酵母-Brachyury(短尾畸形)免疫治疗组合物
阅读：757发布：2020-09-19
专利汇可以提供酵母-Brachyury(短尾畸形)免疫治疗组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了包含短尾畸形 抗原 的基于 酵母 的免疫 治疗 组合物，以及 预防 和/或治疗以短尾畸形的表达或过表达为特征的癌症的方法。，下面是酵母-Brachyury(短尾畸形)免疫治疗组合物专利的具体信息内容。
1.免疫治疗组合物在制备用于患有癌症的个体中减少、遏制、逆转、延迟或防止癌症转移性进展的药物中的用途，所述免疫治疗组合物包含:
a)酵母媒介物；和
b)癌抗原，包含至少一种短尾畸形抗原，其中所述的短尾畸形抗原由以下序列结构组成：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：18的位点2-435。
2.权利要求1所述的用途，其中在第一次给予所述组合物时，个体的癌症中没有检测到短尾畸形表达。
3.权利要求1所述的用途，其中在第一次给予所述组合物时，个体的癌症中检测到了短尾畸形表达。
4.权利要求1所述的用途，其中所述个体患有I期癌症，患有II期癌症，患有III期癌症，或患有IV期癌症。
5.免疫治疗组合物在制备用于防止或延迟表达短尾畸形的癌症的发病的药物中的用途，所述组合物包含:
a)酵母媒介物；和
b)癌抗原，包含至少一种短尾畸形抗原，其中所述的短尾畸形抗原由以下序列结构组成：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：18的位点2-435。
6.权利要求1-5中任一项所述的用途，其中个体正被或者已经被用另一种癌症疗法治疗。
7.权利要求6所述的用途，其中疗法是化疗，靶向癌症疗法，放疗，过继性T细胞转移，或从个体经手术切除肿瘤。
8.权利要求6所述的用途，其中疗法是给予一或多种其他免疫治疗组合物。
9.权利要求8所述的用途，其中所述其他免疫治疗组合物包含酵母媒介物和第二癌抗原，所述第二癌抗原不包括短尾畸形抗原。
10.权利要求9所述的用途，其中第二癌抗原选自:突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤样息肉(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素和NGEP。
11.权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述癌选自:乳腺癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、Epstein-Barr病毒转化的B细胞、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、和它们的转移癌症。
12.免疫治疗组合物在制备用于减少或防止癌症患者中肿瘤细胞的化疗抗性或放疗抗性的药物中的用途，所述患者是患有癌症并正在接受化疗和/或放疗的患者，所述免疫治疗组合物包含:
a)酵母媒介物；和
b)癌抗原，包含至少一种短尾畸形抗原，其中所述的短尾畸形抗原由以下序列结构组成SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：18的位点2-435。
13.第一免疫治疗组合物和第二免疫治疗组合物在制备癌症治疗的药物中的用途，所述癌症治疗包括:
a)给予个体第一免疫治疗组合物，所述个体患有还未检测到短尾畸形表达的癌症，所述第一免疫治疗组合物包含酵母媒介物和不包括短尾畸形抗原的第一癌抗原；和b)给予个体第一免疫治疗组合物之前、同时或者顺序或者随后给予第二免疫治疗组合物，后者包含酵母媒介物和包括短尾畸形抗原的第二癌抗原，其中所述的短尾畸形抗原由以下序列结构组成：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：
18的位点2-435。
14.第一免疫治疗组合物，第二免疫治疗组合物，以及第三免疫治疗组合物在制备癌症治疗药物中的用途，所述癌症治疗包括:
a)给予患有癌症的个体第一免疫治疗组合物，所述第一免疫治疗组合物包含酵母媒介物和突变的Ras抗原；
b)给予(a)中的个体第二免疫治疗组合物，所述第二免疫治疗组合物包含酵母媒介物和选自癌胚抗原(CEA)和粘蛋白-1(MUC-1)的抗原；和
c)给予(a)和(b)中的个体第三免疫治疗组合物，所述第三免疫治疗组合物包含酵母媒介物和短尾畸形抗原，其中所述的短尾畸形抗原由以下序列结构组成：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：18的位点2-435。
15.权利要求13或14所述的用途，其中癌症选自:乳腺癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、Epstein-Barr病毒转化的B细胞、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和它们的转移癌症。
16.权利要求1-15中任一项所述的用途，其中短尾畸形抗原由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。
17.权利要求1-16中任一项所述的用途，其中短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18的位点
246-254。
18.权利要求1-15中任一项所述的用途，其中短尾畸形抗原由SEQ ID NO:18所示或SEQ ID NO:18的位点2-435的氨基酸序列组成。
19.权利要求1-15中任一项所述的用途，其中短尾畸形抗原由SEQ ID NO:6所示或SEQ ID NO:6的位点2-435的氨基酸序列组成。
20.权利要求1-19中任一项所述的用途，其中癌抗原是融合蛋白，所述融合蛋白由SEQ ID NO:8所代表的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:20所代表的氨基酸序列组成。
21.权利要求20的用途，其中所述融合蛋白的表达受启动子CUP1的控制。
22.权利要求1-21中任一项所述的用途，其中酵母媒介物是被杀死的完整酵母。
23.权利要求22所述的用途，其中所述完整酵母被热灭活。
24.权利要求1-23中任一项所述的用途，其中所述酵母媒介物表达所述抗原。
25.权利要求1-24中任一项所述的用途，其中酵母来自酿酒酵母。
26.权利要求1-25中任一项所述的用途，其中组合物在适合给予受试对象的药学上可接受的赋形剂中成剂。
27.酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，其中所述免疫治疗组合物包含:
a)酵母媒介物；
b)酵母媒介物所表达的包含至少一种短尾畸形抗原的抗原，其中所述短尾畸形抗原由SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：18的位点2-435组成，或者其中所述的短尾畸形抗原由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：18的从至少位点1或2到位点255和C端之间的序列组成；和
c)适合给予人的药学上可接受的赋形剂。
28.权利要求27所述的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，其中所述短尾畸形抗原由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:18的位点2-435组成。
29.权利要求27所述的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，其中所述短尾畸形抗原由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的位点2-435组成。
30.酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，其包含:
a)完整的灭活酵母；和
b)短尾畸形融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:6的位点2-435的氨基酸序列，其中短尾畸形融合蛋白的表达受到启动子CUP1的控制；
其中酵母表达短尾畸形融合蛋白；和
其中组合物引发短尾畸形特异性T细胞反应。
31.酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，其包含:
a)完整的灭活酵母；和
b)短尾畸形融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:18的位点2-435的氨基酸序列，其中短尾畸形融合蛋白的表达受到启动子CUP1的控制；
其中酵母表达短尾畸形融合蛋白；和
其中组合物引发短尾畸形特异性T细胞反应。
32.生产酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的方法，所述方法包括:
a)在不含CuSO4的合适培养基中培养酵母直至酵母达到对数生长中期，所述酵母转化了在CUP1启动子控制下的编码短尾畸形抗原的重组核酸分子，其中所述的短尾畸形抗原由SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的位点2-435，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：18的位点2-435组成；
b)通过向培养基中加入CuSO4诱导酵母中短尾畸形抗原的表达；
c)在步骤(b)后将酵母培养最多6-8小时；和
d)收集酵母。
33.权利要求27-31中任一项的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在制备治疗疾病的药物中的用途。
酵母-Brachyury(短尾畸形)免疫治疗组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2011年3月17日提交的美国临时申请61/453,656的优先权。所述2011年3月17日提交的美国临时申请61/453,656的全部公开内容通过引用并入本文。
[0003] 政府的权利
[0004] 本发明是在执行与Department of Health and Human Services下属的National Institutes of Health之间的Cooperative Research and Development Agreement(合作研发协议)产生的。美国政府对本发明具有部分权利。
[0006] 本发明是由2008年5月8日执行的Cooperative Research and Development Agreement或者该协议的参与机构产生的。该Cooperative Research and Development
Agreement的参与机构是:GlobeImmune,Inc.和美国Department of Health and Human
Services，后者由National Institutes of Health的一个研究所、中心或Division的
National Cancer Institute代表。
Agreement的参与机构是:GlobeImmune,Inc.和美国Department of Health and Human
Services，后者由National Institutes of Health的一个研究所、中心或Division的
National Cancer Institute代表。
[0008] 本申请含有通过EFS-Web以文本文件电子提交的序列表。该名为“3923-34-PCT_ST25”的文本文件大小为76KB，在2012年3月13日记录。该文本文件包含的信息根据37CFR§
1.52(e)(5)通过引用全部并入本文。
发明领域
1.52(e)(5)通过引用全部并入本文。
发明领域
[0009] 本发明一般地涉及用于预防和/或治疗以短尾畸形的表达或过表达为特征的基于酵母的免疫治疗组合物和方法。
[0010] 发明背景
[0011] 短尾畸形，又被称为“T”，是一种中胚层转录因子和T-box基因复合体的成员。编码短尾畸形的基因(在人体中表示为T基因或短尾畸形基因)最初是由Nadine 在1927年通过影响小鼠中尾长度和杂合动物中骶椎的一个突
变鉴定到的。短尾畸形基因在1990年由Hermann及其同事在小鼠中克隆(Herrmann et al.,
1990,Nature343:617-622)，在1996年由Edwards及其同事在人中克隆(Edwards et al.,
1996,Genome Res.6:226-223)，他们还描述了推断的人短尾畸形氨基酸序列。
变鉴定到的。短尾畸形基因在1990年由Hermann及其同事在小鼠中克隆(Herrmann et al.,
1990,Nature343:617-622)，在1996年由Edwards及其同事在人中克隆(Edwards et al.,
1996,Genome Res.6:226-223)，他们还描述了推断的人短尾畸形氨基酸序列。
[0012] 作为T-box家族转录因子的成员，短尾畸形含有高度保守的DNA结合结构域基元，被称为“T-box”或T-结构域，能够结合回文共有序列。与其他T-box蛋白一样，短尾畸形被证实在脊椎动物的早期发育中发挥作用，对于后部中胚层的形成和分化以及中轴发育非常关键(参见例如，Wilkinson et al.,1990,Nature343(6259):657–659)；Beddington et al.,1992,Development (Suppl.):157-165；Schulte-Merker et al.,1994,Development120:
1009-1015；Kispert and Herrmann,1994,Dev.Biol.161:179-193；Showell et al.,2004,Dev Dyn229:201-218)。近年，Palena和同事显示在多种人类肿瘤组织和癌细胞系中均有短尾畸形的表达，并且证实短尾畸形肽可以用于在正常供体和癌症患者中生成短尾畸形特异性T细胞系(Palena et al.,2007,Clin.Cancer Res.13(8):2471-2478)。Fernando等的研究显示，短尾畸形促进人肿瘤细胞中的上皮细胞-间充质转化(EMT)，赋予肿瘤细胞间充质表型，以及迁移和侵袭能力，同时减弱肿瘤细胞周期进展(Fernando et al.,2010,
J.Clin.Invest.120(2):533-544)。相应地，短尾畸形参与了癌症的转移性进展。
1009-1015；Kispert and Herrmann,1994,Dev.Biol.161:179-193；Showell et al.,2004,Dev Dyn229:201-218)。近年，Palena和同事显示在多种人类肿瘤组织和癌细胞系中均有短尾畸形的表达，并且证实短尾畸形肽可以用于在正常供体和癌症患者中生成短尾畸形特异性T细胞系(Palena et al.,2007,Clin.Cancer Res.13(8):2471-2478)。Fernando等的研究显示，短尾畸形促进人肿瘤细胞中的上皮细胞-间充质转化(EMT)，赋予肿瘤细胞间充质表型，以及迁移和侵袭能力，同时减弱肿瘤细胞周期进展(Fernando et al.,2010,
J.Clin.Invest.120(2):533-544)。相应地，短尾畸形参与了癌症的转移性进展。
[0013] 癌症在全世界是主要的致死原因，开发有效的癌症一直是最活跃的研究和临床开发领域之一。虽然已提出了各种癌症治疗和预防的创新方法，许多癌症仍然有高的死亡率，并且可能难以治疗或者对传统疗法比较没有响应。与短尾畸形表达相关的癌症可见于包括乳房、小肠、胃、肾、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、肺、结肠和前列腺的多种组织，包括转移性和晚期癌症。此外，短尾畸形在B细胞起源的肿瘤中表达，比如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、Epstein-Barr病毒转化的B细胞、伯基特氏(Burkitt’s)和霍奇金淋巴瘤。因此，短尾畸形似乎在许多人类癌症中有作用。虽然短尾畸形曾被提议作为癌症免疫疗法的目标(参见例如，Palena et al.,同前，Fernando et al.，同前和WO2008/106551)，由于它是较新的一种癌症目标，本领域仍然需要新的免疫治疗产物能够有效地治疗和/或防止与短尾畸形表达或过表达关联的癌症。
[0014] 发明概述
[0015] 发明的一个实施方案涉及在患有癌症的个体中减少、遏制、逆转、延迟或防止癌症的转移性进展的方法。所述方法包括给予正在发生转移性进展、有转移性进展风险、或者预期会开始转移性进展的患有癌症的个体免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含(a)酵母媒介物；和(b)含有至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。发明的另一个实施方案涉及免疫治疗组合物在患有癌症的个体中减少、遏制、逆转、延迟或防止癌症的转移性进展中的用途，所述免疫治疗组合物包含酵母媒介物和含有至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。
[0016] 在发明这些实施方案的一个方面中，首次给予组合物时，个体的癌症中还检测不到短尾畸形。在一个方面中，首次给予组合物时，个体的癌症中检测到了短尾畸形。个体可能患有I期癌症、II期癌症、III期癌症或IV期癌症。
[0017] 发明的另一个实施方案涉及防止或延迟表达短尾畸形的癌症的发病。方法包括给予个体免疫治疗组合物的步骤，所述组合物包含(a)酵母媒介物；和(b)含有至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。发明的另一个实施方案涉及免疫治疗组合物在防止或延迟表达短尾畸形的癌症中的用途，所述组合物包含酵母媒介物和含有至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。
[0018] 在这些实施方案的一个方面中，个体中还未检测到癌症。在一个方面中，个体有高风险发生癌症(例如，经由遗传倾向性)。在一个方面中，个体患有癌前病变。
[0019] 在这些实施方案的一个方面中，个体患有癌症，但是癌症中还未检测到表达短尾畸形的癌细胞。在一个方面中，癌症还没有转移。在一个方面中，癌症有高风险发生转移。在一个方面中，受试对象患有I期癌症。在一个方面中，受试对象患有II期癌症。
[0020] 发明的另一个实施方案涉及减少或防止癌症患者中肿瘤细胞的化疗抗性或放疗抗性。方法包括给予患有癌症并正在接受化疗和/或放疗的患者免疫治疗组合物的步骤，所述免疫治疗组合物包含(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种短尾畸形抗原的癌抗原。发明的另一个实施方案涉及包含酵母媒介物和含有至少一个短尾畸形抗原的癌抗原的免疫治
疗组合物在减少或防止癌症患者中肿瘤细胞的化疗抗性或放疗抗性中的用途。在发明该实施方案的一个方面中，首次给予组合物时，个体的癌症中还检测不到短尾畸形。在一个方面中，首次给予组合物时，个体的癌症中检测到了短尾畸形。
疗组合物在减少或防止癌症患者中肿瘤细胞的化疗抗性或放疗抗性中的用途。在发明该实施方案的一个方面中，首次给予组合物时，个体的癌症中还检测不到短尾畸形。在一个方面中，首次给予组合物时，个体的癌症中检测到了短尾畸形。
[0021] 发明的再一个实施方案涉及癌症的治疗方法。所述方法包括步骤(a)给予个体第一免疫治疗组合物，所述个体患有还未检测到短尾畸形表达的癌症，所述第一免疫治疗组合物包含酵母媒介物和不包括短尾畸形抗原的第一癌抗原；和(b)给予个体第一免疫治疗组合物之前、同时或者顺序或者随后给予第二免疫治疗组合物，后者包含酵母媒介物和包括短尾畸形抗原的第二癌抗原。在一个方面中，方法在步骤(a)中还包括给予一或多个其他免疫治疗组合物，其中所述一或多个其他免疫治疗组合物中的任一个包含另外的癌抗原。
在以上任何一个实施方案的一个方面中，所述癌抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、MUC-
1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤样息肉(adenomatous polyposis coli,APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白
(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素和NGEP。在一个方面中，癌抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)和MUC-1。发明的另一个实施方案涉及免疫治疗组合物在癌症治疗中的组合使
用，所述免疫治疗组合物包含：(a)第一免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和不含有短尾畸形抗原的第一癌抗原；和(b)第二免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和含有短尾畸形抗原的第二癌抗原。
在以上任何一个实施方案的一个方面中，所述癌抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、MUC-
1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤样息肉(adenomatous polyposis coli,APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白
(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素和NGEP。在一个方面中，癌抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)和MUC-1。发明的另一个实施方案涉及免疫治疗组合物在癌症治疗中的组合使
用，所述免疫治疗组合物包含：(a)第一免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和不含有短尾畸形抗原的第一癌抗原；和(b)第二免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和含有短尾畸形抗原的第二癌抗原。
[0022] 发明的再一个实施方案涉及治疗癌症的方法。所述方法包括步骤(a)给予患有癌症的个体第一免疫治疗组合物，所述第一免疫治疗组合物包含酵母媒介物和突变的Ras抗原；(b)给予(a)中的个体第二免疫治疗组合物，所述第二免疫治疗组合物包含酵母媒介物和选自癌胚抗原(CEA)和粘蛋白-1(MUC-1)的抗原；和(c)给予(a)和(b)中的个体第三免疫治疗组合物，所述第三免疫治疗组合物包含酵母媒介物和短尾畸形抗原。在一个方面中，(a)、(b)和(c)中的给药步骤是同时的。发明的另一个实施方案涉及使用免疫治疗组合物组合来治疗癌症，所述免疫治疗组合物包含：(a)第一免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和突变的Ras抗原；(b)第二免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和选自癌胚抗原(CEA)和粘蛋白-1(MUC-1)的抗原；和(c)第三免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和短尾畸形抗原。
[0023] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，对于个体患有癌症或者癌前病变的情况，在发明的一个方面中，个体正接受或者已经接受另一种癌症疗法。例如这类疗法可以包括，但不限于化疗、靶向癌症疗法、放疗、适应性T细胞转移和/或给予一或多种其他免疫治疗组合物。在一个方面中，所述其他免疫治疗组合物包含酵母媒介物和不包括短尾畸形抗原的第二癌抗原。所述第二癌抗原可以包括，但不限于突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤样息肉(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素和NGEP。在一个方面中，第二癌抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)和MUC-1。
[0024] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，方法或者用途减少了个体中的肿瘤负荷、提高个体存活率和/或抑制个体中的肿瘤生长。
[0025] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，方法还包括从个体手术切除肿瘤。
[0026] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，癌症是上皮细胞起源的。在一个方面中，癌症可以包括，但不限于乳腺癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、Epstein-Barr病毒转化的B细胞、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或者它们的转移癌症。
[0027] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，短尾畸形抗原是全长人短尾畸形。在一个方面中，短尾畸形抗原不是全长短尾畸形。
在一个方面中，短尾畸形抗原具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。
在一个方面中，短尾畸形抗原包含从SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少位点1或2到位点255和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含从SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少位点1或2到位点430和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的位点246-254。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点2-435，或者与SEQ ID NO:6至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:2的位点2-435，或者与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点2-435，或者与SEQ ID NO:6至少
99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的位点2-435，或者与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，癌抗原的长度是至少25个氨基酸。在一个方面中，短尾畸形抗原的长度是25个氨基酸。在一个方面中，短尾畸形抗原的长度超过30个氨基酸。在一个方面中，癌抗原包含两个或更多个短尾畸形免疫原性结构域。
在一个方面中，短尾畸形抗原具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。
