谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断
阅读：717发布：2020-05-11
专利汇可以提供谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通过利用存在于谷 氨 酰胺转移酶家族 蛋白质 上的主要 乳糜泻 抗原 表位的结合分析对谷蛋白引起的自身免疫性 疾病 的选择性诊断。，下面是谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断专利的具体信息内容。
1.参考蛋白质和至少一种测试蛋白质在制备用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的方法中的试剂盒的用途，
其中所述参考蛋白质属于谷氨酰胺转移酶家族并具有
a)Mab 885能与其结合的TG2蛋白质的分子表面部分，所述抗原表位包括结合时与被Mab 885覆盖的区域距离 内的表面区域，或
b)TG2蛋白质的分子表面的部分，患有乳糜泻的对象的乳糜泻自身抗体能以所述自身抗体在竞争分析中可被Mab 885置换的方式结合所述TG家族蛋白质，或
c)可为乳糜泻中自身抗原的TG2蛋白质的分子表面部分，基于多序列比对，所述TG2蛋白质至少部分地由与根据全长人TG2的氨基酸编号而编号的Glu153和/或Arg19对应/相当的氨基酸残基形成，或
d)TG2蛋白质的分子表面部分，其能结合表面识别分子，其中所述表面识别分子能结合a)至c)中定义的分子表面部分，所述TG2蛋白质的分子表面部分形成完整的主要乳糜泻抗原表位，
所述至少一种测试蛋白质属于谷氨酰胺转移酶家族，与其中主要乳糜泻抗原表位是完整的参考蛋白质相比，所述测试蛋白质中对所述主要乳糜泻抗原表位有贡献的至少一个表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，
其中所述主要乳糜泻抗原表位的至少一个表面氨基酸残基包括或选自
基于氨基酸序列比对与Glu153对应或相当的氨基酸残基，所述Glu153根据全长人TG2的氨基酸编号而编号，和/或
基于氨基酸序列比对与Arg19对应或相当的氨基酸残基，所述Arg19根据全长人TG2的氨基酸编号而编号，
并且其中核心结构域具有折叠的三维结构；
所述方法包括步骤：
i)提供从对象获取的生物学样品，所述样品含有所述对象的自身抗体，
ii)使所述样品的自身抗体接触
-所述参考蛋白质，
-所述至少一种测试蛋白质
iii)评价所述自身抗体与所述参考蛋白质和所述至少一种测试蛋白质的结合特性，其中，与参考蛋白质相比，如果自身抗体与测试蛋白质的结合受损，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。
2.权利要求1的用途，其中，在步骤i)中，从所述样品分离自身抗体。
3.权利要求1的用途，其中，在步骤iii)中，通过测量所述自身抗体与所述测试蛋白质和与所述参考蛋白质的结合水平评价所述结合，
其中，如果所述自身抗体与所述参考蛋白质的平均结合水平超过预定阈值，并且如果自身抗体与测试蛋白质的平均结合水平显著低于与参考蛋白质的结合水平，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。
4.权利要求3的用途，其中所述自身抗体与所述测试蛋白质的平均结合水平与所述参考蛋白质相比，降低至少30％。
5.权利要求1至4中任一项的用途，其中任一种所述测试蛋白质和参考蛋白质均为野生型蛋白质或者通过蛋白质工程从TG2制备，其中所述测试蛋白质是突变的TG2。
6.权利要求1至4任一项的用途，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，属于谷氨酰胺转移酶家族的测试蛋白质中，至少另外一个氨基酸的侧链和/或空间位置被改变。
7.权利要求6的用途，其中基于多序列比对，所述另外的氨基酸选自与根据全长人TG2的氨基酸编号而编号的Asp151、Glu153、Glu154、Arg19、Met659对应或相当的氨基酸残基。
8.属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质和测试化合物在制备用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断方法中的试剂盒的用途，
其中所述属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位，并且所述测试化合物是已知能够与权利要求1所定义的主要乳糜泻抗原表位结合的测试抗体或者其片段、变体；
所述方法包括步骤：
i)提供从对象获取的生物学样品，所述样品含有所述对象的自身抗体，并且任选地从所述样品中分离自身抗体，
ii)将所述样品的自身抗体接触所述属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质，和iii)评价所述自身抗体与所述TG家族蛋白质在不存在和存在所述测试化合物时的结合水平，
其中，所述属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质是TG2，
其中如果不存在所述测试化合物时自身抗体的平均结合水平超过预定阈值，并且如果存在测试化合物时自身抗体与参考蛋白质的平均结合水平显著低于当不存在所述测试抗体时的自身抗体的结合水平，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。
9.权利要求8的用途，其中存在测试化合物时，所述自身抗体与所述参考蛋白质的平均结合水平与不存在所述测试抗体时所述自身抗体的结合水平相比，降低至少50％。
10.属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质(TG家族蛋白质)和测试化合物在制备用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断方法中的试剂盒的用途，
其中所述TG家族蛋白质具有权利要求1所定义的完整的主要乳糜泻抗原表位并且所述测试化合物是已知能够与所述主要乳糜泻抗原表位结合的测试抗体或者其片段、变体，所述方法包括步骤：
i)提供从对象获取的生物学样品，
ii)将测试化合物和所述TG家族蛋白质接触，
iii)评价所述测试化合物与所述TG家族蛋白质在不存在和存在所述生物学样品时的结合水平，
其中，所述属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质是TG2，
其中如果存在所述样品时测试化合物与TG家族蛋白质的平均结合水平低于不存在所述样品时的结合水平，这个事实代表存在能够结合主要乳糜泻抗原表位的自身抗体，且代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。
11.权利要求9或10的用途，其中所述测试化合物为能够与相同抗原表位区结合的Mab 885或者其片段，且所述蛋白质为乳糜泻疾病中的自身抗原。
12.用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断试剂盒，其包括a)如权利要求1-7中任一项定义的属于谷氨酰胺转移酶家族的测试蛋白质，并且其中所述核心结构域具有折叠的三维结构，和
b)属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质，其是TG2。
13.权利要求12的试剂盒，其还包括，
c)从对象中取得或加工生物学样品的装置，所述样品含有所述对象的自身抗体，和/或
d)从所述样品中分离自身抗体的装置，和/或
e)评价所述自身抗体与所述蛋白质的结合水平和/或动力学的装置。
14.用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断试剂盒，其包括a)属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质，其是TG2，所述蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位，其中所述参考蛋白质的核心结构域具有折叠的三维结构，和/或带有用于提供和使用所述属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质的说明书的介质，和b)已知能够与所述属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质的主要乳糜泻抗原表位结合的测试化合物，所述主要乳糜泻抗原表位如权利要求1所定义。
15.权利要求14的试剂盒，其还包括，
c)从对象获取或加工生物学样品的装置，所述样品含有所述对象的自身抗体，和/或d)从所述样品中分离自身抗体的装置，和/或
e)评价所述测试化合物与参考蛋白质的结合水平和/或动力学的装置。
谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断
发明领域
背景技术
[0002] 乳糜泻(也称为乳糜泻病、非热带性口炎性腹泻或谷蛋白敏感性肠病)是一种疾病的环境诱因已知的独特的自身免疫性障碍。所述障碍出现在有人类白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8背景的具有遗传倾向的人中，其特征在于慢性肠道炎症、吸收不良以及由于摄入谷蛋白导致的自身抗体生成。除了肠病外，谷蛋白还能引起搔痒性和发疱性皮疹，在此情况下，所述疾病称为疱疹样皮炎。通过去除患者饮食中的谷蛋白可成功地治疗所述疾病，但对于持续的反应则应终生遵照所述治疗。
[0003] 摄取小麦、裸麦和大麦中的谷蛋白部分引起乳糜泻发病。麦醇溶蛋白是谷蛋白的醇溶性部分，并且含有显示对患者有毒的肽混合物。已鉴定了33聚体的α-麦醇溶蛋白衍生的肽为谷蛋白最具有免疫原性的部分，所述肽耐胃蛋白酶、胰蛋白酶和刷状缘膜蛋白酶消化，并且可以经过肠上皮以引起固有层中的免疫应答[Shan L et al，Science.2002；297：2275-9.]。上段小肠中的慢性炎症细胞浸润、绒毛萎缩和隐窝增生是所述疾病的典型特征，同时它也能导致肠外症状，例如贫血、神经性障碍或称为疱疹样皮炎的皮肤病。
[0004] 所述疾病最初出现在以小麦作为基本食物的西方人群中(欧洲、美国、澳大利亚)，但是最近也已出现在中东、南美洲、北非和亚洲。筛查发现，在1.0％的芬兰学龄儿童[Maki M et al.N Engl J Med.2003；348(25)：2517-24.]、0.75％的美国“无风险”群体[Fasano A et al，Arch Intern Med.2003；163(3)：286-92.]和1.4％的匈牙利六岁儿童[Korponay-Szabo IR et al，BMJ.2007；335(7632)：1244-7.]中发现所述疾病。
[0005] 所述疾病具有大范围的各种临床表现，例如腹泻、腹胀、贫血、体重减轻、生长缓慢、皮肤或神经症状，并且可在任何年龄诊断出该病。由于缺乏适当的吸收，可出现维生素和矿物质缺乏，例如维生素B12、维生素K、叶酸、铁和钙缺乏。许多患者也许仅有隐蔽症状，在这类情况下，经常延迟了适当的诊断。未治疗的乳糜泻具有严重并发症，如腺癌(具有与普通人群相比差不多两倍的风险)、T细胞淋巴瘤(具有大约五十倍风险)和骨质疏松。
[0006] 乳糜泻的当前诊断标准由欧洲儿科胃肠病学和营养学会建立，并且需要来自小肠上部的活检样品、特征为上皮内淋巴细胞增多的组织学检查(十二指肠活检)，也应该观察隐窝增生和绒毛萎缩以及对不含谷蛋白饮食的有利应答。如果显示患者血液中含有能结合沿着环绕平滑肌细胞的结缔组织片的正常组织切片的某些自身抗体(肌内膜抗体)或沿着网硬蛋白纤维结合正常组织切片的自身抗体(R1-网硬蛋白抗体结合模式)，也支持乳糜泻的诊断[Green PH，Cellier C，N Engl J Med.2007；357(17)：1731-43.]。
[0007] 所述疾病被严重漏诊，十个患者中仅有两个被临床上识别。其主要原因在于并不是全部患者都产生临床表现(无症状病)，有些患者甚至可长时间具有正常的粘膜形态[Maki M，Collin P，Lancet.1997；349(9067)：1755-9.]。然而，他们具有高密度上皮内淋巴细胞或具有阳性乳糜样肠抗体模式，对于网硬蛋白和肌内膜组织自身抗体通常为阳性。所述称为潜伏或潜在乳糜泻的疾病的亚群是诊断方面的挑战，并且这些患者在晚些年可能出现绒毛萎缩和隐窝增生，或者可能在其他器官中产生严重的(有时不可逆的)损伤(谷蛋白共济失调、心肌病、糖尿病、甲状腺机能减退)。难以对处于潜伏期的患者进行诊断，因为患者最初经常达不到常规诊断标准并且需要长期随访。抗体水平可随时间波动，并且目前还没有好的装置用来准确地预测在不久的将来哪些对象将会恶化[Simell S et al，Scand J Gastroenterol.2005；40(10)：1182-91.]。
[0008] 因此，基于小肠中确定的绒毛损伤的当前诊断标准有不足，需要改订(Kaukinen K et al，Dig Dis Sci.2001；46：879-87.)。另外，小肠活检是不愉快的侵入性诊断程序，用抗体阳性替代基于活检的诊断标准将具有一些实用的优点，也具有将患有早期疾病的对象计入和及时明确叙述治疗适应症的可能性。
[0009] 长期以来，已经公认需要更简单更可耐受的初步诊断工具。越来越多地使用血清学试验，所述血清学试验基于患者血液中抗麦醇溶蛋白、网硬蛋白、肌内膜和2型谷氨酰胺转移酶(TG2)的循环抗体的检测。所述血清学试验也可用于发现具有轻度症状或非典型临床表现的患者，并可用于筛选一级亲属或风险群体。主要风险群体包含患有糖尿病、唐氏综合征、选择性IgA缺陷和各种经常与乳糜泻共存的自身免疫性障碍(如自身免疫性甲状腺病、 综合征、红斑狼疮、自身免疫性肝病、脱发、肾小球疾病和心脏病)的患者[Green PH，Cellier C，N Engl J Med.2007；357(17)：1731-43.]。
[0010] 对于乳糜泻，抗麦醇溶蛋白抗体没有显示足够的灵敏度或特异性，尽管如此，基于与TG2具有结构相似性的脱酰胺基的麦醇溶蛋白肽的试验是相对有效的[Volta U et al，Dig Dis Sci.2008；53(6)：1582-8.；Korponay-Szabo IR et al，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46(3)：253-61.]。使用间接免疫荧光分析监测肌内膜IgA抗体可提供高准确度，因为所述抗体为所述疾病的高度特异性标志物。然而，肌内膜抗体试验的评价多半取决于观察者，需要高度熟练且训练有素的人员，因此不能广泛用于每个医疗机构中。选择性IgA缺陷是乳糜泻患者中的常见特征(40例中的1例)，使得很难通过常规肌内膜抗体试验识别患者。在这些情况下，应该检测IgG类抗TG2自身抗体[Korponay-Szabo I et al，Gut.2003；52(11)：1567-71]。此外，肌内膜试验不能鉴别所述疾病的显在形式和潜伏形式(Green PH，Cellier C，N Engl J Med.2007；357(17)：1731-43.)。因此，在本技术领域中需要可靠且更易使用的试验。
[0011] 人们已经发现TG2(也称为组织、红细胞或细胞谷氨酰胺转移酶)是主要的本身2+
自身抗原和用于乳糜泻中肌内膜和网硬蛋白抗体的靶标。所述酶为以Ca 依赖方式催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺基和赖氨酸残基的ε-氨基之间酰基转移反应(共价蛋白质交联)的谷氨酰胺转移酶超家族的成员(EC2.3.2.13)。TG2除了能催化胺类并入蛋白质中(位点特异性脱酰胺作用)之外，还具有异肽酶活性，并且通过其鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性参与跨膜信号传导。TG2可从细胞表面化，其与结合素类和纤连蛋白复合，促进胞外基质的重塑和装配，并且介导细胞—基质相互作用。这样，TG2参与伤口愈合和血管生成。所述酶可转移至细胞核，并且通过组蛋白类和视网膜母细胞瘤蛋白质的交联，也能调节基因表达。
细胞凋亡时诱导并激活TG2；而且，该酶的缺乏影响巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬[Fesus L，Piacentini M，Trends Biochem Sci.2002；27(10)：534-9.]。
自身抗原和用于乳糜泻中肌内膜和网硬蛋白抗体的靶标。所述酶为以Ca 依赖方式催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺基和赖氨酸残基的ε-氨基之间酰基转移反应(共价蛋白质交联)的谷氨酰胺转移酶超家族的成员(EC2.3.2.13)。TG2除了能催化胺类并入蛋白质中(位点特异性脱酰胺作用)之外，还具有异肽酶活性，并且通过其鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性参与跨膜信号传导。TG2可从细胞表面化，其与结合素类和纤连蛋白复合，促进胞外基质的重塑和装配，并且介导细胞—基质相互作用。这样，TG2参与伤口愈合和血管生成。所述酶可转移至细胞核，并且通过组蛋白类和视网膜母细胞瘤蛋白质的交联，也能调节基因表达。
细胞凋亡时诱导并激活TG2；而且，该酶的缺乏影响巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬[Fesus L，Piacentini M，Trends Biochem Sci.2002；27(10)：534-9.]。
[0012] TG2是普遍存在的酶，可发现于全身、细胞内和细胞外。在鉴定主要自身抗原TG2后，利用豚鼠肝TG2或重组人TG2作为抗原开发了若干酶联免疫分析(ELISA)[Schuppan D et al，1998；WO 98/03872.；Powell M et al，2002；WO 02/068616 A2.]。此外，富含由细胞系生成的TG2的胞外基质也可作为诊断试验中的抗原。在使用人TG2抗原的情况下，所述分析比肌内膜抗体试验更经济，并且其灵敏度和特异性高于90％。而且，描述了通过使用患者血液样品的红细胞中的天然本身TG2的高效快速的抗体检测(Maki M et al，2002；WO02/086509)。
[0013] 在一些患者中，特别是在患有疱疹样皮炎的患者中，还发现了抗同源皮肤谷氨酰胺转移酶蛋白质(TG3)的抗体，所述抗体也可用于诊断目的(Paulsson M.et al.，2001，WO01/001133)。
[0014] Hadjivassiliou等人(Hadjivassiliou et al，Ann Neurol.2008；64：332-43)提出，除了人白细胞抗原类型以及抗麦醇溶蛋白和抗谷氨酰胺转移酶2抗体的检测之外，抗谷氨酰胺转移酶6(TG6)抗体也可作为谷蛋白引起的自身免疫性疾病的标志物，以鉴别可能具有患神经学疾病的风险并具有谷蛋白敏感性的患者亚群。他们发现，不依赖于肠道参与，TG6 IgG和IgA应答在谷蛋白共济失调中很普遍。
[0015] 事实上，一些基于本技术领域的基于TG2的试验的研究描述了具有IgA肌内膜抗体阳性的假阴性IgA TG2结果和没有IgA肌内膜阳性的假阳性IgATG2结果[Wong RC et al，J Clin Pathol.2002；55(7)：488-94.]。假阳性TG2抗体阳性结果在临床环境中相对普遍[Lock RJ et al，Eur J Gastroenterol Hepatol.2004；16(5)：467-70.；Green PH，Cellier C，N Engl J Med.2007；357(17)：1731-43.]，并且这严格地限制了TG2抗体阳性作为唯一诊断试验的用途。特别地，患有其他自身免疫性疾病、肿瘤、心力衰竭、神经性障碍、银屑病和肝病的患者可表现出低的与TG2反应的抗体水平。这并不令人感到意外，因为这些组织含有相对高的TG2量，所述TG2可通过任何类型能诱导非特异性抗TG2自身抗体的组织损伤而释放，并且所述抗体阳性可能与乳糜泻无关。
