基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用专利检索-治疗方案疗法专利检索查询-专利查询网

基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用

阅读：384发布：2023-03-02

专利汇可以提供基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用，涉及生物医药工程技术领域，本发明提供的一种基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽及其应用，通过生物信息学手段设计并合成了基于前列腺癌干细胞表面标记物CD44的抗原表位多肽，特异性激活细胞毒性T淋巴细胞、具有良好的杀伤效果，可以用于研制靶向前列腺癌干细胞的治疗性肽疫苗，为恶性前列腺癌精准免疫治疗提供新的技术方案，并能够特异性靶向前列腺癌干细胞从根本上减少前列腺癌复发。，下面是基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.分离的抗原表位多肽CD44-P1，其特征在于，所述抗原表位多肽CD44-P1选自如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有前列腺癌干细胞标志物CD44抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。
2.根据权利要求1所述的抗原表位多肽CD44-P1，其特征在于，所述抗原表位多肽CD44-P1的分子量为1000-1300。
3.根据权利要求1所述的抗原表位多肽CD44-P1，其特征在于，所述抗原表位多肽CD44-P1通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得；或，
所述抗原表位多肽CD44-P1通过人工合成。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-3任一项所述的抗原表位多肽CD44-P1。
5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸选自如下(A)-(C)中任一项：
(A)由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(B)编码SEQ ID NO:1所示的多肽的多核苷酸；
(C)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同源性在80％以上且编码前列腺癌干细胞标志物CD44抗原表位功能的多肽的核苷酸。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4或5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求4或5所述的核酸或权利要求6所述的载体。
8.如权利要求1-3任一项所述的抗原表位多肽CD44-P1在制备预防和/或治疗前列腺癌的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为疫苗或药物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗原表位多肽CD44-P1通过杀伤LNCAP-多细胞球预防和/或治疗前列腺癌；和/或，
所述抗原表位多肽CD44-P1通过杀伤VCaP-多细胞球预防和/或治疗前列腺癌。

说明书全文

基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其是涉及一种基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用。

背景技术

[0002] 目前前列腺癌发病率、死亡率呈逐年上升趋势，已经成为严重威胁人类健康的头号杀手。尽管前列腺癌的手术治疗、化疗、放射治疗及分子靶向治疗不断取得新进展，但前列腺癌的有效治疗仍是亟待解决的关键问题。

[0003] 近年来，随着人们对前列腺癌的分子机理和免疫机制的不断揭示，前列腺癌特异的免疫治疗日益受到重视，而获得理想肿瘤抗原是肿瘤免疫治疗的关键。随着免疫学理论方法和分子生物学方法的飞速发展，大量可以诱导机体免疫应答的肿瘤抗原的发现，为肿瘤免疫治疗开辟了新纪元。

[0004] “肿瘤干细胞”学说认为在肿瘤组织中存在一群具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞群的细胞，其与肿瘤的增殖、转移、复发和对放化疗不敏感关系密切，肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。近年来，以CD133+/CD44+为表型的前列腺癌干细胞被发现以后，它具有干细胞功能的特征已在多个方面得到证实。

[0005] 近年来，随着对免疫应答分子机制研究的深入，现已逐渐认识到机体的免疫细胞并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位，即蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。研究表明，CD8+T细胞所识别的肿瘤抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。现有的抗肿瘤治疗技术特异性低、杀伤效果有限，而且容易肿瘤复发。

[0006] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0007] 本发明为了解决现有技术中的问题，提供一种基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1及其应用。

[0008] 为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下所述：

[0009] 本发明提供了一种分离的抗原表位多肽CD44-P1，所述抗原表位多肽CD44-P1选自如下(a)或(b)：

[0010] (a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽；

[0011] (b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有前列腺癌干细胞标志物CD44抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。

[0012] 进一步地，所述抗原表位多肽CD44-P1的分子量为1000-1300。

[0013] 进一步地，所述抗原表位多肽CD44-P1通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得；或，

[0014] 所述抗原表位多肽CD44-P1通过人工合成。

[0015] 本发明还提供了一种核酸，所述核酸编码上述的抗原表位多肽CD44-P1。

[0016] 进一步地，所述核酸选自如下(A)-(C)中任一项：

[0017] (A)由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0018] (B)编码SEQ ID NO:1所示的多肽的多核苷酸；

