本发明涉及腺病毒、编码它们的核酸及其应用，特别是在制备用于治 疗肿瘤的药物的应用。

当前在治疗肿瘤中利用许多治疗原理。除了使用外科手术以外，化学 疗法和放射疗法是占优势的。然而所有这些技术都伴有相当大的副作用。 复制选择性的溶瘤病毒的应用提供了治疗肿瘤的新平台。与之相应地，引 发病毒剂的选择性的肿瘤内复制，导致病毒复制、受染肿瘤细胞的裂解和 病毒向相邻肿瘤细胞的扩散。因为病毒复制能力限于肿瘤细胞，正常组织 免于病毒复制并因此免于病毒裂解。

目前，对几种病毒系统进行了目的在于肿瘤裂解的临床试验。该腺病 毒的一个实例是dl1520(Onyx-015)，其已经成功用于I期和II期临床(Khuri， F.等Nature Medicine 6，879-885，2000)。Onyx-015是一种具有完全缺失 E1B-55kDa基因的腺病毒。腺病毒的E1B-55kDa蛋白的完全缺失是基于 一项发现，即具有p53缺失的腺病毒载体可能导致复制和因此细胞的裂解 (Kirn，D.等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.17，391a，1998)，其中正常细胞不受 伤害。更具体地，E1B-55kDa基因产物参与p53的抑制，病毒mRNA的 转运和宿主细胞蛋白合成的切断。p53的抑制是通过由p53和腺病毒编码 的E1B-55kDa蛋白的复合物和/或由E1B-55kDa和E4orf6的复合物的形成 而发生。由TP53编码的p53是复合物调节机制的起点(Zambetti，G.P.等， FASEB J.7，855-865，1993)，其尤其有效地抑制病毒(如腺病毒)的细胞 复制。基因TP53在约50％的所有人肿瘤中缺失或突变，导致由化学疗法 或放射疗法导致的期望细胞凋亡的缺乏，造成通常不成功的肿瘤治疗。

裂解肿瘤(tumorlytic)腺病毒的另一原理是基于一项发现，即如果E1A 蛋白以特定的缺失形式存在或包含一个或多个突变而不影响Rb/E2F和/ 或p107/E2F和/或p130/E2F的结合，该腺病毒将不诱导感染的细胞进入S 期，并且能够在不含有功能性的Rb蛋白的肿瘤细胞中复制。另外，E1A 蛋白分别可以在N-末端缺失和在E1A蛋白的1-76的氨基酸区域上包含一 个或多个突变，以便抑制E1A与p300的结合和因此提供在肿瘤细胞中的 选择性复制。这些方法在欧洲专利EP 0 931 830中以例举的方式描述。这 些病毒的实例是AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07和CB016(Howe，J.A.等， Molecular Therapy 2，485-495，2000；Fueyo，J.等，Oncogene 19，2-12，2000； Heise，C.等，Nature Medicine 6，11341139，2001；Balague，C.等，J.Virol.75， 7602-7611，2001)。这些在现有技术中已知用于溶癌作用的腺病毒系统因此 包含E1A蛋白中不同的缺失，其中已经在以下假设下制造了这些缺失： 功能性的Rb蛋白和由无活性的Rb蛋白和E2F组成的复合物能分别阻断 有效的体内复制，以使腺病毒仅在Rb-阴性/突变细胞中进行体内复制。按 照现有技术的这些腺病毒系统是基于E1A，以便通过早期E2启动子(英文 是E2 early promoter)和自由E2F(Dyson，N.Genes & Development，12， 2245-2262，1998)控制体内复制。

裂解肿瘤腺病毒系统的另一种形式是基于对特异性表达病毒癌基因 E1A的选择性启动子的使用，其提供在肿瘤细胞中的选择性复制 (Rodriguez，R.等，Cancer Res.57，2559-2563，1997)。

如上所述，选择适于各个作用模式的原理的细胞背景对于腺病毒肿瘤 裂解病毒的各种原理是重要的。换句话说，只有当认识了不同的分子生物 学先决条件时，才能使用当前已知的各种腺病毒系统。这限制了这些系统 应用于不同的患者群。

一旦患者产生所谓的多药抗性(英文是multidrug resistance(MDR))，治 疗肿瘤病时会出现一个特殊问题，该多药抗性代表一种研究得特别详尽的 肿瘤对细胞生长抑制剂(cytostatics)的抗性(Gottesman和Pastan，Annu.Rev. Biochem.62，385-427，1993)。它是基于膜结合转运蛋白P-糖蛋白的过量表 达，该蛋白属于所谓的ABC转运蛋白(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，2001， J.Wijnholds，Novartis Found Symp.，243，69-79，2002)。Bargou，R.C.等和 Oda，Y.等(Bargou，R.C.等，Nature Medicine 3，447-450，1997；Clin.Cancer Res.4，2273-2277，1998)能够证明，人转录因子YB-1的核定位直接参与 P-糖蛋白表达的激活。进一步的研究证实，YB-1通过各种胁迫条件如UV 照射、细胞生长抑制剂的给药(Koike，K.等，FEBS Lett 17，390-394，1997) 和过热(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，2001)而转运到核内。进一步的研究 证实，YB-1的核定位对另一个ABC转运蛋白具有影响。该ABC转运蛋 白称为MRP(英文是multidrug resistance-related protein，多重药抗性相关 蛋白)，并参与形成所谓的非典型非P-糖蛋白依赖性的多重药抗性(Stein，U. 等，JBC 276，28562-69，2001)。

本发明解决的问题是，提供了一种技术教导和特别是一种方法，其允 许具体地使用裂解肿瘤活性剂治疗生物体，更具体地分别治疗人类生物体 和一组患者。本发明解决的另一问题是，提供了适于在患者中导致肿瘤裂 解的方法，所述患者患有抗细胞生长抑制剂的肿瘤病，特别是具有多药抗 性的那些。最后，本发明解决的一个问题是，提供了一种适于细胞裂解的 腺病毒。

本发明解决的问题的第一方面是通过能在表达选自包含E1A-蛋白的 组的第二种蛋白之前表达选自包含E1B蛋白和E4蛋白的组的第一种蛋白 的腺病毒解决的。

在一个实施方案中，第一种蛋白是E1B蛋白，优选E1B55kd蛋白。

在另一个实施方案中，第一种蛋白是E4蛋白，优选E4orf6蛋白。

在一个优选的实施方案中，第一种蛋白是E1B蛋白和E4蛋白的组合， 优选E1B55kD蛋白和E4orf6蛋白的组合。

在一个优选的实施方案中，E1A蛋白是E1A12S蛋白。

本发明解决的问题的第二方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒包含至少一种编码选自包含E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的组的蛋白 的核酸，其中至少一种蛋白在启动子的控制下，所述启动子与在野生型腺 病毒中控制蛋白表达的启动子不同。

在第二方面的一个实施方案中，腺病毒是根据本发明的第一方面的腺 病毒。

在第二方面的一个实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白，优选 E1B55kD蛋白。

在第二方面的一个实施方案中，至少一种蛋白是E4蛋白，优选E4orf6 蛋白。

在第二方面的一个实施方案中，至少一种蛋白是E1A蛋白，优选 E1A12S蛋白。

在第二方面的一个优选的实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白和 E4蛋白的组合，优选E1B55kD蛋白和E4orf6蛋白的组合。

在第二方面的一个实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白和E1A蛋 白的组合，优选E1B55kD蛋白和E1A12S蛋白的组合。

在第二方面的一个优选的实施方案中，至少一种蛋白是E4蛋白和E1A 蛋白的组合，优选E4orf6蛋白和E1A12S蛋白的组合。

在第二方面的一个实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白、E4蛋白 和E1A蛋白的组合，优选E1B55kD蛋白、E4orf6蛋白和E1A12S蛋白的 组合。

在第二方面的一个实施方案中，E1B蛋白的表达由启动子控制，其 中所述的启动子选自包含肿瘤特异性的启动子、器官特异性的启动子、组 织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中所述的腺病毒 启动子与E1B启动子不同。

在第二方面的一个实施方案中，E4蛋白的表达由启动子控制，其中 所述的启动子选自包含肿瘤特异性的启动子、器官特异性的启动子、组织 特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中所述的腺病毒启 动子与E4启动子不同。

在第二个方面的一个优选实施方案中，腺病毒的启动子是E1A启动 子。

在第二个方面的一个实施方案中，E1A蛋白质的表达由启动子控制， 其中所述启动子选自包括下列的组：肿瘤-特异性启动子、器官-特异性启 动子、组织-特异性启动子、异源启动子和腺病毒的启动子，其中腺病毒 的启动子不同于E1A启动子。

在第二方面的一个优选的实施方案中，控制E1A蛋白的表达的启动 子是YB-1控制的，或可以由YB-1调控的。

在第二方面的一个优选的实施方案中，控制E1A蛋白的表达的启动 子是腺病毒2晚期启动子。

在第一和第二方面的一个实施方案中，E4蛋白、优选地E4orf6蛋白 和E1B蛋白、优选地E1B55kd蛋白在相同或共同启动子的控制下。

本发明解决的问题的第三方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒通过至少一种腺病毒蛋白在核中提供了YB-1，或者核中的YB-1供应 是由至少一种腺病毒蛋白介导的，其中所述的腺病毒蛋白优选地与E1A 不同。

在第三方面的一个实施方案中，该腺病毒是根据本发明第一和/或第 二方面的腺病毒。

本发明解决的问题的第四方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒通过至少一种腺病毒蛋白为腺病毒的复制提供了YB-1，或者通过至少 一种腺病毒蛋白介导用于腺病毒的复制的YB-1的提供，其中所述的腺病 毒蛋白优选地与E1A不同。

在第四方面的一个实施方案中，该腺病毒是根据本发明第一和/或第 二和/或第三方面的腺病毒。

在第三和第四方面的一个实施方案中，腺病毒蛋白是E4orf6和 E1B55kd的复合物。

本发明解决的问题的第五方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒的核酸包含至少一个功能上无活性的腺病毒区域，其中所述的区域选自 包含E1区、E3区、E4区及其组合的组。

在第五个方面的一个实施方案中，所述腺病毒是按照本发明的第一个 和/或第二个和/或第三个和/或第四个方面的腺病毒。

在第五方面的一个实施方案中，该区是E1区。

在第五方面的一个实施方案中，该区是E3区。

在第五方面的一个实施方案中，该区是E4区。

在第五方面的一个实施方案中，该区包含E1区、E3区和E4区。

本发明解决的问题的第六方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒包含至少一个表达盒，其中所述的表达盒包含至少一个启动子和编码腺 病毒蛋白的核酸，其中所述的腺病毒蛋白是E1B蛋白，优选E1B55kD蛋 白。

在第六方面的一个实施方案中，该腺病毒是根据本发明第一和/或第 二和/或第三和/或第四和/或第五方面的腺病毒。

在第六方面的一个实施方案中，该启动子与E1B启动子不同。

在第六方面的一个实施方案中，该启动子是选自包含肿瘤特异性的启 动子、器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒 启动子的组，其中所述的启动子与E1B启动子不同。

本发明解决的问题的第七方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒包含至少一个表达盒，其中所述的表达盒包含至少一个启动子和编码腺 病毒蛋白的核酸，其中所述的腺病毒蛋白是E4蛋白，优选E4orf6蛋白。

在第七个方面的一个实施方案中，所述腺病毒是根据本发明的第一个 和/或第二个和/或第三个和/或第四个和/或第五个和/或第六个方面的腺病 毒。

在第七方面的一个实施方案中，该启动子与E4启动子不同。

在第七方面的一个实施方案中，该启动子选自包含肿瘤特异性的启动 子、器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启 动子的组，其中腺病毒启动子与E4启动子不同。

在第七方面的一个实施方案中，该启动子是E1A启动子。

本发明解决的问题的第八方面是通过腺病毒解决的，其中所述的腺病 毒包含至少一个表达盒，其中所述的表达盒包含至少一个启动子和编码腺 病毒蛋白的核酸，其中所述的腺病毒蛋白是E1A蛋白，优选E1A12S蛋 白。

在第八方面的一个实施方案中，该腺病毒是根据本发明第一和/或第 二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七方面的腺病毒。

在第八方面的一个实施方案中，该启动子与E1A启动子不同。

在第八方面的一个实施方案中，该启动子选自包含肿瘤特异性的启动 子、器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启 动子的组。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七和/ 或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒包含核酸，其中所述的核酸编码 YB-1。

在第八方面的一个优选的实施方案中，编码YB-1的核酸在启动子的 控制下，其中所述的启动子优选地是E2晚期启动子。

在第八方面的一个实施方案中，编码YB-1的核酸在启动子的控制下， 其中所述的启动子分别是YB-1依赖性的和YB-1控制的。

在第八方面的一个实施方案中，编码YB-1的核酸是表达盒的一部分， 所述的表达盒包含编码E1A蛋白的核酸，优选编码E1A12S蛋白的核酸。

在第八方面的一个实施方案中，编码E1A蛋白的核酸是通过IRES序 列从编码YB-1的核酸分离出。

在第六和/或第七和/或第八方面的一个实施方案中，编码E4蛋白、 优选E4orf6蛋白的核酸和编码E1B蛋白、优选E1B55kD蛋白的核酸都包 含在表达盒中，其中两个编码序列优选地通过IRES序列分开。

在第八方面的一个优选的实施方案中，表达盒的启动子选自包含肿瘤 特异性的启动子、器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动 子和腺病毒启动子的组，其中腺病毒启动子与E4启动子不同，也与E1B 启动子不同，优选与野生型E4启动子不同，也与野生型E1B启动子不同。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒包含一个表达盒，它包含一 个启动子和一段核酸序列，其中所述的核酸序列选自包含适体(aptamer)、 核酶、适酶(aptazyme)、反义分子和siRNA的组。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒包含一个表达盒，它包含一 个启动子和一段核酸序列，其中所述的核酸序列是编码核酸，其中所述的 核酸编码的分子选自包含肽、多肽、蛋白、抗促成素、抗体和抗体片段的 组。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒包含一个表达盒，其中所述 的表达盒包含一个启动子和一个核酸序列，其中所述的核酸序列选自包含 细胞凋亡诱导基因、前药基因、蛋白酶抑制剂、肿瘤抑制剂基因、细胞因 子和血管生成抑制剂的组。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒是重组腺病毒。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒是腺病毒突变体。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒是复制缺陷型。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒能在细胞中复制，所述细胞 含有去调节的YB-1或在核中含有YB-1。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该细胞在独立于细胞周期的核中含有 YB-1。

在第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六和/或第七 和/或第八方面的一个实施方案中，该腺病毒不包含任何E1A13S蛋白和/ 或该腺病毒不包含任何编码E1A13S蛋白的核酸。

本发明解决的问题的第九方面是通过编码第一至第八方面中的任一 项的腺病毒的核酸解决的。

本发明解决的问题的第十方面是通过复制系统解决的，所述的复制 系统包含根据第九方面的的核酸和辅助病毒的核酸，其中所述的辅助病 毒的核酸包含一个或多个根据第一至第八方面的任一项的腺病毒的表达 盒。

在第十方面的一个实施方案中，该腺病毒或编码它的核酸缺少包含在 辅助病毒中的表达盒。

本发明解决的问题的第十一方面是通过载体解决的，所述的载体包含 根据第九方面的核酸和/或根据第十方面的复制系统。

在第十一方面的一个实施方案中，该载体是表达载体。

本发明解决的问题的第十二方面是通过腺病毒细胞解决的，所述的腺 病毒细胞包含根据第一至第八方面的任一项的腺病毒和/或根据第九方面 的核酸和/或根据第十方面的复制系统和/或根据第十一方面的载体。

在第十二方面的一个实施方案中，该细胞是真核细胞，优选动物细胞， 更优选哺乳动物细胞。

在第十二方面的一个优选的实施方案中，哺乳动物细胞是选自包含小 鼠、大鼠、豚鼠、猪、绵羊、山羊、牛、马、狗、猫和人的细胞的组的细 胞。

本发明解决的问题的第十三方面是通过生物体、优选哺乳动物生物体 解决的，所述的生物体包含根据第一至第八方面的腺病毒、根据第九方面 的核酸、根据第十方面的复制系统、根据第十一方面的载体或根据第十二 方面的细胞，其中所述的生物体优选地选自包含小鼠、大鼠、豚鼠、猪、 绵羊、山羊、牛、马、狗和猫的组。

本发明解决的问题的第十四方面是通过下述方式解决的：根据第一至 第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第十方面的复制 系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞在复制腺病毒、优 选体外地复制腺病毒中的应用。

本发明解决的问题的第十五方面是通过下述方式解决的：根据第一至 第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第十方面的复制 系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞在生产腺病毒、优 选体外地生产腺病毒中的应用。

本发明解决的问题的第十六方面是通过下述方式解决的：根据第一至 第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第十方面的复制 系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞在表达基因中的应 用，优选所述基因促进细胞裂解，优选是在腺病毒复制过程中的细胞裂解， 和/或促进腺病毒介导的细胞裂解。

在第十六方面的一个实施方案中，表达的基因是本文中公开的转基 因。

本发明解决的问题的第十七方面是通过下述方式解决的：根据第一至 第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第十方面的复制 系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞在制备药物中的应 用。

在第十四至十七方面的一个实施方案中，腺病毒在其中复制的细胞在 其核中含有YB-1，优选在其独立于细胞周期的核中含有YB-1。

在第十四至十七方面的一个实施方案中，腺病毒在其中复制的细胞包 含去调节的YB-1。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该药物用于治疗肿瘤病。

在第十七方面的应用的一个优选的实施方案中，该肿瘤病选自包含恶 性病、癌症、癌性病和肿瘤的组。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该肿瘤病选自包含实体瘤、 非实体瘤、恶性瘤和良性瘤的组。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，至少一部分形成肿瘤的细胞 在核中具有YB-1，优选在独立于细胞周期的核中具有YB-1。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，至少一部分形成肿瘤的细胞 包含去调节的YB-1。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，至少一部分形成肿瘤的细胞 是Rb阳性的或Rb阴性的。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，至少一部分形成肿瘤的细胞 具有对药学活性剂的抗性，优选多种抗性。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该抗性是多种抗性。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该抗性是对抗肿瘤药的，优 选细胞抑制剂，和/或该抗性是由辐照造成的。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，药物的目标患者包含许多细 胞，其中所述的细胞是在根据本发明的第十七方面的应用的各个实施方案 中所述的细胞。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该药物包含至少一种其它的 药学活性剂。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该药物与一种其它的药学活 性剂一起施用，或应如此。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，其它的药学活性剂选自包含 细胞因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞抑制剂、酪氨酸激 酶抑制剂和细胞周期抑制剂的组。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该药物是在辐照之前、过程 中或之后施用。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该辐照的施用目的是治疗肿 瘤。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，对要治疗的细胞或生物体采 取措施，其中所述的措施选自包含辐照、施用细胞抑制剂和高热疗法的组。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该措施是局部地或全身地应 用。

在第十七方面的应用的一个实施方案中，该辐照使用高能辐照，优选 使用在治疗肿瘤病中使用的任何辐照。

本发明解决的问题的第十八方面是通过下述方式解决的：根据第一至 第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第十方面的复制 系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞在制备用于治疗肿 瘤病的药物中的应用，其特征在于，该肿瘤病选自包含乳腺瘤、骨瘤、胃 瘤、肠瘤、胆囊瘤、胰腺瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、脑瘤、卵巢肿瘤、皮肤瘤、 皮肤附属物的肿瘤、头和颈癌、子宫瘤、关节瘤、喉瘤、食管瘤、舌瘤、 前列腺瘤的组，优选地前述肿瘤病中的一种具有前述权利要求中的任一项 所述的特征。

本发明解决的问题的第十九方面是通过下述方式解决的：根据第一至 第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第十方面的复制 系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞在制备用于治疗肿 瘤病的药物中的应用，其中所述的肿瘤特异性的启动子是对该药物要施用 的肿瘤特异性的启动子。

本发明解决的问题的第二十方面是通过一种药物组合物解决的，它包 含根据第一至第八方面的任一项的腺病毒、根据第九方面的核酸、根据第 十方面的复制系统、根据第十一方面的载体或根据第十二方面的细胞，和 任选的药用载体。

在第二十一个方面中，本发明的问题通过病毒，优选地腺病毒在制备 药物中的应用而得以解决，其中所述病毒分别在细胞核中不包含YB-1的 正常细胞中、在独立于细胞周期的细胞核中不包含YB-1的细胞中、和在 不包含去调节的YB-1的细胞中是复制缺陷的，并且所述病毒编码癌基因 或癌基因产物，特别是在YB-1细胞核阳性细胞中至少反式激活一个病毒 基因，优选腺病毒基因的癌基因蛋白质，其中所述基因选自包括 E1B55kDa、E4orf6、E4orf3和E3ADP的组。优选地，所述病毒表达病 毒蛋白质E1B55kD，其在本文也表示为E1B55kDa和E4orf6。

在第二十二个方面中，本发明的问题通过病毒，优选地腺病毒在细胞 中进行复制的应用而得以解决，所述细胞在细胞核中包含YB-1，其中所 述病毒在细胞核中不包含YB-1的细胞中、或在独立于细胞周期的细胞核 中不包含YB-1的细胞中、或在不包含任何去调节的YB-1的细胞中是复 制缺陷的，其中所述病毒编码癌基因或癌基因产物，特别是反式激活至少 一个病毒基因，优选腺病毒基因的癌基因蛋白质，其中所述基因选自包括 E1B55kDa、E4orf6、E4orf3和E3ADP的组。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个实施方案中， 病毒，特别是腺病毒在细胞中复制，所述细胞在细胞核中包含YB-1或在 独立于细胞周期的细胞核中不包含YB-1，或不包括任何去调节的YB-1。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，病毒癌基因蛋白质是E1A和/或癌基因是编码E1A的基因和/或癌基 因蛋白质是E1A。

