的环加氧酶-I中，加入100μM花生四烯酸并反应2分钟，将三氯乙酸 (TCA)加入到反应混合物中以使反应终止，并测定530nm处的吸光度。
表7
  类别   试验浓度(mg/ml)   抑制率(％)   实施例1   0.5   61.8   实施例2   0.5   62.5   实施例3   0.5   59.8   实施例4   0.5   67.3   对比实施例1   0.5   51.5   对比实施例2   0.5   49.1
如表7所示，本发明制备的联合草药提取物显著地抑制了环加氧酶-1。
实验实施例9：对环加氧酶-II的抑制活性试验
评价了由所述实施例1-2和对比实施例1-3制备的提取物对环加氧酶 -II的抑制活性，结果显示于表8。
实验方法：
将由所述实施例1-2和对比实施例1-3制备的提取物加入到环加氧酶 -II中，并置于调节至27℃的试管中。与500mM花生四烯酸反应90秒后， 将三氯乙酸(TCA)加入到反应混合物中以使反应终止，并测定532nm处 的吸光度。
表8
  类别   试验浓度(mg/ml)   抑制率(％)   实施例1   0.5   72.5   实施例2   0.5   69.8   实施例3   0.5   65.7   实施例4   0.5   77.5   对比实施例1   0.5   61.5   对比实施例2   0.5   58.8
如表8所示，可以看出本发明制备的联合植物提取物显著地抑制了环 加氧酶-II。
实验实施例10：对B-淋巴细胞增殖的抑制活性试验
评价了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对脂多 糖(LPS)诱导的B-淋巴细胞增殖的抑制活性，结果显示于附图5。
实验方法：
在37℃下用106个B-淋巴细胞/ml培养基建立培养物。将由所述实施 例1-4和对比实施例1-2制备的提取物加入到培养物中，然后用10μg/ml 的LPS将培养物处理24小时。48小时内加入以氚表示放射性的2μCi胸 苷-3H，用液体闪烁计数器(LSC)对培养物进行定量。
如附图5所示，可以看出本发明制备的联合草药提取物显著地抑制了 B-淋巴细胞的增殖。
实验实施例11：对T-淋巴细胞增殖的抑制活性试验
研究了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对伴刀 豆球蛋白-A(Con-A)诱导的T-淋巴细胞增殖的抑制活性，结果显示于附 图6中。
实验方法：
在37℃下用106T-淋巴细胞/ml的培养基建立培养物。将由所述实施例 1-4和对比实施例1-2制备的提取物加入到培养物中，并用3μg/ml伴刀豆 球蛋白-A处理24小时。48小时内加入以氚表示放射性的2μCi胸苷-3H， 用LSC对培养物进行定量。
如附图6所示，可以看出本发明制备的联合草药提取物显著地抑制了 T-淋巴细胞的增殖。
实验实施例12：对过氧化物自由基消除的清除活性试验
评价了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对由黄 嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生的过氧化物自由基的清除活性，结果显示于表9。
实验方法：
将细胞色素-c(Cyt-c)和由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的 草药提取物加入到调节至37℃的黄嘌呤氧化酶中，以诱导黄嘌呤产生氧自 由基。用分光光度计在540nm下测定伴随细胞色素-c(Cyt-c)氧化的颜色 变化，并将氧自由基的清除率确定为斜率。
表9
  类别   试验浓度(mg/ml)   抑制率(％)   实施例1   0.5   82.7   实施例2   0.5   89.5   实施例3   0.5   83.6   实施例4   0.5   92.1   对比实施例1   0.5   81.5   对比实施例2   0.5   78.4
如表9所示，可以看出本发明制备的联合草药提取物显著地清除了活 性氧。
实验实施例13：对蛋白多糖降解的抑制活性试验
研究了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对重要 的软骨组织成分蛋白多糖降解的抑制活性，结果显示于表10。
实验方法：
从兔的每个关节切割软骨，并将50mg软骨放置在调节至37℃的培养 基中。将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物和5μg白 细胞介素-1α(IL-1α)/50mg软骨加入到培养基中，并培养72小时。用1，9- 二甲基亚甲基蓝染料显色并于525nm下测定由蛋白多糖降解而产生的葡 糖胺聚糖(GAG)的产量。
表10

