阿托伐他汀钙的氧化降解产物
阅读：915发布：2020-05-14
专利汇可以提供阿托伐他汀钙的氧化降解产物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 阿托伐他汀 钙 的 氧 化降解产物及其制备方法。本发明还涉及基本上不含氧化降解产物的 阿托伐他汀钙 和含有此阿伐他汀钙的药物组合物。，下面是阿托伐他汀钙的氧化降解产物专利的具体信息内容。
1.4-[6-(4-氟-苯基)-6-羟基-1b-异丙基-6a-苯基-1a-苯基氨甲酰基-六氢-1，
2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸。
2.4-(4-氟-苯基)-2，4-二羟基-2-异丙基-5-苯基-3，6-二氧杂-二环[3.1.0]己烷-1-甲酸苯基酰胺。
3.4-[1b-(4-氟-苯基)-6-羟基-6-异丙基-1a-苯基-6a-苯基氨甲酰基-六氢-1，
2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸。
4.制备化合物的方法，所述的化合物选自4-[6-(4-氟-苯基)-6-羟基-1b-异丙基-6a-苯基-1a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸、4-(4-氟-苯基)-2，4-二羟基-2-异丙基-5-苯基-3，
6-二氧杂-二环[3.1.0]己烷-1-甲酸苯基酰胺和4-[1b-(4-氟-苯基)-6-羟基-6-异丙基-1a-苯基-6a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸，其特征在于使固体阿托伐他汀盐在空气或氧气氛围中在
40-90℃的升高温度下氧化。
5.权利要求4的方法，其中固体阿托伐他汀盐选自阿托伐他汀钙盐、钠盐、钾盐、镁盐和铵盐。
6.权利要求4的方法，其中阿托伐他汀盐的氧化在阿托伐他汀盐在水和/或选自乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷的溶剂的混合物中的溶液中通过在40℃至90℃的温度下加入过氧化氢或向溶液中充入空气或氧气来进行。
7.制备化合物的方法，所述的化合物选自4-[6-(4-氟-苯基)-6-羟基-1b-异丙基-6a-苯基-1a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸、4-(4-氟-苯基)-2，4-二羟基-2-异丙基-5-苯基-3，
6-二氧杂-二环[3.1.0]己烷-1-甲酸苯基酰胺和4-[1b-(4-氟-苯基)-6-羟基-6-异丙基-1a-苯基-6a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸，其特征在于将阿托伐他汀盐溶液暴露在日光或人工日光下。
8.权利要求7的方法，其中阿托伐他汀盐选自阿托伐他汀钙盐、钠盐、钾盐、镁盐和铵盐。
9.权利要求4至8中任一项的方法，其中另外包括一步或多步分离步骤。
10.权利要求9的方法，其中分离步骤选自制备型正相和反相色谱法。
11.权利要求10的方法，其中在制备型正相色谱法中采用硅胶或选自氨基丙基、氰基丙基、二醇和硝基苯基的基于硅胶的键合相。
12.权利要求11的方法，其中在制备型正相色谱法中流动相包含极性调节剂醇与乙腈的混合物以及选自己烷、二氯甲烷、甲基环己烷及其任意组合的非极性溶剂的混合物，其中所述的醇选自甲醇、乙醇和丙醇。
13.权利要求10的方法，其中在制备型反相色谱法中采用键合于硅胶的十八烷基硅胶或辛基硅胶。
14.权利要求13的方法，其中在制备型反相色谱法中流动相包含水与有机或无机缓冲剂的混合物以及一种或多种选自醇和乙腈的有机调节剂的混合物。
阿托伐他汀钙的氧化降解产物
[0002] 药物活性物质的纯度已经一直被认为是确保药物安全性和质量的重要因素。在本领域众所周知的是，在生产药物活性物质的过程中，多步不同复杂步骤的结果不仅是所需的产物，而且还包括结构与化合物密切相关的杂质。此外，许多药物活性物质对环境的影响敏感，例如温度、pH、湿度、光、气体、氧气、二氧化碳，以及在处理或储存过程中环境介质的反应活性。这些环境因素的影响可导致药物活性化合物转变为有效性通常低于活性化合物的降解产物。降解产物除有效性较低外，还可能引起不期望的副作用，从而对用药安全产生不利的影响。即使在活性物质中存在极少百分比的杂质或降解产物也可能显著损害药物的安全性。因此，用药时药物活性物质尽可能纯是非常重要的；这意味着在药物活性物质中存在的降解产物和杂质的百分比应该最小。
[0003] 此外，药物剂型中使用的药用赋形剂也可影响药物活性物质中存在的降解产物和杂质的量。药用赋形剂自身的降解产物可充当反应活性位点触发药物剂型中的药物活性物质的降解反应。
[0004] 多种药物活性物质对氧化降解的敏感性在Waterman，K.C.等人的“药物对氧化降解的稳定性”(“Stabilization of Pharmaceuticals to Oxidative Degradation”，Pharmaceutical Development and Technology，7(1)，2002，1-32)一文中有描述，它也展示了使药物活性物质对氧化降解稳定的可能途径。上述文章提出，固体药物剂型的氧化机理研究是困难和费力的，因为该机理在所述领域几乎没有报告指出，然而该文章教导，活性物质本身以及更大程度上是药物剂型中的活性物质可以发生氧化。Byrn，S.R.等人(Solid-State Chemistry of Drugs，第2版，SSCI，West Lafayette，1999)公开：来自大气的分子氧与有机晶体反应，其反应活性取决于活性物质的晶形和形态，它们分别决定对氧的可通透性及其在晶格中的溶解性。在某些实例中反应活性随熔点的升高表现出降低，提示较高的晶格能抑制氧的扩散。