在一个优选的实施方案中，病毒癌基因蛋白质E1A能结合功能性的 Rb肿瘤抑制基因产物。

在一个备选的实施方案中，病毒癌基因蛋白质E1A不能结合功能性 的Rb肿瘤抑制基因产物。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，病毒癌基因蛋白质E1A不诱导YB-1的细胞核定位。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，药物是施用于细胞是Rb阳性或Rb阴性的患者。

在一个优选的实施方案中，所述细胞是那些参与受所述药物影响的病 症形成的细胞。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，所述细胞在细胞核中是Rb阴性或YB-1阳性的，特别是在独立于细 胞周期的细胞核中是YB-1阳性。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，所述药物用来治疗肿瘤。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，所述细胞，特别是形成肿瘤或其部分的细胞，是有抵抗力的，特别是 对药物具有多重抗性，所述药物优选地是抗肿瘤剂，更优选地是细胞抑制 剂。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个优选实施方案 中，细胞表达，优选地过度表达膜结合转运蛋白质P-糖蛋白和/或MRP。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，细胞是p53阳性或p53阴性的。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个实施方案中， 与野生型癌基因蛋白质E1A相比，癌基因蛋白质包括一个或几个突变或 缺失，其中所述缺失优选地是选自包括CR3区的缺失和N端缺失和C端 缺失的组中的那些。意欲E1A癌基因蛋白质能结合Rb。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，与野生型癌基因蛋白质相比，癌基因蛋白质包括一个或几个突变或缺 失，其中所述缺失是在CR1区和/或CR2区中优选的一个。意欲癌基因蛋 白质E1A不能结合Rb。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个实施方案中， 病毒癌基因蛋白质，特别是E1A，是在组织特异性和/或肿瘤特异性启动 子控制下。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，病毒，特别是腺病毒编码YB-1。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，YB-1是在组织特异性和/或肿瘤特异性启动子控制下。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个优选实施方案 中，病毒，特别是腺病毒，编码选自包括E4orf6、E4orf3、E1B55k和 腺病毒的E3ADP蛋白质的组中的至少一个蛋白质。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个备选实施方案 中，细胞在细胞核中包含YB-1，特别是形成肿瘤或其部分的细胞在细胞 核中包括YB-1。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的另一个实施方案 中，在诱导将YB-1转运进入细胞核后，肿瘤在细胞核中包含YB-1。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个优选实施方案 中，YB-1向细胞核的转运是由至少一个方法引起的，其中所述方法选自 包括辐射、施用细胞抑制剂和过热疗法的组。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个特别优选实施 方案中，将所述方法施用于细胞、器官或生物体。

在按照本发明的第二十一和第二十二个方面应用的一个优选实施方案 中，病毒，特别是腺病毒，选自包括下列的组：AdΔ24、dl922-947、 E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB 016、dl520和缺乏表达的病毒E1A癌基因 的病毒，所述病毒E1A癌基因能结合功能性Rb肿瘤抑制基因产物。

在第二十三个方面中，问题通过病毒，优选地腺病毒在制备药物中的 应用而得以解决，其中所述病毒，特别是腺病毒是适合的使得复制经过或 通过YB-1介导的E2-晚期启动子的活化得到控制，优选地主要通过E2- 晚期启动子的活化得到控制。在一个实施方案中，YB-1是转基因的YB-1 或细胞的YB-1，特别是细胞的去调节的YB-1或去调节的YB-1。转基因 的YB-1优选地是在细胞中通过载体，特别是通过一个或所述腺病毒表达 的YB-1。E2-晚期启动子优选地是如包含在野生型腺病毒中的腺病毒E2- 晚期启动子或如与本文描述的转基因表达相关使用的E2-晚期启动子。

在第二十四个方面中，问题通过病毒，特别是腺病毒在细胞中复制的 应用而得以解决，所述细胞在细胞核中包含YB-1，其中所述病毒，特别 是腺病毒是适合的使得复制通过E2晚期启动子的活化，优选地主要通过 E2晚期启动子的活化来由YB-1进行控制。在一个实施方案中，YB-1是 转基因的YB-1或细胞的YB-1，特别是细胞的去调节的或去调节的YB-1。 转基因的YB-1优选地是通过载体在细胞中表达的YB-1，所述载体特别 是是一个或所述腺病毒。E2-晚启动子优选地是如在野生型腺病毒中存在 的腺病毒E2-晚期启动子，或如与本文描述的转基因的表达相关使用的E2 一晚期启动子。

在本发明的第二十三和/或二十四方面的一个优选实施方案中，如本 文公开的所述腺病毒是适合的，特别适合的，使得其可按照本发明来使用。

在第二十五个方面，问题通过病毒的癌基因蛋白质，特别是一个分离 的病毒癌基因蛋白质得以解决，其中所述病毒癌基因蛋白质具有如下特 征：

a)在YB-1细胞核阳性细胞中至少一个病毒基因的反式激活，所 述基因选自包括下列的组：E1B55k、E3ADP和E4orf6和E4orf4； 和

b)在细胞核中。特别是在存在病毒癌基因蛋白质的细胞的细胞核 中没有YB-1的诱导。

在一个实施方案中，病毒癌基因蛋白质是E1A。

在另一个实施方案中，与野生型癌基因蛋白质相比，病毒癌基因蛋白 质包括一个或几个突变或缺失，其中所述缺失优选地是选自包括CR3区 的缺失、N端的缺失和C端的缺失的组中的那些。

在一个实施方案中，通过病毒癌基因蛋白质的YB-1的诱导发生在 E4orf6和/或E1B55kD存在于包括所述细胞核的细胞中的条件下。

意欲病毒癌基因蛋白质能结合Rb。

在一个备选实施方案中，病毒癌基因蛋白质包括一个或几个突变或缺 失，其中所述缺失优选地是E1A癌基因蛋白质的CR1区和/或CR2区中 的一个。意欲所述病毒癌基因蛋白质不能结合Rb。

在第二十六个方面中，本发明涉及病毒复制系统的应用，特别是腺病 毒复制系统的应用，所述系统包括编码如根据本发明使用的病毒，特别是 腺病毒的核酸，并且包含辅助病毒的核酸，其中所述辅助病毒的核酸包括 编码YB-1的核酸序列。

在一个实施方案中，病毒的核酸，特别是腺病毒的核酸，和/或辅助 病毒的核酸作为可复制的载体存在。

在第二十七个方面中，本发明涉及编码如根据本发明使用的病毒，特 别是腺病毒的核酸在制备药物中的应用，特别是在制备用于治疗肿瘤的药 物中的应用。

在一个优选的实施方案中，细胞，特别是形成肿瘤或其部分的细胞显 示抗性，特别是对药物的多重抗性，所述药物特别是抗肿瘤剂和更特别地 细胞抑制剂。

在第二十八个方面中，本发明涉及编码如根据本发明使用的病毒，特 别是腺病毒的核酸在细胞核中含有YB-1的细胞中复制的应用，其中所述 病毒在细胞核内不包含YB-1或在独立于细胞周期的细胞核内不包含YB- 1或不包含任何去调节的YB-1的细胞内是复制缺陷的，其中所述病毒编 码癌基因或癌基因蛋白，其在YB-1细胞核阳性细胞内至少反式激活一个 病毒基因，优选腺病毒基因，其中所述基因选自包括E1B55kDa、E4orf6、 E4orf3和E3ADP的组。

在第二十九个方面中，问题通过编码如按照本发明使用的病毒，特别 是腺病毒的核酸在制备药物中的应用而得以解决，其中所述病毒是适合 的，使得复制经过E2-晚期启动子的活化，优选主要经E2-晚期启动子的 活化由YB-1进行控制。在一个实施方案中，YB-1是转基因的YB-1或细 胞的，特别是细胞的去调节的，或去调节的YB-1。转基因的YB-1优选 地是通过载体，特别是通过一个或所述腺病毒在细胞中进行表达的YB-1。 E2-晚期启动子优选地是腺病毒E2-晚期启动子诸如包含在野生型腺病毒 中的E2-晚期启动子，或如与本文描述的转基因表达相关使用的E2-晚期 启动子。

在第三十个方面中，问题通过编码如按照本发明使用的病毒，特别是 腺病毒的核酸在细胞中复制中的应用而得以解决，其中所述病毒是适合的 使得复制经过E2-晚期启动子的活化，优选主要经过E2-晚期启动子的活 化由YB-1进行控制。在一个实施方案中，YB-1是转基因的YB-1或细胞 的，特别是细胞的去调节的YB-1。转基因的YB-1优选地是通过载体， 优选地通过一个或所述腺病毒在细胞中进行表达的YB-1。E2-晚期启动子 优选地是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚期启动子，或如与本文 描述的转基因表达相关使用的E2-晚期启动子。

在第三十一个方面中，问题通过将包括前述核酸之一的载体按照本发 明第二十一或第二十二个方面使用而得以解决。

在第三十二个方面中，本发明涉及与YB-1相互作用的的试剂的应用， 用于赋予细胞、肿瘤组织的细胞或患者以特征，以便确定是否他们将会被 如按照本发明使用的病毒，特别是腺病毒接触和/或处理。

在一个实施方案中，所述试剂选自包括抗体、抗促成素(anticaline)、 适体、适酶(aptazymes)和spiegelmers的组。

在第三十二个方面中，问题通过根据本发明的病毒癌基因蛋白质或编 码它们的核酸在制备如与按照本发明第二十一和第二十二方面的用途相关 使用的病毒、特别是腺病毒中的应用而得以解决。

在一个实施方案中，所述病毒包括编码转基因的核酸。

在另一个实施方案中，所述病毒包括翻译产物和/或转基因的转录产 物。

在一个优选的实施方案中，腺病毒复制系统的核酸和/或辅助病毒的 核酸包括转基因或编码转基因的核酸。

在另一个实施方案中，核酸包括转基因或编码转基因的核酸。

在一个备选的实施方案中，转基因选自包括下列的组：前体药物、 细胞因子、细胞调亡诱导基因、肿瘤抑制基因、金属蛋白酶抑制剂基因 和血管发生抑制剂基因和酪氨酸激酶抑制剂基因。

在一个实施方案中，转基因选自包括siRNA、适体、反义分子和核 酶的核酸的组，其中所述siRNA、适体、反义分子和/或核酶针对靶分子。

在另一个实施方案中，靶分子选自包括下列的组：抗性相关因子、 抗细胞调亡因子、癌基因、血管生成因子、DNA合成酶、DNA修复酶、生 长因子和它们的受体、转录因子、金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶 和尿激酶类型的纤溶酶原激活剂。在一个实施方案中，抗性相关因子优 选地选自包括P-糖蛋白、MRP和GST的组，并且还包括编码它们的核酸。 在一个实施方案中，抗细胞调亡因子选自包括BCL2的组，并且还包括编 码它们的核酸。在一个实施方案中，癌基因选自包括Ras，特别是突变 的Ras、Rb和MYC的组，并且还包括编码它们的核酸。在一个实施方案 中，血管生成因子选自包括VEGF和HMG蛋白的组，并且还包括编码它 们的核酸。在一个实施方案中，DNA合成酶选自包括端粒酶的组，并且 还包括编码它们的核酸。在一个实施方案中，DNA修复酶选自包括Ku-80 的组，并且还包括编码它们的核酸。在一个实施方案中，生长因子选自 包括PDGF、EGF和M-CSF的组，并且还包括编码它们的核酸。在另一个 实施方案中，受体优选的是生长因子的受体，其中优选地，生长因子选 自包括PDGF、EGF和M-CSF的组，并且还包括编码它们的核酸。在一个 实施方案中，转录因子选自包括YB-1的组，并且还包括编码它们的核酸。 在一个实施方案中，金属蛋白酶特别是基质金属蛋白酶。在一个优选的 实施方案中，基质金属蛋白酶选自包括MMP-1和MMP-2的组，并且还包 括编码它们的核酸。在一个实施方案中，尿激酶类型的纤溶酶原激活剂 选自包括uPa-R的组，并且还包括编码它们的核酸。

在另一个实施方案中，所述药物还包括至少一个药用活性化合物。

在本发明任何一个方面的优选实施方案中，药用活性化合物选自包 括下列的组：细胞因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞抑 制剂和细胞周期抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。

上述公开的根据本发明的腺病毒，特别是与本发明的第一至第八方面 有关的所述的那些，在这里也称作I组腺病毒；而具有反式激活的癌基因 蛋白(例如，E1A和/或这里和特别是上面提及的要根据本发明使用的那 些)的腺病毒在这里也称作II组腺病毒。I组腺病毒和II组腺病毒在本文 中还一起称作腺病毒或根据本发明的腺病毒或根据本发明的病毒。

本发明是基于一项意外发现，即腺病毒基因的表达序列的反转导致有 效的复制和任选地裂解受腺病毒感染的细胞。关于腺病毒基因的时间上的 变化的表达，重点放在E1B蛋白和E4蛋白上，他们在这里还单独地或集 中地称作第一种蛋白，它们在第二种蛋白之前表达。第二种蛋白选自E1A 蛋白。该表达顺序与野生型腺病毒相比是反转的，在野生型腺病毒中，首 先表达E1A蛋白，随后才表达E1B蛋白和E4蛋白，以确保激活转录因 子，例如转运进受感染的细胞的核中，并影响或控制进一步的复制活性。 野生型腺病毒中的腺病毒转录物的动力学记载在例如Glenn G.M.和 Ricciardi R.P.Virus Research 1988，9，73-91中，其报道说，在野生型中， 通常在转录物和翻译产物(分别是E4orf6和E1B55k)之前就可以检测到 E1A转录物(即E1A12S转录物和E1A13S转录物)。在本文中，如果没 有相反的说明，在本文中E1B蛋白通常优选地是E1B-55kD蛋白。在本文 中，如果没有相反的说明，E4蛋白通常优选地是E4orf6蛋白。在本文中， 如果没有相反的说明，E1A蛋白通常优选地是E1A12S蛋白，或者是在 本文中所述的与E1A-修饰的腺病毒有关的E1A蛋白。

本发明包括，原则上E1A蛋白(更具体地也是E1A12S蛋白)可以 是取代的。如果没有相反的说明，这种取代的E1A蛋白和E1A12S蛋白 在本文中也分别称作E1A蛋白和E1A12S蛋白，或者认为是由该术语包 括。不只是E1A12S蛋白，还可以使用具有肿瘤抑制功能的E1A蛋白， 例如Dickopp A，Esche H，Swart G，Seeber S，Kirch HC，Opalka B.Cancer Gene Ther.2000，Jul；7(7)：1043-50中所记载的。如这里所使用的和/或提及 的E1A蛋白(特别是E1A12S蛋白)的其它衍生物，通过也是能从Rb/E2F 复合物中释放出因子E2F的蛋白。他们特别是如Chellappan S.等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，4549-4533所述的猿猴病毒40肿瘤抗原 (SV40大T抗原)、乳头状瘤病毒E7蛋白(HPV E7)。

本发明还包括，可以使用E4orf6和E1B55k的衍生物，如这里所使用 的，其中所述的术语E4orf6和E1B55k包含这样的衍生物。衍生物记载在 例如Shen Y等，J.of Virology 2001，75，4297-4307；Querido E.等，J.of Virology 2001，75，699-709中。

本发明包括，E1B蛋白在E1A蛋白之前表达，或E4蛋白在E1A蛋 白之前表达，或E1B蛋白和E4蛋白都在E1A蛋白之前表达，每一种都 如上所述。

以该方式设计的腺病毒能在感染细胞后以特别高的水平复制，所述的 细胞在核中表达YB-1，优选地在独立于细胞周期的核中表达YB-1，或者 其包含去调节的YB-1，优选在细胞质中。希望不限于此，本发明的发明 人在下面假设，E1B蛋白和/或E4蛋白组成的复合物和这两种蛋白中的单 独一种分别能将去调节的YB-1转运进细胞核中，或者能在先于E1A蛋白 表达的E1B蛋白和/或E4蛋白的影响下在那里启动腺病毒的复制。一旦 在细胞核中或者以活化的形式存在于那里，如这里所述，更具体地使用 E2-晚期启动子，YB-1有效地复制。因此，E1B蛋白和/或E4蛋白的时间 上较早表达避免了在伴有E1A蛋白的初始表达的野生型中观察到的级联。 在一个优选的实施方案中，E1A蛋白是特别不再反式激活或仅能将E1B 蛋白和/或E4蛋白反式激活到非常有限程度的E1A蛋白。优选地，该反 式激活既不足以确保有效的复制，也不足以确保在细胞中的复制，所述细 胞的核中不含有YB-1。优选的是，反式激活不发生在这样的细胞中，其 独立于细胞周期的核中不含有YB-1，或者不具有去调节的YB-1。

而且，本发明是基于一项意外发现，即腺病毒能以特别有效的方式复 制，如果其包含至少一种能编码蛋白的核酸，其中所述的蛋白选自包含 E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的组，其中的至少一种蛋白在启动子的控 制下，所述启动子与在野生型腺病毒中控制各蛋白表达的启动子不同。这 样的复制是特别有效的，且通常导致肿瘤裂解，如果该细胞在核中含有 YB-1，特别是在独立于细胞周期的核中含有YB-1，或者如果该细胞含有 去调节的YB-1，特别是在细胞质中含有去调节的YB-1。已经在上面关于 E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白描述的内容也适用于此。在野生型腺病毒 中，E1B蛋白由E1B启动子控制，E4蛋白由E4启动子控制，E1A蛋白 由E1A启动子控制。通过选择与在野生型腺病毒中控制前述蛋白表达的 启动子不同的启动子，由此改变前述蛋白的表达以及各腺病毒核酸和蛋白 之间的调节性的相互作用。通过选择启动子，可以建立时间上不同的表达 图谱，希望在下面不受此限制，导致细胞中观察到的复制，其中的机制可 能是已经在前面关于腺病毒蛋白E1B、E4和E1A的时间上不同的表达所 描述的。通过启动子(与在野生型腺病毒中控制各蛋白的表达的启动子不 同)控制所述蛋白的具体设计的实例，可以从下面的权利要求和实施例部 分中得到，其中更具体地，提及的病毒XVirPSJL1和XVirPSJL2是其中 的代表性的。优选地，E1B蛋白是E1B55kD蛋白，E4蛋白是E4orf6蛋 白，且E1A蛋白是E1A12S蛋白。

优选地控制E1B蛋白和E4蛋白的启动子选自包含肿瘤特异性的启动 子、器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启 动子的组，其条件是，当使用腺病毒启动子时，它们与控制E1B蛋白表 达的E1B启动子不同，且与控制E4蛋白表达的E4启动子不同。特别优 选的是，使用E1A启动子控制E1B蛋白和/或E4蛋白表达。E1A启动子 记载在例如Boulanger P.A.和Blair，G.E.Biochem.J.1991，275，281-299 中。另外，还可以使用每一种和任何其它的异源启动子，即与在野生型腺 病毒中控制各蛋白表达的启动子不同的启动子。代表性的实例是CMV启 动子，其它的启动子对本领域的技术人员而言是显而易见的。

用于控制E1A蛋白的启动子还可以选自包含肿瘤特异性的启动子、 器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启动子 的组，其条件是腺病毒启动子与E1A启动子不同。本发明包括，前述蛋 白(即E1B蛋白、E4蛋白或E1A蛋白)中的一种或多种是在相同启动子 的控制下，尽管如此，优选的是，特别是E1B蛋白和E4蛋白是在相同启 动子的控制下。特别优选的是，E1A蛋白的表达由YB-1-控制的启动子或 可以通过YB-1调节的启动子控制。这样的启动子在本文中与本发明的其 它方面有关地公开。特别优选地，用腺病毒2-晚期启动子控制E1A启动 子的表达，因为它首先可以通过YB-1调节，其次还在没有YB-1的情况 下仅仅表现出微小的实际上可以忽略的转录，因而能确保非常好地控制由 E2-晚期启动子控制的核酸的表达。这显著地提高了生物安全性，特别是 当用于医药领域时。

而且，本发明的发明人已经发现，腺病毒在细胞中能特别好地复制， 所述的细胞在核中含有YB-1，更具体地在独立于细胞周期的核中含有 YB-1，和/或含有去调节的YB-1，优选地在细胞质中含有去调节的YB-1， 如果直接地或间接地特别是在细胞核中为复制提供YB-1，或者如果YB-1 的提供是直接地或间接地通过腺病毒蛋白介导，其中所述的腺病毒蛋白与 E1A不同。本发明的该方面与本文中已经公开的方面不同，即反式激活 E1A-修饰的腺病毒优选II组腺病毒的应用能使这些病毒在YB-1核-阳性 的肿瘤细胞中复制，特别是YB-1阳性的独立于细胞周期的YB-1核-阳性 的细胞，以及含有去调节的YB-1、特别是在细胞质中含有YB-1的那些 细胞，在这里没有利用E1A蛋白(特别是E1A13S蛋白)的反式激活特 征，即关于I组腺病毒，而是在一个优选的实施方案中，E1A13S蛋白是 功能上失活的，因而不再能反式激活E4orf6和E1B55k，它们分别在核中 直接地或间接地参与YB-1的转运和提供。结果，根据本发明的该方面， 不能有效地复制腺病毒。在该范围内，现在核中的YB-1的提供和为腺病 毒复制进行的YB-1的提供不再受E1A蛋白的直接或间接参与的控制，而 是通过不受E1A控制的E1B蛋白(特别是E1B55kD蛋白)和/或E4蛋 白(特别是E4orf6蛋白)的表达来实现。