在一个方面中，短尾畸形抗原包含从SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少位点1或2到位点255和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含从SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少位点1或2到位点430和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的位点246-254。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点2-435，或者与SEQ ID NO:6至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:2的位点2-435，或者与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点2-435，或者与SEQ ID NO:6至少
99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的位点2-435，或者与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，癌抗原的长度是至少25个氨基酸。在一个方面中，短尾畸形抗原的长度是25个氨基酸。在一个方面中，短尾畸形抗原的长度超过30个氨基酸。在一个方面中，癌抗原包含两个或更多个短尾畸形免疫原性结构域。
[0028] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，癌抗原是融合蛋白。在一个方面中，所述融合蛋白具有SEQID NO:8所代表的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:8至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，融合蛋白具有SEQ ID NO:20所代表的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:20至少95%相同的氨基酸序列。
[0029] 发明的另一个实施方案涉及酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，其中所述免疫治疗组合物包含：(a)酵母媒介物；和(b)由酵母媒介物表达的抗原并且包含至少一个短尾畸形抗原，其中短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列中的30个以上的氨基酸。在一个方面中，短尾畸形抗原包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含从SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少位点1或2到位点255和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含从SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少位点1或2到位点430和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的位点246-254。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点
2-435，或者与SEQ ID NO:6至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的位点2-435，或者与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点2-435，或者与SEQ ID NO:6至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的位点2-
435，或者与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，癌抗原是融合蛋白。在一个方面中，融合蛋白具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:8至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，融合蛋白具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:
20至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，酵母媒介物是完整酵母。在一个方面中，完整酵母是热灭活的。
2-435，或者与SEQ ID NO:6至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的位点2-435，或者与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的位点2-435，或者与SEQ ID NO:6至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的位点2-435，或者与SEQ ID NO:18至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的位点2-
435，或者与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面中，癌抗原是融合蛋白。在一个方面中，融合蛋白具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:8至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，融合蛋白具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:
20至少95%相同的氨基酸序列。在一个方面中，酵母媒介物是完整酵母。在一个方面中，完整酵母是热灭活的。
[0030] 发明的再一个实施方案涉及酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，所述组合物包含:(a)完整的灭活酵母；和(b)短尾畸形融合蛋白，其包含SEQ ID NO:6的位点2-435的氨基酸序列。短尾畸形融合蛋白的表达处于启动子CUP1的控制下，酵母表达短尾畸形融合蛋白，并且组合物引发短尾畸形特异性T细胞反应。在一个方面中，融合蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
[0031] 发明的再一个实施方案涉及酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，所述组合物包含:(a)完整的灭活酵母；和(b)短尾畸形融合蛋白，其包含SEQ ID NO:18的位点2-435的氨基酸序列。短尾畸形融合蛋白的表达处于启动子CUP1的控制下，酵母表达短尾畸形融合蛋白，并且组合物引发短尾畸形特异性T细胞反应。在一个方面中，融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
[0032] 在以上或者文中其他地方描述的发明任何实施方案的一个方面中或者发明的方面中，酵母媒介物是完整酵母。在一个方面中，所述完整酵母被杀死。在一个方面中，完整酵母被热灭活。在一个方面中，酵母表达抗原。在一个方面中，酵母选自下述的属：糖酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属。在一个方面中，酵母来自糖酵母属。在一个方面中，酵母来自酿酒酵母。
[0033] 在以上或者文中其他地方描述的本发明任何实施方案的一个方面中，组合物在药学上可接受的赋形剂中成剂以便给予受试对象。
[0034] 发明的再一个实施方案涉及文中描述的任何酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在治疗疾病中的用途。在一个方面中，所述疾病是癌症。在一个方面中，疾病与传染原关联。在一个方面中，疾病与病毒或病毒感染关联。这类病毒包括，但不限于Epstein Barr病毒(EBV)。
[0035] 发明的另一个实施方案涉及治疗或防止与Epstein Barr病毒(EBV)感染相关的疾病或状况的方法。所述方法包括将本文描述的任何酵母-短尾畸形免疫治疗组合物给予个体的步骤。
[0036] 发明的再一个实施方案涉及产生酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的方法。所述方法包括步骤(a)在不含CuSO4的合适培养基中培养酵母直至酵母达到对数生长中期，所述酵母转化了在CUP1启动子控制下的编码短尾畸形抗原的重组核酸分子；(b)通过向培养基中加入CuSO4诱导酵母中的短尾畸形抗原表达；(c)在步骤(b)后将酵母培养最多6-8小时；和(d)收集酵母。在一个方面中，酵母在步骤(a)中被培养到细胞密度在每毫升总培养物体积
1.0和2.0Y.U.之间。在一个方面中，酵母在步骤(a)中被培养到细胞密度在每毫升总培养物体积1.0和1.5Y.U.之间。在一个方面中，酵母在步骤(a)-(c)中被培养在pH维持在pH5.5或更高的培养基中。在一个方面中，方法还包括在步骤(d)后将酵母热灭活。在一个方面中，酵母被在大约56℃热灭活约1小时。在该实施方案的再一个方面中，酵母可以与药学上可接受的赋形剂配制用于注射。在一个方面中，酵母来自糖酵母属。在一个方面中，酵母来自酿酒酵母。
1.0和2.0Y.U.之间。在一个方面中，酵母在步骤(a)中被培养到细胞密度在每毫升总培养物体积1.0和1.5Y.U.之间。在一个方面中，酵母在步骤(a)-(c)中被培养在pH维持在pH5.5或更高的培养基中。在一个方面中，方法还包括在步骤(d)后将酵母热灭活。在一个方面中，酵母被在大约56℃热灭活约1小时。在该实施方案的再一个方面中，酵母可以与药学上可接受的赋形剂配制用于注射。在一个方面中，酵母来自糖酵母属。在一个方面中，酵母来自酿酒酵母。
[0038] 图1A的Western印迹数字图像显示了利用抗短尾畸形检测的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物中的短尾畸形表达，使用了U2和UL2培养基。
[0039] 图1B的Western印迹数字图像显示了利用抗His检测的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物中的短尾畸形表达，使用了U2和UL2培养基。
[0040] 图2的Western印迹数字图像显示了酵母-短尾畸形免疫治疗组合物中的短尾畸形表达，其中抗原诱导时的细胞密度和抗原诱导后的收集时间各不相同
[0041] 图3A-3C的图形显示了来自三个健康供体中的两个的外周血单核细胞(PBMCs)用酵母-短尾畸形脉冲刺激两轮，然后用短尾畸形CTL肽脉冲，能够产生可以杀死SW480癌细胞的CD8+CTLs(HLA-A2阳性/短尾畸形高)，对MCF7癌有最小裂解(HLA-A2阳性/短尾畸形低)；
(图3A，供体07706；图3B，供体17663；图3C，供体26532)。
(图3A，供体07706；图3B，供体17663；图3C，供体26532)。
[0042] 图4A的图形显示用酵母-短尾畸形免疫治疗组合物刺激过的来自健康供体PBMCs的短尾畸形特异性T细胞可以特异性裂解含有合适MHC的肿瘤细胞(SW480，HLA-A2阳性/短尾畸形高)相对H226癌细胞(HLA-A2阴性/短尾畸形高)。
[0043] 图4B的图形显示，图4A所示试验中使用的SW480和H226肿瘤细胞中短尾畸形mRNA相对对照基因(GAPDH)mRNA的表达。
[0044] 图5的图形显示从用酵母-短尾畸形(GI-6301，圆圈)或对照酵母(酵母对照，三角形)疫苗接种的小鼠的肾分离的CD4+T细胞，在应答指定剂量纯化短尾畸形蛋白或对照β-gal蛋白时的增殖情况。
[0045] 图6的图形显示，与仅接受酵母(没有短尾畸形抗原)的小鼠相比，给予本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(GI-6301，圆圈)表现出减少小鼠中表达短尾畸形的肿瘤的趋势。
[0046] 图7A和7B的流式细胞术分析显示了短尾畸形特异性T细胞系T-2-BR-A结合短尾畸形特异性HLA-A2四聚体(图7B)，但不结合对照四聚体(图7A)。
[0047] 图8的流式细胞术分析显示了短尾畸形特异性T细胞系T-2-BR-A在用短尾畸形激动剂肽脉冲的自体B细胞刺激后，穿孔素的表达。
[0048] 发明详述
[0049] 本发明一般地涉及用于防止和/或治疗表达或过表达短尾畸形的癌症的基于酵母的免疫治疗组合物和方法。发明包括包含酵母媒介物和短尾畸形抗原或其免疫原性结构域的基于酵母的免疫治疗组合物(又称为基于酵母的免疫疗法)的用途(文中又称为“酵母-短尾畸形免疫疗法”或“酵母-短尾畸形免疫治疗组合物”)。发明人在本文中描述了新的酵母-短尾畸形免疫治疗产物的构建和产生，显示了酵母-短尾畸形免疫疗法扩增了来自正常个体和来自癌症患者的短尾畸形特异性T细胞，包括CD8+CTLs。此外，用酵母-短尾畸形免疫治疗组合物免疫的小鼠在体内产生了短尾畸形特异性T细胞反应，这些小鼠中的表达短尾畸形的肿瘤的生长被抑制。总得来说，文中给出的数据显示酵母-短尾畸形免疫疗法可以用于引发短尾畸形特异性细胞免疫反应(CD4+和CD8+)和表达短尾畸形的肿瘤的防止和治疗，提供了防止和/或治疗转移性癌症和相关状况的新的疗法。
[0050] 可用于本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物由于几个原因独特地适应有效靶向表达短尾畸形的癌症。首先，短尾畸形参与EMT过程，因此不希望受到理论约束，发明人相信它在晚期肿瘤和转移过程中发挥作为。相应地，在发明的一个方面中，酵母-短尾畸形免疫疗法能够在肿瘤细胞开始获得活动性和侵袭其他组织之前或者过程中有效地靶向治疗
细胞，从而防止、抑制、遏制、逆转或延迟转移癌的发病和/或癌症(特别是转移性癌症)的进展。对晚期癌症，特别是转移性癌症的有效疗法有极大的需求，这类癌症在传统癌症疗法失败后治疗选择很少。酵母-短尾畸形提供了一种治疗这类癌症、或者延迟、抑制、逆转或完全防止它们的新方法。此外，酵母-短尾畸形免疫疗法可以用于防止或延迟患有早期癌症的个体中的转移性癌症或癌症进展。在一个实施方案中，疗法可用于具有高转移进展率的癌症，并且可能用于遏制癌症的进展。而且，酵母-短尾畸形免疫疗法可用于患有癌前
(precancerous或premalignant)病变或肿瘤的个体，有高风险发生癌症(特别是高转移率的癌症)的个体，甚至是在正常个体中作为癌症防范的预防性药剂，可以与其他的预防性癌症免疫疗法(比如文中描述的)结合使用。
细胞，从而防止、抑制、遏制、逆转或延迟转移癌的发病和/或癌症(特别是转移性癌症)的进展。对晚期癌症，特别是转移性癌症的有效疗法有极大的需求，这类癌症在传统癌症疗法失败后治疗选择很少。酵母-短尾畸形提供了一种治疗这类癌症、或者延迟、抑制、逆转或完全防止它们的新方法。此外，酵母-短尾畸形免疫疗法可以用于防止或延迟患有早期癌症的个体中的转移性癌症或癌症进展。在一个实施方案中，疗法可用于具有高转移进展率的癌症，并且可能用于遏制癌症的进展。而且，酵母-短尾畸形免疫疗法可用于患有癌前
(precancerous或premalignant)病变或肿瘤的个体，有高风险发生癌症(特别是高转移率的癌症)的个体，甚至是在正常个体中作为癌症防范的预防性药剂，可以与其他的预防性癌症免疫疗法(比如文中描述的)结合使用。
[0051] 酵母-短尾畸形免疫疗法还给正在进行其他癌症疗法(包括化疗和放疗)的个体提供好处。更具体地说，转移性癌症已知在一些病例中比原发性癌症对化疗和/或放疗抗性更高。因此，本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以用于通过抑制癌症中的短尾畸形表达(从而抑制抗增殖效应)，抑制或减少或消除转移性癌症中可能发生的化疗抗性或放疗抗性，并且发明的组合物可以增强化疗或放疗在个体中的表现。
[0052] 酵母-短尾畸形免疫疗法还可以用于治疗与短尾畸形表达相关的状况或疾病，这些状况或疾病可能本身是非肿瘤性的，或者可能在恶性转化之前发生。例如，在感染了传染原(例如诸如Epstein Barr病毒(EBV)的病毒)的细胞中短尾畸形被上调。相应地，酵母-短尾畸形免疫疗法可以用于治疗或防止与短尾畸形表达相关的任何疾病或状况，包括但不限于感染性疾病，比如病毒感染，包括但不限于EBV相关的状况(例如，单核细胞增多)。
[0053] 酵母-短尾畸形免疫疗法还可以适应在相同酵母组合物中使用其他肿瘤抗原、或者与靶向其他肿瘤抗原的其他基于酵母的免疫治疗剂(顺序或同时)，或者其他癌症免疫治疗剂和治疗/疗法组合使用。相应地，可以针对癌症类型、癌症阶段、癌症级别、肿瘤所表达的抗原和个体的整体医学状态来调适酵母-短尾畸形免疫疗法(即疗法可以容易地个性
化)，对于已经患有癌症的个体，随着个体中癌症的进展可以进行改动以便提供对各个肿瘤阶段的最大效力。酵母-短尾畸形免疫疗法提供了一个机会来设计广泛应用于多种癌症的预防性和/或治疗性处置的复杂和有效的个体化方法。
化)，对于已经患有癌症的个体，随着个体中癌症的进展可以进行改动以便提供对各个肿瘤阶段的最大效力。酵母-短尾畸形免疫疗法提供了一个机会来设计广泛应用于多种癌症的预防性和/或治疗性处置的复杂和有效的个体化方法。
[0054] 本文描述的酵母-短尾畸形组合物诱发抗目标抗原(短尾畸形)的先天免疫反应，以及适应性免疫反应，包括CD4依赖性TH17和TH1T细胞反应和抗原特异性CD8+T细胞反应，包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，都不需要使用会带来毒性问题的外源佐剂、细胞因子或其他免疫刺激分子。此外，酵母-短尾畸形免疫治疗组合物抑制调节性T细胞(Treg)的数量和/或功能，从而例如增强正常情况下会被肿瘤的存在所抑制的效应性T细胞反应。而且，与通过生成抗体反应来免疫的免疫治疗组合物相比，相信酵母-短尾畸形免疫疗法所引发的抗原特异性、广泛的强力细胞免疫反应在靶向肿瘤细胞方面特别有效。的确，大量研究显示当经由CD8+CTLs(在I型MHC分子的情况中识别肿瘤肽)靶向肿瘤细胞时，免疫治疗方法的效果得到强化。
[0055] 酵母-短尾畸形免疫疗法即使在面临可能是抑制性的环境，也非常善于激活抗原呈递细胞，具有独特的交叉引发免疫反应的能力，能够生成通常可以有效抗肿瘤的CD8+CTL反应。因为这类免疫疗法利用了抗原呈递细胞的天然本领来呈递相关免疫原，不需要知道CTL表位或者短尾畸形II型MHC表位的确切身份来产生有效的发明所述免疫治疗剂。事实
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上，单个酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以靶向多重CD4 和CD8T细胞表位，因此发明的酵母-短尾畸形免疫治疗剂不限于使用短肽，事实上，在这些组合物中使用较长的多肽和融合蛋白是有效的。相应地，通过使用酵母-短尾畸形免疫疗法可以取消使用算法和复杂的公式来鉴定推断的T细胞表位。
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上，单个酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以靶向多重CD4 和CD8T细胞表位，因此发明的酵母-短尾畸形免疫治疗剂不限于使用短肽，事实上，在这些组合物中使用较长的多肽和融合蛋白是有效的。相应地，通过使用酵母-短尾畸形免疫疗法可以取消使用算法和复杂的公式来鉴定推断的T细胞表位。
[0056] 并且，因为短尾畸形在多数正常(无肿瘤)组织中不表达，而一般在肿瘤细胞中过表达，不需要担心与正常组织有关的任何“脱靶”效应。正如以上提到的，酵母-短尾畸形可以在不使用外源佐剂、免疫刺激剂或分子、共刺激分子或者细胞因子的情况下有效地用于免疫方案(预防性或治疗性)，虽然如果需要可以包含这些试剂。此外，酵母-短尾畸形免疫疗法可以反复给予而不失去效果，而这对其他类型的免疫疗法可能是个问题。
[0057] 本发明的组合物
[0058] 本发明的一个实施方案涉及基于酵母的免疫治疗组合物，所述组合物可以用于防止和/或治疗以短尾畸形表达或过表达为特征的癌症(包括那些开始可能不含有表达可检测水平短尾畸形的细胞的癌症，但在癌症发展后期可能或者会含有表达短尾畸形的细胞)。
组合物是酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，包含:(a)酵母媒介物；和(b)癌抗原，其包含一或多个短尾畸形抗原和/或其免疫原性结构域。短尾畸形抗原或其免疫原性结构域最常见是由酵母媒介物表达为重组蛋白(例如，由完整酵母或者酵母原生质球，任选进一步加工为酵母胞质体、酵母ghost，或者酵母膜提取物或其组分)，虽然本发明的实施方案也包括将一或多个短尾畸形抗原装载到酵母媒介物中，或者象文中描述的以其他方式与酵母媒介物复
合、附着或混合或共同施用，从而形成本发明的组合物。
组合物是酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，包含:(a)酵母媒介物；和(b)癌抗原，其包含一或多个短尾畸形抗原和/或其免疫原性结构域。短尾畸形抗原或其免疫原性结构域最常见是由酵母媒介物表达为重组蛋白(例如，由完整酵母或者酵母原生质球，任选进一步加工为酵母胞质体、酵母ghost，或者酵母膜提取物或其组分)，虽然本发明的实施方案也包括将一或多个短尾畸形抗原装载到酵母媒介物中，或者象文中描述的以其他方式与酵母媒介物复
合、附着或混合或共同施用，从而形成本发明的组合物。
[0059] “酵母-短尾畸形免疫治疗组合物”是含有至少一个短尾畸形抗原或其免疫原性结构域的特定类型的“基于酵母的免疫治疗组合物”。短语“基于酵母的免疫治疗组合物”可以与“基于酵母的免疫治疗产物”、“基于酵母的免疫治疗组合物”、“基于酵母的组合物”、“基于酵母的免疫治疗剂”、“基于酵母的疫苗”或者这些短语的派生形式交换使用。“免疫治疗组合物”是能够在受试对象中引发免疫反应，实现至少一个治疗好处的组合物。用于本文，基于酵母的免疫治疗组合物是指包含酵母媒介物成分并且在受试对象中引发能实现至少一个治疗好处的免疫反应的组合物。更具体地说，基于酵母的免疫治疗组合物是这样的组合物，所述组合物包含酵母媒介物成分，通常还有抗原成分，可以引发或诱发免疫反应，比如细胞免疫反应，包括但不限于T细胞介导的细胞免疫反应。在一个方面中，可以用于发明的基于酵母的免疫治疗组合物能够诱发CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫反应，并且在一个方面中，特别是抗目标抗原(例如癌抗原)的CD8+和CD4+T细胞介导的免疫反应。CD4+免疫反应可以包括TH1免疫反应、TH2免疫反应、TH17免疫反应或者以上的任意组合。基于酵母的免疫治疗剂尤其能够生成TH1和TH17反应。CD8+免疫反应可以包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，基于酵母的没有治疗剂能够生成这样的反应。在一个方面中，基于酵母的免疫治疗组合物调理受试对象中调节性T细胞(Tregs)的数量和/或功能。还可以通过例如添加细胞因子、抗体和/或调理酵母的生产过程来改造基于酵母的免疫疗法，从而促进一类反应超过另一类。任选地，基于酵母的免疫治疗组合物能够引发体液免疫反应。
[0060] 本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以是“预防性的”或者“治疗性的”。当提供用于预防目的时，本发明的组合物是在发展或者检测到发展表达短尾畸形的癌症之前提供的，目的是防止、抑制或延迟表达短尾畸形的肿瘤的发展；和/或防止、抑制或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭其他组织(转移)和/或整体防止或抑制个体中的癌症。正如文中讨论的，短尾畸形在几种癌症中均有表达，包括晚期癌症，并且已被证实参与EMT过程，所述EMT过程是与比如转移癌中肿瘤的侵袭和迁移有关的过程。因此，可以将预防性组合物给予似乎未患癌症的个体(健康或正常的个体)、癌前(pre-cancerous或pre-malignant)病变的个体，以及患有癌症但还没有检测到短尾畸形的个体(即在癌症中的肿瘤细胞表达短尾畸形之前)。可以用本发明的组合物预防性处置那些有高风险发展出癌症，尤其是往往与短尾畸形表达和/或转移关联的癌症的个体。当提供用于治疗目的时，免疫治疗组合物是提供给患有表达短尾畸形的癌症的个体的，目的是通过比如减少个体中的肿瘤负荷缓解癌症；抑制个体中的肿瘤生长；提高个体的存活率；防止、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭其他组织(转移性癌症)和/或防止、抑制、逆转或延迟个体中的癌症的进展。在一个方面中，酵母-短尾畸形免疫疗法被用于治疗性用途，通过抑制癌症中的短尾畸形表达从而抑制、减少或消除转移性癌症中可能发生的化疗抗性或放疗抗性，发明的组合物可以提高化疗或放疗在个体中的表现。
[0061] 一般来说，酵母-短尾畸形免疫治疗组合物包含酵母媒介物和含有短尾畸形抗原或其免疫原性结构域的至少一个癌抗原，其中癌抗原是由酵母媒介物表达的、附着在酵母媒介物上的或者与酵母媒介物混合的。在一些实施方案中，癌抗原、短尾畸形抗原或其免疫原性结构域被提供为融合蛋白。以下描述了适合在本发明的组合物和方法中使用的几个短尾畸形蛋白和融合蛋白。在一些实施方案中，癌抗原和短尾畸形抗原是相同的组成成分。在一些实施方案中，癌抗原包含其他抗原，除了短尾畸形抗原还包括其他癌抗原。在发明的一个方面中，作为癌抗原使用的融合蛋白可以包含两个或更多个抗原，例如短尾畸形抗原和另一个不是短尾畸形抗原的癌抗原，或者两个不同的短尾畸形抗原。在一个方面中，融合蛋白可以包含一或多个抗原的两个或更多个免疫原性结构域，比如短尾畸形抗原的两个或更多个免疫原性结构域，或者一或多个抗原的两个或更多个表位，比如短尾畸形抗原的两个或更多个表位。
[0062] 根据本发明，用于酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的酵母媒介物是任何酵母细胞(例如整个或完整细胞)或其衍生物(见下文)，可以与一或多个抗原、期免疫原性结构域或其表位在发明的组合物(例如治疗或预防性组合物)中联用。因此酵母媒介物可以包括，但不限于活的完整(整个)酵母微生物(即具有包括细胞壁在内的所有成分的酵母细胞)、被杀死(死的)或者灭活的完整酵母微生物，或者完整酵母的衍生物，包括:原生质球(即缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞)、酵母ghost(即缺少细胞壁、细胞核和细胞质的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其组分(又被称为酵母膜颗粒，以前被称为亚细胞酵母颗粒)、任何其他酵母颗粒或者酵母细胞壁制备物。
[0063] 酵母原生质球通常是通过对酵母细胞壁进行酶解产生的。这类方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
[0064] 酵母胞质体通常是通过酵母细胞去核仁产生的。这类方法在例如Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
[0065] 酵母空胞(ghosts)通常是通过将发生通透化或者裂解的细胞重新密封产生的，可以但不必须含有该细胞的至少部分细胞器。这类方法在例如Franzusoff et al.,1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614和Bussey et al.,1979,Biochim.Biophys.Acta553,185-196中有描述，每个文献都通过引用全部并入本文。