[0016] 相反，响应于谷蛋白，很可能通过半抗原-载体机制诱导乳糜泻特异性抗体[Sollid LM et al，Gut.1997；41(6)：851-2.]，并且所述乳糜泻特异性抗体通过免疫荧光法识别与用于肌内膜抗体检测的肌肉组织切片底物中的纤连蛋白表面结合形式的TG2。然而，即使肌内膜抗体试验也不能区别乳糜泻患者的抗TG2抗体和小鼠中实验诱导的其他TG2抗体[Korponay-Szabo IR et al，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46(3)：
253-61.]。此外，为尝试提出更多的乳糜泻特异性诊断试验，与麦醇溶蛋白肽复合的TG2也作为抗原，但是得到甚至比只用TG2的可靠性更低的结果[Rajadhyaksha M et al，WO
01/29090 A1]。因此，差异性地识别靶标乳糜泻和其他TG2抗原表位的抗体的验证免疫分析对于将来简化所述诊断过程可能是极其重要的。
253-61.]。此外，为尝试提出更多的乳糜泻特异性诊断试验，与麦醇溶蛋白肽复合的TG2也作为抗原，但是得到甚至比只用TG2的可靠性更低的结果[Rajadhyaksha M et al，WO
01/29090 A1]。因此，差异性地识别靶标乳糜泻和其他TG2抗原表位的抗体的验证免疫分析对于将来简化所述诊断过程可能是极其重要的。
[0017] 因此，还需要开发可靠且相对方便的诊断方法，所述方法对于谷蛋白引起的自身免疫性疾病或者优选乳糜泻是特异的。特别地，本技术领域中还需要开发可鉴别疾病的潜伏态和/或适用于儿童或在症状不提供明确答案的情况下适用的诊断分析。而且，从成本和患者舒适性方面来看，基于空肠活检的替代诊断也是理想的。
[0018] 事实上，在本技术领域中，已作了一些努力以鉴别所述乳糜泻自身抗体的主要结合抗原表位。然而，到目前为止还没有发现这种独特的抗原表位，也不清楚是否仅存在一个或若干个这种抗原表位。应用TG2片段的以前研究[Seissler J et al，Clin Exp Immunol.2001；125(2)：216-21.；Sblattero D et al，Eur J Biochem.2002；269(21)：5175-81.；Nakachi K et al，J Autoimmun.2004；22(1)：53-63.]表明C末端结构域可能包含重要的结合位点。然而，一些患者样品也识别N末端或核心结构域，从而断定抗体应答可根据对象而分散和变化。此外，已经注意到年轻女性乳糜泻患者和具有其他临床表现的患者之间的区别[Tiberti C et al，Clin Immunol.2003；109(3)：318-24.]。在另一项研究[Byrne G et al，Gut.2007；56(3)：336-41.]中，提出了催化三联体作为主要结合位点，因为这三个氨基酸的突变导致患者抗体与其弱结合的蛋白质。同样在所述研究中，IgA和IgG类乳糜泻抗体(celiac antibody)的特异性似乎不同。然而，这些研究没有考虑可能被基因全缺失，尤其是影响核心结构域或催化三联体的基因全缺失严重打乱的蛋白质的三维结构。由于也不能通过这些方式鉴别源于乳糜泻患者的单克隆抗体的抗原表位，所以通过在噬菌体表面上展示的TG2片段进行的进一步研究也表明，蛋白质构象可能对于形成用于乳糜泻抗体的功能性结合位点很重要[Di Niro R et al，Biochem J.2005；388(3)：
889-94.]。
889-94.]。
[0019] TG2不仅是乳糜泻中主要的自身抗原，因而是诊断中重要的靶分子，而且也与疾病的发病机制有关。
[0020] 与健康供体相比，在乳糜泻患者的十二指肠活检中检测了增强的TG2表达和活性，并且发现麦醇溶蛋白肽是TG2的良好底物。根据目前的假说，麦醇溶蛋白-TG2复合物可与TG2特异的B细胞结合，其中麦醇溶蛋白和TG2片段都呈递于DQ2上。所述呈递的麦醇溶蛋白-DQ2复合物可激活麦醇溶蛋白特异的T细胞，从而可为TG2特异的B细胞提供帮助，以通过半抗原-载体机制生成抗TG2抗体[Sollid LM et al，Gut.1997；41(6)：851-2.]。通常，乳糜泻被视为主要由T细胞介导的障碍，讨论了在该障碍中乳糜泻抗体的作用。
[0021] 有意思的是，乳糜泻抗体不会阻碍TG2的交联活性[Dieterich W et al，Gut.2003；52(11)：1562-6.；Roth EB et al，Clin Exp Rheumatol.2006；24(1)：12-8.]，相反，它们甚至可以通过稳定该酶的构象而增强转酰胺基作用和脱酰胺基作用过程[Kiraly R et al，J Autoimmun.2006；26(4)：278-87.]。这样，TG2将处理更多的麦醇溶蛋白，这能增强以越来越多的抗体生成为结果的并进一步驱动病程的免疫应答。本技术领域中关于该抗原表位是构象的并且涉及多个结构域的提议明显地与这一发现相矛盾。
[0022] 几条新证据暗示抗TG2的自身抗体在该病发展中也没有致病性作用。这些抗体的存在是所有患者的一致特征，并且如果在循环中不可检测，可以发现这些抗体沉积于各种组织中。组织损伤与抗体的体内结合有关，并且在不存在血清样品中抗体阳性时，发现与胞外TG2结合的抗体也原位存在于患病器官中，如小肠、肝脏、肌肉、肾、脑等[Korponay-Szabo IR et al，Gut.2004；53(5)：641-8.]。由于这些抗体可与外部加入的重组TG2结合，故而它们是有功能的，并且在绒毛萎缩发展前已经出现在组织中[Salmi TT et al，Gut.2006；55(12)：1746-53.；Salmi TT et al，Aliment Pharmacol Ther.2006；24(3)：541-52.]。
[0023] 另外，显示乳糜泻抗体扰乱细胞模型中上皮细胞分化和血管生成[Myrsky E et al，Clin Exp Immunol.2008；152(1)：111-9.]，以及诱导的通过线粒体通路的细胞凋亡[Cervio E et al，Gastroenterology.2007；133(1)：195-206.]。用TG2同系物肽纯化的抗体增加上皮细胞渗透性和诱导单核细胞活化[Zanoni G et al，PLoS Med.2006；3(9)：e358.]。
[0024] 本发明人意外地发现，主要乳糜泻抗原表位可位于在谷蛋白引起的自身免疫性疾病中作为自身抗原的谷氨酰胺转移酶上。
[0025] 令人惊讶的是，可以基于具有折叠的β夹层和核心结构域的工程谷氨酰胺转移酶，使用乳糜泻自身抗体的结合模式提供改良的诊断方法，从而去除假阳性结果。此外，也可以使用与所述主要乳糜泻抗原表位特异性结合并能取代乳糜泻患者自身抗体或被乳糜泻患者自身抗体取代的化合物，以提供进一步改良的诊断方法。
[0026] 发明概述
[0027] 根据第一个方面，本发明涉及用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断方法，其包括步骤：
[0028] i)获取来自于对象的生物学样品或者提供从对象获取的生物学样品，所述样品含有所述对象的自身抗体，并且视需要从所述样品中分离自身抗体，
[0029] ii)将所述样品的自身抗体接触
[0030] -属于谷氨酰胺转移酶家族(TG家族蛋白质)并具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质，
[0031] -属于谷氨酰胺转移酶家族的至少一种测试蛋白质，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，所述测试蛋白质中对所述主要乳糜泻抗原表位有贡献的至少一个表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，从而在所述测试蛋白质中，已知能与所述主要乳糜泻抗原表位结合的抗体的结合水平受损，
[0032] 其中，所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自[0033] 所述核心结构域的第一个α-螺旋的一个或多个表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或
[0034] 所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的一个或多个表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的一个或多个表面氨基酸残基，优选选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和所述HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸，
[0035] 并且其中，所述核心结构域具有折叠的三维结构，优选天然折叠的三维结构，并且所述β夹层结构域具有折叠的三维结构，优选天然折叠的三维结构，优选地，所述结构域的折叠基本上是完整的或被维持的，
[0036] iii)评价所述自身抗体与所述参考蛋白质和所述至少一种测试蛋白质的结合特性，
[0037] 其中，与参考蛋白质相比，如果自身抗体与测试蛋白质的结合受损，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。
[0038] 优选地，当侧链改变时，侧链几何构型、侧链大小、侧链官能团或其电荷改变了。
[0039] 优选地，通过评价结合水平或评价结合动力学速率或参数，例如缔合和/或解离的动力学速率或参数，从而评价结合特性。
[0040] 在所述诊断方法的步骤iii)的优选实施方案中，通过测量自身抗体与测试蛋白质和参考蛋白质的结合水平以评价所述结合，其中，如果自身抗体与参考蛋白质的结合水平超过预定阈值，并且如果自身抗体与测试蛋白质的结合水平显著低于自身抗体与参考蛋白质的结合水平或者优选地，与参考蛋白质相比，自身抗体与测试蛋白质的结合水平降低至少预定的比例，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，这个事实视为代表所述对象具有谷蛋白引起的自身免疫性疾病。
[0041] 设定预定阈值(或截断值)是常规优化过程，并且属于精通设定分析条件的技术的人员的技能。如本领域公知的，例如可通过用已知的乳糜泻和非乳糜泻样品完成的接受者操作特征曲线(ROC)建立用于说明结合分子如与TG家族蛋白质(如参考TG家族蛋白质)反应的抗体的合适截断值。
[0042] 在实施方案中，所述预定阈值设定为最大参考值(如100％结合水平)的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
[0043] 优选地，所述β夹层结构域的第一个α-螺旋从一个氨基酸残基跨到所述β夹层结构域的HisHisThr基序的第一个His，在N末端方向上所述氨基酸残基与所述β夹层结构域的HisHisThr基序的所述第一个His距离八个氨基酸。
[0044] 优选地，所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后五个氨基酸从所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的保守Asn跨到所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的第一个His，并且优选地，相应地计算所述螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基。
[0045] 因此，优选地，所述螺旋的第六个氨基酸残基是从所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序开始的氨基末端方向上第二个氨基酸，或者从所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的保守Asn开始的羧基末端方向上第二个氨基酸。
[0046] 优选地，所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的第六个氨基酸是人TG2中Arg19或者具有折叠的β夹层结构域和折叠的核心结构域的谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质序列中相应氨基酸；并且所述HisHisThr基序的第一个His是人TG2中His 22或者具有折叠的β夹层结构域和折叠的核心结构域的谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质序列中相应氨基酸。
[0047] 优选地，所述核心结构域的第一个α-螺旋
[0048] -从由所述核心结构域的第一个α-螺旋的保守GluTyrXxx基序(其中Xxx是非极性氨基酸残基，优选Val或Ile或Leu)开始的氨基末端方向上第五个氨基酸，或者[0049] -从由人谷氨酰胺转移酶的核心结构域的第一个α-螺旋的保守Arg开始的氨基末端方向上第三个氨基酸
[0050] -至少跨到所述GluTyrXxx基序的Glu或Tyr。
[0051] 这样，相应地计算所述核心结构域的第一个α-螺旋的第一个或前两个、三个或四个氨基酸残基。
[0052] 更优选地，所述α-螺旋的第一个氨基酸残基是从所述核心结构域的第一个α-螺旋的保守GluTyrXxx基序开始的氨基末端方向上第五个氨基酸，或从多数人谷氨酰胺转移酶的核心结构域的第一个α-螺旋的保守Arg开始的氨基末端方向上第三个氨基酸。
[0053] 在优选实施方案中，彼此相对地改变a)和b)的表面氨基酸残基的空间位置或侧链几何构型：
[0054] a)所述核心结构域的第一个α-螺旋的至少一个表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和
[0055] b)所述β夹层结构域的第一个α-螺旋和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的至少一个表面氨基酸残基，优选选自最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和HisHisThr基序的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基。
[0056] 在另一实施方案中，在谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的一部分中进行突变，所述突变引起氨基酸中任一氨基酸的错位或空间位置改变，所述氨基酸在本申请中定义为对主要乳糜泻抗原表位或携带所述蛋白质的SSE有贡献的氨基酸。在某些实施方案中，α-螺旋的较大部分错位，如所述α-螺旋断裂或倾斜。
[0057] 优选地，在本发明的诊断方法中，
[0058] 基于氨基酸序列比对，所述核心结构域的第一个α-螺旋的第一个氨基酸残基是与Glu153对应或相当的氨基酸残基，所述Glu153根据全长人TG2的氨基酸编号而编号，和/或
[0059] 基于氨基酸序列比对，所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的第六个氨基酸残基是与Arg19对应或相当的氨基酸残基，所述Arg19根据全长人TG2的氨基酸编号而编号，和/或
[0060] 基于氨基酸序列比对，所述β夹层结构域第一个α-螺旋的HisHisThr基序的第一个氨基酸是与His22对应或相当的氨基酸残基，所述His22根据全长人TG2的氨基酸编号而编号。
[0061] 在根据本发明的诊断方法的优选实施方案中，在所述TG家族测试蛋白质中，至少一个另外氨基酸的侧链或空间位置被改变，例如与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，一个或多个另外氨基酸产生突变，
[0062] 其中优选地，基于多序列比对，所述另外氨基酸选自与根据全长人TG2的氨基酸编号而编号的Arg151、Glu153、Glu154、Arg156、Arg19、His22、Val431、Arg433、Glu435、Met659和Leu661对应或相当的氨基酸残基，并且其中优选地，所述改变影响乳糜泻抗体结合。
[0063] 在另一优选实施方案中，与参考蛋白质相比，由于一个或多个另外氨基酸的改变，故而改变了以下氨基酸残基中任一个的空间位置：
[0064] 选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或
[0065] 选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和所述HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸。
[0066] 在所述实施方案的优选变体中，所述另外的改变是与参考蛋白质相比的一个或多个氨基酸残基突变，基于多序列比对，所述氨基酸残基选自与全长人TG2的下列氨基酸对应或相当的氨基酸残基：Glu158、Tyr160、Val161、His23、Thr24，或者所述另外的改变是所述β夹层结构域的N末端部分改变，例如从所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的第六个氨基酸算起，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个氨基酸残基的缺失或替换。
[0067] 优选地，测试蛋白质为突变TG2，并且所述一个或多个氨基酸的改变为选自以下组的突变：
[0068] Glu153(如E153S、E153T、E153Y、E153K、E153R、E153Q、E153N)、
[0069] Arg19(如R19S、R19K、R19Q)、
[0070] Glu154(如E154S、E154T、E154Y、E154K、E154R、E154Q、E154N)、
[0071] Glu158(如E158S、E158Q、E158L)、
[0072] His22(如H22S)
[0073] 的突变，
[0074] 并且对于另外的突变：
[0075] Ala24、Arg151、Arg156、Val431、Val432、Arg433、Glu435、Met659、Leu661。
[0076] 技术人员将了解，如果侧链的突变或改变的作用小，例如，如果作出保守性置换，就可以方便地突变多于一个的氨基酸残基。
[0077] 在本发明的另一实施方案中，在与测试蛋白质和(如需要)参考蛋白质接触前分离自身抗体或一组自身抗体。
[0079] a)属于谷氨酰胺转移酶家族的测试蛋白质，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，所述测试蛋白质中对所述主要乳糜泻抗原表位有贡献的至少一个表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，
[0080] 其中所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自[0081] 所述核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个表面氨基酸残基，和/或
[0082] 所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的表面氨基酸残基，优选选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和所述HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸，[0083] 并且其中所述核心结构域为折叠的三维结构，优选天然折叠的三维结构，和[0084] b)属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质，所述蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位，或至少一个带有用于提供和使用所述属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质的说明书的介质；
[0085] 并且任选地
[0086] 从对象中取得生物学样品的装置，所述样品含有所述对象的自身抗体，和/或从所述样品中分离自身抗体的装置，和/或
[0087] 评价所述自身抗体与蛋白质的结合水平和/或动力学的装置。