如表10所示，可以看出本发明制备的联合草药提取物显著地抑制了蛋 白多糖的降解活性。
实验实施例14：对II型胶原降解的抑制活性试验
研究了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物对重要 的关节软骨组织成分II型胶原降解的抑制活性，结果显示于表11。
实验方法：
从兔的每个关节切割软骨，并将50mg软骨放置在调节至37℃的培养 基中。将由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的草药提取物和5μg白 细胞介素-1α(IL-1α)/50mg软骨加入到培养基中，并培养21天。用氯胺-T 和二甲基氨基苯甲醛显色并在560nm处测定由II型胶原降解而产生的羟 基脯氨酸的产量。
表11

如表11所示，可以看出与对比实施例1的提取物相比，本发明制备的 联合草药提取物对II型胶原降解表现出更为显著的抑制活性。
实验实施例15：抗骨关节炎疗效试验
通过监测兔模型而研究了由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的 草药提取物对骨关节炎的活性和骨保护活性，所述兔模型的软骨通过向关 节腔注射胶原酶而受伤，从而具有与人骨关节炎类似的症状。结果显示于 表12。
实验方法：
在第1天和第4天将1mg胶原酶/1Kg体重注射到体重为2.0至2.5Kg 的兔的关节腔内以使关节组织受伤，并患上胶原酶诱导的关节炎。以200 mg/Kg的剂量口服给予由所述实施例1-4和对比实施例1-2制备的提取物， 持续4周。施用4周后，切割并取出兔的软骨部分，然后用sapranin-O染 色。将染色的软骨部分分成软骨组织和滑液组织，并用0-4的整数分级记 录关节炎的严重程度以量化关节炎的水平：0＝正常；1＝轻微；2＝中度；3＝ 重度；和4＝最大。
表12

如表12所示，可以看出与对比实施例1的提取物相比，本发明制备的 联合草药提取物对胶原酶诱导的关节炎表现出更为显著的缓解活性。
制备实施例1
以下的化学组合物用于使用本发明的粉末提取物制备口服片剂。
化学组合物：草药组合物200mg；硬无水硅酸盐10mg；硬脂酸镁2mg； 微晶纤维素50mg；羟基乙酸淀粉钠25mg；玉米淀粉113mg；和适量的 无水乙醇。
制备实施例2
以下的化学组合物用于使用本发明的粉末提取物制备软膏。
化学组合物：草药组合物5g；鲸蜡醇十六酸酯20g；鲸蜡醇40g；硬 脂醇20g；十四酸异丙酯80g；失水山梨醇单硬脂酸酯20g；聚山梨酸酯 60g；对羟基苯甲酸丙酯1g；对羟基苯甲酸甲酯1g；和适量的磷酸与蒸馏 水。
制备实施例3
以下的化学组合物用于使用本发明的粉末提取物制备注射液。
化学组合物：草药组合物100mg；甘露醇180mg；Na2HPO425mg； 和注射用水2,974mg。
制备实施例4
以下的化学组合物用于使用本发明的粉末提取物制备透皮剂。
化学组合物1：草药组合物0.4g；聚丙烯酸或其钠盐1.3g；甘油3.6g； 氢氧化铝0.04g；对羟基苯甲酸甲酯0.2g；和水14g。
化学组合物2：草药组合物0.8g；丙二醇1.6g；液体石蜡0.8g；
使用本发明的威灵仙、天花粉和夏枯草、按照与联合草药制剂有关的 制备例1-4，制备了多种剂型(例如片剂、软膏、透皮剂和注射液)。所述 制剂包含一定浓度的齐墩果酸和迷迭香酸作为参照物，因而有效地用作具 有止痛作用的抗炎剂、慢性风湿性关节炎药物和用于改善外周血液循环的 活性剂。