腺病毒的该实施方案还可以通过上述措施中的一种来实现，例如通过 与E1A蛋白的表达相比，提前E1B蛋白和/或E4蛋白的时间上表达，或 者通过将E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白中的一种或多种置于与在野生型 腺病毒中控制各蛋白的表达的启动子不同的启动子的控制下。

最后，本发明的发明人从意外的发现开始，即有效的腺病毒复制还可 以发生特别是在核中含有YB-1的细胞中，更具体地在独立于细胞周期的 核中含有YB-1的细胞中，或者在含有去调节的YB-1、优选在细胞质中 含有去调节的YB-1的细胞中，如果E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白中的 至少一个、特别是它们的优选形式是在启动子控制下的表达盒中表达。在 本发明的一个实施方案中，基本地提供了3种表达盒，每一个都含有单独 一种所述蛋白。在一个备选实施方案中，表达盒还可以分别含有两种或多 种蛋白E1B、E4和E1A和它们的衍生物以及可能的替代物，特别是在 E1A12S的情况下。以前所述的关于腺病毒包含与蛋白E1B、E4和E1A 有关的核酸的内容，也适用于设计各种蛋白和各自使用的启动子。当使用 这样的表达盒时，优选的是，完全地或部分地删除了野生型腺病毒的基因 组中的蛋白及编码它们的核酸，所述蛋白对应于表达盒的各蛋白，以确保 病毒是稳定的，并防止重组，至少是在较大的程度上。

原则上，可以将表达盒分别克隆进腺病毒的每个区域和每个位点，其 中优选地将一个或几个表达盒分别地或彼此组合地插入到病毒的E1区、 E3区和/或E4区。E1、E3和E4区的核酸可能被完全的、部分地删除， 或者根本未被删除，然而根据本发明关于腺病毒优选的是，编码E1A13S 基因的核酸是失活的或缺失的，所以该病毒不能提供任何反式激活E1A 蛋白。一个或多个区域E1、E3和E4的这种缺失程度取决于使用的表达 盒和任选地进一步导入的外源基因或转基因或含有它们的其它表达盒，即 与腺病毒基因不同的基因，至少在一定程度上不同，即它们不是由在野生 型腺病毒中占优势的腺病毒核酸的调节内容提供，也不是由在该位点的野 生型腺病毒的腺病毒核酸序列提供。本发明包括，在腺病毒基因组中部分 地或完全地删除了在一个或多个编码E1B蛋白、E4蛋白和/或E1A蛋白 的表达盒中含有的核酸。在一个实施方案中，例如在根据本发明的腺病毒 XvirPSJL1或2中，部分地删除了编码E4orf6的腺病毒核酸，但是表达盒 中含有能编码它的完整核酸。优选地，这也可以在E1B55k(也称作E1 55Kd)蛋白和/或E1A12S蛋白实现。缺失的程度将在优选的实施方案中选 择，以使最大包装大小达到野生型腺病毒的最大包装大小的约103％，尽 管该界限只是一个优选的界限。在腺病毒基因组中制作的可能的缺失在优 选的实施方案中只进行限制，以确保还可以生产出感染性的和包装的颗 粒。在本文公开的内容和标准实验的基础上，本领域的技术人员能够确定 缺失的精确程度。

作为构建本文所述的腺病毒的起点，可以使用任何野生型腺病毒，但 是也可以使用其它的腺病毒，只要它们是根据本发明的技术教导构建的。 特别优选地使用C亚群腺病毒，在该群内又优选使用腺病毒2和腺病毒5。

如果没有相反的说明，术语E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的单复数 形式在本文中以同义的方式使用。

如这里所使用的术语“去调节的”YB-1是指如这里所使用的YB-1 分子或YB-1蛋白，其存在形式与在细胞中、优选地在非肿瘤细胞中通常 存在的YB-1定量地和/或定性地不同。可以通过特殊病毒将去调节的YB-1 表征和鉴别为：能在含有这样的去调节的YB-1的细胞背景中，在存在去 调节的YB-1的情况下进行复制。与其相关的特殊病毒是这样的，其中的 E1A蛋白是突变的且表现出反式激活功能。这些特殊病毒的实例是： ADδ24，dl 922-947，E1 Ad/01/07和CB 016和/或[Howe，J.A等，Molecular Therapy 2，485-495，2000；Fueyo J.等，Oncogene 19，2-12，2000；Heise C.等， Nature Medicine 6，1134-1139，2001；Balague，C等，J.Virol.75，7602-7611， 2001；Bautista，D.S.等，Virology 1991，182，578-596；Jelsma T.N.等，Virology 1988，163，494-502；Wong，H.K.和Ziff E.B.，J.of Virology 1994，68， 4910-4920]所述的那些。这样的细胞和具有这样背景的细胞可以分别用于 I组腺病毒和/或II组腺病毒的复制。另外，根据本发明的腺病毒可以裂解 含有这种细胞的肿瘤。

而且，本发明是基于意外的发现，即E1A-修饰的腺病毒在YB-1核阳 性的肿瘤细胞中的DNA复制是基于E2-晚期启动子的激活。E1A-修饰的 腺病毒应当理解为是这样的，其(a)在YB-1核-阴性的细胞中的复制与 野生型相比有所减少，或根本不复制，(b)对至少一种病毒基因具有反式 激活活性，其中该基因特别选自包含E1B-55kDa、E4orf6、E4orf3和E3ADP 的组，和/或(c)不能通过腺病毒将细胞的YB-1转移至核内。任选地， 根据本发明使用的腺病毒具有其它特征，即腺病毒编码的E1A蛋白的结 合会干扰E2F与Rb的结合，并且能够分解由E2F和Rb组成的各自复合 物。具有一个或数个前述的特征a)至c)、优选全部特征a)至c)的腺病毒在 核内不含有YB-1的细胞中是复制缺陷的。

在一个实施方案中，本文所用的显著减少的复制具体地是指与野生型 相比，复制降低了2倍、优选5倍、更优选10倍和最优选100倍。在优 选的实施方案中，使用相同或相似的细胞系，相同或相似的感染的病毒滴 度(感染复数，MOI，或噬菌斑形成单位，pfu)和/或相同或相似的常规 实验条件来比较复制。本文所用的复制特别是指颗粒的形成。在另一实施 方案中，复制的测量可以是病毒核酸合成的程度。测定病毒核酸合成的程 度的方法以及测定颗粒形成的方法为本领域技术人员所已知。

本文所述的发现、方法、应用或核酸、蛋白、复制系统等不一定限于 腺病毒。原则上，这些系统还存在于其它病毒中，它们也包含在本文中。

使用根据本发明的病毒或使用根据本发明所述的病毒的应用，与按照 现有技术10-100pfu/细胞相比，当使用1-10pfu/细胞的感染率时，可以实 现比得上野生型的复制。

细胞的YB-1应当是指由细胞编码和优选还由细胞表达的任何YB-1， 其中该YB-1存在细胞中，特别是在各细胞感染腺病毒之前，所述的腺病 毒优选本文所述的腺病毒和/或辅助病毒。然而，本发明也包括，细胞的 YB-1是引入细胞的或通过仅当施加外部措施(例如用病毒、优选腺病毒 感染)由这些细胞生产的YB-1。

以下不希望受此束缚，本发明的发明人假定E2-早期启动子(即早期 E2启动子)不是通过人细胞E2F转录因子打开，所述E2F转录因子与根 据本发明使用的病毒的复制相关，还与本发明的腺病毒的根据本发明的应 用相关。在这样的环境下，复制的开始独立于细胞的Rb状态，即使用本 文公开的病毒感染的和优选随后裂解的肿瘤细胞可以包含功能性的以及 无活性的Rb蛋白。另外，使用本文公开的腺病毒或使用本文公开的条件 的腺病毒的复制不需要任何功能性的p53蛋白，但是也不受其存在的负面 影响。如此，该技术教导背离了使用能消解肿瘤或能裂解肿瘤的腺病毒的 原理，所述腺病毒的类型为AdΔ24、dl922-947、E1Ad/01/07、CB016，或 例如在欧洲专利EP 0 931 830中描述的那些腺病毒，已经在以下假设下在 E1A蛋白中引入了一个或数个缺失：完好的功能性的Rb蛋白会阻碍体内 有效复制，因此仅在Rb-阴性和Rb-突变细胞中体内地提供了腺病毒的复 制。现有技术的这些腺病毒系统是基于E1A，以便通过早期E2启动子(E2 早期启动子)和“自由E2F”控制腺病毒的体内复制。然而，根据本发明 可以将现有技术中的这些已知病毒用于细胞中的复制，所述细胞在独立于 细胞周期的核内含有YB-1，或者含有去调节的YB-1。

根据本发明可以使用在所述欧洲专利EP 0 931 830中描述的病毒，特 别是腺病毒。更具体地，在所述专利中描述的病毒是复制缺陷的，且不能 表达病毒癌蛋白的病毒，该癌蛋白能够结合功能性的Rb肿瘤抑制基因产 物。腺病毒可以具体地为不能表达病毒E1A癌蛋白的任何腺病毒，该E1A 癌蛋白能够结合功能性的肿瘤抑制剂基因产物，更具体地是Rb。病毒E1A 癌蛋白可以表现出失活突变，例如在腺病毒Ad5(在本文中也称作Ad5) 的氨基酸位点30-85的CR1结构域，在核苷酸位点697-790和/或Ad5的 氨基酸位点120-130CR2结构域，核苷酸位点920-967，其涉及p105Rb 蛋白、p130和p107蛋白的结合。但是，本发明还包括，腺病毒是类型2 的dl 312或类型5的NT dl 1010。

关于根据本发明的腺病毒制备药物，特别是制备治疗肿瘤病和本文公 开的其它疾病的药物的应用，关于本发明的腺病毒的应用和本发明的腺病 毒在细胞中复制的应用，所述的细胞在核内含有YB-1，优选地在独立于 细胞周期的核内含有YB-1，或者含有去调节的YB-1，优选地在细胞质中， 复制最终发生在这样的细胞中，其在核内含有YB-1，优选地独立于细胞 周期，换句话说，它们是YB-1核-阳性的，或者发生在含有去调节的YB-1 的细胞中。特别值得注意的是，如此的腺病毒在下述的细胞中不复制或以 显著降低的水平复制：其核内不含有YB-1而仅在细胞质中含有YB-1， 或者不含有任何去调节的YB-1。因此，这些病毒的成功复制需要在核内 存在YB-1，优选地独立于细胞周期，或者存在去调节的YB-1。如将在下 面更详细地描述的，这可以通过例如对细胞施加措施来实现，该措施能导 致YB-1的表达或存在，优选地独立于细胞周期，或核中的去调节的YB-1， 或去调节的YB-1的表达。各种措施可以例如分别是通过根据本发明使用 或经历本发明的腺病毒YB-1的编码和表达，该腺病毒除了腺病毒基因以 外还携带编码YB-1和特别是编码YB-1表达的遗传信息。导致细胞核内 YB-1转运、诱导或表达的其它措施是采用应激，如向细胞和包含该细胞 的生物体施加细胞生长抑制剂、照射、过热等。在一个优选实施方案中， 辐照可以是任何辐射，其是例如在治疗肿瘤病中所使用的。

在优选的实施方案中表征了根据本发明使用的、特别是用于肿瘤裂解 的腺病毒以及依照本发明的腺病毒，其特征在于，它们在下述细胞中不复 制：其独立于细胞周期的核内不含有YB-1且因而是YB-1核-阴性的，或 者不含有任何去调节的YB-1。

一部分要根据本发明使用的腺病毒(它们与本发明的腺病毒不同)的 另一特征是它们编码在此也称为癌基因蛋白的病毒癌基因，其中癌基因蛋 白优选为E1A，其中癌基因蛋白能够激活至少一个对病毒复制和/或受病 毒感染细胞的细胞裂解有影响的病毒基因。优选地，对复制的影响是这样 的，与其中各种病毒的癌基因蛋白缺失的情形相比，病毒在癌基因蛋白存 在下复制得更好。该过程在本文中也称为反式激活，当反式激活是通过 E1A介导时，具体地称作E1A反式激活。术语“反式激活”优选地描述 以下过程，即各种病毒癌蛋白对一个或多个不同于编码病毒癌蛋白基因本 身基因的其它基因的表达和/或转录有影响，即控制其表达和/或翻译，特 别是激活们。这些病毒基因优选地为E1B55kDa、E4orf6、E4orf3和 E3ADP，以及前述基因和基因产物各自的任何组合。

根据本发明使用的腺病毒和本发明的腺病毒的另一个尽管只是任选 的特征分别是它们对肿瘤抑制剂Rb的结合特征，以及它们编码的蛋白中 的具体一些的对肿瘤抑制剂Rb的结合特征。原则上，本发明包括，根据 本发明使用的腺病毒能或不能与Rb结合。两种腺病毒备选实施方案的任 一种的应用独立于处理的或要处理细胞的Rb状态。

为了赋予E1A不结合Rb的能力，可以对E1A癌蛋白进行下列删除： CR1区域(Ad5中氨基酸位点30-85)的缺失和CR2区域(AD5中氨基 酸位点120-139)的缺失。在进行过程中，CR3区域被保留，且可对其它 早期病毒基因具有反式激活功能。

但是，为了赋予E1A结合Rb的能力，下列对E1A癌蛋白的缺失原 则上是可能的：CR3区域(氨基酸位点140-185)的缺失；N-末端(氨基 酸位点1-29)的缺失；氨基酸位点85-119的缺失；和C-末端(氨基酸位 点186-289)的缺失。上述列出的区域不影响E2F与Rb的结合。反式激 活功能保持完整，但是与野生型Ad5相比有所降低。

本发明还包括，特别是关于本发明的腺病毒，将E1A蛋白、特别是 E1A12S蛋白设计成这样，在一个实施方案中，它能结合到Rb，在不同的 实施方案中，它不能结合到Rb，其中这样的E1A12S蛋白是E1A蛋白， 更具体地是本发明意义上的E1A12S蛋白，然而其在现有技术中有时称作 修饰的E1A12S。E1A12S蛋白的各种设计，更具体地关于E1A蛋白(它 在本文中也简称为E1A)的前述缺失，均为本领域技术人员所知。

在现有技术中基本已知的且没有显示出任何反式激活的这些腺病毒 通常认为是复制缺陷型。然而，本发明的发明人的贡献在于，已经发现它 们仍然能够在适当背景下特别是细胞背景下复制。YB-1在核内的存在， 优选YB-1在核内的独立于细胞周期的存在，或去调节的YB-1，能产生 或提供该适当的细胞背景。在本发明的一个和任何其它方面所用的术语细 胞或细胞系统包含细胞提取物的片段或级分，以及体外、体内或原位的细 胞。在这个程度上，术语细胞系统或细胞还包含分别存在于细胞培养物、 组织培养物、器官培养物或任何体内和原位组织或器官中的细胞，其为分 离的、成群的或作为组织、器官或生物体的一部分，但是也照此在优选的 活体中存在。生物体优选地为任何脊椎生物，更优选哺乳动物。更优选地， 生物体是人生物体。其它优选的生物体是根据本发明的各个方面公开的那 些。

另外，还本发明包括，基于本文提供的技术教导，在细胞中产生了新 病毒，该病毒能表现出本文所述的腺病毒以及现有技术中所述的那些的复 制行为，所述的细胞是YB-1核-阳性的，优选独立于细胞周期的YB-1核 -阳性的，或包含去调节的YB-1。换句话说，优选特别从已知的腺病毒开 始，可以设计其它病毒，其具有根据本发明应用有关的本文定义的特征。

与本发明相关，与本发明的病毒相反，要根据本发明使用的各种腺病 毒的修饰的E1A癌蛋白能够在YB-1核-阳性的细胞中或包含去调节的 YB-1的细胞中反式激活早期病毒基因，例如E1B55K，E4orf3，E4orf6， E3ADP。优选地，对病毒基因组无其它改变，各种腺病毒在此程度上可以 另外对应于野生型的腺病毒或其衍生物。

在本文中公开的编码或包含反式激活本发明意义上的癌基因蛋白的 病毒，包含例如腺病毒AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB106和/或在欧洲 专利EP 0 931 830中所述的腺病毒，其各自能够反式激活早期基因，如 E1B，E2，E3和/或E4，并且比得上野生型腺病毒，特别是野生型Ad5。在 这些情况下，E1A蛋白的特定区域负责反式激活。在各种腺病毒的血清型 中，在E1A蛋白中存在3个高度保守的区域。氨基酸位点41-80的CR1 区域，氨基酸位点120-139的CR2区域和氨基酸位点140-188的CR3区 域。反式激活功能主要基于E1A蛋白中CR3区域的存在。CR3的氨基酸 序列在前述腺病毒中以未改变的方式存在。这导致早期基因E1B，E2，E3 和E4的反式激活，其独立于是否YB-1存在于核或细胞质中。

与此相反，在重组腺病毒dl520中，CR3区域已经缺失。因此，dl520 表达所谓的E1A12S蛋白，其不包含CR3区域的氨基酸序列。结果，dl520 仅可以发挥极弱的反式激活功能，特别是在E2区域，因此在YB-1核-阴 性的细胞中不复制。在YB-1核-阳性的细胞中，YB-1反式激活E2区域， 并因此允许dl520的有效复制。为了本文所述目的的象dl520的系统和源 自它们的系统的应用以此为基础。两种前述腺病毒组(例如δ24(本文也 称为AdΔ24)和例如dl520)之间的另一重要区别在于，与YB-1核-阴性 的细胞或不含有去调节的YB-1的细胞相比，早期基因E1B、E3和E4在 YB-1核-阳性的独立于细胞周期的细胞或含有去调节的YB-1的细胞中被 更全面地反式激活。与此相反，在δ24中没有或仅有微小差异。然而，与 野生型腺病毒相比，dl520和更具体地E1A12S蛋白的反式激活作用显著 降低。然而，该反式激活足以提供YB-1核-阳性的细胞中的有效复制，也 如实施例10所示。在本文所述的特别是在这方面所述的E1A蛋白的设计， 和编码它们的核酸的设计，以便E1A蛋白与野生型癌基因蛋白E1A相比 具有一个或数个缺失和/或突变，包括和特别优选如与dl520或AdΔ24、 dl922-947，E1Ad/01/07、CB106和/或在欧洲专利EP 0 931 830中所述腺 病毒相关的所述的E1A蛋白的那些设计，是病毒特别是腺病毒的实施方 案，其复制受到控制，优选由激活E2-晚期启动子显著控制。优选地，缺 失是选自包含CR3区域的缺失和N-末端的缺失和C-末端的缺失的组。基 于本文提供的公开内容，本领域技术人员可以产生E1A蛋白的其它允许 这种腺病毒复制形式的实施方案。如前所述的E1A蛋白的实施方案是也 可以根据本发明的腺病毒使用的实施方案，所述的腺病毒在本文中也称作 本发明的腺病毒或I组腺病毒。

本发明的腺病毒、特别是I组腺病毒在本文中也称为衍生物，且可以 根据本发明使用，它们典型地包含E1缺失、E1/E3缺失和/或E4缺失， 即相应的腺病毒分别不能产生功能活性的E1和/或E3和/或E4表达产物 和相应的产物。或者换句话说，这些腺病毒仅能够产生在功能上无活性的 E1、E3和/或E4表达产物，其中功能上无活性的E1、E3和/或E4表达产 物是这样的表达产物，其或者根本不作为表达产物存在，无论是转录水平 和/或翻译水平，或者它以至少缺少一种功能(在野生型腺病毒中归因于 它)的形式存在。野生型腺病毒的表达产物固有的这个/这些功能为本领 域技术人员所已知，例如在Russell，W.C.，Journal of Virology，81， 2573-2604，2000中描述。Russell(上文)也描述了腺病毒和腺病毒载体的 设计原理，其结合于此作为参考。还本发明包括，修饰的E1A癌蛋白， 即不再反式激活的E1A蛋白和其它的蛋白，例如E1A12S、E1B-55K、 E4orf6和/或E3ADP(腺病毒死亡蛋白(ADP))(Tollefson，A.等，J.Virology， 70，2296-2306，1996)在这样的载体中单独地或任意组合地表达。单独提及 的基因以及本文公开的转基因可以相互独立地克隆到E1和/或E3和/或E4 区域中，并且可以使用适当的启动子或在适当启动子的控制下表达。基本 上，E1、E3和E4每一个区域适合作为腺病毒核酸内的克隆位点。在一 些实施方案中，适当的启动子分别是与E1A、优选修饰的E1A的控制和 表达有关的在本文中公开的那些。

最后，在一个实施方案中，根据本发明使用的II组腺病毒是E1B缺 陷型的，特别是E1B 19kDa缺陷型的。如本文一般地使用的，术语缺陷 型通常是指一种状况，其中E1B不能表现出野生型E1B的所有特征，并 且缺少这些特征中的至少一个。

