ManLAM的制备方法及其在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用
阅读：313发布：2020-09-18
专利汇可以提供ManLAM的制备方法及其在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了ManLAM的制备方法及其在制备 治疗 自身免疫 疾病 的药物中的应用。通过从结核分枝杆菌中获得粗糖提取物，PBS溶解获得粗糖溶解物，行SDS-PAGE 电泳 后，将整 块 分离胶置于3%预冷的氯化 钾 溶液中并轻轻摇动，分离胶上出现乳白色条带；对34 kD附近的条带进行切取；将切取的条带置于无菌研钵反复 研磨 ，加入2倍体积的去离子 水 浸泡研碎的胶条；10000 g离心15 min取上清，并 冷冻干燥 ，得到ManLAM纯度不低于95%。该ManLAM刺激的免疫细胞IL-10上升，具有免疫调节作用，能下调 机体 免疫细胞Th1型极化，对所有Th1型极化上升的自身免疫疾病均有治疗作用。，下面是ManLAM的制备方法及其在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种从结核分枝杆菌中提取纯化ManLAM的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、从结核分枝杆菌中获得粗糖提取物：
(1) 接种结核分枝杆菌于7H9液体培养基大量培养，37 °C培养约4周，其OD值约为2.0，
65 °C水浴中灭活2小时，10000 g离心15 min，收集结核分枝杆菌菌体，加入少量PBS重悬后再次离心收集菌体；
(2) 将灭活后的结核分枝杆菌分散并冷冻干燥，使用10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇，v/v，1:1) 重悬干燥后的菌体，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(3) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集菌体沉淀，将菌体再次重悬10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇/水，v/v/v，10:10:3) 中，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(4) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集脱脂后的菌体，于-80 °C冷冻后进行干燥；
(5) 将脱脂干燥后的菌体再次重悬于5倍于菌体体积的PBS中，同时加入含有终浓度
200 U/mL的DNase 、200 U/mL RNase、3 mM PMSF，充分混匀后精确测定体积，再加入Triton X-114至终浓度为8% (Triton X-114/PBS, v/v)，再次充分混匀，4 °C静置12小时；
(6) 低温下32000 g离心30 min，小心吸取上层液相置于无菌管中并放置于37 °C温箱中至明显分层；
(7) 取下层Triton X-114液相，加入9倍体积(Triton X-114相) 的95%的冰乙醇后置于-80 °C环境中12小时至沉淀析出；
(8) 10000 g离心5 min低温离心，弃去上清收集沉淀，冷冻干燥；然后加入2倍体积的终浓度为2 mg/mL蛋白酶K溶液，于58 °C水浴2小时；
(9) 透析除去氨基酸等小分子物质后，收集透析袋内液体再次干燥后备下一步分离纯化；
2）ManLAM的分离：
(1) 将透析冷冻干燥后的粗糖提取物称重后，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为10 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 电泳结束后，将浓缩胶切除，将整块分离胶置于浓度为3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动，约30秒分离胶上出现乳白色条带；
(5) 按照对应的预染蛋白marker的分子量对34 kD附近的条带进行切取；
(6) 将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；
(7) 10000 g离心15 min取上清，并冷冻干燥。
2.权利要求1的方法提取纯化的ManLAM在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，其特征在于，所述药物为ManLAM处理的免疫细胞诱导成为IL-10分泌上升的调节性B细胞，所述药物的作用方式为过继免疫。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫疾病是Th1型极化上升的自身免疫疾病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫疾病是炎症性肠病、多发性硬化、类风湿性关节炎。