[0088] 在本发明的诊断试剂盒中，可以应用如本申请定义的任何测试蛋白质和/或参考蛋白质。
[0089] 在优选实施方案中
[0090] a)所述测试蛋白质是突变谷氨酰胺转移酶(TG)，优选突变TG2、TG3或TG6，和[0091] b)所述参考蛋白质是野生型TG，优选野生型TG2、TG3或TG6。
[0092] 在优选实施方案中，评价结合水平的装置包括板如具有孔的微量滴定板，其中第一部分的孔包被有参考蛋白质，第二部分的孔包被有至少一种测试蛋白质。
[0093] 在实施方案中，所述板的孔也包被有纤连蛋白。
[0094] 另一方面，本发明涉及用于诊断谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断方法，其包括如下步骤：
[0095] i)获取生物学样品或者提供从对象获取的生物学样品，所述样品含有所述对象的自身抗体，并且视需要从所述样品中分离自身抗体，
[0096] ii)将所述样品的自身抗体与属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质接触，所述蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位，和
[0097] iii)在缺乏和存在测试化合物时评价所述TG家族蛋白质的自身抗体的结合水平，已知所述测试化合物能与所述主要乳糜泻抗原表位结合，
[0098] 其中，如果在缺乏所述测试化合物时自身抗体的结合水平超过预定阈值，并且与在缺乏所述测试抗体时自身抗体的结合水平相比，如果在存在所述测试化合物时自身抗体与参考蛋白质的结合水平显著地降低，这个事实视为指示所述对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病。优选地，对应于剩余结合分别不高于60％，优选不高于50％，更优选分别不高于40％、30％或20％的结合水平，在存在所述测试化合物时所述自身抗体与参考蛋白质的结合水平至少降低了预定比例，优选至少40％，优选至少50％，更优选至少60％、70％或80％。
[0099] 因此，所述测试化合物应为能与主要乳糜泻抗原表位结合的亲和性或亲合力足够高、从而至少部分地替换患者乳糜泻抗体或反之亦然的化合物。所述测试化合物将与主要乳糜泻抗原表位结合，其具有足够高的结合亲和性或亲合力以与患者自身抗体竞争，优选具有比患者抗体的结合亲和性或亲合力更高的结合亲和性或亲合力。技术人员将了解，即使所述测试化合物的结合亲和性或亲合力比得上或低于患者自身抗体的结合亲和性或亲合力，也可以通过使用较高浓度的测试化合物实现足够的替换程度。
[0100] 在一替换实施方案中检测了用乳糜泻患者抗体置换所述测试化合物。
[0101] 设置浓度以实现用测试化合物适当地替换自身抗体属于本领域的技术人员的技能。
[0102] 优选的测试化合物为对主要乳糜泻抗原表位高度特异的抗体或抗体片段。特别优选的测试化合物为制备以抗所述抗原表位的单克隆抗体。优选实例为Phadia的Mab885，其根据布达佩斯条约由Phadia AB(P.O.Box 646075137 UPPSALA，瑞典，访问地址：Rapsgatan 7P 754 50 Uppsala)于2010年3月25日保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Miroorganismen un Zellkulturen GmbH，DSMZ，德国不伦瑞克，Inhoffenstr.7B，D-38124)，其保藏号_______在适当的国际表格中指明。
[0103] 优选实施方案中，所述测试化合物为已知能与属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的主要乳糜泻抗原表位结合的测试抗体或其片段、变体、衍生物或类似物，所述蛋白质为乳糜泻中自身抗原，优选TG2、TG3或TG6，更优选TG2或TG6，非常优选TG2。
[0104] 优选实施方案中，所述测试化合物为Mab885的片段、变体、衍生物或类似物，所述Mab885包含具有Mab885可变区的氨基酸序列或者与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列相似性的氨基酸序列的结合区，所述片段、变体、衍生物或类似物能与属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的主要乳糜泻抗原表位结合。
[0105] 有利地，从所述对象中获得的生物学样品为天然的或加工状态的组织或身体部分的样品，其中可以存在乳糜泻自身抗体。本发明的优选实施方案中，从所述对象中获得的生物学样品为体液样品，如唾液、十二指肠液、粪便或血液样品，或其加工样品，如血清样品或含有适当抑制剂的样品。
[0106] 另外实施方案中，所述生物学样品为储存有乳糜泻自身抗体的固体组织样品，例如，优选地，从小肠、空肠、胎盘或肝脏中获取的样品[Korponay-Szabo，I.R.et al.Gut 53，641-648(2004)]。所述样品可从已报道存在抗TG3抗体的皮肤中获得。
[0107] 使用体液样品的优点是患者自身抗体以直接可应用的形式存在于样品中，并且其分离不是必需的。优选地，至少通过从如[Salmi TT et al，Gut.2006；55(12)：1746-53.]中描述的从样品中部分分离或洗脱自身抗体，以获得来自固体组织样品的患者自身抗体。
[0108] 本发明也提供了如本申请公开的测试化合物在乳糜泻诊断或以置换分析法诊断乳糜泻的方法中的用途，所述化合物与主要乳糜泻抗原表位特异性结合。
[0109] 在本发明的用途中，本发明的患者自身抗体和测试化合物均与主要乳糜泻抗原表位结合，从而竞争结合位点。可以设定分析条件，从而以乳糜泻患者自身抗体替换测试化合物，或者替代性地以测试化合物替换乳糜泻患者自身抗体。根据本发明的另一个方面，提供了另一个用于诊断对象中谷蛋白引起的自身免疫性疾病的诊断试剂盒，所述试剂盒包括[0110] a)已知能与属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的主要乳糜泻抗原表位结合的测试化合物，所述蛋白质为乳糜泻中自身抗原；
[0111] b)带有用于提供和使用所述属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质的说明书的介质，所述蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位；
[0112] 和任选地一个或多个以下物质或工具：
[0113] c)属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质，所述蛋白质具有完整的主要乳糜泻抗原表位，和
[0114] c)从对象获取生物学样品的装置，所述样品含有所述对象的自身抗体，和/或从所述样品中分离自身抗体的装置，和/或
[0115] d)评价所述自身抗体与所述蛋白质的结合水平和/或动力学的装置。
[0116] 优选地，所述测试化合物为已知能与属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的主要乳糜泻抗原表位结合的测试抗体或其片段、变体或类似物，所述蛋白质为乳糜泻中自身抗原。更优选地，所述测试抗体是具有患者衍生抗体的典型结合位点和/或识别模式的乳糜泻患者衍生的抗体或其片段、变体或类似物。
[0117] 优选地，所述测试抗体为具有相同结合特性的结合位点的单克隆抗体或其片段、变体或类似物。在非常优选实施方案中，所述单克隆抗体为能与所述核心结构域的第一个α-螺旋的前一个至四个氨基酸的表面部分结合的抗体。优选地，所述抗体为Mab 885单克隆抗体。
[0118] 另一方面，本发明涉及测试蛋白质在诊断谷蛋白引起的自身免疫性疾病的方法中的用途。
[0119] 所述测试蛋白质属于谷氨酰胺转移酶家族，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，所述测试蛋白质中至少一个对主要乳糜泻抗原表位有贡献的表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，
[0120] 其中所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自[0121] 所述核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或
[0122] 所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述
[0123] β夹层结构域的保守HisHisThr基序的表面氨基酸残基，优选选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和所述HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸，
[0124] 并且其中所述核心结构域具有折叠的三维结构，优选天然折叠的三维结构。
[0125] 优选地，在本发明的用途中，所述测试蛋白质和所述参考蛋白质分别为如本申请定义的任何测试蛋白质和参考蛋白质。
[0126] 优选地，在本发明的用途中，诊断乳糜泻的方法为如本申请描述的任何诊断方法。
[0127] 例如，在根据本发明的用途、诊断方法或试剂盒中，
[0128] 所述测试蛋白质为属于谷氨酰胺转移酶家族的野生型蛋白质且为乳糜泻中自身抗原的突变体，并且
[0129] 所述参考蛋白质为属于谷氨酰胺转移酶家族的野生型蛋白质，其为乳糜泻中自身抗原。
[0130] 优选地，所述参考蛋白质为包括野生型氨基末端β夹层和核心结构域的TG2、TG3或TG6，所述测试蛋白质为包括突变β夹层和核心结构域的TG2、TG3或TG6。
[0131] 另一方面，本发明涉及用于制备属于谷氨酰胺转移酶家族的测试蛋白质的制备方法，所述测试蛋白质可用于诊断对象中乳糜泻的诊断方法，其包括以下步骤：
[0132] i)选择乳糜泻抗原表位完整且属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质，
[0133] ii)设计所述蛋白质的突变变体，其中，与具有完整的主要乳糜泻抗原表位的参考蛋白质相比，至少一个对主要乳糜泻抗原表位有贡献的表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，
[0134] 其中所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自[0135] 所述核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或
[0136] 所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的表面氨基酸残基，优选选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和所述HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸，[0137] 并且其中所述核心结构域为折叠的三维结构，优选天然折叠的三维结构，[0138] iii)制备编码包括所述突变的突变氨基酸序列的突变重组核酸，
[0139] iv)在宿主中表达所述突变重组核酸，
[0140] v)从所述宿主中获得所述突变蛋白质以提供测试蛋白质，与对应的野生型参考蛋白质相比，所述测试蛋白质与乳糜泻抗体接触时显示的结合水平降低(结合水平优选至少降低了30％，更优选至少降低了40％，更优选至少降低了50％)。
[0141] 在另一实施方案中，本发明涉及用于制备属于谷氨酰胺转移酶家族的参考蛋白质的制备方法，所述参考蛋白质可用于诊断对象中乳糜泻的诊断方法，其包括以下步骤：
[0142] i)选择属于谷氨酰胺转移酶家族的测试蛋白质，其中乳糜泻抗原表位受损、有缺陷或不存在，
[0143] ii)设计所述测试蛋白质的突变变体，其中与所述测试蛋白质(其中主要乳糜泻抗原表位受损)相比，至少一个对主要乳糜泻抗原表位有贡献的表面氨基酸残基的侧链和/或空间位置被改变，以获得主要乳糜泻抗原表位为完整的参考蛋白质，
[0144] 其中所述主要乳糜泻抗原表位的所述至少一个表面氨基酸残基包括或选自[0145] 所述核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或
[0146] 所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的表面氨基酸残基，优选选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和所述HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸，[0147] 并且其中所述核心结构域为折叠的三维结构，优选天然折叠的三维结构，[0148] iii)制备编码包括所述突变的突变氨基酸序列的突变重组核酸，
[0149] iv)在宿主中表达所述突变重组核酸，
[0150] v)从所述宿主中获得所述突变蛋白质以提供参考蛋白质，所述参考蛋白质与乳糜泻抗体接触时，与对应的野生型参考蛋白质相比显示的结合水平提高(结合水平优选至少提高了30％，更优选至少提高了40％，更优选至少提高了50％或60％)。
[0151] 定义
[0152] 蛋白质或结构域结构的折叠在本申请中理解为其二级结构元件(包括主要结构元件，例如螺旋如α-螺旋和延伸结构例如β结构如β股、平行和反平行β片、β桶，和次要结构元件，例如各种转角如β或γ转角、环等)相互之间的空间(三维)排列。
[0153] 二级结构元件(SSE)为具有确定构象的蛋白质的给定部分或片段的二级结构单元。可以用各种方法(参见下面)评价、预测或计算SSE。例如，根据实施方案，使用两种或任选地三种类型SSE：α-螺旋、延伸结构以及任选地卷曲或无规结构(参见下面)。
[0154] 如果两个蛋白质或两个蛋白质结构域中一个蛋白质或蛋白质结构域的主要SSE的至少大半部分，优选至少60％、70％、80％或至少90％或每个可与其他的主要SSE对应，所述两个蛋白质或两个蛋白质结构域的折叠在本申请中理解为类似的或相似的。在其折叠至少为80％，优选至少为90％相同的情形下，所述折叠称为基本上相同的。此情形为，例如如果对于在和给定的另外元件连接或相邻的第一个蛋白质或结构域中的给定二级结构元件，可在和与第一个蛋白质或结构域中给定的另外元件相同类型的元件连接或相邻的第二个蛋白质或结构域中找到相同类型的对应元件。通过氨基酸或SSE的数目计算对应SSE的比例。
[0155] 如果达到以下标准的任一标准，就可基本上完整地保持或者维持蛋白质的折叠：
[0156] i)维持至少主要SSE(螺旋，例如α-螺旋，和延伸结构，如β结构比如β片和β桶)的空间排列和/或如果折叠保持为类似的或相似的或基本上相同的，
[0157] ii)主要结构元件的比例最多改变40％或30％，优选最多25％或20％，更优选最多15％、10％或5％，而无规结构的比例最多改变40％或30％，优选最多25％或20％，更优选最多15％、10％或5％，
[0158] iii)蛋白质的任何活性保持为可检测的，
[0159] iv)蛋白质的任何复合型或构象(非连续的)抗原表位在免疫学上保持为可检测的。
[0160] 应当理解，任何用于研究所述标准的技术方法均可应用于本发明。技术人员将了解所有这些方法都具有其局限性，因此将有必要考虑所述局限性而诠释以上定义。
[0161] 如果其折叠与野生型蛋白质是相似的或类似的或基本上相同的，包括其任何突变体、变体或类似物的蛋白质或蛋白质结构域具有天然折叠。蛋白质或结构域的谷氨酰胺转移酶折叠在本申请中理解为与TG家族蛋白质或其各自结构域(如结构域I、II、III或IV)的折叠类似的或相似的或基本上相同的折叠，优选地，其中所述TG家族蛋白质可以是乳糜泻中自身抗原，并且优选地，其中所述TG家族蛋白质是真核蛋白质、动物蛋白质、脊椎动物蛋白质或哺乳动物蛋白质。
[0162] 蛋白质或结构域的折叠的三维结构在本申请中理解为以下结构，其中空间(三维)定义的结构元件，例如SSE(包括主要结构元件，例如螺旋如α-螺旋和延伸结构或β结构)排列成在给定条件下为所述蛋白质或结构域提供一定程度的热力学稳定性的空间上确定(不过仍具有柔性)的三级结构。选择性地，折叠的蛋白质或结构域具有确定的或可定义的折叠。非折叠的蛋白质或结构域或熔球态视为没有折叠。
[0163] 如果具有天然折叠，蛋白质或结构域的折叠的三维结构就是天然的。
[0164] 优选实施方案中，在折叠的或天然折叠的三维结构中，基本上完整地保持或维持蛋白质或结构域的折叠。对于技术人员立即显而易见的是，可以通过若干结构分析方法以实验显示。可以使用这些方法的任一方法表征所述蛋白质或结构域的折叠本质，但是在此情况下折叠本质的定义被应用的方法限制或约束。
[0165] 对于技术人员也是显而易见的是，如果蛋白质保持活性，所述蛋白质必须是基本上或至少部分折叠的(本申请中将视为折叠的)。而且，如果存在复合型或构象(非连续的)抗原表位，所述蛋白质或结构域也将视为折叠的，并且可用适当的抗体检测这个事实。
[0166] 给定蛋白质或蛋白质结构域的突变体是，与给定蛋白质或蛋白质结构域的序列相比，通过基因工程或随机诱变方法缺失、替换或插入其序列中的一个或多个氨基酸残基的蛋白质或蛋白质结构域。
[0167] 给定蛋白质或蛋白质结构域的变体为，与给定蛋白质或蛋白质结构域的序列相比，其序列有一个或多个氨基酸残基不同的蛋白质或蛋白质结构域，其中所述变体可以包括缺失、替换或插入。
[0168] 给定蛋白质或蛋白质结构域的类似物或者类似蛋白质或结构域至少具有30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列相似性，并且其折叠是类似的或相似的。优选地，给定蛋白质家族的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％保守区在蛋白质或结构域及其类似物中相同。
[0169] 突变体、变体或类似物优选具有与给定蛋白质或蛋白质结构域类似的或基本上相同的折叠，更优选所述突变体、变体或类似物各自独立地和所述给定蛋白质或蛋白质结构域之间的氨基酸序列相似性至少为40％，优选至少为50％、至少为60％或者更优选至少为70％、至少为80％或者至少为90％或95％。在优选实施方案中的突变体或变体情形下，所述突变体或变体与给定的不同。
[0170] 改变给定蛋白质中(即氨基酸序列或三维结构中)氨基酸残基的侧链可包括：通过诱变(包括定点诱变和随机诱变)或者通过化学衍生作用改变侧链几何构型、侧链大小、侧链官能团或侧链电荷。
[0171] 可通过任何用于分子几何构型计算的适当方法或模型表征存在于多肽或蛋白质分子中的氨基酸的侧链几何构型。例如，侧链几何构型可理解为如侧链三维表面的形状(包括分子体积)，如范德瓦尔斯表面，或者一组具有或没有氢原子并用于形成彼此之间的侧链等的原子的原子核空间排列。可通过本领域技术人员已知的任何合适的数学方法计算侧链几何构型。
[0172] 存在于多肽或蛋白质分子中的氨基酸的侧链大小与任何涉及或表征所述侧链的2
大小的几何度量有关，如所述氨基酸侧链的长度(如以pm或 表达)、表面积(如以pm或
3
表达)或分子体积(如以pm或 表达)。
大小的几何度量有关，如所述氨基酸侧链的长度(如以pm或 表达)、表面积(如以pm或
3
表达)或分子体积(如以pm或 表达)。
[0173] 侧链官能团在本申请中理解为存在于在多肽或蛋白质分子中存在的氨基酸的侧链中的化学官能团。
[0174] 多肽或蛋白质分子中(即三维蛋白质结构如谷氨酰胺转移酶中)氨基酸残基的空间位置在本申请中理解为蛋白质三维结构中一组或全部原子位置，或者理解为由给定蛋白质三维结构采用的、确定的或符合给定蛋白质三维结构的坐标系中一组或全部原子坐标或位置坐标。因此，改变氨基酸残基的空间位置将被理解为改变蛋白质结构或使蛋白质结构产生突变，从而在给定条件下，以比由蛋白质柔性和构象运动引起的位置或坐标更高的程度改变这些位置或坐标。例如，氨基酸空间位置的改变可由所述氨基酸附近或邻近中引起侧链位置或构象变化的突变引起，或者由也影响α碳原子或与所述氨基酸相关的肽骨架的位置的突变引起。