[0066] 酵母膜颗粒(亚细胞酵母膜提取物或其组分)是指缺少天然细胞核或细胞质的酵母膜。颗粒可以是任何大小，大小的范围包括从天然酵母膜到通过超声处理或其他本领域技术人员已知的膜破碎方法产生的微颗粒，然后重新密封。产生亚细胞酵母膜提取物的方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述。还可以使用含有酵母膜部分的酵母膜颗粒组分，以及如果抗原或其他蛋白是在制备酵母膜颗粒之前由酵母重组表达的，可以使用抗原或其他目标蛋白。抗原或其他目标蛋白可以被运送到膜内，或者膜表面或者它们的组合(即，蛋白可以是膜内或者膜外的，和/或跨酵母膜颗粒的膜)。在一个实施方案中，酵母膜颗粒是重组酵母膜颗粒，所述重组酵母膜颗粒可以是完整的、破碎的或者破碎并重新密封的酵母膜，所述酵母膜包含位于膜表面或者至少部分镶嵌在膜内的至少一个所需抗原或其他目标蛋白。
[0067] 酵母细胞壁制备物的一个例子是带有抗原的分离酵母细胞壁制品，所述抗原在细胞壁表面或者至少部分嵌在细胞壁内，这样将所述酵母细胞壁制备物给予动物时，会刺激抗疾病目标的所需免疫反应。
[0068] 可以使用任何酵母株来产生本发明的酵母媒介物。酵母是单细胞微生物，属于以下三类之一:子囊菌纲、担子菌纲或半知菌纲。选择作为免疫调节剂的酵母的类型时一个考虑是酵母的病原性。在一个实施方案中，酵母是诸如酿酒酵母的非致病菌株。选择非致病酵母菌株最小化了带给被给予酵母媒介物的个体的任何不良效应。但是，如果酵母的致病性可以通过本领域技术人员已知的任何手段(例如突变菌株)抵消，则可以使用致病酵母。根据本发明的一个方面，使用的是非致病性酵母株。
[0069] 可以用于本发明的酵母菌株的属包括，但不限于糖酵母属、假丝酵母属(有可能是病原性的)、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属。在一个方面中，酵母的属选自糖酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属；并且在一个方面中，使用了糖酵母属。可以用于本发明的酵母株的种包括，但不限于酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假丝酵母、克菲假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母、罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌、异常汉逊酵母、多形汉逊酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母马克斯变种、巴斯德毕赤酵母、深红酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母。应当理解，这些种中有许多包括多种亚种、型、亚型等，它们都是意图包括在以上提到的种中的。在一个方面中，用于发明的酵母种包括酿酒酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。酿酒酵母很有用因为它相对容易操作，并且对于作为食品添加剂被“通常认为是安全的”或"GRAS"(GRAS,FDA proposed Rule62FR18938,April17,1997)。本发明的一个实施方案是能够将质粒复制到特别高拷贝数的酵母株，比如酿酒酵母cir°株。该酿酒酵母株是这样的菌株，所述菌株能够支持高水平表达一或多个目标抗原和/或抗原融合蛋白和/或其他蛋白的表达载体。可以用于本发明的另一个酵母株是酿酒酵母W303α。此外，本发明中可以使用任何突变酵母株，包括那些表现出对所表达的目标抗原或其他蛋白的翻译后修饰减少(比如延伸N端连接糖基化的酶发生突变)的菌株。
[0070] 发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物包含至少一个包括短尾畸形抗原的癌抗原。根据本发明，本文中术语“抗原”的一般使用是指蛋白的任何部分(例如，肽、部分蛋白、全长蛋白)，其中所述蛋白对于细胞组成(完整细胞、细胞裂解物或破碎的细胞)、生物体(完整生物体、裂解物或破碎的细胞)、或者碳水化合物或者其他分子或者它们的部分来说是自然存在的或者合成来源或设计的。抗原可以引发针对与免疫系统组成成分(例如，T细胞、抗体)遇到的相同或相似的抗原的抗原特异性免疫反应(例如，体液和/或细胞介导的免疫反应)。
[0071] 抗原可以小到单个表位、单个免疫原性结构域，或者更大一些，包括多个表位或免疫原性结构域。因此抗原的大小可以只有大约8-11个氨基酸(即，肽)，也可以达到全长蛋白、多聚体、融合蛋白、嵌合蛋白、完整细胞、完整微生物或其任何部分(例如，完整细胞的蛋白片段(多肽)裂解物或者微生物的提取物)。可以用于本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗剂的抗原是肽、多肽、全长蛋白、聚合物、融合蛋白和嵌合蛋白。此外，抗原可以包含碳水化合物，可以被载入酵母媒介物或者本发明的组合物中。可以理解在一些实施方案(例如，当抗原是由酵母媒介物从重组核酸分子表达的)中，抗原是蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白、或者它们的片段，而不是完整的细胞或微生物。在酵母中表达时，如果抗原是要被酵母表达的整个蛋白，抗原处于能在酵母中重组表达的最小体积，通常长度是至少或大于25个氨基酸、或至少或大于26、至少或大于27、至少或大于28、至少或大于29、至少或大于30、至少或大于31、至少或大于32、至少或大于33、至少或大于34、至少或大于35、至少或大于36、至少或大于37、至少或大于38、至少或大于39、至少或大于40、至少或大于41、至少或大于42、至少或大于43、至少或大于44、至少或大于45、至少或大于46、至少或大于47、至少或大于48、至少或大于49或者至少或大于50个氨基酸，或者至少或大于25-50个氨基酸长、至少或大于30-50个氨基酸长、或者至少或大于35-50个氨基酸长、或者至少或大于40-50个氨基酸长、或者至少或大于45-50个氨基酸长，虽然可以表达较小的蛋白，也可以表达颇大的蛋白(例如，长几百个氨基酸，甚至几千个氨基酸)。在一个方面中，可以表达全长蛋白或者N和/或C端缺少1到
20个氨基酸的蛋白。融合蛋白和嵌合蛋白也是本发明可以表达的抗原。“靶抗原”是被本发明的免疫治疗组合物特异靶向的抗原(即，希望引起针对它的免疫反应的抗原)。“癌抗原”是包含至少一个与癌症相关的抗原的抗原，比如肿瘤细胞表达的抗原，从而靶向所述抗原即可靶向癌症。癌抗原可以包含来自一或多个蛋白(包括一或多个肿瘤相关蛋白)的一或多个抗原。“短尾畸形抗原”是由短尾畸形蛋白衍生、设计或生成的抗原。
20个氨基酸的蛋白。融合蛋白和嵌合蛋白也是本发明可以表达的抗原。“靶抗原”是被本发明的免疫治疗组合物特异靶向的抗原(即，希望引起针对它的免疫反应的抗原)。“癌抗原”是包含至少一个与癌症相关的抗原的抗原，比如肿瘤细胞表达的抗原，从而靶向所述抗原即可靶向癌症。癌抗原可以包含来自一或多个蛋白(包括一或多个肿瘤相关蛋白)的一或多个抗原。“短尾畸形抗原”是由短尾畸形蛋白衍生、设计或生成的抗原。
[0072] 提到免疫反应的刺激时，术语“免疫原”是术语“抗原”的子集，因此在一些情况中，可以与术语“抗原”交换使用。用于本文的免疫原描述了能够引发体液和/或细胞介导的免疫反应(即是免疫原性的)的抗原，因此将免疫原给予个体会发动抗原特异性免疫反应，针对与个体免疫系统遭遇的相同或相似的抗原。在一个实施方案中，免疫原引发细胞介导的免疫反应，包括CD4+T细胞反应(例如，TH1,TH2和/或TH17)和/或CD8+T细胞反应(例如，CTL反应)。
[0073] 给定抗原的“免疫原性结构域”可以是抗原中含有至少一个在给予动物时能够作为免疫原的表位的任何部分、片段或表位(例如，肽片段或亚基或抗体表位或其他构象表位)。因此，免疫原性结构域大于单个氨基酸，大小要至少足够含有可以作为免疫原的至少一个表位。例如，单个蛋白可以含有多个不同的免疫原性结构域。免疫原性结构域不需要是蛋白内的线性序列，比如在体液免疫反应的情况中，考虑了构象结构域。
[0074] 表位在本文定义为给定抗原中的单个免疫原性位点，所述免疫原性位点在被提供给免疫系统(对于合适的共刺激信号的情况)和/或免疫系统的活化细胞时足以引发免疫反应。换句话说，表位是抗原中被免疫系统成分识别的部分，还可以被称为抗原决定簇。本领域技术人员可以认识到T细胞表位与B细胞或者抗体表位的大小和组成不同，通过I型MHC途径呈递的表位与通过II型MHC途径呈递的表位在大小和结构特性上不同。例如，通过I型MHC分子呈递的T细胞表位通常长度在8-11氨基酸，而通过II型MHC分子呈递的表位的长度没有太多限制，可以达到25个氨基酸或更长。此外，根据表位结合的特定MHC分子，T细胞表位有预测得到的结构特点。表位可以是线性序列表位或者构象表位(保守结合区)。多数抗体识别构象表位。
[0075] 短尾畸形(还可以被称为“T”)蛋白在多种不同动物物种之间高度保守，是含有“T-box”结构域或“T域”的转录因子，所述“T-box”结构域或“T域”是几种不同蛋白中共有的DNA结合结构域基元，统称为T-box蛋白家族。人短尾畸形在1996年首次被克隆(Edwards et al.，同前)。编码人短尾畸形的一个核苷酸序列在文中以SEQ ID NO:1代表，该序列是从Accession No.NM_003181(GI:19743811)获得的mRNA序列。SEQ ID NO:1
编码435个氨基酸的人短尾畸形蛋白,其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:2表示(还可见于
Accession No.NP_003172；GI:4507339)。
编码435个氨基酸的人短尾畸形蛋白,其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:2表示(还可见于
Accession No.NP_003172；GI:4507339)。
[0076] 本文公开的另一个人短尾畸形蛋白是SEQ ID NO:2所代表的人短尾畸形蛋白的变体，具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。同样是435个氨基酸的蛋白SEQ ID NO:6由SEQ ID NO:5所代表的核苷酸序列编码。SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:2在蛋白全长上大概99%相同。SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:2的不同在位点177(分别是Asp vs.Gly)、位点368(分别是Thr vs.Ser)和位点409(分别是Asn vs.Asp)。
[0077] 本文公开的另一个人短尾畸形蛋白是SEQ NO:2或SEQ ID NO:6所代表的人短尾畸形蛋白的激动剂。作为一般性的用法，“激动剂”是包含但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等的任何化合物或试剂，它们能够结合受体或配体并产生或引发反应，激动剂可以包括模拟或增强那些与受体或配体结合的天然物质的作用的试剂。用于本发明的短尾畸形抗原的语境时，“激动性”抗原或蛋白是指包含至少一个T细胞激动性表位的抗原或蛋白，又被称为“模拟表位(mimotope)”。模拟表位肽是模拟野生型表位的结构的肽，并且作为激动剂，模拟表位可以模拟或增强天然表位的作用(生物学功能)。例如，氨基酸序列SEQ ID NO:12(WLLPGTSTL)是野生型短尾畸形蛋白的T细胞表位。氨基酸序列SEQ ID NO:13
(WLLPGTSTV)是T细胞表位SEQ ID NO:12的模拟表位或激动剂。
(WLLPGTSTV)是T细胞表位SEQ ID NO:12的模拟表位或激动剂。
[0078] 一个人短尾畸形激动性抗原在此以SEQ ID NO:18代表。SEQ ID NO:18是由SEQ ID NO:17所代表的核苷酸序列编码的435个氨基酸的蛋白。除了SEQ ID NO:6位点254的亮氨酸被取代为SEQ ID NO:18中的缬氨酸，SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:6相同。这一取代在SEQ ID NO:18的位点246-254形成一个T细胞激动性表位，不希望受到理论的束缚，但相信该表位与野生型表位(SEQ ID NO:6的位点246-254)相比，能够诱导增强的抗短尾畸形的T细胞反应。
[0079] SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中的任何一个的位点41-223代表人短尾畸形的T-box DNA结合结构域，通过与这些序列的比较，可以容易地鉴定到其他短尾畸形序列，包括来自其他物种的短尾畸形序列中的T-box结构域。用于本文，提到本文描述的或者本领域已知并且用于本发明的任何短尾畸形蛋白的T-box结构域，可以在限定的T-box结构域的N末端和/或C末端(例如在SEQ ID NOs:2、6或18的位点41-223的任何一端)包含短尾畸形序列的另外1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39or40个连续氨基酸。人短尾畸形(包括+ +
这里描述的两个人短尾畸形蛋白)还含有各种CD4 和CD8 T细胞表位。这类表位在例如
WO2008/106551中已有描述，包含位于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的位点246-254的CD8+
CTL表位WLLPGTSTL(文中又被称为Tp2，SEQ ID NO:12)。正如以上讨论的，SEQ ID NO:18包含SEQ ID NO:12的激动性表位，在文中以SEQ ID NO:13代表。
这里描述的两个人短尾畸形蛋白)还含有各种CD4 和CD8 T细胞表位。这类表位在例如
WO2008/106551中已有描述，包含位于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的位点246-254的CD8+
CTL表位WLLPGTSTL(文中又被称为Tp2，SEQ ID NO:12)。正如以上讨论的，SEQ ID NO:18包含SEQ ID NO:12的激动性表位，在文中以SEQ ID NO:13代表。
[0080] 人短尾畸形与来自其他动物物种的短尾畸形有非常高的特异性，因此在制备本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物时可以使用来自其他生物的短尾畸形序列，特别是当这些序列是相同的、基本同源的并且能引发抗目标抗原(例如由肿瘤细胞表达的天然短尾畸形)的有效免疫反应时。例如，小鼠短尾畸形首次由Hermann及其同事在1990年克隆(Hermann et al.,同前)与人短尾畸形在核苷酸水平上大概85%相同，在氨基酸水平上大概
91%相同。就来自其他动物的短尾畸形来说，在氨基酸水平上，人短尾畸形与来自黑猩猩(Pan troglodytes)的短尾畸形99.5%相同，与来自家犬(Canis lupus familiaris)的短尾畸形90.1%相同，与来自野牛(Bos Taurus)的短尾畸形88.5%相同，与来自褐鼠(Rattus
norvegicus)的短尾畸形92.2%相同，与来自原鸡(Gallus gallus)的短尾畸形80.9%相同。
在短尾畸形中含有T-box结构域的氨基酸1-223中，小鼠和人短尾畸形只有两个氨基酸不同(位点26和96)。编码小鼠短尾畸形的核苷酸序列在文中以SEQ ID NO:3代表，它是从
Accession No.NM_009309 (GI:118130357)获得的mRNA序列。SEQ ID NO:3
编码一个436个氨基酸的小鼠短尾畸形蛋白，其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:4代表。SEQ ID NO:4的位点41-223代表小鼠短尾畸形的T-box DNA结合结构域。
91%相同。就来自其他动物的短尾畸形来说，在氨基酸水平上，人短尾畸形与来自黑猩猩(Pan troglodytes)的短尾畸形99.5%相同，与来自家犬(Canis lupus familiaris)的短尾畸形90.1%相同，与来自野牛(Bos Taurus)的短尾畸形88.5%相同，与来自褐鼠(Rattus
norvegicus)的短尾畸形92.2%相同，与来自原鸡(Gallus gallus)的短尾畸形80.9%相同。
在短尾畸形中含有T-box结构域的氨基酸1-223中，小鼠和人短尾畸形只有两个氨基酸不同(位点26和96)。编码小鼠短尾畸形的核苷酸序列在文中以SEQ ID NO:3代表，它是从
Accession No.NM_009309 (GI:118130357)获得的mRNA序列。SEQ ID NO:3
编码一个436个氨基酸的小鼠短尾畸形蛋白，其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:4代表。SEQ ID NO:4的位点41-223代表小鼠短尾畸形的T-box DNA结合结构域。
[0081] 在发明的一个实施方案中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或者它们的至少一个免疫原性结构域所代表的氨基酸序列，或者由它们构成。在一个实施方案中，短尾畸形抗原包含两个、三个、四个、五个或更多个短尾畸形免疫原性结构域，或者由它们构成。在发明的一个实施方案中，短尾畸形抗原包含以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1或2到C端最后25个氨基酸中的一个(即，到SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的位点441-435中的任何一个，或者到SEQ ID NO:4的位点442-436中的任何一个)为代表的氨基酸序列，或者由它们构成。另一个可以用于发明的短尾畸形抗原还包括短尾畸形的至少氨基酸位点1-223(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的位点1-223)或者短尾畸形的位点41-223(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的位点41-223)。
另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1到85到位点255和C端之间。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1到
85到位点430和C端之间。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9或10到位点255和C端之间。
另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1到85到位点255和C端之间。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1到
85到位点430和C端之间。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9或10到位点255和C端之间。
[0082] 根据本发明的任何实施方案，提到“全长”蛋白(或者全长功能结构域或全长免疫结构域)包括象本文描述的或者其他方式已知的或者在已公开序列中描述的所述蛋白或功能结构域或免疫结构域的全长氨基酸序列。“接近全长的”的蛋白或结构域也是蛋白的一种同源物，与全长蛋白或结构域的不同在于在所述全长蛋白或全长结构域的N和/或C端有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的添加或缺失或省略。作为一个例子，文中描述的几个融合蛋白包含“接近全长的”短尾畸形抗原，因为抗原省略了位点1的甲硫氨酸并取代了N端肽。
一般性提及蛋白或结构域或抗原可以包括全长和接近全长的蛋白，以及它们的其他同源
物。
一般性提及蛋白或结构域或抗原可以包括全长和接近全长的蛋白，以及它们的其他同源
物。
[0083] 在任何涉及短尾畸形抗原的实施方案的一个方面中，癌抗原或短尾畸形抗原处于使得抗原能被酵母表达的最小大小。为了在酵母中表达，蛋白通常长度是至少约25个氨基酸，虽然更小的蛋白可以被表达，大得多的蛋白也可以被酵母表达。例如，可以用于本发明的短尾畸形抗原是可以被酵母重组表达的短尾畸形蛋白片段，含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域，可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中任何一个的至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，这样的抗原至少25个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，这样的抗原至少30个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。。在一个方面中，这样的抗原至少25-50个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，这样的抗原至少30-50个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，这样的抗原至少35-50个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，这样的抗原至少40-50个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，这样的抗原至少45-50个氨基酸长，并且含有短尾畸形的至少一个免疫原性结构域。
在一个实施方案中，可以用于本发明的短尾畸形抗原长度是至少25个氨基酸，或者长度是至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、
135、140、145、150、155、160、165、170、175,180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、
230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、
325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、
420、425或者430个氨基酸，可以包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中至少任何这些长度的任何片段。
在一个实施方案中，可以用于本发明的短尾畸形抗原长度是至少25个氨基酸，或者长度是至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、
135、140、145、150、155、160、165、170、175,180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、
230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、
325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、
420、425或者430个氨基酸，可以包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中至少任何这些长度的任何片段。
[0084] 在一个方面中，短尾畸形抗原包含一或多个CTL表位，可能包括文中描述的CTL表位中的任何一个、两个、三个或更多个的两个或以上拷贝。在一个方面中，短尾畸形抗原包含一或多个CD4+T细胞表位。T细胞在一个方面中，短尾畸形抗原包含一或多个CTL表位和一或多个CD4+T细胞表位。在一个方面中，T细胞表位是激动性表位。
[0085] 在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列WLLPGTSTL(SEQ ID NO:12，还被SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的位点245-254代表)。在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列WLLPGTSTV(SEQ ID NO:13,还被SEQ ID NO:18的位点245-254代表)。在一个方面中，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO:13位点4的氨基酸(在这些序列中是脯氨酸或P)被丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代。
[0086] 在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列SQYPSLWSV(SEQ ID NO:14)。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点2的氨基酸(在该序列中是谷氨酰胺或Q)被亮氨酸(L)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点4的氨基酸(在该序列中是脯氨酸或P)被丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或缬氨酸(V)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点7的氨基酸(在该序列中是色氨酸或W)被缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点9的氨基酸(在该序列中是缬氨酸或V)被亮氨酸(L)取代。发明考虑了这样的抗原，所述抗原包含具有SEQ ID NO:14中这些取代的一或多个的任意组合的序列。
[0087] 在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列RLIASWTPV(SEQ ID NO:15)。在一个方面中，SEQ ID NO:15位点1的氨基酸(在该序列中是精氨酸或R)被酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:15位点6的氨基酸(在该序列中是色氨酸或W)被缬氨酸(V)、赖氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代。发明考虑了这样的抗原，所述抗原包含具有SEQ ID NO:15中这些取代的一或多个的任意组合的序列。
[0088] 在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列AMYSFLLDFV(SEQ ID NO:16)。在一个方面中，SEQ ID NO:16位点2的氨基酸(在该序列中是甲硫氨酸或M)被取代为亮氨酸(L)。
[0089] 在发明的一个实施方案中，短尾畸形抗原包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的融合蛋白，基本由其构成，或者由其构成。SEQ ID NO:8的融合蛋白是一个单一多肽，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对在酵母中的蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:8的位点1-6)；(2)由SEQ ID NO:6的氨基酸2-435构成的人短尾畸形抗原(SEQ ID NO:8的位点7-440)；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:8的位点441-446)。氨基酸序列SEQ ID NO:8由多核苷酸序列SEQ ID NO:7编码。
