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非肽聚合物接头化合物、包含该接头化合物的缀合物及制备该接头化合物和缀合物的方法

阅读:970发布:2020-11-28

专利汇可以提供非肽聚合物接头化合物、包含该接头化合物的缀合物及制备该接头化合物和缀合物的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 的一个方面提供了一种化合物,其中能够与球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团被引入至非肽 聚合物 的一端,并且能够发生点击反应的官能团被引入到非肽聚合物的另一端;多肽缀合物,其中生理活性多肽结合至该化合物的一端;生理活性多肽缀合物,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过使用该化合物作为接头结合于其两端;以及制备该化合物、多肽缀合物和生理活性多肽缀合物的方法。,下面是非肽聚合物接头化合物、包含该接头化合物的缀合物及制备该接头化合物和缀合物的方法专利的具体信息内容。

1.一种化合物,其选自如下式1的化合物,其立体异构体,其溶剂化物及其药学上可接受的盐:
[式1]
R1-非肽基聚合物-X-R2
在式1中,
R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族基:2,5-二杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、酸对硝基苯酯及其衍生物
所述非肽基聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸和多糖;
X为-(CH2)jNHCO-或-(CH2)jNHCS-,其中j为0至6的整数;
R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,
其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,
Z是O或S,
Y是C2-C6炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基(其中每个环炔基具有3-8个碳原子,每个芳基具有5-8个碳原子,并且每个杂环炔基是包含3-8个碳原子和在1至3个环原子中具有选自N、O和S的杂原子的饱和环),k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;并且
所述炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、氧或卤素取代或未被取代。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中R1是包含醛基的C1-C6脂族烃基。
3.根据权利要求1所述的化合物,其中Y选自由以下组成的组:双环[6.1.0]壬炔(BCN)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、DIFO2、DIFO3、二苯并环化的环辛炔(DIBO)、双芳基环辛炔(BARAC)、环辛炔(OCT)、无芳基环辛炔(ALO)、单氟代环辛炔(MOFO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、2,3,6,7-四甲氧基-DIBO(TMDIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)、吡咯并环辛炔(PYRROC)、二苯并氮杂-环辛炔(DIBAC)、3,3,6,6-四甲基硫代环庚炔(TMTH)、桑德海默二炔和磺酰化DIBO(S-DIBO)。
4.根据权利要求1所述的化合物,其中式1是如下式1a:
[式1a]
在式1a中,
n是20至1000的整数;
j为0至6的整数;
R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,
其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,
Z是O或S,
Y选自由以下组成的组:双环[6.1.0]壬炔(BCN)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、DIFO2、DIFO3、二苯并环化的环辛炔(DIBO)、双芳基环辛炔酮(BARAC)、环辛炔(OCT)、无芳基环辛炔(ALO)、单氟代环辛炔(MOFO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、2,3,6,7-四甲氧基-DIBO(TMDIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)、吡咯并环辛炔(PYRROC)、二苯并氮杂-环辛炔(DIBAC)、3,3,6,6-四甲基硫代环庚炔(TMTH)、桑德海默二炔和磺酰化DIBO(S-DIBO),
k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0。
5.根据权利要求4所述的化合物,其中式1a是以下式2a至2n中的任何一个:
[式2a]
[式2b]
[式2c]
[式2d]
[式2e]
[式2f]
[式2g]
[式2h]
[式2i]
[式2j]
[式2k]
[式2l]
[式2m]
[式2n]
在式2a至2n中,
n是20至1000的整数;
j是0至6的整数;并且
R1是包含醛基的C1-C6脂族烃基。
6.一种制备根据权利要求1-5中任一项所述的化合物的方法,所述方法包括:在所述非肽基聚合物的一端引入基(-NH2),以及通过与所述氨基的酰胺键在所述非肽基聚合物的一端引入R2,其中,R2与权利要求1中所定义的相同;和
在引入R2的所述非肽基聚合物的另一端引入包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物。
7.一种生理活性多肽连接体,其中生理活性多肽通过官能团Y与权利要求1至5中任一项所述的化合物连接。
8.根据权利要求7所述的生理活性多肽连接体,其中将叠氮基引入到所述生理活性多肽中,然后通过由所述叠氮基与亚乙炔基(-C≡C-)的点击反应的环加成反应形成1,2,3-三唑。
9.根据权利要求7所述的生理活性多肽连接体,其中所述生理活性多肽连接基具有如下式3a至31的任何一个的结构式:
[式3a]
[式3b]
[式3c]
[式3d]
[式3e]
[式3f]
[式3g]
[式3h]
[式3i]
[式3j]
[式3k]
[式3l]
在式3a至3l中,
n是20至1000的整数;
j为0至6的整数;
R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,
Z为O或S;
k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;并且
[氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种。
10.根据权利要求9所述的生理活性多肽连接体,其中所述[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式3a至31的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
11.根据权利要求7所述的生理活性多肽连接体,其中所述生理活性多肽连接基具有如下式4a至4n中的任何一个的结构式:
[式4a]
[式4b]
[式4c]
[式4d]
[式4e]
[式4f]
[式4g]
[式4h]
[式4i]
[式4j]
[式4k]
[式4l]
[式4m]
[式4n]
在式4a至4n中,
n是20至1000的整数;
j为0至6的整数;
R1是包含醛基的C1-C6的脂族烃基;和
[氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种。
12.根据权利要求11所述的生理活性多肽连接体,其中所述[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式4a至4n的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
13.根据权利要求7所述的生理活性多肽连接体,其中所述生理活性多肽选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、促胰岛素肽、神经肽、垂体激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、生理活性的非天然肽衍生物、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组。
14.根据权利要求7所述的生理活性多肽连接体,其中所述生理活性多肽选自由以下组成的组:胰高血糖素、胃抑制多肽(GIP)、类爪蟾肽、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰岛淀粉样多肽、胃泌素、生长素释放肽、胃或肠中调节血糖和体重的肠促胰岛素、脂肪分泌的脂肪因子、神经肽、肌肉分泌的肽或蛋白质、血管活性肠肽、利钠肽、生长抑素、神经肽Y(NPY)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、塞那肽-4、胃泌素调节素、纤维细胞生长因子、血管紧张素、缓激肽、降素、促肾上腺皮质激素(促皮质素)、章鱼降压肽、催产素、血管加压素、促黄体生成激素、促黄体生成激素、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、促胰液素、舍莫瑞林、人类生长激素(hGH)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激素因子(GCSF)、干扰素(IFN)、干扰素受体、白介素、白介素受体、白介素结合蛋白、催乳素释放肽、食欲素、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房利钠肽(ANP)、B型利尿肽(BNP)、C型利尿肽(CNP)、神经激肽A、神经调节素、肾素、内皮素、蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制因子、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺蛋白酶、胸腺五肽、胸腺肽、胸腺壁因子、肾上腺调节素、阿托伐他汀、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化剂、铃蟾肽、骨钙素、CART肽、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、白蛋白、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰泌素、恩夫韦肽、胰高血糖素样肽、胃泌素调节素、G蛋白偶联受体、酶、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、转移诱导因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、VII、VIIa、IX和XIII凝血因子、纤溶酶原激活因子、血纤蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、上皮细胞生长因子、血管抑素、成骨生长因子、促成骨蛋白、心房肽、软骨诱导因子、降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制剂、神经生长因子、松弛素、生长抑素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰腺多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动素、乳蛋白、肌生长抑制素、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、促红细胞生成素、白细胞生成素及其类似物。
15.一种生理活性多肽缀合物,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过根据权利要求1至5中任一项所述的化合物作为接头彼此连接。
16.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中将叠氮基引入到所述生理活性多肽中,然后通过由点击反应的环加成形成1,2,3-三唑将所述叠氮基与所述官能团Y的亚乙炔基彼此连接,并且所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸通过共价键与式1的化合物的R1连接。
17.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述生理活性多肽缀合物具有以下式5a至51的任何一个的结构式:
[式5a]
[式5b]
[式5c]
[式5d]
[式5e]
[式5f]
[式5g]
[式5h]
[式5i]
[式5j]
[式5k]
[式5l]
在式5a至5l中,
n是20至1000的整数;
j为0至6的整数;
R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基;
Z为O或S;
k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;
[氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种;并且
q是1到6的整数。
18.根据权利要求17所述的生理活性多肽缀合物,其中所述[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式5a至51的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
19.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述生理活性多肽缀合物具有如下式6a至6n的任何一种结构式:
[式6a]
[式6b]
[式6c]
[式6d]
[式6e]
[式6f]
[式6g]
[式6h]
[式6i]
[式6j]
[式6k]
[式6l]
[式6m]
[式6n]
在式6a至式6n中,
n是20至1000的整数;
j为0至6的整数;
[氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种;并且
q是1到6的整数。
20.根据权利要求19所述的生理活性多肽缀合物,其中所述[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式6a至6n的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
21.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述生理活性多肽选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、促胰岛素肽、神经肽、垂体激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、生理活性的非天然肽衍生物、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组。