[0005] 至今已经采用了不同的方法来防止或减少药物制剂中活性物质的氧化，例如：
[0006] 1.在氧化由赋形剂中过氧化物和金属杂质的存在引起的情况下，增加药物制剂中活性物质的浓度；
[0008] 3.使用高纯度的药用赋形剂；
[0009] 4.使用供选的药用赋形剂，或者减少药物组合物中赋形剂的量，特别是当赋形剂由于过氧化物杂质成为氧化的起因时；
[0011] 过一些适宜的抗氧化剂，包括：
[0012] -链终止剂(如硫醇类和苯酚类)；
[0014] -依据Fenton方法的原理降解过氧化物的过氧化物“清除剂”(如Fe2+)。然而它们的使用有限，因为通过这种方法可形成游离羟基，它可进一步诱导自由基反应且由此诱导活性物质的降解。
[0015] -掩盖活性物质受氧化位点的环糊精(Waterman，K.C.等人，药物对氧化降解的稳定性，Pharmaceutical Development and Technology，7(1)，2002，1-32)[0016] 然而，个别活性物质不可能达到最佳模式，并且在本领域几乎不能获得出版物(Waterman，K.C.等人，药物对氧化降解的稳定性，PharmaceuticalDevelopment and Technology，7(1)，2002，1-32)。
[0017] 阿托伐他汀钙，其化学名为(R-(R*，R*))-2-(4-氟苯基)-β，δ-二羟基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-((苯氨基)-羰基)-1H-吡咯基-1-庚酸的半钙盐，已知为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。它首次在美国专利No.5273995中被述及。阿托伐他汀钙及其关键中间体的制备方法在美国专利号5,003,080、5,097,045、5,103,024、5,124,482、5,149,837、5,155,251、5,216,174、5,245,047、5,248,793、
5,280,126、5,342,952和5,397,792中有描述。
5,280,126、5,342,952和5,397,792中有描述。
[0018] HMG-CoA还原酶抑制剂已知是对环境pH、湿度、光、温度、二氧化碳和氧气敏感的药物活性物质。它们已知是有效治疗与脂质和胆固醇代谢相关的血脂异常症和心血管疾病的治疗活性物质，所述的血脂异常症和心血管疾病选自血脂异常症、高脂血症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠状动脉疾病、冠心病等。他汀类化合物的作用机理是通过抑制人或动物肝脏中胆固醇和其他甾醇的生物合成而实现的。它们是HMG-CoA还原酶或3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的竞争性抑制剂，所述的酶催化人或动物肝脏中HMG-CoA还原酶向甲羟戊酸的转化，该转化是肝脏中胆固醇生物合成的一个重要步骤。最近的研究表明，除上述的治疗作用以外，他汀类药物还具有其它治疗作用，因此，它们可用于治疗选自血管病症、炎性疾病、变应性疾病、神经变性疾病、恶性疾病、病毒性疾病(WO 0158443)、异常骨状态(WO 0137876)、淀粉样-β前体蛋白加工紊乱如阿尔茨海默氏病或唐氏综合征(WO 0132161)的疾病、异常状况和紊乱。
[0019] 迄今为止，关于如何避免阿托伐他汀物质中氧化产物的存在几乎没有报导，阿托伐他汀钙的降解产物以前也没有被鉴别。通过在惰性氛围中进行的制备方法和在惰性氛围中用适宜包装进行的包装来防止阿托伐他汀钙的氧化在斯洛文尼亚专利申请SI P-200200244中有描述。阿托伐他汀钙的一种降解产物(化学名为3-(4-氟-苯甲酰基)-2-异丁酰基-3-苯基-环氧乙烷-2-甲酸苯基酰胺)的结构及其通过光解反应的制备在Hurley，T.R.等人，Tetrahedron 49，1993，1979-1984一文中有描述。
[0020] 鉴于获得具有高纯度水平的活性物质的重要性，有必要对活性物质和/或药物组合物中存在的每种杂质或降解产物进行鉴定。对活性物质或药物组合物中存在的每种杂质或降解产物进行表征对如下的那些活性物质而言是特别重要的：对所述的活性物质而言，杂质和/或降解产物对特定分析方法(如HPLC)的响应因子与活性物质的响应因子不同。换句话说，在这种情况下，尽管事实上杂质或降解产物的真实水平超出了允许值，但是根据管理要求，可发生如下情形：活性物质被宣布为是可药用的。
[0021] 通过鉴定阿托伐他汀钙和/或其药物组合物中存在的三种氧化降解产物，本发明以技术上简单的方法和高的收率满足了本领域的如下要求：获得高纯度形式且具有低含量氧化降解产物的阿托伐他汀钙产品。
[0022] 本发明的一个目的涉及新化合物，它们是阿托伐他汀钙的氧化降解产物，具有如下化学式与化学名：
[0023] a)式I化合物
[0024]
[0025] 化学名为4-[6-(4-氟-苯基)-6-羟基-1b-异丙基-6a-苯基-1a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸(下文称为ATV-环IP)；