ManLAM的制备方法及其在制备治疗自身免疫疾病的药物中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 自身免疫性疾病(autoimmune diseases，ADs)是一类严重危害人类健康的慢性复杂性疾病，是由于机体免疫效应细胞如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞等，或免疫效应分子(补体、抗体、细胞因子等)针对自身组织或细胞产生病理性免疫应答反应的一类慢性、异质性疾病，可累及特定的靶器官或多个系统。包括器官特异性自身免疫病(如胰岛素依赖型糖尿病)和系统性自身免疫病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎)等20余种疾病。但是目前自身免疫性疾病没有很好疗效的药物进行治疗。
[0003] 自身免疫性疾病具有一些相同的临床特征、环境和遗传因素，这一现象被称作“自身免疫性同义反复”，表明ADs有着共同的病理生理学机制。当然，ADS并不是真的等同。因为每一种ADS都有着不同的靶细胞和靶器官。而且其触发因子和发病年龄也千差万别。其共同特征为机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害。目前确切的发病机制尚不明确，近年研究发现表观遗传异常所致免疫调控网络紊乱与自身免疫病发生、发展及其分子机制相关。目前认为，具有某种遗传特征(由AD相关基因多态性决定)的个体，由于某些内外致病因素刺激(自身抗原释放、变构及超抗原分子模拟等)或自身免疫反应细胞基因突变、修饰等原因，导致抗原提呈细胞(APC)或树突状细胞异常活化、免疫调节网络失衡(Th1/Th2平衡破坏)、自身免疫细胞多克隆活化或凋亡延迟等改变，从而可能发生自身免疫性疾病。自身免疫的启动与效应过程形成恶性循环，要恢复正常的免疫耐受机制十分困难。很多自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、硬皮病、皮肌炎、系统性硬化症等疾病常呈反复、迁延的难治过程，需要长期巩固治疗才能获得满意疗效。
[0004] 正常人I类辅助性/II类辅助性CD4+ T细胞(Th1/Th2细胞）处于相对平衡状态，在机体免疫反应的调节中起关键作用。Th1细胞分泌白细胞介素(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-β (TNF-β)，主要介导细胞免疫反应；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6等，主要介导体液免疫反应。人类Th1和Th2均可产生IL-10。Th1和Th2两种细胞亚群之间存在交互抑制作用，一旦CD4+ T细胞亚群向某亚群偏移，产生Th1/Th2细胞失衡，就可能导致自身免疫性疾病。Th1及其分泌的细胞因子主要参与细胞免疫介导的自身免疫性疾病，如I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、甲状腺疾病等，其作用机制主要是通过分泌的IFN-γ等细胞因子，激活细胞毒性淋巴细胞(CTL)，促进细胞凋亡和上调粘附分子表达，导致胰岛β细胞、甲状腺细胞等特异性组织器官的破坏。Th2细胞过度活化与系统性红斑狼疮(SLE)、过敏性疾病（如哮喘）的发病有关，其过度活化产生的IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等细胞因子，诱导抗体大量异常产生或嗜酸性粒细胞浸润，导致过敏性疾病或体液免疫介导的自身免疫性疾病。
[0005] 在IL-10-/-小鼠自发性炎症性肠病和CD4+ T细胞诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC，IBD一种，DSS可诱导）中Th1和Th17细胞是炎症性肠病的主要致病细胞，并且异常升高的IFN-γ和IL-17分泌性细胞（Th1和Th17代表性细胞）在小鼠IBD模型和IBD患者中均存在。近期研究甚至发现除了肠系膜淋巴结的产生B10（产生IL-10的B细胞）细胞能抑制DSS诱导的IBD进展之外，腹腔和脾脏的B10细胞均能通过抑制肠系膜淋巴结IFN-γ+CD4+ T细胞数量发挥作用。ManLAM是否能够作为一个潜在的辅助治疗通过诱导B10细胞来调控自身免疫性疾病患者体内的Th1/Th2失衡，还不得而知。
[0006] 目前，还未见结核分枝杆菌中提取纯化的ManLAM在用于治疗自身免疫疾病中的报道。