[0175] 特别地，在属于谷氨酰胺转移酶家族并具有折叠的β夹层结构域和折叠的核心结构域的蛋白质中，所述核心结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基和所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的表面氨基酸残基的空间位置变化可用氨基酸组之间距离(即其彼此的相对空间位置)表征。
[0176] 蛋白质的谷氨酰胺转移酶超家族或谷氨酰胺转移酶家族(TG家族蛋白质)的表达可互换使用，并且在本申请中理解为一类分类为EC 2.3.2.13的蛋白质或其突变体或片段，其具有结构域结构，所述结构域结构包括N末端β夹层结构域、当蛋白质具有活性时为所述蛋白质中催化结构域的核心结构域、第一β桶结构域和第二β桶结构域(也称为结构域I、II、III和IV，结构域II为核心结构域)，所述突变体或片段至少包括折叠的N末端β夹层结构域和折叠的核心结构域。作为综述，参见如[Lorand，L.，and Graham，R.M.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003，4，140-156]。以上定义的属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质在本申请中简称为TG家族蛋白质。
[0177] 优选地，所述核心结构域具有与如例如Grenard等人[J.Biol.Chem.(2001)vol.276(35)pages 33056-33078]的表1和图7所示的下列基因(F13A1、TGM1、TGM2、TGM3、TGM4、TGM5、TGM6、TGM7或EPB42)的任一基因产物、或者其任何真核等价物或类似物(假如它具有包含所述折叠的核心结构域)、或者其任何突变体、变体或类似物的核心结构域相似或基本上相同的折叠。优选地，在所述基因产物中，所述β夹层结构域具有所述β夹层结构域的第一个α-螺旋，所述核心结构域也具有如以下或发明概述中定义的核心结构域的第一个α-螺旋。
[0178] 属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的核心结构域的第一个α-螺旋为从核心结构域或结构域II(为谷氨酰胺转移酶家族活性成员的催化结构域，但是也以催化非活性形式存在于所述家族的非活性成员中)的N末端开始的第一个α-螺旋。天然谷氨酰胺转移酶折叠中所述核心结构域的第一个α-螺旋靠近β夹层结构域的第一个α-螺旋。因此，所述核心结构域的第一个α-螺旋为对应于以下α-螺旋二级结构元件(SSE)的任一元件的α-螺旋SSE：
[0179] 如例如在Loránd and Graham，Nature Reviews 2003，Vol.4，page 140，figure 3中所示的
[0180] 在人谷氨酰胺转移酶2中从Glu153至少跨到Tyr159或Val160的SSE、
[0181] 在人因子XIII中从Glu198至少跨到Tyr204或Val205的SSE、
[0182] 在人谷氨酰胺转移酶1中从Glu153至少跨到Tyr159或Val160的SSE、
[0183] 在人TG3中从His148至少跨到Tyr154或Val155的SSE。
[0184] 属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的β夹层结构域的第一个α-螺旋为从N末端β夹层结构域或结构域I的N末端开始的第一个α-螺旋。天然谷氨酰胺转移酶折叠中所述夹层结构域的第一个α-螺旋靠近核心结构域的第一个α-螺旋。因此，所述夹层结构域的第一个α-螺旋为对应于以下α-螺旋二级结构元件(SSE)的任一元件的α-螺旋SSE：
[0185] 在人谷氨酰胺转移酶1中从Ser14跨到His21的SSE、
[0186] 在人谷氨酰胺转移酶2中从Leu14跨到His21的SSE、
[0187] 在人TG3中从Thr12跨到His19的SSE、
[0188] 在人因子XIII中从Trp57跨到His64的SSE
[0189] [参见Loránd and Graham，Nature Reviews Volume 4，page 140，2003]。
[0190] SSE的第一个或前n个氨基酸残基为SSE从N末端开始的第一个或前n个氨基酸残基，即所述SSE的位于氨基最末端的氨基酸残基，其中n为正整数。SSE的最后一个或最后n个氨基酸残基为SSE从C末端开始的最后一个或最后n个氨基酸残基，即所述SSE的位于羧基最末端的氨基酸残基，其中n为正整数。可基于该蛋白质或同源蛋白质(如果通过序列比对或同源建模或用任何其他适当方法相关联)的三维结构和/或基于相应的酰胺平面的扭转角值和/或通过任何适当的检测、计算或预测方法，来确认氨基酸残基是否属于给定的SSE。
[0191] 通过从靠近C末端(羧基末端)或N末端(氨基末端)方向上给定氨基酸相邻的第一个氨基酸开始计数所述方向上n个氨基酸残基的每一个，而计算与所述方向上给定氨基酸相距n个氨基酸的氨基酸残基的位置，其中n为正整数。
[0192] 谷蛋白引起的自身免疫性疾病包括任何潜伏或外在(显在)形式的疾病，其症状可由谷蛋白诱导，并且在病程中，自身抗体在患者中被引出以抗谷氨酰胺转移酶(TG)，优选抗TG2、TG3或TG6。典型地，谷蛋白引起的自身免疫性疾病包括如典型地在有人类白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8背景并有遗传倾向的人中产生的乳糜泻(也称作乳糜泻病、非热带性口炎性腹泻或谷蛋白敏感性肠病)、以及疱疹样皮炎，其中除了肠道中障碍之外，在皮肤乳头层下区域还有颗粒状IgA沉积。
[0193] 抗原表位为蛋白质分子上的片(patch)或位点，优选为抗体或抗体的结合区能与其结合的分子表面的一部分。
[0194] 抗原表位可通过以下方法定义：如可通过给出对所述分子的片或位点或给定的分子表面的形成有贡献的氨基酸残基或其配位物、从对所述蛋白质的折叠有贡献的结构元件的角度来讲给出其在蛋白质分子上的定位、或用数学计算方法定义分子表面部分。
[0195] 抗原表位的模拟位为分子上的片或位点，优选为相同的抗体或结合区能与其结合的分子表面的一部分。
[0196] 例如如[Goede，Andrean et al.：BMC Bioinformatics 2005，6：223]所述，可给出作为分子的分子表面部分的抗原表位并且可制备模拟位。
[0197] 主要乳糜泻抗原表位理解为以下特征的至少一个为真的抗原表位：
[0198] a)患有乳糜泻的对象的疾病特异性自身抗体能与其结合的TG家族蛋白质的分子表面部分，其中所述自身抗体能与分子表面的所述部分结合，然而患有任何其他疾病并具有能与TG2结合的自身抗体的对象的自身抗体通常或典型地不与该分子表面的所述部分结合；或者
[0199] Mab 885能与其结合的或其部分结合的TG家族蛋白质的分子表面部分，任选地包括结合时与被Mab 885覆盖的区域距离 或 内的表面区域，或者
[0200] TG家族蛋白质的分子表面的部分，如上说明，患有乳糜泻的对象的乳糜泻自身抗体能以所述自身抗体在竞争分析中可被Mab 885置换的方式结合所述TG家族蛋白质；
[0201] b)TG家族蛋白质(其可为乳糜泻中自身抗原)的分子表面的部分，所述分子表面部分至少由下列物质部分地形成或贡献：
[0202] 所述核心结构域的第一个α-螺旋的一个或多个表面氨基酸残基，优选选自所述α-螺旋的前四个、三个或两个氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述α-螺旋的第一个氨基酸残基，和/或
[0203] 所述β夹层结构域的第一个α-螺旋和所述β夹层结构域的保守HisHisThr基序的一个或多个表面氨基酸残基，优选选自所述β夹层结构域的第一个α-螺旋的最后六个、五个、四个或三个氨基酸残基和HisHisThr基序的氨基酸残基的表面氨基酸残基，更优选所述螺旋的第六个氨基酸残基和/或所述HisHisThr基序的第一个氨基酸；
[0204] c)TG家族蛋白质(其可为乳糜泻中自身抗原)的分子表面部分，所述部分与球体内表面部分重叠或包含所述表面部分，根据全长人TG2的氨基酸编号，所述球体具有从Glu153的任何原子算起的 半径和/或在从Arg19的任何原子算起的 半径内，或者基于多序列比对，在动物(优选脊椎动物，更优选哺乳动物)TG2中，分别与之对应/相当的氨基酸残基；
[0205] d)TG家族蛋白质(其可为乳糜泻中自身抗原)的分子表面部分，基于多序列比对，所述TG家族蛋白质至少部分地由与根据全长人TG2的氨基酸编号而编号的Glu153和/或Arg19对应/相当的氨基酸残基形成；
[0206] e)分子的分子表面的片，例如蛋白质(优选TG家族蛋白质)中分子表面部分，所述分子表面部分能结合表面识别分子，优选抗体，其中所述表面识别分子能结合a)至d)中定义的主要乳糜泻抗原表位，
[0207] 其中优选地，所述TG家族蛋白质是
[0208] -真核蛋白质，优选动物蛋白质，更优选脊椎动物或哺乳动物或人蛋白质，[0209] -TG2和/或TG6蛋白质，
[0210] -工程TG家族蛋白质，优选地，其中通过突变生成主要乳糜泻抗原表位或者其中通过突变使主要乳糜泻抗原表位受损。
[0211] 如果所述主要乳糜泻抗原表位是完整的，即具有与TG家族的野生型蛋白质(乳糜泻中自身抗原)的分子表面基本上相同的分子表面，和/或
[0212] 已知能结合所述主要乳糜泻抗原表位如TG2抗原表位的乳糜泻抗体能可检测地结合所述主要乳糜泻抗原表位，和/或
[0213] 核心结构域的N末端α-螺旋的至少第一个N末端表面暴露的氨基酸残基(如下定义的)的侧链几何构型、侧链大小、侧链官能团、电荷和空间位置与对应的可为乳糜泻中自身抗原的谷氨酰胺转移酶家族的野生型蛋白质(TG家族蛋白质)是基本上相同的或具有免疫学上不能区别的相同的重要性，和/或
[0214] 与其中所述主要乳糜泻抗原表位受损的测试蛋白质相比，所述主要乳糜泻抗原表位改变以得到主要乳糜泻抗原表位为完整的或者可被乳糜泻抗体识别的参考蛋白质，[0215] 那么所述主要乳糜泻抗原表位可视为完整的。
[0216] 与野生型谷氨酰胺转移酶(可为乳糜泻中自身抗原)的主要乳糜泻抗原表位相比，如主要乳糜泻抗原表位提供不同的分子表面，因此可以找到以较低亲和性或亲合力与受损的主要乳糜泻抗原表位结合或者不能结合的乳糜泻抗体，则主要乳糜泻抗原表位受损或有缺陷。
[0217] 在实施方案中，如果与参考蛋白质相比，结合亲和性和/或亲合力和/或结合反应速度降低了，优选平均结合水平(average or mean binding level)至少降低了预定比例，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，乳糜泻抗体和乳糜泻抗原表位不同于完整乳糜泻抗原表位的测试蛋白质的结合就受损。
[0218] 乳糜泻抗体为能够特异性识别和结合所述主要乳糜泻抗原表位的抗体。
[0219] 乳糜泻自身抗体是这样一种乳糜泻抗体，其是乳糜泻对象中的自身抗体，其中所述自身抗体能结合野生型TG家族蛋白质和/或能在如上定义的主要乳糜泻抗原表位上结合，其中所述蛋白质为乳糜泻中自身抗原，优选TG2和/或TG6以及任选地TG3，更优选TG2。
[0220] 肌内膜抗体为能与人或灵长类食管中或其他含有平滑肌细胞的组织切片的环绕平滑肌细胞的结缔组织结构结合的乳糜泻抗体，通过间接免疫荧光方法在冰冻组织切片上检测所述抗体。
[0221] 蛋白质分子如TG家族蛋白质的分子表面为描述所述蛋白质分子三维表面的表面积，所述蛋白质分子对于其他化学个体例如溶剂、或其他分子如离子、或蛋白质分子如抗体是易接近的。为了本说明书的目的，分子表面的意思也包括“可及表面积”或“李-理查兹分子表面”、溶剂外部表面或范德瓦尔斯表面。因此，只要用于计算的模型提供所述表面的科学上正确的估计，就可通过任何适合计算此种三维表面的算法计算所述分子表面，而不考虑计算方法之间的变化。
[0222] 本申请所用的结合亲和性为抗原结合位点和抗原决定簇之间相互作用强度的热力学表达(和它们之间立体化学相容性的热力学表达)。在优选意思中，该术语用于抗原决定簇和抗体结合位点之间相互作用。结合亲和性可用由解离常数或其函数计算得到的或与其相关的数量或度量表征，例如解离常数的倒数1/Kd(缔合常数)或解离常数的负对数或-1其函数，如也可以用pKd表示的-log10[Kd/NA*(mol/l) ]。例如，可用在平衡态下或在平衡态后的结合分子如配体或抗体的数量或比例表征结合亲和性。典型地，由于具有给定特异性的抗体分子群中的亲和性异质性，结合亲和性(和例如缔合常数或pKd)事实上表示一类平均值。
[0223] 一方面，如本申请所用的亲合力涉及蛋白质-配体复合物中亲和性的联合强度。另一方面，亲合力描述蛋白质之间多个键合相互作用的结合强度。优选地，亲合力指的是抗体-抗原结合强度。由于亲合力也可用于描述多重键合强度，因此本申请的亲合力有包含亲和性但为更广的术语意思。例如，与IgG的两个强结合位点相反，IgM的单个结合位点可能具有低亲和性，但是由于IgM的十个弱结合位点，所以IgM仍然具有高亲合力。
[0224] 乳糜泻抗体与乳糜泻抗原表位结合的抑制剂为：能结合TG2(转谷氨酰胺转移酶)或乳糜泻抗体，并且在结合时，与不存在所述抑制剂时的结合相比，可检测的结合水平或亲和性降低的化合物。
[0226] 1、表征重组谷氨酰胺转移酶2(TG2)突变蛋白质。(A)蛋白质印迹。上组：羊抗TG2多克隆一抗；下组：小鼠抗谷氨酰胺转移酶2单克隆一抗TG100。Wt、野生型TG2、R、R19S、E、E153S、M、M659S、RE、R19S-E153S双重突变体、RM、R19S-M659S双重突变体、EM、E153S-M659S双重突变体、REM、R19S-E153S-M659S三重突变体、154K、E154K突变体、433、R433S-E435S双重突变体、D、仅含有结构域I-III-IV的结构域突变体。
[0227] (B)野生型TG2各自值的百分比表示的突变蛋白质的谷氨酰胺转移酶(TGase)和GTPase活性。用来自三个重复中所作的两个单独测量的均值表示值。
[0228] 2、TG2突变体的纤连蛋白结合。通过识别核心结构域(II)的抗TG2单克隆抗体TG100测量直接包被在板(TG-ELISA)上或加入纤连蛋白中的蛋白质。结果显示分析中板上的彼此之间的相等的抗原量。这些量用于使用乳糜泻样品的进一步测量。用来自两个重复中所作的两个单独实验的均值表示值。关于蛋白质的缩写，参见图1。
[0229] 3、在将抗原直接包被在板上的ELISA中，来自乳糜泻患者的血清IgA抗体(n＝14)与位点4突变体(A)和结构域突变TG2蛋白质(B)的结合。结果显示为相对于野生型TG2的结合百分比。S4为位点4突变体，S4.1/4/5为D151N-E154Q-E155Q联合突变体。
[0230] 4、来自出现严重吸收不良的乳糜泻儿童(上组)和患有吸收不良的成人患者(下组)的血清IgA抗体与突变TG2蛋白质的结合。将抗原直接包被在板上进行抗TG2 ELISA。结合结果显示为与抗TG2单克隆抗体相比，与野生型TG2结合的数量百分比。以两个重复检查所有血清样品。短划线表示中位值。关于突变体的缩写，参见图1。
[0231] 5、(A)TG2和因子XIII中推定的乳糜泻抗原表位结构。(B)乳糜泻儿童(n＝20)和成人(n＝17)的血清IgA抗体与野生型TG2和模拟因子XIII表面的TG2突变体的结合。K为E154K，RKM为R19S-E154K-M659S三重突变体。
[0232] 6、ELISA中来自乳糜泻儿童和成人的血清IgA抗体与结合纤连蛋白的TG2突变体的结合。结果显示为与抗TG2单克隆抗体TG100相比，与野生型TG2结合的数量百分比。
[0233] 7、蛋白质的封闭和开放形式中TG2的乳糜泻抗原表位结构。
[0234] 8、乳糜泻抗原表位靶向作用的疾病特异性。来自乳糜泻患者和来自患有其他自身免疫性疾病(n＝11)的患者的抗TG2抗体与野生型和突变TG2蛋白质的结合。
[0235] 9、竞争分析中，来自不同患者的乳糜泻抗体识别相同抗原表位。(A)在使用野生型TG2的ELISA中，来自含有IgG类抗TG2抗体的56个IgA缺陷乳糜泻患者的血清样品与相同乳糜泻IgA竞争，并且所述竞争与其血清浓度成比例(A2)。患者中三个也有IgM类抗TG2抗体。来自非乳糜泻IgA缺陷对象的血清样品(n＝23)和IgA活性对象的血清样品(n＝22)不显示干扰(A1)。(B)与N末端R19S突变体反应(G1)或者不与R19S突变体反应(G5)但是与R19S-E153S复合突变体(RE)具有相等的非反应性的纯化IgG乳糜泻抗体以相同的剂量依赖方式与不和R19S反应的纯化乳糜泻IgA竞争，然而由非乳糜泻对象制备的总IgG部分(K4)不显示干扰。分别识别与ELISA板结合的IgA和IgG抗体。
[0236] 10、与野生型TG2相比，乳糜泻抗体与位点4和位点5突变体结合的关联性。
[0237] 11、在特别饮食和血清阴性一段时间后经受诊断性谷蛋白攻击的乳糜泻患者中(A-B)和在随访五年无特别饮食的乳糜泻患者中(C)，乳糜泻抗原表位靶向作用的稳定性。
[0238] 12、组织沉积的和被动转移的致病性抗TG2抗体具有与乳糜泻患者血清中抗体相同的抗原表位特异性。(A)母源抗TG2 IgA抗体沉积在婴儿绒毛膜绒毛状结构表面上和在患有活动性疾病的乳糜泻妇女中胎盘的母源部分中。被动转移的母源IgG沉积在新生儿脐带组织中作为肌内膜抗体。(B)从这些组织洗脱的抗体显示与使用TG2突变蛋白质的血清抗体相似的抗原表位特异性。(C)与由特别饮食和没有抗TG2抗体的乳糜泻母亲的新生儿制备的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)相比，来自具有母源乳糜泻抗体的新生儿的HUVEC显示异常形状以及伸长和减少的细胞长度。
[0239] 13、用等离子表面共振测量纯化乳糜泻IgA与相同数量的野生型和位点4突变TG2的结合动力学。观察到减少的结合和更快的解离。
[0240] 14、患有潜伏的(CDL，n＝11)和显在的(CD，n＝11)乳糜泻疾病的对象中血清抗体的相似抗原表位特异性。
[0241] 15、来自非乳糜泻对象并用来自乳糜泻患者的血清抗体和小鼠单克隆抗体885(A)和CUB7402(B)温育的冷冻小肠段。用异硫氰酸荧光素结合的绿色荧光二抗识别结合的人IgA，并且用罗丹明结合的红色荧光二抗标记小鼠抗体。在这些条件下，885不能结合沿患者抗体结合的肌内膜结构的组织。随着患者IgA的结合，CUB结合肌内膜结构，从而导致合并的黄色。
[0242] 发明详述
[0243] 本发明人应用复合物的结构、生化和免疫学途径研究了人TG2。
[0244] 单体人TG2由687个氨基酸组成，分子量为76kDa，并且由四个结构域组成：具有纤连蛋白结合区的N末端β夹层结构域、具有催化三联体的催化核心结构域和两个C末端β桶结构域。多年前TG2的GDP结合形式已被结晶，其为酶的“封闭”构象[Liu S et al，Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(5)：2743-7.]。发明人用该模型开始定位乳糜泻抗体的潜在结合位点。在所述构象中，GDP在催化核心和第一个β桶之间的裂缝中被结合，并且负责转酰胺基活性的催化三联体隐藏在分子中，并被两个环抑制，因此所述酶不能作为谷氨酰胺转移酶。最近，在具有谷蛋白肽衍生的抑制剂的复合物中，酶的“开放”形式已被结晶[Pinkas DM et al，PLoS Biol.2007；5(12)：e327.]。在此情况下，与GDP结合形式相比，C末端β桶结构域被置换为 并且活性位点残基变得易被底物接近。在模型中，与催化氨基酸结合的活性位点抑制剂“冷冻”TG2的活化形式。尽管有这一发现，没有底物或抑制剂的TG2的Ca2+结合形式仍然未知。还有一个问题是TG2的哪种形式出现在细胞外，在细胞外它可被乳糜泻自身抗体识别。一系列蛋白质工程实验后，本发明人发现，在形成用于谷蛋白引起的自身免疫性疾病中(优选乳糜泻中)的患者自身抗体的抗原表位中，TG2结构中两个锚定位点是基本的。发现乳糜泻抗原表位的底物结合位点和Ca2+离子形式部分都不与其重叠，然而，Ca2+结合位点4与其重叠。所述抗原表位为构象抗原表位，但是由于所述两个锚定位点位于N末端β夹层结构域和核心结构域上，大多数患者自身抗体的结合不阻碍酶的开放—封闭的构象转变。