[0026] b)式II化合物
[0027]
[0028] 化学名为4-(4-氟-苯基)-2，4-二羟基-2-异丙基-5-苯基-3，6-二氧杂-二环[3.1.0]己烷-1-甲酸苯基酰胺(下文称为ATV-环氧呋喃)；
[0029] c)式III化合物
[0030]
[0031] 化学名为4-[1b-(4-氟-苯基)-6-羟基-6-异丙基-1a-苯基-6a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸(下文称为ATV-环FP)。
[0032] Hurley，T.R.等人在Tetrahedron 49，1993，1979-1984一文中所述的阿托伐他汀钙的氧化降解产物具有如下化学式IV
[0033]
[0034] 化学名为3-(4-氟-苯甲酰基)-2-异丁酰基-3-苯基-环氧乙烷-2-甲酸苯基酰胺(下文称为ATV-环氧二酮)。
[0035] 阿托伐他汀钙的氧化降解可用下图表示：
[0036]
[0037] 本发明的式I、II、III和IV化合物作为氧化降解产物存在于阿托伐他汀钙物质中，因此非常重要的是，它们的量应当最小并且它们应当仅以非常小的量被检测到。作为杂质，它们显示出对患者有毒性或在其它方面有害的危险。出于这些原因，它们在物质中的存在应当最小是必要的。另一方面，精确监测这些杂质的水平是非常重要的，因此应当正确和准确地测定它们的含量，例如通过采用用于定量分析的标准物(已知化学结构和已知测定法的化合物)。
[0038] 本发明还涉及本发明的化学式I、II、III和IV化合物的新的制备方法。
[0039] 本发明的新化合物可通过使盐形式的固体阿托伐他汀(例如作为钙盐、钠盐、钾盐、镁盐或铵盐)在空气或氧气氛围中在升高温度如40-90℃下氧化来制备。反应可持续一至数天。氧化可在阿托伐他汀盐在水和/或有机溶剂和/或溶剂的混合物中的溶液中通过在约40℃至90℃的温度下加入过氧化氢或向溶液中充入空气或氧气来进行，所述溶剂例如是乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷。固体阿托伐他汀盐可通过任何已知方法制备。
[0040] 本发明的新化合物还可如下制备：通过将阿托伐他汀盐溶液暴露在日光或人工日光下，使盐形式的阿托伐他汀(例如作为钙盐、钠盐、钾盐、镁盐或铵盐)进行光氧化。阿托伐他汀盐可通过任何已知方法制备。
[0041] 通过上述方法制备的本发明的新化合物可通过制备型正相或反相色谱法进行分离。
[0042] 在制备型正相色谱法中，可采用硅胶或基于硅胶的键合相如氨基丙基、氰基丙基、二醇或硝基苯基键合固定相。流动相包含极性调节剂醇(如甲醇、乙醇、丙醇)或乙腈的混合物以及非极性溶剂(如己烷、二氯甲烷、甲基环己烷或两种以上上述溶剂的组合)的混合物。
[0043] 在制备型反相色谱法中，可采用键合于硅胶的十八烷基硅胶或辛基硅胶。流动相包含水与有机或无机缓冲剂的混合物(浓度为5mm至100mm，pH为2至8)以及包含一种或多种选自醇(例如甲醇、乙醇和丙醇)或乙腈的有机调节剂。
[0046] 在制备稳定的阿托伐他汀钙组合物的研发工作期间，已经发现：当阿托伐他汀钙与空气或更精确地说与氧接触时发生降解。惊奇的是，使用多种不同的抗氧化剂(例如丁羟茴醚、丁羟甲苯、富马酸、没食子酸丙酯、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸钠)不能防止或减少氧化降解产物的形成。令人惊奇的是，已经发现：通过降低阿托伐他汀钙或包含阿托伐他汀钙的药物组合物的环境大气中氧的含量，可显著减少阿托伐他汀钙中氧化降解产物的形成。所观察到的氧化降解产物的减少与环境大气中氧含量的降低呈线性比例。这种氧含量的降低可通过用惰性气体(如氮气或氩气)替换氧来进行，或者通过降低阿托伐他汀钙周围的大气压来进行。
[0047] 除了在惰性氛围中进行阿托伐他汀钙的制备方法及在惰性氛围中储存之外，监测阿托伐他汀钙物质及含有该物质的药物组合物中存在的氧化降解产物的量是非常重要的。对于测定不期望化合物的量，有必要提供这些化合物的标准物(这意味着已知化学结构和测定法的化合物)以能够进行精确的定量分析。在杂质和/或降解产物在例如HPLC分析中的响应因子与活性物质的响应因子不同的情况下，这尤为重要。HPLC分析通常用于药物活性物质和药物组合物中的杂质测定。
[0048] 惊奇的是，已经发现：当在250nm进行HPLC分析时，阿托伐他汀钙物质中存在的某些化合物表现出与阿托伐他汀钙本身不同的响应因子。换句话说，与阿托伐他汀钙本身相比，本发明的式I新化合物表现出0.41的响应因子，本发明的式II新化合物表现出0.72的响应因子，本发明的式III新化合物表现出0.48的响应因子，本发明的式IV新化合物表现出1.20的响应因子。
[0049] 活性物质和/或药物组合物中杂质的含量对于药物安全而言是一个重要因素，因此应当使杂质含量最小。这对于降解产物而言尤其重要，因为它们在药物中的含量在药物储存期间上升。
[0050] 本发明的另一目的是提供基本上不含氧化降解产物的阿托伐他汀钙及含有所述阿托伐他汀钙和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
[0051] 本发明提供了基本上纯的阿托伐他汀钙，其包含少于约0.29重量％的氧化降解产物。
[0052] 本发明提供了基本上纯的阿托伐他汀钙，其包含少于约0.09重量％的ATV-环IP。