[0007] 现有技术中结核分枝杆菌胞壁糖复合物提取基本遵循：脱脂->去蛋白->高速离心->萃取 步骤。（1. Torrelles JB, Khoo KH, Sieling PA, Modlin RL, Zhang N, Marques AM, Treumann A, Rithner CD, Brennan PJ, Chatterjee D. Truncated structural variants of lipoarabinomannan in Mycobacterium leprae and an ethambutol-resistant strain of Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem, 2004 Sep 24;279(39):41227-39.2. Torrelles JB, Knaup R, Kolareth A, Slepushkina T, Kaufman TM, Kang P, Hill PJ, Brennan PJ, Chatterjee D, Belisle JT, Musser JM, Schlesinger LS. Identification of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates with altered phagocytosis by human macrophages due to a truncated lipoarabinomannan. J Biol Chem, 2008 Nov 14;283(46):31417-28.），但这样得到的是包含ManLAM在内的LAM混合物（包含LAM、LM、PIMs等）。
[0008] 因此，建立从结核分枝杆菌中提取纯化ManLAM的方法迫在眉睫。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种从结核分枝杆菌中提取纯化得到高纯度ManLAM的方法。通过本发明方法可得到ManLAM含量不低于95%的纯度。本发明首次建立从结核分枝杆菌中提取纯化ManLAM的方法，具有较强的实用价值。
[0010] 本发明的另一个目的是提供ManLAM在临床治疗自身免疫性疾病中的应用。
[0011] 为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：本发明第一方面，提供一种从结核分枝杆菌中提取纯化ManLAM的方法，包括如下步骤：
1）、从结合分枝杆菌中获得粗糖提取物：
(1) 接种结核分枝杆菌于7H9液体培养基大量培养，37 °C培养约4周，其OD值约为2.0，
65 °C水浴中灭活2小时，10000 g离心15 min，收集结核分枝杆菌菌体，加入少量PBS重悬后再次离心收集菌体；
(2) 将灭活后的结核分枝杆菌分散并冷冻干燥，使用10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇，v/v，1:1) 重悬干燥后的菌体，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(3) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集菌体沉淀，将菌体再次重悬10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇/水，v/v/v，10:10:3) 中，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(4) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集脱脂后的菌体，于-80 °C冷冻后进行干燥；
(5) 将脱脂干燥后的菌体再次重悬于5倍于菌体体积的PBS中，同时加入含有终浓度
200 U/mL的DNase 、200 U/mL RNase、3 mM PMSF，充分混匀后精确测定体积，再加入Triton X-114至终浓度为8% (Triton X-114/PBS, v/v)，再次充分混匀，4 °C静置12小时；
(6) 低温下32000 g离心30 min，小心吸取上层液相置于无菌管中并放置于37 °C温箱中至明显分层；
(7) 取下层Triton X-114液相，加入9倍体积(Triton X-114相) 的95%的冰乙醇后置于-80 °C环境中12小时至沉淀析出；
(8) 10000 g离心5 min低温离心，弃去上清收集沉淀，冷冻干燥；然后加入2倍体积的终浓度为2 mg/mL蛋白酶K溶液，于58 °C水浴2小时；
(9) 透析除去氨基酸等小分子物质后，收集透析袋内液体再次干燥后备下一步分离纯化。
1）、从结合分枝杆菌中获得粗糖提取物：
(1) 接种结核分枝杆菌于7H9液体培养基大量培养，37 °C培养约4周，其OD值约为2.0，
65 °C水浴中灭活2小时，10000 g离心15 min，收集结核分枝杆菌菌体，加入少量PBS重悬后再次离心收集菌体；
(2) 将灭活后的结核分枝杆菌分散并冷冻干燥，使用10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇，v/v，1:1) 重悬干燥后的菌体，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(3) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集菌体沉淀，将菌体再次重悬10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇/水，v/v/v，10:10:3) 中，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(4) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集脱脂后的菌体，于-80 °C冷冻后进行干燥；