22.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述生理活性多肽选自由以下组成的组:胰高血糖素、胃抑制多肽(GIP)、类爪蟾肽、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰岛淀粉样多肽、胃泌素、生长素释放肽、胃或肠中调节血糖和体重的肠促胰岛素、脂肪分泌的脂肪因子、神经肽、肌肉分泌的肽或蛋白质、血管活性肠肽、利钠肽、生长抑素、神经肽Y(NPY)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、艾塞那肽-4、胃泌素调节素、成纤维细胞生长因子、血管紧张素、缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素(促皮质素)、章鱼降压肽、催产素、血管加压素、促黄体生成激素、促黄体生成激素、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、促胰液素、舍莫瑞林、人类生长激素(hGH)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激素因子(GCSF)、干扰素(IFN)、干扰素受体、白介素、白介素受体、白介素结合蛋白、催乳素释放肽、食欲素、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房利钠肽(ANP)、B型利尿肽(BNP)、C型利尿肽(CNP)、神经激肽A、神经调节素、肾素、内皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制因子、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺蛋白酶、胸腺五肽、胸腺肽、胸腺壁因子、肾上腺调节素、阿托伐他汀、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化剂、铃蟾肽、骨钙素、CART肽、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、白蛋白、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰泌素、恩夫韦肽、胰高血糖素样肽、胃泌素调节素、G蛋白偶联受体、酶、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、转移诱导因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、VII、VIIa、IX和XIII凝血因子、纤溶酶原激活因子、血纤蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、上皮细胞生长因子、血管抑素、成骨生长因子、促成骨蛋白、心房肽、软骨诱导因子、降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制剂、神经生长因子、松弛素、生长抑素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰腺多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动素、乳铁蛋白、肌生长抑制素、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、促红细胞生成素、白细胞生成素及其类似物。
23.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区为无糖基化形式。
24.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1-4个结构域组成。
25.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区还包含铰链区。
26.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM、其组合及其杂合物衍生的Fc区组成的组。
27.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、其组合及其杂合物衍生的Fc区组成的组。
28.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。
29.根据权利要求15所述的生理活性多肽缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是人无糖基化的IgG4 Fc区。
30.一种制备生理活性多肽缀合物的方法,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区经由式1的化合物作为接头彼此连接,所述方法包括:将叠氮基引入到所述生理活性多肽中;
通过所述叠氮基和如下式1的化合物的R2的亚乙炔基(-C≡C-)的点击反应由环加成反应形成1,2,3-三唑;并且
将所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸与式1化合物的R1共价连接:
[式1]
R1-非肽基聚合物-X-R2
在式1中,
R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
X为-(CH2)jNHCO-或-(CH2)jNHCS-,其中j为0至6的整数;
R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,Z是O或S,
Y是C2-C6炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基(其中每个环炔基具有3-8个碳原子,每个芳基具有5-8个碳原子,并且每个杂环炔基是包含3-8个碳原子和在1至3个环原子中具有选自N、O和S的杂原子的饱和环),k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;并且
所述炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、氧或卤素取代或未被取代。

说明书全文

非肽聚合物接头化合物、包含该接头化合物的缀合物及制备

该接头化合物和缀合物的方法

技术领域

[0001] 本公开涉及一种非肽基聚合化合物,包括该化合物的缀合物及其制备方法。更具体地,本公开涉及可以用作接头以增加生理活性多肽的半衰期的非肽基聚合物化合物,经由该化合物作为接头与生理活性多肽连接的缀合物,以及其制备方法。

背景技术

[0002] 蛋白药物在施用于人体时具有短的血液半衰期。因此,蛋白质药物的不便之处在于,为了维持其功效需要经常施用它们。为了解决该问题,已经使用了将聚乙二醇与蛋白药物结合的聚乙二醇化来增加蛋白药物的血液半衰期。这种聚乙二醇化不仅增加了蛋白质药物的血液半衰期,而且降低了蛋白质药物的抗原性,因此聚乙二醇化被广泛用于蛋白质治疗剂中。
[0003] 聚乙二醇具有聚乙二醇衍生物的形式,其除了与蛋白质药物结合的官能团之外,该聚乙二醇衍生物还包括与已知可改善蛋白质药物的半衰期的免疫球蛋白Fc区结合的官能团。因此,聚乙二醇可用作连接蛋白药物和免疫球蛋白Fc区的接头(linker)。此外,作为蛋白质药物和免疫球蛋白Fc区的接头化合物,除了聚乙二醇衍生物以外,还提出了各种具有生物相容性的非肽基聚合物作为接头能够与蛋白质药物一起形成缀合物(专利文献1)。
[0004] 非肽基聚合物可在其两端各自独立地具有基、丙醛基、丁醛基、来酰亚胺基、琥珀酰亚胺衍生物(丙二酰亚胺琥珀酰亚胺基、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基或琥珀酰亚胺基酸酯)等作为与蛋白质药物和免疫球蛋白Fc结合的官能团。
[0005] 然而,官能团的缺点在于,由于在与蛋白质药物结合后靶向特定基酸位点的反应过程中引入反应的全部物质可能无法转化为缀合物的原因而导致的缀合物产率降低,以及某些反应性基团在血液中稳定性降低。
[0006] (专利文献1)韩国专利公开第2014-0018462号。发明内容
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的一个方面是提供一种非肽基聚合化合物,其不仅能够与生理活性多肽稳定结合以增加生理活性多肽的血液半衰期,而且能够以高产率与其结合。
[0009] 本发明的另一方面是提供一种生理活性多肽连接体,其中生理活性多肽连接在非肽基聚合物的一端。
[0010] 本发明的另一方面是提供一种生理活性多肽缀合物,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区分别连接至非肽基聚合物的两端。
[0011] 本发明的另一个方面是提供一种制备非肽基聚合物、生理活性多肽连接体和生理活性多肽缀合物的方法。
[0012] 解决方案
[0013] 本发明的一个方面是提供一种化合物,其中在非肽基聚合物的一端引入能够与免疫球蛋白Fc区结合的官能团或生理活性多肽,并且在另一端引入能够发生点击反应(click reaction)的官能团。
[0014] 该化合物可包括如下式1的化合物,其立体异构体或其药学上可接受的盐:
[0015] [式1]
[0016] R1-非肽基聚合物-X-R2
[0017] 在式1中,
[0018] R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族基:2,5-二杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
[0019] 所述非肽基聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸和多糖;
[0020] X为-(CH2)jNHCO-或-(CH2)jNHCS-,其中j为0至6的整数;
[0021] R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,
[0022] 其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,
[0023] Z是O或S,
[0024] Y是C2-C6炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基(其中每个环炔基具有3-8个碳原子,每个芳基具有5-8个碳原子,并且每个杂环炔基是包含3-8个碳原子和在1至3个环原子中具有选自N、O和S的杂原子的饱和环),
[0025] k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;并且
[0026] 所述炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、氧或卤素取代或未被取代。
[0027] 本发明的另一个方面是提供一种制备根据本发明的一个方面的化合物的方法,该方法包括:
[0028] 在非肽基聚合物的一端引入能够发生点击反应的官能团;和
[0029] 在非肽基聚合物的另一端引入能够与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团。
[0030] 本发明的另一方面是提供一种生理活性多肽连接体,其中该生理活性多肽连接至能够在根据一个方面的化合物的一端发生点击反应的官能团。
[0031] 本发明的另一个方面是提供一种免疫球蛋白Fc区连接体,其中该免疫球蛋白Fc区连接至能够在根据一个方面的化合物的一端发生点击反应的官能团。
[0032] 本发明的另一方面是提供一种生理活性多肽缀合物,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区经由根据一个方面的化合物作为接头彼此连接。
[0033] 本发明的有利效果
[0034] 与已知的接头化合物相比,根据本发明的一个方面的化合物可以稳定地连接至生理活性多肽的靶位点并且可以形成具有高产率和稳定性的缀合物。附图说明
[0035] 图1显示了根据一个实施方案的接头化合物6(MW=10000)的1H NMR结果;
[0036] 图2显示了根据一个实施方案的接头化合物6(MW=5000)的1H NMR结果;
[0037] 图3显示了根据一个实施方案的接头化合物6(MW=3400)的1H NMR结果。
[0038] 图4显示了根据一个实施方案的接头化合物6(MW=2000)的1H NMR结果。
[0039] 图5显示了根据一个实施方案的接头化合物9(MW=10000)的1H NMR结果。
[0040] 图6显示了根据一个实施方案的接头化合物14(MW=10000)的1H NMR结果;
[0041] 图7显示了根据一个实施方案的接头化合物16(MW=10000)的1H NMR结果;
[0042] 图8显示了接头化合物ALD-PEG 10K-DBCO的质谱分析结果。
[0043] 图9显示了接头化合物ALD-PEG 5K-DBCO的质谱分析结果。
[0044] 图10显示了接头化合物ALD-PEG 3.4K-DBCO的质谱分析结果。
[0045] 图11显示了接头化合物ALD-PEG 2K-DBCO的质谱分析结果。
[0046] 图12显示了接头化合物PeALD-PEG 10K-BCN的质谱分析结果。
[0047] 图13显示了接头化合物PeALD-PEG 10K-DBCO的质谱分析结果。
[0048] 图14显示了接头化合物ALD-PEG 10K-BCN的质谱分析结果。
[0049] 图15显示了HMT211-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的SDS-PAGE纯度分析的结果,其中M:标记物;1:HMT211-叠氮基肽;2:单聚乙二醇化的HMT211-叠氮基-PEG;3:免疫球蛋白Fc,4:通过经由ALD-PEG 10K-BCN接头将HMT211-叠氮基与免疫球蛋白Fc连接而制备的HMT211-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。
[0050] 图16显示了GLP-2类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的非还原SDS-PAGE纯度分析的结果,其中M:标记物;1:GLP-2类似物;2:单PEG化的GLP-2类似物;3:免疫球蛋白Fc,4:通过经由ALD-PEG 10K-DBCO接头将GLP-2类似物叠氮基与免疫球蛋白Fc连接而制备的GLP-2类似物-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。并且
[0051] 图17显示了胰高血糖素类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的非还原SDS-PAGE纯度分析的结果,其中M:标记物;1:胰高血糖素类似物;2:单聚乙二醇化的胰高血糖素类似物;3:免疫球蛋白Fc;4:通过经由PeAL-PEG 10K-BCN接头将胰高血糖素类似物叠氮基与免疫球蛋白Fc连接而制备的胰高血糖素类似物-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。

具体实施方式

[0052] 在下文中,将更详细地描述本发明。
[0053] 除非另有定义,否则本文中使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。此外,尽管本文描述了方法或样品,但是那些与它们相似或等同的方法或样品也被合并入本发明的范围内。除非另有说明,否则本文所述的数值被认为包括“约”的含义。在此作为参考公开的所有出版物的内容都包含在本公开中。