[0053] 本发明提供了基本上纯的阿托伐他汀钙，其包含少于约0.05重量％的ATV-环氧呋喃。
[0054] 本发明提供了基本上纯的阿托伐他汀钙，其包含少于约0.09重量％的ATV-环FP。
[0055] 本发明提供了基本上纯的阿托伐他汀钙，其包含少于约0.06重量％的ATV-环氧二酮。
[0056] 下表1显示了进行制备过程中暴露于不同氛围条件下的阿托伐他汀钙中存在的每种氧化降解产物的量。
[0057] 当阿托伐他汀钙在室温下在空气氛围中制备或储存时，形成了氧化降解产物。当阿托伐他汀钙在氮气氛围中储存时这种情况可以避免。
[0058] 表1：当阿托伐他汀钙在空气和氮气氛围中制备时阿托伐他汀钙中氧化降解产物的含量。所有物质用响应因子1.00进行分析。
[0059]生产 ATV-环IP的 ATV-环氧呋喃 ATV-环FP的 ATV-环氧二酮
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 0.088 0.066 0.093 0.069
氮气 0.013 0.011 0.018 0.016
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 0.088 0.066 0.093 0.069
氮气 0.013 0.011 0.018 0.016
[0060] 表2：在空气或氮气氛围中制备的阿托伐他汀钙中氧化降解产物的含量。ATV-环IP用响应因子0.41、ATV-环氧呋喃用响应因子0.72、ATV-环FP用响应因子0.48和ATV-环氧二酮用响应因子1.20进行分析。
[0061]生产 ATV-环IP的 ATV-环氧呋喃 ATV-环FP的 ATV-环氧二酮
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 0.215 0.093 0.193 0.058
氮气 0.032 0.016 0.038 0.013
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 0.215 0.093 0.193 0.058
氮气 0.032 0.016 0.038 0.013
[0062] 考虑氧化降解产物的响应因子为1.00的表1与考虑所测定的响应因子的表2之间的比较显示了含量值的重要差别。当未采用杂质的标准物而应用响应因子1.00时，在空气或氮气氛围中制备的阿托伐他汀钙中氧化降解产物的测定值低于采用确切响应因子所测定的值。采用响应因子1.00测定的氧化降解产物的含量也可能低于0.10％的阈值，根据普遍接受的药物规则杂质在该阈值之上应当被鉴别出。并且，由于具有大于1.00响应因子的事实，采用响应因子1.00所测定的ATV-环氧二酮的含量在采用确切响应因子所测定的值之上。
[0063] ATV-环IP采用响应因子0.41、ATV-环氧呋喃采用响应因子0.72、ATV-环FP采用响应因子0.48和ATV-环氧二酮采用响应因子1.20进行所有另外的分析。
[0064] 表3：室温下(如25℃)在空气或氮气氛围中储存24个月的阿托伐他汀钙中氧化降解产物的含量
[0065]储存 ATV-环IP的 ATV-环氧呋喃 ATV-环FP的 ATV-环氧二酮
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 0.856 0.636 0.905 0.741
氮气 0.094 0.052 0.088 0.063
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 0.856 0.636 0.905 0.741
氮气 0.094 0.052 0.088 0.063
[0066] 本发明提供了一种包含基本上纯的阿托伐他汀钙(其包含少于约0.6重量％的氧化降解产物)和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
[0067] 本发明提供了一种包含基本上纯的阿托伐他汀钙(其包含少于约0.2重量％的ATV-环IP)和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
[0068] 本发明提供了一种包含基本上纯的阿托伐他汀钙(其包含少于约0.1量％的ATV-环氧呋喃)和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
[0069] 本发明提供了一种包含基本上纯的阿托伐他汀钙(其包含少于约0.2重量％的ATV-环FP)和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
[0070] 本发明提供了一种包含基本上纯的阿托伐他汀钙(其包含少于约0.1重量％的ATV-环氧二酮)和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
[0071] 表4：配制成片剂药物制剂形式、在Al/Al泡罩中于室温下(如25℃)和在空气或氮气氛围下储存24个月的阿托伐他汀钙中氧化降解产物的含量
[0072]储存 ATV-环IP的 ATV-环氧呋喃 ATV-环FP的 ATV-环氧二酮
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 1.75 0.61 1.23 0.65
氮气 0.18 0.08 0.17 0.09
氛围 含量，％ 的含量，％ 含量，％ 的含量，％