(5) 将脱脂干燥后的菌体再次重悬于5倍于菌体体积的PBS中，同时加入含有终浓度
200 U/mL的DNase 、200 U/mL RNase、3 mM PMSF，充分混匀后精确测定体积，再加入Triton X-114至终浓度为8% (Triton X-114/PBS, v/v)，再次充分混匀，4 °C静置12小时；
(6) 低温下32000 g离心30 min，小心吸取上层液相置于无菌管中并放置于37 °C温箱中至明显分层；
(7) 取下层Triton X-114液相，加入9倍体积(Triton X-114相) 的95%的冰乙醇后置于-80 °C环境中12小时至沉淀析出；
(8) 10000 g离心5 min低温离心，弃去上清收集沉淀，冷冻干燥；然后加入2倍体积的终浓度为2 mg/mL蛋白酶K溶液，于58 °C水浴2小时；
(9) 透析除去氨基酸等小分子物质后，收集透析袋内液体再次干燥后备下一步分离纯化。
[0012] 2）ManLAM的分离：(1) 将透析冷冻干燥后的粗糖提取物称重后，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为10 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 电泳结束后，将浓缩胶切除，将整块分离胶置于浓度为3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动，约30秒分离胶上出现乳白色条带；
(5) 按照对应的预染蛋白marker的分子量对34 kD附近的条带进行切取；
(6) 将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；
(7) 10000 g离心15 min取上清，并冷冻干燥。
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 电泳结束后，将浓缩胶切除，将整块分离胶置于浓度为3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动，约30秒分离胶上出现乳白色条带；
(5) 按照对应的预染蛋白marker的分子量对34 kD附近的条带进行切取；
(6) 将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；
(7) 10000 g离心15 min取上清，并冷冻干燥。
[0013] 在本发明的一个具体实施例中，将分离纯化的结核分枝杆菌表面ManLAM冷冻干燥后使用PBS溶解调整浓度至1 mg/mL，扫描前使用PBS调整扫描基线，使用波长扫描仪从900 nm至190 nm每次间隔1 nm进行连续波长扫描，测得ManLAM在202 nm处有最高吸收峰；随后通过安捷伦1260型HPLC进行纯度鉴定，在流速1 mL/min，柱温25°C，压力45 Bar时，测得其保留时间6.3 min时出现主峰，根据峰面积计算其含量约占95%（图1B）。
[0014] 在本发明的一个具体实施例中，经过纯化之后的ManLAM，使用Biotin-ConA经Western blot检测结果显示在34 kD至26 kD之间有集中的一条富含甘露糖糖苷的条带（图1C和D）。
[0015] 在本发明的一个具体实施例中，气相色谱检测结果可见所提取ManLAM中主要糖成分组成均为阿拉伯糖(Ara, Arabinose)和甘露糖(Man, Mannose)，只是不同类型细菌ManLAM的Ara和Man比例不同，BCG ManLAM中Ara:Man比例为2.12:1，H37Rv Ara:Man比例为1.04:1（图1E和F）。
[0016] 本发明的第二方面，提供ManLAM在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，所述药物为ManLAM处理的免疫细胞诱导成为IL-10分泌上升的调节性B细胞，所述药物的作用方式为过继免疫。
[0017] 优选地，所述的自身免疫疾病是Th1型极化上升的自身免疫疾病。
[0018] 优选地，所述的自身免疫疾病是炎症性肠病、多发性硬化、类风湿性关节炎。
[0019] 在本发明的一个具体实施例中，为了进一步探究ManLAM诱导的B10细胞是否能够在炎症性肠病模型中发挥免疫抑制作用，将ManLAM处理的荧光染料CFSE标记的B细胞过继到了IL-10-/-小鼠中，再观察其对炎症性肠病进展的调控作用。结果说明ManLAM通过诱导B细胞分泌IL-10抑制炎症性肠病的进展。进一步检测了脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+ T细胞的IFN-γ，IL-4表达情况。从结果中可以看出：过继ManLAM-WT B细胞组脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+ T细胞分泌的IFN-γ均明显低于其他3组（图2C和2D）；而IL-4则明显高于其他3组，差异具有统计学意义，明显缓解炎症性肠病。（图2C和2D）。因此，ManLAM具有免疫调节作用，能诱导下调机体免疫细胞Th1型极化，增加Th2型极化，明显缓解炎症性肠病。本发明所述的ManLAM诱导B10上升，过继治疗后，对所有Th1型极化上升的自身免疫疾病均有治疗作用。