[0054] 本发明人已进行研究以开发可与生理活性多肽结合以改善生理活性多肽的体内稳定性从而增加其半衰期的接头化合物,结果,他们开发了能够与生理活性多肽更稳定地结合的接头化合物。
[0055] 本公开的一个方面提供了一种接头化合物,其中在非肽基聚合物的一端引入能够与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团,并且在另一端引入能够发生点击反应的官能团。
[0056] 如本文所用,“能够与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团”是指该官能团能够结合免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的任何区域的氨基酸的官能团。“免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的任何区域的氨基酸的官能团”可以包括例如赖氨酸的氨基(-NH2)、脯氨酸的胺基(-NH-)、半胱氨酸的巯基(-SH)等。在一个具体的实施方案中,能够与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团是指能够与N末端氨基酸、赖氨酸或半胱氨酸的官能团(胺基、氨基或硫醇基)结合的官能团。能够与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团可以选自例如2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物,但不限于此。
[0057] 如本文所用,术语“能够发生点击反应的官能团”是指能够在有机化学中进行所谓的点击反应的官能团,并且点击反应可以包括炔-叠氮化物或炔-硝基环加成、硫醇-烯点击反应(Hoyle,Charles E.等,2010,″Thiol-Ene Click Chemistry″.Angewandte Chemie International Edition.49(9):1540-1573),亲二烯体和二烯的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应(Houk等,2013,135,15642-15649),异腈和四嗪的环加成反应(Henning等,2011,"Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with 
biomolecules″,Organic&Biomolecular Chemistry.9:7303)等,但不限于此。炔-叠氮化物或炔-硝基环加成可包括(I)催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)或应变促进的炔-硝环加成(SPANC)。点击反应在有机化学领域是众所周知的。
[0058] “能够进行点击反应的官能团”可以具体包括炔基、二烯基、异腈等,但不限于此。炔基可包括直链或支链的炔基、环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基、芳基杂环基炔基或二芳基杂环基炔基。存在于化合物的一端且能够进行点击反应的官能团可以与被引入到生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区域中的叠氮化物或硝酮等官能团一起发生点击反应。
[0059] 如本文所用,“引入官能团”是指包含相应官能团的任何可连接原子基团被结合。
[0060] 如本文所用,“非肽基聚合物”是指本领域已知的任何可与生理活性多肽结合以增加生理活性多肽的体内半衰期而没有肽基结构的聚合物。所述非肽基聚合物可以选自例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸和多糖,但不限于此。
[0061] 如本文所用,术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
[0062] 根据一个方面的化合物可以包括选自如下式1的化合物、其立体异构体、其溶剂化物及其药学上可接受的盐的化合物:
[0063] [式1]
[0064] R1-非肽基聚合物-X-R2
[0065] 在式1中,
[0066] R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
[0067] 所述非肽基聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸和多糖;
[0068] X为-(CH2)jNHCO-或-(CH2)jNHCS-,其中j为0至6的整数;
[0069] R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,
[0070] 其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,
[0071] Z是O或S,
[0072] Y是C2-C6炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基(其中每个环炔基具有3-8个碳原子,每个芳基具有5-8个碳原子,并且每个杂环炔基是包含3-8个碳原子和在1至3个环原子中具有选自N、O和S的杂原子的饱和环),k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;并且
[0073] 所述炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、氧或卤素取代或未被取代。
[0074] 在R1中,脂族烃基可包括具有1至20个碳原子、特别是1至12个碳原子、更特别是1至6个碳原子的直链或支链烷基;含有一个或多个碳-碳双键并具有2至15个碳原子、特别是2至12个碳原子、更特别是2至6个碳原子的直链或支链烯基;含有一个或多个碳-碳三键并具有2至15个碳原子、特别是2至12个碳原子、更特别是2至6个碳原子的直链或支链炔基。烷基可以例如选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、庚基、壬基和癸基。烯基可以例如选自乙烯基、丙烯基、正丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、辛烯基和癸烯基。
炔基可以选自例如乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基和癸炔基。烷基、烯基、炔基可被选自C1-C6烷基和卤素的基团取代或未被取代。
[0075] R1可以是含有醛基的C1-C6脂族烃基。在一个具体的实施方案中,R1为含有醛基的C1-C6烷基(即HC(O)-C1-6烷基),例如正戊醛、正丁醛、丙醛或乙醛。
[0076] Y可以选自:双环[6.1.0]壬炔(BCN)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、DIFO2、DIFO3、二苯并环化的环辛炔(DIBO)、双芳基环辛炔酮(BARAC)、环辛炔(OCT)、无芳基环辛炔(ALO)、单氟代环辛炔(MOFO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、2,3,6,7-四甲氧基-DIBO(TMDIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)、吡咯并环辛炔(PYRROC)、二苯并氮杂-环辛炔(DIBAC)、3,3,6,6-四甲基硫代环庚炔(TMTH)、桑德海默二炔和磺酰化DIBO(S-DIBO),但不限于此。
[0077] 在一个具体的实施方案中,式1中的非肽基聚合物可以具有如下式1a的结构,该式1a的结构具有聚乙二醇结构:
[0078] [式1a]
[0079]
[0080] 在式1a中,
[0081] n是20至1000的整数,特别是20至500的整数,并且更特别是20至250的整数;
[0082] j是0至6的整数,并且具体地,是0或2的整数;
[0083] R1是脂族烃基,包括选自2,5-二氧杂吡咯烷基,2,5-二氧杂吡咯基,醛,马来酰亚胺,C6-C20芳基二硫化物,C5-C20杂芳基二硫化物,乙烯基砜的官能团,硫醇,卤代乙酰胺,琥珀酰亚胺,碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
[0084] R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
[0085] R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,
[0086] 其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,
[0087] Z是O或S,
[0088] Y选自由以下组成的组:双环[6.1.0]壬炔(BCN)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、DIFO2、DIFO3、二苯并环化的环辛炔(DIBO)、双芳基环辛炔酮(BARAC)、环辛炔(OCT)、无芳基环辛炔(ALO)、单氟代环辛炔(MOFO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、2,3,6,7-四甲氧基-DIBO(TMDIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)、吡咯并环辛炔(PYRROC)、二苯并氮杂-环辛炔(DIBAC)、3,3,6,6-四甲基硫代环庚炔(TMTH)、桑德海默二炔和磺酰化DIBO(S-DIBO),
[0089] k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0。
[0090] 在式1和1a中,
[0091] C6-C20亚芳基可以是例如芳族基团的二价形式,例如苯、联苯、三苯、、蒽、联萘、菲、芘、二氢芘、 苝、并四苯、并五苯、苯并芘、芴、茚、茚并芴或螺并二芴,更具体地说是苯的二价形式。
[0092] C5-C20杂亚芳基可以是例如杂芳族基团的二价形式,例如5-元环(例如吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、呋喃、噻吩、硒烯、恶唑、异恶唑、1,2-噻唑、1,3-噻唑、1,2,3-恶二唑、1,2,4-恶二唑、1,2,5-恶二唑、1,3,4-恶二唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、1,2,5-噻二唑和1,3,4-噻二唑);6元环(例如,吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、1,3,5-三嗪、1,2,
4-三嗪、1,2,3-三嗪、1,2,4,5-四嗪、1,2,3,4-四嗪和1,2,3,5-四嗪);或稠合基团(例如咔唑、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、吲唑、苯并咪唑、苯并三唑、嘌呤、萘并咪唑、菲并咪唑、吡啶并咪唑、吡嗪并咪唑、喹喔啉并咪唑、苯并恶唑、萘并恶唑、蒽并恶唑、菲并恶唑、异恶唑、苯并噻唑、苯并呋喃、异苯并呋喃、二苯并呋喃、喹啉、异喹啉、蝶啶、苯并5,6-喹啉、苯并6,7-喹啉、苯并7,8-喹啉、苯并异喹啉、吖啶、吩噻嗪、吩恶嗪、苯并哒嗪、苯并嘧啶、喹喔啉、吩嗪、萘啶、氮杂咔唑、苯并咔啉、菲啶、菲咯啉、噻吩并[2,3-b]噻吩、噻吩并[3,2-b]噻吩、二噻吩并噻吩、二噻吩并吡啶、异苯并噻吩、二苯并噻吩、苯并噻二唑并噻吩等)。
[0093] 在一个特定的实施方案中,式1a可具有如下式2a至2n的任一结构:
[0094] [式2a]
[0095]
[0096] [式2b]
[0097]
[0098] [式2c]
[0099]
[0100] [式2d]
[0101]
[0102] [式2e]
[0103]
[0104] [式2f]
[0105]
[0106] [式2g]
[0107]
[0108] [式2h]
[0109]
[0110] [式2i]
[0111]
[0112] [式2j]
[0113]
[0114] [式2k]
[0115]
[0116] [式2l]
[0117]
[0118] [式2m]
[0119]
[0120] [式2n]
[0121]
[0122] 在式2a至2n中,
[0123] n可以是20至1000的整数,具体地20至500的整数,并且更具体地20至250的整数;
[0124] j可以是0至6的整数,并且具体地,可以是0或2的整数;
[0125] R1可以是包括醛基的C1-C6脂族烃基。
[0126] 根据一个方面的化合物可以以药学上可接受的盐的形式存在。作为盐,由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐是有用的。如本文所用,术语“药学上可接受的盐”是指化合物的任何有机或无机加成盐,其浓度具有有效的作用,因为它对患者相对无毒且无害,并且其副作用不会降低由式1、1a或2a至2n表示的化合物的有益功效。酸加成盐可以通过常规方法制备,例如,通过将化合物溶解在过量的酸的溶液中,然后使用与水混溶的有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈沉淀得到盐。可以加热在水中的相同摩尔量的化合物和酸或醇(例如乙二醇单甲醚),然后,可以通过蒸发干燥所得混合物,或者可以通过抽吸过滤沉淀的盐。
[0127] 此外,可使用制备药学上可接受的金属盐。例如,可以通过将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中,过滤不溶解的化合物盐,并通过蒸发干燥滤液来获得碱金属盐或碱土金属盐。
[0128] 此外,本公开可以包括式1、1a或2a至2n的化合物及其药学上可接受的盐以及可以由其制备的溶剂化物
[0129] 此外,当式1、1a或2a至2n的化合物在其取代基中具有不对称碳中心(手性碳)时,它可以对映体(R或S异构体)、外消旋体、非对映体或其混合物存在。此外,当式1、1a或2a至2n的化合物包括桥环时,其可以作为外向异构体或内向异构体存在,例如,式2a的化合物可以作为外型异构体(exo isomer)或内型异构体(endo isomer)存在。
[0130] 根据一个方面的化合物可以具有在0.1kDa至100kDa、特别地0.1kDa至50kDa、并且更特别地0.3kDa至10kDa的范围内的分子量,但不限于此。
[0131] 本公开的另一个方面提供了制备根据本公开的一个方面的化合物的方法,该方法包括:
[0132] 在非肽基聚合物的一端引入能够发生点击反应的官能团;和
[0133] 在非肽基聚合物的另一端引入能够与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团。
[0134] 根据本公开的一个方面的化合物的以上描述可以原样应用于制备方法。
[0135] 制备方法可包括:1)在非肽基聚合物的一端引入氨基(-NH2),通过与该氨基的酰胺键在非肽基聚合物的一端引入R2;和
[0136] 2)在引入R2的非肽基聚合物的另一端引入包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物,其中R2与式1或1a中定义的相同。
[0137] 在一个具体的实施方案中,1)的非肽基聚合物可以是聚乙二醇。
[0138] 在一个具体的实施方案中,1)的非肽基聚合物的分子量可以在0.1kDa至100kDa、特别是0.1kDa至50kDa、并且更特别地0.3kDa至10kDa的范围内,但不限于此。