[0245] 令人感到意外的是，本发明人也已发现分子的表面片可辨别来自乳糜泻患者或患有谷蛋白引起的自身免疫性疾病的患者的自身抗体和来自患有其他自身免疫性疾病的患者的自身抗体。因此可提供对于这些疾病具有高度选择性的诊断。
[0246] 技术人员显然会认为，此种复杂疾病中的抗原表位可因患者而不同或依赖疾病表现类型或疾病进程而不同。就这一通常的认识来看，重要的是本发明人发现的复合抗原表位区是高度特征性的，即对于乳糜泻自身免疫具有选择性的，并且根据使用来自乳糜泻成人的血清样品的测量，近年来仅出现疾病抗原表位的不显著扩展。
[0247] 本申请也提供证据：本申请发现的抗原表位区于疾病的临床前早期已经存在，并且也具有用于诊断后期生活中乳糜泻的预测价值。然而，需了解，随着疾病进行，精确的乳糜泻抗原表位可扩展至另外氨基酸，这可在本发明试验的某些实施方案中考虑。例如(但不限于)，为了进一步减少自身抗体结合，可使TG2中以下氨基酸或者对应的氨基酸产生突变：Arg19、His22、Asp151、Glu153、Glu154、Arg156、Glu157、Leu161、Val431、Arg433、Glu435、Met659、Leu661(根据全长人TG2的氨基酸编号而编号)。基于多序列比对可发现对应的氨基酸。
[0248] 很明显，视为抗原表位的分子表面的片的确切区域可如上所述变化。因此，应了解在所述抗原表位的最中心区外的氨基酸替换或其他突变可影响抗体结合。不完全性地，可在氨基末端β桶结构域上和核心结构域上的某些区域中(如在Ca2+结合位点5中)发现这类区域。在设计用于本发明的谷氨酰胺转移酶突变体时，基于本申请提供的教导，技术人员将能考虑这些变化并优化用于给定目的的突变体。
[0249] 起初发明人鉴定了在现有技术中寻找到但没有发现的作为构象抗原表位的主要乳糜泻抗原表位。可存在所述主要乳糜泻抗原表位的若干重叠变体。可基于本申请提供的教导明确地决定给定抗体是否结合乳糜泻抗原表位这一事实。本发明人鉴定了所述抗原表位的基本部分，从而为技术人员提供设计诊断方法、本申请有用的突变谷氨酰胺转移酶、用于诊断目的的诊断试剂盒的关键。
[0250] 诊断方法和试剂盒
[0251] 基于本申请提供的教导，技术人员将认可根据本发明的实施方案，诊断方法具有两个重要特征。一方面，将提供乳糜泻抗原表位受损、缺陷或缺少的测试TG家族蛋白质，从而乳糜泻自身抗体不能与所述蛋白质结合或者仅仅以降低的水平结合。另一方面，优选存在其他抗原表位以确保所述方法的选择性，因此，至少β夹层结构域和核心结构域具有折叠结构。优选地，β桶结构域中任何一个或两个也是折叠的。因此，在本诊断方法中，阳性结果非常可靠地表示患者患有乳糜泻。
[0252] 可通过若干手段表征结构域的折叠特性。
[0253] 一个方便的方式是检查活性。因此，在优选实施方案中，突变TG2具有一个或多个以下可检测的功能活性：谷氨酰胺转移酶酶活性、GTPase活性和/或纤连蛋白结合。如果2+
由于突变引起谷氨酰胺转移酶活性降低，可能是由于突变位点涉及到Ca 结合这一事实。
由于突变引起谷氨酰胺转移酶活性降低，可能是由于突变位点涉及到Ca 结合这一事实。
[0254] 非乳糜泻构象抗体能与蛋白质结合这一事实也指示其折叠特性。
[0255] 对于技术人员立即显而易见的是，正确的蛋白质折叠可通过若干结构分析方法在实验上显示，例如圆二色性(CD)光谱法、傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)、差示扫描(DSC)微量热法、核磁共振(NMR)光谱法、双偏振极化干涉测量法(DPI)、原子力显微镜等，或者通过如在例如[Simossis VA，and Heringa J，“Integrating protein secondary structure prediction and multiple sequence alignment”，Curr Protein Pept Sci.20045(4)249-66；Rost B，“Review：protein secondary structure prediction continues to rise”J Struct Biol.2001 134(2-3)204-18.]中综述的Chou-Fasman和GOR方法、神经网络模型或最近毗邻法预测。
[0256] 这些方法可作为所述折叠的指纹图谱或用于检测不同蛋白质或结构域例如野生型或其突变体的折叠之间或者不同状态下相同蛋白质的折叠之间的任何差异。
[0257] 在现实生活诊断方法中，将提供参考蛋白质，所述参考蛋白质包括整体的乳糜泻抗原表位，或者，如果使用野生型谷氨酰胺转移酶，例如TG2或TG6或某些实施方案中TG3，完整的乳糜泻抗原表位。应当注意，TG6中抗原表位区的分子表面与TG2的抗原表位区的分子表面非常相似，因此，若需要，这些抗原表位区可通过定点诱变彼此容易地转换。此外，假如不同疾病中抗TG6自身抗体与抗TG2自身抗体不同，那么TG6抗原表位将用于诊断具体不同疾病。对于在谷蛋白引起的自身免疫性疾病中具有自身抗原性的其他谷氨酰胺转移酶，这也是对的。
[0258] 方法中将显示自身抗体的差异结合。例如，与参考蛋白质相比，如果测试蛋白质中一个值，优选与结合亲和性和/或亲合力和/或结合反应速度相关的平均值降低了，优选所述值至少降低了预定比例，优选至少20％、30％，更优选至少40％，更优选至少50％或60％或70％或80％，或者对应的剩余值分别不大于80％、70％，更优选不大于60％，更优选不大于50％或40％或30％或20％，此结果视为指示疾病存在。如果自身抗体与参考蛋白的平均结合水平超过预定阈值，这也是优选的。可使用标准乳糜泻样品或由已知患有乳糜泻的患者得到的样品，通过使用参考谷氨酰胺转移酶简单地进行初步测量，从而确定所述阈值。不需要在各情形下数字上定义预定阈值，如果结合可安全地检测，则所述预定阈值或许是足够的。如本申请所公开的结合通常以与已知具有结合特性的自身抗体和具有完整的乳糜泻抗原表位的谷氨酰胺转移酶的结合相比的相对值给出。
[0259] 测试蛋白质和参考蛋白质均可为野生型蛋白质或者可由来自适当支架(scaffold)的蛋白质工程制备，所述支架与为乳糜泻中自身抗原的蛋白质十分相似或类似。例如，非穷尽地，如人或动物TG1、TG3、TG4、TG5、TG7、因子XIII或EBP42“支架”[如参见Lorand，L.，and Graham，R.M.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003，4，140-156 and Grenard et al，J.Biol.Chem.(2001)vol.276(35)pages 33056-33078]。
[0260] 为了设计谷氨酰胺转移酶或谷氨酰胺转移酶衍生的蛋白质中适当的突变体，鉴别关键氨基酸残基是可取的。为此，如本领域熟知地进行氨基酸序列比对，其包括本领域已知的手段，例如通过Shyu等人[Shyu et al.Genetic Programming and Evolvable Machines 2004 June；5(2)：121-144]综述的方法，或者通过例如在欧洲生物信息研究所的主页可得到的方法如ClustalW2、MAFFT、MUSCLE、T-Coffee等和/或通过使用Genetic Data Environment(GDE)软件包[Smith SW et al.Comput Appl Biosci.1994Dec；10(6)：671-5.]。
[0261] 目前，造成突变也属于本领域的技术人员的技能，所述突变包括形成适当抗原表位的分子表面的片。可在本领域中得到计算蛋白质的分子表面的方法，可通过如WHATIF程序[G.Vriend，J.Mol.Graph.(1990)8，52-56]、Michael L.Connolly，Version 3.9.3的Molecular Surface Package[1259 ElCamino Real，#184Menlo Park，CA 94025，U.S.A.]、Molecular Surfaces Computation(MSMS)[M.F.Sanner et al.Biopolymers，1996Vol.38，(3)，305-320.]；SURFNET[R.A.Laskowski J.Mol.Graph.，(1995)13，323-330.]、SURFNET[R.A.Laskowski J.Mol.Graph.，(1995)13，323-330.]、Analytic Surface Calculation Package(ASC)[F.Eisenhaber et al.J.Comp.Chem.199516(3)：273-28]、SUPERFICIAL[Goede，Andrean et al.BMC Bioinformatics 2005，6：223]和Xiang和Hu的方法[Xiang and Hu，BioMedical Engineering and Informatics，2008.BMEI 2008.Intemational Conference on；Volume 1，Issue，27-30Page(s)：52-56]执行所述方法。
[0262] 只要满足本发明确定的要求，测试蛋白质和参考蛋白质均可为蛋白质片段。然而，在优选实施方案中，所述测试蛋白质和参考蛋白质也包括折叠的N末端β桶结构域。
[0263] 也应当理解，如上说明的为适当支架的任何蛋白质可用于本发明。因此，属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质可以为真核蛋白质，更优选为动物蛋白质，更优选为脊椎动物蛋白质、任选地两栖动物、爬行动物类、鱼类、鸟类蛋白质，或者非常优选为哺乳动物或人蛋白质。
[0264] 在本发明的某优选实施方案中，本发明的测试蛋白质不同于本领域的突变蛋白质，优选如在以下出版物[Sblattero et al.Eur J Biochem.2002Nov；269(21)：5175-81，Nakachi K et al.J Autoimmun.2004Feb；22(1)：53-63.Seissler et al.Clin Exp Immunol.2001 Aug；125(2)：216-21.]的任一出版物中具体描述的突变体。典型地，所述突变体为缺失突变体，假如所述缺失突变体在乳糜泻抗原表位中受损或有缺陷，那么它们不包括折叠的β夹层和核心结构域两者。在反之为真并且某些方法显示在抗原表位缺陷的蛋白质中至少这些结构域有折叠结构的情形下，优选本发明范不包括所述突变体。
[0265] 在某具体实施方案中，如适当，本发明范不包括TG2E153S(E)、R19S(R)、M659S(M)三重突变体和R19S(R)、M659S(M)双重突变体，其中优选地，序列不包括进一步突变。在另外的具体实施方案中，如适当，优选排除包含TG2Met659突变或M659S突变的突变体，其中优选地，序列不包括进一步突变。在另外的实施方案中，本发明范不包括[Király et al.FEBS J.2009 Dec；276(23)：7083-96]中公开的突变体谷氨酰胺转移酶。在实施方案中，Met659在TG2中未产生突变。在另外的实施方案中，本发明范不包括在上述出版物的一个或全部或任意组合中公开的每个突变体。在另外的实施方案中，本发明排除了上述现有技术突变体的一个或全部或任意组合的诊断用途。
[0266] 检测自身抗体结合本属于本领域的技术人员的技能。对于技术人员立即显而易见的是，动力学方法和表征结合亲和性或亲合力的方法是适用的。例如，以下方法的任一个方法(没有任何限制)是适用的：
[0267] 免疫分析，例如ELISA、RIA、侧流(lateral flow)、免疫沉淀，
[0268] 结合分析，例如Biacore、荧光淬灭，
[0269] 分光光度法，例如FT-IR、圆二色性、NMR，
[0270] 物理化学方法，例如量热法、超速离心等。
[0272] 在本发明的诊断方法的优选实施方案中，谷氨酰胺转移酶是纤连蛋白结合的。纤连蛋白结合提供了谷氨酰胺转移酶蛋白质的初步定位，从而使其乳糜泻抗原表位暴露于抗体。因此，诊断测试变得更加灵敏。
[0273] 然而在某些实施方案中，目的是提供选择性区分患者乳糜泻自身抗体和不是乳糜泻抗体(即不是乳糜泻典型的)的其他抗体的分析。在此情况下，省略纤连蛋白以允许到达测试蛋白质和参考蛋白质的整个表面是可取的。在此情况下，优选地，乳糜泻患者的非乳糜泻自身抗体将以几乎相同的结合亲和性结合测试蛋白质和参考蛋白质。在该实施方案的变形中，在液相中进行分析。两种方法中，相信构象抗原表位的呈递在某种程度上是更好的。
[0274] 在优选的变形中，假如患者的这些类型的任一类型无缺陷，那么IgA或IgG作为自身抗体被测量。
[0275] 本发明也涉及实施以上所述的诊断方法的试剂盒。所述试剂盒可包括上述部分或者用于实施以上所述的方法的部分。试剂盒要包括测试蛋白质和至少用于获得参考蛋白质的说明书或者所述参考蛋白质。
[0276] 优选地，试剂盒包括人TG家族蛋白质和用于检测与其结合的抗体的装置。因此，所述试剂盒适当地为免疫试剂盒，并且用于检测的装置包括使用直接标志物和/或二级标志物。直接标志物可为荧光标志物或放射性标志物，二级标志物可为二抗，任选地结合的二抗，如标记的或酶联抗体。因此，所述试剂盒可基于ELISA、EMA、DELFIA、RIA等原理工作。
[0277] 在本发明的优选实施方案中，本发明的测试蛋白质加入到分析试剂盒中，所述分析试剂盒可作为用于乳糜泻检测的组织谷氨酰胺转移酶抗体分析。van Meensel等人[Clinical Chemistry 50：11 2125-2135(2004)]综述了所谓第二代人组织谷氨酰胺转移酶抗体分析的这类分析试剂盒。除了评价患者自身抗体也与测试蛋白质结合之外，基本上可以如所述地进行分析，并且与本申请所述的作为参考蛋白质并具有完整的主要乳糜泻抗原表位的TG家族蛋白质相比，评价了结合差异。
[0278] 技术人员应了解，相比如以上van Meensel等人公开的使用信号值本身，首选在抗体水平函数中采用指示信号如ELISA中OD的校准曲线。例如，可以使用具有已知结合特性的适当稀释的抗体如TG100抗体得到校准曲线。
[0279] 基于抗体置换的诊断方法、用途和试剂盒
[0280] 在这些实施方案中，如发明概述中定义的，如果患者自身抗体被能特异性结合主要乳糜泻抗原表位的预选测试化合物置换，那么这指示所述患者自身抗体为乳糜泻自身抗体这个事实，并且因此指示该疾病本身，即所述患者遭受或易感谷蛋白引起的自身免疫性疾病或优选乳糜泻。
[0281] 优选地，测试化合物为已知能结合属于谷氨酰胺转移酶家族的蛋白质的主要乳糜泻抗原表位的测试抗体或其片段、变体或类似物，所述蛋白质为乳糜泻中自身抗原，优选选自TG2、TG3或TG6。
[0282] 原则上，任何以足够的结合亲和性或亲合力结合乳糜泻抗原表位的抗体适用于本实施方案。所述抗体可以是例如如实施例7中的分离患者自身抗体。
[0283] 更优选地，制备抗乳糜泻抗原表位的单克隆抗体。所述抗体可通过已知技术如杂交瘤方法制备。用于杂交瘤细胞方法的技术是公知的并且在例如Kontermann，Roland；Dübel，Stefan(Eds.)Antibody Engineering Series：Springer Lab Manuals 2001，XII，
792 p.ISBN：978-3-540-41354-7、Gary C.Howard，Matthew R.Kaser(Eds)Making and Using Antibodies：A PracticalHandbook，CRC Press，2006，ISBN：9780849335280中公开。
而且，可从若干公司如GL Biochem Ltd.(Shanghai，CH)、LC Sciences(Houston，TX，USA)或LAMPIRE Biological Laboratories(Pipersville，PA，USA)、FusionAntibodies(Pembroke Loop Rd.BT17 0QL Northern Ireland)定购生成单克隆抗体的杂交瘤制品。
792 p.ISBN：978-3-540-41354-7、Gary C.Howard，Matthew R.Kaser(Eds)Making and Using Antibodies：A PracticalHandbook，CRC Press，2006，ISBN：9780849335280中公开。
而且，可从若干公司如GL Biochem Ltd.(Shanghai，CH)、LC Sciences(Houston，TX，USA)或LAMPIRE Biological Laboratories(Pipersville，PA，USA)、FusionAntibodies(Pembroke Loop Rd.BT17 0QL Northern Ireland)定购生成单克隆抗体的杂交瘤制品。
[0284] 本发明中，抗体选择包括抗原表位选择。在一个实施方案中，可通过选择克隆来实现，所述克隆分泌结合谷氨酰胺转移酶蛋白质的完整TG2或其他蛋白质但是不结合具有受损乳糜泻抗原表位的突变体的抗体。可选择地，选择分泌抗体的克隆，所述抗体可被已知能结合如本申请公开的乳糜泻抗原表位的抗体置换。可通过常规免疫试验例如如实施例中描述的ELISA进行克隆选择。
[0285] 一旦以杂交瘤的形式获得单克隆抗体，那么就可容易地给它们测序。基于cDNA序列，可从例如FusionAntibodies(Pembroke Loop Rd.BT17 0QLNorthern Ireland)定购测序服务。
[0286] 在备选方法中，可通过氨基酸测序例如通过Edman方法获得抗体序列。虽然有时繁琐，这为常规方法并且可从各公例如从Proteome Factory AG Magnusstr.11 D-12489 Berlin Germany定购所述服务。选择性地，可应用相对较近的方法(鸟枪法测序)[Nuno Bandeira et al.Nature Biotechnology，December 2008，v26，n12，pp1336-1338]。
[0287] 通常，仅仅测序可变结构域或者可变结构域加上前导序列就足够了。在某些情况下可获得全抗体序列。基于所述序列，可克隆抗体或其片段的基因，并为给定用途而定制，例如可人源化(例如可制备人抗小鼠抗体(HAMA)，FusionAntibodies也提供此服务)，通过定向进化方法等可以增加结合亲和性。
[0288] 可获得抗体片段如带有可变区的单链抗体片段(scFv)和Fab片段，由于其大小和可靠性，所述抗体片段具有一些优点。Fab片段不同于scFv片段，因为Fab片段也含有可变结构域、恒定区，并且是通过两个半胱氨酸残基连接的二聚体。
[0289] 由于Fab片段和scFv片段的小尺寸以及人免疫系统对其较低的负应答，Fab片段和scFv片段提供一些与作为载体的单克隆抗体相比的优点和较低灵敏度。从合成DNA或从单克隆细胞系均可制备这些片段。甚至当只有可变区的序列已知时，也可以制备所述片段。
[0290] 技术人员可使用如在[Marzari，R.et al.J.Immunol.166，4170-4176(2001)]中公开的噬菌体展示方法，通过所述方法也可制备scFv片段。实施例中描述了基于噬菌体展示方法的诊断抗体制备的示例性方法。
[0291] 基于本申请提供的教导，鉴别其他测试化合物本属于本领域技术人员的技能。
[0292] 本申请中，应当理解，可使用另外的识别分子如本领域的其他基于蛋白质的受体，而不是抗体和抗体片段。例如，应用用IgG结构域观察到的原理，已作了成功的尝试以构建对于原来没有受体特性的蛋白质上给定靶分子特异的结合位点[Xu，L.et al.Chemistry & Biology 2002，9，933-942；Skerra，A.Rev.Mol.Biotech.2001，74，257-275；Nygren P.and Uhlen，M.Curr.Op.Struct.Biol.1997，7，463-469]。适当的支架为例如3型纤连蛋白和脂质运载蛋白，并且通过定向进化技术联合如展示方法可实现结合位点的形成。通过上述方法可设计这些分子的表面。
[0293] 优选地，测试化合物应为更强结合的和/或应当以高浓度使用，以置换自身抗体。
[0294] 优选实施方案中检测了测试化合物的结合。利用特异性结合测试化合物的被标记化合物检测结合。选择性地，测试化合物本身可被标记。在此情况下，例如无患者样品或抗体的信号可定义为0％抑制(测试化合物的最大结合—无疾病)并且空白的信号定义为100％抑制(对应于测试化合物被患者抗体全替换)。如果测试化合物被非常强地结合，就不能识别疾病，这可能在理论上发生。然而，结合水平可受到如本项技术公知的浓度的影响，因此，设定如实施例7显示的分析条件本属于本领域技术人员的技能。