[0020] 本发明的有益效果：本发明通过在传统结核分枝杆菌胞壁糖复合物提取方法的基础上，增加了HPLC、SDS-PAGE等ManLAM纯化步骤，从而得到不包含LAM、LM、PIMs的纯ManLAM。利用此制备方法获得的纯ManLAM处理的免疫细胞诱导成为IL-10上升的调节性细胞，用于过继治疗自身免疫疾病，发现ManLAM可明显减轻IBD疾病，ManLAM处理的免疫细胞过继治疗中通过下调Th1，上调Th2。本发明首次提出以ManLAM调控免疫功能，从而治疗自身免疫疾病，在其它Th1型极化上升的自身免疫疾病-ADs中也会发挥同样的免疫调节作用，减轻疾病作用。
附图说明
附图说明
[0021] 图1.结核分枝杆菌表面ManLAM的提取、纯化和鉴定。
[0022] (A) 提取的初糖的糖原染色(PAS染色，Periodic Acid-Schiff stain)鉴定；(B) HPLC鉴定提取的ManLAM；(C)和(D) biotin-ConA Western blot鉴定ManLAM；(E) 气相色谱鉴定所提取BCG (Bacille Calmette-Guérin，卡介苗) ManLAM中主要糖成分；(F) 气相色谱鉴定所提取H37Rv ManLAM中主要糖成分；Ara: Arabinose, 阿拉伯糖; Man: Mannose, 甘露糖。
[0023] 图2. ManLAM刺激的免疫细胞过继能够减缓炎症性肠病进展。
[0024] (A) 结肠长度测量和统计分析结果；(B) 结肠组织HE染色结果，然后进行IBD病理评分。每组4只小鼠，数据来源于3次重复实验，结果用均值 ± 标准差表示。*p<0.05，***p<0.001。(C) 脾脏中CD4+ T细胞IFN-γ，IL-4和IL-17水平；(D) 肠系膜淋巴结CD4+ T细胞表达IFN-γ，IL-4和IL-17水平。数据来源于3次重复实验，结果用均值 ± 标准差表示。*p<
0.05，***p<0.001。
0.05，***p<0.001。
具体实施方式
[0025] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0026] 【实施例1】 ManLAM的制备提取结核分枝杆菌ManLAM后，粗糖先经过糖原染色鉴定，其主要成份仍为两种多糖类物质，ManLAM分子量约集中在34 kD至26 kD之间，LAM分子量约集中在26 kD至17 kD之间（图1A）；将分离纯化的结核分枝杆菌表面ManLAM冷冻干燥后使用PBS溶解调整浓度至1 mg/mL，扫描前使用PBS调整扫描基线，使用波长扫描仪从900 nm至190 nm每次间隔1 nm进行连续波长扫描，测得ManLAM在202 nm处有最高吸收峰；随后通过安捷伦1260型HPLC进行纯度鉴定，在流速1 mL/min，柱温25°C，压力45 Bar时，测得其保留时间6.3 min时出现主峰，根据峰面积计算其含量约占95%（图1B）；经过纯化之后的ManLAM，使用Biotin-ConA经Western blot检测结果显示在34 kD至26 kD之间有集中的一条富含甘露糖糖苷的条带（图1C和D）。
气相色谱检测结果可见所提取ManLAM中主要糖成分组成均为阿拉伯糖(Ara, Arabinose)和甘露糖(Man, Mannose)，只是不同类型细菌ManLAM的Ara和Man比例不同，BCG ManLAM中Ara:Man比例为2.12:1，H37Rv Ara:Man比例为1.04:1（图1E和F）。
气相色谱检测结果可见所提取ManLAM中主要糖成分组成均为阿拉伯糖(Ara, Arabinose)和甘露糖(Man, Mannose)，只是不同类型细菌ManLAM的Ara和Man比例不同，BCG ManLAM中Ara:Man比例为2.12:1，H37Rv Ara:Man比例为1.04:1（图1E和F）。
[0027] 具体分离步骤如下：1．结核分枝杆菌表面ManLAM的提取和制备方法
(1) 接种结核分枝杆菌于7H9液体培养基大量培养，37 °C培养约4周，其OD值约为2.0，
65 °C水浴中灭活2小时，10000 g离心15 min，收集结核分枝杆菌菌体，加入少量PBS重悬后再次离心收集菌体；
(2) 将灭活后的结核分枝杆菌分散并冷冻干燥，使用10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇，v/v，1:1) 重悬干燥后的菌体，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(3) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集菌体沉淀，将菌体再次重悬10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇/水，v/v/v，10:10:3) 中，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(4) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集脱脂后的菌体，于-80 °C冷冻后进行干燥；