空气 1.75 0.61 1.23 0.65
氮气 0.18 0.08 0.17 0.09
[0073] 表3和表4显示的结果表明，当阿托伐他汀钙或片剂形式的含有阿托伐他汀钙的药物制剂在室温下在空气氛围中储存24个月时，氧化降解产物显著增加。当阿托伐他汀钙在氮气氛围中储存时这种情况可以避免。
[0074] 本发明的药物组合物可以以剂型向哺乳动物给药。该剂型含有本发明的基本上纯的阿托伐他汀钙和至少一种可药用赋形剂，所述赋形剂选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、增甜剂、防腐剂、染色剂和其它制备药物组合物中所采用的赋形剂。本发明的药物组合物可以是制药工业中采用的任何剂型，例如片剂、口服可分散制剂、胶囊、小丸、颗粒剂等。可采用氮气或氩气作为惰性气体来维持惰性氛围。药物组合物可在Al/Al泡罩、Al-聚氯-3-氟乙烯均聚物/PVC层状泡罩(laminate blister)或瓶中在惰性氛围中储存。
[0075] 本发明的药物组合物可用于治疗高胆固醇血症和高脂血症。
[0076] 本发明可通过以下实施例来说明，但决非局限于以下实施例。
[0077] 实施例1
[0078] 化合物ATV-环IP、ATV-环氧呋喃、ATV-环FP和ATV-环氧二酮的制备与分离[0079] 将5克阿托伐他汀钙在氧气氛围中于80℃下在200ml气密性容器中储存30天。然后将由此制备的样品溶于50％的乙腈/水(体积/体积)中，进行制备型色谱法。
[0080] 制备型色谱法：氧化降解产物的分离在反相色谱上进行。为得到纯的化合物，具有不同流动相的两步色谱分离是有必要的。
[0081] 第一步分离在装备有Luna prep C18(2)10μm柱(200mm×50mm)和紫外检测器(设置在250nm)的制备型HPLC色谱上进行。两种流动相溶剂A和B分别是10mM pH为4.5的乙酸铵和95％乙腈/5％四氢呋喃(体积/体积)。流速为140ml/min。采用以下梯度形式：
[0082]时间(分:秒) ％B
0 5
0:22 5
0:25 30
14 75
14:10 90
15 90
15:10 5
0 5
0:22 5
0:25 30
14 75
14:10 90
15 90
15:10 5
[0084] 将所有四份级分另外纯化以获取纯的物质。
[0085] 第一份级分的纯化：第一份级分的纯化条件与第一步分离的条件相同，除了流动相A为10mM碳酸氢铵。采用以下梯度形式：
[0086]时间(分:秒) ％B
0 10
0:17 10
0:22 36
7 36
7:10 90
8 90
8:10 10
0 10
0:17 10
0:22 36
7 36
7:10 90
8 90
8:10 10
[0087] 收集到一份级分；pH用1M氢氧化钾调节至8-9。将该级分以与第一步色谱分离后相同的方式减压蒸发。通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出170mg纯的ATV-环IP化合物(4-[6-(4-氟-苯基)-6-羟基-1b-异丙基-6a-苯基-1a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸)。色谱纯度为97.2％。
[0088] 第二份级分的纯化：
[0090]时间(分:秒) ％B
0 0
1:55 0
2 15
11:30 15
14:20 35
14:45 85
17:30 85
0 0
1:55 0
2 15
11:30 15
14:20 35
14:45 85
17:30 85
[0091] 收集到一份级分并减压蒸发。将浓缩的级分装载于反相柱上，缓冲盐用水洗出，ATV-环FP化合物用80％乙腈、20％水(体积/体积)从柱上洗脱出来。
[0092] 通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出185mg纯的ATV-环FP化合物(4-[1b-(4-氟-苯基)-6-羟基-6-异丙基-1a-苯基-6a-苯基氨甲酰基-六氢-1，2-二氧杂-5a-氮杂-环丙烷并[a]茚-3-基]-3-(R)-羟基-丁酸)。色谱纯度为97.5％。
[0093] 第三份级分的纯化：
[0094] 第三份级分纯化的色谱条件与第一步分离的条件相同，除了流动相A溶剂为5mM盐酸以及采用以下梯度形式：
[0095]时间(分:秒) ％B
0 20
0:17 20
0:22 72
7 72
7:10 20
0 20
0:17 20
0:22 72
7 72
7:10 20
[0096] 收集到一份级分并以与第一步分离所得的级分相同的方式减压蒸发。通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出205mg纯的ATV-环氧呋喃化合物(4-(4-氟-苯基)-2，4-二羟基-2-异丙基-5-苯基-3，6-二氧杂-二环[3-1.0]己烷-1-甲酸苯基酰胺)。色谱纯度为93.6％。
[0097] 第四份级分的纯化：
[0098] 第四份级分纯化的色谱条件与第三份级分纯化的条件相同，除了采用以下梯度形式：
[0099]时间(分:秒) ％B
0 20
0:17 20
0:22 75
7 75
7:10 20
0 20
0:17 20
0:22 75
7 75
7:10 20