[0295] 优选实施方案中检测了结合抗体。在此情况下，例如结合的二抗可用于检测抗体结合。二抗对于测试抗体应该是特异的，并且不应识别患者抗体。在优选实施方案中，抗体类型是不同的(例如用IgA抗体诊断IgA抗体缺陷患者)。选择性地，测试抗体具有特殊序列，例如它为非人抗体。在工程抗体或抗体片段(例如scFv或Fab)的情形下，容易加入通过基因工程为二抗提供特殊识别位点的序列(Kontermann et al.，2001，Howard and Kaser，2006，见上)。如本领域已知的，二抗、抗体片段和衍生物之外，也可以使用其他识别分子。
[0296] 在备选方法中，可用特异性识别患者抗体如二抗的分子检测患者抗体的结合。在此情况下，通过用测试化合物替换所述抗体从而在最大结合时测量信号的减少，以检测患者乳糜泻自身抗体和乳糜泻抗原表位的特异性结合。
[0297] 本发明也涉及实施以上所述的诊断方法的试剂盒。
[0298] 本实施方案的试剂盒可包括如上所述的试剂盒的组分，区别在于如本申请定义的测试化合物代替或者附加于测试蛋白质包含在所述试剂盒中。
[0299] 本发明的优选实施方案中，如本发明定义的测试化合物可加入到已知的用作用于乳糜泻检测的组织谷氨酰胺转移酶抗体分析的分析试剂盒中。因此，所述分析可作为如本申请教导的用于排除假阳性发现的置换分析。应在本发明的测试化合物存在时进行分析。依赖检测方法可监测患者自身抗体置换测试化合物或测试化合物置换患者自身抗体。van Meensel等人[Clinical Chemistry 50：11 2125-2135(2004)]综述了所谓第二代人组织谷氨酰胺转移酶抗体分析的这类分析试剂盒。可从制造商指南开始优化分析条件，但可基本上如描述的执行分析步骤。
[0300] 本发明也涉及本发明的测试化合物在诊断如本申请公开的谷蛋白引起的自身免疫性疾病中的用途。
[0301] 在优选实施方案中，假如所述抗体能结合、优选特异性结合主要乳糜泻抗原表位，那么本发明的测试化合物不同于以下文献的任一文献中公开的抗体、抗体片段或衍生物：Sblattero et al.Eur J Biochem.2002Nov；269(21)：5175-81、Nakachi K et al.J Autoimmun.2004Feb；22(1)：53-63、Seissler et al.Clin Exp Immunol.2001 Aug；125(2)：216-21。选择性地，本发明的范围排除以上出版物的一个或全部出版物或任意组合中公开的每个抗体、抗体片段或衍生物。
实施例
实施例
[0302] 实施例1：材料和方法
[0303] 1.1分子建模
[0304] 在人TG2(PDB代码：1KV3)[Liu S et al，Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(5)：2743-7.]晶体结构中的第1-14、第44-45和第123-132位残基缺失，然而，在TG3结构(PDB代码：1VJJ)[Ahvazi B et al.，EMBO J.2002；21(9)：2055-67.]中，相应的区域是可见的，因此，其用于全长TG2的建模。使用Modeller[Sali A，Blundell TL，J Mol Biol.1993；
234(3)：779-815.]程序的多模板选项建立同源模型。在Silicon Graphics Fuel工作站上使用Sybyl程序包(Tripos，St.Louis，MO)进行图形分析，进行研究以寻找彼此位置足够近但属于不同结构域的氨基酸。特别研究了核心结构域和N-末端(I)结构域的界面，以及
2+
核心结构域和C-末端(IV)结构域的界面。根据对TG2的Ca -结合突变体的观察，优选带电氨基酸。
234(3)：779-815.]程序的多模板选项建立同源模型。在Silicon Graphics Fuel工作站上使用Sybyl程序包(Tripos，St.Louis，MO)进行图形分析，进行研究以寻找彼此位置足够近但属于不同结构域的氨基酸。特别研究了核心结构域和N-末端(I)结构域的界面，以及
2+
核心结构域和C-末端(IV)结构域的界面。根据对TG2的Ca -结合突变体的观察，优选带电氨基酸。
[0305] 本发明人建议了一组可能参与乳糜泻抗原表位建立的氨基酸，例如：
[0306] Arg19、His22、Glu153、Glu154、Arg156、Arg433、Glu435、Met659、Leu661。
[0307] 还发现Arg19、Glu153、Met659彼此之间较近：
[0308]
[0309]
[0310]
[0311] 所有这些残基位于分子表面，且假定其可能形成共同的构象表位。根据需要，有关其他氨基酸变化的位置和作用依据实验结果而做出评价。
[0312] 1.2产生TG突变体
[0313] 为了获得带His标签的人重组TG2，在聚合酶链式反应中使用编码TG2基因的DNA构建体(pGEX-2T-TG2；Ambrus A et al，2001)为模板，用特异性引物(根据Ek/LIC Cloning Kit，Novagen)：寡核苷酸引物1(5’-gac gac gac aag atg aga att cag acc atg gcc gag gag ctg g-3’)和引物2(5’-gag gag aag ccc ggt tga att cgg tta ggc ggg gcc aat gat gac-3’)进行所述聚合酶链式反应。通过将PCR扩增的DNA亚克隆入pET-30 Ek/LIC Vector中生成带His标签的TG2。
[0314] 使用pET-30Ek/LIC Vector(如上述)中的带His标签的TG2构建体为模板，根据QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)生成TG2突变体。为所述突变体设计含有所述期望突变的寡核苷酸引物对。PCR反应后，通过DpnI消化去除母链。通过使用ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer进行DNA测序，证实所述突变。
[0315] 用丝氨酸而不是更常规Ala取代，是因为所有研究位置均位于分子表面，且Ala诱变引入的憎水部分可导致折叠问题。
[0316] 用于诱变的引物列于表1中。
[0317] 表1
[0318]
[0319]
[0320] 所用的TG2序列公开于UniProtKB/Swiss-Prot Database，ID：P21980(TGM2_HUMAN)，将其以引用的方式并入本申请中。
[0321] 根据所述序列，可以采用相同的方法制备其他引物。
[0322] 1.3TG2蛋白质的表达和纯化
[0323] 用所述表达载体转化Rosetta 2TM细胞(Novagen)，并在LB中，37℃下培养所述细胞至OD6000.6-0.8。为了诱导带His标签的蛋白质的表达，使培养物在0.3mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在下，在20℃下生长5小时，然后，4℃下离心收集细胞。
[0324] 所有的纯化步骤均在冰上进行。将细胞重悬于含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解缓冲液[50mM磷酸钠(pH 7.4)、500mM NaCl、5mM咪唑、20mM β-巯基乙醇、10％(v/v)甘油、1％(v/v)Triton X-100]中。声波处理进行细胞裂解，然后在20000g下离心35分钟。将上清液在20mM咪唑存在下，装入2mL Ni Sepharose High Performance柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB)。用80mL清洗缓冲液1[50mM磷酸钠(pH 7.4)、800mMNaCl、20mM咪唑、20mM β-巯基乙醇]清洗柱，然后用40mL清洗缓冲液2[50mM磷酸钠(pH 7.4)、
500mM NaCl、30mM咪唑、20mM β-巯基乙醇]清洗柱。用12mL含有250mM咪唑的清洗缓冲液2洗脱蛋白质。用Amicon Centricon-YM 50MW(Millipore)浓缩洗脱液，并将缓冲液换为存储缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.2)、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、10％(v/v)甘油]三次。
500mM NaCl、30mM咪唑、20mM β-巯基乙醇]清洗柱。用12mL含有250mM咪唑的清洗缓冲液2洗脱蛋白质。用Amicon Centricon-YM 50MW(Millipore)浓缩洗脱液，并将缓冲液换为存储缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.2)、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、10％(v/v)甘油]三次。
[0325] 如 [Korponay-Szabo I et al.，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46：253-61]所述产生和表达结构域缺失突变体。
[0326] 1.4突变蛋白质的表征
[0327] A)蛋白质印迹法
[0328] 按照标准技术进行SDS/PAGE。TG2蛋白通过SDS/PAGE分离，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)。在TTBS[含0.1％(v/v)Tween 20的50mM Tris缓冲生理盐水]中，用1％牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭该膜1小时，然后在TTBS中，与1∶20000稀释的羊抗TG2多克隆抗体(Upstate)或1∶15000稀释的小鼠抗TG2单克隆抗体TG100(NeoMarkers)室温下温育1小时。用TTBS充分清洗后，该膜与1∶30000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma)结合结合的抗羊抗体或抗小鼠抗体在TTBS中室温下温育1小时。使用Chemiluminescent ECL Detection System(Millipore)显示条带。
[0329] 所有的突变TG2均可以在细菌中成功表达，与野生型(Wt)酶相比，仅在蛋白质收率和蛋白质条带强度方面有细微差别(图1A)。这种现象可能归因于突变体的不同性质，这些性质可能影响表达或纯化效率。SDS凝胶的Coomassie亮蓝染色显示，所有表达蛋白质的纯度均高于80％。
[0330] B)转谷氨酰胺转移酶活性
[0331] 使用微量滴定板分析测定转谷氨酰胺转移酶活性，所述分析基于将5-生物素化戊胺(5-(biotinamido)pentylamine)结合入固定化的N，N-二甲基酪蛋白(DMC)中[Kiraly R et al，J Autoimmun.2006；26(4)：278-87.]。
[0332] 在100mM Tris/HCl(pH 8.0)中，用4mg N，N-二甲基酪蛋白(Sigma)4℃下包被板孔过夜。清洗后，用0.5％奶粉溶液室温下封闭孔30分钟。然后，加入反应混合物(在总体积为200μL的100mM Tris/HCl(pH 8.0)中)，其含有10mM二硫苏糖醇、1mM N-(5-氨基戊基)生物素酰胺(Molecular Probes，Eugene，OR)、5mM CaCl2和0.5μg TG2。反应在37℃下进行30分钟。用200mM EDTA(pH 8.5)清洗板，并用0.42μg/孔的链霉亲和素-碱性磷酸酶(Sigma)温育。通过添加200mL 25mM磷酸对硝基苯酯(Sigma)并在405nm处测量吸光度显示酶反应。通过10分钟和30分钟之间的显色的ΔA405/分钟获得酶活性值。空白反应含有10mM EDTA，没有添加CaCl2。
[0333] 突变体R显示具有高于野生型(Wt)转谷氨酰胺转移酶约30％的Ca依赖型转谷氨酰胺转移酶(TGase)活性(图1B)。所有其他突变体显示出降低的但可测量的TGase活性(图1B)。存在I-III-IV结构域但缺失催化核心(II)结构域的对照突变体(D)未显示TGase活性。
[0334] C)鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性测定
[0335] GTPase活性通 过炭法 测定[Kiraly R et al，J Autoimmun.2006；26(4)：278-87.]。100μL反应混合物在50mM Tris-HCl(pH 7.5)、4mMMgCl2、1mM DTT、1mM EDTA、
10％(v/v)甘油、9.9mM GTP和0.1mM[g-32P]GTP(3000Ci/mmol，Institute of Isotopes Ltd.，Budapest，Hungary)中含有2μg重组野生型或突变型TG2。反应在37℃下进行30分钟，并在冰冷的50mM NaH2PO4(pH 7.5)中用700μL6％(w/v)活性碳终止。离心该混合
32
物，并通过计数上清的150μL样品来测定释放的[ P]Pi。测定无酶空白。
10％(v/v)甘油、9.9mM GTP和0.1mM[g-32P]GTP(3000Ci/mmol，Institute of Isotopes Ltd.，Budapest，Hungary)中含有2μg重组野生型或突变型TG2。反应在37℃下进行30分钟，并在冰冷的50mM NaH2PO4(pH 7.5)中用700μL6％(w/v)活性碳终止。离心该混合
32
物，并通过计数上清的150μL样品来测定释放的[ P]Pi。测定无酶空白。
[0336] 野生型酶的比活性(切割的皮摩尔GTP/分钟/毫克酶)设为100％。突变体RM、EM和REM的GTPase活性高于Wt活性两倍多(图1B)。单突变体和其他双突变体显示24-50％的GTPase活性。
[0337] D)突变体的纤连蛋白结合力(纤连蛋白-TG2ELISA)
[0338] 用碳酸氢盐缓冲液稀释的0.3μg人纤连蛋白(FBN)室温下包被微量滴定板(ImmunoPlate Maxisorp，Nunc，Denmark)1小时。该板用含10mM EDTA的TTBS(TTBS+EDTA)清洗三次，并在含5mM CaCl2和0.1％(v/v)Tween-20的TBS(Ca-TBS-Tween)中，与0.8μg TG2室温下温育1小时。将单克隆抗体[TG100，在TTBS+EDTA中稀释500倍，(NeoMarkers，Fremont，CA)]室温下温育1小时。清洗微量滴定板，并与HRP结合抗小鼠IgG(1∶4000，Sigma)在室温下温育1小时。通过添加100μL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Sigma)进行显色反应，然后用50μL 1N H2SO4终止反应。读出450nm处的吸光度。用各突变体的TG100单克隆抗体的稀释物制备标准曲线。
[0339] 当结合到FBN上时，所述突变体与小鼠单克隆TG100抗体的反应程度和Wt相同(图2)。这些数据证实突变体具有适当的构象，以用于乳糜泻血清的进一步测定。
[0340] 1.5患者
[0341] 除非特别指出不同的条件，使用来自总共216名、年龄在0.9-78岁之间的患有乳糜泻病患者的血清样品，其中56名患者有选择性体液IgA缺陷(总血清IgA＜0.05g/l)；所有患者通过小肠活检诊断，至少患有Marsh III级绒毛萎缩症。在治疗前采集样品，从样品中取22个进行长达17年的随访。11名对象起初保持有小肠绒毛结构，但随后在前瞻性随访中发展为乳糜泻型绒毛萎缩(潜伏病例)。所包括的非乳糜泻对照物具有正常的小肠绒毛结构。
[0342] 1.6抗体和单链可变片段(ScFv)
[0343] Phadia的小鼠单克隆抗体系Mab885(Cl.885A)已经由Phadia AB(Box 6460 75137 UPPSALA，Sweden，Visiting address：Rapsgatan 7P 754 50Uppsala)按照《布达佩斯条约》保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Miroorganismen un Zellkulturen GmbH，DSMZ，德国不伦瑞克，Inhoffenstr.7B，D-38124)，其保藏号_______在适当的国际表格中指明。Mab885的融合伴侣为SP2/0(大鼠)cl.321B。
[0344] 培养Cl.885A的条件如下：
[0345] 培养基：F-DMEM+4mM L-谷氨酰胺+5％胎牛血清
[0346] 优选温度：37℃
[0347] 气相：6％CO2
[0348] 最佳分流比：约1/10。
[0349] 优选在F-DMEM+10％胎牛血清+7.5％DMSO中-150℃下长期保存。
[0350] 1.7抗TG2 ELISA
[0351] ELISA测定与以前描述的检测类似[Sulkanen，S.et al.，Gastroenterology 115，1322-1328(1998)]。简要地讲，微量滴定板(ImmunoPlate Maxisorp，Nunc)在含5mM CaCl2的100μL TBS(pH 7.4)中用0.6μg TG2包被。该板用含10mM EDTA的TTBS(TTBS+EDTA)清洗三次。所有抗体均在TTBS+EDTA中稀释。血清样品(稀释比1∶200)或单克隆抗体(TG100，稀释比1∶500，NeoMarkers)在室温下温育1小时。清洗该板并用HRP结合的兔抗人IgA或IgG(1∶5000；Dako)室温下温育1小时，然后用HRP结合的抗小鼠IgG(1∶5000；
Sigma)室温下温育1小时。通过添加100μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物(Sigma)显色，然后使用50μL 1N H2SO4停止反应。读出450nm处的吸光度。通过各突变体的TG100单克隆抗体的稀释物制备标准曲线，并且，如果结合到Wt TG2为100％，其他抗体的结合通过4-参数拟合计算。
Sigma)室温下温育1小时。通过添加100μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物(Sigma)显色，然后使用50μL 1N H2SO4停止反应。读出450nm处的吸光度。通过各突变体的TG100单克隆抗体的稀释物制备标准曲线，并且，如果结合到Wt TG2为100％，其他抗体的结合通过4-参数拟合计算。
[0352] 1.8竞争性ELISA试验
[0353] 微量滴定板在100μL含5mM CaCl2的TBS(pH 7.4)中用0.6μg或更少的野生型(Wt)TG2包被。孔与乳糜泻血清(1∶800)以及递增量的纯化的总乳糜泻IgG抗体(稀释比1∶200-1∶50)或IgA缺陷的患者血清温育，并检测IgA和IgG抗体的结合。在进一步的竞争性测定中，在板中加入乳糜泻血清以及递增量(直至18μg/孔)的单克隆小鼠抗体(885，CUB7402，H23)，并测定结合的IgA。
[0354] 1.9免疫荧光研究
[0355] 非固定的冷冻切片与抗人IgA或IgG(DAKO)温育，单独检测体内结合的免疫球蛋白，或与TG2双标记结合，所述TG2双标记的方法如以前所述[Korponay-Szabo，I.R.et al.J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.31，520-527(2000)，Korponay-Szabo，I.R.et al.Gut53，641-648(2004)]。检测与TG2特异性单克隆抗体的竞争的方法为：在PBS中，向组织中添加单克隆抗体，30分钟后，去除温育液，并检测所述单克隆抗体以检测患者IgA和小鼠抗体。以Alexa-Fluor 594-结合的或者Rhodamine结合的抗小鼠抗体检测单克隆抗体的结合。