[0139] 在一个具体的实施方案中,2)可以在引入了R2的非肽基聚合物的另一端引入包括醛基的C1-C6脂族烃基。
[0140] 用于引入能够在非肽基聚合物的一端进行点击反应的官能团的方法和用于引入能够与在非肽基聚合物的另一端的免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽结合的官能团的方法的具体反应条件,可以由有机化学领域的技术人员使用已知技术适当地确定。
[0141] 上述制备方法仅用于说明制备根据一方面的化合物的方法。根据一方面的制备化合物的方法不限于此,并且可以通过使用本领域已知的技术适当地改变。
[0142] 本公开的另一方面提供了一种生理活性多肽连接体,其中生理活性多肽连接至能够在根据一个方面的化合物的一端发生点击反应的官能团。
[0143] 本公开的另一个方面提供了一种免疫球蛋白Fc区连接体,其中免疫球蛋白Fc区连接至能够在根据一个方面的化合物的一端发生点击反应的官能团。
[0144] 如本文所用,术语“生理活性多肽连接体”是指其中生理活性多肽与根据一个方面的化合物连接的构建体,术语“免疫球蛋白Fc区连接体”是指其中免疫球蛋白Fc区与根据一个方面的化合物连接的构建体。连接可以是共价键,但不限于此。在下文中,生理活性多肽连接体或免疫球蛋白Fc区连接体也称为“生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区连接体”。
[0145] 生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区连接体可包括其中所述生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区通过式1或1a的化合物的官能团Y与式1或1a的化合物连接的生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区连接体。
[0146] 为了将生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区连接至能够发生点击反应的官能团,特别是式1的官能团Y,引入了能够与官能团Y发生点击反应的官能团,然后,可以通过点击反应形成连接体。可以引入到生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区域中且能够发生点击反应的官能团可以是例如叠氮化物、硝酮等。为了将叠氮化物或硝酮引入到生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区域中,可以通过氨基酸之间的酰胺键将与叠氮化物或硝酮结合的氨基酸与生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区连接。与叠氮化物或硝酮结合的氨基酸可以直接制备或从市售来源购买。在一个具体的实施方案中,叠氮赖氨酸(N3-赖氨酸)可以通过酰胺键与生理活性多肽连接,叠氮赖氨酸可以从可商购的来源(Sigma Aldrich,Fmoc-叠氮赖氨酸)购买。在一个具体的实施方案中,叠氮赖氨酸(N3-赖氨酸)可以通过酰胺键连接至生理活性多肽的C-末端。
[0147] 在另一个具体的实施方案中,叠氮化物或硝酮可以直接连接至生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区域中的氨基酸,而无需单独的氨基酸。为此,可与待连接至叠氮化物或硝酮的氨基酸连接的官能团可以可首先与叠氮化物或硝酮连接。例如,可使N-羟基琥珀酰亚胺基叠氮化物(例如,NHS-叠氮化物,NHS-PEG4-叠氮化物)与生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区反应,以通过存在于生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区的氨基酸(例如,赖氨酸,N-末端氨基)直接与其连接。
[0148] 在另一个具体的实施方案中,叠氮化物或硝酮可以通过添加或取代至生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区的氨基酸而连接。为此,可以将与待连接至叠氮化物或硝酮的氨基酸添加或取代至生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区,然后将可与添加或取代的氨基酸连接的官能团与叠氮化物或硝酮连接。例如,可以向生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区添加或取代赖氨酸,然后可以通过添加或取代的赖氨酸连接N-羟基琥珀酰亚胺基叠氮化物(例如,NHS-叠氮化物,NHS-PEG4-叠氮化物)。
[0149] 引入叠氮化物或硝酮的生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区可通过与能够在根据本发明的一个方面的接头化合物的一端发生点击反应的官能团(例如,通过点击反应的环加成的式1或1a的化合物的官能团Y)一起形成三唑(叠氮化物与Y的亚乙炔基-C≡C-的反应)或异恶唑烷(硝酮与Y的亚乙炔基-C≡C-的反应)而与接头化合物连接。本领域技术人员可以使用常识适当地确定制备方法的具体条件。
[0150] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽键可以是如下的生理活性多肽键,其中将叠氮基引入到生理活性多肽中,然后经由点击反应通过环加成形成1,2,3-三唑将叠氮基和式1或式1a化合物的官能团Y的亚乙炔基彼此结合。
[0151] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽键可具有以下式3a至31中的任何一个式:
[0152] [式3a]
[0153]
[0154] [式3b]
[0155]
[0156] [式3c]
[0157]
[0158] [式3d]
[0159]
[0160] [式3e]
[0161]
[0162] [式3f]
[0163]
[0164] [式3g]
[0165]
[0166] [式3h]
[0167]
[0168] [式3i]
[0169]
[0170] [式3j]
[0171]
[0172] [式3k]
[0173]
[0174] [式3l]
[0175]
[0176] 在式3a至3l中,R1、R3、R4、Z、j、k、l、m、n和p与式1a中定义的相同;并且[0177] [氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种。
[0178] 在一个具体的实施方案中,式3a至3l的[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式3a至3l的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
[0179] 在另一个具体的实施方案中,式3a至3l的[氨基酸]是从生理活性多肽的天然序列的N端氨基酸除去α-氨基的部分,并且式3a至3l的三唑氮可以连接至N-末端氨基酸的α碳。
[0180] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽键可以是具有如下式4a至4n中任一个结构式的生理活性多肽键:
[0181] [式4a]
[0182]
[0183] [式4b]
[0184]
[0185] [式4c]
[0186]
[0187] [式4d]
[0188]
[0189] [式4e]
[0190]
[0191] [式4f]
[0192]
[0193] [式4g]
[0194]
[0195] [式4h]
[0196]
[0197] [式4i]
[0198]
[0199] [式4j]
[0200]
[0201] [式4k]
[0202]
[0203] [式4l]
[0204]
[0205] [式4m]
[0206]
[0207] [式4n]
[0208]
[0209] 在式4a至4n中,
[0210] R1、j和n与式1a中定义的相同,并且
[0211] [氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种。
[0212] 在一个具体的实施方案中,式4a至4n的[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式4a至4n的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
[0213] 在另一个具体的实施方案中,式4a至4n的[氨基酸]是从生理活性多肽的天然序列的N端氨基酸除去α-氨基的部分,并且式4a至4n的三唑氮可以连接至N-末端氨基酸的α碳。
[0214] 本公开的另一方面提供了生理活性多肽连接体,其中生理活性多肽在根据一个方面的化合物的一端连接至官能团R1。
[0215] 本公开的另一方面提供了免疫球蛋白Fc区连接,其中免疫球蛋白Fc区在根据一个方面的化合物的一端连接至官能团R1。
[0216] 生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区的任何氨基酸可与式1或1a化合物的官能团R1形成共价键。具体地,R1是包含选自2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物的官能团的脂族烃基,可共价连接至生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区的任何氨基酸的官能团(例如,赖氨酸的氨基(-NH2),脯氨酸的胺(-NH-),半胱氨酸的硫醇(-SH)等),更具体地,可以与N端氨基酸的官能团共价连接。在一个具体的实施方案中,当生理活性多肽的N-末端具有胺基或氨基时,它可以通过还原胺化与包括醛官能团的R1形成共价键。如本文所用,术语“还原胺化”是指一种反应物的胺基或氨基与另一种反应物的醛(即,能够进行还原胺化的官能团)反应形成亚胺的反应,并且然后通过还原形成胺键,还原胺化是本领域广泛已知的有机合成反应。
[0217] 本公开的另一方面提供了生理活性多肽缀合物,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过根据一方面的化合物作为接头彼此连接。
[0218] 如本文所用,术语“生理活性多肽缀合物”是指其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过根据一方面的化合物作为接头彼此连接以形成单一物质的构建体。连接可以是共价键,但不限于此。
[0219] 生理活性多肽缀合物可以包括生理活性多肽缀合物,其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过式1或1a的化合物作为接头彼此连接。
[0220] 在生理活性多肽缀合物中,生理活性多肽可以与包括式1或1a的化合物的接头化合物的两端的任一端连接,并且免疫球蛋白Fc区可以与包括式1或1a的化合物的接头化合物的多肽的另一端连接。
[0221] 关于上述缀合物,通过根据一方面的化合物的一端的官能团Y或R1形成的如上所述的生理活性多肽连接体,可以进行将生理活性多肽连接至包括式1或1a的化合物的接头化合物的任一末端的方法。
[0222] 关于上述缀合物,通过根据一方面的化合物的一端的官能团Y或R1形成的如上所述的免疫球蛋白Fc区连接体,可以进行将免疫球蛋白Fc区连接至包括式1或1a的化合物的接头化合物的任一末端的方法。
[0223] 在一个具体的实施方案中,所述生理活性多肽缀合物可以是如下的生理活性多肽缀合物,其中将叠氮基引入到所述生理活性多肽中,然后可以将叠氮基和式1的R2的亚乙炔基经由点击反应通过环加成反应形成1,2,3-三唑而彼此结合,并且免疫球蛋白Fc区的氨基酸通过共价键与式1的化合物的R1连接。在另一个具体的实施方案中,生理活性多肽缀合物可以是如下的生理活性多肽缀合物,其中将叠氮基团引入到生理活性多肽中,然后叠氮基和式1的R2的亚乙炔基可以经由点击反应通过环加成反应形成1,2,3-三唑彼此结合,并且免疫球蛋白Fc区的N端脯氨酸可通过还原胺化与式1的R1形成胺键。
[0224] 在一个具体的实施方案中,所述生理活性多肽缀合物可以是具有以下式5a至51的任何一个结构式的生理活性多肽缀合物:
[0225] [式5a]
[0226]
[0227] [式5b]
[0228]
[0229] [式5c]
[0230]
[0231] [式5d]
[0232]
[0233]
[0234] [式5e]
[0235]
[0236] [式5f]
[0237]
[0238] [式5g]
[0239]
[0240] [式5h]
[0241]
[0242] [式5i]
[0243]
[0244] [式5j]
[0245]
[0246] [式5k]
[0247]
[0248] [式5l]
[0249]
[0250] 在式5a至5l中,
[0251] R3、R4、Z、j、k、l、m、n和p与式1a中定义的相同;
[0252] [氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种;并且
[0253] q是1到6的整数。
[0254] 在一个具体的实施方案中,式5a至51的[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式5a至51的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
[0255] 在另一个具体的实施方案中,式5a至5l的[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去α-氨基的部分,并且式5a至5l的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的α碳。
[0256] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽缀合物可以是具有以下式6a至6n的任何一个结构式的生理活性多肽缀合物:
[0257] [式6a]
[0258]
[0259] [式6b]
[0260]
[0261] [式6c]
[0262]
[0263] [式6d]
[0264]
[0265] [式6e]
[0266]
[0267] [式6f]
[0268]
[0269] [式6g]
[0270]
[0271] [式6h]
[0272]
[0273] [式6i]
[0274]
[0275] [式6j]
[0276]
[0277] [式6k]
[0278]
[0279] [式6l]
[0280]
[0281] [式6m]
[0282]
[0283] [式6n]
[0284]
[0285] 在式6a至6n中,
[0286] j和n与式1a中定义的相同;
[0287] [氨基酸]是构成天然形式的生理活性多肽序列的氨基酸或不属于其的添加或取代的氨基酸中的任何一种;并且
[0288] q是1到6的整数。
[0289] 在一个具体的实施方案中,式6a至6n的[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去ε-氨基的部分,并且式5a至5l的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的ε碳。
[0290] 在另一个具体的实施方案中,式6a至6n的[氨基酸]是从所述生理活性多肽的天然序列的赖氨酸残基中除去α-氨基的部分,并且式5a至5l的三唑氮连接至所述赖氨酸侧链的α碳。
[0291] 如本文所用,术语“生理活性多肽”是指具有在体内特别是在人体中表现出生理活性的多肽结构的任何物质,并且包括前体、类似物、衍生物、片段或具有相应多肽生理活性的多肽变体。