根据本文公开的本发明使用的II组腺病毒的至少一些实施方案是照 此在本领域已知的。根据本发明使用的腺病毒优选地是重组腺病毒，更具 体地，如果与野生型相比，在本文提供的技术教导的意义上已经进行了变 化。分别删除或诱变与本发明无关的腺病毒核酸序列为本领域技术人员所 知。如本文所述，这些缺失可以例如与编码E3和E4的核酸的一部分有 关。如果这些缺失不延伸至蛋白E4orf6，换句话说，要根据本发明使用的 腺病毒能编码E4orf6，特别优选的是E4缺失。在优选的实施方案中，这 些腺病毒核酸可以还包装在病毒衣壳中，并因此形成感染性的颗粒。对根 据本发明的核酸的应用同样如此。通常应当注意，腺病毒系统可以缺失单 个或数个表达产物。与此相关，这与I组腺病毒和II组腺病毒相关，应当 考虑这可能是由编码该表达产物的核酸的突变或缺失造成的，其中这样的 突变和缺失分别是彻底的，或者达到不再形成表达产物的程度，或者由调 控元件和控制表达的元件造成，例如以不同于野生型的方式发生缺失或活 化的启动子和转录因子，其分别在核酸水平上(缺少启动子；顺式-作用 元件)或在翻译和转录系统水平上(反式-作用元件)。特别是后一方面可 能依赖于各细胞的背景。

除了使用照此已知的腺病毒以外，根据本发明还可以使用新的腺病 毒，例如II组腺病毒，其可用于已经公开的在本文所述对于其它腺病毒 的目的。本发明的新的腺病毒来自本文提供的技术教导。特别优选的代表 是，例如，在图16和图17中描述的病毒Xvir03和Xvir03/01，其设计原 理也进一步在实施例11和12中说明。

在载体Xvir03的情形中，将CMV启动子克隆到E1区域中，该E1 区域控制被IRES序列分开的E1B 55K和E4orf6的核酸。由于分别将这 两个基因克隆进病毒和由于其产生的基因产物，维持复制功效结果以使复 制特别发生在YB-1核-阳性的细胞中、更具体地在本发明公开的意义上的 包含去调节的YB-1的那些细胞中，所述结果实际上对应于一种野生型病 毒，其中在细胞、特别是肿瘤细胞中选择性的复制。在一个实施方案中， 其中存在去调节的YB-1的细胞显示出与正常的或非肿瘤的细胞相比增加 的YB-1表达，优选YB-1的隔室独立表达。

另外开发的病毒Xvir03是病毒Xvir03/01，在优选的实施方案中，其 中已经克隆了在特定启动子、尤其是肿瘤特异性的或组织特异性的启动子 控制下的治疗基因或转基因。与该病毒相关，E4区域也是功能上无活性 的，优选缺失。本文所述的转基因也可以克隆到E4区域中，其中这可以 作为备选或除了转基因克隆到E3区域中以外而发生。

本文所述的和特别在下面所述的转基因，还可以分别通过本发明的腺 病毒(即I组腺病毒和它们的核酸)或本发明的复制系统或与之相关地表 达，并由此包含在含有启动子和核酸序列的表达盒中，其中该核酸序列编 码一个或多个所述的转基因。E1、E3和/或E4区是腺病毒基因组中特别 合适的克隆位点，但是，克隆位点不限于此。

该治疗基因可以是前药基因、细胞因子的基因、诱导细胞凋亡的基因、 肿瘤抑制基因、金属蛋白酶抑制剂和/或血管生成抑制剂和酪氨酸激酶抑 制剂的基因。另外，可以表达siRNA、适体、反义分子和核酶，其优选地 直接针对与癌症相关的靶分子。优选地，单个或多个靶分子选自包含抗性 相关因子、抗细胞凋亡因子、癌基因、血管生成因子、DNA合成酶、DNA 修复酶、生长因子和它们的受体、转录因子、金属蛋白酶，特别是基质金 属蛋白酶和尿激酶类型的纤溶酶原激活剂的组。其优选的实施方案是已经 在本文中关于本发明的其它方面公开的那些。

可以用于优选的实施方案中的可能的前药基因是，例如，胞嘧啶脱氨 酶，胸苷激酶，羧肽酶，尿嘧啶磷酸核糖基转移酶；或嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)；[Kim等，Trends in Molecular Medicine，卷8，No.4(增刊)，2002； Wybranietz W.A.等，Gene Therapy，8，1654-1664，2001；Niculescu-Duvaz等， Curr.Opin.Mol.Therapy，1，480.486，1999；Koyama等，Cancer Gene Therapy，7，1015-1022，2000；Rogers等，Human Gene Therapy，7，2235-2245， 1996；Lockett等，Clinical Cancer Res.，3，2075-2080，1997；Vijayakrishna等， J.Pharmacol.和Exp.Therapeutics，304，1280-1284，2003]。

可以用于优选的实施方案中的可能的细胞因子是，例如，GM-CSF， TNF-α，Il-12，Il-2，Il-6，CSF，干扰素-γ；[Gene Therapy，Advances in Pharmacology，卷40，编辑：J.Thomas August，Academic Press；Zhang和 Degroot，Endocrinology，144，1393-1398，2003；Descamps等，J.Mol.Med.， 74，183-189，1996；Majumdar等，Cancer Gene Therapy，7，1086-1099，2000]。

可以用于优选的实施方案中的可能的细胞凋亡诱导基因是，例如，核心 蛋白聚糖：[Tralhao等，FASEB J，17，464-466，2003]；成视网膜细胞瘤94： [Zhang等，Cancer Res.，63，760-765，2003]；Bax和Bad[Zhang等，Hum.Gene Ther.，20，2051-2064，2002]；细胞凋亡素(apoptin)[Noteborn和Pietersen， Adv.Exp.Med.Biol.，465，153-161，2000]]；ADP[Toth等，Cancer Gene Therapy，10，193-200，2003]；bcl-xs[Sumantran等，Cancer Res，55，2507-2512， 1995]；E4orf4[Braithwaite和Russell，Apoptosis，6，359-370，2001]；FasL， Apo-1和Trail[Boehringer Manheim，Guide to Apoptotic Pathways，Arai等， PNAC，94，13862-13867，1997]；Bims[Yamaguchi等，Gene Therapy，10， 375-385，2003；GNR163：Oncology News，17 June，2000]。

可以用于优选的实施方案中的可能的肿瘤抑制基因是，例如，E1A，p53， p16，p21，p27，或MDA-7。[Opalka等，Cell Tissues Organs，172，126-132， 2002，Ji等，Cancer Res.，59，3333-3339，1999，Su等，Oncogene，22， 1164-1180，2003]。

可以用于优选的实施方案中的可能的血管生成抑制剂是，例如，血管 内皮抑素(endostatin)或血管生长抑素(angiostatin)[Hajitou等，FASEB J.， 16，1802-1804，2002]，和针对VEGF的抗体(Ferrara，N.，Semin Oncol 2002 Dec；29(6 Suppl 16)：10-4)。

可以用于优选的实施方案中的可能的金属蛋白酶抑制剂是，例如， Timp-3[Ahonen等，Mol Therapy，5，705-715，2002]；PAI-1；[Soff等，J.Clin. Invest.，96，2593-2600，1995]；Timp-1，[Brandt K.Curr.Gene Therapy，2， 255-271，2002]。

可以通过I组腺病毒和II组腺病毒表达的本发明意义上的其它转基因 也是酪氨酸激酶抑制剂。示例性的酪氨酸激酶是EGFR(表皮生长因子受 体)[Onkologie，Entstehung und Progression maligner Tumoren；author： Christoph Wagner，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1999]。优选的酪氨酸激酶 抑制剂是曲妥单抗(herceptin)[Zhang H等，Cancer Biol Ther.2003，Jul-Aug； 2(4suppl 1)：S122-6]。

SiRNA(短干扰RNA)由2条、优选2条分开的RNA链组成，其由 于碱基互补性而彼此杂交，该互补性是指它们基本上碱基配对地存在，且 优选地具有高达50个核苷酸、优选18-30个核苷酸、更优选少于25个核 苷酸和最优选21、22或23个核苷酸的长度，其中这些数字是指siRNA 的单链，特别是一段单链序列的长度，该单链与一条、更具体地与第二条 单链杂交或与其碱基配对。SiRNA特异性地诱导或介导mRNA的降解。 其所需的特异性由siRNA的序列和由此它的结合位点介导。待降解的靶 序列基本上与siRNA形成链的第一或第二条链互补。尽管作用的确切方 式还不清楚，推测siRNA代表细胞在发育期间抑制分开的等位基因 (distinct allele)和保护其自身对抗病毒的生物学策略。siRNA介导的RNA 干扰可以用作通过引入基因特异性的双链RNA来特异性地抑制或完全剔 除蛋白的表达的方法。对于高等生物，包含19-23个核苷酸的siRNA照此 是特别合适的，因为它不会激活非特异性的防御反应，例如白介素应答。 直接转染21个核苷酸的具有对称的2个核苷酸长的3’突出端的双链RNA 适用于介导哺乳动物细胞中的RNA干扰，并且与其它技术如核酶和反义 分子相比是高效的(Elbashir，S.Harborth J.Lendeckel W.Yalvcin，A.Weber K Tuschl T：Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature 2001，411：494-498)。仅需要极少siRNA 分子即可抑制靶基因的表达。为了避免外源施用的siRNA的限制，该限 制特别在于干扰现象和siRNA分子特异性传递的瞬时性质，现有技术使 用允许内源性siRNA表达的载体。为此目的，例如，将具有64个核苷酸 长度的寡核苷酸以有义和反义方向引入包含19个核苷酸长的靶序列的载 体，其被例如9个核苷酸长的间隔序列分开。产生的转录物折叠成发卡结 构，其茎结构具有例如19个碱基对。环在细胞中快速降解，以便产生功 能性的siRNA(Brummelkamp等，Science，296，550-553，2002)。

编码YB-1的核酸可以包含介导YB-1转运至核内的核酸序列，所述 YB-1可以是根据本发明使用的腺病毒，特别是II组腺病毒，也可以是本 发明的腺病毒，即I组腺病毒，的一个实施方案中腺病毒的一部分。依照 本发明的核酸、腺病毒和腺病毒系统以及现有技术已知的腺病毒，例如 Onyx-015，AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016，dl 520和在专利EP 0 931 830中描述的腺病毒可以分别用作腺病毒和腺病毒系统，和相应的核酸， 结合根据本发明的这些核酸。介导核转运的适当的核酸序列为本领域技术 人员所已知，例如在(Whittaker，G.R.等，Virology，246，1-23，1998；Friedberg， E.C.，TIBS 17，347，1992；Jans，D.A.等，Bioassays 2000 Jun；22(6)：532-44； Yoneda，Y.，J.Biocehm.(Tokyo)1997 May；121(5)：811-7；Boulikas，T.，Crit. Rev.Eukaryot.Gene Expr.1993；3(3)：193-227；Lyons RH，Mol.Cell Biol.，7， 2451-2456，1987)中描述。介导核转运的核酸序列可以使用不同的原理。 一种这样的原理是，YB-1与信号肽一起形成融合蛋白，或为其提供这样 的信号肽，借助该信号肽将其导入细胞核内，借此发生根据本发明的腺病 毒的复制。

可以在根据本发明使用的腺病毒、更具体地是II组腺病毒，但也是根 据本发明的腺病毒，即I组腺病毒的设计中使用的另一原理是，给YB-1 提供转运序列，其优选从细胞质中的合成开始，将YB-1转移或者移位至 细胞核内，并促进那里的病毒复制。介导转运至核的特别有效的核酸序列 的实例是HIV的TAT序列，其例如与其它该类合适的核酸序列一起记载 在Efthymiadis，A.，Briggs，LJ，Jans，DA.，JBC 273，1623-1628，1998。本发明 包括，按照本发明使用的腺病毒，具体地II组腺病毒，但也是根据本发 明的腺病毒，即I组腺病毒，包含编码介导核转运的肽的核酸序列。

本发明包括，YB-1以其全长的、特别是以对应于野生型YB-1的形式 存在。而且，本发明包括，YB-1作为衍生物，例如以缩短或截短形式使 用或存在。与本发明有关的可以使用或可以存在的YB-1衍生物是优选能 够结合E2-晚期启动子和因此激活腺病毒E2区域基因表达的YB-1。该衍 生物特别包含本文公开的YB-1衍生物。通过在N-末端、在C-末端或在 氨基酸序列内缺失单个或数个氨基酸可以产生其它衍生物。本发明包括， 还将YB-1片段用作本发明意义上的YB-1蛋白。在Jürchott K等[JBC 2003，278，27988-27996]的论文中公开了多种YB-1片段，其特征在于在 C-和N-末端的缺失。各种YB-1片段的分布已经证实，冷休克域(CSD)和 C-末端都与细胞周期调节的使YB-1进入细胞核中的转运有关。因此本发 明包括，与天然YB-1相比，与E1B55k和E4orf6的创造性表达有关的截 短的YB-1(本文也称作YB-1蛋白)更好地迁移进核中并由此介导更强的 CPE，而不需更好地结合E2-晚期启动子，其中不能排除的是，截短的YB-1 还更好地迁移进核中并造成两种效果，即诱导CPE和结合到E2-晚期启动 子。最后，这种截短的YB-1片段也可以更好地迁移进核中并更有效地结 合到E2-晚期启动子，而不诱导更好的CPE。本发明还包括，截短的YB-1 蛋白和片段分别包含与这里公开的全长YB-1有关的其它序列，特别是细 胞定位信号序列(NLS)等。

关于前述各种其它基因和分别由腺病毒编码和表达的基因产物，原则 上它们还可以分别以任何组合的方式编码和表达。

本发明包括，术语腺病毒和腺病毒系统应当理解为具有基本相同的含 义。术语腺病毒应当特别理解为，与包含衣壳和核酸的完整病毒颗粒相关。 术语腺病毒系统特别集中于一项事实，即核酸与野生型相比有所改变。优 选地，这些变化包含腺病毒基因组结构的变化，如由缺失和/或增加和/或 突变启动子、调节序列和/或编码序列如可读框产生。另外，术语腺病毒 系统更优选地作为载体使用，它可以例如用于基因治疗。

前面的说明，包括腺病毒和腺病毒系统的任何应用和任何设计，也适 用于编码它们的核酸，反之亦然。

根据本发明可能的是，根据本发明使用的腺病毒、更具体地II组腺病 毒、但也包括I组腺病毒和编码它们的核酸分别可以是任何各自的腺病毒 核酸，该腺病毒核酸照这样或与其它核酸序列组合导致复制事件。如本文 所解释，可能通过辅助病毒提供复制所需的序列和/或基因产物。在提及 编码核酸序列方面和在该核酸序列是已知的核酸序列的方面，本发明包括 不仅使用相同的序列，而且使用其衍生的序列。术语衍生序列应当特别是 指仍产生基因产物(核酸或多肽)的任何序列，其具有相应于非衍生序列 的功能或非衍生序列的功能。这可以通过本领域技术人员已知的常规试验 确定。该衍生的核酸序列的实例是编码相同基因产物、特别是相同氨基酸 序列的那些核酸序列，然而，由于遗传密码的简并性而具有不同的碱基序 列。

在一个实施方案中，分别关于根据本发明的II腺病毒和/或根据本发 明的对应的腺病毒复制系统和根据本发明的它们应用，腺病毒核酸对于表 达癌基因蛋白是缺失的、特别是E1A蛋白缺失，即，既不编码12S E1A 蛋白(本文也称作E1A12S蛋白)也不编码13S E1A蛋白(本文也称作 E1A13S蛋白)，或者它均不编码12S E1A蛋白和13S E1A蛋白，或被修 饰的，如本文所定义，如果没有相反的说明，腺病毒复制系统另外还包含 辅助病毒的核酸，其中辅助病毒的核酸包含编码癌基因蛋白、特别是E1A 蛋白的核酸序列，其分别具有下列特征和赋予腺病毒下列特征：它优选不 在YB-1核-阴性的细胞中复制，而在独立于细胞周期的YB-1核-阳性的细 胞中或表现去调节的YB-1的细胞中复制，反式激活至少一种病毒基因， 特别是E1B55kDa，E4orf6，E4orf3和/或E3ADP，在YB-1核-阳性的细胞 中，和/或不将细胞YB-1转移至核内。本发明包括，本文所述转基因是由 辅助病毒单独地或集中地编码和/或表达。对于I组腺病毒和II组腺病毒 均施用辅助病毒。

而且，在根据本发明的这种腺病毒复制系统的一个实施方案中，腺病 毒核酸和/或辅助病毒的核酸是作为可复制的载体存在。

本发明还包括，编码I组腺病毒和/或II组腺病毒的核酸优选地存在于 表达载体中，该表达载体根据本发明使用。

在另一方面，本发明还涉及包含至少两个载体的载体组，其中载体组 总共包含如本文所述的用于I组腺病毒和/或II组腺病毒的腺病毒复制系 统，载体组根据本发明使用。在一个实施方案中，腺病毒复制系统的每个 元件排列在单个载体、优选表达载体上。

最后，本发明的另一方面还涉及细胞的应用，所述细胞含有一个或数 个核酸，所述核酸编码的I组腺病毒和/或II组腺病毒优选地根据本发明 使用、和将要根据本发明使用，和/或相应的腺病毒复制系统和/或相应的 载体和/或根据本发明的载体组，用于本文关于各种腺病毒所述的非常相 同的目的。

前述腺病毒构建体和特别是它们的核酸和编码它们的核酸，也可以以 多份的形式导入细胞、优选肿瘤细胞中，于是由于各种单独元件的存在， 它们可以这样一起作用，好像单个元件分别来源于单个核酸和单个或数个 腺病毒。

根据本发明使用的编码I组腺病毒和/或II组腺病、对应的腺病毒系统 或其部分的核酸也可以作为载体存在。优选地，这些载体是病毒载体。当 核酸包含腺病毒核酸时，优选地病毒颗粒为载体。然而，本发明也包括， 所述核酸以质粒载体存在。在每个情形中，载体包含允许和控制插入的核 酸的增殖(即复制)和插入的核酸的任选表达的元件。适当的载体、优选 表达载体和各自的元件是本领域技术人员已知的，例如在Grunhaus，A.， Horwitz，M.S.，1994，Adenoviruse as cloning vectors.In Rice，C.，editor.， Seminars in Virology，London：Saunders Scientific Publications中描述。

涉及载体组的方面考虑前述实施方案，既所述核酸的各种元件不一定 仅包含在一个载体中。因此，载体组由至少两个载体组成。另外，关于载 体进行任何论述也分别适用于载体和载体组。

I组腺病毒和/或II组腺病的特征分别在于本文公开的各种核酸和基因 产物，并可以另外包含本领域技术人员已知的且是野生型腺病毒固有的所 有那些元件(Shenk，T.：Adenoviridae：The virus and their replication.Fields Virology，第三卷，编辑.Fields，B.N.，Knipe，D.M.，Howley，P.M.等， Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996，第67章)。

为了解释而不是限制本发明，下面将简单地讨论腺病毒的复制。

腺病毒的复制是非常复杂的过程，通常是基于人转录因子E2F。在病 毒感染期间，首先表达“早期基因”E1、E2、E3和E4。“晚期基因”组 负责合成病毒的结构蛋白。对于早期基因以及晚期基因的激活，由编码不 同的E1A和E1B蛋白的两个转录单元E1A和E1B组成的E1区域起到关 键的作用，因为它们诱导E2、E3和E4基因的转录(Nevins，J.R.，Cell 26， 213-220，1981)。另外，E1A蛋白可以启动静止细胞中的DNA合成，并因 此促使它们进入S期(参见Boulanger和Blair，1991)。另外，它们与Rb类 的肿瘤抑制剂相互作用(Whyte，P.等，Nature 334，124-127，1988)。在这种情 况下，释放细胞转录因子E2F。E2F因子可以随后结合细胞基因以及病毒 基因的相应的启动子区域(特别是腺病毒E2早期启动子)，并引发转录和 由此的复制(Nevins，J.R.，Science 258，424-429，1992)。pRb和E2F的活性 通过磷酸化调节。pRb的低磷酸化形式主要存在于G1和M期。相反，pRb 的超磷酸化形式存在于S和G2期。通过pRb的磷酸化，从由E2F和低磷 酸化的pRb组成的复合体中释放E2F。E2F从由E2F和低磷酸化的pRb 的复合体中的释放导致E2F依赖性的基因的转录。E1A蛋白仅仅结合低 磷酸化形式的pRb，其中E1A与pRb的结合大部分通过E1A蛋白的CR2 区域发生。另外，它还与CR1区域结合，尽管亲和力较低(Ben-Israel和 Kleiberger，Frontiers in Bioscience，7，1369-1395，2002；Helt和Galloway， Carcinogenesis，24，159-169，2003)。