[0356] 1.10HUVEC制备和细胞培养实验
[0357] 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由新鲜的脐带制备，并用标准技术[Palatka K.et al.World J.Gastroenterol.12，1730-1738(2006)]培养。为了分析抗体对细胞分化的作用，在胶原I上培养HUVEC 48小时[Myrsky，E.et al.Clin.Exp.Immunol.152，111-119(2008)]，并用Image J软件分析内皮小管的长度。从三个孔中(50000个细胞/孔)，拍摄10张不同照片。
[0358] 1.11统计分析
[0359] 使用GraphPad Prism Software和STATISTICA分析ELISA测定的数据。为比较抗体与突变体TG2的结合，分析数据的方法为重复测量ANOVA，然后进行Dunnett多重后检验，单因子ANOVA，然后进行Tukeys后检验，或Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn多重比较检验，视情况而定。p值＜0.05视为显著。
[0360] 实施例2：定位乳糜泻抗原表位的预实验
[0361] 乳糜泻抗体的结合与TG2的钙结合位点有关
[0362] 在检测Ca2+与人TG2结合的过程中，我们在核心结构域上发现两块+
带负电荷的表面片，所述表面片彼此临近，可以作为Ca2结合位点。在位点
4(151DSEEERQE158→151NSQQQRQQ158)或位点5(434DERED438→434NQRQN438)上的酸性谷氨酸和天冬氨酸残基到中性谷氨酰胺和天冬酰胺的多种突变，导致每个TG分子上结合
2+
的Ca 离子数从6个减少到3个，并且在酶联免疫测定(ELISA)中大量地(与野生型TG2相比，位点4的残基结合11.6±-8.5％)或中等程度(位点5，51.3±16.0％)地减弱了乳糜泻患者血清样品的结合。这些ELISA测定使用取自62名乳糜泻患者(诊断时年龄1-42岁)和20名疾病对照对象(年龄1-17岁)的血清样品。在临床诊断初期采集血清样品，乳糜泻在血清中具有抗TG2和肌内膜抗体并且根据小肠活检具有严重绒毛萎缩症，而对照分别具有正常小肠结构和阴性血清学结果。
带负电荷的表面片，所述表面片彼此临近，可以作为Ca2结合位点。在位点
4(151DSEEERQE158→151NSQQQRQQ158)或位点5(434DERED438→434NQRQN438)上的酸性谷氨酸和天冬氨酸残基到中性谷氨酰胺和天冬酰胺的多种突变，导致每个TG分子上结合
2+
的Ca 离子数从6个减少到3个，并且在酶联免疫测定(ELISA)中大量地(与野生型TG2相比，位点4的残基结合11.6±-8.5％)或中等程度(位点5，51.3±16.0％)地减弱了乳糜泻患者血清样品的结合。这些ELISA测定使用取自62名乳糜泻患者(诊断时年龄1-42岁)和20名疾病对照对象(年龄1-17岁)的血清样品。在临床诊断初期采集血清样品，乳糜泻在血清中具有抗TG2和肌内膜抗体并且根据小肠活检具有严重绒毛萎缩症，而对照分别具有正常小肠结构和阴性血清学结果。
[0363] 为进行ELISA，将野生型和突变型TG2蛋白质在Ca-TBS-Tween中稀释，然后在室温下包被到Maxisorp板(0.6μg/孔)1小时。然后，如实施例1所述进行ELISA：将1∶200稀释的患者抗体加入试验缓冲液中，并使用兔抗IgA多克隆抗体(DAKO，在试验缓冲液中按1∶4000稀释)检测信号。将与野生型TG2的结合设为100％，患者样品的结合据此成比例计算，使用TG100单克隆抗体参照物控制板具有可比数量的野生型和突变型TG2抗原。
[0364] 在试验的液相方案中，微量滴定板(Maxisorp，Nunc，Denmark)包被0.6μg野生型(Wt)TG2。乳糜泻血清与不同数量的野生型或突变型TG2在Ca-TBS-Tween中，室温下温育10分钟。将该混合物添加到孔中，室温下温育1小时。对包被的野生型TG2结合的IgA抗体的检测与抗TG2 ELISA中类似。
[0365] 为寻找可以在位点4形成乳糜泻抗原表位的锚定位点残基，我们制备了分别带有D151N、E153Q、E154Q、E155Q、E158Q和E158L突变的突变型TG2分子。这些当中，残基153或158的突变显著降低(p＜0.0001)了乳糜泻抗体的结合(图3A)，而其他变化没有任何153
作用。由于E158没有暴露于表面，所以这些结果显示了Glu 的重要性，其可形成用于抗体结合的锚定位点。然而，在此位置上Glu到Gln的突变不足以完全取消患者抗体的结合，
153
或者也有可能，Glu 需要其他表面部分的协同以形成功能性抗原表位。
作用。由于E158没有暴露于表面，所以这些结果显示了Glu 的重要性，其可形成用于抗体结合的锚定位点。然而，在此位置上Glu到Gln的突变不足以完全取消患者抗体的结合，
153
或者也有可能，Glu 需要其他表面部分的协同以形成功能性抗原表位。
[0366] 还在位点5上进行定点诱变。分析表面特性，在位点5的推定抗原表位的中部有433 435
带电侧链的两个候选氨基酸(Arg 和Glu )变为丝氨酸(突变体433)，因为这些氨基酸距离位点4最近。然而，突变体433没有显示与乳糜泻患者血清样品结合的改变。此外，在位点5具有结合抗原表位的单克隆小鼠抗TG2抗体H23[Korponay-Szabo I et al.J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46：253-61.]，当在ELISA中过量地与乳糜泻血清样品一同共施用时，不干扰乳糜泻抗体与野生型TG2的结合。
带电侧链的两个候选氨基酸(Arg 和Glu )变为丝氨酸(突变体433)，因为这些氨基酸距离位点4最近。然而，突变体433没有显示与乳糜泻患者血清样品结合的改变。此外，在位点5具有结合抗原表位的单克隆小鼠抗TG2抗体H23[Korponay-Szabo I et al.J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46：253-61.]，当在ELISA中过量地与乳糜泻血清样品一同共施用时，不干扰乳糜泻抗体与野生型TG2的结合。
[0367] 我们还制备了转谷氨酰胺转移酶活性位点突变体(C277S)，但此蛋白质与乳糜泻抗体的结合和野生型TG2一样好。
[0368] 钙离子不形成乳糜泻抗原表位的部分
[0369] 位点4是Ca2+结合位点，以前的临床实验室研究显示，在Ca2+存在下，乳糜泻抗体2+
优先识别TG2[Sulkanen S et al，Gastroenterology 1998；115：1322-8.]。由于Ca 在位点4或位点5的配位所涉及的表面氨基酸不完全负责乳糜泻抗体结合，我们研究钙离子自身是否也对抗原表位有贡献。为此目的，我们利用在乙二胺四乙酸(EDTA)中彻底透析后的
2+
TG2制剂作为抗原，并且我们在ELISA中的所有缓冲液溶液中使用EDTA。然而，当其Ca 强
2+
结合位点(位点1，氨基酸229-233，与TG3的Ca 强结合位点同源)突变时，这一步骤仅从
2+
该蛋白质中去除所有结合的Ca 。具有完整位点4和位点5氨基酸的位点1突变体是乳糜
2+
泻抗体的良好抗原，且在Ca 存在和不存在时，均在ELISA中同样地良好结合(≥100％)乳糜泻抗体。这一结果排除潜在乳糜泻抗原表位中的钙离子在位点4和位点5上的结构作用。
优先识别TG2[Sulkanen S et al，Gastroenterology 1998；115：1322-8.]。由于Ca 在位点4或位点5的配位所涉及的表面氨基酸不完全负责乳糜泻抗体结合，我们研究钙离子自身是否也对抗原表位有贡献。为此目的，我们利用在乙二胺四乙酸(EDTA)中彻底透析后的
2+
TG2制剂作为抗原，并且我们在ELISA中的所有缓冲液溶液中使用EDTA。然而，当其Ca 强
2+
结合位点(位点1，氨基酸229-233，与TG3的Ca 强结合位点同源)突变时，这一步骤仅从
2+
该蛋白质中去除所有结合的Ca 。具有完整位点4和位点5氨基酸的位点1突变体是乳糜
2+
泻抗体的良好抗原，且在Ca 存在和不存在时，均在ELISA中同样地良好结合(≥100％)乳糜泻抗体。这一结果排除潜在乳糜泻抗原表位中的钙离子在位点4和位点5上的结构作用。
[0370] 抗原表位锚定位点在核心结构域外的存在
[0371] 由于Glu153靠近结构域之间的界面，我们尝试确定哪些除核心结构域以外的结153
构域可能泊靠更多的抗原表位，或可能在抗体结合中与Glu 配合。考虑到TG2截短片段的现有技术中的较早结果相矛盾，我们表达了各缺失一个TG2结构域的TG2突变体，如[Korponay-Szabo et al，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46：253-61.]所述。当在固相和液相免疫测定中以等摩尔浓度使用这些结构域突变构建体时，我们发现，甚至在完全缺少结构域III(氨基酸472-584)时乳糜泻抗体结合也正常进行。与此不同，缺少结构域I或II使蛋白质根本不与乳糜泻抗体结合(图3B)，表明这些结构域在抗体结合中均具有直接或间接的作用。并且，缺少结构域IV(氨基酸585-687)在某种程度上影响结合(相对于野生型TG2的O.D.为0.8，p＜0.0001)。然而，还令人惊讶地发现，由结构域I-III-IV组成但不含结构域II的构建体不结合乳糜泻抗体，尽管已知这些结构域采用也不依赖于核心结构域的折叠形式[Hang J et al，J Biol Chem.2005；280(25)：23675-83.；Pinkas DM et al，PLoS Biol.2007；5(12)：e327.]。因此，这些结构表明在乳糜泻抗原表位，高效的结合需要存在核心结构域锚定残基，因此，不存在核心结构域锚定残基的其他抗原表位部分不能形成功能性结合位点。
构域可能泊靠更多的抗原表位，或可能在抗体结合中与Glu 配合。考虑到TG2截短片段的现有技术中的较早结果相矛盾，我们表达了各缺失一个TG2结构域的TG2突变体，如[Korponay-Szabo et al，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46：253-61.]所述。当在固相和液相免疫测定中以等摩尔浓度使用这些结构域突变构建体时，我们发现，甚至在完全缺少结构域III(氨基酸472-584)时乳糜泻抗体结合也正常进行。与此不同，缺少结构域I或II使蛋白质根本不与乳糜泻抗体结合(图3B)，表明这些结构域在抗体结合中均具有直接或间接的作用。并且，缺少结构域IV(氨基酸585-687)在某种程度上影响结合(相对于野生型TG2的O.D.为0.8，p＜0.0001)。然而，还令人惊讶地发现，由结构域I-III-IV组成但不含结构域II的构建体不结合乳糜泻抗体，尽管已知这些结构域采用也不依赖于核心结构域的折叠形式[Hang J et al，J Biol Chem.2005；280(25)：23675-83.；Pinkas DM et al，PLoS Biol.2007；5(12)：e327.]。因此，这些结构表明在乳糜泻抗原表位，高效的结合需要存在核心结构域锚定残基，因此，不存在核心结构域锚定残基的其他抗原表位部分不能形成功能性结合位点。
[0372] 实施例3：在推定乳糜泻抗原表位和相关表面区域内的突变的作用
[0373] 基于初步结果和计算分析，在一大组氨基酸中，鉴定了6个氨基酸(R19、D151、E153、E154、E155、M659)，这些氨基酸在与位点4有关的TG2的表面或与其邻近，且彼此距离足够近而有可能形成复合抗原表位。这些残基通过定点诱变逐一改变(单一突变体)或一起改变(双重和三重突变体)为丝氨酸，或当为酸性残基时，变为其中性同系物。
[0374] 我们制备以下点突变体TG2分子：E153S(E)、R19S(R)、M659S(M)或各自突变的组合(D151N/E154Q/E155Q、RE、EM、RM、REM、E154K/R19S/M659S[RKM])，并且用一大组连续的患者血清样品(n＝76)检测所述蛋白质。可通过与以小鼠单克隆抗TG2抗体TG100的浓度依赖结合而建立的校准曲线相比较计算出结合抗体的相对数量，TG100在氨基酸447-538处具有线性抗原表位。
[0375] 各单一突变导致乳糜泻抗体结合显著降低(R、E和M的结合，分别剩余26.5％、28.8％和39.1％)，双重或三重突变引起成比例的变化。D151N/E154Q/E155Q突变体的结合较其单点突变体显著降低(图3A)，但没有完全丧失其结合能力。RM突变体仍然保持35.8％的结合力，EM保持18.5％的结合力，REM以及令人惊讶的RE最低，分别保持13.4％和6.6％的结合力。观察到连续诊断的儿童和成人乳糜泻患者具有相同的结合模式(图4)，这些结果共同指出了抗体结合中核心结构域的首个α螺旋的重要性。
[0376] 尽管乳糜泻抗体结合力下降，突变体TG2蛋白质还正常结合一大组小鼠单克隆抗TG2抗体[Korponay-Szabo I et al，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2008；46：253-61.]，显示纤连蛋白结合以及TG2酶或GTP酶测定中的功能性，如实施例1所示。此外，对所选突153 158
变体(R、S4、E 和E 突变体)的CD光谱分析显示，所述蛋白质具有折叠结构，其无序区段的比例无显著增加(＜5％)。
变体(R、S4、E 和E 突变体)的CD光谱分析显示，所述蛋白质具有折叠结构，其无序区段的比例无显著增加(＜5％)。
[0377] 通过改造所述推定复合抗原表位的另一个核心结构域锚定位点而进一步证实乳153 154
糜泻抗体直接结合到Glu 周围的表面。如上所示，将Glu 变为中性Gln(E154Q)不足以改变乳糜泻抗体结合，但TG2(E154K)的变化结合R和M突变(RKM)致使与REM突变类似的乳糜泻抗体结合的大幅减少(剩余结合22.0％)(图5)。
糜泻抗体直接结合到Glu 周围的表面。如上所示，将Glu 变为中性Gln(E154Q)不足以改变乳糜泻抗体结合，但TG2(E154K)的变化结合R和M突变(RKM)致使与REM突变类似的乳糜泻抗体结合的大幅减少(剩余结合22.0％)(图5)。
[0378] 该结果还由以下事实支持：转谷氨酰胺转移酶家族的一个其他成员因子XIII，乳糜泻抗体不与其结合[ et al，Autoimmunity 2002；35：357-64.]，其在除此之外非常同源的表面内，含有位于相应位置的带正电荷的赖氨酸。与此相反，对来源于不同物种和人TG中的TG2序列的文库搜索显示，已知在临床实验室中通过ELISA(豚鼠)或传统免疫荧光法(猴、大鼠、兔、小鼠)检测组织切片中的乳糜泻抗体时，作为高度敏感抗原的所有动物TG2蛋白质在相应的位置含有同源的带负电荷的表面和锚定位点(表2)。在人TG6中也可以找到类似的表面。
[0379] 为了描绘可贡献于推定乳糜泻抗原表位的表面积，我们使用从突变体433(图4)中获得的数据，所述数据显示，推定乳糜泻抗原在位点5方向没有延伸到这些残基。
[0380] 表2、贡献于从不同物种获得的TG2蛋白质和转谷氨酰胺转移酶超家族的其他成员中的乳糜泻抗原表位的氨基酸比较。
[0381]
[0382]
[0383] a)[Korponay-Szabo et al，J Pediatr Gastroenterol Nutr.2000；31：520-7.][0384] b)[Dieterich et al，Nat Med.1997；3：797-801.]
[0385] c)[Korponay-Szabo et al，Gut.2003；52：199-204.]
[0386] d)[Hadjivassiliou et al，Ann Neurol.2008；64：332-43.]
[0387] e)[Sardy et al，J Exp Med.2002；195：747-57.]
[0388] f)因子XIII[ et al，Autoimmunity 2002；35：357-64.]
[0389] g)红细胞膜带4.2蛋白质，未发表的自有数据
[0390] 两个锚定位点足以确定乳糜泻抗原表位
[0391] 为了确定在乳糜泻抗体结合中Arg19和Met659的相对重要性，还研究了模拟在胞外基质中表面抗原的易接近性的与纤连蛋白结合的TG2，患者体内抗体主要在所述胞外基质与自身抗原相遇。为此，如实施例1所述，以0.8μg TG2/孔包被纤连蛋白，在测定缓冲液中用1∶4000稀释的兔抗IgA二抗(DAKO)检测结合的IgA类乳糜泻抗体。在这些条件下，19 153
Arg 和Glu 的突变与使用直接结合到ELISA板上的TG2检测时具有类似的作用。然而，
659
令人惊讶的是，单独的Met 突变在儿童或成人中均未改变乳糜泻抗体结合(图6)，如果与
153 19
其他两种突变结合也没有累加效应。因而，这些结果显示，Glu 和Arg 一起足够抗体结合，当TG2采用开放延伸构象[Pinkas DM et al，PLoS Biol.2007；5(12)：e327.]时，乳糜
659
泻抗体还可以以其催化活性形式结合到TG2，在所述开放延伸构象中，带Met 的结构域IV外摆(swing out)。由于在闭合构象中Arg19距离 比距离
19 153
近很多，这更令人惊讶。另一方面，开形晶体结构(2Q3Z)中Arg 和Glu 位置的测量没有显示与闭合构象 的差异(图7)。
Arg 和Glu 的突变与使用直接结合到ELISA板上的TG2检测时具有类似的作用。然而，
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令人惊讶的是，单独的Met 突变在儿童或成人中均未改变乳糜泻抗体结合(图6)，如果与
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其他两种突变结合也没有累加效应。因而，这些结果显示，Glu 和Arg 一起足够抗体结合，当TG2采用开放延伸构象[Pinkas DM et al，PLoS Biol.2007；5(12)：e327.]时，乳糜
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泻抗体还可以以其催化活性形式结合到TG2，在所述开放延伸构象中，带Met 的结构域IV外摆(swing out)。由于在闭合构象中Arg19距离 比距离
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近很多，这更令人惊讶。另一方面，开形晶体结构(2Q3Z)中Arg 和Glu 位置的测量没有显示与闭合构象 的差异(图7)。
[0392] 在液相测定中，抗体显示与固相ELISA中相同的模式，这支持了Glu153和Arg19在抗体结合中具有重要作用的发现。
[0393] 实施例4：间接影响乳糜泻抗原表位的其他突变
[0394] 如图3A所示，核心结构域上的单点突变(E158Q或E158L)也大大降低了ELISA中乳糜泻自身抗体到TG2的结合。由于此氨基酸没有暴露于表面，我们进行了进一步的计算158
机模拟分析(in silico analysis)和分子建模以探索这种突变的作用。Glu 位于所述核心结构域的首个α-螺旋的碱基上，其侧链上负电荷的损失导致氢键断裂并使螺旋不稳定。此过程可以影响表面残基153、154和155彼此之间的相对位置或到N-末端结构域上
19
Arg 的相对位置。
机模拟分析(in silico analysis)和分子建模以探索这种突变的作用。Glu 位于所述核心结构域的首个α-螺旋的碱基上，其侧链上负电荷的损失导致氢键断裂并使螺旋不稳定。此过程可以影响表面残基153、154和155彼此之间的相对位置或到N-末端结构域上
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Arg 的相对位置。
[0395] 通过还评价位点5氨基酸的位置，可得出结论：这些改变可以间接方式影响位点4的螺旋，但程度较轻。
[0396] 另外，我们评价了除N-末端结构域首个α-螺旋内的Arg19突变以外的其他改变是否会对乳糜泻抗体结合产生影响。因此，我们制备了全长TG2的N-末端前14个氨基酸缺失的突变体TG2，这种突变体被认为也会影响所述螺旋。乳糜泻抗体显示与该突变体大大减少的结合(和野生型TG2相比，剩余8.4％结合)。