[0292] 生理活性多肽可以选自激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、促胰岛素肽、神经肽、垂体激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、生理活性的非天然肽衍生物、结构蛋白和受体,但不限于此。
[0293] 生理活性多肽可以例如选自胰高血糖素、胃抑制多肽(GIP)、类爪蟾肽、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰岛淀粉样多肽、胃泌素、生长素释放肽、胃或肠中调节血糖和体重的肠促胰岛素、脂肪分泌的脂肪因子、神经肽、肌肉分泌的肽或蛋白质、血管活性肠肽、利钠肽、生长抑素、神经肽Y(NPY)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、塞那肽-4、胃泌素调节素、纤维细胞生长因子、血管紧张素、缓激肽、降素、促肾上腺皮质激素(促皮质素)、章鱼降压肽、催产素、血管加压素、促黄体生成激素、促黄体生成激素、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、促胰液素、舍莫瑞林、人类生长激素(hGH)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激素因子(GCSF)、干扰素(IFN)、干扰素受体、白介素、白介素受体、白介素结合蛋白、催乳素释放肽、食欲素、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房利钠肽(ANP)、B型利尿肽(BNP)、C型利尿肽(CNP)、神经激肽A、神经调节素、肾素、内皮素、蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制因子、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺蛋白酶、胸腺五肽、胸腺肽、胸腺壁因子、肾上腺调节素、阿托伐他汀、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化剂、铃蟾肽、骨钙素、CART肽、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、白蛋白、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰泌素、恩夫韦肽、胰高血糖素样肽、胃泌素调节素、G蛋白偶联受体、酶、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、转移诱导因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、VII、VIIa、IX和XIII凝血因子、纤溶酶原激活因子、血纤蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、上皮细胞生长因子、血管抑素、成骨生长因子、促成骨蛋白、心房肽、软骨诱导因子、降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制剂、神经生长因子、松弛素、生长抑素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰腺多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动素、乳蛋白、肌生长抑制素、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、促红细胞生成素、白细胞生成素及其类似物,但不限于此。
[0294] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽的类型不受限制,并且可以包括例如对国际专利公开号WO 2017-116205 A1中公开的全部胰高血糖素、GLP-1和GIP受体、国际专利公开号WO 2017-003191 A1中公开的胰高血糖素类似物等具有活性的三重激动剂。
[0295] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽可以包括GLP-2类似物。例如,GLP-2类似物可包括其中巯基(例如,半胱氨酸)被引入天然GLP-2的C末端的GLP-2类似物,其第二个氨基酸的丙氨酸被甘氨酸替代,从N末端的第1个氨基酸除去组氨酸残基的α碳。一种GLP-2类似物,其中将胺基(例如赖氨酸)引入天然GLP-2的C-末端,将第2个氨基酸的丙氨酸替换为甘氨酸,并将从N末端的第一个氨基酸组氨酸残基的α碳去除;在其中将胺基(例如赖氨酸)引入天然GLP-2的C端的GLP-2类似物,将天然GLP-2的第二个氨基酸丙氨酸替换为甘氨酸,天然GLP-2的第30个氨基酸赖氨酸置换为精氨酸,并除去从N末端的第一个氨基酸即组氨酸残基的α碳。GLP-2类似物,其中将叠氮基(例如叠氮赖氨酸)引入天然GLP-2的C端,第2个氨基酸丙氨酸被甘氨酸替代,并除去从N端的第一个氨基酸组氨酸残基的α碳,等。
[0296] 如本文所用,术语“免疫球蛋白Fc区”是指具有恒定序列的区域,该区域不包括与抗原结合的可变区,并且在免疫球蛋白中具有许多序列变异,并且相应部分的特征在于具有效应子的功能,例如激活补体、穿越胎盘的能或充当各种免疫细胞受体的配体。免疫球蛋白Fc区和“免疫球蛋白恒定区”可以以相同的含义使用。
[0297] 具体地,免疫球蛋白Fc区是指包含免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白质,但不包括重链和轻链可变区、重链免疫球蛋白的链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。免疫球蛋白Fc区还可包括在重链恒定区中的铰链区。此外,免疫球蛋白Fc区可以是延伸的Fc区,其包含除重链和轻链可变区之外的部分或全部的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1),只要其效果基本上等于或优于天然形式即可。此外,免疫球蛋白Fc区可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的片段。换句话说,免疫球蛋白Fc区可包括1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域,2)CH1结构域和CH2结构域,3)CH1结构域和CH3结构域,4)CH2结构域和CH3结构域,5)一个或两个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合,或6)重链恒定区每个结构域和轻链恒定区的二聚体。
[0298] 此外,免疫球蛋白Fc区不仅可以包括天然氨基酸序列,而且可以包括其序列衍生物(突变体)。如本文所用,术语“氨基酸序列衍生物”是指由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。例如,在IgG Fc的情况下,在位置214至238、297至299、318至322或327至331的氨基酸残基已知在结合中非常重要,可用作修饰的合适靶标。
[0299] 另外,免疫球蛋白Fc区的各种衍生物也是可能的,包括具有能够形成二硫键的区域的缺失、天然Fc的N末端的几个氨基酸残基的缺失或在天然Fc的N-末端添加甲硫氨酸残基。此外,为了消除效应子的功能,可以去除补体结合位点,例如C1q结合位点,并且还可以去除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。国际专利公开号WO 97/34631和WO 96/32478公开了制备免疫球蛋白Fc区的此类序列衍生物的技术。
[0300] 蛋白质和肽中的氨基酸交换通常不改变分子的活性,这是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly,双相交换都可。在某些情况下,免疫球蛋白Fc区也可以通过磷酸化硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰。
[0301] 免疫球蛋白Fc区的序列衍生物是表现出与免疫球蛋白Fc区相同的生物学活性,但是具有改善的抗热、pH等结构稳定性的衍生物。Fc免疫球蛋白区可以从分离自人类和动物(包括、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等)的天然形式获得,或者可以是其重组形式或衍生物,从转化的动物细胞或微生物获得。在此,从天然形式获得Fc免疫球蛋白区域的方法可以是从人或动物的活体中分离出完整的免疫球蛋白然后用蛋白酶处理的方法。当用木瓜蛋白酶处理整个免疫球蛋白时,将其切割成Fab和Fc,而当用胃蛋白酶处理时,将其切割成pF′c和F(ab)2。这些片段可以进行体积排阻色谱法以分离Fc或pF′c。
[0302] 在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白Fc区可以是通过使用人Fc区从微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
[0303] 此外,免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链且与天然形式相比糖链增加或与天然形式相比糖链减少的形式,或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc区的糖链的增加、减少或去除可以使用诸如化学方法、酶促方法和使用微生物的基因工程的方法之类的常规方法来进行。在此,去糖基化的免疫球蛋白Fc区与补体(c1q)的结合亲和力可能会急剧下降,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性会降低或丢失,因此不会在体内引起不必要的免疫反应。在这方面,去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可能更适合用作药物载体。
[0304] 如本文所用,术语“去糖基化”是指使用酶去除糖部分的免疫球蛋白Fc区,术语“无糖基化”是指在原核生物特别是大肠杆菌中产生的未糖基化的免疫球蛋白Fc区。
[0305] 免疫球蛋白Fc区可以源自人或动物,例如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等。具体地,它是人源的。
[0306] 此外,免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或它们的杂合的Fc区。具体而言,它衍生自IgG或IgM,其是人血中最丰富的蛋白质,最具体地说,它衍生自已知可延长结合蛋白半衰期的IgG。
[0307] 如本文所用,术语“组合”是指将相同来源的编码单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。换句话说,二聚体或多聚体可由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个片段形成。
[0308] 如本文所用,术语“杂合”是指编码不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc片段的序列存在于单链免疫球蛋白Fc区域中。各种类型的杂合都是可能的。换句话说,结构域杂合可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4中的一到四个结构域组成,并且可以可选地包括铰链区。
[0309] IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类,并且其组合或杂合可用作免疫球蛋白Fc区。免疫球蛋白Fc区特别是IgG2和IgG4亚类,最具体地说,IgG4的Fc片段很少具有效应功能,例如补体依赖性细胞毒性(CDC)。
[0310] 在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白Fc区可以是人IgG4衍生的无糖基化的Fc区。与可能在人体内充当抗原并引起不良的免疫应答(例如产生针对该抗原的新抗体)的非人Fc区相比,人源Fc区是合适的。
[0311] 本公开的另一方面提供了一种制备生理活性多肽缀合物的方法,其中所述生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过式1的化合物作为接头彼此连接,所述方法包括:
[0312] 将叠氮基引入生理活性多肽;
[0313] 通过叠氮基与如下式1的化合物的R2的乙炔基(-C≡C-)的点击反应的环加成反应形成1,2,3-三唑;并且
[0314] 将免疫球蛋白Fc区的氨基酸与式1化合物的R1共价连接。
[0315] [式1]
[0316] R1-非肽基聚合物-X-R2
[0317] 在式1中,
[0318] R1是包含选自由以下组成的组的官能团的脂族烃基:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物;
[0319] X为-(CH2)jNHCO-或-(CH2)jNHCS-,其中j为0至6的整数;
[0320] R2为-(R3)k-(Z)l-(R4)m-(CZ)p-Y-,其中R3和R4各自独立地为C1-C6亚烷基、C6-C20亚芳基或具有1-3个选自N、O和S的杂原子的C5-C20亚杂芳基,Z是O或S,
[0321] Y是C2-C6炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基(其中每个环炔基具有3-8个碳原子,每个芳基具有5-8个碳原子,并且每个杂环炔基是包含3-8个碳原子和在1至3个环原子中具有选自N、O和S的杂原子的饱和环),
[0322] k、l、m和p分别独立地是0到3的整数,但其不同时为0;并且
[0323] 所述炔基、环炔基、双环炔基、芳基环炔基、二芳基环炔基、杂环炔基或二芳基杂环炔基被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、氧或卤素取代或未被取代。
[0324] 根据本公开的一个方面的生理活性多肽缀合物的以上描述可以原样应用于制备方法。
[0325] 将叠氮基引入生理活性多肽的方法可以根据有机化学领域中已知的方法进行。
[0326] 在一个具体的实施方案中,生理活性多肽的C-末端的氨基酸可以被赖氨酸替换,并且叠氮基可以被引入到替换的赖氨酸位置。
[0327] 在一个具体的实施方案中,叠氮赖氨酸(N3-赖氨酸)可以与生理活性多肽的C-末端连接。
[0328] 叠氮基和下式1的化合物的R2的亚乙炔基通过点击反应的环加成可以根据在有机化学领域广为人知的铜(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)或应变促进的叠氮-炔烃环加成(SPAAC)进行,取决于R2的结构。当R2的Y为C2-C6炔基时,可以在单价铜催化剂存在下根据CuAAC进行点击反应,并且当R2的Y具有环结构例如环炔基、芳基环炔基、杂环炔基、芳基杂环炔基、二芳基环炔基、二芳基杂环炔基等时,环加成可以根据SPAAC在不存在一价铜催化剂的情况下进行。
[0329] 在生理活性多肽的叠氮基与式1的化合物的R2的亚乙炔基的点击反应中,生理活性多肽与式1的化合物的反应摩尔比可以选自1∶1至1∶20的范围,但不限于此。在一个具体的实施方案中,生理活性多肽与式1化合物的反应摩尔比可以为1∶2至1∶20。