[0090] 在发明的另一个实施方案中，短尾畸形抗原包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的融合蛋白，基本由其构成，或者由其构成。SEQ ID NO:10的融合蛋白是一个单一多肽，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对在酵母中的蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:10的位点1-6)；(2)由SEQ ID NO:4的位点2-435构成的小鼠短尾畸形抗原(SEQ ID NO:10的位点7-441)；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:10的位点442-447)。氨基酸序列SEQ ID NO:10由多核苷酸序列SEQ ID NO:9编码。
[0091] 在发明的另一个实施方案中，短尾畸形抗原包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的融合蛋白，基本由其构成，或者由其构成。SEQ ID NO:20的融合蛋白是一个单一多肽，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对在酵母中的蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:20的位点1-6，该肽序列在文中还被SEQ ID NO:11所代表)；(2)SEQ ID NO:18的氨基酸2-435(SEQ ID NO:20的位点7-440)，SEQ ID NO:18代表全长人短尾畸形激动剂蛋白；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:20的位点441-446)。激动性表位(SEQ ID NO:13)位于SEQ ID NO：20的位点251-259(SEQ ID NO:18的位点246-254)。氨基酸序列SEQ ID NO:20由多核苷酸序列SEQ ID NO:19编码。
[0092] 可用于本发明的短尾畸形抗原还包括这样的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列与文中描述的任何短尾畸形蛋白或抗原的氨基酸序列在蛋白全长上，或者对于形成蛋白的一部分的限定片段或其结构域(例如，免疫学结构域或者功能结构域(具有至少一个生物活性的结构域))来说，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。例如，文中描述的短尾畸形蛋白的结构域包括T-box结构域。以上已经详细描述了免疫结构域。
[0093] 在发明的一些方面中，可以对野生型或参照短尾畸形蛋白的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个氨基酸进行氨基酸插入、缺失和/或取代，只要得到的短尾畸形蛋白在作为本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物中的抗原时能够象野生型或参照短尾畸形蛋白一样引发抗天然短尾畸形蛋白的免疫反应，所述免疫反应可以包括增强的免疫反应、减弱的免疫反应或者基本类似的免疫反应。例如，发明包括短尾畸形激动性抗原的使用，所述抗原可以包括一或多个这样的T细胞表位，所述T细胞表位经过突变能够增强抗短尾畸形激动剂的T细胞反应，比如通过提高表位对MHC分子或者对就MHC递呈来说的识别表位的T细胞受体的亲合力或亲和力。因此短尾畸形激动剂可以提高抗肿瘤细胞表达的天然短尾畸形的T细胞反应的效力(potency或efficiency)。具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的短尾畸形抗原是短尾畸形激动剂(或包含激动性表位的短尾畸形抗原)的一个非限制性例子。
[0094] 此外，对于SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20的融合蛋白来说，诸如以上描述的N端表达序列和C端标签是任选的，但可以从文中其他地方描述的几个不同序列中选择从而提高或协助蛋白的表达、稳定性和/或鉴定和/或纯化。还有许多适合在酵母中使用的不同启动子是本领域已知的。而且，可以为了多种原因在包含短尾畸形抗原的融合蛋白部分之间引入短的间隔连接序列(例如，1、2、3、4或5个氨基酸肽)，包括引入限制酶切位点以便有助于克隆、作为宿主吞噬体蛋白酶的切割位点、加快蛋白或抗原加工，以及将来对构建体的操作。
[0095] 任选地，作为本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的成分使用的蛋白(包括融合蛋白)是利用抗原构建体产生的，所述抗原构建体特别适用于提高或稳定酵母中的异源抗原的表达。在一个实施方案中，需要的抗原蛋白或肽在N端与下述融合:(a)特定的合成肽，能够稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达或者防止所表达的融合蛋白的翻译后修饰(这类肽在例如2004年8月12日公开的美国专利公开2004-0156858A1中有详细描述，该文献通过引用全部并入本文)；(b)内源酵母蛋白的至少一部分，包括但不限于酵母α因子前导序列，其中融合伙伴中的任意一个提供提高的蛋白在酵母中表达的稳定性和/或防止酵母细胞对蛋白的翻译后修饰(这类蛋白在美国专利公开2004-0156858A1中也有详细描述，同
前)；和/或(c)酵母蛋白的至少一部分，所述蛋白导致融合蛋白表达在酵母表面(例如，文中更详细描述的Aga蛋白)。此外，本发明任选包括抗原编码构建体C端融合的肽的使用，抗原编码构建体，特别是用于蛋白的选择和鉴定。这类肽包括，但不限于任何合成的或天然肽，比如肽标签(例如，6X His或六肽)或者任何其他短表位肽。根据发明，附着在抗原C端的肽可以和或者不和以上讨论的N端肽一起使用，反之亦然。
前)；和/或(c)酵母蛋白的至少一部分，所述蛋白导致融合蛋白表达在酵母表面(例如，文中更详细描述的Aga蛋白)。此外，本发明任选包括抗原编码构建体C端融合的肽的使用，抗原编码构建体，特别是用于蛋白的选择和鉴定。这类肽包括，但不限于任何合成的或天然肽，比如肽标签(例如，6X His或六肽)或者任何其他短表位肽。根据发明，附着在抗原C端的肽可以和或者不和以上讨论的N端肽一起使用，反之亦然。
[0096] 在一个实施方案中，可以在融合蛋白中使用的合成肽被连接在抗原的N端，所述肽由对于抗原是异源的至少两个氨基酸残基构成，其中肽能够稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达，或者防止被表达融合蛋白的翻译后修饰。合成肽和抗原的N端部分一起形成满足以下要求的融合蛋白:(1)融合蛋白位点1的氨基酸残基是甲硫氨酸(即合成肽中的第一个氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白位点2的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸(即合成肽中的第二个氨基酸不是甘氨酸或者脯氨酸)；(3)融合蛋白位点2-6的氨基酸残基都不是甲硫氨酸(即如果合成肽短于6个氨基酸，不论合成肽部分或蛋白的位点2-6的氨基酸都不包含甲硫氨酸)；以及(4)融合蛋白位点2-6的氨基酸没有赖氨酸或精氨酸(即如果合成肽短于5个氨基酸，不论合成肽部分或蛋白的位点2-6的氨基酸都不包含赖氨酸或精氨酸)。合成肽可以短到只有两个氨基酸，但在一个方面中，是2-6个氨基酸(包括3、4、5个氨基酸)，并且可以超过6个氨基酸，均为整数，最多大约200个氨基酸、300个氨基酸、400个氨基酸、500个氨基酸或者更多。
[0097] 在一个实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6，其中M是甲硫氨酸；其中X2是除了甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X3是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X4是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X5是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X6是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸。在一个实施方案中，X6残基是脯氨酸。能够提高抗原在酵母细胞中表达稳定性和/或防止蛋白在酵母中的翻译后修饰的一个示范性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(文中以SEQ ID NO:11代表)。除了更高的表达产物稳定性，该融合伙伴似乎不会负面影响抗构建体中免疫抗原的免疫反应。此外，可以设计合成融合肽来提供能被选择剂(比如抗体)识别的表位。
[0098] 在发明的一个方面中，酵母媒介物经过操作，使得抗原被部分或全部表达在酵母媒介物的表面(胞外表达)，或者通过被表达蛋白产物的递送或转运部分或全部地提供在酵母媒介物的表面。实现发明这一方面的一个方法是利用间隔臂将一或多个蛋白定位在酵母媒介物的表面。例如，可以利用间隔臂来制备抗原或其他目标蛋白与那些能够将抗原或其他目标蛋白定靶到酵母细胞壁的蛋白的融合蛋白。例如，可以用来定靶其他蛋白的一个这样的蛋白是酵母蛋白(例如，细胞壁蛋白2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flo1蛋白)，所述酵母蛋白能够将抗原或其他蛋白定靶到酵母细胞壁，从而使所述抗原或其他蛋白位于酵母的表面。可以使用酵母蛋白之外的蛋白作为间隔臂；但是，对于任何间隔臂蛋白，最需要的是使免疫反应针对靶抗原而不是间隔臂蛋白。因此，如果使用其他蛋白作为间隔臂，则所使用的间隔臂蛋白不应当造成对间隔臂蛋白自身的强大免疫反应超越了对靶抗原的免疫反应。本领域技术人员应当致力使针对间隔臂蛋白的免疫反应相对靶抗原的免疫反应较小。可以将间隔臂构建成带有切割位点(例如，蛋白酶切割位点)，从而使得在需要的情况下，抗原能够容易地被从酵母中除去或处理掉。可以使用任何已知的确定免疫反应强度的方法(例如抗体产生、裂解分析等)，这些对本领域技术人员是熟知的。
[0099] 另一种将靶抗原或其他蛋白定位到暴露在酵母表面的方法是利用信号序列(比如糖基磷脂酰肌醇(GPI))将目标分子锚定到酵母细胞壁上。替代地，可以通过附加某些信号序列来实现定位，所述信号序列将抗原或其他目标蛋白经由转位到内质网(ER)定靶到分泌途径中，从而使抗原与会结合细胞壁的蛋白(例如cwp)结合。
[0100] 在一个方面中，间隔臂蛋白是酵母蛋白。所述酵母蛋白可以由大约两个到大约800个酵母蛋白的氨基酸构成。在一个实施方案中，酵母蛋白是大约10–700个氨基酸。在另一个实施方案中，酵母蛋白是大约40–600个氨基酸。本发明的其他实施方案包括至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸、至少450个氨基酸、至少500个氨基酸、至少550个氨基酸、至少600个氨基酸，或者至少650个氨基酸的酵母蛋白。在一个实施方案中，酵母蛋白长至少450个氨基酸。如果希望优化抗原的表面表达，另一个考虑是抗原和间隔臂组合是否应当表达为单体或二聚体或三聚体，或者甚至更多的单位连接在一起。单体、二聚体、三聚体等的这种用途使得抗原可以有适当的间隔或折叠，从而抗原的某些部分(如果不是所有部分)在酵母媒介物表面的展示方式使它更有免疫原性。
[0101] 使用酵母蛋白可以稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达，防止被表达的融合蛋白发生翻译后修饰，和/或将融合蛋白定靶到酵母中的特定区室(例如，被表达在酵母细胞表面上)。为了递送到酵母的分泌途径，可以使用的示范性酵母蛋白包括，但不限于Aga(包括但不限于Agal和/或Aga2)；SUC2(酵母转化酶)；α因子信号前导序列；CPY；Cwp2p，因为它能定位并保持在细胞壁中；BUD基因，用于在形成子细胞的初始阶段定位在酵母细胞芽；Flo1p；Pir2p和Pir4p。
[0102] 可以使用其他序列将蛋白靶向、保持和/或稳定在酵母媒介物的其他部分，例如细胞浆或线粒体或内质网或者细胞核。可以用于以上任何实施方案的合适酵母蛋白的例子包括，但不限于TK、AF、SEC7；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1、磷酸甘油激酶PGK和磷酸丙酮异构酶TPI基因产物，因为它们在葡萄糖中表达会受到抑制，以及它们的胞质定位；热震惊蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1，其表达在细胞接触热处理时被诱导并且蛋白热稳定性更好；用于输入到线粒体的线粒体蛋白CYC1；ACT1。
[0103] 发明考虑了制备酵母媒介物和用酵母媒介物表达并与抗原和/或其他蛋白和/或目标试剂组合和/或结合从而产生基于酵母的免疫治疗组合物的方法。
[0104] 根据本发明，术语“酵母媒介物-抗原复合体”或“酵母-抗原复合体”用于一般性描述酵母媒介物与抗原的任何结合，并且可以与“基于酵母的免疫治疗组合物”在所述组合物被用于如上所述引发免疫反应的情况下交换使用。这种结合包括由酵母(重组酵母)表达抗原、将抗原引入酵母、抗原与酵母的物理附着，和酵母与抗原在比如缓冲液或其他溶液或制剂中的混合。以下详细描述了这些类型的复合体。
[0105] 在一个实施方案中，用于制备酵母媒介物的酵母细胞与编码蛋白(例如抗原)的异源核酸分子一起转染，从而由酵母细胞表达蛋白。这样的酵母在本文又被称为重组酵母或重组酵母媒介物。然后可以将酵母细胞与药学可接受的赋形剂成剂并直接给予患者、保持用于以后给药，或者装载到树突细胞中作为完整细胞。还可以将酵母细胞杀死，或者通过形成酵母原生质球、胞质、空胞或亚细胞颗粒进行衍生化，之后将上述衍生物中的任何一种保存、给药或者装载到树突细胞中。为了产生能够表达抗原或其他蛋白的重组原生质球，还可以直接用重组核酸分子转染酵母原生质球(例如，由整个酵母产生原生质球，然后转染)。能够重组表达抗原的酵母细胞或酵母原生质球可以用于制备包含酵母胞质、酵母ghost或酵母膜颗粒或酵母细胞壁颗粒或者它们的部分的酵母媒介物。
[0106] 一般来说，酵母媒介物或抗原和/或其他试剂可以通过本文描述的任何技术进行结合。在一个方面中，用抗原和/或试剂胞内装载酵母媒介物。在另一个方面中，抗原和/或试剂共价地或者非共价地附着酵母媒介物。在再一个方面中，酵母媒介物和抗原和/或试剂通过混合来结合。另一个方面中，在一个实施方案中，抗原和/或试剂是由酵母媒介物或酵母细胞或者衍生酵母媒介物的酵母原生质球重组表达。
[0107] 由本发明的酵母媒介物产生的抗原和/或其他蛋白的数量是可以通过酵母媒介物合理产生的任何抗原和/或其他蛋白数量，通常在至少一个到至少大约6个或更多个，包括大约2个到大约6个异源抗原和/或其他蛋白。
[0108] 抗原或其他蛋白在本发明的酵母媒介物中的表达是利用本领域技术人员已知的技术实现的。简单来说，将编码至少一个所需抗原或其他蛋白的核酸分子插入表达载体，其方式使得核酸分子与转录调控序列可操纵地连接，从而在转化到宿主酵母细胞中时，能够影响核酸分子的组成性表达或调控表达。编码一或多个抗原和/或其他蛋白的核酸分子可以在一或多个表达载体上与一或多个表达调控序列可操纵地连接。特别重要的表达调控序列是那些控制转录起始的序列，比如启动子和上游激活序列。任何合适的酵母启动子都可以用于本发明，许多这样的启动子是本领域技术人员已知的。用于酿酒酵母表达的启动子包括，但不限于编码以下酵母蛋白的基因的启动子：乙醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙酮异构酶(TPI)、翻译延伸因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH;又被称为TDH3，代表磷酸丙酮脱氢酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7),UDP-半乳糖表异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括诸如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子的杂合启动子，包括细胞内的葡萄糖浓度低(例如，大约百分之0.1到大约百分之0.2)时被诱导的ADH2/GAPDH启动
子，以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样的，多个上游激活序列(UASs)，又被称为增强子是已知的。用于酿酒酵母表达的上游激活序列包括，但不限于编码以下蛋白的基因的UASs：
PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及被GAL4基因产物活化的其他UASs，一个方面中使用的是ADH2UAS。因为ADH2UAS被ADR1基因产物所激活，当异源基因与ADH21UAS可操纵地连接时，优选用ADH2UAS来过表达ADR1基因。用于酿酒酵母表达的转录终止序列包括α因子、GAPDH或CYC1基因的终止序列。
子，以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样的，多个上游激活序列(UASs)，又被称为增强子是已知的。用于酿酒酵母表达的上游激活序列包括，但不限于编码以下蛋白的基因的UASs：
PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及被GAL4基因产物活化的其他UASs，一个方面中使用的是ADH2UAS。因为ADH2UAS被ADR1基因产物所激活，当异源基因与ADH21UAS可操纵地连接时，优选用ADH2UAS来过表达ADR1基因。用于酿酒酵母表达的转录终止序列包括α因子、GAPDH或CYC1基因的终止序列。
[0110] 根据本发明，核酸分子转染酵母细胞可以通过任何核酸分子导入细胞的方法来实现，包括但不限于扩散、主动运输、浴超声处理、电穿孔、微量注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。被转染的核酸分子可以利用本领域技术人员已知的技术整合到酵母染色体中或者维持在染色体外的载体中。带有这样的核酸分子的酵母媒介物的例子在文中有详细公开。正如以上讨论的，还可以通过用所需核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球从而重组产生酵母胞质体、酵母ghost和酵母膜颗粒或者细胞壁制品，在其中产生抗原，然后利用本领域技术人员已知的技术进一步操纵微生物或原生质球，产生含有所需抗原或其他蛋白的胞质、ghost或亚细胞酵母膜提取物或其部分。
[0111] 产生重组酵母媒介物并由酵母媒介物表达抗原和/或其他蛋白的有效条件包括可以培养酵母菌株的有效培养基。有效培养基通常是包含可同化的碳水化合物、氮和磷源，以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养(比如维生素和生长因子)的水样培养基。培养基可以包含复杂营养或者是限定的基础培养基。本发明的酵母株可以培养在多种容器内，包括但不限于生物反应器、锥形瓶、试管、微量滴定板和培养皿。培养在适合酵母菌株的温度、pH和氧气含量下进行。这些培养条件是本领域技术人员的专业知识范围内的(参见例如，
Guthrie et al.(eds.),1991,Methods in Enzymology,vol.194,Academic Press,San
Diego)。例如，在一个方案中，可以用从酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的起始培养板和/或起始培养物获得的培养物接种含有合适培养基的液体培养物，在30℃，250rpm搅拌培养约
20小时。然后将原生培养物按照需要扩增到更大的培养物。蛋白从酵母所转化的载体的表达(例如，短尾畸形表达)可以是组成型的，如果使用的是组成型启动子；或者可以通过加入对启动子适合的诱导条件来诱导，如果所用启动子是诱导型启动子(例如，对CUP1启动子的情况，硫酸铜)。在诱导型启动子的情况中，蛋白表达的诱导可以在培养物生长到合适的细胞密度后开始，所述合适的细胞密度可以是大约0.2Y.U./ml或更高。
Guthrie et al.(eds.),1991,Methods in Enzymology,vol.194,Academic Press,San
Diego)。例如，在一个方案中，可以用从酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的起始培养板和/或起始培养物获得的培养物接种含有合适培养基的液体培养物，在30℃，250rpm搅拌培养约
20小时。然后将原生培养物按照需要扩增到更大的培养物。蛋白从酵母所转化的载体的表达(例如，短尾畸形表达)可以是组成型的，如果使用的是组成型启动子；或者可以通过加入对启动子适合的诱导条件来诱导，如果所用启动子是诱导型启动子(例如，对CUP1启动子的情况，硫酸铜)。在诱导型启动子的情况中，蛋白表达的诱导可以在培养物生长到合适的细胞密度后开始，所述合适的细胞密度可以是大约0.2Y.U./ml或更高。
[0112] 适合培养本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的培养基的一个非限制性例子是U2培养基。U2培养基包含以下成分:20g/L葡萄糖、6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源，和各
0.04mg/mL的组氨酸、亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤。适合培养本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的培养基的另一个非限制性例子是UL2培养基。UL2培养基包含以下成分:20g/L葡萄糖、6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源，和各0.04mg/mL的组氨酸、色氨酸和腺嘌呤。
0.04mg/mL的组氨酸、亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤。适合培养本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的培养基的另一个非限制性例子是UL2培养基。UL2培养基包含以下成分:20g/L葡萄糖、6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源，和各0.04mg/mL的组氨酸、色氨酸和腺嘌呤。
[0113] 在发明的一个实施方案中，当使用诱导型启动子(比如CUP1启动子)根据发明表达酵母媒介物中的短尾畸形蛋白时，与对用该启动子的酵母表达的多数蛋白来说合适的细胞密度相比，蛋白表达的诱导在更高的细胞密度开始。更具体地说，本发明人发现CUP1启动子引导的最佳短尾畸形抗原表达发生在表达短尾畸形抗原的酵母生长到至少0.5Y.U/ml和大约2.0Y.U./ml之间的细胞密度，在一个方面中，生长到0.5Y.U./ml和大约1.5Y.U./ml,之间，在一个方面中，到至少1.0Y.U./ml和约2.0Y.U./ml之间，在另一个方面中，到至少约1.0Y.U./ml。本申请人发现在短尾畸形表达被诱导后，酵母只加倍约1X到1.5X。并且，短尾畸形表达被诱导后，发明人发现酵母细胞生长到高于约2.0Y.U./ml的细胞密度，或者生长超过约6-8小时会导致培养物的活性下降，而且不能明显提高酵母中的抗原积累。因此，在发明的一个实施方案中，在诱导抗原表达之前，将含有处于诱导型启动子(比如CUP1启动子)控制的抗原表达的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物生长到对数生长中期。在一个方面
中，在诱导抗原表达之前，细胞生长到约1和2Y.U./ml。在一个方面中，抗原表达被诱导(例如，通过添加硫酸铜)并持续达到6、6.5、7、7.5或8个小时。在一个方面中，诱导发生在约30℃的温度和250rpm的搅拌速度。
中，在诱导抗原表达之前，细胞生长到约1和2Y.U./ml。在一个方面中，抗原表达被诱导(例如，通过添加硫酸铜)并持续达到6、6.5、7、7.5或8个小时。在一个方面中，诱导发生在约30℃的温度和250rpm的搅拌速度。
[0114] 在发明的一些实施方案中，酵母生长在中性pH条件下。用于本文，术语“中性pH”的一般用法是指在大约pH5.5和大约pH8之间的pH范围，在一个方面中，在大约pH6和大约8之间。本领域技术人员可以理解，用pH计测量时会发生小的浮动(例如，十分之几或百分之几)。因此，使用中性pH来培养酵母细胞意味着酵母细胞在培养过程中的多数时间是生长在中性pH的。在一个实施方案中，酵母生长的培养基维持在至少5.5的pH水平(即不允许培养基的pH降到pH5.5以下)。在另一个方面中，酵母生长在维持在大约6、6.5、7、7.5或8的pH水平。培养酵母中使用中性pH促进了对于使用酵母作为免疫调节媒介物来说是有益特性的几个生物效应。例如，在中性pH培养酵母允许酵母有良好的生长，同时对细胞传代时间没有负面影响(例如，加倍时间变慢)。酵母可以在不丧失细胞壁柔性的情况下继续生长到高密度。使用中性pH可以在所有收集密度产生具有柔性细胞壁的酵母和/或对细胞壁消化酶(例如
葡聚糖酶)更敏感的酵母。这个特点是可取的，因为具有柔性细胞壁的酵母与在更酸性条件下生长的酵母相比，可以诱导不同的或者改善的免疫反应，例如通过促进胞吞了酵母的抗原递呈细胞分泌细胞因子(例如，TH1型细胞因子，包括但不限于IFN-γ、白介素12(IL-12)和IL-2，以及促炎细胞因子，比如IL-6)。此外，这类培养方法可以提供对位于细胞壁内的抗原的更高的可接触性。在另一个方面中，对于一些抗原使用中性pH可以利用二硫苏糖醇
(DTT)处理来释放二硫键结合的抗原，而这对于培养在较低pH(例如pH5)的培养基中的抗原表达酵母是不可能的。
葡聚糖酶)更敏感的酵母。这个特点是可取的，因为具有柔性细胞壁的酵母与在更酸性条件下生长的酵母相比，可以诱导不同的或者改善的免疫反应，例如通过促进胞吞了酵母的抗原递呈细胞分泌细胞因子(例如，TH1型细胞因子，包括但不限于IFN-γ、白介素12(IL-12)和IL-2，以及促炎细胞因子，比如IL-6)。此外，这类培养方法可以提供对位于细胞壁内的抗原的更高的可接触性。在另一个方面中，对于一些抗原使用中性pH可以利用二硫苏糖醇
(DTT)处理来释放二硫键结合的抗原，而这对于培养在较低pH(例如pH5)的培养基中的抗原表达酵母是不可能的。
[0115] 在一个实施方案中，利用控制酵母糖基化的量来控制酵母表达抗原，特别是在表面上的表达。酵母糖基化的量会影响表面上表达的抗原的免疫原性和抗原性，因为糖部分往往较庞大。因此，根据发明在调整酵母时应当考虑到酵母表面上存在的糖部分以及它对目标抗原周围的三维空间的影响。可以使用任何方法来减少酵母糖基化的量(或者需要的话，增加这个量)。例如，可以使用经过选择具有低糖基化水平的酵母突变株(例如，mnn1、och1和mnn9突变体)，或者可以通过突变目标抗原上的糖基化受体序列来消除糖基化。替代地，可以使用具有简短糖基化模式的酵母，例如，毕赤酵母。还可以使用能够减少或改变糖基化的方法来处理酵母。
[0116] 在本发明的一个实施方案中，作为在酵母媒介物中重组表达抗原或其他蛋白的一个替代方法，将酵母媒介物胞内装载蛋白或肽，或者碳水化合物或其他分子，这些装载的分子可以作为本发明的抗原和/或作为免疫调节剂或生物反应调节剂。随后可以将现在胞内含有抗原和/或其他蛋白的酵母媒介物给予个体或装载到载体(比如树突细胞)中。肽和蛋白可以通过本领域技术人员已知的技术直接插入到酵母媒介物中，比如通过扩散、主动运输、脂质体融合、电穿孔、胞吞、冻融循环和浴超声处理。可以直接装载肽、蛋白、碳水化合物或其他分子的酵母媒介物包括完整酵母，以及原生质球、空胞或胞质，它们可以在生产后装载抗原和其他试剂。替代地，可以给完整酵母装载抗原和/或试剂，然后由它制备原生质球、空胞、胞质或亚细胞颗粒。在这个实施方案中，可以将任何数量的抗原和/或其他试剂装载到酵母媒介物中，从至少1、2、3、4或任何整数到几百或几千抗原和/或其他试剂，比如通过装载例如微生物或某些部分可以提供的数量。