[0100] 收集到一份级分并以与第一步分离所得的级分相同的方式减压蒸发。通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出50mg纯的ATV-环氧二酮化合物(3-(4-氟-苯甲酰基)-2-异丁酰基-3-苯基-环氧乙烷-2-甲酸苯基酰胺)。色谱纯度为96.2％。
[0101] 化合物ATV-环IP的结构说明：
[0102] 质谱法：
[0103] 条件：
[0104] 采用四级飞行时间质谱仪Micromass Q TOF Ultima Global获得高分辨质谱。采用电喷射离子化。源温度设定为100℃，去溶剂化温度设定为200℃，锥孔气(cone gas)0L/h和去溶剂化气体200L/h。采用TOF分析仪的W几何学。该仪器采用甲酸钠簇进行标定。将样品溶于50％5mM乙酸铵/乙腈(体积/体积)溶液中，以10μl/min的恒定流速注入质谱仪中。样品溶液的浓度为0.05mg/ml。
[0105] 采用阿托伐他汀钙盐作为高分辨测量方法的内标物。将浓度为0.01mg/ml的内标物加入样品溶液中。
[0106] 观察到质子化的分子离子591.2507m/z。计算的元素组成为C33H36N2O7F。计算质量与测量质量之间的偏差为0.5mDa。与阿托伐他汀钙相比，化合物ATV-环IP在其化学结构中显示出额外的两个氧原子。
[0107] 核磁共振光谱法：
[0108] 条件：1 13
[0109] H与 C测量在300MHz Varian仪器INOVA或UNITY300上进行。INOVA仪器装备1 13
有5mm逆探测脉冲场梯度探针(inverse detect pulsed fieldgradient probe)。H与 C光谱通过在室温下测量获得。
有5mm逆探测脉冲场梯度探针(inverse detect pulsed fieldgradient probe)。H与 C光谱通过在室温下测量获得。
[0110] 样品溶于甲醇、氯仿或者甲醇与氯仿2∶1的混合物中。
[0112] 溶剂：CD3OD(1H与13C测量)
[0113] 结构：
[0114]
[0115] 1H NMR光谱：
[0116] 6.90-7.40ppm 芳香质子 14H，m
[0117] 4.88ppm CD3OD s
[0118] 4.39ppm 5，3 2H，m
[0119] 3.31ppm CD3OD m
[0120] 3.25ppm 7a 1H，m
[0121] 3.17ppm (CH3)2CH 1H，m
[0122] 2.87ppm 7b 1H，m
[0123] 2.54ppm 2 2H，d
[0124] 1.80-2.10ppm 6a，4 3H，m
[0125] 1.40ppm 6b 1H，m
[0126] 1.33与1.32ppm (CH3)2CH 6H，2xd
[0127] 13C NMR光谱：
[0128] 180.5ppm 1
[0129] 165.5ppm CO-NH
[0130] 164.4ppm C-F d
[0131] 140.0-115.0 芳香碳
[0132] 97.2ppm 2′
[0133] 94.9ppm 5′
[0134] 74.4ppm 4′
[0135] 70.6ppm 3′
[0136] 70.4ppm 5
[0137] 69.3ppm 3
[0138] 49.1ppm CD3OD m
[0139] 46.4ppm 2
[0140] 45.0ppm 4
[0141] 37.4ppm 7
[0142] 30.5ppm 6
[0143] 29.5ppm (CH3)2CH
[0144] 19.5和18.3ppm (CH3)2CH
[0145] 化合物ATV-环氧呋喃的结构说明：
[0146] 质谱法：
[0147] 条件：
[0148] 以与化合物ATV-环IP相同的条件获得高分辨质谱。
[0149] 在质谱中观察到分子离子与钠的加合物472.1536m/z和与钾的加合物488.1270。在第一种情况下计算的元素组成为C26H24NO5FNa(计算质量与测量质量之间的偏差为
0.0mDa)，在第二种情况下为C26H24NO5FK(计算质量与测量质量之间的偏差为0.5mDa)。
0.0mDa)，在第二种情况下为C26H24NO5FK(计算质量与测量质量之间的偏差为0.5mDa)。
[0150] 由于水从分子中快速消除，没有观察到质子化的分子离子(M+H-H2O)+＝432.1606m/z。提出的元素组成为C26H23NO4F。计算质量与测量质量之间的偏差为0.5mDa。
碎片离子还与钠和钾形成加合物。
碎片离子还与钠和钾形成加合物。
[0151] 在921.3131 m/z观察到两分子化合物ATV-环氧呋喃与钠的加合物。建议的元素组成为C52H48N2O10F2Na。计算质量与测量质量之间的偏差为4.4mDa。
[0152] 核磁共振光谱法：
[0153] 条件：
[0154] 以与化合物ATV-环IP相同的方式获得1H与13C测量结果。
[0155] 溶剂：CDCl3(1H测量)
[0156] CD3OD∶CDCl3＝2∶1的混合物(13C测量)
[0157] 结构：
[0158]
[0159] 1H NMR光谱：
[0160] 7.57ppm -NH 1H，br
[0161] 6.90-7.50ppm 芳香质子 14H，m
[0162] 6.05ppm -OH 1H，br
[0163] 4.31ppm -OH 1H，s
[0164] 2.38ppm (CH3)2CH 1H，m
[0165] 1.22与1.21ppm (CH3)2CH 6H，2xd
[0166] 13C NMR光谱：
[0167] 215.9ppm imp.