[0019] (C)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同源性在80％以上且编码前列腺癌干细胞标志物CD44抗原表位功能的多肽的核苷酸。

[0020] 本发明还提供了一种载体，所述载体包括上述的核酸。

[0021] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的核酸或载体。

[0022] 另外，本发明还提供了上述的抗原表位多肽CD44-P1在制备预防和/或治疗前列腺癌的产品中的应用。

[0023] 进一步地，所述产品为疫苗或药物。

[0024] 进一步地，所述抗原表位多肽CD44-P1通过杀伤LNCAP-多细胞球预防和/或治疗前列腺癌；和/或，

[0025] 所述抗原表位多肽CD44-P1通过杀伤VCaP-多细胞球预防和/或治疗前列腺癌。

[0026] 本发明提供的分离的抗原表位多肽CD44-P1，为基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽。本发明通过生物信息学手段设计并合成了基于前列腺癌干细胞表面标记物CD44的抗原表位多肽，该抗原表位多肽CD44-P1具有良好的免疫原性，能够特异性激活细胞毒性T淋巴细胞，对前列腺癌干细胞具有良好的杀伤效果，为前列腺癌干细胞表面标记物抗原表位的研究奠定了良好的基础。

[0027] 本发明提供的基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽CD44-P1能够刺激机体产生抗前列腺癌干细胞保护性免疫反应，从而增强对前列腺癌干细胞的抑制和清除效果，基于此，本发明提供的抗原表位抗体可以用于研制靶向前列腺癌干细胞的治疗性肽疫苗，为恶性前列腺癌精准免疫治疗提供新的技术方案，并能够特异性靶向前列腺癌干细胞从根本上减少前列腺癌复发。附图说明

[0028] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0029] 图1为本发明实施例1提供的CD44蛋白抗原表位分析的示意图；

[0030] 图2为本发明实施例1提供的抗原表位多肽CD44-P1的质谱分析图；

[0031] 图3为本发明实施例1提供的抗原表位多肽CD44-P1的高效液相色谱分析图；

[0032] 图4A为本发明实施例2中第0天时流式细胞仪分析结果示意图；

[0033] 图4B为本发明实施例2中第14天时流式细胞仪分析结果示意图；

[0034] 图5A为本发明实施例2中抗原表位多肽CD44-P1作用于LNCAP-多细胞球的结果示意图；

[0035] 图5B为本发明实施例2中抗原表位多肽CD44-P1作用于LNCAP-多细胞球的杀伤效果示意图；

[0036] 图6A为本发明实施例3中第0天时流式细胞仪分析结果示意图；

[0037] 图6B为本发明实施例3中第14天时流式细胞仪分析结果示意图；

[0038] 图7A为本发明实施例3中抗原表位多肽CD44-P1作用于VCaP-多细胞球的结果示意图；

[0039] 图7B为本发明实施例3中抗原表位多肽CD44-P1作用于VCaP-多细胞球的杀伤效果示意图。

具体实施方式

[0040] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0041] 需要说明的是：

[0042] 本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。

[0043] 本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

[0044] 本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

[0045] 除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

[0046] 根据本发明的一个方面，提供了一种分离的抗原表位多肽CD44-P1，所述抗原表位多肽CD44-P1选自如下(a)或(b)：

[0047] (a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽；

[0048] (b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有前列腺癌干细胞标志物CD44抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。

[0049] 其中，SEQ ID NO:1为：

[0050] Ala-Gly-Val-Phe-His-Val-Glu-Lys-Asn-Gly-Arg-Tyr。

[0051] 在本申请中，术语“抗原表位多肽”指任何能够被特异性的抗体所识别的多肽片段。

[0052] 本发明提供的分离的抗原表位多肽CD44-P1，为基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽。本发明通过生物信息学手段设计并合成了基于前列腺癌干细胞表面标记物CD44的抗原表位多肽，该抗原表位多肽CD44-P1具有良好的免疫原性，能够特异性激活细胞毒性T淋巴细胞，对前列腺癌干细胞具有良好的杀伤效果，为前列腺癌干细胞表面标记物抗原表位的研究奠定了良好的基础。