复制的引发和完成特别需要E2区域的基因产物，因为它们编码三个 关键蛋白。E2蛋白的转录受两个启动子控制，“E2-早期E2F-依赖型”启 动子，其在本文中也称为E2-早期启动子或早期E2启动子，和“E2-晚期” 启动子(Swaminathan和Thimmapaya，The Molecular Repertoire of Adenoviruses III：Current Topics in Microbiology and Immunology，卷199， 177-194，Springer Verlag 1995)。另外，E4区域的产物与E1A和E1B-55kDa 蛋白一起对E2F的活性和p53的稳定性起重要作用。例如，通过由E4区 域编码的E4orf6/7与由E2F和DP1组成的杂二聚体直接相互作用更加反 式激活E2启动子(Swaminathan和Thimmapaya，JBC 258，736-746，1996)。 另外，p53使由E1B-55kDa和E4orf6组成的复合体失活(Steegenga，W.T. 等，Oncogene 16，349-357，1998)，以便成功地完成裂解性的感染周期。另 外，E1B-55kDa蛋白具有另一重要功能，即当与E4orf6蛋白相互作用时， 它促进病毒RNA从核中输出，其中细胞的RNA保持在核内(Bridge和 Ketner，Virology 174，345-353，1990)。另一个重要发现是，由E1B-55kDa/ E4orf6组成的蛋白复合体定位于所谓的“病毒包涵体”。推测这些结构是 复制和转录的位点(Ornelles和Shenk，J.Virology 65，424-429，1991)。

对于复制、特别是对于腺病毒的释放的另一重要区域是E3区域。E3 区域更具体地包含多种相对小蛋白的遗传信息，该蛋白不是腺病毒体外感 染周期(即在细胞培养中)所必需的。然而，它们对于体内急性和/或潜 伏感染期间的病毒的存活起重要作用，因为它们尤其具有免疫调节和细胞 凋亡功能(Marshall S.Horwitz，Virololgie，279，1-8，2001；Russell，上文)。可 以证实，具有约11.6kDa大小的蛋白能诱导细胞死亡。由于其功能，该蛋 白称为ADP-英文术语adenovirus death protein-(Tollefson，J.Virology，70， 2296-2306，1996)。该蛋白主要在感染周期的晚期形成。而且，蛋白的过 量表达导致感染细胞的更好裂解(Doronin等，J.Virology，74，6147-6155， 2000)。

而且，本发明的发明人已知缺失E1A的病毒，即具体地不表达任何 12S E1A蛋白和也不表达任何13S E1A蛋白的那些病毒，它们可以在较高 MOI下非常高效的复制(Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)，然而其不能 在临床应用中实现。该现象在文献中称为“类E1A活性”。还已知从E1A 编码的5个蛋白中，两个蛋白，即12S和13S蛋白，分别控制和诱导其它 腺病毒基因的表达(Nevins，J.R.，Cell 26，213-220，1981；Boulanger，P.和 Blair，E.；Biochem.J.275，281-299，1991)。这证实了，13S蛋白的CR3区 域具体地显示反式激活功能(Wong HK和Ziff EB.，J Virol.，68，4910-20， 1994)。然而，在13S蛋白的CR1和/或CR2区域和/或CR3区域具有特定 缺失的腺病毒基本上是复制缺陷型，在其它细胞系中仍反式激活病毒基因 和启动子，特别是E2区域(Wong HK，Ziff EB.，J Virol.68，4910-20，1994； Mymryk，J.S.和Bayley，S.T.，Virus Research 33，89-97，1994)。

在使用野生型腺病毒感染细胞、典型地肿瘤细胞以后，通过E1A、 E1B-55K和E4orf6将YB-1导入核内，在核内与E1B-55K共定位于病毒 包涵体，其允许病毒体外地和体内地在细胞核内有效复制。先前已经发现， E4orf6也能结合E1B-55K(Weigel，S.和Dobbelstein，M.J.Virology，74， 764-772，2000；Keith N.Leppard，Seminars in Virology，8，301-307，1998)，并 因此分别介导E1B-55K转运和分配到核内，其确保最佳的病毒生产和腺 病毒复制。分别通过E1A、E1B-55K和YB-1的协同作用、通过由 E1B-55K/E4orf6和YB-1组成的复合体，在核内YB-1和E1B-55K在所谓 的病毒包涵体的共定位，根据本发明的病毒的有效复制是可能的，因此本 文所述病毒用于在细胞中复制，所述细胞是YB-1核-阳性的，优选在独立 于细胞周期的核中含有YB-1的细胞，和/或含有或表现去调节的YB-1的 细胞，和/或制备药物，用于治疗疾病，其中涉及YB-1核-阳性的细胞， 优选在独立于细胞周期的核中含有YB-1的细胞，和/或含有或表现去调节 的YB-1的细胞。因此，复制在该细胞背景中是可能的，导致细胞的裂解、 病毒的释放和相邻细胞的感染和裂解，因此在分别感染肿瘤细胞和肿瘤的 情形中，肿瘤最终裂解，即发生溶癌作用。

YB-1属于高度保守因子的类别，其结合反向CAAT序列，其称为Y- 盒。它们可以以调节的方式在转录以及翻译水平上起作用(Wolffe，A.P. Trends in Cell Biology 8，318-323，1998)。在生长和细胞凋亡相关基因的激 活和抑制中发现了越来越多的Y-盒依赖性的调节途径(Swamynathan，S. K.等，FASEB J.12，515-522，1998)。例如，YB-1直接与p53相互作用 (Okamoto，T.等，Oncogene 19，6194-6202，2000)，在Fas基因表达(Lasham，A. 等，Gene 252，1-13，2000)、在MDR和MRP的基因表达(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，2001；Bargou，R.C.等，Nature Medicine 3，447-450，1997)和 在拓扑异构酶和金属蛋白酶的激活(Mertens.P.R.等，JBC 272， 22905-22912，1997；Shibao，K.等，Int.J.Cancer 83，732-737，1999)中起实质 作用。另外，YB-1还参与调节mRNA稳定性(Chen，C-Y.等，Genes & Development 14，1236-1248，2000)和修复过程(Ohga，T.等，Cancer Res.56， 4224-4228，1996；Izumi H.等，Nucleic Acid Research 2001，29，1200-1207； Ise T.等，Cancer Res.，1999，59，342-346)。

通过存在于独立于细胞周期的核中的YB-1，或通过已经由I组腺病毒 和/或II组腺病毒转移到核中的存在于细胞质中的去调节的YB-1，YB-1 在肿瘤细胞的核中定位，导致在不表达和使用任何12S E1A蛋白或任何 13S E1A蛋白过程中独立于E1A的病毒复制(Holm，P.S.等JBC 277， 10427-10434，2002)，并在蛋白YB-1过量表达的情形中导致多药抗性。另 外，已知腺病毒蛋白例如E4orf6和E1B-55K对病毒复制具有积极作用 (Goodrum，F.D.和Ornelles，D.A，J.Virology 73，7474-7488，1999)，其中功 能E1A蛋白负责活化其它病毒基因产物(如E4orf6，E3ADP和E1B-55K) (Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)。然而，这对于现有技术已知的E1A- 阴性的腺病毒不发生，在该腺病毒中不存在13S E1A蛋白。YB-1在核内 含有YB-1的多药抗性的细胞中的核定位分别允许该E1A-阴性病毒的复 制和颗粒形成。然而在该情形中，与野生型Ad5相比，病毒复制和颗粒 形成的效率减少数倍。与此相比，YB-1的组合允许YB-1介导的极有效 的病毒复制和颗粒形成，并因此提供溶癌作用，其中YB-1已经存在于肿 瘤细胞的核内，其可能来自位于独立于细胞周期的核内的YB-1，或者其 中存在于细胞质中的去调节的YB-1由I组腺病毒和/或II组腺病毒转移到 核中，或者通过外部因素(例如施用细胞生长抑制剂或辐照或过热)引入 细胞核，即诱导存在于核中，特别是独立于细胞周期，或者作为转基因通 过载体用系统、优选腺病毒系统导入，该腺病毒系统能启动腺病毒基因但 不表现出病毒复制。这也适用于根据本发明的腺病毒，即因为它们的特异 性的设计而能够有效地复制的I组腺病毒，并且使用效果，即E1B蛋白、 优选E1B55K蛋白和/或E4蛋白、优选地E4orf6蛋白提供YB-1，优选地 在核中的有效动员。根据本发明的各个方面，可以与本文公开的腺病毒一 起使用的合适的细胞生长抑制剂是，例如属于下述组的那些：蒽环霉素， 如道诺霉素和多柔比星；烷化剂，如环磷酰胺；生物碱类，如依托泊苷； 长春花-生物碱类，如长春新碱和长春碱；抗代谢药如5-氟尿嘧啶和甲氨 蝶呤(methrothrexat)；铂衍生物，例如顺铂；拓扑异构酶抑制剂，如 camphothecine，CPT-11；紫杉烷类，例如紫杉酚(taxole)、紫杉醇 (paclitaxel)；组蛋白-脱乙酰酶抑制剂，例如FR901228，MS-27-275， trichostatine A；MDR调控剂，例如MS-209，VX-710，和格尔德霉素衍生 物，例如17-AAG。本文公开的腺病毒、特别是重组腺病毒，仅能够在 YB-1核-阳性的细胞中和在含有、优选地在细胞质中含有去调节的YB-1 的细胞中复制，与野生型腺病毒、特别是野生型Ad5相应的反式激活能 力相比，它们在反式激活病毒基因E1B-55K，E4orf6，E4orf3和E3ADP的 能力方面有限。本发明的发明人现在意外地发现，这些有限的反式激活能 力可以通过表达相应的基因、特别是E1B-55K和E4orf6并结合YB-1的 核定位来克服。如本文实施例所示，在该条件下的病毒复制和颗粒形成分 别增加至可与野生型腺病毒的复制活性和颗粒形成活性相比的水平。

根据本发明使用与本文所述的腺病毒相关的或制备其的药物，意欲通 常全身施用，尽管局部施用或传递该药物也在本发明范围内。该应用意欲 特别地用腺病毒感染那些细胞，并且意欲在其中特别发生腺病毒的复制， 其优选地以因果的方式参与病症、典型地疾病的形成，为了诊断和/或预 防和/或治疗它们，使用了根据本发明的药物。

这种药物优选用于治疗：恶性病、肿瘤病、癌性病、癌症和肿瘤，其 中如果没有相反说明，这些术语在本文中以实质上同义的方式使用。肿瘤 病优选地是：其中肿瘤病的机制、特别是由于病理学机制导致YB-1已经 定位于核内、优选地独立于细胞周期，或者其中由于外源措施导致YB-1 存在于细胞核内，其中所述的外源措施适于将YB-1转移至细胞核内，或 在那里诱导或表达YB-1。本文所用的术语肿瘤或肿瘤病应当包含恶性以 及良性的肿瘤、实体瘤和扩散瘤、以及各种疾病。在一个实施方案中，该 药物包含至少一种其它的药物活性化合物。这种其它的药物活性化合物的 性质和数量将取决于药物使用的适应症的种类。在药物用于治疗和/或预 防肿瘤病的情形中，典型地使用细胞生长抑制剂，例如顺铂和紫杉酚， daunoblastin，柔红霉素(daunorubicin)，多柔比星和/或米托蒽醌或本文所 述的其它细胞生长抑制剂或细胞生长抑制剂组，优选如关于细胞生长抑制 剂介导的YB-1的核定位所述的那些。

根据本发明的药物可以以各种制剂存在，优选液体形式。而且，药物 将包含佐剂，例如稳定剂、缓冲剂、防腐剂和制剂领域技术人员已知的那 些。

本发明的发明人已经意外地发现，本文所述的病毒、优选I组腺病毒 和/或II组腺病毒根据本发明的应用可以以非常高的成功率应用于肿瘤， 它们可以用于生产治疗该肿瘤的药物，所述肿瘤在独立于细胞周期的核内 含有YB-1。通常，YB-1位于细胞质中，特别是存在核周胞质中。在细胞 周期的G1/S-期，在正常细胞以及肿瘤细胞的细胞核中都可以发现YB-1， 其中部分YB-1残留在细胞质中[Jürchott K等，JBC 2003，278， 27988-27996]。然而，使用这样修饰的腺病毒还不足以提供病毒的溶癌作 用。现有技术中所述的这种减毒腺病毒的相对低功效最终是由于它们的错 误应用。换句话说，当如本文所述使用这些减毒或修饰的病毒，优选使用 I组腺病毒和/或II组腺病毒，提供病毒溶癌作用的分子生物学先决条件 时，可以以更高功效特别使用这些腺病毒系统。当要根据本发明使用本文 所述的腺病毒时，如AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016，dl520和在欧 洲专利EP 0 931 830中描述的重组腺病毒，在下述的肿瘤中提供先决条件： 其细胞显示出YB-1的独立于细胞周期的核定位。这种形式的核定位可以 是由肿瘤自身的性质导致，或可以是由本文公开的根据本发明的措施或本 发明的试剂导致。本发明因此定义了一组新的肿瘤和肿瘤病，因此也定义 了一组患者，其可以被使用根据本发明的病毒、如优选I组腺病毒和/或 II组腺病毒、但是也使用现有技术中已经描述的减毒或修饰的腺病毒而成 功地治疗。

另一组患者是确保通过施加或实现具体条件使YB-1迁移到核内或引 入或转移到其中、或其中存在去调节的YB-1的那些患者，其可以根据本 发明使用I组腺病毒和/或II组腺病毒，或例如现有技术已知的并要根据 本发明使用的腺病毒，或者使用在本文中第一次描述的腺病毒，优选使用 分别在E1A蛋白中具有突变和缺失的这些腺病毒，其不干扰Rb/E2f的结 合或其不在YB-1核-阴性的细胞中复制，或者显示出显著减少的如本文定 义的复制，和/或具有和/或表现出缺失的癌蛋白，特别是E1A，例如在病 毒AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB106和在欧洲专利EP 0 931 830中描 述的腺病毒的情况中。与这组患者相关的I组腺病毒和/或II组腺病毒的 应用是基于发现，即病毒复制的诱导是基于YB-1的核定位，随后YB-1 与E2-晚期启动子结合。由于本文公开的发现，腺病毒如AdΔ24，dl922-947， E1Ad/01/07，CB106和/或欧洲专利EP 0 931 830描述的腺病毒也可以在下 述细胞中复制：YB-1核-阳性的，和/或YB-1在其中以本发明所定义去调 节的方式存在的细胞。因此，这些腺病毒可以用于治疗根据本发明疾病和 患者组，其包含具有这些特征的细胞，特别是当这些细胞参与要治疗的各 种疾病的形成时。这是AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016和在专利EP 0 931 830中描述的腺病毒以及I组腺病毒和/或II组腺病毒的根据本发明 治疗这些肿瘤的成功基础，这些肿瘤在独立于细胞周期的核内含有YB-1， 或者含有本公开内容意义上的去调节的YB-1。可以根据本发明使用本文 描述的可按本发明使用的病毒和使用在本文中第一次描述的病毒、特别是 I组腺病毒和/或II组腺病毒治疗依照本发明治疗的另一组患者是YB-1核 -阳性的患者，和/或因为下列所述治疗导致YB-1核-阳性的患者，和/或将 经历一种下述措施、优选在治疗意义上，在施用腺病毒之前、伴随使用各 腺病毒或施用腺病毒之后的患者。本发明包括，YB-1核-阳性患者是在许 多独立于细胞周期的形成肿瘤的细胞的核内含有YB-1、和/或在这样的细 胞中含有去调节的YB-1的患者。这些措施中的一种是，作为整体和/或如 在肿瘤治疗中所用的那样施用如本文所述的细胞生长抑制剂。另外，辐照、 特别是在肿瘤治疗中所用的辐照属于这类措施。辐照特别是指使用高能辐 射的辐照，优选放射性辐射，优选如在肿瘤治疗中所用。其它措施分别是 过热和应用过热，优选在肿瘤治疗中使用的过热。在特别优选的实施方案 中，局部施加过热。最后，其它措施是激素治疗，特别是如在肿瘤治疗中 使用的激素治疗。在这样的激素治疗的过程中，使用抗-雌激素剂和抗-雄 激素剂。与其相关，抗雌激素例如他莫昔芬，特别地用在乳腺癌的治疗中， 和抗雄激素例如氟他胺或醋酸环丙孕酮，特别地用在前列腺癌的治疗中。

本文所述的腺病毒还可以用于治疗肿瘤，其中所述的肿瘤选自包含原 发性肿瘤、次发性肿瘤、第三级肿瘤和转移性肿瘤的组。与此相关，肿 瘤优选地表现出至少一个下述特征，即它们的独立于细胞周期的核中具有 YB-1，无论其原因如何，和/或它们含有去调节的YB-1。

本发明包括，细胞和肿瘤分别包含这样的细胞，根据本发明的腺病毒 在其中复制，或者能在其中复制，所述细胞或肿瘤具有本文所述的一个或 多个特征，更具体的特征是，它们在独立于细胞周期的核中含有YB-1， 无论其原因如何，和/或它们含有去调节的YB-1的特征，并且这些细胞和 肿瘤分别可以使用根据本发明的I组腺病毒和/或II组腺病毒进行治疗， 并且所述的腺病毒可以用于生产治疗它们的药物，其中所述的腺病毒能表 达编码YB-1的核酸。因此，优选地有3种类型的细胞和因之的肿瘤，根 据本发明的I组腺病毒和/或II组腺病毒可以在其中复制，并且使用这些 腺病毒可以分别治疗，优选裂解它们：

A组：在独立于细胞周期的核中含有YB-1的细胞；

B组：在核中、特别是非独立于细胞周期的核中不含有YB-1，但是含 有去调节的YB-1的细胞；和

C组：在核中、特别是非独立于细胞周期的核中不含有YB-1，并且不 含有去调节的YB-1的细胞。

对于A组细胞，不表达其它YB-1的根据本发明的腺病毒、特别是I 组腺病毒，可以用于复制或裂解。但是，表达其它YB-1的根据本发明的 这类腺病毒、特别是I组腺病毒，也可以用于复制或裂解。这也适用于B 组。希望不受此限制，其原因好像是，由于E1B蛋白、具体的E1B55K 蛋白和/或E4蛋白、具体的E4orf6蛋白的作用，通过YB-1在核中的定位 和向该核中的转移YB-1分别确保了有效的复制。腺病毒另外表达的YB-1 支持了该过程。

在C组的情况下，优选地，根据本发明的那些腺病毒、特别是I组腺 病毒将用于复制或裂解，它们另外表达YB-1。其原因似乎是，仍然希望 不受此限制，上述的病毒复制过程在特定的细胞背景中没有被活化，以致 可以发生有效的复制。仅仅分别通过提供YB-1和表达YB-1，就会发生 有效的复制，其中的机制似乎是这样的，YB-1的过量表达导致YB-1的 核定位，如也记载在Bargou[Bargout R.C.等，Nature Medicine 1997，3， 447-450]和Jürchott[Jürchott K.等，JBC 2003，278，27988-27966]中。

本发明包括，一些形成肿瘤的细胞本身在核中含有YB-1或这样做或 在诱导和活化导入核中以后含有YB-1，或包含本公开内容意义上的去调 节的YB-1。优选地，约5％或任何比其更大的百分比(即6％，7％，8％等) 的肿瘤形成细胞是这种YB-1核-阳性的细胞，或其中存在去调节的YB-1 的细胞。对于其它肿瘤，例如乳腺瘤、骨肉瘤、卵巢癌、关节癌或肺癌， 含有去调节的YB-1或者表现出独立于细胞周期的YB-1核定位的肿瘤细 胞的百分比可以是约30～50％[Kohno K.等，BioEssays 2003，25， 691-698]。这样的肿瘤可以优选地使用根据本发明的腺病毒治疗。分别通 过外部胁迫和通过局部施加胁迫可以诱导YB-1的核定位。这种诱导可以 例如通过辐照、特别是UV辐照，施用如尤其已经在本文中公开的细胞生 长抑制剂，和过热来发生。关于过热，重要的是现在可以以非常特定的方 式、更具体以局部的方式实现，因此还可以造成YB-1在核内的特定的核 转运，因此，提供了腺病毒复制和因此细胞和肿瘤裂解的先决条件，其优 选地是局部限制的(Stein U，Jurchott K，Walther W，Bergmann S，Schlag PM， Royer HD.J Biol Chem.2001，276(30)：28562-9；Hu Z，Jin S，Scotto KW.J Biol Chem.2000 Jan 28；275(4)：2979-85；Ohga T，Uchiumi T，Makino Y， Koike K，Wada M，Kuwano M，Kohno K.J Biol Chem.1998， 273(11)：5997-6000)。

本发明的药物因此也可以施用于患者和患者组，或可以为他们设计， 其中通过适当的治疗前或治疗后或伴随治疗分别实现YB-1的转运，特别 地在各种肿瘤细胞中的转运，并在细胞中生成去调节的YB-1。

基于本文提供的该技术教导，本领域技术人员在其技术范围内进行适 当的改进，特别是对E1A，例如其可以包含产生缺失或点突变以便因此产 生腺病毒的各种实施方案，其可以在根据本发明的应用中使用。

如以上已经解释的，I组腺病毒和/或II组腺病毒能够在核中含有YB-1 的这些细胞和细胞系统中复制。关于根据本发明使用的腺病毒是否能够复 制和因此能够裂解肿瘤的问题，含有或不含Rb(即成视网膜细胞瘤抑制 剂产物)的细胞的状态是不相关的。另外，关于所述腺病毒根据本发明的 应用，当使用本文公开的与YB-1核-阳性的细胞(即在独立于细胞周期的 核内含有YB-1的细胞)有关的腺病毒系统时，不需要考虑感染细胞、待 感染细胞或待治疗细胞的p53的状态，该p53状态以及Rb状态对实施本 文公开的技术教导的腺病毒的复制无任何影响。