[0330] 在免疫球蛋白Fc区的氨基酸与式1化合物的R1的共价连接中,R1是脂肪族烃基,其包括选自以下的官能团:2,5-二氧杂吡咯烷基、2,5-二氧杂吡咯基、醛、马来酰亚胺、C6-C20芳基二硫化物、C5-C20杂芳基二硫化物、乙烯基砜、硫醇、卤化乙酰胺、琥珀酰亚胺、碳酸对硝基苯酯及其衍生物,R1可以共价连接至免疫球蛋白Fc区的N末端氨基酸的官能团如胺基、氨基或硫醇基等。在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白Fc区的氨基酸的胺基或氨基可以通过还原胺化与包括醛官能团的R1共价连接。在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白Fc区的N-末端氨基酸可以与式1化合物的R1共价连接。
[0331] 在免疫球蛋白Fc区的氨基酸与式1化合物的R1共价连接中,与生理活性多肽连接的式1化合物与免疫球蛋白Fc的反应摩尔比可选的范围是1∶1至1∶20,但不限于此。在一个具体的实施方案中,与生理活性多肽连接的式1化合物与免疫球蛋白Fc的反应摩尔比可以为1∶2至1∶20。
[0332] 本公开的另一方面提供了一种在制备生理活性多肽连接体中使用选自式1的化合物、其立体异构体、其溶剂化物及其药学上可接受的盐的方法。换句话说,提供了式1等的化合物在制备生理活性多肽连接体中的用途。
[0333] 本公开的又一方面提供了在制备生理活性多肽缀合物中使用选自式1的化合物、其立体异构体、其溶剂化物及其药学上可接受的盐的方法。换句话说,提供了式1等的化合物作为接头在制备生理活性多肽缀合物中的用途。
[0334] 在下文中,将参照示例性实施例更详细地描述本公开。然而,这些示例性实施例仅出于说明的目的,并且本发明的范围不限于这些示例性实施例。
[0335] 实施例1:接头化合物(1)的制备
[0336]
[0337] 1-1:化合物2(MW=10000)的制备
[0338] 将20g化合物1(MW=10000)和60mL二氯甲烷引入反应器中。在保持反应温度在10℃以下的同时,向其中添加1.11g三乙胺和1.15g甲磺酰氯,然后在室温搅拌3小时。反应完成后,加入100mL水和40mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将100mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用100mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将20mL的二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加300mL的甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到17.2g的标题化合物(2)(MW=10000)。
[0339] 1-2:化合物3(MW=10000)的制备
[0340] 将200mL的氨水溶液和20g的氯化铵引入反应器中。加入10g化合物2(MW=10000),然后在室温下搅拌4天。反应完成后,引入200mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将200mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用200mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将10mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加150mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到8.5g的标题化合物(3)(MW=10000)。
[0341] 1-3:化合物5(MW=10000)的制备
[0342] 将1.66g的化合物3(MW=10000)和17mL的二氯甲烷引入反应器中。加入200mg化合物4和50mg三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入35mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(35mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并用35mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加30mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.0g作为标题化合物的化合物(5)(MW=10000)。
[0343] 1-4:化合物6(MW=10000)的制备
[0344] 将0.8g的化合物5(MW=10000)和14.4mL的蒸馏水引入反应器中。向其中加入1.6mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用20mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将1mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加15mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到498mg作为标题化合物的化合物(6)(MW=10000)。将化合物6(MW=10000)命名为ALD-PEG 10K-DBCO。图1显示了接头化合物6的1H NMR结果(MW=10000)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.78(s,
1H),7.65(d,1H),7.51(d,1H),7.38-7.25(m,6H),6.11(br s,1H),5.14(d,1H),3.85-3.43(m,915H),3.31(m,2H),2.80(m,1H),2.67(t,2H),2.45(m,1H),2.15(m,1H),1.93(m,1H)。
[0345] 实施例2:接头化合物(2)的制备
[0346] 2-1:化合物2(MW=5000)的制备
[0347] 将20g化合物1(MW=5000)和60mL二氯甲烷引入反应器中。在将反应温度保持在10℃以下的同时,添加2.23g三乙胺和2.29g甲磺酰氯,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,加入100mL水和40mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将100mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用100mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将20mL的二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加300mL的甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到16.2g的标题化合物(2)(MW=5000)。
[0348] 2-2:化合物3(MW=5000)的制备
[0349] 将200mL的氨水溶液和20g的氯化铵引入反应器中。加入10g化合物2(MW=5000),然后在室温下搅拌4天。反应完成后,引入200mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将200mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用200mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将10mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加150mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,以获得8.1g作为标题化合物的化合物(3)(MW=5000)。
[0350] 2-3:化合物5(MW=5000)的制备
[0351] 将2g化合物3(MW=5000)和20mL二氯甲烷引入反应器中。加入483mg化合物4和122mg三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入30mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(35mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并使用30mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,将所得的晶体过滤并在20分钟内逐滴添加30mL甲基叔丁基醚。过滤得到的晶体,用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.2g标题化合物(5)(MW=5000)。
[0352] 2-4:化合物6(MW=5000)的制备
[0353] 将0.8g的化合物5(MW=10000)和14.4mL的蒸馏水引入反应器中。向其中加入1.6mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用20mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将1mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加15mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到500mg为标题化合物的化合物(6)(MW=5000)。将化合物6(MW=5000)命名为ALD-PEG 5K-DBCO。图2显示了接头化合物6的1H NMR结果(MW=5000)。1H NMR(CDCl3,400MHz)69.78(s,1H),7.66(d,1H),7.50(d,1H),7.40-7.25(m,6H),6.10(br s,1H),5.13(d,1H),3.82-3.41(m,459H),
3.32(m,2H),2.80(m,1H),2.67(t,2H),2.45(m,1H),2.16(m,1H),1.92(m,1H)。
[0354] 实施例3:接头化合物(3)的制备
[0355] 3-1:化合物2(MW=3400)的制备
[0356] 将20g化合物1(MW=3400)和60mL二氯甲烷引入反应器中。在保持反应温度在10℃以下的同时,向其中加入3.27g三乙胺和3.37g甲磺酰氯,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,加入100mL水和40mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将100mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用100mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。向浓缩物中加入40mL二氯甲烷,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴加入400mL甲基叔丁基醚。将得到的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到17.1g作为标题化合物的化合物(2)(MW=3400)。
[0357] 3-2:化合物3(MW=3400)的制备
[0358] 将200mL的氨水溶液和20g的氯化铵引入反应器中。加入10g化合物2(MW=3400),然后在室温下搅拌4天。反应完成后,引入200mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将200mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用200mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将20mL的二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加200mL的甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到8.7g的标题化合物(3)(MW=3400)。
[0359] 3-3:化合物5(MW=3400)的制备
[0360] 将1.7g化合物3(MW=3400)和17mL二氯甲烷引入反应器中。加入604mg化合物4和152mg三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入35mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(35mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并用35mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将3.5mL的二氯甲烷添加至浓缩物,然后将其溶解,并且在20分钟内逐滴添加35mL的甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.1g作为标题化合物的化合物(5)(MW=
3400)。
[0361] 3-4:化合物6(MW=3400)的制备
[0362] 将0.9g化合物5(MW=10000)和16.2mL蒸馏水引入反应器中。向其中加入1.8mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用20mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加20mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到590mg为标题化合物的化合物(6)(MW=3400)。将化合物6(MW=5000)命名为ALD-PEG 3.4K-DBCO。图3显示了接头化合物6的1H NMR结果(MW=3400)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.77(s,1H),7.65(d,
1H),7.50(d,1H),7.38-7.24(m,6H),6.11(br s,1H),5.13(d,1H),3.80-3.39(m,315H),
3.32(m,2H),2.80(m,1H),2.66(t,2H),2.44(m,1H),2.15(m,1H),1.92(m,1H)。
[0363] 实施例4:接头化合物(4)的制备
[0364] 4-1:化合物2(MW=2000)的制备
[0365] 将29.3g的化合物1(MW=2000)和90mL的二氯甲烷引入反应器中。在保持反应温度在10℃以下的同时,向其中加入8.2g三乙胺和8.4g甲磺酰氯,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,加入150mL水和60mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将150mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用150mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将30mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加900mL甲基叔丁基醚。将得到的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到23.0g作为标题化合物的化合物(2)(MW=2000)。