[0053] 人类CD44基因位于11号染色体短臂，全长约50kb，共由20个高度保守的外显子组成，每个外显子长度70-210bp不等，中间由长短不一的内含子分隔。CD44作为一种细胞表面分子，在细胞粘附和信号转导中发挥功能作用，被作为前列腺癌干细胞的肿瘤标志物，具有非常强效的抗原表位，本发明提供的基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽对前列腺癌干细胞具有更强的免疫原性和杀伤作用。

[0054] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，可为1-10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可发生在上述结构域之外。

[0055] 在一些优选的实施方式中，所述抗原表位多肽CD44-P1的分子量为1000-1300，例如可以为，但不限于1202.35、1208.26或1084.18，优选为1202.35。

[0056] 在一些优选的实施方式中，所述抗原表位多肽CD44-P1通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得；或，

[0057] 所述抗原表位多肽CD44-P1通过人工合成。

[0058] 在一些实施方案中，本发明还提供了一种核酸，能够编码上述的抗原表位多肽CD44-P1。

[0059] 在本文中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

[0060] 在一些优选的实施方式中，所述核酸选自如下(A)-(C)中任一项：

[0061] (A)由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0062] (B)编码SEQ ID NO:1所示的多肽的多核苷酸；

[0063] (C)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同源性在80％以上且编码前列腺癌干细胞标志物CD44抗原表位功能的多肽的核苷酸。

[0064] 序列表中的SEQ ID NO:2为gcaggtgtattccacgtggagaaaaatggtcgctac。

[0065] 在一些实施方案中，本发明还提供了含有编码该抗原表位多肽CD44-P1的核酸序列的表达载体。

[0066] 在本发明中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

[0067] 本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

[0068] 本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

[0069] 另外，本发明还提供了上述的抗原表位多肽CD44-P1在制备预防和/或治疗前列腺癌的产品中的应用。

[0070] 本发明提供的基于前列腺癌干细胞标志物CD44的抗原表位多肽能够刺激机体产生抗前列腺癌干细胞保护性免疫反应，从而增强对前列腺癌干细胞的抑制和清楚效果，基于此，本发明提供的抗原表位抗体可以用于研制靶向前列腺癌干细胞的治疗性肽疫苗，为恶性前列腺癌精准免疫治疗提供新的技术方案，并能够特异性靶向前列腺癌干细胞从根本上减少前列腺癌复发。

[0071] 在一些优选的实施方式中，所述产品为疫苗或药物。

[0072] 在一些实施方式中，疫苗还包括佐剂，药物还包括药学上可接受的载体。

[0073] 在一些优选的实施方式中，所述抗原表位多肽CD44-P1通过杀伤LNCAP-多细胞球预防和/或治疗前列腺癌；和/或，

[0074] 所述抗原表位多肽CD44-P1通过杀伤VCaP-多细胞球预防和/或治疗前列腺癌。

[0075] 为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。

[0076] 如无特别说明，本发明实施例中使用的实验动物、药品及试剂均来源为正规而易购渠道：

[0077] a.LNCaP细胞以及VCaP细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)；

[0078] b.红细胞裂解液、IFN-γ、IL1α以及抗CD3和抗CD28单抗，IL-2，AIM-V培养液、IL4、TNFβ、GM-CSF因子均购自北京同立海源生物科技有限公司；