[0397] 对于所有这些突变氨基酸来说，虽然它们不形成乳糜泻抗原表位分子表面的部分，但是，突变间接影响所述抗原表位。
[0398] 实施例5：复合抗原表位的疾病特异性和临床相关性
[0399] 疾病特异性
[0400] 我们评价了所鉴定的复合抗原表位是否仅仅是乳糜泻自身免疫所特有的。因此，我们比较了11个乳糜泻样品的结合模式和由于其他自身免疫疾病(SLE、干燥综合征( syndrome)、类风湿性关节炎)血清中存在抗TG2抗体的11名患者的血清样品的结合模式，所述乳糜泻样品肌内膜抗体和抗TG2抗体均为阳性。非乳糜泻组的结合模式明显不同，其与乳糜泻抗原表位不相关(图8)，这些对象也为抗肌内膜和脱酰胺基醇溶蛋白抗体阴性。自身免疫患者没有吸收障碍或其他肠道症状，在进行小肠组织学检查(在1例中)时，小肠正常。
[0401] 不同乳糜泻患者的抗体识别相同抗原表位的部分
[0402] 由于患者天然抗体为多克隆，并可以包含具有不同抗原表位特异性的抗体混合物，我们接下来研究了新鉴定的构象性表位是否决定所有乳糜泻病例的抗体应答。因此，我们用血清样品和纯化的IgG和IgA患者免疫球蛋白进行竞争性研究。取自所有接受研究的56名带IgG或IgM类抗TG2抗体的IgA缺陷的乳糜泻患者(年龄0.9-78岁)的血清样品，可以顶替取自相同的IgA充足的乳糜泻患者中相同的IgA抗TG2乳糜泻抗体(图9)，而23名不带TG2抗体的非乳糜泻IgA缺陷的对照对象的血清无作用。顶替效应与血清中的IgG和IgM类抗TG2抗体的浓度成正比，因而适合在临床实验室中测量未知的非IgA乳糜泻抗体。
[0403] 尽管所有乳糜泻患者血清样品显示与REM、RKM三重和RE双重突变体的反应大大降低，它们的反应显示与R点突变体的一些差异，在所述R点突变体中，仅改变了N-末端锚19
定位点(Arg )，如图4所示。然而，在我们用取自其抗体不与R反应的乳糜泻患者中纯化的IgG抗体进行竞争性研究时，我们发现，相同IgA乳糜泻抗体具有与我们用其他不与R反应的IgG乳糜泻抗体时相同的竞争作用(图9)。
定位点(Arg )，如图4所示。然而，在我们用取自其抗体不与R反应的乳糜泻患者中纯化的IgG抗体进行竞争性研究时，我们发现，相同IgA乳糜泻抗体具有与我们用其他不与R反应的IgG乳糜泻抗体时相同的竞争作用(图9)。
[0404] 此外，当我们比较抗体结合到用最初研究的62个乳糜泻血清样品获得的位点4和2+
位点5的Ca -结合突变体的结果时，对于单个样品，结合到位点5与结合到位点4的对数数值相关(图10)。这一结果表明，所述结合主要是由位点4螺旋所决定，此外在位点5附近的改变具有比例效应，指明所有患者存在单个主结合位点，所述位点5在位点4表面积的边缘且可影响位点4螺旋的位置。这一系列还包括成年人，在成年人身上发现了类似的结果。
位点5的Ca -结合突变体的结果时，对于单个样品，结合到位点5与结合到位点4的对数数值相关(图10)。这一结果表明，所述结合主要是由位点4螺旋所决定，此外在位点5附近的改变具有比例效应，指明所有患者存在单个主结合位点，所述位点5在位点4表面积的边缘且可影响位点4螺旋的位置。这一系列还包括成年人，在成年人身上发现了类似的结果。
[0405] 疾病发展中表位结合模式的稳定性和进化
[0406] 乳糜泻是严格的谷蛋白依赖性临床实体，并且TG2自身抗体的生成取决于谷蛋白摄入，并随谷蛋白去除和再引入而消失和再现。因此，我们研究了来自最初获得的及其后来的血清样品的个体患者的循环TG2自身抗体的抗原表位特异性。在7个患者中，节食时自身抗体消失，但是以后(1-4年后)再引入谷蛋白以用于诊断性谷蛋白激发，正如早期的临床实践，患者用相同抗原表位特异性的抗体对谷蛋白激发作出应答。类似地，在没有饮食顺从性并且血清中TG2抗体从童年期到成年期长时间持续阳性的情况下，观察到表位结合模式3.5-14年内的稳定性(图11)。
[0407] 循环抗体和与患者组织体内结合的抗体的相似抗原表位特异性
[0408] 然后，我们评估复合表位的抗体是否也与临床疾病表现有关。一些临床观察发现高亲合力抗体可在组织中被捕获并且不循环，解释了少数患者中的血清阴性的乳糜泻病例(Salmi TT et al，Gut.2006；55(12)：1746-53.)。沉积在组织中的乳糜泻抗体出现在所有患病器官中(Korponay-Szabo IR et al，Gut.2004；53(5)：641-8.)，并且显示为有功能的，由于它们结合外部加入的重组TG2(Salmi TT et al，Gut.2006；55(12)：1746-53.)，因而乳糜泻抗体对于疾病发病机制可能比血液抗体更重要。因此，我们的目的在于试验组织结合的TG2抗体的抗原表位特异性是否与血液抗体相似。我们从组织切片中洗脱沉积在患者组织中的患者IgA抗体，并且纯化后用相关的突变TG2蛋白质的组(panel)试验所述抗体。为了仅获得与TG2抗原结合的功能性患者抗体和避免IgA部分被包含在血浆细胞或上皮细胞中并不一定参与疾病过程的非特异性IgA污染，我们选择不使用肠活检样品而选择使用没有IgA局部生成的肠外器官。当我们试验来自两个分娩过同时患有血清学活动性疾病的乳糜泻母亲的胎盘样品时，不进行侵入性过程就轻易得到足够量的用于生化研究的患者组织。事实上，我们观察到乳糜泻中胎盘含有大量的蜕膜部分中和绒毛膜绒毛状结构表面上的TG2结合的母体抗体(图12)。如先前所述，利用氯乙酸从胎盘组织洗脱IgA(Korponay-Szabo I et al，Gut.2004；53(5)：641-8.9)，并且IgA显示与用乳糜泻血清样品观察到的典型模式相同的表位靶向模式。
[0409] 靶向抗鉴定的复合表位的乳糜泻抗体在被动转移中引起疾病
[0410] 为了评估我们鉴定的靶向所述乳糜泻抗原表位的抗体是否参与疾病现象，我们寻找了可分别研究免疫反应的体液组份和细胞组分的疾病模型。不幸的是，乳糜泻为严格的人患疾病，没有TG2特异性抗体有效的相关动物模型。因此，我们探究了母体抗体的天然转移是否出现在人类新生儿中，以及此过程是否伴随病理特征。这些后代经常体重过轻，并且比正常母亲的孩子更常患有产科并发症(Hadziselimovic F，et al.Fetal Pediatr Pathol.2007；26：125-34)。因此，我们研究了8例母亲患有乳糜泻的分娩时的胎盘、脐带和血清标本，并且制备了人脐带内皮细胞(HUVEC)。这些母亲中的三位患有具有循环TG2抗体的活动性疾病，所述循环TG2抗体具有如通过使用血清样品的ELISA评估的典型特异性。这些母亲中的一位有IgA缺陷且IgG类抗体的血清水平高。IgG类抗TG2抗体出现在所有三个婴儿的血清中。这些抗体具有与其母亲的IgG抗体相似的抗原表位特异性(图12)。在来自IgA缺陷母亲的新生儿的脐带组织中也检测了IgG抗体，并且婴儿体重过轻，患有没有发现其他临床原因的肝损伤，所述肝损伤的减轻与血液中血清抗体水平的衰退并行。由于伦理上的原因，不能在该婴儿中进行空肠活检。与来自抗体阴性的乳糜泻母亲的婴儿的细胞相比，由另一个在出生前暴露于母体抗体的婴儿制备的HUVEC细胞显示细胞存活降低、形状异常以及在表面上扩展。
[0411] 实施例6：除TG2之外的诊断性谷氨酰胺转移酶突变体的设计
[0412] 使用分子建模，我们评价了谷氨酰胺转移酶家族成员蛋白质的结构及其对应于TG2中鉴定的复合乳糜泻抗原表位的表面。如表2所示，在因子XIII和TG3中，核心结构域的第一个N末端螺旋也是相似的，然而其乳糜泻抗原表位的一些锚定位点不同，并且通常不与经典的乳糜泻自身抗体交叉反应。考虑到这些分子的总体结构框架的相似性，我们预期改变对应于乳糜泻抗原表位的主要锚定位点的氨基酸将增强其结合特性。基于来自分子199
建模的结果以及TG2中E154K突变的实验数据，预测因子XIII Lys 改变成Glu会提高因子XIII的乳糜泻抗原性(图5)。该工程TG抗原可作为参考蛋白质，同时原因子XIII可作为测试蛋白质，用于在ELISA或其他免疫分析中以乳糜泻抗原表位特异的方式测量患者样品。在本实施方案中，具有工程蛋白质的信号但是不存在具有原因子XIII的信号将表示乳
146 148
糜泻型抗体结合。类似地，TG3中Gly 和/或His 或者其他的人或真核生物TG家族成员的对应氨基酸的改变可具有相似的效果。
建模的结果以及TG2中E154K突变的实验数据，预测因子XIII Lys 改变成Glu会提高因子XIII的乳糜泻抗原性(图5)。该工程TG抗原可作为参考蛋白质，同时原因子XIII可作为测试蛋白质，用于在ELISA或其他免疫分析中以乳糜泻抗原表位特异的方式测量患者样品。在本实施方案中，具有工程蛋白质的信号但是不存在具有原因子XIII的信号将表示乳
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糜泻型抗体结合。类似地，TG3中Gly 和/或His 或者其他的人或真核生物TG家族成员的对应氨基酸的改变可具有相似的效果。
[0413] 实施例7：诊断试剂盒的开发
[0414] 基于突变TG2的诊断试剂盒
[0415] 可基于TG2的特异性乳糜泻抗体结合位点和实施例1-3所述的测定条件开发诊断试剂盒。该试剂盒基于ELISA方法、其他免疫测定或无标记的结合测定。在ELISA设置中，野生型TG2和一个或多个具有改变的乳糜泻抗原表位的突变TG2结合到板的表面，被研究样品的结合模式将区分假阳性和“真”乳糜泻血清。具有完整的乳糜泻抗原表位的TG2蛋白质将为参考，结合乳糜泻抗原表位特异性突变体的抗体的下降表示乳糜泻型结合模式。如果检测与所述参考蛋白质的结合，但是测试蛋白质的结合至少没有改变30％，所述结果理解为非乳糜泻型TG2抗体结果，并且不进行进一步的临床检查。这样，可避免不必要的侵入性检查如上内视镜检查和小肠活检。如果所述参考和所述测试蛋白质的结果均低于预定的截断值水平，所述样品不包含TG2抗体，因此也可避免侵入性检查。通过用已知的乳糜泻和非乳糜泻样品完成的接受者操作特征曲线(ROC)，建立用于宣布与所述参考TG2蛋白质有反应的抗体的合适截断值。基于实施例5中的结果，提出用来自患有未治疗的乳糜泻的患者的样品获得的5％结合的截断值。
[0416] 除了全长野生型TG2之外，我们以下的重组蛋白质也显示与野生型TG2相似的结合，并且适合作为以上测定中的参考蛋白质：D151N、E154Q、E155Q、C277S、突变体433、结构2+ 2+
域突变体B(结构域I-II-IV)和A(结构域I-I-III)以及具有或没有Ca 离子的位点1Ca结合突变体。后者可用于不希望加入钙的测定设置中。另外，参考蛋白质可以是在TG家族框架上具有组合乳糜泻抗原表位的工程蛋白质，所述TG家族框架本身对于乳糜泻抗体是无抗原性的。作为测试蛋白质，提出突变体R、E、E158Q、E158L，但是更优选联合突变体RE、REM、RKM、位点4突变体或者不具有代表工程蛋白质的相似物的乳糜泻结合抗原表位的同源TG蛋白质。
域突变体B(结构域I-II-IV)和A(结构域I-I-III)以及具有或没有Ca 离子的位点1Ca结合突变体。后者可用于不希望加入钙的测定设置中。另外，参考蛋白质可以是在TG家族框架上具有组合乳糜泻抗原表位的工程蛋白质，所述TG家族框架本身对于乳糜泻抗体是无抗原性的。作为测试蛋白质，提出突变体R、E、E158Q、E158L，但是更优选联合突变体RE、REM、RKM、位点4突变体或者不具有代表工程蛋白质的相似物的乳糜泻结合抗原表位的同源TG蛋白质。
[0417] 图13显示利用Biacore方法无标记测量乳糜泻抗体结合的实施例，其中与野生型TG2相比，乳糜泻抗体与位点4突变体的结合和离解被改变。
[0418] 基于抗体置换的诊断试剂盒
[0419] 发现从乳糜泻患者的血清纯化并且差异地识别R19S的天然IgA和IgG抗体也相互竞争，但是不与非乳糜泻人IgG竞争(图9B1至B3)。基于此发现，我们开发了具有98％灵敏度和96％特异性的诊断性ELISA，以利用对已知的乳糜泻IgA示踪剂抗体的浓度依赖性置换效果(r＝0.88)而测量选择性体液IgA缺陷的对象中的IgG类乳糜泻抗体(图9A1至A2)。
[0420] 在所述示例性测定中，我们通过IgA乳糜泻患者抗体的置换来测量IgA缺陷的患者中血清IgG类抗TG2抗体。在ELISA中，使用野生型TG2抗原测量来自56位年龄为0.9-73岁(中位数为10.5)具有选择型IgA缺陷(总血清IgA＜0.05g/l)的未治疗的乳糜泻患者、来自23位非乳糜泻IgA缺陷和22位具有正常小肠结构的正常血清IgA的对照(对照的年龄为1-18岁，中位数为5.5)。虽然大多数患者具有IgG类患者抗体，其中三位也具有IgM类抗TG2抗体。在含有以1∶500稀释的乳糜泻IgA示踪剂抗体的测定缓冲液中以1∶100稀释被研究的血清样品，并且用抗IgA过氧化物酶结合的二抗测量IgA抗体的结合。使用空白获得的光密度值(OD)定义为100％抑制，并且不加IgA缺陷的样品用IgA示踪剂抗体获得的信号定义为0％抑制。根据100-(OD示踪剂-OD样品/OD示踪剂)计算利用被调查样品获得的抑制。测定间差异性为5.9％，测定内差异性为9.2％。作为根据接受者操作特征曲线计算的预定阈的最佳截断值为11％抑制，其中对于IgA缺陷的人的乳糜泻诊断，置换测定具有98.2％灵敏度(95％置信区间：94.5-100)和95.6％特异性(95％置信区间：89.9-100)。(图9A1)通过用单克隆小鼠抗人IgG(Phadia)和抗小鼠HRP结合的二抗直接识别人IgG，以测量置换效果和IgG抗TG2抗体的血清浓度的相互关系；r＝0.88。(图
9A2)在本实验设置中，在IgG稀释度为1∶100和IgA稀释度为1∶500时观察到最优选的置换比例。
9A2)在本实验设置中，在IgG稀释度为1∶100和IgA稀释度为1∶500时观察到最优选的置换比例。
[0421] 实施例8：利用患者抗体的抗原表位特异性预测即将出现的临床疾病
[0422] 为了了解在临床前早期是否已经看到与鉴定的复合乳糜泻抗原表位的反应，并且所述反应是否也具有用于余生中乳糜泻诊断的预测价值，我们试验了11个来自肌内膜抗体和TG2抗体阳性的患者的血清样品，在所述患者中，在血清收集时，不存在肠病征兆(正常绒毛结构)，因而不能立刻进行乳糜泻诊断。这些对象中的六位是已知的乳糜泻患者的无症状的家族成员，并且通过家族筛选而挑选。在0.8-3年随访中，这些对象中的具有局部抗体沉积的七位在小肠中产生严重的绒毛萎缩，另外具有其他轻微病灶的两位有抗体沉积。在所有11例中，在所述疾病的潜伏期收集的血清样品显示与具有明显临床疾病的乳糜泻患者的血清样品相似的抗原表位识别模式(图14)，并且与野生型TG2和突变体RE和REM的反应之间的区别甚至更大。
[0423] 提出诊断攻击的另外案例为TG2抗体不循环的对象。在这些案例中，抗体可在组织中被捕获，并且可以以洗脱物的形式用于诊断。由于这些案例经常呈现也能被其他疾病诱导的肠外症状，抗原表位特异性将有助于确立观察到的病理学表现是否与谷蛋白相关。
[0424] 实施例9：利用噬菌体展示方法制备诊断性单克隆抗体
[0425] 制备靶向乳糜泻抗原表位的单克隆抗体的另外工具是通过噬菌体展示技术建立来自人抗体的可变区的文库。所述方法中，从人样品克隆、生成和选择用于给定抗原的单链可变区片段(scFv)(Marzari，R.et al.J.Immunol.166，4170-4176(2001))。有可能发现具有与来自有症状的患者的乳糜泻抗体相同的结合位点的TG2特异性抗体。
[0426] 总抗体文库制备过程的第一个步骤是用Trizol从肠淋巴细胞中分离总RNA。然后，使用所述分离的RNA作为模板合成第一链cDNA，利用特异性引物通过PCR技术扩增IgA抗体的H、κ和λ链的可变区。加入连接区后，重链(VH+连接子)和轻链(Vκ+连接子和Vλ+连接子)的扩增的可变区通过另一个PCR组装。为了文库制备，组装的VH-Vκ和VH-Vλ用限制性酶消化，并与用相同的酶消化的pDAN5载体连接。此步骤后，载体包含作为插入片段的组装的scFv，并且可通过电穿孔转化到DH5ΔF’电感受态大肠杆菌(E.coli)细胞。包含所述抗体文库的细菌在选择性培养基上生长过夜，次日收获文库并在-80℃下储7
藏。所述文库应包含大约10个克隆，以保持可与人体中的抗体差异性相比的差异性。
藏。所述文库应包含大约10个克隆，以保持可与人体中的抗体差异性相比的差异性。
[0427] 利用噬菌体展示技术进行针对给定抗原的文库选择。为此，包含所述文库的细菌在选择性培养基中生长，并且用辅助噬菌体感染。所述辅助噬菌体为新的重组噬菌体的组装提供酶和其他蛋白质，所述重组噬菌体包含与其外壳蛋白质p3融合的scFv。制备后，用TG2蛋白质抗原包被的具有Maxisorp(DAKO)表面的免疫管选择与TG2反应的重组噬菌体。该抗原包含完整的乳糜泻抗原表位。用包含牛血清白蛋白的缓冲液封闭未包被的表面，并且将所述噬菌体加到具有相同的封闭溶液的免疫管中。在其表面上包含TG2特异性scFv的噬菌体将与包被的抗原结合。然后用DH5ΔF’细菌从免疫管中洗脱噬菌体，噬菌体在平板细菌中生长过夜，并且在次日作为第一选择输出而收获。使用TG2蛋白质，优选我们的E或RE突变体(其乳糜泻抗原表位改变了)，然后仅使包含对于完整的TG2而不是具有改变的乳糜泻抗原表位的TG2蛋白质特异的插入片段的细菌生长，以进行第二和更多轮选择(以与第一轮中相同的步骤使来自先前输出的细菌生长)，从而提高克隆的特异性。这样，特异性地选择包含靶向期望的TG2抗原表位的抗体的克隆，并使其进一步在选择性培养基上生长，同时去除与TG2的其他抗原表位反应的克隆。使用制备的抗体通过ELISA检验所述克隆的抗原表位特异性，其以指纹图谱PCR和限制性酶消化表征。ELISA板被全长的人重组TG2和突变体TG2蛋白质覆盖，然后用所述噬菌体温育。用与过氧化物酶(GE Healthcare)结合的抗噬菌体M13抗体检测结合，并用四甲基联苯胺显示，并且用硫酸停止反应。用分光光度计在OD450读取吸光度值。
[0428] 实施例10：用于评价诊断性患者样品的抗原表位特异性的竞争性ELISA
[0429] 因为可能难以检测抗体类型(如IgM)或者其抗原表位特异性不确定，所以患者样品中抗TG2抗体可导致诊断困难。为了获得疾病特异性的抗体结果，我们设计了两种竞争性ELISA，其中在存在和不存在在抗原表位水平干扰所述患者抗体—乳糜泻抗原结合的测试抗体时，评价患者抗体与具有完整的乳糜泻抗原表位的TG2抗原的结合。对于ELISA应用，测试抗体的同种型不同于将要测量的抗体。
[0430] a)在第一类型ELISA中，作为患者抗体的具有部分重叠的抗原表位的单克隆抗体885作为过量的竞争者测试抗体，并且如实施例9所述，测量乳糜泻IgA患者抗体与野生型TG2的剩余结合。在一起加入885和患者抗体前进行优化实验。包被在板上的TG2的量减到最小以给定的患者抗体稀释度仍然获得大约O.D.0.8-1.0的信号，所述降低可与该信号相比。我们显示在这些条件下，置换效果是与885的减少量剂量依赖性的(90.6％、85％、
64％)，并且与相同的患者样品有关，因此存在885时，仅有9.3％、15％和36％的患者抗体结合。实施方案中的ELISA可能也显示如果患者抗体大部分被885或相似的测试抗体置换，研究的患者抗体的抗原表位特异性为其靶向我们鉴定的主要复合乳糜泻抗原表位。
64％)，并且与相同的患者样品有关，因此存在885时，仅有9.3％、15％和36％的患者抗体结合。实施方案中的ELISA可能也显示如果患者抗体大部分被885或相似的测试抗体置换，研究的患者抗体的抗原表位特异性为其靶向我们鉴定的主要复合乳糜泻抗原表位。
[0431] b)如果以以下方式进行ELISA：测试抗体的量保持不变并且用HRP结合物测量所述测试抗体的结合量，那么信号的降低证明具有乳糜泻型抗原表位特异性的样品中存在竞争性的TG2特异性的抗体。因此，例如可同时使用高稀释度的885测试抗体测量未知的具有IgG、IgM或IgA框架的患者抗体，然而患者抗体是过量的。使用适当稀释的885抗体，我们可在使用正常组织样品的免疫荧光试验中达到患者IgA与肌内膜中TG2抗原结合，同时Mab 885结合的信号降低了(图16)。也可如实施例5所述，使用已知的IgA类乳糜泻患者抗体并且测量IgA缺陷患者的IgG类乳糜泻特异性抗体进行这种类型ELISA。然而，如果测试抗体被标记(如生物素化的)并且标记物是可特异性识别的，那么也可显示两种IgA类乳糜泻抗体之间的竞争。
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