反式激活的癌基因和癌基因蛋白，特别是E1A，优选II组腺病毒，可 以分别在所有天然腺病毒启动子的控制下和/或通过肿瘤特异性的或组织 特异性的启动子控制。适当的非腺病毒启动子可以选自包含巨细胞病毒启 动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、基于腺病毒的启动子VaI和非病毒 的YB-1启动子(Makino Y.等，Nucleic Acids Res.1996，15，1873-1878)。可 以在本文公开的本发明任何方面使用的其它启动子是端粒酶启动子、甲胎 蛋白(AFP)启动子、caecinoembryonic抗原启动子(CEA)(Cao，G.，Kuriyama， S.，Gao，J.，Mitoro，A.，Cui，L.，Nakatani，T.，Zhang，X.，Kikukawa，M.，Pan， X.，Fukui，H.，Qi，Z.Int.J.Cancer，78，242-247，1998)、L-丝束蛋白启动子 (Chung，I.，Schwartz，PE.，Crystal，RC.，Pizzorno，G，Leavitt，J.，Deisseroth， AB.Cancer Gene Therapy，6，99-106，1999)、精氨酸血管升压素启动子 (Coulson，JM，Staley，J.，Woll，PJ.British J.Cancer，80，1935-1944，1999)、E2f 启动子(Tsukada等Cancer Res.，62，3428-3477)、uroplakin II启动子(Zhang 等，Cancer Res.，62，3743-3750，2002)和PSA启动子(Hallenbeck PL，Chang， YN，Hay，C，Golightly，D.，Stewart，D.，Lin，J.，Phipps，S.，Chiang，YL.Human Gene Therapy，10，1721-1733，1999)、酪氨酸酶启动子（Nettelbeck，DM. Anti-Cancer Drugs，14，577-584，2003)，环加氧酶2启动子(Nettelbeck，DM.， Rivera，AA，Davydova，J.，Dieckmann，D.，Yamamoto，M.，Curiel，DT. Melanoma Res.，13，287-292，2003)，和诱导系统例如四环素(Xu，XL.， Mizuguchi，H.，Mayumi，T.，Hayakawa，T.Gene，309，145-151，2003)。另外， 如德国专利申请DE 101 50 984.7所述的腺病毒的YB-1依赖性E2-晚期启 动子是可以用于本发明的启动子。

已知端粒酶启动子在人类细胞中极其重要。因此，端粒酶活性通过端 粒酶逆转录酶基因(hTERT)的转录控制调节，hTERT是酶的催化亚基。 端粒酶的表达在85％的人类肿瘤细胞中是活化的。与此相反，它在大多数 正常细胞中无活性。生殖细胞和胚胎组织不含有它(Braunstein，I.等，Cancer Research，61，5529-5536，2001；Majumdar，A.S.等，Gene Therapy 8，568-578， 2001)。对hTERT启动子更详细的研究已证实，分别远离起始密码子283bp 和82bp的启动子的片段足以在肿瘤细胞中特异性表达(Braunstein I.等； Majumdar AS等，上文)。因此，该启动子和特定片段分别适合基因和特别 是转基因、优选本文公开的转基因之一在肿瘤细胞中的特异性表达。启动 子应当允许修饰的癌基因、优选E1A癌基因蛋白仅在肿瘤细胞中表达。 此外，在一个实施方案中，转基因在该腺病毒载体中的表达在这些启动子 的控制下，所述转基因优选选自包含E4orf6，E1B55kD，ADP和YB-1的组。 本发明还包括，反式激活癌基因蛋白，特别是E1A蛋白的可读框在一个 或数个腺病毒系统的基因产物的框架内。然而，反式激活E1A蛋白的可 读框也可以是从那里独立的。

本发明包括，上述的各种启动子也用于根据本发明的腺病毒、优选I 组腺病毒的各个实施方案，特别是在要使用的启动子与在野生型腺病毒中 控制各蛋白的表达或表达产物的启动子不同时。前述启动子因而是合适的 本发明意义上的异源启动子。在根据本发明的腺病毒、特别是I组腺病毒 的优选实施方案中，当将腺病毒应用于上述的A组和B组细胞时，认为 E1B蛋白和/或E4蛋白的表达从这样的异源启动子开始，其中优选地但不 是排它地，E1A蛋白的表达由YB-1控制。在该实施方案和其它的实施方 案中，E1A蛋白的表达在YB-1可控制的启动子的控制下，例如腺病毒2- 晚期启动子。当E1B蛋白和/或E4蛋白是在一个表达盒中表达时，这也 适用。

在根据本发明的腺病毒、特别是I组腺病毒的优选实施方案中，当将 腺病毒应用于上述的C组细胞时，每个启动子独立地是肿瘤特异性的、 器官特异性的或组织特异性的启动子。与此相关，当至少一个控制E1B 蛋白、E4蛋白和/或E1A蛋白的表达的启动子是这样的特异性启动子时是 足够的。通过这样的肿瘤、器官和组织特异性，确保了根据本发明的腺病 毒的复制仅仅发生在相应的肿瘤、器官和组织的细胞中，而且，除此之外， 没有其它的组织受到腺病毒复制的破坏，例如被裂解。优选地，还有第二 和更优选地，所有的3种由这样的肿瘤特异性的、器官特异性的或组织特 异性的启动子控制。使用这样的腺病毒，还可以裂解不能形成肿瘤或不能 发展成这样的肿瘤的细胞，但是出于其它的原因例如医学原因，要破坏它 们或将它们从生物体除去，优选哺乳动物生物体，更优选人生物体，例如 因为它们生产不希望的因子或以过高的水平生产这样的因子。

在一个实施方案中，认为使用所述的根据本发明的腺病毒裂解的细胞 是抗性的，优选地表现出多种抗性。

如这里提及的抗性是肿瘤和要治疗的患者的特征，它们由下述基因介 导，但是不限于它们：MDR，MRP拓扑异构酶，BCL2，谷胱甘肽-2-转移 酶(GST)，蛋白激酶C(PKC)。由于细胞生长抑制剂是尤其以诱导细胞凋亡 为基础，与细胞凋亡相关的基因的表达在任何抗性的产生中起关键作用， 使得下述因子也是与其相关的，即Fas，BCL2家族，HSP 70和EGFR[Kim 等，Cancer Chemther.Pharmacol.2002，50，343-352]。

Levenson等[Levenson，V.V.等，Cancer Res.，2000，60，5027-5030]已经 记载，YB-1在抗性的肿瘤细胞中的表达比在无抗性的肿瘤细胞中显著提 高。

如本文所用的抗性优选是指对本文所述的细胞生长抑制剂的抗性。该 多药抗性抗性优选与膜结合转运蛋白P-糖蛋白的表达、优选过量表达一 致，其可以用作确定各种细胞的标记，因此还可以用作具有该标记的肿瘤 和各类患者组的标记。本文所用的术语抗性也包含P-糖蛋白介导的抗性， 其也称为典型抗性，以及称为非典型抗性的抗性，其是MRP介导，或其 它的，非P-糖蛋白介导的抗性。另一个与YB-1表达相关的标记是拓扑异 构酶IIα。因此，为了确定患者是否可以使用腺病毒按照本发明治疗以获 得预期成功，可以在代替或除了确定在核内的YB-1外的筛选方法中使用 拓扑异构酶IIα。原则上，一种可以类似用作P-糖蛋白的标记是MRP。 至少就结直肠癌细胞或患结直肠癌的患者而言，另一个标记是PCNA(增 殖细胞核抗原)(Hasan S.等，Nature，15，387-391，2001)，例如Shibao K.等所 述(Shibao K等，Int.Cancer，83，732-737，1999)。最后，至少在乳腺癌细胞 和骨肉瘤细胞领域中，MDR(多重药抗性)的表达是在上述意义上的标记 (Oda Y等，Clin.Cancer Res.，4，2273-2277，1998)。可以根据本发明使用的 另一个可行的标记是p73(Kamiya，M.，Nakazatp，Y.，J Neurooncology 59， 143-149(2002)；Stiewe等，J.Biol.Chem.，278，14230-14236，2003)。

最后，还应当将YB-1认为是乳腺癌的前兆标记，它可以在本发明中 使用。只有在原发肿瘤具有具有升高的YB-1表达的患者中，会在手术和 化疗后出现复发[Janz M.等Int.J.Cancer 2002，97，278-282]。

本发明的一个特殊优势还在于，使用本文所述的根据本发明的腺病毒 也可以治疗那些患者，否则这些患者被认为是在临床意义上不再可治疗 的，因此利用现有技术方法治疗肿瘤病不再可能期望获得成功，特别是当 细胞生长抑制剂和辐射的使用不再是合理可能的和不再可以在影响或减 少肿瘤的意义上成功地进行时。术语肿瘤在本文通常是指任何肿瘤或癌症 疾病，其固有地在细胞核内、优选地独立于细胞周期的核内含有YB-1， 或通过施用如本文公开的外加措施而含有YB-1，和/或它们含有去调节的 YB-1。

而且，本文所述的病毒原则上可以用于治疗肿瘤。优选地，这些肿瘤 选自包含乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、 小细胞肺癌和结直肠癌的组。其它肿瘤是如本文所述有抗性的那些，优选 具有多重抗性的那些，特别还是上述组的那些肿瘤。特别优选的肿瘤是选 自包含乳腺肿瘤、骨肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺癌、肝肿瘤、 肾肿瘤、脑瘤、卵巢肿瘤、皮肤和皮肤附属物肿瘤、头/颈肿瘤、子宫瘤、 关节瘤、喉瘤、唾液腺肿瘤、食道瘤、舌肿瘤和前列腺瘤的组。与此相关， 优选这些肿瘤整体如本文所述被表示。

本发明的腺病毒，优选地I组腺病毒和要根据本发明使用的腺病毒， 优选地II组腺病毒。

本文所述的腺病毒、特别是I组腺病毒和/或II组腺病毒的作为药物的 应用，特别地与全身给药相关，可以通过腺病毒的适当靶向来改善。通过 腺病毒对肿瘤细胞的感染尤其在一定程度上依赖于coxackievirus-腺病毒 受体CAR和独特的整联蛋白的存在。它们一旦在肿瘤细胞中强烈表达， 在非常低效价(pfu/细胞)发生感染是可能的。为了实现所谓的重组腺病毒 的重新靶向，迄今已经尝试了多种策略，例如分别通过将异源序列插入到 纤维结节区，使用双特异性的抗体，用聚合物包被腺病毒，将配体导入 Ad纤维，将血清型5结节(knob)和血清型5纤维轴(shaft)和结节替 代为血清型3结节和Ad 35纤维轴和结节，修饰五邻体基底(penton base) (Nicklin S.A.等，Molecular Therapy 2001，4，534-542；Magnusson，M.K.等， J.of Virology 2001，75，7280-7289；Barnett B.G.等，Biochimica et Biophysica Acta 2002，1575，1-14)。本发明包括，分别在根据本发明的腺病 毒和根据本发明使用的腺病毒、特别是I组腺病毒和II组腺病毒中，实现 这样的其它实施方案和特征的本发明的各个方面。

另一方面，本发明涉及筛选患者的方法，该患者可以使用一种修饰的 腺病毒治疗，即根据本发明使用的腺病毒例如AdΔ24，dl922-947， E1Ad/01/07，CB016或欧洲专利EP 0 931 830中描述的病毒，和/或I组腺 病毒和/或II组腺病毒，其中所述的方法包含下列步骤：

-分析肿瘤组织的样品，和

-确定YB-1是否定位在独立于细胞周期的核内，或者该细胞是否含 有去调节的YB-1。

代替或除了YB-1，可以检测上述标记的存在。

在肿瘤组织或其一部分在核内含有YB-1、特别是独立于细胞周期， 或含有去调节的YB-1的情形中，可以根据本发明使用本文公开的腺病毒、 特别是I组腺病毒和II组腺病毒。

在根据本发明的方法的一个实施方案中，通过使用试剂完成肿瘤组织 的分析，该试剂选自包含针对YB-1的抗体，针对YB-1的适体，和针对 YB-1的spiegelmer以及针对YB-1的抗促成素(anticaline)的组。原则上， 还可以制备相同种类的试剂，并分别用于各自的标记。抗体、特别是单克 隆抗体的制备是本领域技术人员已知的。特异性检测YB-1或标记的另一 种试剂是与它们的靶结构以高亲和力结合的肽，在本发明的情形中的靶结 构为YB-1或所述标记。为了产生这样的肽，在现有技术中已知其方法， 例如噬菌体-展示。为此目的，从肽库开始，其中单个肽具有约8-20个氨 基酸的长度，库的大小约有102-1018、优选108-1015种不同的肽。一种能 结合多肽的特殊形式的靶分子是所谓的抗促成素，其例如在德国专利申请 DE 197 42 706中描述。

用于特异性地结合YB-1或本文公开的相应标记、并因此检测独立于 细胞周期的YB-1在细胞核内的定位的另一种试剂是所谓的适体，即D- 核酸，其以RNA或DNA为基础，作为单链或双链存在，并特异性地与 靶分子结合。适体的产生例如在欧洲专利EP 0 533 838中描述。适体的一 种具体实施方案是所谓的aptazyme，其例如在Piganeau，N.等(2000)， Angew.Chem.Int.Ed.，39，no.29，第4369-4373页中描述。它们是适体的 具体实施方案，因为它们除了包含适体部分外还包含核酶部分，在结合或 释放结合适体部分的靶分子以后，核酶部分获得催化活性并剪切核酸底 物，这伴随着信号的产生。

另一种形式的适体是所谓的spiegelmer，即由L-核酸组成的靶分子结 合核酸。制备该spiegelmer的方法例如在WO 98/08856中描述。

可以通过穿刺或通过外科手术获得肿瘤组织的样品。对YB-1是否定 位于独立于细胞周期的核内的评估经常通过使用显微镜技术和/或免疫组 织学分析进行，典型地使用抗体或任何其它的前述试剂来完成。本领域技 术人员已知其它方法来检测YB-1在核内的存在和它在其中的定位是独立 于细胞周期的。例如，当扫描针对YB-1染色的组织切片时，可以容易地 检测YB-1的定位。YB-1在核内的存在频率已经成为在核中独立于细胞 周期地定位的指征。独立于细胞周期地检测核内的YB-1的另一可能性是， 针对YB-1进行染色并检测YB-1是否定位于核内和确定细胞的阶段。然 而，这以及YB-1的检测也可以通过使用前述针对YB-1的试剂实现。通 过本领域技术人员已知的方法进行试剂的检测。因为所述的试剂特异性地 指向YB-1、因此不结合要分析的样品中的其它结构、特别是细胞的其它 结构，借助于试剂的合适标记和由于它们的特异性地结合到YB-1，可以 检测和分析所述试剂的定位，还有YB-1的定位。标记试剂的方法对本领 域技术人员是已知的。为了检测样品的细胞中含有多少去调节的YB-1， 还可以使用相同的技术。由于去调节的YB-1与未去调节的YB-1相比也 表现出过表达，YB-1相对于参照样品的相对表达也可以使用，以便检测 YB-1是否在分析的细胞中是去调节的。

现在，利用附图和实施例进一步说明本发明，从中将获得新特征、实 施方案和优势。与其相关地，

图1显示了腺病毒载体的结构设计，该载体在本文中称为AdE1/E3- 阴性的腺病毒载体，为野生型腺病毒和腺病毒dl520的E1/E3-缺失的腺病 毒；

图2显示了E1A蛋白关于结合p300、p107和p105的结合域；

图3显示了U2OS细胞，在用E1/E3-缺失的腺病毒Ad5(本文称为 E1/E3-阴性的Ad5)和dl520感染后，在其核内不含有YB-1；

图4显示了257RDB细胞，在用E1/E3-缺失的腺病毒Ad5(本文称为 E1/E3-阴性Ad5)和腺病毒dl520感染后，在其核内含有YB-1；

图5显示了在用腺病毒dl1119/1131感染后的257RDB细胞和U2OS 细胞；

图6显示了EMSA分析的结果，其证实了YB-1存在于多抗性的细胞 和细胞系257RDB，181RDB，MCF-7Ad的细胞核中，而YB-1不存在于 U2OS和HeLa细胞的核内；

图7显示了野生型腺病毒、腺病毒dl520和腺病毒dl1119/1131的E1A 蛋白的结构设计；

图8是显示了在另外表达的病毒蛋白的存在下腺病毒复制效率的直方 图，为绝对数值；

图9是显示了在另外表达的病毒蛋白的存在下腺病毒复制效率增加的 直方图；

图10显示了在结晶紫染色和用10和30pfu/细胞的dl520感染后和对 照(K)的U2OS细胞生长的孔，分别未施用柔红霉素和施用40ng柔红 霉素/ml；

图11显示了在结晶紫染色和用10和30pfu/细胞的dl520感染后和对 照(K)的HeLa细胞生长的孔，分别未施用柔红霉素和施用40ng柔红 霉素/ml；

图12是不同来源(RDB257和HeLa)的肿瘤的肿瘤体积作为时间函 数的图，其分别为在用PBS和dl520处理以后；

图13显示了杀死的小鼠的照片，在分别用PBS和5×108pfu dl520 处理后，基于RDB257细胞该小鼠发展了肿瘤；

图14是感染了dl520以后的RDB257细胞和HeLa细胞的细胞提取物 (皮下生长肿瘤)的DNA杂交印迹分析的结果；

图15是显示了YB-1核-阳性的肿瘤细胞(257RDB和181RDB)和 YB-1核-阴性的肿瘤细胞(HeLa，U2OS)中的dl520和野生型腺病毒的复制 效率和颗粒形成的直方图；

图16显示了野生型腺病毒和腺病毒载体AdXVir03的结构设计；

图17显示了腺病毒载体AdXVir03/01的结构设计；和

图18A/B显示了在结晶紫染色和用Ad312(20pfu/细胞)、Xvir03(5pfu/ 细胞)感染以后和对照(未感染)的18RDB细胞(图18A)和272RDB细 胞(图18B)生长的孔，其中在感染后5天进行结晶紫染色；

图19显示了E2基因在感染了野生型腺病毒Ad5和腺病毒Ad312后 的A549细胞和U2OS细胞中的表达的RNA印迹分析的结果；

图20显示了E2基因在感染了野生型腺病毒和腺病毒δ24后12和24 小时的U2OS细胞中的表达的RNA印迹分析的结果；

图21显示了腺病毒载体XvirPSJL1的结构设计；

图22显示了腺病毒载体XvirPSJL2的结构设计；

图23显示了在结晶紫染色和用不同pfu/细胞的腺病毒dl520感染后 HeLa细胞生长的孔；

图24显示了表示荧光素酶在使用腺病毒2-晚期启动子的不同启动子 片段的U2OS细胞、HeLa细胞和257RDB细胞中的活性的直方图；

图25显示了表示用表达YB-1的腺病毒和病毒Ad312感染U2OS细 胞2天和5天后的病毒颗粒数量的直方图，其中在细胞内残留的病毒颗粒 (由黑色表示)和释放出的细胞外的病毒颗粒(水平条)间进行了区别。

实施例1：根据本发明使用的腺病毒可以包含的E1A修饰的类型

图1显示了腺病毒载体AdE1/E3-阴性的(即E1/E3-缺失的腺病毒)、野 生型腺病毒和腺病毒dl520的结构设计。

腺病毒AdE1/E3-阴性不含有编码功能性的E1A或功能性的E1B或E3 的区域，在本实验中用作毒性对照。

野生型E1A基因编码总共5个蛋白，其是通过E1ARNA的选择剪接 产生的。其中，产生2个不同的蛋白，即289个氨基酸的蛋白和243个氨 基酸的蛋白。dl520不编码289个氨基酸的蛋白，因为它在E1A基因的 CR3区域中存在缺失，导致缺乏13S的基因产物。根据本发明可以使用的 腺病毒dl520被本领域技术人员称为12S-E1A病毒。现有技术中已知的腺 病毒dl347(Wong und Ziff，J.Virol.，68，4910-4920，1994)也是可以根据本 发明使用的12S-E1A病毒。

在由13S-E1A mRNA编码的289个氨基酸的蛋白中，存在在各种腺病 毒亚类之间保守的3个区域。这些称为CR1、CR2和CR3。尽管CR1和 CR2存在两种E1A蛋白(E1A 12S和E1A 13S)中，即在289个氨基酸和 243个氨基酸的蛋白中，CR3区域仅存在于前述两个蛋白中较大的一个中。

病毒基因特别是E1B、E2、E3和E4的激活需要CR3区域。仅含有 较小(即243个氨基酸的)蛋白的病毒仅能极弱地反式激活病毒基因，并 且不促进在核内不含有YB-1的那些细胞中的腺病毒的复制。因为YB-1 仅存在于肿瘤细胞的核内和仅可以在那里检测到，该载体适合诱导肿瘤特 异性的复制。

由于dl520中CR3的缺失，该腺病毒不能将细胞YB-1转移至细胞的 核内，其在本文中也称为移位，因此不是在YB-1核-阴性的细胞中进行复 制的位置，因此是可以根据本发明使用的病毒，其中所述的病毒包含根据 本发明所需的反式激活。

实施例2：腺病毒的作用方式依赖于细胞的Rb状态

图2显示了E1A蛋白的与p300、p107和p105的结合有关的结合域。 P300以及p107是细胞结合蛋白。成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)是一种肿瘤抑 制蛋白，其结合是通过CR1和CR2介导的。研究已经表明，pRb和 p107/p300结合在调节转录中有效的细胞转录因子E2F。野生型E1A蛋白 能干扰E2F与Rb的结合。如此释放的E2F能结合E2早期启动子，并由 此诱导腺病毒的复制。