(5) 将脱脂干燥后的菌体再次重悬于5倍于菌体体积的PBS中，同时加入含有终浓度
200 U/mL的DNase 、200 U/mL RNase、3 mM PMSF，充分混匀后精确测定体积，再加入Triton X-114至终浓度为8% (Triton X-114/PBS, v/v)，再次充分混匀，4 °C静置12小时；
(6) 低温下32000 g离心30 min，小心吸取上层液相置于无菌管中并放置于37 °C温箱中至明显分层；
(7) 取下层Triton X-114液相，加入9倍体积(Triton X-114相) 的95%的冰乙醇后置于-80 °C环境中12小时至沉淀析出；
(8) 10000 g离心5 min低温离心，弃去上清收集沉淀，冷冻干燥；然后加入2倍体积的终浓度为2 mg/mL蛋白酶K溶液，于58 °C水浴2小时；
(9) 透析除去氨基酸等小分子物质后，收集透析袋内液体再次干燥后备下一步分离纯化。
(1) 接种结核分枝杆菌于7H9液体培养基大量培养，37 °C培养约4周，其OD值约为2.0，
65 °C水浴中灭活2小时，10000 g离心15 min，收集结核分枝杆菌菌体，加入少量PBS重悬后再次离心收集菌体；
(2) 将灭活后的结核分枝杆菌分散并冷冻干燥，使用10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇，v/v，1:1) 重悬干燥后的菌体，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(3) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集菌体沉淀，将菌体再次重悬10倍于菌体体积的混合溶剂 (氯仿/甲醇/水，v/v/v，10:10:3) 中，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时；
(4) 10000 g离心15 min离心，弃上清收集脱脂后的菌体，于-80 °C冷冻后进行干燥；
(5) 将脱脂干燥后的菌体再次重悬于5倍于菌体体积的PBS中，同时加入含有终浓度
200 U/mL的DNase 、200 U/mL RNase、3 mM PMSF，充分混匀后精确测定体积，再加入Triton X-114至终浓度为8% (Triton X-114/PBS, v/v)，再次充分混匀，4 °C静置12小时；
(6) 低温下32000 g离心30 min，小心吸取上层液相置于无菌管中并放置于37 °C温箱中至明显分层；
(7) 取下层Triton X-114液相，加入9倍体积(Triton X-114相) 的95%的冰乙醇后置于-80 °C环境中12小时至沉淀析出；
(8) 10000 g离心5 min低温离心，弃去上清收集沉淀，冷冻干燥；然后加入2倍体积的终浓度为2 mg/mL蛋白酶K溶液，于58 °C水浴2小时；
(9) 透析除去氨基酸等小分子物质后，收集透析袋内液体再次干燥后备下一步分离纯化。
[0028]2．ManLAM的分离及高效液相色谱鉴定
(1) 将透析冷冻干燥后的粗糖提取物称重后，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为10 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 电泳结束后，将浓缩胶切除，将整块分离胶置于浓度为3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动，约30秒分离胶上出现乳白色条带；
(5) 按照对应的预染蛋白marker的分子量对34 kD附近的条带进行切取；
(6) 将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；
(7) 10000 g离心15 min取上清，并冷冻干燥；
(8) 将冷冻干燥的ManLAM使用流动相溶解至1 mg/mL，以流动相校准波长扫描仪基线后，对ManLAM溶液进行190 nm -900 nm，每间隔1 nm扫描一次，确定最佳吸收峰；
(9) 打开安捷伦1260型HPLC 仪器，启动四元泵后，打开purge阀，以5 mL/min流速排除泵内气体并清洗泵腔5 min，连接安捷伦ZORBAX Sephadex G-25的HPLC分析柱，将检测波长调至202 nm，预热30 min，同时关闭purge阀，将流速调至1 mL/min，冲洗分析柱30 min，直至基线稳定；
(10) 手动加样器吸取ManLAM溶液50 μL，匀速加入进样环，将进样阀从“loading”转至“inject”。