[0117] 在本发明的另一个实施方案中，抗原和/或其他试剂物理附着于酵母媒介物。抗原和/或其他试剂与酵母媒介物的物理附着可以通过本领域的任何合适方法来实现，包括共价和非共价结合方法，包括但不限于将抗原和/或其他试剂化学交联到酵母媒介物的外表面；或者比如通过利用抗体或其他结合伙伴，将抗原和/或其他试剂生物连接到酵母媒介物的外表面。化学交联的实现可以通过例如包括戊二醛连接、光亲和标记的方法、用二亚胺碳进行处理、用能够连接二硫键的化学物质进行处理，以及用其他本领域标准的交联化学剂进行处理。替代地，可以将化学剂与酵母媒介物进行接触，所述化学剂会改变酵母细胞膜脂双层的电荷或细胞壁的成分，从而使酵母外表面更可能与具有特定电荷特性的抗原和/或其他试剂发生融合或结合。还可以将诸如抗体、结合肽、可溶性受体和其他配体的靶向试剂并入抗原作为融合蛋白，或者以其他方式与抗原关联从而使抗原结合酵母媒介物。
[0118] 当抗原或其他蛋白被表达或者物理附着在酵母表面上时，在一个方面中可以仔细挑选间隔臂来优化抗原或其他蛋白的表达或者表面的成分。间隔臂的大小会影响抗原或其他蛋白有多少暴露在酵母表面发生结合。因此，根据所使用的抗原或其他蛋白，本领域技术人员可以挑选能够在酵母表面上的抗原或其他蛋白之间形成合适间隔的间隔臂。在一个实施方案中，间隔臂是至少有450个氨基酸的酵母蛋白。上文已经详细讨论了间隔臂。
[0119] 在再一个实施方案中，酵母媒介物和抗原或其他蛋白通过更被动、非特异性的或者非共价的结合机制相互结合，比如通过将酵母媒介物与抗原或其他蛋白在缓冲液或其他合适的制剂(例如混合液)中轻轻混合。
[0120] 在一个实施方案中，可以将(有或没有异源抗原或其他蛋白表达的)完整酵母以能够产生酵母细胞壁制品、酵母膜颗粒或酵母片段(即不是完整的)的方式磨碎或加工，在一些实施方案中，可以将酵母片段与包含抗原的其他组合物(例如DNA疫苗、蛋白亚基疫苗、杀死或灭活的病原体、病毒载体疫苗)一起提供或给予从而加强免疫反应。例如，可以利用酶处理、化学处理或物理力(例如，机械剪切或超声处理)将酵母破碎成可以作为佐剂的部分。
[0121] 在发明的一个实施方案中，可用于发明的酵母媒介物包括已经被杀死或灭活的酵母媒介物。杀死或灭活酵母可以通过本领域已知的多种合适方法中的任何一种来完成。例如，酵母热灭活是灭活酵母的一种标准途径，如果需要，本领域技术人员可以通过本领域已知的常规方法来监测目标抗原的结构变化。替代地，可以使用其他酵母灭活方法，比如化学、电学、放射性或UV方法。参见例如标准酵母培养参考书，比如Methods of Enzymology,Vol.194,Cold Spring Harbor Publishing(1990)中公开的方法。任何使用的灭活策略都应当考虑到目标抗原的二级、三级或四级结构，并且保存这些结构以便优化抗原的免疫原性。
[0122] 酵母媒介物可以利用本领域技术人员已知的多种技术配制成本发明的基于酵母的免疫治疗组合物或产品。例如，可以通过冻干对酵母媒介物进行干燥。包含酵母媒介物的制剂还可以通过将酵母制成饼或片剂，比如象用于烘培或酿造工艺中的酵母。此外，可以将酵母媒介物与药学上可接受的赋形剂混合，比如宿主或宿主细胞能够耐受的等渗缓冲液。
这类赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，和其他水性生理平衡盐溶液。还可以使用非水性的媒介物，比如固定油类、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有增稠剂(比如羧甲基纤维素钠、山梨醇、甘油或葡聚糖)的悬浮液。赋形剂还可以含有微量的添加剂，比如能增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，防腐剂的例子包括噻汞撒(thimerosal)、m-或o-甲苯酚、福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是液态注射剂，或者能够加入合适液体成为用于注射的悬浮液或溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含例如葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐剂，然后在给药前可以加入无菌水或盐水。
这类赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，和其他水性生理平衡盐溶液。还可以使用非水性的媒介物，比如固定油类、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有增稠剂(比如羧甲基纤维素钠、山梨醇、甘油或葡聚糖)的悬浮液。赋形剂还可以含有微量的添加剂，比如能增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，防腐剂的例子包括噻汞撒(thimerosal)、m-或o-甲苯酚、福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是液态注射剂，或者能够加入合适液体成为用于注射的悬浮液或溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含例如葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐剂，然后在给药前可以加入无菌水或盐水。
[0123] 在本发明的一个实施方案中，组合物可以包含其他试剂，这些试剂也可以被称为生物反应调节剂化合物，或者产生这些试剂/改造剂的能力。例如，可以用至少一种抗原和至少一种抗原/生物反应调节剂化合物转染或装载酵母媒介物，或者可以将本发明的组合物与至少一种试剂/生物反应调节剂一起给予。生物反应调节剂包括能调节免疫应答的佐剂和其他化合物，它们可以被称为免疫调节性化合物；还包括能改造另一种化合物或试剂的生物活性的化合物，比如基于酵母的免疫治疗剂，所述生物活性不限于免疫系统的效应。某些免疫调节化合物能刺激保护性免疫反应，而其它的能抑制有害的免疫反应，免疫调节与给定基于酵母的免疫治疗剂的组合是否有用可能至少部分取决于要治疗或防止的疾病
状态或状况，和/或待治疗的个体。某些生物反应调节剂优先增强细胞介导型免疫反应，而其它的优先增强体液免疫反应(即，刺激的免疫反应中，与体液免疫相比，细胞介导的免疫反应水平提高，或者反过来)。某些生物反应调节剂与基于酵母的免疫治疗剂有一或多个共同的特性，或者对基于酵母的免疫治疗剂的生物特性能够增强或互补。本领域技术人员知道多种测量免疫反应的激发或抑制的方法，以及区分细胞介导的免疫反应和体液介导的免疫反应的方法，和区分一类细胞介导的反应与另一类反应(例如，TH17反应对TH1反应)。
状态或状况，和/或待治疗的个体。某些生物反应调节剂优先增强细胞介导型免疫反应，而其它的优先增强体液免疫反应(即，刺激的免疫反应中，与体液免疫相比，细胞介导的免疫反应水平提高，或者反过来)。某些生物反应调节剂与基于酵母的免疫治疗剂有一或多个共同的特性，或者对基于酵母的免疫治疗剂的生物特性能够增强或互补。本领域技术人员知道多种测量免疫反应的激发或抑制的方法，以及区分细胞介导的免疫反应和体液介导的免疫反应的方法，和区分一类细胞介导的反应与另一类反应(例如，TH17反应对TH1反应)。
[0124] 可用于发明的试剂/生物反应调节剂可以包括，但不限于细胞因子、趋化因子、激素、脂类衍生物、肽、蛋白、多糖、小分子药物、抗体及其抗原结合片段(包括，但不限于抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗趋化因子抗体)、维生素、多核苷酸、核酸结合部分、适配体和生长调节剂。一些合适的试剂包括，但不限于IL-1，或者IL-1或IL-1R的激动剂，抗IL-1或其他IL-1拮抗剂；IL-6，或者IL-6或IL-6R的激动剂，抗IL-6或其他IL-6拮抗剂；IL-12，或者IL-12或IL-12R的激动剂，抗IL-12或其他IL-12拮抗剂；IL-17，或者IL-17或IL-17R的激动剂，抗IL-17或其他IL-17拮抗剂；IL-21，或者IL-21或IL-21R的激动剂，抗IL-21或其他IL-21拮抗剂；IL-22，或者IL-22或IL-22R的激动剂，抗IL-22或其他IL-22拮抗剂；IL-23，或者IL-23或IL-23R的激动剂，抗IL-23或其他IL-23拮抗剂；IL-25，或者IL-25或IL-25R的激动剂，抗IL-25或其他IL-25拮抗剂；IL-27，或者IL-27或IL-27R的激动剂，抗IL-27或其他IL-27拮抗剂；I型干扰素(包括IFN-α)，或者I型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；II型干扰素(包括IFN-γ)，或者II型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；抗CD40、CD40L、淋巴细胞激活基因3(LAG3)蛋白和/或IMP321(由可溶形式LAG3衍生的T细胞免疫刺激因子)；抗CTLA-
4抗体(例如，为了释放无反应性T细胞)；T细胞共刺激剂(例如，抗CD137、抗CD28、抗CD40)；
阿来组单抗(alemtuzumab)(例如 )、地尼白介素2(denileukin diftitox，例如
)；抗CD4；抗CD25；抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2；FOXP3的阻断剂(例如，以消除CD4
+ + TM
/CD25T调节细胞的活性)；Flt3配体、咪喹莫特(imiquimod，Aldara )、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim，
)；激素，包括但不限于催乳素和生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不
限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂和TLR-9拮抗剂；抗炎剂和免疫调节剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如，赛来昔布(Celecoxib)、NSAIDS)、糖皮质激素、他汀类(statins)和沙利度胺(thalidomide)以及它们的类似物，包括IMiDTMs(它是沙利度胺(例如，
(来那度胺(lenalidomide))、 (泊马度胺(pomalidomide))的
结构和功能类似物；促炎剂，比如真菌或细菌成分或任何促炎细胞因子或趋化因子；免疫治疗疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗，或者基于抗体的疫苗；和任何其他免疫调节剂、免疫增强剂、抗炎剂、促炎剂和能够调节抗原呈递细胞或TH17、TH1和/或Treg细胞的数量、活化状态和/或存活情况的任何试剂。发明考虑了这些试剂的任何组合，并且任何这类试剂与基于酵母的免疫治疗剂的组合或者与基于酵母的免疫治疗剂一起的
(例如同时、顺序或者其他格式)给药方案都是发明涵盖的组合物。这类试剂是本领域公知的。这些试剂可以单独使用或者与文中描述的其他试剂组合使用。
4抗体(例如，为了释放无反应性T细胞)；T细胞共刺激剂(例如，抗CD137、抗CD28、抗CD40)；
阿来组单抗(alemtuzumab)(例如 )、地尼白介素2(denileukin diftitox，例如
)；抗CD4；抗CD25；抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2；FOXP3的阻断剂(例如，以消除CD4
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/CD25T调节细胞的活性)；Flt3配体、咪喹莫特(imiquimod，Aldara )、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim，
)；激素，包括但不限于催乳素和生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不
限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂和TLR-9拮抗剂；抗炎剂和免疫调节剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如，赛来昔布(Celecoxib)、NSAIDS)、糖皮质激素、他汀类(statins)和沙利度胺(thalidomide)以及它们的类似物，包括IMiDTMs(它是沙利度胺(例如，
(来那度胺(lenalidomide))、 (泊马度胺(pomalidomide))的
结构和功能类似物；促炎剂，比如真菌或细菌成分或任何促炎细胞因子或趋化因子；免疫治疗疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗，或者基于抗体的疫苗；和任何其他免疫调节剂、免疫增强剂、抗炎剂、促炎剂和能够调节抗原呈递细胞或TH17、TH1和/或Treg细胞的数量、活化状态和/或存活情况的任何试剂。发明考虑了这些试剂的任何组合，并且任何这类试剂与基于酵母的免疫治疗剂的组合或者与基于酵母的免疫治疗剂一起的
(例如同时、顺序或者其他格式)给药方案都是发明涵盖的组合物。这类试剂是本领域公知的。这些试剂可以单独使用或者与文中描述的其他试剂组合使用。
[0125] 试剂可以包括给定蛋白或肽或其结构域的激动剂和拮抗剂。用于本文，“激动剂”是能够与受体或配体结合并产生或引发反应的任何化合物或试剂，包括但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等，其中可能包括那些模拟天然物质结合受体或配体的作用的试剂。“拮抗剂”是能够阻断或抑制或减少激动剂的作用的任何化合物或试剂，包括但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等。
[0126] 本发明的组合物还可以包含任何其他试剂或组合物或方案，或者与它们一起(同时、顺序或间歇地)给药，所述试剂或组合物或方案可以用于防止或治疗癌症，或者治疗或缓解癌症(特别是与短尾畸形表达或过表达相关的癌症)的任何症状的任何化合物。此外，本发明的组合物可以与其他免疫治疗组合物一起使用，包括预防性和/或治疗性免疫疗法。
的确，本发明的组合物可以用于通过抑制癌症中的短尾畸形表达来抑制或减少转移癌中可能发生的化学抗性或放疗抗性(并从而抑制抗增殖影响)，或者发明的组合物可以增强化疗或放疗在个体中的表现。可以用于癌症治疗的其他试剂、组合物或方案(例如治疗性方案)包括，但不限于化疗、手术切除肿瘤、放疗、同种异体或自体干细胞移植，和/或靶向癌症疗法(例如小分子药物；生物剂；或者特异靶向那些参与肿瘤生长和进展的分子的单克隆抗体疗法，所述分子包括但不限于选择性雌激素受体调节剂(SERMs)、芳香酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、视黄素受体激动剂、凋亡刺激剂、血管生成抑制剂、poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂或者免疫刺激剂)。这些其他治疗剂和/或治疗方案可以在本发明的免疫治疗组合物之前、同时、交替或之后给予，或者在不同时间点给予。例如，当与化疗或靶向癌症疗法联合给予个体时，可能希望在化疗或靶向癌症疗法剂量之间的“假期”给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，以便最大化免疫治疗组合物的效力。肿瘤的手术切除往往是在给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物之前，但在给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物过程中或者之后可以进行另外的或者初次手术。
的确，本发明的组合物可以用于通过抑制癌症中的短尾畸形表达来抑制或减少转移癌中可能发生的化学抗性或放疗抗性(并从而抑制抗增殖影响)，或者发明的组合物可以增强化疗或放疗在个体中的表现。可以用于癌症治疗的其他试剂、组合物或方案(例如治疗性方案)包括，但不限于化疗、手术切除肿瘤、放疗、同种异体或自体干细胞移植，和/或靶向癌症疗法(例如小分子药物；生物剂；或者特异靶向那些参与肿瘤生长和进展的分子的单克隆抗体疗法，所述分子包括但不限于选择性雌激素受体调节剂(SERMs)、芳香酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、视黄素受体激动剂、凋亡刺激剂、血管生成抑制剂、poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂或者免疫刺激剂)。这些其他治疗剂和/或治疗方案可以在本发明的免疫治疗组合物之前、同时、交替或之后给予，或者在不同时间点给予。例如，当与化疗或靶向癌症疗法联合给予个体时，可能希望在化疗或靶向癌症疗法剂量之间的“假期”给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，以便最大化免疫治疗组合物的效力。肿瘤的手术切除往往是在给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物之前，但在给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物过程中或者之后可以进行另外的或者初次手术。
[0127] 发明还包括含有本文描述的任何组合物或本文描述的组合物的任何个别成分的试剂盒。试剂盒可能包含其他试剂和使用本发明的任何组合物来防止或治疗与短尾畸形表达或过表达相关的书面说明或指导。
[0128] 发明组合物的给药或使用方法
[0129] 本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物被设计用于防止或治疗与短尾畸形表达或过表达有关的或者以短尾畸形表达或过表达为特征的癌症，包括通过防止这类癌症的出现、遏制这类癌症的进展或者消除这类癌症。更具体地说，酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以用于防止、抑制或延迟表达短尾畸形的肿瘤的发展，和/或防止、抑制或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤对其他组织的侵袭(转移)，和/或整体防止或抑制个体中癌症的进展。酵母-短尾畸形免疫治疗组合物还可以用于减轻癌症的至少一个症状，比如通过减少个体中的肿瘤负荷；抑制个体中的肿瘤生长；提高个体存活率；防止、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭其他组织(转移癌症)的发展；和/或防止、抑制、逆转或延迟个体中癌症的进展。酵母-短尾畸形免疫疗法还可以用于通过抑制癌症中的短尾畸形表达来抑制、减少或消除转移癌中可能发生的化疗抗性或放疗抗性，并且发明的组合物可以增强化疗或放疗在个体中的表现。
[0130] 与本发明的组合物和方法有关的癌症是任何表达或可能表达短尾畸形的癌症，或者与表达或可能表达短尾畸形的癌症邻近的癌症，包括但不限于乳腺、小肠、胃、肾、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、肺、结肠、胰或前列腺的癌症，包括转移和晚期癌症。此外，B细胞来源的肿瘤，比如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、Epstein-Barr病毒转化的B细胞、伯基特氏和霍奇金氏淋巴瘤，以及它们的转移癌症中表达短尾畸形。
[0131] 发明的一个实施方案涉及抑制肿瘤迁移和/或减少、停止(遏制)、逆转或防止患有癌症的个体中的癌症的转移性进展，或者逆转癌症中转移事件的发展的方法。正如以上讨论的，短尾畸形促进了人肿瘤细胞中的上皮细胞-间充质转化(EMT)、赋予肿瘤细胞间充质表型，以及迁移和侵袭能力，同时减弱肿瘤细胞周期进展。因此，短尾畸形对转移过程的参与使它成为理想的防止或抑制转移过程(包括将癌症遏制在转移前阶段)的目标。使用本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以在面临癌症逃避(或试图逃避)传统疗法(比如化疗和放疗)时，有效地防止或治疗转移性癌症，包括遏制癌症的进展。所述方法包括将文中描述的本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物给予患有癌症的个体的步骤，所述组合物包括，但不限于:(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。
[0132] 在一个方面中，第一次给予组合物时在个体的癌症中没有检测到短尾畸形。通常，当个体癌症中检测不到短尾畸形时，个体可能患有较早期癌症，短尾畸形表达还没有发生(例如I期或II期)，或者短尾畸形表达还是无法检测到的(即短尾畸形可能有或没有以低水平表达，或者只在少数肿瘤细胞中表达，但使用常规检测方法还不能容易地检测到)。就发明的这个方面来说，通过使用酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以防止、延迟或抑制短尾畸形表达的肿瘤细胞的发展。因此，导致肿瘤转移性进展的肿瘤迁移和/或其他转移过程被防止、延迟或抑制，和/或个体中发生肿瘤进展的整体遏制。
[0133] 在另一个方面中，第一次给予组合物时在个体的癌症中检测到了或者可以检测的短尾畸形表达。发明的这个方面中个体可能患有I期、II期、III期或IV期癌症。就这个方面来说，使用酵母-短尾畸形免疫治疗组合物减少、消除或减慢或遏制了表达短尾畸形的肿瘤的生长，这可以导致个体中肿瘤负荷的减少、抑制表达短尾畸形的肿瘤的生长，和/或提高个体存活率。所述个体可能经历转移过程的遏制、减慢或逆转；个体存活率和健康的改善；并且使得其他治疗方案能对癌症进行治疗。
[0134] 的确，转移性癌症可能和对癌症疗法(比如化疗、放疗或靶向癌症疗法)的抗性或者对癌症疗法的抗性提高有关，癌症因此可以“逃避”这些疗法或者就是被疗法和过程更少地影响。相应地，需要减少或消除对所述疗法的抗性，从而提高或增强疗法的效率，改善患者的健康和存活率。相应地，发明的一个实施方案涉及减少或防止患有癌症的个体的化疗抗性、靶向癌症疗法抗性或放疗抗性的方法。所述方法包括将本文描述的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物给予患有癌症并正在接受化疗和/或放疗的个体，其中所述化合物包括的组合物包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种短尾畸形抗原的癌抗原。发明的这个方法还可以用于治疗与其他癌症治疗相关的抗性，包括但不限于靶向癌症疗法。
[0135] 在该实施方案的一个方面中，在第一次给予所述组合物时，个体的癌症中没有检测到短尾畸形。就这个方面来说，给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物能够通过抑制癌症中表达短尾畸形的肿瘤细胞的发展，防止或抑制化疗抗性或放疗抗性的出现。另一方面中，第一次给予所述组合物时，个体的癌症中检测到了短尾畸形表达。这个方面，个体可能已经或者还没有经历对化疗或放疗的抗性。任一种情况中，给予本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物通过减少或消除患者中的表达短尾畸形的肿瘤细胞，能够防止或抑制对化疗或放疗的抗性，或者增强化疗或放疗治疗个体的能力。
[0136] 发明的另一个实施方案涉及治疗癌症，特别是表达短尾畸形的癌症的方法。所述方法包括将本文描述的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物给予患有表达短尾畸形的癌症的个体，包括的组合物含有:(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。在一个方面中，方法减少了患者中的肿瘤负荷。在一个方面中，方法提高了患者的存活率。在一个方面中，方法抑制了个体中的肿瘤生长。在一个方面中，方法防止、遏制或逆转了肿瘤的转移性进展。
[0137] 因为短尾畸形表达据信随着癌症进展到更高阶段(根据具体癌症，从例如I期到II期到III期到IV期)会更普遍，并且与转移过程相关，本发明的实施方案提供了防止或延迟表达短尾畸形的癌症发病、或者将癌症遏制在转移前或癌变前阶段的方法。这样的方法包括将本文描述的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物给予没有检测到短尾畸形表达的癌细胞的个体，所述组合物包括的组合物含有:(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一个短尾畸形抗原的癌抗原。在该实施方案的一个方面中，患有癌症的个体中有至少一部分已知表达短尾畸形，或者相信在癌症的某个阶段倾向表达短尾畸形。在该实施方案的一个方面中，个体已经患有癌症，但在第一次给予组合物时癌症中没有检测到短尾畸形，意味着个体可能患有较早期癌症，短尾畸形表达还没有发生，或者短尾畸形表达还是无法检测到的(即短尾畸形可能有或没有以低水平表达，或者只在少数肿瘤细胞中表达，但使用常规检测方法还不能容易地检测到)。在一些情况中，癌症类型可能是已知有高转移进展率的类型，在这方面，给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物防止、延迟或抑制患者的癌症中表达短尾畸形的肿瘤细胞的发展，因此防止、遏制、延迟或抑制伴随短尾畸形表达的转移过程。在另一个方面中，个体在被给予组合物时没有癌症。这样的个体可能是由于家族史或者遗传标记，或者个体有表现出来的癌前细胞或病变或者有前癌(precancerous或premalignant)细胞或病变，是“有倾向”或可能发展成癌症的。
[0138] 在一个方面中，个体另外用可以治疗癌症的至少一种治疗化合物或治疗方案处置。这类治疗剂和方案在本文其他地方已有详细讨论。例如，在关于本文描述的方法的任何实施方案中，一方面，当个体患有癌症(无论肿瘤细胞中可检测短尾畸形表达的状态)，个体正接受或者已经接受另一种癌症疗法。这类疗法可以包括任何先前描述的任何治疗性方案或者任何治疗化合物或试剂的使用，包括但不限于化疗、放疗、靶向癌症疗法、手术切除肿瘤、干细胞转移、细胞因子疗法、适应性T细胞转移和/或给予第二免疫治疗组合物。在给予第二免疫治疗组合物的例子中，这类组合物可以包括，但不限于其他基于酵母的免疫疗法、基于重组病毒的免疫疗法(病毒载体)、细胞因子疗法、免疫刺激剂疗法(包括具有免疫刺激性能的化疗)、DNA疫苗和其他免疫治疗组合物。
[0139] 在一个方面中，第二免疫治疗组合物包含的第二癌抗原不包括短尾畸形抗原。例如，可以用于与酵母-短尾畸形免疫治疗组合物组合的第二免疫治疗组合物是包含另一种癌抗原的酵母-免疫治疗组合物。这类癌抗原可以包括，但不限于癌胚抗原(CEA)、点突变的Ras癌蛋白、MUC-1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、正常和点突变p53癌蛋白、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤样息肉(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素、NGEP、这些抗原的修饰形式、这些抗原的剪接变体、这些抗原的表位激动剂，以及这些抗原的组合，和/或其免疫原性结构域、其修饰形式、其变体和/或表位激动剂。