[0079] c.流式细胞仪使用BD bioscience公司的LSRFortessa Cell Analyzer；

[0080] d.细胞培养皿、培养瓶购自美国Corning公司。

[0081] 在以下实施例DC细胞培养过程中，如有发黄，则换液，补加IL-4、TNFβ和GM-CSF因子。

[0082] 实施例1CD44抗原表位短肽的设计与合成

[0083] 1.从国际开放共享基因库NCBI Genbank中查找人CD44蛋白的全氨基酸序列(NP_000601.3)共742个氨基酸。其氨基酸序列如下：

[0084] MDKFWWHAAWGLCLVPLSLAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIYPSNPTDDDVSSGSSSERSSTSGGYIFYTFSTVHPIPDEDSPWITDSTDRIPATTLMSTSATATETATKRQETWDWFSWLFLPSESKNHLHTTTQMAGTSSNTISAGWEPNEENEDERDRHLSFSGSGIDDDEDFISSTISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLQTTTRMTDVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTSTIQATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPKEDSHSTTGTAAASAHTSHPMQGRTTPSPEDSSWTDFFNPISHPMGRGHQAGRRMDMDSSHSITLQPTANPNTGLVEDLDRTGPLSMTTQQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSSNRNDVTGGRRDPNHSEGSTTLLEGYTSHYPHTKESRTFIPVTSAKTGSFGVTAVTVGDSNSNVNRSLSGDQDTFHPSGGSHTTHGSESDGHSHGSQEGGANTTSGPIRTPQIPEWLIILASLLALALILAVCIAVNSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGV

[0085] 2.本实施例通过DNA Star(Protean)软件根据氨基酸序列的亲水性、抗原指数以及表面可及性综合分析预测其抗原短肽的位置。

[0086] 3.如图1所示，结合Immune Epitope Database(IEDB，http://www.iedb.org/)数据库设计了包含CD44蛋白抗原表位的抗原表位多肽，并命名为CD44-P1。

[0087] 如图2所示，抗原表位多肽CD44-P1的分子量为：1202.35，脱溶剂温度为：350℃，脱溶剂其流速350L/h。

[0088] 如图3所示，抗原表位多肽CD44-P1的高效液相色谱分析流速为：1.0ml/min，波长：220nm，上样量：10μl，具体结果如表1所示：

[0089] 表1抗原表位多肽CD44-P1的高效液相色谱分析结果

[0090]顺序时间样品量峰面积峰高
1 9.111 0.0555 4687 946
2 9.532 0.0693 5858 1164
3 9.795 99.5406 8414181 402756
4 10.333 0.3346 28285 9802
总计 NA 100 8453011 414668

[0091] 实施例2

[0092] 采用本发明实施例1提供的CD44蛋白抗原表位的抗原表位多肽CD44-P1研究CD44诱导的效应T细胞对人前列腺癌细胞LNCAP-多细胞球的杀伤效应。具体包括如下步骤：

[0093] 1.外周血单个核细胞的分离制备：将采集的HLA-A2阳性健康志愿者外周血10mL收集到2支离心管中，2000r/min离心5min，弃上清液，将沉淀细胞混合，加生理盐水至25mL，使沉淀细胞充分悬浮，形成血细胞悬液。另取1支离心管，加入淋巴细胞分离液20mL，用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。

[0094] 2.将上述的形成清晰的界面的离心管用2000r/min离心20min后，从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层即PBMC层、血浆层；用吸管将外周血单个核细胞层吸出，转移至另一支离心管中，备用。

[0095] 3.向装有外周血单个核细胞层的离心管中加生理盐水至40mL，1500r/min离心5min，结束后弃上清液，加入生理盐水至40mL将沉淀细胞悬浮，充分混匀后，1500r/min离心
5min；共离心洗涤3次。

[0096] 4.最后一次离心结束后，弃上清液，将沉淀细胞并转移到培养瓶中，加入40mL的AIM-V培养液培养，并标记为A。

[0097] 5.培养2h后取出培养的细胞，将A中悬浮的淋巴细胞转移至另1个培养瓶中，标记为B。

[0098] 向含有淋巴细胞的B瓶中加入IFN-γ、IL1α以及抗CD3和抗CD28单抗，并在第二天加入IL-2，诱导培养CIK细胞；向含有贴壁细胞的A瓶中加入40mL的AIM-V培养液和IL4，并在第三天加入TNFβ，第五天加入、GM-CSF因子，诱导培养DC细胞。

[0099] 6.DC细胞培养过程中，如有发黄，则换液，补加IL-4、TNFβ和GM-CSF因子。

[0100] 7.CIK细胞培养过程中，如发现培养液发黄，则换液，换液后补加IL-2。如发现有细胞团块结为不良絮状，则用离心管收集后静置沉降5min左右，待絮状物沉淀后，小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。