(1) 将透析冷冻干燥后的粗糖提取物称重后，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为10 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 电泳结束后，将浓缩胶切除，将整块分离胶置于浓度为3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动，约30秒分离胶上出现乳白色条带；
(5) 按照对应的预染蛋白marker的分子量对34 kD附近的条带进行切取；
(6) 将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；
(7) 10000 g离心15 min取上清，并冷冻干燥；
(8) 将冷冻干燥的ManLAM使用流动相溶解至1 mg/mL，以流动相校准波长扫描仪基线后，对ManLAM溶液进行190 nm -900 nm，每间隔1 nm扫描一次，确定最佳吸收峰；
(9) 打开安捷伦1260型HPLC 仪器，启动四元泵后，打开purge阀，以5 mL/min流速排除泵内气体并清洗泵腔5 min，连接安捷伦ZORBAX Sephadex G-25的HPLC分析柱，将检测波长调至202 nm，预热30 min，同时关闭purge阀，将流速调至1 mL/min，冲洗分析柱30 min，直至基线稳定；
(10) 手动加样器吸取ManLAM溶液50 μL，匀速加入进样环，将进样阀从“loading”转至“inject”。
[0029]3．分离产物的银染鉴定及糖原染色鉴定
(1) 取切胶回收的ManLAM条带用去离子水浸泡后冷冻干燥，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为1 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 将1 mm厚度的PAGE胶小心剥离至洁净的平皿里，使用去离子水冲洗2次，每次10秒，然后将胶块置于含30% 乙醇、10% 乙酸、0.7%的过碘酸固定液中，室温下摇动浸泡20分钟，保持匀速100转/min；
(5) 弃去固定液后，使用去离子水洗涤PAGE胶块，每次5分钟，共计6次，每次需更换去离子水，
(6) 将PAGE胶块浸泡于1%硝酸银溶液中，室温下避光浸泡30分钟，并不断摇动，保持匀速50转/min；
(7) 弃去硝酸银染色液，用去离子水冲洗PAGE胶块2次，每次15秒；
(8) 弃去洗液，使用30 g/L 碳酸钠，0.1%的甲醛溶液覆盖PAGE胶块，并轻轻摇动；
(9) 显示出条带后即刻使用1%的乙酸溶液终止反应，约5分钟后弃去乙酸溶液，放入去离子水中保存。
(1) 取切胶回收的ManLAM条带用去离子水浸泡后冷冻干燥，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为1 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 将1 mm厚度的PAGE胶小心剥离至洁净的平皿里，使用去离子水冲洗2次，每次10秒，然后将胶块置于含30% 乙醇、10% 乙酸、0.7%的过碘酸固定液中，室温下摇动浸泡20分钟，保持匀速100转/min；
(5) 弃去固定液后，使用去离子水洗涤PAGE胶块，每次5分钟，共计6次，每次需更换去离子水，
(6) 将PAGE胶块浸泡于1%硝酸银溶液中，室温下避光浸泡30分钟，并不断摇动，保持匀速50转/min；
(7) 弃去硝酸银染色液，用去离子水冲洗PAGE胶块2次，每次15秒；
(8) 弃去洗液，使用30 g/L 碳酸钠，0.1%的甲醛溶液覆盖PAGE胶块，并轻轻摇动；
(9) 显示出条带后即刻使用1%的乙酸溶液终止反应，约5分钟后弃去乙酸溶液，放入去离子水中保存。
[0030]4．分离产物的免疫印迹（Western blot）鉴定
(1) 取切胶回收的ManLAM条带用去离子水浸泡后冷冻干燥，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为1 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4%、分离胶浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 将SDS-PAGE胶剥离后使用去离子水冲洗2遍，由PAGE胶电转至PVDF膜上，200 mA稳流2小时；
(4) 将PVDF膜从电转槽的夹心中取出，浸入无蛋白封闭液中，4 °C封闭12小时；
(5) TBST洗PVDF膜3次，每次室温震荡5分钟。
(1) 取切胶回收的ManLAM条带用去离子水浸泡后冷冻干燥，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为1 mg/mL；
(2) 配制浓缩胶4%、分离胶浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶；
(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS-PAGE电泳；
(4) 将SDS-PAGE胶剥离后使用去离子水冲洗2遍，由PAGE胶电转至PVDF膜上，200 mA稳流2小时；
(4) 将PVDF膜从电转槽的夹心中取出，浸入无蛋白封闭液中，4 °C封闭12小时；