[0168] 165.0ppm CO-NH
[0169] 164.0ppm C-F d
[0170] 140.0-115.0ppm 芳香碳
[0171] 107.1ppm 2
[0172] 104.1ppm 5
[0173] 77.0ppm CDCl3 t
[0174] 75.9ppm 4
[0175] 70.4ppm 3
[0176] 49.1ppm CD3OD m
[0177] 35.6ppm (CH3)2CH
[0178] 17.9与17.0ppm (CH3)2CH
[0179] 化合物ATV-环FP的结构说明：
[0180] 质谱法：
[0181] 条件：
[0182] 以与化合物ATV-环IP相同的方式获得高分辨质谱。
[0183] 观察到质子化的分子离子591.2507m/z。分子离子比ATV-环IP弱得多。在质谱中最强的离子是573.2406m/z，它是由水分子的消除形成的。对591.2507m/z而言所计算的元素组成为C33H36N2O7F。计算质量与测量质量之间的偏差为1.4mDa。与阿托伐他汀相比，该化合物在结构中具有两个额外的氧原子。
[0184] 核磁共振波光谱法：
[0185] 条件：
[0186] 以与化合物ATV-环IP相同的方式获得1H与13C测量结果。
[0187] 溶剂：CD3OD(1H与13C测量)
[0188] 结构：
[0189]
[0190] 1H NMR光谱：
[0191] 6.90-7.40ppm 芳香质子 14H，m
[0192] 4.88ppm CD3OD s
[0193] 4.13ppm 5 1H，m
[0194] 3.74ppm 3 1H，m
[0195] 3.36ppm 7a 1H，m
[0196] 3.31ppm CD3OD m
[0197] 2.97ppm 7b 1H，m
[0198] 2.50ppm (CH3)2CH 1H，m
[0199] 2.37与2.27ppm 2 2H，2xm
[0200] 2.07ppm 6a 1H，m
[0201] 1.85与1.64ppm 4 2H，2xm
[0202] 1.26与1.28ppm (CH3)2CH 6H，2xd
[0203] 1.25ppm 6b 1H，m
[0204] 13C NMR光谱：
[0205] 180.2ppm 1
[0206] 167.1ppm CO-NH
[0207] 164.2ppm C-F d
[0208] 140.0-115.0ppm 芳香碳
[0209] 96.9ppm 2′
[0210] 95.1ppm 5′
[0211] 74.5ppm 4′
[0212] 70.4ppm 5
[0213] 70.0ppm 3′
[0214] 67.5ppm 3
[0215] 49.1ppm CD3OD m
[0216] 45.2ppm 2
[0217] 44.7ppm 4
[0218] 38.3ppm 7
[0219] 36.6ppm (CH3)2CH
[0220] 31.0ppm 6
[0221] 19.7与19.0ppm (CH3)2CH
[0222] 化合物ATV-环氧二酮的结构说明：
[0223] 质谱法：
[0224] 条件：
[0225] 以与化合物ATV-环IP相同的方式获得高分辨质谱。
[0226] 观察到质子化的分子离子432.1612m/z。计算的元素组成为C26H23NO4F。计算质量与测量质量之间的偏差为0.1mDa。表5显示了质子化的分子离子的MS/MS光谱。
[0227] 表5：质子化的分子离子432m/z的MS/MS光谱-五个最强的峰
[0228]质量 RA％ 计算质量 误差mDa 误差mDa 式
226.0664 10.97 226.0668 -0.4 -1.8 C14H19NOF
241.0659 11.86 241.0665 -0.6 -2.4 C15H10O2F
269.0603 10.67 269.0614 -1.1 -4.1 C15H10O3F
304.1138 100.00 304.1126 -0.9 -2.9 C20H15NOF
344.1082 25.07 344.1087 -0.5 -1.4 C22H15NO2F
432.1611 16.08 432.1611 0 0 C26H23NO4F
226.0664 10.97 226.0668 -0.4 -1.8 C14H19NOF
241.0659 11.86 241.0665 -0.6 -2.4 C15H10O2F
269.0603 10.67 269.0614 -1.1 -4.1 C15H10O3F
304.1138 100.00 304.1126 -0.9 -2.9 C20H15NOF
344.1082 25.07 344.1087 -0.5 -1.4 C22H15NO2F
432.1611 16.08 432.1611 0 0 C26H23NO4F
[0229] 核磁共振光谱法：
[0230] 条件：
[0231] 以与化合物ATV-环IP相同的方式获得1H与13C测量结果。
[0232] 溶剂 CD3OD∶CDCl3＝2∶1的混合物(1H与13C测量)
[0233] 结构：
[0234]
[0235] 1H NMR光谱：