[0140] 用于本文，“治疗(treat)”癌症，或者它的任何排列方式(例如“对癌症的治疗(treated for cancer)”等)通常是指癌症一旦已经发生给予本发明的组合物(例如一旦在个体中诊断或检测到癌症)，其至少一个处置目的(与没有这种处置相比)包括：减少肿瘤负荷；抑制肿瘤生长；提高个体存活率；延迟、抑制、遏制或防止转移性癌症的开始或发展(比如通过延迟、抑制、遏制或防止肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭原发癌症之外的组织和/或其他与癌症的转移性进展相关的过程)；延迟或遏制癌症进展；提高抗肿瘤的免疫反应；提高抗肿瘤抗原的长期记忆免疫反应；和/或提高个体的整体健康情况。“防止(prevent)”或“保护免于”癌症，或者任何排列方式(例如“癌症的防止(prevention of cancer)”等)通常是指在癌症发生前，或者在癌症的特定阶段或者癌症中肿瘤抗原表达发生之前(例如，在癌症中检测到短尾畸形表达之前)给予本发明的组合物，其至少一个处置目的(与没有这种处置相比)包括：防止或延迟癌症的发病或发展，或者如果癌症在处置后发生率，至少减轻癌症的严重性(例如，减少肿瘤生长的水平、遏制癌症进展、提高抗癌的免疫反应、抑制转移性过程)或者提高个体中的后果(例如，提高存活率)。
[0141] 本发明包括发明所述酵母-短尾畸形免疫治疗组合物对受试对象或个体的递送(给药、免疫)。给药过程可以离体或体内进行。离体给药是指在患者体外进行部分调节步骤，比如在一定条件下将本发明的组合物给予从患者分离的细胞(树突细胞)群，使得酵母媒介物、抗原和任何其他试剂或组合物被装载到细胞中，并将这些细胞返回给患者。本发明的治疗性组合物可以用任何合适的给药模式返回给患者，或给予患者。
[0142] 组合物的给予可以是系统性的、粘膜的和/或目标位点位置附近的(例如，肿瘤部位附近)。合适的给药途径对本领域技术人员而言是显然的，取决于要防止或治疗的癌症的类型和/或目标细胞群或组织的类型。各种可接受的给药方法包括，但不限于静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、结内给药、冠状动脉内给药、动脉内给药(例如到颈动脉中)、皮下给药、经皮递送、气管内给药、关节内给药、脑室内(intraventricular)给药、吸入(例如气溶胶)、颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺给药、导管浸渍(impregnation)及直接注射入组织。在一个方面中，给药途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内和脊柱内。胃肠外递送可包括皮内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管和静脉导管途径。耳递送可包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂或鼻内注射，眼内递送可包括滴眼剂。也可以利用本领域的标准方法进行气溶胶(吸入)递送(参见例如Stribling等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA189:11277-11281,1992)进行。在一个方面中，发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物是皮下给予的。在一个方面中，酵母-短尾畸形免疫治疗组合物是直接给予肿瘤周围环境的。
[0143] 一般来说，酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的合适单个剂量是在合适的时间段内给予一次或多次时，能够有效地给患者身体的特定细胞类型、组织或区域提供有效量的酵母媒介物和短尾畸形抗原，从而引发抗一或多个短尾畸形抗原或表位的抗原特异性免疫反应的剂量。例如，在一个实施方案中，本发明的酵母-短尾畸形的单个剂量是每千克被给予该组合物的生物体重约1x105到约5x107个酵母细胞等同量。在一个方面中，本发明的酵母媒介物的单个剂量是每剂(即每个生物)约0.1酵母单位(Y.U.，即1x106个酵母细胞或酵母细胞等同物)到约100Y.U.(1x109个细胞)，包括按0.1x106个细胞的增量递增的任何中间剂量(即，1.1x106、1.2x106、1.3x106...)。在一个实施方案中，合适的剂量包括1Y.U和40Y.U.之间的剂量；在一个方面中，在10Y.U.和40Y.U.之间。在一个实施方案中，剂量在相同的给剂时期内被给予到个体的不同部位。例如，40Y.U.的剂量可以在一个给剂时期内通过在个体的四个不同部位注射10Y.U.剂量来给予。发明包括将一定量酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)给予到个体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同部位形成单个剂量。一个酵母单位(Y.U.)是
1x107酵母细胞或酵母细胞等同物。
1x107酵母细胞或酵母细胞等同物。
[0144] 治疗组合物的“加强剂”(booster或boosts)在针对抗原的免疫反应已减弱时给予或按需要给予，以提供针对特定抗原的免疫反应或诱发记忆应答。根据被治疗的个体的状态以及给药时的疗法目的(例如，预防、积极治疗、维持)，可以在初始给药后约1、2、3、4、5、6、7、或8周，或者每月、每两月、每季度、每年和/或几年或多年后给予加强剂。在一个实施方案中，给药计划包括在几周到几个月到几年的时间段内，给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。在一个实施方案中，剂量每周或每两周给予，共给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量，然后根据需要每两周或每月给剂以达到对癌症的预防性或治疗性处置。然后可以按照相似或更长的间隔(几月或几年)给予额外的加强剂作为维持或缓解疗法。
[0145] 在发明的一个方面中，将一或多个另外的治疗剂或治疗方案(例如手术切除肿瘤、化疗的进行、放疗的进行、另一种免疫治疗组合物或方案的给予、细胞因子疗法、适应性T细胞转移或干细胞移植)与酵母-短尾畸形免疫治疗组合物顺序和/或同时给予或实行。例如，在给予第一剂酵母-短尾畸形免疫治疗组合物之前或之后给予一或多个疗法。在一个实施方案中，一或多个疗法与酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的给剂交替给予或进行，比如在一个方案中，酵母-短尾畸形组合物以预定的间隔在一或多个连续剂量的化疗或其他疗法之间给予。在一个实施方案中，在开始给予另外的疗法之前，在一个时间段内给予一或多个剂量的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。换句话说，酵母-短尾畸形免疫治疗组合物作为单一疗法给予一段时间，然后增加另外的疗法(例如化疗)，或者是与新剂量的酵母-短尾畸形免疫疗法同时进行，或者与酵母-短尾畸形免疫疗法交替进行。替代地或附加地，在开始给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物之前，给予另一种疗法一段时间，这种构想可以组合(例如，手术切除肿瘤，然后以酵母-短尾畸形免疫疗法作为单一疗法进行几周，然后间隔进行化疗和酵母-短尾畸形免疫疗法几周或几个月，任选之后是使用酵母-短尾畸形免疫疗法或另一种疗法的单一疗法，或者是顺序、同时或交替提供组合疗法的新方案)。发明考虑了利用酵母-短尾畸形免疫疗法治疗癌症的各种方案，这些实施例应当被看作是种种可能方案的非限制性范例。
[0146] 在发明的一个方面中，利用基于酵母的免疫疗法除了靶向短尾畸形，还靶向短尾畸形以外的其他抗原。这些其他靶抗原可以和短尾畸形抗原包含在相同的酵母媒介物中；或者可以制备靶向不同抗原的其他基于酵母的免疫治疗组合物，然后根据要治疗的个体、癌症类型或者个体的特定肿瘤所表达的抗原，和/或根据个体的癌症阶段或者个体的治疗阶段，按照需要进行组合。例如，可以选择覆盖下述的抗原组合:(1)参与癌症发展中影响深远的事件的抗原，比如突变的Ras，(2)参与细胞过程失调或者与它们相关的抗原，比如CEA，和(3)短尾畸形，它参与转移过程。例如，一或多种其他基于酵母的免疫治疗组合物可能表达一或多种抗原，所述抗原包括，但不限于癌胚抗原(CEA)、点突变的Ras癌蛋白、MUC-1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、正常和点突变p53癌蛋白、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤样息肉(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素、NGEP、这些抗原的修饰形式、这些抗原的剪接变体、这些抗原的表位激动剂，以及这些抗原的组合，和/或其免疫原性结构域、其修饰形式、其变体和/或表位激动剂。可以在给予个体酵母-短尾畸形免疫治疗组合物之前、同时或交替、和/或之后给予这些基于酵母的免疫治疗组合物中的一、二、三或更多种，以便优化对个体肿瘤中的抗原的靶向。如上所述，还可以在这些方案中使用其他疗法(例如，手术切除肿瘤、化疗、癌症靶向疗法、放疗等)。
[0147] 在发明的一个实施方案中，提供了治疗癌症的方法。所述方法包括步骤(a)给予个体第一免疫治疗组合物，所述个体患有还未检测到短尾畸形表达的癌症，所述第一免疫治疗组合物包含酵母媒介物和不包括短尾畸形抗原的第一癌抗原；和(b)在给予个体第一免疫治疗组合物之前、同时或者随后给予第二免疫治疗组合物，后者包含酵母媒介物和包括短尾畸形抗原的第二癌抗原。在其他实施方案中，方法可以包括给予一或多个其他免疫治疗组合物，其中所述一或多个其他免疫治疗组合物中的每个包含另外的癌抗原。所述另外的抗原可以是本领域已知的任何抗原或者本文描述过的，包括但不限于突变的Ras、癌胚抗原(CEA)和MUC-1。
[0148] 在发明的另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括下述步骤:(a)给予患有癌症的个体第一免疫治疗组合物，所述第一免疫治疗组合物包含酵母媒介物和突变的Ras抗原；(b)给予(a)中的个体第二免疫治疗组合物，所述第二免疫治疗组合物包含酵母媒介物和选自癌胚抗原(CEA)和粘蛋白-1(MUC-1)的抗原；和(c)给予(a)和(b)中的个体第三免疫治疗组合物，所述第三免疫治疗组合物包含酵母媒介物和短尾畸形抗原。(a)、(b)和(c)中的一或多个给药步骤可以同时或者顺序进行。可以根据需要重复进行步骤来治疗特定个体的癌症，可以在治疗之前或治疗过程中将癌抗原改造以便针对性地解决特定个体的癌症。
[0149] 在本发明的方法中，可以将组合物和治疗性组合物给予动物，包括任何脊椎动物，特别是脊椎动物纲、哺乳纲的任何成员，包括但不限于灵长类、啮齿动物、家畜和家庭宠物。家畜包括被食用或能产生有用产品的哺乳动物(例如，用于生产羊毛的绵羊)。可以利用发明治疗或保护的哺乳动物包括人、非人灵长类、犬、猫、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马和猪。
[0150] “个体”是脊椎动物，比如哺乳动物，包括但不限于人。哺乳动物包括，但不限于农场动物、体育运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。术语“个体”可以与术语“动物”、“受试对象”或“患者”交换使用。
[0151] 可用于本发明的一般技术
[0152] 本发明的实施会应用(除非另有说明)到本领域技术人员熟知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这类技术在文献中有充分解释，比如Methods of Enzymology,Vol.194,Guthrie et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts,
Skinner,et al.,eds.,Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics:a
laboratory course manual,Rose et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1990)；The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology,Pringle et al.,
eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces:Gene Expression,Jones et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The
Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broach
et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)和Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,third edition(Sambrook and Russel,2001)(文中统称为
“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,
1987，包括至2001年的补充材料)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et
al.,eds.,1994)；Harlow and Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Publications,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY
(文中统称为“Harlow and Lane”)；Beaucage et al.eds.,Current Protocols in
Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett and
Doull’s Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen,ed.,6th edition
(2001)以及Vaccines,S.Plotkin and W.Orenstein,eds.,Fifth Edition(2008).
Skinner,et al.,eds.,Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics:a
laboratory course manual,Rose et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1990)；The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology,Pringle et al.,
eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces:Gene Expression,Jones et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The
Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broach
et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)和Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,third edition(Sambrook and Russel,2001)(文中统称为
“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,
1987，包括至2001年的补充材料)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et
al.,eds.,1994)；Harlow and Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Publications,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY
(文中统称为“Harlow and Lane”)；Beaucage et al.eds.,Current Protocols in
Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett and
Doull’s Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen,ed.,6th edition
(2001)以及Vaccines,S.Plotkin and W.Orenstein,eds.,Fifth Edition(2008).
[0153] 一般定义
[0154] (GlobeImmune,Inc.,Louisville,Colorado)通常是指胞外(在表面)、胞内(内部或者胞质)或者既有胞外也有胞内地表达一或多个异源抗原的酵母媒介物。 产品已有概括描述(参见例如美国专利5,830,463)。某些基于酵母
的免疫治疗组合物以及它们的制备方法和一般使用方法也有详细描述，例如美国专利5,
830,463、美国专利7,083,787、美国专利7,736,642、Stubbs et al.,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu et al.,Cancer Research64:5084-5088(2004)和Bernstein et al.,
Vaccine2008Jan24;26(4):509-21，这些文献中的每一个都通过引用全部并入本文。
的免疫治疗组合物以及它们的制备方法和一般使用方法也有详细描述，例如美国专利5,
830,463、美国专利7,083,787、美国专利7,736,642、Stubbs et al.,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu et al.,Cancer Research64:5084-5088(2004)和Bernstein et al.,
Vaccine2008Jan24;26(4):509-21，这些文献中的每一个都通过引用全部并入本文。
[0155] 用于本文，术语“类似物”是指与另一种化合物结构上相似但组成上略有不同(象用不同元素的原子替代一个原子，或者在有特定功能团存在时，一个功能团被另一个功能团代替)的化学化合物。因此，类似物是功能和外表上相似或相当的化合物，但相对参照化合物具有不同的结构或来源。
[0156] 术语“取代的”、“取代衍生物”和“衍生物”在用于描述化合物时，意味着结合在未取代化合物上的至少一个氢被不同原子或化学部分所代替。
[0157] 衍生物虽然具有和母体化合物相似的物理结构，但衍生物可能有和母体化合物不同的化学和/或生物学性能。这类性能可能包括，但不限于与母体化合物相比提高或下降的活性、与母体化合物相比的新活性、提高或下降的生物可得性、提高或下降的效力、提高或下降的体外和/或体内稳定性，和/或提高或下降的吸附性能。
[0158] 一般来说，术语“生物活性的”表明化合物(包括蛋白或肽)通过体内(即在天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察，具有至少一种对细胞、组织或生物的代谢、生理、化学或其他过程有影响的可检测活性。
[0159] 根据本发明，术语“调整(modulate)”可以与调节(regulate)交换使用，通常是指对特定活性的上调或下调。用于本文，术语“上调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的引发、启动、增加、增多、加强、提高、增强、扩大、促进或提供。类似地，术语“下调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的下降、减少(reducing)、抑制、减轻、消除、减少(lessening)、阻断或防止。
[0160] 在本发明的一个实施方案中，文中描述的任何氨基酸序列可以制备为在限定的氨基酸序列的C和/或N端各自侧接了至少一个到最多大约20个额外的异源氨基酸。这样得到的蛋白或多肽可以被称为“基本由(所述限定氨基酸序列)构成”。根据本发明，异源氨基酸是这样的氨基酸序列，所述序列不是天然(即自然界、体内没有)侧接着限定的氨基酸序列的；或者与限定的氨基酸序列的功能无关；或者如果使用给定氨基酸序列所来源的生物的标准密码子对天然序列中的核苷酸进行翻译，则编码所述限定的氨基酸序列的基因中的天然核酸序列的侧翼核苷酸不编码所述序列(即异源序列)。类似地，短语“基本由…构成”在提到本文的核酸序列时使用是指编码限定氨基酸序列的核酸序列，可以在编码该限定氨基酸序列的核酸序列的5’和/或3’端各自侧接从至少一个到最多大约60个额外的异源核苷酸。异源核苷酸不象在天然基因中那样，天然侧接编码限定氨基酸序列的核酸序列(即自然界、体内没有)；或者不编码能够给具有限定氨基酸序列的蛋白带来任何额外功能或者改变蛋白的功能的蛋白。
[0161] 根据本发明，短语“选择性结合”是指本发明的抗体、抗原结合片段或结合伙伴优先结合特定蛋白的能力。更具体地说，短语“选择性结合”是指一个蛋白与另一个(例如，针对某抗原的抗体、抗体片段或结合伙伴)的特异结合，其中通过任何标准检验(例如免疫学分析)测量到它们的结合水平比检验中的背景对照在统计学上显著更高。例如，在进行免疫学分析时，对照一般包括只含有抗体或抗原结合片段的反应孔/管(即没有抗原)，其中在没有抗原情况下，抗体或其抗原结合片段产生的反应量(例如，与孔的非特异性结合)被认为是背景。结合可以利用本领域的多种标准方法，包括酶免疫分析(例如ELISA、免疫印迹分析等)来测量。
[0162] 一般提到的本发明中使用的蛋白或多肽包括给定蛋白的全长蛋白、接近全长的蛋白(上文定义的)、或者这些蛋白的任何片段、结构域(结构的、功能的或者免疫原性的)、构象表位或同源物或变体。融合蛋白也可以统称为蛋白或多肽。根据本发明分离的蛋白是已经被从其自然环境移出(即已经经过人的操作)的蛋白(包括多肽或肽)，并且可以包括例如纯化蛋白、部分纯化的蛋白、重组产生的蛋白和合成产生的蛋白。因此“分离的”不反映蛋白的纯化程度。优选地，本发明的分离的蛋白是重组产生的。根据本发明，术语“修饰”和“突变”可以交换使用，特别是就对本文描述的蛋白或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)进行的修饰/突变来说。
[0163] 用于本文，术语“同源物”或“变体”用来指这样的蛋白或肽，所述蛋白或肽由于对参照蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的次要修饰而不同于参照蛋白或肽，但维持了所述天然形式的基本蛋白和侧链结构。这样的变化包括，但不限于，一个或数个氨基酸侧链的变化；一个或数个氨基酸的变化，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；一个或数个原子的立体化学的变化；和/或次要的衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。同源物或变体与参照蛋白或肽相比可具有加强的、降低的，或基本相似的性能。同源物或变体可以包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物或变体可以用本领域已知的制备蛋白的方法来制备，包括，但不限于直接对分离的参照蛋白进行修饰、直接合成蛋白，或者使用例如经典或重组DNA技术对编码该蛋白的核酸序列进行修饰以产生随机或定向突变，从而得到蛋白变体的编码。此外，可能存在参照蛋白的天然变体(例如异构体、等位基因变体或其他可能从个体到个体发生的天然变体)，可以分离、产生和/或用于发明。
[0164] 给定蛋白的同源物或变体可能包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列(例如文中限定的氨基酸序列或者限定蛋白的氨基酸序列)至少约45%、或至少约50%、或至少约55%、或至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约91%相同、或至少约92%相同、或至少约93%相同、或至少约94%相同、或至少约95%相同、或至少约96%相同、或至少约97%相同、或至少约98%相同、或至少约99%相同(或者45%和99%之间的按整数增加的任何百分比同一性)。在一个实施方案中，同源物或变体包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列小于100%相同、小于约99%相同、小于约98%相同、小于约97%相同、小于约96%相同、小于约95%相同等等，按1%递减到小于约70%相同。
[0165] 用于本文，除非另有说明，提到百分比(%)同一性是指利用下述程序进行的同源性评估：(1)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)基本同源性检索，以标准缺省参数，使用blastp进行氨基酸检索，使用blastn进行核酸检索，其中缺省将查询序列进行低复杂度区域的过滤(比如在Altschul,S.F.,Madden,T.L., ,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs."Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有描述，该文献通过引用并入全部本文)；(2)两个序列的BLAST比对(使用以下描述的参数)；(3)和/或PSI-BLAST，使用标准缺省参数(Position-Specific Iterated BLAST)。应当注意，由于两个序列的Basic BLAST和BLAST之间的标准参数存在一些差异，两个特定序列在使用BLAST程序时可能被识别为有显著的同源性，而在Basic BLAST中使用序列之一作为查询序列进行的检索可能最佳匹配中没有鉴定到第二个序列。此外，PSI-BLAST提供了“profile”检索的自动化的使用简便版本，是一种寻找同源序列的敏感方式。程序首先进行空位BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序利用来自返回的任何明显比对的信息构建位点特异性打分矩阵，以此在下一轮数据库检索中替代查询序列。因此，可以理解通过使用这些程序中的任意一种能够确定百分比同一性。
[0166] 使用BLAST，按照Tatusova and Madden,(1999),"Blast2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"(FEMS Microbiol Lett.174:247-250，通过引用全部并入本文)中描述的那样，将两个特定序列进行相互比对。BLAST2序列比对在blastp或blastn中进行，使用BLAST2.0算法在两个序列间进行空位BLAST检索
(BLAST2.0)，以便在最后得到的比对中引入空位(缺失和插入)。为了清楚起见，利用如下标准缺省参数进行了BLAST序列比对。
(BLAST2.0)，以便在最后得到的比对中引入空位(缺失和插入)。为了清楚起见，利用如下标准缺省参数进行了BLAST序列比对。
[0167] 对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵:
[0168] 匹配得分=1
[0169] 错配罚分=-2
[0170] 开放空位(5)和延伸空位(2)罚分
[0171] gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(11)滤器(开)
[0172] 对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵:
[0173] 开放空位(11)和延伸空位(1)罚分
[0174] gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(3)滤器(开).