[0101] 8.DC细胞培养至第7天时向A培养瓶中加入CD44抗原表位多肽CD44-P1，第8天时铲下DC细胞收集后与相应的B中的CIK细胞混合共培养，并将DC细胞培养瓶弃去。

[0102] 如果总的细胞量过于庞大，也可将DC细胞和CIK细胞混合后均分到A和B瓶中继续培养。将T细胞诱导成细胞毒性T细胞(CTL)，即效应T细胞。

[0103] 9.共培养的DC-CIK细胞于第14天做流式细胞仪分析CD3、CD56、CD4和CD8阳性细胞比例并进行细胞杀伤实验。

[0104] 10.靶细胞的制备：复苏前列腺癌细胞LNCAP正常培养、传代。通过胰酶消化后磷酸盐缓冲液清洗、重悬；以10mM的浓度的Calcein-AM标记靶细胞，清洗重悬后按照效应细胞与肿瘤干细胞5:1、10:1的效靶比例，37℃共培养4h；收集培养液，l000rpm离心5min，取100μL上清液测定平均荧光强度，以单纯靶细胞作为自发释放量，以单纯靶细胞加去垢剂作为最大释放量。

[0105] 如图4A和图4B所示，通过流式细胞仪对比分析，结果显示通过CD44抗原表位多肽激活后的CIK细胞比例显著升高；在第0天时(图4A)，流式细胞仪分析结果表明CD3阳性T细胞比例为69.10％，CD4阳性T细胞比例为41.90％，CD8阳性T细胞比例为26.90％，CIK细胞(CD3/CD56双阳性)比例为2.70％；在第14天时(图4B)，流式细胞仪分析结果表明CD3阳性T细胞比例为97.50％，CD4阳性细胞比例为14.90％，CD8阳性细胞比例为84.30％，CIK细胞比例为32.20％。

[0106] 如图5A和图5B所示，通过CD44抗原表位多肽前列腺癌干细胞杀伤效果分析，结果显示CD44抗原表位多肽激活的CIK细胞具有显著的前列腺癌干细胞杀伤效应。CD44抗原表位多肽CD44-P1能够特异性诱导细胞杀伤的效应，杀伤细胞比例由2.70％提升至32.20％；并且对人前列腺癌细胞干细胞富集的LNCAP-肿瘤多细胞球具有显著杀伤作用，杀伤效果由本底的7.90％提升至31.21％，其中杀伤作用以杀伤率(％)表示。

[0107] 实施例3

[0108] 采用本发明实施例1提供的CD44蛋白抗原表位的抗原表位多肽CD44-P1研究CD44诱导的效应T细胞对人前列腺癌细胞VCaP-多细胞球的杀伤效应。

[0109] 1.外周血单个核细胞的分离制备方法同实施例2。

[0110] 2.DC-CIK细胞的培养方法同实施例2。

[0111] 3.靶细胞VCaP-多细胞球细胞的准备以及杀伤效果检测方法同实施例2。

[0112] 如图6A和图6B所示，通过流式细胞仪对比分析，结果显示通过CD44抗原表位多肽激活后的CIK细胞比例显著升高；在第0天时(图6A)，流式细胞仪分析结果表明CD3阳性T细胞比例为65.20％，CD4阳性T细胞比例为35.50％，CD8阳性T细胞比例为25.3％，CIK细胞(CD3/CD56双阳性)比例为1.90％；在第14天时(图6B)，流式细胞仪分析结果表明CD3阳性T细胞比例为95.30％，CD4阳性细胞比例为22.60％，CD8阳性细胞比例为57.50％，CIK细胞(CD3/CD56双阳性)比例为26.60％。CD44抗原表位多肽CD44-P1、CD44-P1和CD44-P3能够特异性诱导细胞杀伤的效应，杀伤细胞比例由1.90％提升至26.60％。

[0113] 如图7A和图7B所示，经过CD44表位肽诱导后的CIK细胞对人前列腺癌细胞干细胞富集的LNCAP-肿瘤多细胞球具有显著杀伤作用，杀伤效果由本底的6.60％提升至34.50％。

[0114] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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