从现有技术中已知，E1A癌蛋白中的某些缺失可能会产生如下面提及 的那些的重组腺病毒载体，其能够在Rb-阴性的细胞中优势地复制且可以 根据本发明使用。例如，腺病毒载体dl922-947包含CR2区域中的缺失(氨 基酸位点122-129)，载体CB016在CR1区域(氨基酸位点27-80)和CR2 区域中具有缺失(氨基酸位点122-129)。载体E1Adl01/07在CR2区域中 含有缺失(氨基酸位点111-123)。另外，因为在N-末端(氨基酸位点4-25) 处的其它缺失，另外，不与蛋白p300结合。腺病毒载体AdΔ24在CR2 区域中含有缺失(氨基酸位点120-127)。在专利EP 0 931 830中描述的腺 病毒载体在CR1区域和CR2区域含有缺失。

E2F/RB的结合机制和E1A介导的E2F的释放机制根本不同于构成本 发明基础的机制。不同于现有技术中假设的，不是E2F从Rb蛋白中的释 放，Rb蛋白即使不说对于病毒复制是关键性的也是必要的，而是人转录 因子YB-1的核定位。该转录因子在正常细胞中在大多数细胞周期中仅存 在于细胞质中。在用腺病毒感染以后，在某些情形下它被诱导入核内或者 在不同的细胞系统中已经存在核内，如不同的肿瘤病，其包括例如但不限 于乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，骨肉瘤癌，成胶质细胞瘤，黑素瘤，小细 胞肺癌和结直肠癌。

实施例3：U2OS细胞的感染

每孔平铺100,000个U2OS细胞。次日用如图3所示的不同腺病毒感 染细胞。在500μl无血清的DMEM培养基中在37℃下感染1小时。随后， 去除感染培养基，并用2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替换。在3天 后使用结晶紫染色进行分析。

如从图3中可以获得，在核内不含有YB-1的U2OS细胞在用两种不 同腺病毒感染以后未显示如结晶紫染色所示的裂解，所述腺病毒即称为 E1/E3-阴性的E1/E3-缺失的腺病毒、和腺病毒dl520，其可以根据本发明 使用。与其相关，首先去除培养基。随后，用结晶紫(50％ETOH，3％甲 醛，5％乙酸，1％结晶紫)覆盖细胞，在室温下孵育5-10分钟。随后，用水 充分漂洗具有6个孔的平板，室温干燥。

这证实构成本发明基础的发现，即需要YB-1的存在以便诱导根据本 发明使用的病毒来裂解感染的细胞。

实施例4：257RDB细胞的感染

每孔平铺100,000个257RDB细胞。次日用如图4所示的不同腺病毒 感染细胞。在500μl无血清的DMEM培养基中在37℃下感染1小时。随 后，去除感染培养基，并用2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替换。在 3天后使用结晶紫染色进行分析。

本实验的结果在图4中描述。经感染核内含有YB-1的257RDB细胞 以后，称为E1/E3-阴性Ad5的、E1/E3-缺失的腺病毒在低MOI(pfu/细胞) 下未显示任何裂解。与此相反，如实施例3所示的dl520，在YB-1核-阴 性的细胞中不复制，同时编码根据本发明用于反式激活癌基因蛋白的 E1A，在40pfu/细胞的MOI(感染复数)下导致实际上完全的裂解，和在 10pfu/细胞的MOI下仍导致显著裂解。可以从中得出结论，dl520和类似 的病毒如本文中通过dl1119/1131或AdXvir 03所述，需要与E1-缺失或 E1/E3-缺失的腺病毒相比减小约1个数量级(十倍)的MOI，这证明了它 们的临床应用。

如图7所示，dl520的蛋白E1A的特征在于其缺失CR3区域，导致根 据本发明的应用所需的反式激活和YB-1核-阳性的细胞中的复制。

实施例5：用dl1119/1131感染257RDB和U2OS细胞

如图5所示，在用腺病毒dl1119/1131感染YB-1核-阴性U2OS细胞 以后在20pfu/细胞的MOI下没有裂解，所述腺病毒dl1119/1131缺失E1A 蛋白的氨基酸4-138和编码它们的核酸，并在氨基酸218后另外包含终止 密码子，其中表达的截短的E1A蛋白包含完整的E1A蛋白的CR3区域。 作为阴性对照，使用未感染的细胞层。

与其相反，在如核内含有YB-1、即YB-1核-阳性的257RDB的细胞 系统中，在腺病毒dl1119/1131的影响下，细胞层在20pfu/细胞的MOI 下实际上完全裂解。因此该实施例是另一证据，其证明了如图7所示的修 饰的E1A癌基因蛋白仅包含例如CR3区域和缺少CR1区域和CR2区域， 在YB-1核-阳性的细胞中能提供所需的反式激活，这是根据本发明的腺病 毒的复制所需的，导致了病毒复制。腺病毒dl1119/1131因此是根据本发 明可以使用的另一种腺病毒。本发明包括，也可以使用在CR3区域类似 于dl1119/1131的设计但与其相反具有CR1区域和/或CR2区域的病毒。

实施例6：检测多药抗性的细胞中的核YB-1

本实施例是基于以下考虑，即核YB-1应当作为转录因子结合mdr1 启动子(英文是multiple drug resistance promoter，多药抗性启动子)内的 Y-盒(CAAT序列)。为了检测，进行所谓的EMSA分析(电泳迁移率变 动分析)。与其相关，分离核蛋白，随后将1-10μg蛋白与短DNA片段(寡) 一起在37℃下孵育。为了测定核YB-1，使用了下列寡核苷酸：与U2O3 相对的mdr1启动子(位点-86至-67)：TGAGGCTGATTGGCTGGGCA(X- 盒加下划线)。

在这之前，在5’末端用32P放射性标记该DNA片段。随后，在天然 聚丙烯酰胺凝胶中进行分离。在蛋白YB-1结合寡核苷酸中序列的情形中， 可以检测它，因为任何未结合的寡核苷酸在凝胶中的迁移比结合的寡核苷 酸迁移快(Holm，P.S.等，JBC 277，10427-10434，2002；Bargou，R.C.等， Nature Medicine 3，447-450，1997)。

如图6所示，EMSA分析可以证实，与细胞系U2OS和HeLa细胞形 成对比，多药抗性的细胞257RDB、181RDB和MCF-7Ad细胞的核中存 在YB-1。

实施例4和5的结果证实，与U205形成对比，腺病毒dl520和 dl1119/1131在YB-1核-阳性的细胞例如257RDB中复制，并诱导其裂解。 这证实了关于根据本发明的腺病毒的应用的发现。另外，该结果已经证实， 与野生型腺病毒相比，在YB-1核-阳性的细胞中通过修饰或缺失的E1A 基因产物来微弱地反式激活病毒基因，在核内YB-1存在下导致成功的复 制和这些细胞的裂解，这些细胞包括例如多药抗性的细胞，本文所述的腺 病毒可以因此用于裂解这些肿瘤。

实施例7：提高E1-阴性腺病毒的复制效率

本实施例证实，早期病毒基因E1B-55K和E4orf6可以通过用质粒 pE4orf6转染和E1/E3-缺失的腺病毒Ad-55K感染来替代。Ad-55K是缺失 E1/E3的病毒，由此将E1B-55K克隆到E1中并在CMV的控制下。根据 以下事实该替代是需要的，即AdYB-1(表达YB-1的腺病毒)不表达这 些早期基因，本发明的发明人已经认识到，在核内含有YB-1的复制系统 中，这些早期基因的替代能够分别提高复制效率和颗粒形成效率，其程度 比得上一种类型Ad5的野生型腺病毒。

进行以下各项：

使用脂转染胺，用质粒pE4orf6转染各个105U2OS细胞。质粒pE4orf6 携带在CMV控制下的编码早期病毒基因E4orf6的DNA序列。

用质粒pE4orf6转染后24小时，用表达YB-1的E1/E3-缺失腺病毒 AdYB-1(50pfu/细胞)和E1/E3-缺失的E1B-55K腺病毒Ad-55K(50pfu/细 胞)感染细胞。Ad-55K是E1/E3-缺失的病毒，其携带在CMV控制下的作 为转基因的病毒基因E1B-55K。

随后，在感染后5天(＝感染后)从培养基(2ml)中去除细胞。通过交 替冷冻和解冻3次(融/冻)，从分离的细胞中释放病毒颗粒。随后，对293 个细胞进行噬菌斑试验，以测定产生的感染性颗粒(噬菌斑形成单位/ml (pfu/ml))。结果在图8和9中表示。图8显示了噬菌斑试验的结果，以 绝对数值表示。通过用质粒pE4orf6转染和用两种病毒AdYB-1和Ad-55K 共感染来显示了与仅用AdYB-1感染相比的最显著的差别。图9显示了图 8的结果，其中复制效率的提高表示为对AdYB-1测定的复制倍数。用质 粒pE4orf6和随后用AdYB-1和E1B-55K(Ad-55K)感染的细胞产生高达 25倍多的pfu/ml。

基于这些结果可以得出结论，E1B-55K和E4orf6的替代提高了用 E1/E3-缺失的腺病毒AdYB-1感染后形成的病毒数量(pfu/ml)高达25倍。 与两种基因产物各自的效果相比，E1B-55K和E4orf6对生成噬菌斑形成 单位(pfu)的附加作用显著更高。

使用表达EGFP的一个质粒的对照实验清楚地证实了，在所选实验方 法中，仅10％的细胞被质粒pE4orf6成功地转染。在能表达E1B-55K和 E4orf6的细胞中形成的颗粒数量比得上一种的人腺病毒类型5(野生型)。 这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B-55K的表达、再结合 YB-1的核定位，能够提供腺病毒复制和颗粒形成，特别是E1A-缺失的腺 病毒，其比得上一种野生型Ad5。

实施例8：在YB-1核-阳性的细胞中经施用细胞生长抑制剂后提高的腺病 毒复制，该腺病毒在YB-1核阴性的细胞中不复制

现有技术中已知，加入不同的细胞生长抑制剂会诱导人转录因子 YB-1的核定位。如本发明的发明人已经发现，定位在核内的YB-1通过 激活腺病毒2-晚期启动子来控制腺病毒复制。为了提供特异性的肿瘤裂 解，可以组合使用两种作用。

在肿瘤消解测定的实施中，依照下列步骤：将200,000个细胞(分别 为HeLa和U2OS)接种到6孔板的每孔中。次日，加入40ng/ml(终浓 度)的柔红霉素。在孵育3小时后，分别用10和30pfu dl520/细胞感染细 胞。随后，将细胞在无细胞生长抑制剂的培养基中孵育。在3-5天后，使 用结晶紫将细胞染色。

如从图10和11中可以获知，柔红霉素的加入会通过YB-1的核定位 诱导dl520的复制。因此，与只用柔红霉素相比，与细胞生长抑制剂柔红 霉素组合使用，dl520产生更大的肿瘤裂解效果。

实施例9：dl520的体内肿瘤裂解

在无菌细胞培养条件下，繁殖用于本体内研究的HeLa(YB-1核-阴性) 和257RDB(YB-1核阳性)细胞。在将细胞注射到小鼠(CD1NuNu品系) 中以便产生皮下肿瘤之前，通过胰蛋白酶处理收集细胞，放入DMEM培 养基(10％FCS)中，计数并用PBS洗涤一次。随后，将细胞离心，吸出 PBS，以期望的细胞数目将细胞在新鲜PBS中分份。在本研究中，皮下注 射的细胞数是两个细胞系每个5×106个细胞。进行皮下注射至动物的一 侧，其中将HeLa细胞注射到右侧，将257RDB细胞注射到左侧，以更好 的区分。1周2次对比肿瘤的生长，其中使用游标卡尺测量肿瘤的长度和 宽度。基于此，基于下列数学公式计算肿瘤体积：

3/4π*a/2*(b/2)2 a＝长度，b＝宽度 一旦肿瘤已经达到200-520mm3的体积，分别在肿瘤内施用病毒和作为 阴性对照的PBS。注射的体积相等，每次50μl。连续3天重复注射。施 用病毒的总剂量为5×108pfu。随后，继续1周2次记录肿瘤生长，计算 体积。在研究结束时杀死小鼠，取出肿瘤用于进一步分析。

结果在图12和13中表示。

图12显示了表示作为时间函数的肿瘤体积和不同治疗方案的图表。 在通过RDB257形成肿瘤的情形中，在注射PBS以后肿瘤显著生长至约 438mm3-1466mm3。在根据本发明使用的载体dl520的影响下，肿瘤的 生长显著减小。从344mm3的平均肿瘤大小开始，肿瘤大小仅增加了21％， 达到共计543mm3。

在本实施例中，将由HeLa细胞组成的肿瘤用作对照，其在施用PBS 以后的行为类似于在施用PBS以后的基于RDB257的肿瘤。然而，基于 HeLa细胞和用dl520处理的肿瘤仍显示了肿瘤生长的显著增加，从311 mm3开始增加至1954mm3。

图13显示了杀死的裸鼠的照片，所述裸鼠具有使用RDB257生长的 肿瘤。可以清楚的看见，在根据本发明施用腺病毒dl520以后，出现了肿 瘤的显著减少。在本情形中甚至还有肿瘤体积的减小(施用病毒dl520后 第1天：515mm3；在施用病毒dl520后第30天：350mm3)。

实施例10：肿瘤DNA的DNA印迹

从肿瘤样品中提取DNA，该肿瘤样品取自实施例9中繁殖的肿瘤中 间。为了分离，使用Qiagen的Dneasy Tissue Kit。按照制造商的使用说明 完成DNA分离。按照其，通过碱裂解从细胞中释放出DNA。随后，经柱 纯化分离的DNA。随后，通过光度测定法在260nm测定分离的DNA的 浓度。使用2μg DNA样品进行分析，该DNA样品用10个单位的限制酶 KpnI处理过。随后，在0.8％的琼脂糖凝胶中进行样品的电泳分离。随后， 将DNA印迹在尼龙膜上(按照Schleicher & Schuell系统进行)。将印迹 在膜上的DNA对特异性的1501bp的DNA探针杂交。1501bp的DNA探 针特异性地结合编码E2A的Ad5序列内的3369bp的Kpn I片段。之前通 过PCR(引物：5‘-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT(SEQ.ID.No.2)，5‘- GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT(SEQ.ID.No.3))制备探针，并使用32P 放射性地标记。随后，洗涤膜并曝光于胶片。

肿瘤DNA的DNA印迹结果在图14中表示。分析证实了，仅dl520 在抗性细胞RDB257中体外复制，如泳道3、4和5所示。泳道1显示了 阳性对照Ad-5d，泳道6、7和8显示了来自感染了dl520的HeLa细胞的 DNA。因为HeLa细胞不是YB-1核阳性的，病毒dl520不复制，因此据 此不可以检测E2A序列。

dl520的其它结果在图15中表示。基于噬菌斑试验，在用dl520和野 生型腺病毒感染以后研究颗粒形成(pfu/ml)。用dl520和野生型腺病毒感染 了各种YB-1核-阳性(257RDB和181RDB)的肿瘤细胞和YB-1核-阴性的 肿瘤细胞。

实施下列步骤：

将100,000-200,000个细胞各自接种到所谓的具有6个孔的平板(即 6孔平板)中的L15培养基(抗性的细胞)和含有10％FCS的DMEM(非 抗性的细胞)。24小时后，用dl520和野生型腺病毒进行感染(10pfu/细胞)。 感染后(感染之后)3天，通过交替冷冻和解冻3次从细胞悬浮液(3ml) 中释放病毒颗粒。随后，对293个细胞进行噬菌斑试验，以测定形成的感 染性颗粒(噬菌斑形成单位/ml(pfu/ml))。结果在图15中显示。噬菌斑试 验的结果表明，类似于野生型腺病毒，dl520在YB-1核-阳性的细胞 (257RDB和181RDB)中复制。因此，当根据本发明使用本文所述的腺 病毒时，可以观察到类似于一种野生型腺病毒的复制效率。

实施例11：腺病毒载体Xvir03的结构设计

图16显示了腺病毒载体Xvir03的结构设计。腺病毒Xvir03是一种所 谓的E1/E3-缺失的腺病毒。这意味着不能制备在腺病毒复制中起作用的 E1A、E1B和E3蛋白。E1区域的缺失从342扩展至3528；氨基酸位点 27865-30995的E3区域缺失。如本文所示，术语“E1-缺失的病毒”是 指E1不再有功能活性的病毒。这可以通过失活另外大部分完整的核酸和 氨基酸序列而实现，然而这也可以意指具有不同大小的编码E1区域蛋白 的缺失。因为缺乏E1A和E1B蛋白和编码它们的核酸，E4区域(如E4orf6) 仅微弱表达(与野生型腺病毒相比约1-5％)或根本不表达。病毒基因 E1B55k和E4orf6通过引入Xvir03的异源CMV启动子(Clontech：Plasmid pShuttle)在E1区域中表达。代替CMV启动子，可以使用与E1A表达相 关的本文公开的各种和任何启动子。两个基因的可读框通过所谓的IRES 序列(英文是internal ribosomal entry site，内部核糖体进入位点)(Pelletier，J. 和Sonenberg，N.Nature，1988，334，320-325)彼此连接。该元件(Novagen： pCITE)提供了来自1个mRNA的2个蛋白的表达。

如下制备载体：

通过将来自M.Dobelstein(University of Marburg)的pCGNE1B的 E1B55k可读框用XbaI和BfrI克隆到Clontech的pShuttle载体中来产生质 粒E1B55k-pShuttle。随后，用ApaI将pShuttle中的E1B55k线性化，末 端补平并用NheI剪切。

在第二个载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，彼此连续地，使用Novagen 公司的pCITE-4a(+)作为模板，通过TA克隆将作为PCR产物的IRES元 件克隆到EcoRV剪切位点，借助BamHI克隆来自质粒pCMV-E4orf6(M. Dobelstein，University of Marburg)的E4orf6＝IRES-E4orf6-pcDNA3.1(+)。 用NotI线性化pcDNA3.1(+)中的IRES-E4orf6，末端补平，随后用NheI 切掉片段IRES-E4orf6。用开放的载体E1B55k-pShuttle(平端，NheI)连接片 段IRES-E4orf6。随后用I-Ceu I和PI-SceI，从E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle 和CMV启动子以及牛生长激素(BGH)-PolyA中将盒克隆到ΔE1、ΔE3 Adeno-X-质粒(Clontech)中，其称为AdcmvE1B/IRES/E4orf6。随后，按照 制造商的使用说明(Clontech)制备腺病毒。将用PacI线性化的含有表达元 件CMV-E1B55k-IRES-E4orf6-BGH polyA的腺质粒转染至HEK293细胞 中，转染后11天，与培养基一起去除脱离的细胞，以便通过反复冻融循 环释放腺病毒。

上述载体原则上适合本文所述根据本发明使用的其它病毒。特别是上 述载体适合在细胞中复制和引发裂解，所述细胞分别为YB-1核-阳性的细 胞以及其中YB-1被去调节(即与正常细胞和非肿瘤细胞相比过量表达) 的细胞。该载体的使用特别适用于那些疾病和患者组或患者集体，其与在 本文中描述根据本发明使用的其它腺病毒和本发明公开的其它腺病毒一 起公开。

实施例12：腺病毒载体Xvir03/01的结构设计

如从图17中可以获得，Xvir03/01是Xvir03的进一步的发展。治疗基 因(例如本文所述的基因)和转基因可以克隆到E3区域。另外，将缺失 引入E4区域，以便避免与来自Xvir03表达盒的E4orf6发生同源重组。 这使较大的转基因可以克隆到该构建体中。缺失的E3区域包含用于引入 盒的SacI，NdeI和NheI限制位点，例如其中可以克隆治疗的转基因。

制备质粒，它用于将治疗基因克隆到E3区域中以及用于在E4区域中 产生缺失：

Clontech的pAdenoX-Plasmid在野生型腺病毒中缺乏的3’ITR区之后 具有针对SfuI的限制位点。使用SpeI(位点23644)和SfuI从pAdenoX (Clontech)中获得E3-E4区域，并转移至pcDNA3.1(+)(Invitrogen)＝ pcDNA3.1-E3Δ27865-30995-E4。通过PstI去除E4ORF6的大部分，即 33241-33875＝pcDNA3.1-E3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875。为了进一步 开发Xvir03，用SfuI和SpeI从pcDNA3.1-E3Δ27865-30995， E4Δ33241-33875中将缺失的E3/E4区域克隆到质粒pAdenoX中＝ pAdenoX E3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875。

如关于Xvir03所述，随后用I-Ceu I和PI-SceI从 E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle中将表达盒连同CMV启动子和牛生长激素 (BGH)-PolyA克隆到pAdenoX E3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875中，其 称为AdcmvE 1B/IRES/E4orf6-ΔE4。随后，按照制造商的使用说明(Clontech) 制备腺病毒。

上述载体原则上与本文所述根据本发明使用的其它病毒一样有用。特 别是上述载体适合在细胞中复制和导致裂解，所述细胞为YB-1核-阳性的 细胞以及其中YB-1被去调节(即与正常细胞和非肿瘤细胞相比过量表达) 的细胞。该载体还可以用于那些疾病和患者组和患者集体，其关于根据本 发明使用的其它腺病毒和根据本发明的腺病毒在本文中公开。