[0175] 分离的核酸分子是已经被从其自然环境移出(即，已经经过人的操作)的核酸分子，其自然环境是自然界中发现该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离的”并不一定反映该核酸分子的纯化程度，而是表明所述分子未包含自然界中发现该核酸分子所处的整个基因组或整个染色体或含有一个以上基因的基因组区段。分离的核酸分子可包括完整基
因。包含某基因的分离的核酸分子并不是包含该基因的染色体片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控区，但没有天然存在于同一染色体上的其它基因。分离的核酸分子还可包含基因的一部分。分离的核酸分子还可包含(在序列的5’和/或3’端)侧接有其他核酸的限定的核酸序列，所述其他核酸在自然界中通常不位于该限定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子包括DNA、RNA(例如mRNA)、或者DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白或蛋白结构域的核酸分子或核酸序列而言。
因。包含某基因的分离的核酸分子并不是包含该基因的染色体片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控区，但没有天然存在于同一染色体上的其它基因。分离的核酸分子还可包含基因的一部分。分离的核酸分子还可包含(在序列的5’和/或3’端)侧接有其他核酸的限定的核酸序列，所述其他核酸在自然界中通常不位于该限定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子包括DNA、RNA(例如mRNA)、或者DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白或蛋白结构域的核酸分子或核酸序列而言。
[0176] 重组核酸分子是这样的分子，所述分子包含的编码本文描述的任何一或多个蛋白的任何一个核酸序列可操纵地连接着至少一个任意转录调控序列，其中所述转录调控序列能有效地调控该核酸分子在要转染的细胞中的表达。虽然短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白的核酸分子或核酸序列而言。此外，短语“重组分子”主要指可操纵地连接转录控制序列的核酸分子，但可以与给予动物的短语“核酸分子”互换使用。
[0177] 重组核酸分子包括重组载体，所述重组载体是与编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子可操纵地连接的任何核酸序列，一般是异源序列，其能使所述融合蛋白得以重组产生，并能将所述核酸分子递送到本发明的宿主细胞中。这样的载体可以含有天然状态下与待插入该载体的分离的核酸分子不相邻的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本发明中优选是可用于转染酵母的质粒。重组载体可用在克隆、测序和/或其它对核酸分子的操作中，并可以用于递送这样的分子(例如，象在DNA组合物或基于病毒载体的组合物中那样)。重组载体优选用于核酸分子的表达，还可称为表达载体。优选的重组载体能在所转染的宿主细胞，比如酵母中表达。
[0178] 在本发明的重组分子中，核酸分子可操纵地与表达载体连接，其中所述表达载体含有调控序列，比如转录控制序列、翻译控制序列、复制原点，以及其它与宿主细胞相容并控制本发明的核酸分子的表达的调控序列。特别地，本发明的重组分子包括与一或多个表达控制序列可操纵地连接的核酸分子。短语“可操纵地连接”是指核酸分子与表达控制序列的连接方式使得该分子在转染(即，转化、转导或转染)到宿主细胞中后被表达。
[0179] 根据本发明，术语“转染”用来指可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。当用来指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母时，术语“转化”可与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获取了外源核酸而继承的变化，并且基本上与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于，转化、细胞的化学处理、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
[0180] 以下实验结果是为说明目的而提供的，并不意在限制发明的范围。实施例
[0181] 实施例1
[0182] 以下实施例描述了酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的制备。
[0183] 在本实施例中，酵母(酿酒酵母)经过改造在铜诱导型启动子CUP1或组成型启动子TEF2的调控下表达人短尾畸形，产生了酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。在每种情况中，作为单个多肽产生的包含短尾畸形抗原的融合蛋白以SEQ ID NO:8为代表含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:8的位点1-6，该肽序列还以SEQ ID NO:11代表)；2)SEQ ID NO:6的氨基酸2-435，其中SEQ ID NO:6代表了接近全长的人短尾畸形蛋白(SEQ ID NO:8的位点7-440)；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:8的位点441-446)。如果需要，该融合蛋白中使用的氨基酸序列可以通过使用旁接短尾畸形抗原任意一侧的额外的或替代的氨基酸来进行改造，也可以使用短尾畸形抗原的较短部分。编码融合蛋白SEQ ID NO:8的核酸序列(密码子经过优化用于酵母中的表达)在文中以SEQ ID NO:7代表。
[0184] 简单来说，利用PCR由National Cancer Institute(Dr.Jeffrey Schlom)提供的短尾畸形-PCRII质粒扩增编码全长人短尾畸形蛋白的DNA，然后插入至酵母2μm表达载体中CUP1启动子(载体pGI-100)或TEF2启动子(载体plu011或pGI-172)后面的EcoRI和SpeI克隆位点。还给该质粒载体添加了编码N端稳定肽MADEAP(SEQ ID NO:11)和C端六组氨酸肽的核苷酸序列以编码SEQ ID NO:8所表示的完整融合蛋白。将这样得到的质粒转化到DH5α中以便保存质粒，和转化到酿酒酵母W303α中以便生成酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。
[0185] 通过乙酸锂/聚乙二醇转染对酿酒酵母进行转化，在缺乏尿嘧啶的固体基础培养板(UDM；撤除尿苷的培养基)上选择原代转染细胞。通过30℃在U2(撤除尿苷的培养基)或UL2(撤除尿苷和亮氨酸的培养基)培养基上生长对菌落进行选择。
[0186] 包含受CUP1启动子调控的编码SEQ ID NO:8所示人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在文中被称为GI-6301。包含受TEF2启动子(在载体
plu011中)调控的编码SEQ ID NO:8所示人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在文中被称为GI-6302。包含受TEF2启动子(在载体pGI-172中)调控的编码SEQ ID NO:8所示人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在文
中被称为GI-6303。
plu011中)调控的编码SEQ ID NO:8所示人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在文中被称为GI-6302。包含受TEF2启动子(在载体pGI-172中)调控的编码SEQ ID NO:8所示人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在文
中被称为GI-6303。
[0187] 用以上描述的平板和起始培养物接种不含(U2)或不含尿苷和亮氨酸(UL2)的液体培养基，在30℃，250rpm生长20小时。还接种了含有4.2g/LBis-Tris的经pH缓冲的培养基(BT-U2;BT-UL2)，以便评估在中性pH生产条件下产生的酵母-短尾畸形免疫治疗剂(数据未显示)。使用初级培养物接种相同配置的终培养物。
[0188] U2液体培养基的配方:
[0189] 15g/L葡萄糖
[0190] 6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源
[0191] 各0.04g/L的组氨酸、色氨酸、腺嘌呤和0.06g/L的亮氨酸
[0192] UL2液体培养基的配方:
[0193] 15g/L葡萄糖
[0194] 6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源
[0195] 各0.04g/L的组氨酸、色氨酸、腺嘌呤
[0196] 在起始试验中，比较了受不同启动子调控的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物，CUP1引导的(诱导型表达)酵母-短尾畸形表达通过在酵母-短尾畸形培养物达到约0.2Y.U./ml的密度后添加0.5mM硫酸铜来启动，并持续到培养物达到0.5-1.5Y.U.的密度(加入硫酸铜后酵母短尾畸形只加倍了约1-1.5，但这些细胞产生了大量短尾畸形蛋白)。TEF2引导的酵母-短尾畸形表达是组成性的，这些细胞的生长持续到培养物密度达到1.1-4.0Y.U./ml之间。然后收集各个培养物中的细胞，洗涤并在PBS中56℃处理1小时热灭活。来自各个培养物的活细胞也进行了处理以进行比较。
[0197] 培养物热灭活后，将细胞在PBS中洗三次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合分析法，以及使用抗his标签单克隆抗体和抗短尾畸形抗体(Abcam,Cambridge,MA)进行的Western印迹测量总蛋白表达。利用半定量数字成像方法确定蛋白含量。
[0198] 器是表达试验的结果(数据未显示)表明，本发明的每种酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(即使用CUP1启动子或TEF2启动子的)都表达了短尾畸形融合蛋白，用任何一种培养基(U2和UL2)都有检测到的表达。此外，在热灭活和活的酵母细胞中都有可检测到的抗原表达(数据未显示)。包含CUP1启动子的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(GI-6301)中的短尾畸形表达明显更高，因此该组合物被选中做进一步研究，包括表达优化以及体外和体内试验(参见以下实施例)。
[0199] 图1A显示了使用U2和UL2培养基在GI-6301中的短尾畸形的表达，检测使用了抗短尾畸形抗体。表达非短尾畸形抗原的对照酵母不被所述抗体染色。图1B显示了相同的GI-6301制品中的短尾畸形表达，使用抗His来鉴定短尾畸形融合蛋白上的六组氨酸标签。还显示了表达非短尾畸形抗原但带有六组氨酸标签的对照酵母。这些结果显示，使用任一种培养基都有良好的短尾畸形表达，虽然UL2培养基中的表达显著更高。
[0200] 实施例2
[0201] 以下实施例描述了酵母-短尾畸形免疫治疗组合物GI-6301的抗原表达和制备的条件的鉴定。
[0202] 为了确定铜诱导的GI-6301抗原表达的最佳密度，按照以上实施例1描述的UL2培养基中的标准生长条件制备GI-6301的起始或中间培养物。然后将小份培养物稀释到
0.5Y.U./ml、1.0Y.U./ml和1.5Y.U./ml，在30℃温育1小时。向培养物中加入0.5mM CuSO4诱导短尾畸形表达，并继续培养。在第6和14小时收集并计数细胞以便测量细胞密度。将来自每个条件的20Y.U.热灭活酵母裂解，测量总蛋白，并用抗His生成Western印迹。
0.5Y.U./ml、1.0Y.U./ml和1.5Y.U./ml，在30℃温育1小时。向培养物中加入0.5mM CuSO4诱导短尾畸形表达，并继续培养。在第6和14小时收集并计数细胞以便测量细胞密度。将来自每个条件的20Y.U.热灭活酵母裂解，测量总蛋白，并用抗His生成Western印迹。
[0203] 表1
[0204]
[0205] 如表1所示，铜诱导后酵母仅翻了一倍(其他试验显示最多1.5x翻倍)，铜诱导6小时后细胞密度和活性下降(未显示)。图2显示所有三个诱导密度都造成显著的短尾畸形表达，趋势是诱导密度越高，短尾畸形表达越高。然而，使用2.1Y.U./ml和2.8Y.U./ml起始诱导密度和375μM CuSO4的其他试验显示，蛋白表达随着铜诱导开始时培养物密度的增加而下降，在约6-8小时后没有明显改善(数据未显示)。
[0206] 随后，考察了CuSO4的量对短尾畸形表达的影响。按照实施例1中的描述，在UL2培养基中由起始和中间培养物培养GI-6301。然后将培养物小份稀释到1.0Y.U./ml，在30℃温育1小时。向每个培养物中加入浓度为375μM或500μM的CuSO4，允许蛋白表达的诱导进行到各个时间点(2小时、4小时、6小时、8小时、24小时)，在这些点如上所述收集细胞，热灭活并经处理以便用抗His Western印迹评估蛋白表达。虽然两个CuSO4浓度都导致良好的短尾畸形表达，使用375μM的蛋白表达看来略好，特别是在后期的时间点(数据未显示)。
[0207] 相应地，对于CUP1引导的酵母-短尾畸形(诱导型表达)，发明人发现，在酵母的对数生长中期诱导抗原表达对于抗原生产是最佳的。为制备以下实施例中使用的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(GI-6301)，将细胞在UL2培养基中按照实施例1的描述生长到1和2Y.U./ml之间，然后加入0.375-0.5mM硫酸铜在30℃,250rpm进行最多6-8小时的诱导。收集细胞，洗涤并在PBS中于56℃保持1小时以便热灭活。
[0208] 实施例3
[0209] 以下实施例描述了另一种酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的构建和制备，其中的短尾畸形抗原含有T细胞激动性表位。
[0210] 在本实施例中，酵母(酿酒酵母)经过改造表达人短尾畸形抗原，所述人短尾畸形抗原是包含T细胞表位WLLPGTSTV(SEQ ID NO:13)这种激动性表位的接近全长的短尾畸形蛋白。天然的短尾畸形T细胞表位，例如SEQ ID NO:6或8中显示的，是WLLPGTSTL(SEQ ID NO:12)。人短尾畸形激动性抗原在铜诱导型启动子CUP1控制下表达，产生酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。更具体地说，作为单个多肽产生的包含短尾畸形激动性抗原的融合蛋白(即含有至少一个激动性表位的短尾畸形抗原)以SEQ ID NO:20为代表含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:20的位点1-6，该肽序列还以SEQ ID NO:11代表)；2)SEQ ID NO:18的氨基酸2-435，(以SEQ ID NO:20的位点7-440为代表；SEQ ID NO:18代表与野生型短尾畸形蛋白相比，带有位点254处的单一氨基酸取代的全长人短尾畸形激动剂蛋白)；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:20的位点441-446)。激动性表位(SEQ ID NO:13)位于SEQ ID NO:20的位点251-259(SEQ ID NO:
18的位点246-254)。如果需要，该融合蛋白中使用的氨基酸序列可以通过使用侧接在短尾畸形抗原任何一端的其他或替代氨基酸进行修饰，还可以使用短尾畸形抗原的较短部分。
编码融合蛋白SEQ ID NO:20的核酸序列(密码子经过优化用于在酵母中表达)在文中以SEQ ID NO:19为代表。
18的位点246-254)。如果需要，该融合蛋白中使用的氨基酸序列可以通过使用侧接在短尾畸形抗原任何一端的其他或替代氨基酸进行修饰，还可以使用短尾畸形抗原的较短部分。
编码融合蛋白SEQ ID NO:20的核酸序列(密码子经过优化用于在酵母中表达)在文中以SEQ ID NO:19为代表。
[0211] 简单来说，编码实施例1中描述的接近全长人的短尾畸形蛋白(即，全长短尾畸形蛋白减去N端甲硫氨酸)的DNA经PCR扩增，然后插入至酵母2μm表达质粒中CUP1启动子(载体pGI-100)后面的EcoRI和SpeI克隆位点，所述接近全长的人短尾畸形蛋白与全长短尾畸形蛋白相比，经定点突变在位点254的亮氨酸被缬氨酸取代。还给该质粒载体添加了编码N端稳定肽MADEAP(SEQ ID NO:11)和C端六组氨酸肽的核苷酸序列以编码SEQ ID NO:20所表示的完整融合蛋白。将这样得到的质粒转化到DH5α中以便保存质粒，和转化到酿酒酵母W303α中以便生成酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。
[0212] 通过乙酸锂/聚乙二醇转染对酿酒酵母进行转化，在缺少尿嘧啶的固体基础培养板(UDM；撤除尿苷的培养基)上选择原代转染细胞。通过30℃在UL2培养基(撤除尿苷和亮氨酸的培养基)上生长对菌落进行选择。
[0213] 包含受CUP1启动子控制的编码SEQ ID NO:20所示人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物在文中被称为GI-6305。
[0214] 将GI-6305细胞如实施例1所述在UL2培养基中生长至1和2Y.U./ml之间，然后添加0.375-0.5mM硫酸铜在30℃,250rpm进行最多6-8小时的诱导，使用的条件是如实施例2中描述的发明人给GI-6301开发的。收集细胞，洗涤并在PBS中56℃处理1小时进行热灭活。
[0215] 培养物热灭活后，将细胞在PBS中洗三次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合分析法，以及使用抗his标签单克隆抗体和抗短尾畸形抗体(Abcam,Cambridge,MA)进行的Western印迹测量总蛋白表达。利用半定量数字成像方法确定蛋白含量。
[0216] 图1C显示了GI-6305中短尾畸形激动性抗原的强劲表达，使用抗His来鉴定短尾畸形融合蛋白上的六组氨酸标签。在UL2培养基中生长的GI-6305的大概抗原含量>22615ng/Y.U.。
[0217] 实施例4
[0218] 以下实施例显示了利用本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物对短尾畸形特异性T细胞进行的增殖。
[0219] 为了确定来自正常供体的T细胞是否能够产生对短尾畸形抗原特异的T细胞，由两个正常供体的外周血单核细胞(PBMCs)制备树突细胞(DCs)。简单来说，将分离的PBMCs在有GM-CSF和IL-4的情况下培养5天，随后与对照酵母(又表示为“YVEC”，其为转化了空载体或者不含编码抗原的插入片段的载体的酿酒酵母)或短尾畸形酵母(GI-6301，如以上实施例1和2中描述的)以1：1的酵母：DCs比率一起温育。共培养48小时后，用DCs作为APCs来刺激自体T细胞。每个刺激周期(被命名为IVS，即体内刺激)的构成如下：在没有IL-2的情况下培养3天，然后在有重组IL-2(20U/ml)的情况下培养额外的4天。在IVS2结束时，用对照四聚体或者特异于短尾畸形肽Tp2(WLLPGTSTL，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的位点246-254)的四聚体将T细胞染色。表2显示了被每种四聚体阳性染色的CD8+T细胞的百分比。
[0220] 表2
[0221]
[0222] 在第二个试验中，通过在有GM-CSF和IL-4的情况下培养5天，由9个正常供体的PBMCs制备树突细胞(DCs)，随后如上所述与短尾畸形酵母(GI-6301)以1：1的酵母：DCs比率一起温育。共培养48小时后，用DCs作为APCs来刺激自体T细胞。每个IVS周期如上所述进行。
在IVS2结束时，用对照四聚体或者特异于短尾畸形肽Tp2的四聚体将T细胞染色。表3显示了被每种四聚体阳性染色的CD8+T细胞的百分比。
在IVS2结束时，用对照四聚体或者特异于短尾畸形肽Tp2的四聚体将T细胞染色。表3显示了被每种四聚体阳性染色的CD8+T细胞的百分比。
[0223] 表3
[0224]
[0225] 表2和3的结果显示，与对照相比，用本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗剂刺激正常供体T细胞，提高了多数正常供体中的四聚体阳性CD8+T细胞的百分比，这表明正常人T细胞有能力将短尾畸形识别为免疫原。
[0226] 实施例5
[0227] 以下实施例显示了酵母-短尾畸形免疫治疗组合物由正常供体PBMCs产生能裂解表达短尾畸形的目标的短尾畸形特异性CTLs的能力。