[0366] 4-2:化合物3(MW=2000)的制备
[0367] 将200mL的氨水溶液和20g的氯化铵引入反应器中。加入10g化合物2(MW=2000),然后在室温下搅拌4天。反应完成后,引入200mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将200mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用200mL蒸馏水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将10mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加300mL甲基叔丁基醚。将得到的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,以获得8.1g作为标题化合物的化合物(3)(MW=2000)。
[0368] 4-3:化合物5(MW=2000)的制备
[0369] 将1.5g的化合物3(MW=2000)和15mL的二氯甲烷引入反应器中。加入905mg的化合物4和228mg的三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入30mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(30mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并使用30mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加60mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.0g作为标题化合物的化合物(5)(MW=2000)。
[0370] 4-4:化合物6(MW=2000)的制备
[0371] 将0.65g的化合物5(MW=10000)和12.6mL的蒸馏水引入反应器中。向其中加入1.6mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用20mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。向浓缩物中加入1mL二氯甲烷,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴加入30mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到140mg的标题化合物(6)(MW=2000)。将化合物6(MW=2000)命名为ALD-PEG 2K-DBCO。图4显示了接头化合物6的1H NMR结果(MW=2000)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.78(s,1H),7.65(d,1H),7.51(d,1H),7.38-7.24(m,6H),6.11(brs,1H),5.13(d,1H),3.82-3.37(m,187H),3.32(m,2H),
2.67(m,1H),2.67(t,2H),2.45(m,1H),2.15(m,1H),1.93(m,1H)。
[0372] 实施例5:接头化合物(5)的制备
[0373]
[0374] 5-1:化合物2(MW=10000)的制备
[0375] 以与实施例1-1相同的方式获得化合物2(MW=10000)。
[0376] 5-2:化合物3(MW=10000)的制备
[0377] 以与实施例1-2相同的方式获得化合物3(MW=10000)。
[0378] 5-3:化合物8(MW=10000)的制备
[0379] 将1.76g的化合物3(MW=10000)和17mL的二氯甲烷引入反应器中。加入154mg的化合物7和54mg的三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,减压蒸馏溶剂,并引入35mL蒸馏水以溶解产物。引入乙酸乙酯(35mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并用35mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加30mL甲基叔丁基醚。将得到的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.0g作为标题化合物的化合物(8)(MW=10000)。
[0380] 5-4:化合物9(MW=10000)的制备
[0381] 将0.4g化合物5(MW=10000)和7.2mL蒸馏水引入反应器中。向其中加入0.8mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用10mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将1mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加15mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到260mg标题化合物(9)(MW=10000)。将化合物9(MW=10000)命名为ALD-PEG 10K-BCN。图5显示了接头化合物9的1H NMR结果(MW=10000)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.78(s,1H),5.23(br s,1H),4.13(d,2H),3.81-3.41(m,914H),3.36(m,2H),2.67(t,2H),2.26-2.18(m,6H),1.57(m,2H),
1.35(m,1H),0.93(m,2H)。
[0382] 实施例6:接头化合物(6)的制备
[0383] 6-1:化合物2(MW=5000)的制备
[0384] 以与实施例2-1相同的方式获得化合物2(MW=5000)。
[0385] 6-2:化合物3(MW=5000)的制备
[0386] 以与实施例2-2相同的方式获得化合物3(MW=5000)。
[0387] 6-3:化合物8(MW=5000)的制备
[0388] 将3g化合物3(MW=5000)和30mL二氯甲烷引入反应器中。加入524mg化合物7和182mg三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入30mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(30mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并使用30mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将3mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加45mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到2.0g标题化合物(8)(MW=5000)。
[0389] 6-4:化合物9(MW=5000)的制备
[0390] 将1.7g的化合物5(MW=5000)和30.6mL的蒸馏水引入反应器中。向其中加入3.4mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用34mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加30mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.25g作为标题化合物的化合物(9)(MW=5000)。将化合物9(MW=5000)命名为ALD-PEG 5K-BCN。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.78(s,1H),5.26(br s,1H),4.15(d,2H),3.81-3.41(m,458H),3.36(m,2H),2.68(t,2H),2.26-2.18(m,6H),1.57(m,2H),1.37(m,1H),0.93(m,2H)。
[0391] 实施例7:接头化合物(7)的制备
[0392] 7-1:化合物2(MW=3400)的制备
[0393] 以与实施例3-1相同的方式获得化合物2(MW=3400)。
[0394] 7-2:化合物3(MW=3400)的制备
[0395] 以与实施例3-2相同的方式获得化合物3(MW=3400)。
[0396] 7-3:化合物8(MW=3400)的制备
[0397] 将2.5g的化合物3(MW=3400)和50mL的二氯甲烷引入反应器中。加入643mg的化合物7和223mg的三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入50mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(50mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层,并使用50mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将5mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加50mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.4g作为标题化合物的化合物(8)(MW=3400)。
[0398] 7-4:化合物9(MW=3400)的制备
[0399] 将1g化合物5(MW=3400)和18mL蒸馏水引入反应器中。向其中加入2mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用20mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加20mL甲基叔丁基醚。
将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到630mg为标题化合物的化合物(9)(MW=3400)。将化合物9(MW=3400)命名为ALD-PEG 3.4K-BCN。1H NMR(CDCl3,
400MHz)δ9.78(s,1H),5.26(br s,1H),4.15(d,2H),3.81-3.41(m,314H),3.36(m,2H),2.68(t,2H),2.26-2.18(m,6H),1.57(m,2H),1.37(m,1H),0.93(m,2H)。
[0400] 实施例8:接头化合物(8)的制备
[0401] 8-1:化合物2(MW=2000)的制备
[0402] 以与实施例4-1相同的方式获得化合物2(MW=2000)。
[0403] 8-2:化合物3(MW=2000)的制备
[0404] 以与实施例4-2相同的方式获得化合物3(MW=2000)。
[0405] 8-3:化合物8(MW=2000)的制备
[0406] 将1.5g的化合物3(MW=2000)和30mL的二氯甲烷引入反应器中。加入655mg的化合物7和230mg的三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入30mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(30mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并使用30mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将3mL的二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加90mL的甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到900mg为标题化合物的化合物(8)(MW=2000)。
[0407] 8-4:化合物9(MW=2000)的制备
[0408] 将0.8g的化合物5(MW=2000)和14.4mL的蒸馏水引入反应器中。向其中加入1.6mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用20mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加60mL甲基叔丁基醚。过滤得到的晶体,用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到549mg为标题化合物的化合物(9)(MW=2000)。将化合物9(MW=2000)命名为ALD-PEG 2K-BCN。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.78(s,1H),5.26(br s,1H),4.15(d,2H),3.81-3.41(m,186H),3.36(m,2H),2.68(t,2H),2.26-2.18(m,6H),1.57(m,2H),1.37(m,1H),0.93(m,2H)。
[0409] 实施例9:接头化合物(9)的制备
[0410]
[0411] 9-1:化合物11(MW=10000)的制备
[0412] 将27.7g的化合物10(MW=10000)和83mL的二氯甲烷引入反应器中。在保持反应温度在10℃以下的同时,向其中加入1.54g三乙胺和1.59g甲磺酰氯,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,加入140mL水和57mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将140mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用140mL水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将30mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加450mL甲基叔丁基醚。将得到的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,得到25.5g作为标题化合物的化合物(11)(MW=10000)。
[0413] 9-2:化合物12(MW=10000)的制备
[0414] 将200mL的氨水溶液和20g的氯化铵引入反应器中。加入10g化合物11(MW=10000),然后在室温下搅拌4天。反应完成后,引入200mL二氯甲烷,然后搅拌5分钟。分离获得的有机层,然后将200mL的二氯甲烷加入到水层中以进一步萃取。收集有机层,并用200mL蒸馏水洗涤,并用硫酸镁干燥。进行过滤,并在减压下蒸馏剩余的滤液。将10mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加150mL甲基叔丁基醚。将得到的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在室温下在氮气下干燥,以获得8.1g作为标题化合物的化合物(12)(MW=10000)。