(5) TBST洗PVDF膜3次，每次室温震荡5分钟。
[0031] (6) 加入终浓度为5 μg/mL生物素标记的ConA (Sigma公司) ，置于杂交箱中37 °C下孵育1小时，使用TBST洗膜3次，每次室温震荡5分钟。
[0032] (7) 加入HRP标记的链酶亲和素(1:2000稀释) ，将PVDF膜放入其中，置于杂交箱中37 °C下孵育1小时，使用TBST洗膜3次，每次室温震荡5分钟。
[0033] (8) 置于化学发光仪中，加入1:1混合后的显色底物A、B，显色后，并动态观察结果。
[0034]5．气相色谱鉴定所提取ManLAM中主要糖成分
(1) 多糖的完全酸水解：纯化的ManLAM以无水乙酸/乙酸酐（v/v, 3:2）110 °C处理
12h，反应产物浓缩干燥后，溶于400 μl环已烷溶液中(环已烷:水，v/v，1:1)。取环已烷相进行气相色谱检测。
(1) 多糖的完全酸水解：纯化的ManLAM以无水乙酸/乙酸酐（v/v, 3:2）110 °C处理
12h，反应产物浓缩干燥后，溶于400 μl环已烷溶液中(环已烷:水，v/v，1:1)。取环已烷相进行气相色谱检测。
[0035] (2) 以Agilent 7890A气相色谱仪配备DB-1701毛细管柱 (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm) 进行气相色谱鉴定，使用氦气作为载气，流速2.5 ml/min，使用火焰离子化检测器检测，检测器温度310 °C，气化室温度为260 °C。柱升温程序为以3 °C/min速率由初始的100 °C 升温到290 °C。
[0036] 【实施例2】 ManLAM刺激的免疫细胞过继减缓炎症性肠病症状在右旋葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导的炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）中，B细胞分泌的IL-10能够通过抑制中性粒细胞浸润，CD4+ T细胞活化和IFN-γ的分泌等从而显著减缓疾病症状。为了进一步探究ManLAM诱导的B10细胞是否能够在炎症性肠病模型中发挥免疫抑制作用，我们将ManLAM处理的荧光染料CFSE标记的B细胞过继到了IL-10-/-小鼠中，再观察其对炎症性肠病进展的调控作用。
[0037] 过继ManLAM处理的B细胞3天后，用含DSS（3%，w/v）的纯净水喂养IL-10-/-小鼠，诱导急性炎症性肠病模型。检测体重变化发现：过继无任何刺激的WT B细胞和IL-10-/- B细胞对发生炎症性肠病小鼠体重减轻影响无显著差异。但在ManLAM刺激的B细胞中，过继ManLAM刺激的WT B细胞之后，DSS诱导小鼠体重减轻的趋势相比于过继ManLAM刺激的IL-10-/- B 细胞组明显减缓，并且从过继后第二天就出现了差异。在小鼠体重减轻超过20%并且有小鼠出现死亡之后，处死各组小鼠，进一步检测组织病理相关指标。结肠长度（回盲部至肛门）是反映炎症性肠病程度的一个间接指标，长度越短预示病变越严重。结果显示： WT B细胞组结肠长度均比IL-10-/- B细胞组结肠长度要长，并且ManLAM-WT B细胞组结肠长度明显比ManLAM-IL-10-/- B细胞组要长（7.3 ± 1.039 cm vs. 5.0 ± 0.70，*p<0.01）（图2A），说明ManLAM-IL-10-/- B细胞组炎症性肠病更重。对结肠组织HE染色发现：4组经DSS处理之后，肠绒毛结构均有不同程度的破坏（图2B）。未做处理的WT B细胞与ManLAM-WT B细胞组相比，杯状细胞和隐窝明显减少并伴有更为严重的隐窝脓肿，单核细胞浸润增多等（图2B）。这说明ManLAM能够通过B细胞减轻炎症性肠病过程中结肠局部组织病变程度。在ManLAM-IL-10-/- B和IL-10-/- B组中则发现，肠绒毛结构破坏比ManLAM-WT B组更加严重，并伴随有隐窝和杯状细胞的消失，固有层增厚，粘膜下层间隙增大并有大量单核细胞浸润，微血管增生，组织病理学评分也明显高于WT B组以及ManLAM-WT B组（图2B）。以上结果说明ManLAM通过诱导B细胞分泌IL-10抑制炎症性肠病的进展。
[0038] 我们进一步检测了脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+ T细胞的IFN-γ，IL-4表达情况。+
从结果中可以看出：过继ManLAM-WT B细胞组脾脏和肠系膜淋巴结中CD4 T细胞分泌的IFN-γ均明显低于其他3组（图2C和2D）；而IL-4则明显高于其他3组，差异具有统计学意义（图2C和2D）。
从结果中可以看出：过继ManLAM-WT B细胞组脾脏和肠系膜淋巴结中CD4 T细胞分泌的IFN-γ均明显低于其他3组（图2C和2D）；而IL-4则明显高于其他3组，差异具有统计学意义（图2C和2D）。
[0039]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
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