[0236] 8.20-6.80ppm 芳香质子 14H，m
[0237] 4.79ppm CD3OD s
[0238] 3.31ppm CD3OD m
[0239] 3.20ppm (CH3)2CH 1H，m
[0240] 1.20与1.02ppm (CH3)2CH 6H，2xd
[0241] 13C NMR光谱：
[0242] 206.0ppm (CH3)2CH- CO-
[0243] 191.4ppm 苯基- CO-
[0244] 167.3ppm F- C d
[0245] 162.8ppm CO-NH
[0246] 140.0-115.0 芳香碳
[0247] 77.0ppm CDCl3 t
[0248] 74.6与72.0ppm 环氧碳原子
[0249] 49.0ppm CD3OD m
[0250] 38.3ppm (CH3)2CH
[0251] 18.5与17.7ppm CH
[0252] 实施例2
[0253] ATV-环IP化合物的制备与分离：
[0254] 在80％乙腈和20％水(体积/体积)中配制2升阿托伐他汀溶液，每毫升含有1mg阿托伐他汀。将该溶液置于浅结晶器皿中并暴露于日光照射下5小时。随后溶液立即用1M氢氧化钾溶液碱化至pH8至9，减压蒸发直至首次出现混浊。水浴温度保持在30℃以下，冷凝器用0℃水冷却。
[0255] 然后向溶液中加入最少量的乙腈使之澄清。
[0256] 以与实施例1中相同的方式进行制备型色谱法和结构说明。
[0257] 通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出210mg纯的ATV-环IP化合物。色谱纯度为96.6％。
[0258] 实施例3
[0259] ATV-环氧呋喃与ATV-环氧二酮化合物的制备与分离：
[0260] 在80％乙腈/20％水(体积/体积)中配制1升阿托伐他汀溶液，每毫升含有1mg阿托伐他汀。将该溶液置于浅结晶器皿中并暴露于日光照射下5小时。随后溶液立即用0.5M磷酸酸化至pH3.0。混合物于室温下放置两小时，减压蒸发至原混合物体积的约1/3。
[0261] 以与实施例1中相同的方式进行制备型色谱法和结构说明。
[0262] 通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出120mg ATV-环氧呋喃化合物。色谱纯度为92.6％。
[0263] 通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出21mg ATV-环氧二酮化合物。色谱纯度为95.1％。
[0264] 实施例4：
[0265] ATV-环FP化合物的制备与分离：
[0266] 在乙腈中配制800ml阿托伐他汀溶液，每毫升含有10mg阿托伐他汀。加入4ml12M氢氧化钠和40ml30％过氧化氢。溶液在55℃搅拌5小时。使反应混合物冷却并滗析。上清液减压蒸发至约50ml。弃去剩余的水，固体残余物用新鲜的水洗涤。然后将固体残余物溶于乙腈中。
[0267] 以与实施例1中相同的方式进行制备型色谱法和结构说明。
[0268] 通过冷冻干燥从浓缩的级分中分离出230mg纯的ATV-环IP化合物。色谱纯度为98.3％。
[0269] 实施例5：
[0270] 阿托伐他汀钙可以用文献中描述的任意方法来制备。在阿托伐他汀钙制备的整个过程中唯一的要求是必须维持惰性氛围。在如此制备的阿托伐他汀钙中，采用HPLC方法和在250nm检测测得的每种氧化降解产物ATV-环IP、ATV-环氧呋喃、ATV-环FP和ATV-环氧二酮化合物的含量低于0.04％。
[0271] 实施例6：
[0272] 将通过实施例1中所述的方法获得的阿托伐他汀钙于室温下在氮气氛围中储存两年。在如此制备的阿托伐他汀钙中，采用HPLC方法和在250nm检测测得的每种氧化降解产物ATV-环IP、ATV-环氧呋喃、ATV-环FP和ATV-环氧二酮化合物的含量低于0.1％。
[0273] 实施例7：
[0274] 将通过实施例1中所述的方法获得的阿托伐他汀钙于室温下在空气中储存两年。在如此制备的阿托伐他汀钙中，采用HPLC方法和在250nm检测测得的氧化降解产物ATV-环IP、ATV-环氧呋喃、ATV-环FP和ATV-环氧二酮化合物的含量分别是0.856％、0.636％、0.905％和0.741％。
[0275] 实施例7：
[0276] 采用通过实施例1中所述的方法获得的阿托伐他汀钙和至少一种可药用赋形剂制备片剂。在如此制备的片剂中，采用HPLC方法和在250nm检测测得的氧化降解产物ATV-环IP、ATV-环氧呋喃、ATV-环FP和ATV-环氧二酮化合物的含量分别是0.11％、0.07％、0.07％和0.08％。
[0277] 片剂在氮气氛围中包装在铝/铝泡罩中。泡罩在室温下储存两年。采用HPLC方法和在250nm检测测得的氧化降解产物ATV-环IP、ATV-环氧呋喃、ATV-环FP和ATV-环氧二酮化合物的含量分别是0.18％、0.08％、0.17％和0.09％。
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