[0415] 9-3:化合物13(MW=10000)的制备
[0416] 将3g化合物12(MW=10000)和30mL二氯甲烷引入反应器中。加入362mg化合物4和91mg三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入30mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(30mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并使用30mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将3mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加45mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.7g的标题化合物(13)(MW=10000)。
[0417] 9-4:化合物14(MW=10000)的制备
[0418] 将1.6g化合物5(MW=10000)和28.8mL蒸馏水引入反应器中。向其中加入3.2mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用32mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加30mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.2g标题化合物(14)(MW=10000)。将化合物14(MW=10000)命名为PeAL-PEG 10K-DBCO。图6显示了接头化合物14的1H NMR结果(MW=10000)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.75(s,1H),7.65(d,1H),7.51(d,1H),7.37-7.19(m,6H),6.11(br s,1H),5.12(d,1H),3.85-3.42(m,915H),3.32(m,2H),
2.80(m,1H),2.47-2.41(m,3H),2.16(m,1H),1.92(m,1H),1.70(m,2H),1.61(m,2H)。
[0419] 实施例10:接头化合物(10)的制备
[0420]
[0421] 10-1:化合物11(MW=10000)的制备
[0422] 以与实施例9-1相同的方式获得化合物11(MW=10000)。
[0423] 10-2:化合物12(MW=10000)的制备
[0424] 以与实施例9-2相同的方式获得化合物12(MW=10000)。
[0425] 10-3:化合物15(MW=10000)的制备
[0426] 将3g化合物12(MW=10000)和30mL二氯甲烷引入反应器中。加入262mg的化合物7和91mg的三乙胺,然后在室温下搅拌3小时。反应完成后,在减压下蒸馏溶剂,并引入30mL水以溶解产物。引入乙酸乙酯(30mL×3)并搅拌5分钟,然后分离水层并使用30mL二氯甲烷萃取两次。所得有机层经硫酸镁干燥。进行过滤,然后在减压下蒸馏。将3mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加45mL甲基叔丁基醚。将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.6g标题化合物(15)(MW=10000)。
[0427] 10-4:化合物16(MW=10000)的制备
[0428] 将1.5g化合物5(MW=10000)和27mL蒸馏水引入反应器中。向其中加入3mL的0.1N HCl,并在室温下搅拌2小时。然后,通过NMR确认反应完成。用5%(w/v)碳酸氢钠水溶液中和反应溶液,并用30mL二氯甲烷萃取两次。将所得物用硫酸镁干燥,过滤并在减压下蒸馏。将2mL二氯甲烷添加至浓缩物中,然后将其溶解,并在20分钟内逐滴添加30mL甲基叔丁基醚。
将所得的晶体过滤并用甲基叔丁基醚洗涤,然后在氮气下干燥,得到1.1g的标题化合物(16)(MW=10000)。将化合物16(MW=10000)命名为PeAL-PEG 10K-BCN。图7显示了接头化合物16的1H NMR结果(MW=10000)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.75(s,1H),5.20(br s,1H),4.12(d,2H),3.85-3.44(m,914H),3.36(m,2H),2.45(t,2H),2.28-2.16(m,6H),1.70(m,2H),
1.62-1.59(m,4H),1.18(m,1H),0.93(m,2H)。
[0429] 实验例1:接头化合物的质谱分析
[0430] 使用MALDI-TOF质谱仪对实施例中制备的接头化合物进行质谱分析。使用Polytool软件分析结果。
[0431] 图8显示了接头化合物ALD-PEG 10K-DBCO的质谱分析结果。
[0432] 图9显示了接头化合物ALD-PEG 5K-DBCO的质谱分析的结果。
[0433] 图10显示了接头化合物ALD-PEG 3.4K-DBCO的质谱分析的结果。
[0434] 图11显示了接头化合物ALD-PEG 2K-DBCO的质谱分析的结果。
[0435] 图12显示了接头化合物PeALD-PEG 10K-BCN的质谱分析结果。
[0436] 图13显示了接头化合物PeALD-PEG 10K-DBCO的质谱分析结果。
[0437] 图14显示了接头化合物ALD-PEG 10K-BCN的质谱分析结果。
[0438] 实施例11:生理活性多肽连接体(1)的制备
[0439] 通过将生理活性多肽连接至实施例5的ALD-PEG 10K-BCN接头来制备生理活性多肽连接。
[0440] 详细地,生理活性多肽是对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体均具有活性的三重激动剂,公开为WO 2017/116205 A1中的SEQ ID NO:42。将三重激动剂的C末端氨基酸替换为赖氨酸,在赖氨酸上引入了叠氮基,从而制备了引入叠氮化物的三重激动剂,称为HMT211-叠氮化物。
[0441] 将制备的HMT211-叠氮化物粉末溶解在10%(v/v)10mM HCl中,然后以5mg/ml的最终浓度制备HMT211-叠氮化物,使得HMT211-叠氮化物与实施例5的ALD-PEG 10K-BCN接头的比例为1∶5,并使其在4℃下反应约2小时。此时,使反应在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.5)和60%(v/v)异丙醇的混合溶剂中进行。
[0442] 使用SP-HP(GE Healthcare)柱在含有柠檬酸钠(pH 3.0)和45%(v/v)EtOH的缓冲液中用KCl的浓度梯度纯化反应溶液。结果,获得了单PEG化的HMT211-叠氮基-PEG。
[0443] 实施例12:生理活性多肽缀合物(1)的制备
[0444] 接着,将实施例11中纯化的单PEG化的HMT211-叠氮基-PEG与免疫球蛋白Fc以1∶4的摩尔比以10mg/ml的最终浓度在25℃下反应约15小时。此时,向反应溶液中加入10mM磷酸(pH 6.0)和20mM氰基氢化钠作为还原剂。
[0445] 反应完成后,使用Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中的NaCl浓度梯度,将反应溶液施加到S.15Q(GE,USA)色谱柱上,从而纯化HMT211-叠氮基PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。
[0446] 通过SDS-PAGE分析洗脱的HMT211-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的纯度。
[0447] 图15显示了HMT211-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的SDS-PAGE纯度分析的结果。M:标记物;1:HMT211-叠氮基肽;2:单聚乙二醇化的HMT211-叠氮基-PEG,3:免疫球蛋白Fc;4:HMT211-叠氮基-PEG-免疫球蛋白FC缀合物,所述缀合物通过HMT211-叠氮化物与免疫球蛋白Fc经由ALD-PEG 10K-BCN接头连接而制备。
[0448] 如图2所示,参照图15,证实了当使用根据实施例5的接头化合物时,可以以高收率获得生理活性多肽缀合物,其两端均与生理活性多肽和免疫球蛋白Fc连接。
[0449] 实施例13:生理活性多肽连接(2)的制备
[0450] 通过将生理活性多肽连接至实施例1的ALD-PEG 10K-DBCO接头来制备生理活性多肽连接。
[0451] 详细地,生理活性多肽是GLP-2衍生物-叠氮化物,其中叠氮基赖氨酸被引入GLP-2的C端。例如,该实施例中的GLP-2衍生物-叠氮化物是通过将叠氮赖氨酸引入天然GLP-2的C-末端,用甘氨酸代替第二氨基酸的丙氨酸,并去除来自N端的第一个氨基酸组氨酸残基的α碳而制备的。
[0452] 为了将实施例1的ALD-PEG 10K-DBCO(10kDa)聚乙二醇化为GLP-2衍生物叠氮化物,制备GLP-2衍生物叠氮基的浓度为5mg/ml,使得摩尔比为GLP-2衍生物-叠氮化物粉末:ALD-PEG 10K-DBCO为1∶5,并使其在4℃下反应约4小时。此时,使反应在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)和60%(v/v)异丙醇的混合溶剂中进行。
[0453] 使用氯化钠在Bis-Tris(pH 6.2)中的浓度梯度,将反应溶液加到Q Sepharose High Performance(GE Healthcare,USA)柱上进行纯化。结果,SDS-PAGE分析证实单PEG化的GLP-2衍生物-叠氮基-PEG被纯化(图16)。
[0454] 实施例14:生理活性多肽缀合物(2)的制备
[0455] 接着,将实施例13中纯化的单-PEG化的GLP-2类似物-叠氮基-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶4的摩尔比在2℃至8℃以最终浓度10mg/ml反应约12小时至18小时。此时,向反应溶液中加入10mM磷酸钾和20%(v/v)异丙醇(pH 6.0),20mM氰基硼氢化钠作为还原剂,并在该环境下进行反应。
[0456] 反应完成后,使用Tris中的氯化钠(pH 7.5)和异丙醇缓冲液的浓度梯度,将反应溶液施加到丁基琼脂糖凝胶4 Fast Flow(GE Healthcare,美国)柱上,从而纯化GLP-2类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。
[0457] 通过SDS-PAGE分析洗脱的GLP-2类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的纯度。
[0458] 图16显示了GLP-2类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的非还原SDS-PAGE纯度分析的结果。M:标记物;1:GLP-2类似物;2:单PEG化的GLP-2类似物;3:免疫球蛋白Fc;4:GLP-2类似物-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物,其通过将GLP-2类似物-叠氮基与免疫球蛋白Fc经由ALD-PEG 10K-DBCO接头连接而制备。
[0459] 参照图16,证实了当使用根据实施例1的接头化合物时,可以以高收率获得生理活性多肽缀合物,其两端均与生理活性多肽和免疫球蛋白Fc连接。
[0460] 实施例15:生理活性多肽连接(3)的制备
[0461] 通过将生理活性多肽连接至实施例10的PeAL-PEG 10K-BCN接头来制备生理活性多肽连接。
[0462] 详细地,生理活性多肽是胰高血糖素类似物,公开为WO 2017/003191 A1中的SEQ ID NO:37。胰高血糖素类似物的C-末端氨基酸被赖氨酸取代,向其引入叠氮基,从而制备引入叠氮基的胰高血糖素类似物,其被称为胰高血糖素类似物-叠氮化物。
[0463] 为了将实施例10的PeAL-PEG 10K-BCN(10kDa)聚乙二醇化为胰高血糖素类似物-叠氮化物,制备胰高血糖素类似物-叠氮化物的浓度为5mg/ml,使得胰高血糖素类似物-叠氮基与PeAL-PEG 10K-BCN的摩尔比为1∶5,并使其在4℃下反应约4小时。此时,使反应在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5),60%(v/v)异丙醇和20%(v/v)DMSO的混合溶剂中进行。
[0464] 使用氯化钠在柠檬酸钠(pH 3.0)和45%(v/v)乙醇中的浓度梯度,将反应溶液施加到SP Sepharose High Performance(GE Healthcare,USA)柱上进行纯化。结果,SDS-PAGE分析证实单PEG化的胰高血糖素类似物-叠氮基-PEG被纯化(图17)。
[0465] 实施例16:生理活性多肽缀合物(3)的制备
[0466] 接着,将实施例15中纯化的单PEG化胰高血糖素类似物-叠氮基-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶4的摩尔比以10mg/ml的终浓度在2℃至8℃下反应大约12个小时到18个小时。此时,向反应溶液中加入100mM磷酸钾和20%(v/v)异丙醇(pH 6.0),20mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3)作为还原剂,并在该环境下进行反应。
[0467] 反应完成后,使用氯化钠在Tris中的浓度梯度(pH 7.5)将反应溶液施加到Source15Q(GE Healthcare,USA)柱上,从而纯化胰高血糖素类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc共轭。
[0468] 通过SDS-PAGE分析洗脱的胰高血糖素类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的纯度。
[0469] 图17显示了胰高血糖素类似物-叠氮基-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的非还原SDS-PAGE纯度分析的结果。M:标记物;1:胰高血糖素类似物;2:单聚乙二醇化的胰高血糖素类似物;3:免疫球蛋白Fc;4:胰高血糖素类似物-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物,其通过将胰高血糖素类似物-叠氮化物与免疫球蛋白Fc经由PeAL-PEG 10K-BCN接头连接而制备。
[0470] 如图17所示,证实了当使用根据实施例10的接头化合物时,可以以高收率获得生理活性多肽缀合物,其两端均与生理活性多肽和免疫球蛋白Fc连接。
[0471] 已经参考示例性实施例示出并描述了本公开。本领域技术人员将理解,可以在不脱离本公开的基本特征的情况下进行各种修改。因此,应理解,本文描述的实施方案应仅在描述性意义上考虑,而不是出于限制的目的。本公开的范围由所附权利要求书而不是由前述描述限定,并且在其等效范围内的所有差异应被解释为包括在本公开中。
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