[0228] 在本试验中，来自以上表2中三个正常供体的短尾畸形特异性T细胞在体外利用与短尾畸形酵母(GI-6301)温育两轮IVS(如实施例4所述)的DCs进行增殖。第三个IVS用在有CD40L的情况下成熟化的DCs进行，并用短尾畸形特异性Tp2肽(WLLPGTSTL，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的位点246-254)脉冲。在第5天，分离CD8+T细胞，用于抗SW480(HLA-A2+/短尾畸形高水平)和MCF7(HLA-A2+/短尾畸形低水平)肿瘤细胞目标的过夜细胞毒性T淋巴细胞(CTL)检验，效应子：目标物(ET)比率如示(参见图3)。
[0229] 表4显示的是对照四聚体相比于短尾畸形特异性Tp2四聚体的阳性染色CD8+T细胞的百分比。
[0230] 表4
[0231]
[0232] 图3A(供体07706)、3B(供体17663)和3C(供体26532)显示来自三个正常供体中的两个的PBMCs能够产生可以杀死表达短尾畸形的目标的CD8+CTLs。总之，这些数据表明酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以产生能够杀死表达短尾畸形的肿瘤细胞的短尾畸形特异性CTLs。
[0233] 为了显示酵母-短尾畸形免疫疗法可以在没有特异肽脉冲的情况下诱导短尾畸形特异性CTLs(即通过产生抗可能的多个不同CTL表位的CTLs)，使用只用了酵母-短尾畸形免疫治疗组合物GI-6301(即没有肽脉冲)在体外增殖的正常供体T细胞进行额外的试验。简单来说，将来自正常供体PBMCs(供体19063)的短尾畸形特异性T细胞通过使用与GI-6301温育了两轮IVS的DCs(如实施例4所述)在体外增殖。在第5天，分离CD8+T细胞，用于抗SW480
(HLA-A2+/短尾畸形高水平)和H226(HLA-A2-/短尾畸形高水平)肿瘤细胞的过夜CTL检验，效应子：目标物(ET)比率为15：1。图4A显示了SW480和H226肿瘤细胞特异性裂解的百分比。图
4B显示了通过实时RT-PCR测出的SW480和H226肿瘤细胞中短尾畸形mRNA相对GAPDH的表达。
这些试验进一步显示酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以产生能够杀死表达短尾畸形的肿瘤细胞的短尾畸形特异性CTLs。
(HLA-A2+/短尾畸形高水平)和H226(HLA-A2-/短尾畸形高水平)肿瘤细胞的过夜CTL检验，效应子：目标物(ET)比率为15：1。图4A显示了SW480和H226肿瘤细胞特异性裂解的百分比。图
4B显示了通过实时RT-PCR测出的SW480和H226肿瘤细胞中短尾畸形mRNA相对GAPDH的表达。
这些试验进一步显示酵母-短尾畸形免疫治疗组合物可以产生能够杀死表达短尾畸形的肿瘤细胞的短尾畸形特异性CTLs。
[0234] 实施例6
[0235] 以下实施例显示本发明的酵母-短尾畸形组合物能够增殖来自癌症患者的短尾畸形特异性T细胞。
[0236] 在本试验中，由两名用包含CEA和MUC-1抗原的病毒载体疫苗接种后的乳腺癌患者的PBMCs制备DCs。如实施例4的描述，在有GM-CSF和IL-4的情况下的5天培养中制备DCs，之后在有短尾畸形酵母(GI-6301)的情况下温育，酵母：DCs比率为1：1。共培养48小时后，用DCs作为APCs来刺激自体T细胞。每轮IVS的构成如下：在没有IL-2的情况下培养3天，然后在有重组IL-2(20U/ml)的情况下培养额外的4天。表5显示的是被对照四聚体或特异于短尾畸形肽Tp2的四聚体阳性染色的CD8+T细胞的百分比(IVS1)。
[0237] 表5
[0238]
[0239] 表5中的结果显示，用本发明的酵母-短尾畸形组合物对来自乳腺癌供体的T细胞的刺激，与对照相比提高了多数供体中四聚体阳性CD8+T细胞的百分比，这表明来自正患有癌症的供体的T细胞有识别短尾畸形为免疫原的能力。
[0240] 实施例7
[0241] 以下实施例显示体内使用酵母-短尾畸形疗法产生了对短尾畸形特异的CD4+T细胞反应。
[0242] 在本试验中，用4YU酵母-h短尾畸形(GI-6301)将C57BL/6小鼠每周接种，共四次，是在四个独立的注射部位，每个部位1YU)。末次加强剂的两周后，将小鼠处死，纯化CD4+T细胞，并检测在有各种浓度的短尾畸形纯化蛋白(从昆虫细胞获得)的情况下的增殖情况。使用40μg/ml的β-Gal作为对照。
[0243] 显示从动物脾分离的CD4+T细胞的增殖情况的结果如图5所示，其中所述动物用酵母-对照(YVEC，见实施例4)和酵母-hBrachyury(GI-6301)进行了接种。图5显示用酵母-短尾畸形(GI-6301)进行的免疫产生了短尾畸形特异性CD4+T细胞。
[0244] 实施例8
[0245] 以下实施例显示用酵母-短尾畸形免疫治疗组合物进行免疫减少了体内的表达短尾畸形的肿瘤。
[0246] 在该试验中，C57BL/6小鼠经尾静脉接受了1x106MC38-phBrachyur细胞(表达重组人短尾畸形的MC38肿瘤细胞)(第0天)。肿瘤移植的4天后动物们开始每周接种酵母对照(YVEC，见实施例4)或酵母-hBrachyury(GI-6301)，是以每个部位1YU的剂量在四个不同部位进行(每剂共4YU)。在肿瘤移植的40天后，将动物们处死并评估肺肿瘤结节数量。两个组合试验的结果如图6所示。表6显示了平均肺肿瘤数量(±SEM)和带有≥5个肺肿瘤结节的动物的数量(和百分比)。
[0247] 表6
[0248]
[0249] 图6和表6中的结果表明，与只接受酵母(没有短尾畸形抗原)的小鼠相比，给予本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物能够减少小鼠中的表达短尾畸形的肿瘤。
[0250] 实施例9
[0251] 以下实施例显示在从健康供体获得的人外周血单核细胞(PBMCs)中使用酵母-短尾畸形免疫疗法，产生了短尾畸形特异性CD4+T细胞反应。
[0252] 在以下试验中，经由杆状病毒表达在昆虫细胞中表达了全长人短尾畸形蛋白，并随后进行了纯化。
[0253] 通过在有GM-CSF和IL-4的情况下培养5天，由健康供体的PBMC制备树突细胞(DCs)，随后用酵母对照(YVEC，见实施例4)或酵母-短尾畸形(GI-6301，见实施例1和2)(酵母:DCs比率=1:1)体外处理。48小时后，收集DCs，照射(30Gy)并用于刺激自体PBMCs，比率为DC:PBMCs=1:10。在第三天，向培养物中加入IL-2(10U/ml)。第7天，收集经刺激的T细胞随后检测IFN-γ产生情况，所述IFN-γ产生是应答单独的经过照射的自体PBMCs(T细胞:PBMCs比率=1:3)、或者有10μg/ml纯化的短尾畸形蛋白或对照血清白蛋白存在时的IFN-γ产生。
在刺激96小时之后，收集上清并通过ELISA分析评估IFN-γ水平。共对9名健康供体进行了评估，3/9的供体显示用酵母-短尾畸形处理的DCs刺激后有短尾畸形特异性CD4+T细胞反
应。表7中给出了3个阳性案例的结果(数据表示减去用对照人血清白蛋白刺激所诱导的背景水平后，应答短尾畸形蛋白时的IFN-γ水平；对于供体3在评估对短尾畸形蛋白的应答前进行了两轮刺激)。
在刺激96小时之后，收集上清并通过ELISA分析评估IFN-γ水平。共对9名健康供体进行了评估，3/9的供体显示用酵母-短尾畸形处理的DCs刺激后有短尾畸形特异性CD4+T细胞反
应。表7中给出了3个阳性案例的结果(数据表示减去用对照人血清白蛋白刺激所诱导的背景水平后，应答短尾畸形蛋白时的IFN-γ水平；对于供体3在评估对短尾畸形蛋白的应答前进行了两轮刺激)。
[0254] 表7
[0255]
[0256] 另外6个健康供体在用酵母-短尾畸形(GI-6301)处理的DCs体外刺激后，通过CD4+细胞中IFN-γ的胞内细胞因子染色评估了对短尾畸形蛋白的CD4+T细胞反应。通过在有GMCSF和IL-4的情况下培养5天，由健康供体的PBMCs制备树突细胞，随后用酵母对照(YVEC)或酵母-短尾畸形(GI-6301)(酵母:DCs比率=1:1)体外处理。48小时后，收集DCs，照射
(30Gy)并用于刺激自体PBMCs，比率为DC:PBMCs=1:10。在第三天，向培养物中加入IL-2
(10U/ml)。第7天，收集经刺激的T细胞，随后检测IFN-γ产生情况，所述IFN-γ产生是应答单独的自体PBMCs(T细胞:PBMCs比率=1:3)、或者有10μg/ml纯化的短尾畸形蛋白或对照人血清白蛋白存在时的IFN-γ产生。刺激2小时之后，向培养物中加入BD GOLGISTOPTM蛋白转运抑制剂(BD Biosciences)。刺激4小时之后，收集细胞，进行通透化并用抗CD4PerCP-
Cy5.5和抗IFN-γFITC抗体(BD Biosciences)对CD4和IFN-γ染色。共评估了6名健康供体，
2/6的供体显示用酵母-短尾畸形处理的DCs体外刺激后有短尾畸形特异性CD4+T细胞反应。
表8中显示了这些阳性案例的结果(数据表示减去单独用PBMCs所诱导的背景水平后，应答对照人血清白蛋白(HSA)或短尾畸形蛋白时对CD4和胞内IFN-γ同时为阳性的T细胞的百分比)。
(30Gy)并用于刺激自体PBMCs，比率为DC:PBMCs=1:10。在第三天，向培养物中加入IL-2
(10U/ml)。第7天，收集经刺激的T细胞，随后检测IFN-γ产生情况，所述IFN-γ产生是应答单独的自体PBMCs(T细胞:PBMCs比率=1:3)、或者有10μg/ml纯化的短尾畸形蛋白或对照人血清白蛋白存在时的IFN-γ产生。刺激2小时之后，向培养物中加入BD GOLGISTOPTM蛋白转运抑制剂(BD Biosciences)。刺激4小时之后，收集细胞，进行通透化并用抗CD4PerCP-
Cy5.5和抗IFN-γFITC抗体(BD Biosciences)对CD4和IFN-γ染色。共评估了6名健康供体，
2/6的供体显示用酵母-短尾畸形处理的DCs体外刺激后有短尾畸形特异性CD4+T细胞反应。
表8中显示了这些阳性案例的结果(数据表示减去单独用PBMCs所诱导的背景水平后，应答对照人血清白蛋白(HSA)或短尾畸形蛋白时对CD4和胞内IFN-γ同时为阳性的T细胞的百分比)。
[0257] 表8
[0258]
[0259] 实施例10
[0260] 以下实施例显示表达短尾畸形激动性抗原的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物从前列腺癌患者产生了短尾畸形特异性T细胞。
[0261] 为了产生短尾畸形特异性T细胞系，将未成熟的自体树突细胞(DCs)与被称为GI-6305的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(见实施例3)以DCs:GI-6305=1:1的比率接触48小
时，随后作为抗原递呈细胞(APCs)以10：1的效应子对APC比率刺激自体非贴壁细胞。培养物于37℃，在含有5%CO2的潮湿氛围中温育3天，随后补充浓度为20U/ml的重组人IL-2额外7天。所述的10天培养构成了一轮体外刺激(IVS)。第11天，T细胞用接触过GI-6305的自体DCs如上所述再次刺激，从而开始下一个IVS周期。使用接触过GI-6305的自体DCs作为APCs进行三轮IVS。第三轮IVS后，将照射(23,000rads)过的转化了EBV的自体B细胞，用激动剂短尾畸形肽WLLPGTSTV(SEQ ID NO:13)脉冲后作为APCs。建立了表示为T-2-BR-A的短尾畸形特异性T细胞系。该T细胞系如下所述用于免疫检验。
时，随后作为抗原递呈细胞(APCs)以10：1的效应子对APC比率刺激自体非贴壁细胞。培养物于37℃，在含有5%CO2的潮湿氛围中温育3天，随后补充浓度为20U/ml的重组人IL-2额外7天。所述的10天培养构成了一轮体外刺激(IVS)。第11天，T细胞用接触过GI-6305的自体DCs如上所述再次刺激，从而开始下一个IVS周期。使用接触过GI-6305的自体DCs作为APCs进行三轮IVS。第三轮IVS后，将照射(23,000rads)过的转化了EBV的自体B细胞，用激动剂短尾畸形肽WLLPGTSTV(SEQ ID NO:13)脉冲后作为APCs。建立了表示为T-2-BR-A的短尾畸形特异性T细胞系。该T细胞系如下所述用于免疫检验。
[0262] 表9显示了短尾畸形特异性T细胞(T-2-BR-A)在用经GI-6305处理过的同种异体DCs刺激后释放显著水平的IFN-γ，而对照酵母(YVEC，见实施例4)不能刺激T-2-BR-A细胞释放IFN-γ。结果表示为pg/ml/105T细胞。简单来说，来自正常供体的同种异体HLA-A2阳性DCs用GI-6305在不同的酵母比对DC之比率(如表9所示)下处理48小时，然后用于刺激短尾畸形激动性表位特异性T细胞(T-2-BR-A)。在该试验中，DC对T细胞的比率为1:10。
[0263] 表9
[0264]树突细胞 处理 酵母/DC比率 T细胞 IFN-γ
+ 对照酵母 10:1 - <15.6
+ 对照酵母 10:1 + <15.6
- - - + 52.1
+ GI-6305 10:1 - <15.6
+ GI-6305 10:1 + 589.0
+ GI-6305 5:1 - <15.6
+ GI-6305 5:1 + 661.1
+ GI-6305 2.5:1 - <15.6
+ GI-6305 2.5:1 + 341.3
+ GI-6305 1:1 - <15.6
+ GI-6305 1:1 + 388.2
+ 对照酵母 10:1 - <15.6
+ 对照酵母 10:1 + <15.6
- - - + 52.1
+ GI-6305 10:1 - <15.6
+ GI-6305 10:1 + 589.0
+ GI-6305 5:1 - <15.6
+ GI-6305 5:1 + 661.1
+ GI-6305 2.5:1 - <15.6
+ GI-6305 2.5:1 + 341.3
+ GI-6305 1:1 - <15.6
+ GI-6305 1:1 + 388.2
[0265] 表10显示了利用GI-6305处理过的DCs建立的短尾畸形特异性T细胞能够有效地裂解HLA-A2阳性/短尾畸形阳性的MDA-MB-231乳腺癌细胞，但不能裂解HLA-A2阴性/短尾畸形阳性的ASPC-1胰腺癌细胞。简单来说，短尾畸形特异性T细胞系T-2-BR-A在IVS-6时被用于过夜细胞毒性T淋巴细胞(CTL)检验抗MDA-MB-231(HLA-A2+/短尾畸形+)和ASPC-1(HLA-A2-/短尾畸形+)肿瘤细胞目标，效应子:目标(ET)比率如示(见表10)。结果表示为发生特异裂解的百分比。
[0266] 表10
[0267]E:T比率 MDA-MB-231 ASPC-1
25:1 52.2(2.8) -5.1(2.6)
12.5:1 23.8(1.4) 0.2(5.6)
6.25:1 13.9(4.4) 2.3(3.3)
25:1 52.2(2.8) -5.1(2.6)
12.5:1 23.8(1.4) 0.2(5.6)
6.25:1 13.9(4.4) 2.3(3.3)
[0268] 在另一个试验中，评估了T-2-BR-A细胞系结合短尾畸形特异性HLA-A2四聚体的能力。简单来说，将T-2-BR-A细胞(在IVS-4时投入使用)用对照四聚体或者短尾畸形激动剂肽特异性四聚体染色。图7A和7B显示用GI-6305处理过的DCs生成的T-2-BR-A细胞系中有10.8%的CD8+T细胞能够特异结合短尾畸形-HLA-A2四聚体(图7B)，但不结合对照四聚体(图
7A)。
7A)。
[0269] 通过流式细胞术分析T-2-BR-A T细胞系的穿孔素表达(穿孔素是细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的细胞裂解活性的介质)。简单来说，T细胞在用短尾畸形激动剂肽脉冲的转化了EBV的自体B细胞重新刺激后第5天进行测试。图8显示用短尾畸形激动剂肽脉冲的自体B细胞刺激后，T-2-BR-A细胞系中穿孔素的表达，进一步表明该短尾畸形特异性T细胞系利用GI-6305处理过的DCs生成的细胞毒能力。
[0270] 实施例11
[0271] 以下实施例描述了在患有短尾畸形阳性癌症的受试对象中进行的I期临床试验。
[0272] 用实施例1、2和4-9中描述的命名为GI-6301的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物启动开放性的、依序剂量递增的I期临床试验。在这个临床试验方案中，9-18名癌症患者(每个剂量组3-6名患者)按依序剂量递增方案给予酵母-短尾畸形免疫治疗组合物GI-6301，是皮下给药4Y.U.(1Y.U.x4个部位，意味着每次就诊，在患者身体的四个不同部位给予1Y.U.GI-
6301)、16Y.U.(4Y.U x4个部位)和40Y.U.(10Y.U.x4个部位)。每间隔两周给予GI-6301，共7次就诊(～3个月)，然后每月给药直到患者达到脱离研究(off-study)的标准。在最大耐受剂量(MTD)组或观察到最好剂量的组中选出一个患者大组(n-10)进行其他研究。结果是监测安全性和耐受性作为主要终点，在扩展群中，还监测了是否有T细胞前体的显著变化，这是通过ELISpot检验中短尾畸形特异性T细胞的增加和应答短尾畸形蛋白(例如，由于处理导致的短尾畸形特异性CD8+或CD4+T细胞的出现或扩增)时的增殖来测量的。作为次要终点，测量了诸如无进展式的存活、临床放射照相反应(clinical radiographic response)、血清标记物的减少和/或循环肿瘤细胞的减少等等临床获益，以及整体免疫激活的参数，包括外周血中免疫细胞子集(CD8+记忆/效应T细胞、CD4+记忆/效应T细胞、Tregs、NK细胞、DCs)的频率和细胞因子(例如IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、TGF-β等)的血清水平变化。
6301)、16Y.U.(4Y.U x4个部位)和40Y.U.(10Y.U.x4个部位)。每间隔两周给予GI-6301，共7次就诊(～3个月)，然后每月给药直到患者达到脱离研究(off-study)的标准。在最大耐受剂量(MTD)组或观察到最好剂量的组中选出一个患者大组(n-10)进行其他研究。结果是监测安全性和耐受性作为主要终点，在扩展群中，还监测了是否有T细胞前体的显著变化，这是通过ELISpot检验中短尾畸形特异性T细胞的增加和应答短尾畸形蛋白(例如，由于处理导致的短尾畸形特异性CD8+或CD4+T细胞的出现或扩增)时的增殖来测量的。作为次要终点，测量了诸如无进展式的存活、临床放射照相反应(clinical radiographic response)、血清标记物的减少和/或循环肿瘤细胞的减少等等临床获益，以及整体免疫激活的参数，包括外周血中免疫细胞子集(CD8+记忆/效应T细胞、CD4+记忆/效应T细胞、Tregs、NK细胞、DCs)的频率和细胞因子(例如IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、TGF-β等)的血清水平变化。
[0273] GI-6301预期是安全的并且能够良好耐受，没有明显的毒性。此外，预期GI-6301能够在至少部分或大部分患者中产生治疗表现性(treatment-emergent)的短尾畸形特异性T细胞反应或者已有短尾畸形特异性基线T细胞反应的提高。还预期一些患者会有被稳定的疾病。
[0274] 在另外的研究或者本研究的扩展中，将被称为GI-6305的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物(见实施例3)给予另外的患者群，使用的是以上确定的最大耐受剂量或观察到的测试剂量，并测量相同的主要和次要终点。GI-6305也被预期是安全的并且能够良好耐受，没有明显的毒性，并且能够在至少部分或大部分患者中产生治疗表现性(treatment-emergent)的短尾畸形特异性T细胞反应或者已有短尾畸形特异性基线T细胞反应的提高。
还预期一些患者会有被稳定的疾病。
还预期一些患者会有被稳定的疾病。
[0275] 实施例12
[0276] 以下实施例描述了利用酵母-短尾畸形免疫治疗组合物进行的II期临床试验。
[0277] 在乳腺癌患者中进行的随机化II期临床试验使用了实施例1和2(例如GI-6301)或实施例3(GI-6305)中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物。招收了至少100名或以上的含有I、II或III期短尾畸形阳性乳腺癌的受试对象。受试对象纳入标准包括患有1、2或3级癌症的受试对象。受试对象纳入标准还包括患有“三重阴性”乳腺癌(雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和HER2均呈阴性的癌症)的个体。受试对象纳入标准还可以包括患有淋巴结阴性癌症的患者。
[0278] 试验以双盲或开放性、安慰剂控制、多中心试验进行。所有患者接受护理标准疗法，其中患者的治疗臂在治疗过程中接受酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的几个系列注射。主要终点是无复发存活或总体存活。其他终点可以包括抗原特异性T细胞反应(例如，处理时短尾畸形特异性CD8+T细胞的出现或扩增)、保持淋巴结阴性、转移进展和肿瘤细胞中的短尾畸形表达。
[0279] 酵母-短尾畸形免疫治疗组合物预期是安全的并且能够良好耐受，没有明显的毒性。此外，预期酵母-短尾畸形免疫治疗组合物能够在至少部分或大部分患者中产生治疗表现性(treatment-emergent)的短尾畸形特异性T细胞反应和/或已有短尾畸形特异性基线T细胞反应的提高。还预期一些或大部分患者会有被稳定的疾病，保持淋巴结阴性和/或预防、减少或遏制转移进展。
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