实施例13：Xvir 03在257RDB和181RDB细胞中的肿瘤消解作用

在具有6个孔的平板(6孔平板)的每孔中接种100,000个细胞(257RDB 和181RDB)。次日，如图18所示，用Ad312(20pfu/细胞)和Xvir03(5pfu/ 细胞)感染细胞。在500μl无血清DMEM培养基中在37℃下感染1小时。 随后，去除感染培养基，并用2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替代。5 天后通过结晶紫染色完成分析。结果在图18A和18B中表示。

如可以从图18A和18B中获得，在感染Ad312和Xvir03以后，仅在 Xvir03的情形中，在核内含有YB-1的多药抗性的细胞显示了裂解，如细 胞的结晶紫染色所示。与其相关，首先去除培养基。随后，用结晶紫(50％ ETOH，3％甲醛，5％乙酸，1％结晶紫)覆盖细胞，在室温下孵育5-10分钟。 随后，用水充分漂洗6孔平板并在室温下干燥。

本发明的发明人已知E1A-缺失的病毒(例如Ad312)，然而其在本发明 的意义上不是反式激活腺病毒，可能在较高MOI下非常有效地复制 (Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)，但是不能在临床应用中实现。该现 象在文献中称为“类E1A活性”。本文所用的腺病毒Ad312是E1A-缺失 的病毒。在所用效价(20pfu/细胞)下，该效价仍高于临床理想效价，早期 腺病毒基因如E1B55k和E4orf6不表达或只能极少量地表达(Nevins J.R.， Cell 26，213-220，1981)。如本文已经描述，这些基因和蛋白在病毒复制中 起重要作用。与其相反，这些基因和蛋白分别由腺病毒Xvir03表达(图 16)。如从图18A和18B中可以获得，在伴随所需的较低的感染效价下(表 达为pfu/细胞)基因E1B55k和E4orf6的表达将导致有效的病毒复制和细 胞裂解。这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B-55K(和缺 少E1A)的表达结合YB-1的核定位能够诱导非常有效的腺病毒复制。其 所需仅1-5pfu/细胞的效价现在能临床应用。

这证实了构成本发明基础的发现，即为了使根据本发明使用的病毒裂 解感染的细胞，YB-1在核内的存在，特别是独立于细胞周期的存在，是 必需的。

实施例14：腺病毒Ad312的E2基因表达的RNA印迹分析

在每种情况下，将100万A549和U2OS细胞接种到10cm Petri盘中。 次日，用Ad312(50pfu/细胞)和Adwt(作为对照，5pfu/细胞)感染细胞。使 用的Ad312的高病毒效价导致肿瘤细胞中的独立于E1的复制。在1-2ml 无血清的DMEM培养基中在37℃感染1小时。随后，去除感染培养基， 替换为10ml完全培养基(10％FCS/DMEM)。3天后，分离RNA。随后， 在光度计中在260nm检测分离的RNA的浓度。然后，在0.8％甲醛琼脂 糖凝胶中电泳分离RNA样品。随后，将RNA印迹在尼龙膜上(根据 Schleicher & Schuell的系统进行)。将印迹在膜上的RNA对“早期探针”E2 和“晚期探针”E2杂交。1501bp的“晚期探针”能特异性地结合E2晚期启 动子。之前通过PCR(引物：5’-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT(SEQ. ID.NO.4)，5’-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT(SEQ.ID.NO.5))制备探 针，并使用32P放射性地标记。相反地，早期探针能结合在E2-早期启动 子和E2-晚期启动子之间(位置：226791-227002)，且也是借助于PCR(引 物：5’-AGCTGATCTTCGCTTTTG(SEQ.ID.NO.6)，5’- GGATAGCAAGACTCTGAC AAAG(SEQ.ID.NO.7))产生。随后，洗涤膜 并曝光于胶片。

结果在图19中表示。早期和晚期探针都提供了野生型腺病毒对照感 染的特异性信号，而感染了Ad312的肿瘤细胞仅仅提供了当使用晚期探 针时的特异性信号。这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和 E1B55K的表达以及E1A的缺失分别将过量表达的和去调节的YB-1转运 至核中，并由此诱导作为有效的腺病毒复制的先决条件的E2基因的表达。

实施例15：腺病毒Adδ24的E2基因表达的RNA印迹分析

在每种情况下，将100万U2OS细胞接种到10cm Petri盘中。次日， 用腺病毒δ24(Adδ24)(10pfu/细胞)和野生型腺病毒(Adwt)(作为对照，10 pfu/细胞)感染细胞。使用的重组腺病毒Adδ24(Fueyo，J.等，Oncogene 19， 2-12，2000)具有在E1A蛋白的CR2区的特异性缺失，因而仅能在Rb-阴 性的肿瘤中复制。另外，该病毒能表达比得上野生型腺病毒的基因E1B55k 和E4orf6。在1-2ml无血清的DMEM培养基中在37℃感染1小时。随后， 去除感染培养基，替换为10ml完全培养基(10％FCS/DMEM)。12和24 小时后，分离RNA。随后，在光度计中在260nm检测分离的RNA的浓 度。然后，在0.8％甲醛琼脂糖凝胶中电泳分离RNA样品。随后，将RNA 印迹在尼龙膜上(根据Schleicher & Schuell的系统进行)。将印迹在膜上的 RNA对“早期探针”和“晚期探针”杂交。包含1501bp的“晚期探针”能特 异性地结合E2晚期启动子。之前通过PCR(引物：5’-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT(SEQ.ID.NO.4)，5’-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (SEQ.ID.NO.5))制备探针，并使用32P放射性地标记。但是，早期探针 能结合在E2-早期启动子和E2-晚期启动子之间，且也是借助于PCR(引 物：5’-AGCTGATCTTCGCTTTTG(SEQ.ID.NO.6)，5’- GGATAGCAAGACTCTGAC AAAG(SEQ.ID.NO.7))产生。随后，洗涤膜 并曝光于胶片。

结果在图20中表示。

12小时后，仅有晚期探针提供了特异性信号。24小时后，仅有早期 探针在感染了Adδ24的细胞中提供了特异性信号。但是，与野生型腺病 毒相比，信号显著减弱。该结果还证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6 和E1B-55K的表达分别将过表达的和去调节的YB-1转运至核中，其随后 结合到E2-晚期启动子并诱导E2基因表达。

实施例16：腺病毒载体XvirPSJL1和XvirPSJL2的结构设计

载体描述：XvirPSJL组载体是本文中称作I组腺病毒的病毒的实施方 案，并分别通过载体和腺病毒XvirPSJL1和XvirPSJL2示例，它们不但能 象腺病毒dl520那样在YB-1核-阳性的细胞、特别是肿瘤细胞中复制，而 且能在肿瘤细胞中复制，所述肿瘤细胞中的YB-1分别是过表达的和去调 节的。尽管病毒基因E1B55k和E4orf6仅仅分别在E1B启动子和E4启 动子影响下在dl520感染的YB-1核-阳性的细胞中表达，XvirPSJL中的 E1B55k和E4orf6借助于巨细胞病毒(cmw)启动子进行表达。但是，不只 是cmw启动子，还可以使用其它的启动子、特别是肿瘤特异性的、组织 特异性的和器官特异性的启动子。由于E1B55k和E4orf6的表达，过表达 的YB-1和去调节的YB-1被分别转送到核内，并启动腺病毒的复制。如 本文所述的XvirPSJL组的腺病毒载体从而结合在同一个载体中的腺病毒 载体dl520、Xvir03和AdYB-1的各种元件和因此它们的功能。与载体dl520 类似，XvirPSJL病毒含有E1A12S基因。该基因和相应的基因产物分别负 责诱导感染的细胞的S期，并促进病毒的复制、化疗和辐照的作用。象 Xvir03一样，XvirPSJL病毒含有表达盒CMV-E1B55k/IRES/E4orf6，它为 有效的复制所需，并间接地或直接地将去调节的YB-1转送到核中，该核 优选地包含在肿瘤细胞中。因而，复制仅能在YB-1是过表达的或去调节 的细胞、特别是肿瘤细胞中。另外，用E1B55k/E4orf6复合体降解P53。 编码人转录因子YB-1的序列取自病毒AdYB-1。内源的，即已经存在细 胞中的YB-1扩大了病毒的复制。E1A12S和YB-1的表达由依赖于YB-1 的腺病毒E2-晚期启动子控制。还相关地，可以使用特异性的启动子，特 别是肿瘤特异性的、组织特异性的或器官特异性的启动子。这些病毒的另 一个特征是缺失E4区。载体含有限制位点，在腺病毒载体XvirPSJL1和 XvirPSJL2的情况下，通过这些位点可以表达说明书中公开的各种转基因， 例如核酶、反义分子、siRNA、细胞凋亡诱导基因、细胞因子和前药基因。 它们的表达还可以通过说明书中公开的肿瘤特异性的、组织特异性的或器 官特异性的启动子控制。表达盒的定位不是固定的，特别是不关于或在 E1、E3和E4区内，但是可以以任何方式排列。载体的复制独立于p53 或肿瘤细胞的Rb状况。

重组腺病毒XvirPSJL1和XvirPSJL2的结构设计如图21和22所示。

盒E2-晚期-YB1IRES/12S的产生：

Clontech/BD Biosciences的pAdenoX质粒用作本文的原料，其包含腺 病毒Ad5的基因组核酸，并具有在3’ITR区(野生型腺病毒没有)后面 具有SfuI限制性位点。使用SpeI(位点23644)和来自pAdenoX(Clontech) SfuI将E3-E4区域转移至pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，并表示为 pcDNA3.1-E3Δ27865-30995-E4。通过PstI去除E4ORF6的大部分，即碱 基33241-33875。这样得到的片段称作pcDNA3.1-E3Δ27865-30995， E4Δ33241-33875。

用SacI和NheI将E2-晚期启动子从pGL3-EGFP中分离(Holm等，JBC 2002，277，10427-10434)，并克隆进pcDNA3.1-E3Δ27865-30995， E4Δ33241-33875中。在此过程中，进一步在碱基的Δ27593-31509区域删 除E3区。这样得到的片段称作E2-晚期-pcDNA3.1-E3Δ27593-31509， E4Δ33241-33875。

借助RT-PCR生成用于E1A-243AA产物的cDNA，分离，检查序列， 并使用BamHI和EcoRI克隆进pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)。用NheI 和BamHI使E1A-12S-pcDNA3.1+线性化，通过T4聚合酶补平末端，通 过Taq聚合酶和dTTP提供T突出端。将IRES元件作为PCR产物(模板＝ pCITE，Novagen)克隆进E1A-12S-pcDNA 3.1(+)载体(TA克隆策略)。

从载体pHVad2c分离出YB-1-EcoRI片段(Holm等，JBC 2002，277， 10427-10434)，并补平末端。用XbaI使载体pShuttle(市场上买自BD Biosciences)线性化，补平末端，去磷酸化，连接到先前生成的编码YB-1 的核酸上。这样得到的载体称作YB-1-pShuttle。向pShuttle载体的克隆 会提供编码YB-1片段的核酸，其带有框架内的终止密码子。借助于NheI 和BfrI，将编码YB-1的核酸从YB-1-pShuttle克隆进pcDNA3.1(+)中的载 体IRES-E1A-12S。这样得到的载体称作YB-1(带有终止密码子的 EcoRI-EcoRI)-IRES-E1A-12S-pcDNA3.1(+)。

随后，用PmeI切割盒YB-1-IRES-E1A12S，克隆进NheI线性化的、 平端的且去磷酸化的载体E2晚期-pcDNA3.1 E3Δ27593-31509， E4Δ33241-33875中。这样，第二个盒就在E3区的缺失区中。

转基因盒包含核酸构建体E2晚期-YB-1-IRES-E1A12S，通过SfuI和 SpeI，将其与残余腺病毒序列E3Δ27593-31509，E4Δ33241-33875一起克隆 进Clontech的载体pAdenoX(＝AdenoX/E2晚期-YB-1-IRES-E1A12S/E3 Δ27593-31509，E4Δ33241-33875)。

通过I-CeuI和PI-SceI，将盒CMV-E1B55k/IRES/E4orf6从上面关于 Xvir03所述的pShuttle切割出，并插入载体AdenoX/E2晚期-YB-1-IRES- E1A12S/E3Δ27593-31509，E4Δ33241-33875。

随后，用Pac I线性化载体，转染进293细胞，根据生产商的说明， 分别分离不含有图中标记的转基因的重组腺病毒XvirPSJL 1和XvirPSJL 2。

实施例17：用腺病毒dl520感染HeLa细胞

每盘涂布100.000个HeLa细胞。次日，用不同效价(pfu/ml)的腺病毒 dl520感染细胞。在500μl无血清的DMEM培养基中在37℃感染1小时。 随后，去除感染培养基，并用2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替换。 在3-5天后，使用结晶紫染色进行分析。

实验结果如图23所示。腺病毒dl520在低MOI(5-10pfu/细胞)感染核 中没有YB-1的HeLa细胞时未显示出任何裂解，与此相反，dl520在MOI (感染复数)为100-200pfu/细胞时表现出实际上完全的裂解，并且在MOI 为50pfu/细胞时仍然表现出显著裂解。从中可以看出，dl520和类似的能 开启腺病毒基因E1B55k和E4orf6的病毒，在较高MOI时适合于直接地 或间接地将过表达的或去调节的YB-1转送到核中，并因此诱导细胞裂解。

实施例18：用于检测E2-晚期启动子活性的荧光素酶试验

已知YB-1能结合核中的腺病毒2-晚期启动子(Holm等，JBC 2002， 277，10427-20434)，且该启动子还较好地适用于核酸的表达。腺病毒2-晚 期启动子的应用特别地由下述事实推动，即其可以由YB-1控制，其中 YB-1作为正效应物起作用，即该启动子只有在核中存在YB-1的情况下 才是有活性的。因此当核中不存在分别作为效应物和调节物的YB-1时， 可以以高度选择性的方式调节所述的腺病毒E2-晚期启动子，并因此应用 于核中存在YB-1的系统中，实际上避免在腺病毒2-晚期启动子控制下的 核酸的任何表达。E2-晚期启动子包含3 Y-盒(CCAAT)，其与E2基因的激 活有关。已经制备了不同的E2-晚期启动子构建体，并检测了它们的特异 性和活性。如下进行分析。

使用3种不同的细胞浓度，将核中含有YB-1的细胞系EPG-257RDB (上皮胃癌)、HeLa(上皮子宫颈癌)和U2OS(骨肉瘤)接种到6孔平板中。 用次日表现出70％汇合的孔进行转染。对于每个孔，将500ng SpinMiniprep(Qiagen)纯化的在荧光素酶载体(市场上购自Promega，开始 质粒：pGL3-增强子)中的不同E2-晚期启动子的质粒DNA加入到在1.5ml 带固定帽的反应导管中的500μl OptiMEM，将5μl DOTAP加入到500μl 在另一个带固定帽的反应导管中。合并2份溶液，并混合。在室温孵育混 合物30分钟，以形成复合体。用PBS洗涤细胞3次，用转染混合物层覆 盖。将平板在37℃孵育5小时，随后再用PBS洗涤细胞3次，并提供完 全培养基。

感染后48小时，用Promega的荧光素酶分析系统试剂盒(Cat.No. E1500)处理细胞：给每个孔提供一层500μl的裂解缓冲液，在室温10分 钟后，用1ml吸管将细胞从平板孔中冲洗出，并转移到1,5ml带固定帽 的反应导管中。随后在4℃、14.000rpm离心细胞裂解物15分钟。向每 50μl上清液中加入100μl荧光素酶底物，用TopCount(Canberra-Packard GmbH，63303 Dreieich)微板闪烁&荧光计数器在96孔黑平板中在945nm 波长检测。

用目录号为23227(PIERCE，Rockford，Illinois，USA)的BCA蛋白分析 试剂盒在570nm、在生物光度计(BioluminTM 960)动力荧光/吸收平板读数 器中检测蛋白的分子动力学。样品的相对光信号被转换成蛋白量(RLU/μg 蛋白)。

使用下述质粒：用pGL3-增强子(Promega)作为空白读值，用BamHI (2250bp)和BsaBI(2003bp)从该pGL3-增强子中去除增强子。借助于限制 位点Apa I和Sac I，将各E2启动子构建体克隆进缺失增强子的pGL3载 体的MCS中。用Bgl II和Hind III将hCMV启动子克隆进pGL3增强子 中，并作为阳性对照。该阳性对照可以评价转染效率，还用作荧光素酶活 性的参考值。对于每种细胞系，将CMV对照设定为100％，将E2启动 子构建体生成的酶活性与其关联，作出的直方图如图24所示。

提及的各构建体如下：

1.包含Y-box I，II和III，对应于碱基25932-26179bp(关于野生型腺 病毒序列，还参见随后提供的腺病毒E2区部分)

2.包含Y-box II和III，对应于碱基25932-26127bp(关于野生型腺 病毒序列，还参见随后提供的腺病毒E2区部分)

3.包含Y-box III，对应于碱基25932-26004bp(关于野生型腺病毒序 列，还参见随后提供的腺病毒E2区部分)

4.不含有Y-盒，作为空白读数 腺病毒E2区部分(取自Virology 1992，186，280-285) (YB-1结合位点打印为粗体)

25561  aggaactttatcctagagcgctcaggaatcttgcccgccacctgctgtgcacttcctagc

25621  gactttgtgcccattaagtaccgcgaatgccctccgccgctttggggccactgctacctt

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26041  gg tgcaagccatcaacaaagcccgccaagagtttctgctacgaaagggacggggg

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26461  gcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaa

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26581  gcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccg

26641  ccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccg

26701  tcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcggcagcaacagcagcggcca

26761  cacagaagcaaaggcgaccggatagcaagactctgacaaagcccaagaaatccacagcgg

(SEQ.ID.No.8)

显示在图24中的结果有力地证实了，含有不同E2-晚期/Y-盒的各启 动子片段适用于在YB-1核-阳性的肿瘤细胞中表达治疗性的转基因，因而 可以用作本发明意义上的启动子。

实施例19：腺病毒表达的YB-1对颗粒释放的影响

用缺失E1/E3的腺病毒载体AdYB-1和仅缺失E1A的Ad312感染人 骨肉瘤细胞(U2OS)，MOI为50pfu/细胞。AdYB-1在其基因组中含有编 码细胞转录因子YB-1的序列，因而表达Y-盒结合蛋白1(YB-1)。为了评 价感染后的作为“噬菌斑形成单位”(pfu)的病毒颗粒的释放，在感染后2 和5天分别分离培养基上清液或残余的细胞层。通过3个融/冻循环，释 放细胞内的颗粒。使用293细胞上的噬菌斑试验分析颗粒数目。

结果如图25所示，其中实条表示细胞内残余的病毒颗粒，而交叉线 条表示释放出的细胞外的病毒颗粒。

图25所示的结果证实了，AdYB-1作为整体会生成比Ad312更多的 pfu，并释放出更多的颗粒。5天后，感染了AdYB-1的细胞清楚地表现出 与感染了Ad312的细胞相反的细胞病理效应(CPE)。

前述说明书公开的本发明的特征，权利要求以及附图可以单独以及任 意组合，对于本发明其各种实施方案的实现是重要的。

                                   序列表

<110>佩尔·松内·霍尔姆

<120>新的腺病毒，编码它的核酸，及其应用

<130>H10013 PCT

<140>PCT/EP 03/11427

<141>2003-10-15

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>结合YB-1的探针

<400>1

tgaggctgat tggctgggca                                                  20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>用于制备编码E2A的Ad5序列内KpnI片段检测探针的探针

<400>2

gtcggagatc agatccgcgt                                                  20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>用于制备编码E2A的Ad5序列内KpnI片段的检测探针的探针

<400>3

gatcctcgtc gtcttcgctt                                                  20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>用于制备编码E2A的Ad5序列内KpnI片段的检测探针的探针

<400>4

gtcggagatc agatccgcgt                                                  20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>用于制备编码E2A的Ad5序列内KpnI片段的检测探针的探针

<400>5

gatcctcgtc gtcttcgctt                                                  20

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>用于制备结合E2早期和E2晚期启动子间的探针的探针

<400>6

agctgatctt cgcttttg                                                    18

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>misc_feature

<223>用于制备结合E2早期和E2晚期启动子间的探针的探针

<400>7

ggatagcaag actctgacaa ag                                               22

<210>8

<211>1260

<212>DNA

<213>37型腺病毒

<220>

<221>misc_feature

<223>具有YB-1结合位点的腺病毒E2区的一部分

<400>8

aggaacttta tcctagagcg ctcaggaatc ttgcccgcca cctgctgtgc acttcctagc      60

gactttgtgc ccattaagta ccgcgaatgc cctccgccgc tttggggcca ctgctacctt     120

ctgcagctag ccaactacct tgcctaccac tctgacataa tggaagacgt gagcggtgac     180

ggtctactgg agtgtcactg tcgctgcaac ctatgcaccc cgcaccgctc cctggtttgc     240

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gcccgttcgc cgacccaacc gtagatggga caccactgga accagggccg gtaagtccaa     960

gcagccgccg ccgttagccc aagagcaaca acagcgccaa ggctaccgct catggcgcgg    1020

gcacaagaac gccatagttg cttgcttgca agactgtggg ggcaacatct ccttcgcccg    1080

ccgctttctt ctctaccatc acggcgtggc cttcccccgt aacatcctgc attactaccg    1140

tcatctctac agcccatact gcaccggcgg cagcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca    1200

cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg    1260